LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
EGIDIJUS ŠALKAUSKAS
FLAVONOIDŲ, FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKYBINIS
NUSTATYMAS IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
TYRIMAS VAISTINIŲ MEDETKŲ
(CALENDULA OFFICINALIS L.) ŽIEDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
doc. dr. Audronis Lukošius
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
FLAVONOIDŲ, FENOLINIŲ JUNGINIŲ KIEKYBINIS
NUSTATYMAS IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO
TYRIMAS VAISTINIŲ MEDETKŲ
(CALENDULA OFFICINALIS L.) ŽIEDUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovas:
doc. dr. Audronis Lukošius
Darbą atliko: Magistrantas
Egidijus Šalkauskas
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 PADĖKA ... 8 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13
1.1 Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) morfologiniai požymiai, kokybės reikalavimai ir paplitimas gamtoje... 13
1.2. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) cheminė sudėtis ... 14
1.3.1 Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) farmakologinės savybės ... 15
1.3.1 Priešvėžinio aktyvumo vertinimas in vitro ... 16
1.3.2 Vaistinių medetkų poveikis gydant gingivitą ... 17
1.3.3 Medetkų poveikis oksidaciniam stresui ir kepenų pažeidimui, kuris buvo sukeltas aflatoksino ... 19
1.3.4 Žaizdų gydymas, naudojant medetkų preparatus ... 20
1.4. Fenolinių junginių apžvalga ... 21
1.5 Flavonoidų apžvalga ... 21
1.6 Flavonoidų medicininė reikšmė ... 22
1.6.1 Hepatoprotekcinis poveikis ... 23
1.6.2 Antibakterinis poveikis ... 23
1.6.3 Antiuždegiminis poveikis ... 23
1.6.4 Antivėžinis poveikis ... 24
1.7 Antioksidacinis poveikis ir jo įvertinimas ... 24
1.8 Fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymo metodai ... 25
1.8.1 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 26
1.8.2 Spektrofotometrija ... 27 1.8.3 Kapiliarinė elektroforezė ... 27 2. TYRIMO METODIKA ... 28 2.1 Tyrimo objektas... 28 2.2. Reagentai ... 28 2.3. Aparatūra ... 29 2.4 Tyrimų metodai ... 29
2.4.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas ... 29
2.4.2 Spektrofotometriniai metodai ... 30
2.4.2.1 Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu. ... 30
2.4.2.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu. ... 31
2.4.2.3 Bendras flavonoidų kiekio išreikšto hiperozidu, nustatymas pagal Europos
farmakopėjoje aprašytą metodiką... 33
2.4.2.4 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH (2,2-difenil-1-pikrihidrazil hidrato) radikalų surišimo metodą. ... 34
2.5 Statistinė duomenų analizė ... 35
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 36
3.1 Skirtingose kultivavimo vietose rinkti vaistinių medetkų žiedai ... 36
3.2 Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 36
3.2.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas vaistinių medetkų žiedų ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu. ... 37
3.2.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas vaistinių medetkų žiedų ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu. ... 38
3.2.3 Bendras flavonoidų kiekio išreikšto hiperozidu, nustatymas pagal Europos farmakopėjoje aprašytą metodiką... 39
3.2.4 Bendro Flavonoidų kiekio, nustatyto dviem skirtingais spektrofotometriniais metodais, rezultatų palyginimas. ... 40
3.2.5 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas vaistinių medetkų žiedų ekstraktuose. ... 41
IŠVADOS ... 43
PRIEDAI ... 44
SANTRAUKA
Egidijaus Šalkausko magistro baigiamojo darbo mokslinis vadovas doc. dr. Audronis Lukošius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. Kaunas.
Šio darbo tiriamasis objektas buvo vaistinė medetka (Calendula officinalis L.). Tai vienmetis, žolinis, priklausantis astrinių šeimai (Asteraceae) augalas, 30 - 40 cm aukščio, stačiu, šakotu, apaugusiu plaukeliais stiebu. Šis gerai žinomas augalas pasižymi baktericidinėmis savybėmis: iš medetkų žiedų pagamintu nuoviru skalaujama gerklė, sergant angina ar kitomis uždegiminėmis ligomis. Tepalais ir tinktūromis išoriškai gydomos sunkiai gyjančios žaizdos ir nudegimai. Medetkų preparatai pasižymi spazmolitinėmis, tulžį varančiomis, antiseptinėmis ir uždegimą slopinančiomis savybėmis.
Šio darbo tikslas – nustatyti flavonoidų, fenolinių junginių kiekį ir antioksidacinį aktyvumą vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žieduose. Vaistinė augalinė žaliava buvo kultivuojama skirtinguose Lietuvos miestuose ir miesteliuose (įvairiuose regionuose), siekiant įvertinti sukauptų biologiškai aktyvių medžiagų skirtumus. Bendras flavonoidų, fenolinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvumas buvo nustatomas spektrofotometriniu metodu. Gauti duomenys buvo lyginami su kituose regionuose surinktos žaliavos duomenimis.
Vaistinių medetkų cheminė sudėtis – karotinoidai, likopinas, karotinas, violaksantinas, rubiksantinas, vitaminas C, flavonoidai, fenolkarboninė rūgštis, gleivės, saponinai, polisacharidai. Randami eterinio aliejaus pėdsakai: mentonas, izomentanas, kariofilenas, karvonas.
Didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas Navickų kaime, Alytaus rajone rinktoje žaliavoje (22,03 GRE mg/g). Šiek tiek mažesni rezultatai gauti Utenos (18,2 GRE mg/g) ir Kauno botanikos sode (17,13 GRE mg/g) rinktoje augalinėje žaliavoje. Didžiausias flavonoių kiekis buvo nustatytas Navickų kaime, Alytaus rajone (25,37 RE mg/g), Laugalių kaime, Klaipėdos rajone (24,03 RE mg/g) ir Kartenos miestelyje, Kretingos rajