FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
SIGITA KORBUTAITĖ
MIKROEMULSIJOS SU LINŲ SĖMENŲ ALIEJUMI KOKYBĖS IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
KLINIKINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
MIKROEMULSIJOS SU LINŲ SĖMENŲ ALIEJUMI KOKYBĖS IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc. dr. Asta Marija Inkėnienė
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Sigita Korbutaitė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 8
ĮVADAS ... 9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Mikroemulsijų sudėtis ... 12
1.1.1. Natūralūs augaliniai aliejai mikroemulsinėse sistemose ... 12
1.1.2. Surfaktantai ir jų funkcija ... 13
1.1.3. Kosurfaktantai ir jų reikšmė ... 14
1.2. Mikroemulsijų privalumai ir trūkumai bei panaudojimo sritys farmacijoje ... 15
1.3. Mikroemulsijų formavimasis ... 16
1.4. Mikroemulsijų modeliavimas ir gamyba... 17
1.5. Mikroemulsijų klasifikacija... 17
1.6. Mikroemulsijų kokybės vertinimas ... 19
1.6.1. Termodinaminis stabilumas ... 20
1.6.2 Vidutinis dalelių dydis ir jų pasiskirstymas ... 20
1.6.3. Klampa, pH reikšmė ir elektrinis laidis ... 21
1.7.Antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų aktyvumas mikroemulsinėse sistemose ... 21
2. TYRIMO METODIKA ... 23
2.1. Tyrimo medžiagos ir įranga ... 23
2.1.1. Tyrimo medžiagos: ... 23
2.1.2. Tyrimo įranga ... 23
2.3. Mikroemulsijos a/v gamybos technologijos ... 24
2.4. Mikroemulsijos a/v fazių diagramos sudarymas ... 25
2.5. Mikroemulsijų stabilumo ir kokybės vertinimas ... 25
2.5.1. Vidutinio dalelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimas ... 26
2.5.2. pH reikšmės, elektrinio laidžio ir klampos tyrimai ... 26
2.5.3. Mikroemulsijų stabilumo tyrimas ... 27
2.6. Linų sėmenų aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 27
2.7. Linų sėmenų aliejaus ir mikroemulsijų antioksidacinio aktyvumo stabilumo nustatymas .. 28
2.7. Statistinė analizė ... 29
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 30
3.1. Mikroemulsijų gamybos būdo parinkimas ... 30
3.2. Surfaktantų bei surfaktantų ir kosurfaktantų ir jų santykio įtakos mikroemulsijų vidutiniam fazės dalelių dydžiui ir polidispersiškumui vertinimas. ... 32
3.3. Mikroemulsijų a/v fazių diagramos duomenų analizavimas ... 34
3.4. Linų sėmenų aliejaus a/v mikroemulsijos kokybės ir stabilumo vertinimas ... 35
3.4.1. Mikroemulsijos termodinaminio stabilumo tyrimas ... 35
3.4.2 Mikroemulsinių vidutinio dalelių dydžio ir pasiskirstymo analizė a/v mikroemulsijose ... 36
3.4.3. Mikroemulsijų pH reikšmės, elektrinio laidžio ir klampos vertinimas ... 38
3.5. Linų sėmenų aliejaus ir jo mikroemulsijų a/v antioksidacinio aktyvumo tyrimas ... 39
3.5.1. Linų sėmenų aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 39
3.5.2. Mikroemulsijų a/v su linų sėmenų aliejumi antioksidacinio aktyvumo ir jo bei mikroemulsijos stabilumo vertinimas ... 40
IŠVADOS ... 44
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 45
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 46
SANTRAUKA
S. Korbutaitės magistro baigiamasis darbas „Mikroemulsijos su linų sėmenų aliejumi kokybės ir antioksidacinio aktyvumo stabilumo tyrimas“. Mokslinis vadovas doc. dr. A. M. Inkėnienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, klinikinės farmacijos katedra. Kaunas, 2018.
Darbo tikslas: nustatyti pagalbinių medžiagų, gamybos būdo įtaką a/v ME su linų sėmenų aliejumi
stabilumui ir kokybei bei nustatyti vaisto formos įtaką linų sėmenų aliejaus antioksidaciniam aktyvumui.
1. Uždaviniai: Atrinkti ME su linų sėmenų aliejumi tinkamas pagalbines medžiagas ir
sudaryti fazių diagramas atrinktoms sudėtims. Įvertinti sumodeliuotų MEjų kokybę pagal , tiriant šiuosjų parametrus: pH reikšmę, klampą, elektrinį laidį, VDD ir jų pasiskirstymąPDI, ,termostabilumą ir mikroemulsijų stabilumą. Nustatyti ir palyginti sumodeliuotų ME ir linų sėmenų aliejaus antioksidacinį aktyvumą. Įvertinti laikymo sąlygų įtaką ME stabilumui pagal VDD ir antioksidacinį stabilumą.
Tyrimo objektas – mikroemulsinių a/v sistemų su linų sėmenų aliejumi stabilumo ir kokybės
priklausomybė nuo pagalbinių medžiagų, gamybos būdo ir vaisto formos.
Metodai: Pagalbinių medžiagų ir gamybos metodo atrankos metu atliekami VDD ir PDI matavimai.
Titravimo metodu sudaromos fazių diagramos. Kokybei įvertinti matuojama klampa, pH reikšmė, elektrinis laidis, VDD, PDI. Termodinaminioam stabilumuio tyrimas įvertinti atliekami- šaldymo – šildymo, užšaldymo – atšildymo ciklai, stebimi ME pokyčiai tyrimo metu. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui ir stabilumui naudojamas CUPRAC spektrofotometrinis metodas. Stabilumas vertinamas pagal VDD natūraliomis ir ilgalaikio stabilumo sąlygomis.
Rezultatai: Nustatytus kritinius kokybės parametrus dėl ME sistemos atitiko 2 sumodeliuotos a/v tipo
ME – su S/KoS Tween 80 ir - Span 80 (7:3), ir S - Tween 20. Sumodeliuotos termodinamiškai stabilios ir homogeniškos a/v tipo ME, kurių VDD buvo 15,34 – 178,4 nm, PDI – 0,225 - 0,390, pH reikšmė 8,59 – 8,74, elektrinis laidis – 10,4 - 11,3 µS/cm, klampa 440 – 820 mPa•s. Linų sėmenų aliejaus
antioksidacinis aktyvumas 1,58 mg/g. ME su S/KoS - Tween 80 ir Span 80 antioksidacinis aktyvumas 0,102 mg/g pagal Trolaksą, ME su S - Tween 20 - 0,061 mg/g. Antioksidacinio aktyvumo ir ME stabilumas tirtas praėjus 1 mėn. nuo pagaminimo, laikant natūraliomis ir ilgalaikio stabilumo sąlygomis.
Išvados: Gautų a/v, termodinamiškai stabilių ME sudėtys: linų sėmenų aliejus, išgrynintas vanduo,
Tween 20 yra 1:2:19, linų sėmenų aliejus, išgrynintas vanduo, Tween 80 ir Span 80 yra 1:2:3,375:7,765. pH reikšmė - silpnai šarminė (pH>7), ME su Tween 80 ir Span 80 pasižymėjo didesne klampa (p<0,05), kas parodo, jog S/KoS mišinys turi įtakos kampai. Įvertinus VDD, nustatyta S/KoS įtaka - ME su Tween 80 ir Span 80 pasižymėjo mažiausiu VDD (p<0,05). Antioksidacinio veikimo tyrimo metu nustatyta, jog linų sėmenų aliejus pasižymi antioksidaciniu veikimu. a/v ME, kaip vaisto formos, pasižymi mažesniu antioksidaciniu veikimu nei grynas aliejus (p<0,05), dėl mažesnės fenolinių junginių koncentracijos, antioksidaciniam veikimui turi įtakos ir S/KoS – didesniu veikimu (p<0,05) pasižymėjo ME su Tween 80 ir Span 80. Antioksidacinį veikimą ir ME stabilumą įtakoja pagalbinės medžiagos – natūraliomis ir ilgalaikio stabilumo sąlygomis ME su Tween 80 ir Span 80 išliko stabili.
SUMMARY
S. Korbutaitė master's thesis "Microemulsion with linseed oil quality and antioxidant activity stability study". Scientific supervisor doc. dr A. M. Inkenienė. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Clinical Pharmacy. Kaunas, 2018.
The aim of the study: to determine the influence of the S and S/CoS, the production method on the stability and quality of the o / w ME and the linseed oil, and to determine the influence of the formulation on the antioxidant activity of linseed oil.
The objectives of the study: to select suitable S or S/CoS for ME with linseed oil and to construct ternary phase diagrams for the selected compositions. To evaluate the quality of formulated ME according to the main characteristics of their quality assessment: pH value, viscosity, electrical conductivity, droplets size and polydispersity, thermostability. To determine and compare the formulated ME and linseed oil antioxidant activity. To evaluate the effect of storage conditions on ME stability in terms of average droplet size and antioxidant stability.
The object of research – o/w ME systems with linseed oil stability and quality dependence on S/CoS, production method and drug form.
Methods: The selection of S or S/CoS and the manufacturing method carried out in droplet size and polydispersity measurements. Phase diagrams are constructed by the titration method. The viscosity, pH, electrical conductivity, droplet size, polydispersity index are measured for quality evaluation. For the evaluation of thermodynamic stability, the cooling-heating, freezing-thawing cycles are performed. The CUPRAC spectrophotometric method is used for the evaluation and stability of antioxidant activity. Stability is measured by the size of the droplets under natural and long-term stability conditions.
Results: The critical quality parameters for the o/w ME system were matched with 2 formulations, - ME type o/w - S / CoS - Tween 80/ and Span 80 (7:3), and S - Tween 20. The thermodynamically stable and homogeneous ME with droplet size of 15.34 - 178.4 nm were formulated, PDI - 0.225 - 0.390, pH value 8.59 - 8.74, electric conductivity - 10.4 - 11.3 μS / cm, viscosity 440 - 820 mPa • s. The anti-oxidative activity of linseed oil is 1.58 mg / g. ME with Tween 80and /Span 80 antioxidative activity 0.102 mg / g, ME with Tween 20 - 0.061 mg / g. Antioxidative activity and ME stability were investigated after 1 month since made, in natural and long-term stability.
Conclusion: Thermodynamically stable o/w ME compositions were obtained: linseed oil, purified water, Tween 20 is 1: 2:19, linseed oil, purified water, Tween 80 and /Span 80 is 1: 2: 3,375: 7,765. The pH value was weakly alkaline (pH> 7); the ME with Tween 80 and /Span 80 was characterized by a higher viscosity (p <0.05), which indicates that the S / CoS mixture has anglesaffect. Droplet size evaluation set S / CoS influence - the ME of Tween 80 and /SSpan 80 got smallest droplet size (p <0.05). The anti-oxidative activity study found that linseed oil has it. O/w ME, as a drug form, has a lower antioxidant effect than pure oil (p <0.05), it due to lower concentrations of phenolic compounds, antioxidant effect is also affected by ME in the S / CoS-enhanced function (p <0.05) with Tween 80/ and Span 80. The antioxidant action and
ME stability are affected by the S/CoS - under natural and long-term stability, the ME with Tween 80/ and Span 80 remains stable.
PADĖKA
Nuoširdžiai dėkoju Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Analizinės ir toksikologinės chemjos katedros dėstytojui dr. Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant antioksidancio aktyvumo tyrimus. Taip pat dėkoju už pagalbą Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Klinikinės farmacijos katedrai, ir ypač dr. Vaidai Juškaitei bei doktorantui Vyčiui Čižinauskui.
SANTRUMPOS
a/v – aliejus-vandenyje tipo dispersinė sistema
KoS – pagalbinė paviršinio aktyvumo medžiaga – kosurfaktantas ME – mikroemulsija
PDI – polidispersiškumo indeksas
S – pagrindinė paviršinio aktyvumo medžiaga – surfaktantas
S/KoS – surfaktanto ir kosurfaktanto (pagrindinės ir pagalbinės paviršinio aktyvumo medžiagų) mišinys
v/a – vanduo aliejuje tipo dispersinė sistema VDD – vidutinis dalelių dydis
ĮVADAS
Mikroemulsijos – tai šiuolaikinė vaisto forma, sudaryta iš vandeninės ir aliejinės fazių, surfaktanto bei kosurfaktanto, su ypač mažu dalelių dydžiu – nuo 10 iki 200nm. Susidomėjimą mikroemulsijomis ir jų plačias panaudojimo galimybes lemia jų gebėjimas inkorporuoti įvairios kilmės ir skirtingų fizikinių-cheminių savybių vaistines medžiagas ir jų stabilumo išlaikymas, sistemos termodinaminis stabilumas, specialių sąlygų ir įrankos nereikalaujanti gamyba ir platus pritaikomumas – parenteraliai, per os, transdermaliai, ant odos, į nosį ar akis vartojamiems preparatams [1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 19, 22, 27].
Kasmet vis didėjant susidomėjimui kuo natūralesniais vaistais, mokslininkai pradėjo mikroemulsijų aliejinei fazei naudoti natūralius aliejus. Augalinis aliejus mikroemulsinėse sistemose gali būti naudojamas kaip veikloji medžiaga, dėl sudėtyje esančių bioaktyvių medžiagų, taip suteikiamas farmakologinis poveikis. Tačiau buvo pastebėta, jog mikroemulsiją, su natūraliu aliejumi yra sunkiau pagaminti dėl reikalingos platesnės pagalbinių medžiagų atrankos [3, 4, 5, 7, 8, 10, 12, 14, 26].
Mikroemulsijos modeliavimui pasirinktas linų sėmenų aliejus pasižymi išskirtinai dideliu polinesočiųjų rūgščių kiekiu, iš kurių daugiau nei 50% sudaro omega-3 rūgštys. Dėl to yra vertingas gydant širdies ir kraujagyslių, sąnarių, virškinimo sistemos ligas. Šis aliejus turi ir daugiau privalumų – jis yra malonaus kvapo, lyginant su žuvų taukais, bei mažina mažo tankio lipoproteinų (MTL) cholesterolio koncentraciją kraujyje. Dėl aliejaus sudėtyje esančių fenolinių junginių, jis pasižymi ir antioksidancinėmis savybėmis. Patvirtinus, kad linų sėmenų aliejus pasižymi laisvuosius radikalus surišančiu poveikiu ir panaudojus jį mikroemulsinių sistemų modeliavime, svarbu ištirti, kokią įtaką ši vaisto forma turi aliejaus antioksidacinio aktyvumo stabilumui [5, 10, 36].
Šis tyrimas yra aktualus dėl natūralių aliejų panaudojimo galimybių didinimo farmacijoje. Taip pat šis tyrimas yra naujas, nes kol kas Lietuvoje nėra atliktų panašių mokslinių tyrimų - ankstesniuose moksliniuose darbuose, kuriuose modeliuotos mikroemulsijos, buvo panaudoti ne natūralūs augaliniai aliejai, o sintetiniai esteriai (pvz. izopropilo miristatas). Taip pat nėra mokslinių darbų, kuriuose nustatomas mikroemulsijų su linų sėmenų aliejumi antioksidacinis aktyvumas.
Tyrimo objektas – mikroemulsinių a/v sistemų su linų sėmenų aliejumi stabilumo ir kokybės priklausomybė nuo pagalbinių medžiagų, gamybos būdo ir vaisto formos.
Darbo tikslas – nustatyti pagalbinių medžiagų, gamybos būdo įtaką mikroemulsinės a/v sistemos su linų sėmenų aliejumi stabilumui ir kokybei bei nustatyti vaisto formos įtaką linų sėmenų aliejaus antioksidaciniam aktyvumui.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti pagalbinių medžiagų, gamybos būdo įtaką mikroemulsinės a/v sistemos su
linų sėmenų aliejumi stabilumui ir kokybei bei nustatyti vaisto formos įtaką linų sėmenų aliejumi antioksidaciniam aktyvumui
Uždaviniai:
2.1.Atrinkti linų sėmenų aliejaus mikroemulsijai tinkamas pagalbines medžiagas ir sumodeliavus a/v mikroemulsines sistemas sudaryti fazių diagramas atrinktoms sudėtims.
3.2.Įvertinti sumodeliuotų mikroemulsijų kokybę , tiriant šiuospagrindinius mikroemulsijų kokybės vertinimo rodiklius parametrus: pH reikšmę, klampą, elektrinį laidį, vidutinį dalelių dydį ir jų pasiskirstymą ir ,termostabilumą ir mikroemulsijų stabilumą.
4.3.Nustatyti ir palyginti sumodeliuotų mikroemulsijų ir linų sėmenų aliejaus antioksidacinį aktyvumą CUPRAC metodu.
5.4.Įvertinti laikymo sąlygų įtaką mikroemulsijų stabilumui pagal vidutinį dalelių dydį ir antioksidacinį stabilumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Mikroemulsijų sudėtis
Mikroemulsijos – tai skystos ir skaidrios dispersinės sistemos, sudarytos iš dviejų tarpusavyje nesimaišančių skysčių fazių - vandeninės ir aliejinės fazių kurios stabilizuotos surfaktantais (S) ar jų mišiniais su kosurfaktantais (KoS) [9]. Kadangi mikroemulsijų sudėtyje esančiai aliejinei fazei gali būti naudojamos riebalinės rūgštys, riebiųjų rūgščių ir alkoholių esteriai, vidutinio grandinės ilgio trigliceridai, acto rūgšties ir glicerolio triesteriai, terpenai, natūralūs aliejai. Naudojant natūralius aliejus, mikroemulsijos yra papildomos bioaktyviomis medžiagomis [10]. Vandeninei fazei naudojamas išgrynintas ar injekcinis vanduo, kuriame gali būti ištirpinta klampumą didinančių medžiagų, natrio chlorido, buferinių tirpalų, konservantų ir prasiskverbimą pro odą gerinančių medžiagų [11].
1.1.1. Natūralūs augaliniai aliejai mikroemulsinėse sistemose
Šiais laikais vis dažniau atsigręžiama į kuo natūralesnius vaistus dėl mažesnio jų šalutinio poveikio. Natūralūs augaliniai aliejai yra bioaktyvių medžiagų mišiniai, kurie gali veikti vieni ar sinergistiškai kartu su įvairiomis medžiagomis mikroemulsinėje sistemoje taip padidindami terapinį poveikį. Natūralūs aliejai yra naudojami ligų prevencijai ar gydymui, tokių kaip vėžys, Alzheimerio liga, kardiovaskulinės sistemos ligos, taip pat kaip spazmolitikai, priešuždegiminiu, nuskausminamuoju, antibakteriniu, antivirusiniu, antipsoriaziniu, antidiabetiniu, imunomoduliaciniu ir antioksidantiniu poveikiu pasižyminčios medžiagos [3, 9, 10].
Natūralius aliejus naudojant mikroemulsijose, jos yra ne tik papildomos bioaktyviomis medžiagomis, bet ir įgauna terapinį veikimą. Vienas iš dažniausiai naudojamų aliejų - linų sėmenų aliejus yra puikus polinesočiųjų rūgščių šaltinis, iš kurių daugiau nei 50% sudaro omega-3 rūgštys. Šis aliejus turi ir daugiau privalumų – jis yra malonaus kvapo, lyginant su žuvų taukais, bei mažina mažo tankio lipoproteinų (MTL) cholesterolio koncentraciją kraujyje. Dėl aliejaus sudėtyje esančių fenonolinių junginių, jis pasižymi ir antioksidantinėmis savybėmis [4].
1.1.2. Surfaktantai ir jų funkcija
Mikroemulsijų sudėtyje svarbi dalis – surfaktantas. Tai yra pagrindinė paviršinio aktyvumo medžiaga, naudojama mikroemulsijose. Mikroemulsijos susidaro esant optimaliai hidrofilinio-lipofilinio balanso reikšmei [5]. Surfaktantas – tai dvilypė amfifilinė molekulė, turinti polinę galvutę ir nepolinę uodegėlę (1 pav.). Ši molekulė adsorbuojasi dviejų dazių sąlyčio paviršiuje, kur hidrofilinės grupės išsidėsto vandeninėje fazėje, o hidrofobinės – aliejinėje. Taip sistemoje sumažinamas paviršiaus įtempimas (iki itin mažų reikšmių (10-3 mN/m-1)) ir pakeičiama entropija. Dėl
to sistema tampa termodinamiškai stabili ir susiformuoja spontaniškai esant tinkamai sudėčiai ir aplinkos sąlygoms, tačiau surfaktanto koncentracija sistemoje turi būti gana didelė [12, 16, 19].
1 pav. Surfaktanto molekulės išsidėstymo schema aliejinės ir vandeninės fazių sąlyčio riboje. Adaptuota pagal Callender ir kt. (2017)
Surfaktantai, naudojami mikroemulsijose, yra skirstomi į anijoninius, katijoninius, cviterjoninius amfoterinius ir nejoninius (1 lentelė). Mikroemulsijų gamyboje yra naudojama santykinai didelė surfaktanto koncentracija, tačiau net leidžiami naudoti surfaktantai, didesnėmis nei leidžiamos koncentracijomis, gali sukelti nepageidaujamus poveikius (alergiją, odos sudirgimą).
1 lentelė. Mikroemulsijose dažniausiai naudojamųi surfaktantų ir kosurfaktantų pavyzdžiai [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10]
Surfaktantai
Kosurfaktantai
Anijoniniai Katijoniniai Amfoteriniai Nejoniniai Natrio
diheksilsulfosukcinatas Natrio lauryl sulfatas Oleatai Sulfosukcinatas Amonio druskų dariniai (Cetrimonio bromidas) Amonio ir sulfonio druskų dariniai Lecitinas Span 20, 40, 60, 80 Tween 20, 40, 60, 80 Labrasol Plurol PG Nejoniniai surfaktantai PEG 400 Etanolis
Remiantis moksline literatūra, mikroemulsijų gamybai geriau naudoti nejoninius surfaktantus, kurie, lyginant su joniniais, pasižymi mažesnėmis nepageidaujančiomis savybėmis [1, 3, 10].
Ar reikia plėstis su pačiu paaiškinimu kaip susidaro mikroemulsija? Kokios jėgos veikia? Straipsnyje radau 3 teorijas. https://drive.google.com/open?id=1TYRQGVZqNOi3wf1W7vPCPUNDGLOCVfUr[AI1]
1.1.3. Kosurfaktantai ir jų reikšmė
Dar viena mikroemulsijų sudėtyje sutinkama naudojama medžiaga yra kosurfaktantas. Kosurfaktantai yra naudojami norint dar labiau sumažinti paviršiaus įtempimą ir padidinti tarpfazinės surfaktanto plėvelės lankstumą. Dėl šio poveikio galima naudoti mažesnes surfaktanto koncentracijas ir praplėsti kritinę mikroemulsijos susidarymo ribą bei sumažinti galimų nepageidaujamų poveikių riziką. Mikroemulsijos gali tapti kokybiškesnės atsižvelgiant į dalelių dydį ir polidispersiškumą, ko pasekoje padidėja ir stabilumas. Kaip kosurfaktantai dažniausiai yra naudojami nejoniniai surfaktantai, tik mažesnėmis koncentracijomis, trumpo ir vidutinio ilgio grandinės anglies atomų grandinės ilgio alkoholiai (C3–C8), tačiau gali būti naudojami surfaktantai, tokie kaip sorbitano monoleatai (Span), tačiau mažesnėmis koncentracijomis. karboksi rūgštys ir alkilaminai (1 lentelė). Mikroemulsijoms
naudojami kosurfaktantai alkoholiai gali veikti kaip skvarbą į odą gerinančios medžiagos, bet per didelis jų kiekis gali sukelti papildomą odos dirginimą ir dehidrataciją [113, 14, 15, 16, 17].
1.2. Mikroemulsijų privalumai ir trūkumai bei panaudojimo sritys farmacijoje
Mikroemulsijos, kaip vaisto forma, turi šiuos privalumus [10, 29, 32]:
Tai yra termodinamiškai stabili sistema su ypač maža tarpfazine įtampa tarp nesimaišančių fazių Skysta forma – greitesnis poveikis, nes išvengiama tirpimo ir suirimo
Paprasta gamyba, nes susidaro spontaniškai – gamybai nėra būtina energija
Geba tirpinti lipofilines, hidrofilines ir amfifilines medžiagas – tai padidina bioprieinamumą Dėl ypač mažų dalelių dydžio (10 – 200 nm) – didelis paviršiaus ploto ir tūrio santykis – tai
pagerina absorbciją ir biologinį pasisavinimą
Apsaugo vaistines medžiagas nuo oksidacijos ir fermentų poveikio – taip padidina stabilumą ir membranų laidumą
Galimybė aliejinei fazei naudoti natūralius aliejus taip praturtinant vaistinę formą biologiškai naudingomis medžiagomis
Sistemos susiformavimas yra grįžtamas. Mikroemulsijų fazės, esant ypač žemai (>-20°C) ar ypač didelei temperatūrai (>40°C), gali atsiskirti, tačiau temperatūrai pasikeitus į natūralią – sistema grįžta į pradinę būseną.
Dėl šių privalumų mikroemulsijos turi didelį potencialą įvairių ligų gydymui. Mikroemulsijos kaip vaisto forma gali būti naudojama prailginto ir kontroliuojamo poveikio vaistams – transdermaliniams, skirtiems vartoti ant odos, oraliai, į nosį, intraveniškai, parenteraliai, į akį ir kitais vartojimo būdais. Mokslininkai teigia, jog vaistų pernešimas mikroemulsijomis didina vaistų veikimo specifiškumą dėl veikimo vietos taip padidinant jų terapinį poveikį ir sumažinant vaistų toksiškumą. Dėl skirtingų kilmių vaistinių medžiagų tirpinimo, mikroemulsijos gali praplėsti vaistų įvairovę [10, 11, 16, 29].
Kaip ir visos vaistų formos, mikroemulsijos turi ir trūkumų. Mokslininkai Agrawal ir kt. (2012) išskyrė šiuos trūkumus [32]:
Mikroemulsijoms pagaminti reikalinga didelė koncentracija surfaktanto bei kosurfaktanto Apsunkintas aukštoje temperatūroje tirpių medžiagų panaudojimas
Ne visi surfaktantai tinkami vartoti oraliai dėl nemalonaus skonio ir toksiškumo Mikroemulsijų stabilumui svarbu temperatūra (ne didesnė nei 45°C)
Nors mikroemulsijos ir turi trūkumų, jie nesutrukdo šiai vaisto formai būti patrauklia vaistų kūrime ir mokslininkams, ir toliau kurti vaistus šios sistemos pagrindu.
1.3. Mikroemulsijų formavimasis
Mikroemulsijų formavimasis ir stabilumas priklauso nuo surfaktanto kilmės ir molekulinio svorio, kosurfaktanto molekulės dydžio ir temperatūros. Mikroemulsijų formavimosi pagrindas yra tarpfazinės energijos sumažinimas iki labai mažos vertės – 10-3 – 10-6 mN/m-1, taip sudaromos sąlygos termodinaminiam judėjimui, dėl kurios atsiskiria ir yra išsklaidomos tarpusavyje nesimaišančios fazės. Tarpfazinės energijos sumažinimą įvykdo surfaktantas ar surfaktanto ir kosurfaktanto mišinys, pridėtas į sistemą, sudarytą iš vandeninės ir aliejinės fazių, kaip paviršiaus įtempimą mažinančios medžiagos [10, 11, 12, 19, 20, 31].
Sistemos spontaniškam susiformavimui laisvoji sistemos energija turi būti mažesnė nei atskirų sistemą sudarančių komponentų laisvoji energija. Laisvoji sistemos energija (∆𝐺) apibrėžiama formule [31]:
∆𝐺 = 𝛾∆𝐴 − 𝑇∆𝑆
Kur 𝛾 – aliejinės ir vandeninės fazių sąlyčio paviršiaus įtempimas, ∆𝐴 – paviršiaus ploto pokytis susidarant sistemai, 𝑇 – temperatūra, ∆𝑆- sistemos entropijos pokytis.
Mikroemulsija susiformuoja didėjant paviršiaus plotui (∆𝐴) ir susiformuojant dispersinės fazės lašeliams, kurie susidaro veikiant surfaktantui su kosurfaktantu – jie padengia sistemos lašelius monomolekuliniu sluoksniu ir padidėja entropija (∆𝑆) [19, 31]. Kadangi mikroemulsijose aliejinės ir vandeninės fazių sąlyčiau paviršiaus įtempimas ir paviršiaus ploto pokytis yra mažesnis nei sistemos entropijos pokytis su temperatūra, laisvoji sistemos energija yra <0 [20, 31].
1.4. Mikroemulsijų modeliavimas ir gamyba
Ar reikia plėstis su pačiu paaiškinimu kaip susidaro mikroemulsija? Kokios jėgos veikia? Straipsnyje radau 3 teorijas. https://drive.google.com/open?id=1TYRQGVZqNOi3wf1W7vPCPUNDGLOCVfUr[AI2]
Mikroemulsijų susiformavimas priklauso nuo aliejinės, hidrofilinės ir surfaktanto (S), ar jo mišinio su kosurfaktantu (KoS), santykio. Modeliuojant mikroemulsijas, dažniausiai sudaromos fazių diagramos naudojant fazių titravimo metodą. Fazių diagrama yra nustatomos mikroemulsijai susidaryti būtinos medžiagų koncentracijos ribos. Fazių diagramos dažniausiai sudaromos vandenine faze titruojant aliejinės fazės ir surfaktanto (ir kosurfaktanto) mišinį arba aliejine faze titruojant vandeninės fazės ir surfaktanto (ar ir kosurfaktanto) mišinį [6, 10, 12, 15, 18].
Tradicinis mikroemulsijos gamybos būdas yra titravimas, kuris nereikalauja didelių investicijų, brangios aparatūros. Titravimui galima pasirinkti vandeninę fazę, aliejinę fazę, surfaktantą ar ir kosurfaktanto mišinį bei viena iš fazių ir surfaktanto ar kartu su kosurfaktantu mišinį. Tačiau siekiant gauti stabilesnes mikroemulsines sistemas, mažesnį dispersinių dalelių dydį ir geresnį polidispersiškumo indeksą gali būti pasitelktas ultragarso homogenizatorius. Šis poveikis pasiekiamas dėl stipresnio dalelių sužadinimo nei gaunamo maišymo metu. Tačiau kol kas šis gamybos būdas naudojamas tik kosmetikos ir dažų pramonėje dėl neaiškaus poveikio žmogaus organizmui [5].
Visais atvėja[AI3]is Bet kuriuo metodu gaminant mikroemulsiją sistemos nuskaidrėjimas
laikomas mikroemulsijos susidarymu. Jei mikroemulsija gaminama su vaistine medžiaga, viskas atliekama taip pat, tik vaistinė medžiaga ištirpinama terpėje, kurioje ji tirpsta, ar jų mišinyje [5, 6, 10, 12, 15, 18].
1.53. Mikroemulsijų klasifikacija
Mikroemulsijos pagrinde yra skiriamos į du tipus – aliejus vandenyje (a/v) ir vanduo aliejuje (v/a). A/v tipo mikroemulsijos susidaro iš aliejinės fazės lašelių, disperguotų vandenyje, v/a tipo – iš vandens lašelių, disperguotų aliejuje (2 pav.) [10, 18, 19].
2 pav. Pagrindiniai mikroemulsijų tipai v/a (a) ir a/v (b). Adaptuota pagal Callender ir kt. (2017)
Mikroemulsijos gali būti klasifikuojamos pagal Vinsorą (Winsor, 1948 m.) į 4 tipus (3 pav.) [19, 20]: 1) I tipas – dvifazė sistema. Apatinė A/V mikroemulsijos fazė formuoja pusiausvyrą su viršutine
pertekline aliejaus faze. Surfaktantas labiausiai tirpus vandenyje, aliejinėje perteklinėje fazėje randamos itin mažos surfaktanto koncentracijos;
2) II tipas – dvifazė sistema. Viršutinė mikroemulsijos V/A fazė formuoja dinaminę pusiausvyrą su apatine pertekline vandenine faze. Surfaktanto didesnis kiekis yra ištirpęs aliejinėje fazėje. Vandeninėje fazėje aptinkamos mažos surfaktanto koncentracijos;
3) III tipas– trifazė sistema. Vidurinė fazė – biištisinė mikroemulsija, esanti pusiausvyroje su viršutine pertekline aliejine faze ir apačioje esančia pertekline vandenine faze. Perteklinėse aliejaus ir vandens fazėse aptinkami maži surfaktanto kiekiai, jo didelės koncentracijos aptinkamos biištisinės struktūros vandeninėje fazėje;
3 pav. Vinsoro mikroemulsijų tipai ir temperatūros arba elektrolitų koncentracijos ir surfaktanto koncentracijos padidėjimo poveikio mikroemulsijos tipui schema. Adaptuota pagal Callender ir kt.
(2017)
Mikroemulsijų tipai pagal Vinsorą gali kisti vykstant tarpfaziniams perėjimams (3 pav.), kuriuos įtakoja temperatūros padidėjimas, kai surfaktantas nejoninis, elektrolitų koncentracijos padidėjimas, kai mikroemulsijoms gaminti naudojami joniniai surfaktantai [19, 20].
1.64. Mikroemulsijų kokybės vertinimas
Sumodeliuotų mikroemulsijų kokybė yra vertinama pagal šiuos pagrindinius kriterijus: i) termodinaminį stabilumą; ii) vidutinį dalelių dydį (VDD); iii) polidispersiškumo indeksą (PDI); iv) pH reikšmę; v) klampą ir vi) elektrinį laidį. Šie kriterijai parodo mikroemulsijų stabilumą, tinkamumą vartojimui ant odos ir patvirtina mikroemulsijos tipą.
1.64.1. Termodinaminis stabilumas
Norint įrodyti, jog pagamintos mikroemulsijos yra kokybiškos būtina atlikti termodinaminio stabilumo tyrimą. Taip pat termodinaminio stabilumo tyrimas atskiria mikroemulsijas nuo emulsijų, kurios pasižymi kinetiniu stabilumu, ir esant temperatūrų svyravimui išsisluoksniuoja (Patel ir kiti, 2012). Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo tyrimas atliekamas 2 etapais: šildymo-šaldymo ciklas ir užšildymo-šaldymo-atšildymo ciklas. Kai kuriuose šaltiniuose minimas ir centrifugavimas prieš pradedant terminius tyrimus, jei šiame etape mikroemulsija išsisluoksniuotų, į tolesnius tyrimo etapus mikroemulsija nebūtų perkeliama..
Šildymo-šaldymo ciklo metu pagamintos mikroemulsijos laikomos 4 °C, 20 °C, 32 °C ir 45 °C temperatūrose ne mažiau nei 48 valandas kiekvienoje temperatūroje. Mikroemulsijų termodinaminis stabilumas remiantis homogeniškumus vertinamas vizualiai kaskart keičiant temperatūrą – stebimas susidrumstimas, fazių atsiskyrimas ir nuosėdų susidarymas. Nepastebėjus pokyčių, mikroemulsija keliama į kitą temperatūrą.
Užšaldymo-atšildymo ciklas pradedamas šildymo-šaldymo ciklui pasibaigus ir mikroemulsijos patalpinamos į –21 °C, 4 °C, 20 °C temperatūras, kuriose laikomos ne mažiau nei 48 valandas kiekvienoje temperatūroje. Mikroemulsijų termodinaminis stabilumas remiantis homogeniškumu vertinamas analogiškai kaip šildymo-šaldymo ciklo metu – mikroemulsija turi išlikti skaidri [6, 8, 13, 19, 28, 29].
1.64.2 Vidutinis dalelių dydis ir jų pasiskirstymas
Mikroemulsijų dalelių dydis ir jų pasiskirstymas padeda įvertinti sumodeliuotų mikroemulsijų stabilumą. Dalelių dydžiui nustatyti dažniausiai naudojamas dinaminės šviesos sklaidos metodas, kurio metu mėginį apšvietus lazeriu nustatomas ir išsklaidytos šviesos intensyvumas. Taip pat šiuo metodu nustatomas ir polidispersiškumas, kuris parodo gautos sistemos homogeniškumą. Dinaminės šviesos sklaidos metodas yra patogus ir greitas, tyrimui naudojamos sąlygos neįtakoja tiriamų mėginių pokyčių ir gautus rezultatus paprasta analizuoti [18, 21].
1.64.3. Klampa, pH reikšmė ir elektrinis laidis
Mikroemulsijų kokybė vertinama atliekant klampos, pH ir elektrinio laidžio matavimus. Klampa yra svarbus rodiklis, galintis turėti įtakos mechaninėms, juslinėms savybėms ir vaistinės medžiagos atpalaidavimui, todėl tai yra svarbus kokybės rodiklis ir specifiškas pagal vaisto vartojimo būdą ir jo veikimo trukmę. Mikroemulsijų klampa, lyginant su emulsijomis, yra sąlyginai mažesnė dėl ženkliai mažesnio dalelių dydžio.
Mikroemulsijų kaip vaisto formos pH turėtų būti 2 – 11. Dėl mikroemulsijos vartojimo galimybių svarbu nustatyti pH reikšmę. Mikroemulsijų, skirtų vartoti and odos pH reikšmė turi būti rūgštinė – nuo 4 iki 6, o vartoti per odą – 5 – 7, per nosį – 4,5 – 6,5, į akį – neutralus – apie 7, į makštį – 3,8 - 4,4 [2, 6, 8, 33, 40]. Mokslininkai Agamy ir Maghramy (2015) ir Ince ir kt. (2015) pritaikė mikroemulsiją vartoti į akį, mikroemulsijų pH reikšmė 7,2 - 7,4. Nair ir kt. (2010) modeliavo mikroemulsiją su geliu, skirtą vartoti į makštį, ir jų pH reikšmė – 4,25 – 4,4. Baboota ir kt. (2012) modeliavo mikroemulsiją, skirtą vartoti ant odos, ir jos pH reikšmė – 5,5 – 6,4. Jka ir kt. (2014) sumodeliavo per burną vartojamą mikroemulsiją, kurios pH reikšmė – 7,12 ± 1,46, o Salimi ir kt. (2014) sumodeliuota mikroemulsija, taip pat vartojama per burną, pasižymėjo pH reikšmė 5,6 ± 0,1.
Elektrinis laidis mikroemulsijoms yra matuojamas norint nustatyti ir patvirtinti gautos mikroemulsijos tipą. A/v tipo mikroemulsijoms būdingas didelis elektrinis laidis (10– 100 µS/cm), o v/a tipo –ypač mažas arba sistema yra nelaidi [1, 9].
1.7.Antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių medžiagų aktyvumas mikroemulsinėse
sistemose
Kuriant įvairius farmacinius produktus ir jais siekiant apsaugoti žmogaus organizmą nuo laisvųjų radikąjų poveikio, yra atsižvelgiama į jų antioksidacinį poveikį. Nors į mikroemulsijų sudėtį dažniausiai įeinantys augaliniai aliejai, tokie kaip alyvuogių aliejus, turi nemažai antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių bioaktyvių medžiagų, tačiau jų poveikis emulsinėje sistemoje gali pakisti. Aliejinę fazę sudarantis aliejus, lyginant su grynu, dažnai yra jautresnis oksidacijos procesams, nors ir pasižymi dideliu antioksidacinių medžiagių kiekiu. Mikroemulsijos, pasižyminčios ypač mažu dalelių
dydžiu, dideliu paviršiaus ploto ir tūrio santykiu, sunkina lipidų bei vandenyje tirpių prooksidantų sąveiką, todėl oksidacijos procesas vyksta lėtai [10, 22, 26].
Antioksidacinį aktyvumą lemia didelis fenolinių junginių kiekis aliejuose. Per pastarąjį dešimtmetį atliktų tyrimų rezultatai parodė, kad antioksidacinių medžiagų molekulės, tame tarpe ir fenolinių junginių, gali sąveikauti su baltymais, sudarydamos kovalentinius kompleksus, ir taip pagerinti antioksidacines savybes [10, 22, 26]. Oksidacinį poveikį turintys junginiai gali sukelti mitochondrijų membranų depoliarizaciją sumažindami membranos potencialą ir veikdami Ca2+ jonų
ciklą ir kitus jonų kanalus, mažindami pH gradientą, sugriaudami protonų pompą ir išardydami ATP energiją. Jie gali keisti membranų pralaidumą – ji tampa labai pralaidi – ko pasekoje išteka radikalai, citochromas C, kalcio jonai ir baltymai, pavyzdžiui, oksidacinio streso ir energijos atliekos, kurios parodo farmakologinį, galimai toksinį poveikį [10, 26]. Kadangi mikroemulsijos, kaip vaisto forma apsaugo vaistines medžiagas, tuo pačiu ir natūraliame aliejuje esančius bioaktyvius junginius, tokius kaip fenoliniai junginiai, nuo oksidacijos ir fermentų poveikio, taip apsaugomas aliejus ir išsaugomas stabilumas [32].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo medžiagos ir įranga
2.1.1. Tyrimo medžiagos:
Linų sėmenų aliejus (šalto spaudimo) (Carl Roth GmbH+Co., Vokietija) Tween ® 80 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)
Tween ® 40 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)
Tween ® 20 (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)
Span ® 80 (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija)
Span ® 20 (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija)
Etanolis 96 %. V/V (Stumbras, Lietuva)
Išgrynintas vanduo (Ph.eur. 01/2008:0008, LSMU laboratorija) Chitozanas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)
Izopropilo miristatas (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija)
Polietilenglikolis (PEG 400) (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija)
Propilenglikolis (PG) (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija)
Labrasol® (kaprilo/kaprio makrogol – 8 – gliceridai) (Gattefosse, Prancūzija)
Plurol isostearique® (poligliceril -6 izostearatas) (Gattefosse, Prancūzija)
Vario (II) chlorido dihidratas (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija) Neokuproinas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija)
Amonio Acetatas (Sigma-Aldrich, Belgija)
Trolokso referentinis standartas (98%) (FlukaChemika, Šveicarija)
2.1.2. Tyrimo įranga
Analitinės svarstyklės GX — 200 — EC (A&D Instruments, Japonija) Automatinės pipetės (Transferpette, Vokietija)
Magnetinė maišyklė su kontroliuojamos temperatūros šildymo įrenginiu (MSC Basic, Yellow line by IKA®, Werke GmbH & Co. KG Staufen, Vokietija)
Dalelių dydžio matavimo analizatorius Zetasizer Nano ZS (Malvern Instuments, Jungtinė Karalystė)
Spektrofotometras Agilent 8453 UV- Vis (Agilent Technologies, JAV) Viskozimetras Vibro viscometer SV - 10 (A&D Company Limited, Japonija)
Daugiafunkcis pH – metras 766 su elektrodu Knick SE 104N (Knick Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija)
Klimatinė spinta Climacell MMM-Group (Medcenter Einrichtugen GmgH, Brno, Čekija) Klimatinė spinta Binder KBF (Binder GmbH, Vokietija)
Ultragarso homogenizatorius Bandelin Sonopuls HD 2200 (Bandelin electronic, Vokietija) Centrifūga („SIGMA3 – 18KS“, Vokietija)
Homogenizatorius Ultra Turrax (Janke&Kunkel, Vokietija)
2.3. Mikroemulsijos a/v gamybos technologijos
Mikroemulsijos buvo pagamintos naudojant išgrynintą vandenį, linų sėmenų aliejų bei įvairius surfaktantų ir kosurfaktantų mišinius. Mikroemulsijos sudėtis parinkta, naudojant surfaktantų ir kosurfaktantų mišinius skirtingomis koncentracijomis (2 lentelė).
2 lentelė. ME surfaktantų, surfaktantų ir kosurfaktantų mišiniai [2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10].
Mikroemulsija Surfaktantai/kosurfaktantaiPagalbinės medžiagos
ME1 Propilenglikol:Tween 80 1:2 ME2 Izopropilomiristatas:Tween 80 1:9 ME3 Etanolis:Tween 80 1:9
ME4 Span 80:Tween 80 3:7 ME5 Span 80:Tween 80 1:1 ME6 Propilenglikol:Tween 80 1:4 ME7 Propilenglikol:Tween 80 1:7
ME8 Tween 20
ME9 Labrasol
ME10 Labrasol:Plurol
ME11 Tween 80: Span 20 1:1
ME12 Tween 80: Span 20: Propilenglikolis 3:3:1
ME14 Tween 20: Span 20: Span 80 1:1:1
Mikroemulsijos buvo pagamintos dviem metodais:
1) Titravimo metodu – aliejinę fazę sumaišius su vandenine faze ir titruojant surfaktantu ar surfaktanto su kosurfaktantu mišiniu. Sistemos nuskaidrėjimas vertinamas kaip mikroemulsijos susidarymas;
2) Titravimo metodu su ultragarso homogenizatoriumi – aliejinę fazę sumaišius su vandenine faze ir titruojant surfaktantu ar surfaktanto ir kosurfaktanto mišiniu, kai visas mišinys po titravimo yra veikiamas ultragarso homogenizatoriumi (Bandelin Sonopuls HD 2200). Sistemos nuskaidrėjimas vertinamas kaip mikroemulsijos susidarymas.
2.4. Mikroemulsijos a/v fazių diagramos sudarymas
Mikroemulsijų a/v fazių diagramos sudarytos ME8 ir ME4 mikroemulsijoms naudojant surfaktantą Tween 20 ir surfaktanto ir kosurfaktanto Tween 80 ir Span 80, santykiu 7:3, mišinį. Pagaminti ME8 mišiniai, kuriuose išgryninto vandens ir Tween 20 santykiai buvo 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4. Sudarant fazių diagramas gamybos metodas – titravimas linų sėmenų aliejumi. Kita ME4 mikroemulsijos fazių diagrama buvo sudaryta iš linų sėmenų aliejaus ir Tween 80/Span 80 mišinio, santykiais 0,5:9,5, 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, gamybos metodas - titravimas išgrynintu vandeniu. Mišiniai stebimi vizualiai ir užrašomi sulašinto aliejaus kiekiai, kuriems esant įvyksta sistemos nuskaidrėjimas ir susidrumstimas. Apskaičiavus komponentų koncentracijas taškai atidedami fazių diagramoje.
2.5. Mikroemulsijų stabilumo ir kokybės vertinimas
Pagrindiniai dažniausiai taikomi mikroemulsijų charakterizavimo metodai yra: termodinaminio stabilumo tyrimas, mikroemulsijų fazės dalelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimas, pH reikšmės nustatymas,
klampos tyrimas, elektrinio laidžio tyrimas. Visi šie tyrimai atlikti praėjus 24 valandoms po mikroemulsijų pagaminimo, jas laikant 20±2°C temperatūroje.
2.5.1 Mikroemulsijų termodinaminio stabilumo tyrimas
Termodinaminiam stabilumo tyrimui atlikti buvo paimta po 30 ± 0,01 g tiriamųjų mikroemulsijų. Šis tyrimas buvo atliekamas 2 etapais: šildymo – šaldymo ciklas ir užšaldymo - atšildymo ciklas. Šildymo-šaldymo ciklo metu pagamintos mikroemulsijos laikomos 4 °C, 20 °C, 32 °C ir 45 °C temperatūrose ne mažiau nei 48 valandas kiekvienoje temperatūroje. Mikroemulsijų termodinaminis stabilumas remiantis homogeniškumus vertinamas vizualiai kaskart keičiant temperatūrą – stebimas susidrumstimas, fazių atsiskyrimas ir nuosėdų susidarymas. Nepastebėjus pokyčių, mikroemulsija keliama į kitą temperatūrą.
Užšaldymo-atšildymo ciklas pradedamas šildymo-šaldymo ciklui pasibaigus ir mikroemulsijos patalpinamos į –21 °C, 4 °C, 20 °C temperatūras, kuriose laikomos ne mažiau nei 48 valandas kiekvienoje temperatūroje. Mikroemulsijų stabilumas remiantis homogeniškumu vertinamas analogiškai šildymo-šaldymo ciklo metu.
2.5.1. Vidutinio dalelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimas
Mikroemulsijų fazės dalelių dydžio ir pasiskirstymo tyrimas atliktas dinaminiu šviesos sklaidos metodu. Tyrimui naudotas dalelių dydžio matavimo analizatorius Zetasizer Nano ZS (Malvern Instuments, Jungtinė Karalystė). ME dalelių dydis matuotas 173° kampu 25 °C temperatūroje.
2.5.2. pH reikšmės, elektrinio laidžio ir klampos tyrimai
pH reikšmės nustatomos potenciometriniu metodu naudojant daugiafunkcinį pH – metrą (Knick pH – Meter 766 Calimatic, Elektronische Meßgeräte GmbH & Co, Vokietija), skirtą matuoti
puskiečių sistemų pH reikšmėms. Elektrinio laidžio tyrimas taip pat buvo atliktas naudojant daugiafunkcinį pH-metrą. Prieš naudojant aparatas buvo kalibruotas naudojant distiliuotą vandenį.
Klampa nustatoma viskozimetriniu metodu, tyrimui atlikti buvo naudotas vibroviskozimetras (AND SV-10, Japonija). Kiekvienam bandymui paimta po 40 gramų pagamintų mikroemulsijų, jos supilamos į specialius indus ir nuleidžiami davikliai.
Visi matavimai atlikti praėjus 24 val. po mikroemulsijų pagaminimo. Kiekvienas matavimas atliktas 2 skirtingoms mikroemulsijų serijoms (n = 3), esant esant 20 ± 0.2°C temperatūrai.
2.5.3. Mikroemulsijų stabilumo tyrimas
Mikroemulsijų stabilumo tyrimui buvo paimti mėginiai po 30 ± 0,01 g ir laikomi sandariose talpyklėse. Mikroemulsijos buvo laikomos skirtingomis laikymo sąlygomis:
Natūraliomis sąlygomis (15–25 °C), mėginiai apsaugoti nuo šviesos;
Ilgalaikio stabilumo tyrimo sąlygomis (25 ± 2 °C temperatūra ir 60 ± 5 %. santykinė drėgmė) klimatinėje spintoje Binder KBF (Binder GmbH, Vokietija).
Mėginių stabilumas vertintas po 1 dienos ir po 1 mėnesio nuo jų pagaminimo datos matuojant vidutinį dalelių dydį (VDD), polidispersiškumą (PDI). Metodika pateikta 2.5.1 skyrelyje.
2.6. Linų sėmenų aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas
Norint nustatyti linų sėmenų aliejuje esančius fenolinius junginius buvo atlikta ekstrakcija - aliejus (2,5 g) buvo skiedžiamas 96% etanoliu (santykiu 1:1 pagal masę) ir 3 min. maišomi Ultra Turrax homogenizatoriumi ir centrifūguojami 4000 aps/min greičiu 5 minutes.
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti buvo naudojamas spektrofotometrinis metodas panaudojant Folin - Ciocalteu reagentą. Šis metodas yra pagrįstas spalvine reakcija: į 2 ml išgryninto vandens ir 1 ml Folin – CioCalteu reagento mišinį pilamas atitinkamas aliejaus etanolinio ekstrakto kiekis mikrolitrais arba mikrogramais. Pilama 1,5 ml 20 % natrio karbonato tirpalo, skiedžiama
matavimo kolbutėje iki 10 ml žymės išgrynintu vandeniu. Mišinys paliekamas 30 minučių natūralių sąlygų temperatūroje, kad įvyktų reakcija. Palyginamuoju tirpalu, matuojant absorbciją esant 765nm bangos ilgiui, naudojamas išgrynintas vanduo [23].
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (𝐺𝐴𝐸) mg/g žaliavos. Bendras fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal formulę:
𝐺𝐴𝐸 =𝐶 × 𝑉 𝑚
Kurioje 𝐶 – galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; 𝑉 – ekstrakto tūris (ml); 𝑚– atsvertas aliejaus kiekis (g).
2.7. Linų sėmenų aliejaus ir mikroemulsijų antioksidacinio aktyvumo stabilumo
nustatymas
Linų sėmenų aliejaus antioksidacinis aktyvumas buvo matuojamas vieną kartą prieš pradedant gaminti mikroemulsijas spektrofotometriniu CUPRAC tyrimo metodu. Mikroemulsijų antioksidantinio aktyvumo stabilumas buvo vertinamas praėjus 24 valandoms ir po 1 mėnesio nuo jų pagaminimo datos spektrofotometriniu CUPRAC tyrimo metodu.
Šiam tyrimui naudojamas UV spektrofotometras Agilent 8453 UV- Vis (Agilent Technologies, JAV) ir CUPRAC reagentas. CUPRAC reagento sudėtis: 1,0x10-2 M vario (II) chlorido vandeninis tirpalas, 1,0x10-3 M amonio acetato buferinis tirpalas (pH=7), 7,5x10-3 M neokuproino metanolinis tirpalas, santykiu 1:1:1. Pagaminus reagentą, jis 30 min. paliekamas tamsoje natūraliomis sąlygomis, kad įvyktų reakcija.
Į 3 ml kiuvetę įpilama 3 ml CUPRAC reagento tirpalo. Į regentu užpildytas kiuvetes automatinėmis pipetėmis įpilama po 10 µl aliejaus etanolinio ekstrakto ar mikroemulsijų. Mišiniai paliekami 60 minučių tamsoje, natūralių sąlygų temperatūroje, kad įvyktų reakcija. Spektrofotometru matuojama tiriamųjų mėginių šviesos absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu apskaičiuojamas pagal šią formulę:
𝑦 = 0,3899𝑥 + 0,0908
2.7. Statistinė analizė
Tyrimų duomenys apdoroti naudojant Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, JAV), ir „SPSS 20“ (IBM, JAV) programomis. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN), statistinis patikimumas (p<0,05), Spearman‘o korealiacijos koeficientas. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas jeigu p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Mikroemulsijų gamybos būdo parinkimas
Gamybos būdo atranka buvo atlikta tyrimams pasirinkus bandomąjį mėginį, sudarytą iš linų sėmenų aliejaus, išgryninto vandens ir surfaktanto Tween 80 ir kosurfaktanto Span 80, santykiu 9:1. Tiriamas mėginys buvo gamintas dviem būdais: titravimo Tween 80 ir Span 80 mišiniu, santykiu 9:1, ir titravimo tuo pačiu mišiniu, veikiantultragarso homogenizatoriumi.
Gamybos būdas buvo atrinktas pagal gautų mikroemulsijų vidutinį dalelių dydį (VDD) ir polidispersiškumą (PDI) praėjus 24 val. po pagaminimo. Pagal gautus duomenis (3 lentelė) mikroemulsijos, pagamintos panaudojant ultragarso homogenizatorių, suteikia geresnius rezultatus nei gamyba titravimu (p<0,05).
3 lent. Mikroemulsijos dalelių dydžio priklausomybė nuo gamybos būdo, (vid.±SP, n꓿3)
Surfaktantasi/kosurfaktantasi Gamybos būdas VDD, nm Polidispersišk umas PDI Span 80/Tween 80 1:9 (ME5) titravimas+ultragarsa
s 100%×30s*7 548,7±55,65 0,547±0,064 titravimas+ultragarsa s 50%×30s*7 577,0±133,2 0,861±0,24 titravimas+ultragarsa s 30%×30s*7 907,4±126,1 0,648±0,046 titravimas+ultragarsa s 100%×30s*3 966,5±113,5 0,698±0,176 titravimas+ultragarsa s 100%×30s*5 679,4±184,5 0,601±0,104 titravimas+ultragarsa s 100%×30s*10 - - titravimas 1332±304,3 0,862±0,058
Gaminant mikroemulsiją titravimo su ultragarso homogenizatoriumi būdu, svarbu atrinkti tinkamiausią gamybos metodą. Mikroemulsija gali būti veikiama skirtingu ciklų skaičiumi ar skirtingu stiprumu pagal sekundės dalį, kai mėginys yra veikiamas ultragarsu – 30%, 50% ar 100% (visą sekundę).
Šiame etape buvo vykdoma atranka pagal sekundės dalį. Bandinyje, kuris buvo veikiamas 30%/sek., gauta sistema buvo ženkliai tirštesnė nei kitų mėginių, todėl ir gauti VDD ir PDI rezultatai statistiškai reikšmingai skiriasi – yra didesni (3 lent.). Pagal gautus duomenis matome, jog mažiausias VDD ir PDI yra gaunamas kai ultragarso homogenizatorius yra naudojamas 100% sekundės dalies (p<0,05).
Atrinkus gamybos būdą, kai bandinys yra veikiamas 100% sekundės dalies cikle, buvo atlikta atranka pagal ciklų skaičių (3 lentelė). Bandiniai buvo veikiami 3, 5, 7 ir 10 ciklų 100%/30 sek. Atlikus 10 ciklų gautame bandinyje atsiskyrė fazės, todėl nepavyko pamatuoti VDD ir PDI. Taip įvyko todėl, jog mėginys per daug užkaito ir natūralaus aliejaus stabilumas buvo pažeistas. Atlikus 3 ciklus
gautas mėginys buvo akivaizdžiai tirštesnis, kas ir nulėmė didesnius VDD ir PDI rezultatus. Būdas, kai mėginys buvo 7 ciklus 100%/30 sek. veikiamas ultragarso homogenizatoriumi yra tinkamiausias lyginant pagal rezultatus (p<0,05).
4 pav. Mikroemulsijų gamybos metodo atranka – ME5, pagaminta skirtingais ultragarso homogenizatoriaus veikimo intervalais ir skirtingu ciklų skaičiumi.
3 lentelėje matoma, kad kuo ilgiau veikiant ultragarso homogenizatoriumi, tuo mažesnis VDD, tai reiškia, jog mikroemulsija stabilesnė, ir mažesnis PDI – homogeniškesnė. Todėl mikroemulsijų gamybai kaip tinkamesnis būdas pasirinktas titravimo surfaktantu ar su kosurfaktantu mišiniu, veikiant ultragarso homogenizatoriumi 100% po 30 sek. 7 ciklus, atliekant pertraukas po kiekvieno ciklo po 30 sek. (4 pav.).
Titravimo su ultragarso homogenizatoriumi gamybos būdą pagal mokslinius šaltinius mikroemulsijai su linų sėmenų aliejumi naudojo Hosseini ir kt. (2015). Šie mokslininkai naudojo Tween 80 ir Span 60, kaip surfaktantą ir kosurfaktantą, ir gauti VDD yra 72±5,14 nm – atitinka mikroemulsijoms, su natūraliais aliejais keliamus reikalavimus (10-200nm). Ir nors šie mokslininkai straipsnyje ir neatskleidė tikslios mikroemulsijos sudėties, kitame tyrime mokslininkai Xavier-Junior ir kiti (2016), pagaminę mikroemulsiją su kopaibų aliejumi, teigia, jog šis gamybos būdas padeda naudoti mažiau surfaktantų, kas padidina mikroemulsijų vartojimo galimybes ne tik odai, bet ir oraliai ar parenteraliai, nes atsiranda galimybė sumažinti toksinių poveikių pasireiškimą dėl sudėtyje esančių nenatūralių surfaktantų, ir padidinti natūralių aliejų kiekį sudėtyse, taip padidinant ir bioaktyvių medžiagų koncentraciją vaisto formoje.
Lyginant gautais rezultatais galima daryti išvadą, jog tinkamas gamybos būdas, remiantis mažesniu VDD ir PDI yra titravimas kartu su ultragarso homogenizatoriumi, kai mėginys veikiamas 100% 30 sek. 7 ciklus. Tolimesniems tyrimams pasirinktas titravimo gamybos metodas, kuris yra populiariausias iš gamybos metodų. Mokslininkai Hosseini ir kt. (2015) ir Xavier-Junior ir kt. (2016) mikroemulsijų gamyboje taip pat panaudojo ultragarso homogenizatorių, jų gauti dalelių dydžiai atitinkamai 72 ± 5,14 nm (naudoti surfaktantai Tween 80 ir Span 60) bei 42 ± 0,5 nm (panaudojus Brij ir Pluronic) ir 95 ± 10 nm (panaudojus Brij ir Tween 20). Abiejuose tyrimuose mokslininkai naudojo augalinius aliejus ir jiems pavyko pagaminti mikroemulsijoms keliamus reikalavimus atitinkančias mikroemulsijas. Šiame tyrime gauti rezultatai tik patvirtina šio gamybos metodo patikimumą.
3.2. Surfaktantų bei surfaktantų ir kosurfaktantų ir jų santykio įtakos
mikroemulsijų vidutiniam fazės dalelių dydžiui ir polidispersiškumui vertinimas.
Siekiant parinkti mikroemulsijų sudėtį, t.y. nustatyti tinkamus surfaktantų/kosurfaktantų mišinius, mikroemulsijos buvo gaminamos titravimo būdu, naudojant skirtingus surfaktantų ir kosurfaktantų mišinius. Buvo matuojamas dalelių dydis bei polidispersiškumas ir stebima priklausomybė (5 pav.).
5 pav. Surfaktantų/kosurfaktantų mišinio atranka pagal gautų mikroemulsijų dalelių dydį ir polidispersiškumą, (vid.±SP, n꓿3).
Pagal gautus duomenis – mikroemulsijų dalelių dydį ir polidispersiškumą - buvo atrinktos dviejų sudėčių mikroemulsijos: su surfaktantų Span 80/Tween 80 mišiniu santykiu 3:7 (ME4) ir Tween 20 (ME8). Mėginys ME2 gautas puskietės konsistencijos ir neišmatuotas dalelių dydis bei polidispersiškumas. Nepasiektas būdingas dalelių dydis mikroemulsijoms emulsijose ME6, ME9, ME10, ME13, ME14. Gautų sistemų su surfaktantų mišiniais ME1, ME3, ME4, ME5, ME7, ME11, ME12 išmatuoti dalelių dydžiai yra per dideli (>200 nm), polidispersiškumas per aukštas (>0,5) – nebūdingi mikroemulsinėms sistemoms ir neatitinka reikalavimų.
Apibendrinant galima teigti, jog mikroemulsijų dalelių dydis yra stipriai įtakojamas surfaktantų ir kosurfaktantų pasirinkimo. Skirtingi augaliniai aliejai taip pat turi įtakos VDD. Mokslininkai Hosseini ir kt. (2015) mikroemulsijai taip pat panaudojo linų sėmenų aliejų, tačiau kitus surfaktantų mišinius – Tween 80 ir Span 60. Jų sistemos gautas VDD - 72 ± 5,14 nm. Kiti mokslininkai Jha ir kt. (2014) mikroemulsijų gamybai panaudojo alyvuogių aliejų ir surfaktantą Tween 80 bei kosurfaktantą PEG 400. Gautos mikroemulsijos VDD 170,1 ± 1 nm. Pagal lyginamus kitų mokslininkų gautus duomenis, dar kartą galima patvirtinti, jog atrinktos ME4 ir ME8 sudėtys yra tinkamos mikroemulsinei sistemai su linų sėmenų aliejumi ir būtini tolimesni tyrimai.
ME1 ME3 ME4 ME5 ME7 ME8 ME11 ME12
VDD, nm 830.1 1032 15.34 548.7 679.4 178.4 1553 1101 PDI 0.799 0.773 0.39 0.547 1 0.225 0.643 0.503 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 P DI VD D, n m
3.3. Mikroemulsijų a/v fazių diagramos duomenų analizavimas
Atrinktoms pagal VDD ir PDI mikroemulsijoms - ME4 ir ME8 - sudarytos fazių diagramos (6 pav. ir 7 pav.) leidžia matyti mikroemulsijų susiformavimo ribas, atskirti tarpfazinius perėjimus mikroemulsijose. Fazių diagramos su kitais analizės metodais padeda įvertinti ir nustatyti mikroemulsijos komponentų koncentracijas.
6 pav. ME8 mikroemulsijos fazių diagrama, kai surfaktantas Tween 20
7 pav. Mikroemulsijos ME4 fazių diagrama, kai kaip surfaktantas ir kosurfaktantas naudojamas Tween 80 ir Span 80, santykiu 7:3.
Pavaizduotose fazių diagramose apibrėžta sritis reprezentuoja skaidrią sistemą, kuri vertinama kaip mikroemulsijos susiformavimo ribos. Už mikroemulsijų susidarymo ribų susiformuoja emulsijos, drumsti koloidiniai tirpalai. Fazių diagramoje nepastebimi tarpfaziniai perėjimai.
Gauti duomenys, sudarius fazių diagramas, parodė, jog didėjant vandens kiekiui, mažėjant pagalbinių medžiagų kiekiams, mažėja sistemos gebėjimas inkorporuoti didesnį aliejinės fazės kiekį. Pagal gautas diagramas galima teigti, jog ME8 (6 pav.) mikroemulsijos susiformavimo ribų plotas yra didesnis (p<0,05) ir ši mikroemulsija turi didesnę toleranciją kiekybiniams pokyčiams nei ME4 (7 pav.).
Eksperimentiškai pagaminus mikroemulsiją yra būtina sudaryti fazių diagramą, tam, kad būtų nustatytos mikroemulsijų susidarymo ribos ir tolerancija kiekybiniams pokyčiams. Jei mikroemulsijos susidarymo ribos yra mažos, ją pagaminti reikės ypač didelio tikslumo. Tam šį tyrimą atliko ir kiti mokslininkai, tokie kaip Haroon ir kt. (2015) – šių mokslininkų gautos fazių diagramos yra tolerantiškesnės sistemos sudėties pokyčiams – sistemos ribų plotas yra mažesnis, tačiau sistemoje naudota aliejinė fazė – eukalipto aliejus, o Jha ir kt. (2010), panaudoję alyvuogių aliejų kaip aliejinę fazę, gavo didesnį sistemos ribų plotą, lyginant su atliktais šiame tyrime. Norint įrodyti abiejų mikroemulsijų kokybę, buvo atlikti tyrimai, padendantys charakterizuoti mikroemulsiją – termodinaminio stabilumo tyrimas, VDD ir PDI nustatymas, pH, elektrinio laidžio ir klampos tyrimai.
3.4. Linų sėmenų aliejaus a/v mikroemulsijos kokybės ir stabilumo vertinimas
3.4.1. Mikroemulsijos termodinaminio stabilumo tyrimas
Pagal VDD ir PDI atrinktoms mikroemulsijoms ME4 ir ME8 termodinaminio stabilumo tyrimas atliktas taikant šildymo-šaldymo ir užšaldymo - atšildymo ciklus. Mikroemulsijos buvo vertinamos vizualiai po šildymo-šaldymo bei užšaldymo-atšildymo ciklų. Termodinaminio stabilumo tyrimams buvo paimta po po 30 ± 0,01 g tiriamųjų mėginių
Šildymo – šaldymo ciklo metu mikroemulsijos buvo laikomos laikomos 4 °C, 20 °C, 32 °C ir 45 °C temperatūrose ne mažiau nei 48 valandas kiekvienoje temperatūroje. 45 °C temperatūroje ME8 išsisluoksniavo, tačiau perkėlus mikroemulsiją į natūralias sąlygas ji vėl tapo skaidri – tai yra vienas iš mikroemulsijų privalumų, todėl ši mikroemulsija buvo toliau tiriama ir užšaldymo-atšildymo ciklo metu.
Užšaldymo-atšildymo ciklo metu šildymo-šaldymo ciklui pasibaigus mikroemulsijos buvo patalpintos į –21 °C, 4 °C, 20 °C temperatūras, kuriose laikomos ne mažiau nei 48 valandas kiekvienoje temperatūroje. Šio ciklo metu abi mikroemulsijos išliko skaidrios, kas parodė jų stabilumą.
Remiantis šiais tyrimo rezultatais, galima teigti, jog sumodeliuotos mikroemulsijos yra termodinamiškai stabilios, todėl buvo atliekami tolesni tyrimai. Šis tyrimas yra ypač svarbus norint įrodyti, jog pagaminta sistema yra mikroemulsija, nes vienas iš pagrindinių reikalavimų mikroemulsijoms – tai turi būti termodinamiškai stabili sistema. Dėl šios priežasties termodinaminio stabilumo tyrimas yra vienas iš dažniausių, kuriuos galima atrasti mokslininkų tyrimuose, kurie modeliavo mikroemulsijas – šį tyrimą atliko ir Patel ir kt. (2012), modeliavę mikroemulsijas su alyvuogių, kokosų ir ricinos aliejais, Jha ir kt. (2010) – su alyvuogių aliejumi, ir Pessoa ir kt. (2015) – jų aliejinę fazę sudarė atalių aliejus. Šias mikroemulsijas su natūraliais aliejais modeliavusiems mokslininkams pavyko sumodeliuoti termodinamiškai stabilias sistemas.
3.4.2 Mikroemulsinių vidutinio dalelių dydžio ir pasiskirstymo analizė a/v
mikroemulsijose
Mikroemulsijoms atliekamas VDD tyrimas įrodo sistemos stabilumą, o PDI – homogeniškumą, todėl atrinktoms mikroemulsijoms ME4 ir ME8 buvo atliekami šie matavimai. Norint gauti tikslesnius rezultatus, mikroemulsijos buvo tirtos jas praskiedus išgrynintu vandeniu 1:50.
Fazės dalelių dydžio pasiskirstymo pagal intensyvumą diagramos ir polidispersiškumo nustatymas leidžia tiksliau įvertinti sumodeliuotų mikroemulsijų dalelių dydžio pasiskirstymo intervalą kartu su išbarstymo pločiu. Dalelių dydžio pasiskirstymo pagal intensyvumą smailės ME4 ir ME8 pavaizduotos 8 ir 9 paveiksluose.
9 pav. Fazės dalelių dydžio pasiskirstymas Tween 20 (ME8)
8 ir 9 paveiksluose pavaizduotose diagramose mMatomos smailės (8 ir 9 pav.) parodo dalelių dydžio pasiskirstymo intervalą. ME4 (8 pav.) dalelės yra pasiskirsčiusios dviejose smailėse – tai parodo, jog sistemoje esančios dalelės yra įvairaus dalelių dydžio, tačiau vyrauja dalelių dydis, kurio smailė aukščiausia – apie 10 nm. Todėl šios sistemos vidutinis dalelių dydis – 14,42 ± 0,029 nm. ME8 (9 pav.) dalelių dydis yra pasiskirstęs vienoje smailėje, VDD - 153,0 ± 1,153 nm.
4 lent. Mikroemulsijų su Tween 20 (ME8) ir Tween 80 kartu su Span 80, santykiu 7:3 (ME4), dalelių dydžio matavimo rodmenys
Mikroemulsija Gamybos
būdas VDD, nm PDI
ME8 Titravimo 153,0±1,153 0,284±0,012
ME4 Titravimo 14,42±0,029 0,458±0,002
Remiantis gautais duomenimis (4 lent.), abi mikroemulsijos su natūraliais aliejais atitinka joms keliamus reikalavimus reikalavimus – vidutinis dalelių dydis mažesnis nei 200 nm, polidispersiškumas – iki 0,5. Tačiau statistiškai reikšmingai (p<0,05) geresnius rezultatus lyginant dalelių dydį, kuris nurodo sistemos priskyrimą mikroemulsijoms ir atspindi stabilumą, parodė ME4. Baboota ir kt. (2012) modeliuodami mikroemulsiją su linų sėmenų aliejumi, panaudojo kitus S/KoS mišinius – Unitop 100 ir PEG 400. Šių mokslininkų tyrime gautas VDD yra 186 nm ir nors šis VDD atitinka mikroemulsijoms keliamus reikalavimus, tačiau dalelių dydis yra statistiškai reikšmingai didesnis nei ME4 ir ME8, kas įrodo, jog šiame tyrime sumodeliuotos ir atrinktos mikroemulsijos yra stabilesnės, didesnis paviršiaus ploto ir tūrio santykis – geresnė absorbcija ir biologinis pasisavinimas. Polidispersiškumo indeksas nurodomas matavimo metu parodo duomenų patikimumą, dalelių dydžio pasiskirstymo pagal išsklaidytos šviesos intensyvumo piką, kuris turėtų būti vienas ir kuo siauresnis, jog būtų galima teigti, jog sistema monodispersiška [36]. Įvertinus polidispersiškumą, kuris sistemoje įrodo mikroemulsijos homogeniškumą ir stabilumą, galima teigti, jog dalelės yra
pasiskirsčiusios mikroemulsijoms būdingame dydžių intervale 0,01 - 0,5 [23]. Dėl ME4 dalelių dydžio pasiskirstymo diagramoje matomų 2 pikų (8 pav.), šios sistemos polidispersiškumo indektas yra didesnis (p<0,05) lyginant su ME8 >0,4, todėl galima teigti, jog ME4 pasižymi bidispersiškumu – tai galėjo įtakoti ir netinkamai parinktas S/KoS santykis, S/KoS ir aliejinės fazės santykis, per didelė vandens koncentracija. Tačiau atliktų termodinaminio stabilumo tyrimų metu tiek ME4, tiek ME8 išliko stabilios, nes PDI buvo nuo 0,284 iki 0,458 – atitinkantis mikroemulsijoms keliamus reikalavimus (4 lent.), todėl galima teigti, jog šios sistemos yra pakankamai homogeniškos ir stabilios.
3.4.3. Mikroemulsijų pH reikšmės, elektrinio laidžio ir klampos vertinimas
Mikroemulsinėje sistemoje svarbu nustatyti pH reikšmę, kuri lemia vaisto formos panaudojimą ir šalutinių poveikių, pvz. tokių kaip odos dirginimas, išvengimą. Mikroemulsijų pH reikšmę lemia surfaktantai ir kosurfaktantai, tačiau ją galima koreguoti buferinėmis sistemomis. Pagamintų mikroemulsijų pH reikšmė buvo vertinamas įdedant matavimui skirto aparato galvutę į mikroemulsijas. Gauti duomenys išreikšti lentelėje žemiau (5 lentelė).
5 lentelė. Mikroemulsijų kokybiniai rodikliai (vid.±SP, n꓿3)
Kokybiniai rodikliai ME8 ME4 pH reikšmė 8,59 ± 0,03 8,74 ± 0,05 Elektrinis laidis (μS) 10,4 ±0,1 11,3 ±0,6
Klampa (mPa·s) 440 ± 5,1 820 ± 4,8
Pagal lentelės duomenis (5 lent.) matome, jog šių mikroemulsijų pH reikšmė yra didesnė nei 6,5, todėl jos nėra tinkamos vartoti ant odos ar per odą, į nosį, į akį, ar į makštį. Tačiau vartojimui oraliai šių mikroemulsijų pH reikšmė yra tinkama.
Klampos tyrimas parodė, jog mikroemulsijų su skirtingais surfaktantais – Tween 20 ir Tween 80 kartu su Span 80 - kurių klampa skiriasi (p<0,05), bet su vienodu aliejaus ir vandens kiekiu klampa skiriasi reikšmingai – ME8 su Tween 20 yra beveik dvigubai (p<0,05) skystesnė lyginant su ME4 su Tween 80 ir Span 80. Tai įtakoja Span 80 tiršta konsistencija – jo klampa 1000-2000 mPa·s esant 20°C (5 lentelė), o Tween 80 taip pat tirštesnis už Tween 20 - 400 – 620 mPa·s esant 20°C [38,
39]. Tai matoma ir vizualiai. Tačiau abiejų mikroemulsijų sudėčių klampa yra nedidelė, tai didina mikroemulsijos stabilumą. Baboota ir kt. (2012), modeliuodami mikroemulsiją su linų sėmenų aliejumi, tačiau kaip surfaktantą ir kosurfaktantą naudodami Unitop 100 ir PEG 400, gavo itin skystą mikroemulsiją - 12.77±0.88 mPa·s. Šie duomenys tik įrodo, jog didžiausią įtaką klampai turi surfaktantai ir kosurfaktantai.
Pagaminus mikroemulsijas elektrinis laidis buvo matuojamas tam skirto aparato galvutę įdėjus į mikroemulsijas. Dažniausiai modeliuojamos mikroemulsijos su augaliniais aliejais yra a/v tipo [1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 33, 40, 41]. Šio tyrimo gauti duomenys (5 lentelė) tik įrodo, jog šios mikroemulsijos – ne išimtis. Remiantis elektriniu laidžiu galima teigti, jog abi gautos mikroemulsijos yra aliejus vandenyje tipo [5].
3.5. Linų sėmenų aliejaus ir jo mikroemulsijų a/v antioksidacinio aktyvumo
tyrimas
Augalinių aliejų sudėtyje esančios natūralios bioaktyvios medžiagos skatina juos naudoti farmacinių produktų kūrime. Antioksidacinis veikimas, kurį sukelia aliejuje esantys fenoliniai junginiai, yra pageidautinas farmakologinis veikimas visoms vaistų formos. Dėl šios priežasties mikroemulsijos aliejinei fazei buvo pasirinktas natūralus aliejus - linų sėmenų aliejus. Norint nustatyti linų sėmenų aliejaus antioksidantinį aktyvumą, buvo atliekamas bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas. Taip pat, norint nustatyti vaisto formos įtaką antioksidantiniam aliejaus aktyvumui, buvo tiriama ir mikroemulsija su linų sėmenų aliejumi ir įvertintas antioksidantinio poveikio stabilumas mikroemulsijas laikant skirtingomis aplinkos sąlygomis.
3.5.1. Linų sėmenų aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio
aktyvumo nustatymas
Bendras fenolinių junginių kiekis linų sėmenų aliejaus etanoliniame ekstrakte buvo nustatomas spektrofotometrijos būdu, panaudojant Folin - Ciocalteu reagentą. Iš to matyti, jog linų sėmenų aliejus kaupia labai nedidelį fenolinių junginių kiekį (6 lentelė) lyginant su kitų autorių tirtu
alyvuogių aliejumi (2,63 ± 0,24 mg/g), kuris yra ko ne didžiausią fenolinių junginių kiekį kaupiantis aliejus [25, 26].
6 lentelė. Linų sėmenų aliejaus bendro fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas
Tiriamasis parametras: Linų sėmenų aliejus Bendras fenolinių junginių kiekis, mg/g 0,25±0,05
Antioksidacinis aktyvumas, mg/g 1,58±0,12
Nepaisant nedidelio fenolinių junginių kiekio linų sėmenų aliejuje, jam yra būdingas antioksidantinis aktyvumas.
3.5.2. Mikroemulsijų a/v su linų sėmenų aliejumi antioksidacinio aktyvumo ir jo
bei mikroemulsijos stabilumo vertinimas
Norint įvertinti mikroemulsijos įtaką linų sėmenų aliejaus antioksidacinio aktyvumo stabilumui buvo pagamintos dvi skirtingų sudėčių mikroemulsijos ME4 ir ME8 (1 lentelė). Mikroemulsijos buvo laikomos 1 mėnesį natūralių sąlygų temperatūroje (15 - 20 °C) tamsoje ir ilgalaikio stabilumo tyrimo sąlygomis (klimatinėje spintoje esant 25 ± 2°C temperatūroje ir 60 ± 5% santykinei drėgmei). Mėginiai tyrimams buvo imami po 24 val ir po 1 mėnesio nuo mikroemulsijų pagaminimo.
10 pav. Skirtingų laikymo sąlygų įtaka linų sėmenų aliejaus a/v mikroemulsijos antioksidaciniam
aktyvumui
Ištyrus abiejų sudėčių mikroemulsijas paaiškėjo, jog ME4, kurioje buvo naudojamas Tween 80 ir Span 80, statistiškai reikšmingai pasižymi didesniu antioksidantiniu (10 pav. ) aktyvumu negu ME8, kurioje naudojamas Tween 20. Taip pat skiriasi ir jų gebėjimas stabilizuoti linų sėmenų aliejaus antioksidacinį aktyvumą (p<0,05). Lyginant antioksidacinio aktyvumo pirmines reikšmes su rezulatais, gautais po 1 mėn. natūraliomis sąlygomis nustatyta, jog antioksidacinis aktyvumas ME8 sumažėja 14,11%, ME4 – apie 4%, o po 1 mėn. ilgalaikio stabilumo sąlygomis – ME8 - apie 20,7%, ME4 – 6,8%.
Norint palyginti mikroemulsijoje esančių pagalbinių medžiagų poveikį linų sėmenų aliejaus antioksidaciniam aktyvumui, buvo perskaičiuotas emulguoto linų sėmenų aliejaus antioksidacinis aktyvumas ME4 ir ME8 mikroemulsijose (7 lent.). Gauti duomenys rodo, jog aliejaus antioksidacinis aktyvumas sumažėja statistiškai reikšmingai. Lyginant mikroemulsijose naudotų surfaktantų poveikį antioksidaciniam aktyvumui taip pat yra statistiškai reikšmingi skirtumai – Tween 80 ir Span 80 sumažino antioksidacinį aktyvumą mažiau nei Tween 20.
7 lentelė. Linų sėmenų aliejaus ir emulguoto linų sėmenų aliejaus antioksidacinio aktyvumo palyginimas
Tiriamasis parametras Linų sėmenų aliejus ME4 ME8 Antioksidacinis aktyvumas, mg/g 1,58 ± 0,12 1,44 ± 0,09 1,34 ± 0,11 0,102 0,061 0,098 0,053 0,095 0,049 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 ME4 ME8 S tandar to trolakso ko nce nt ra cij a
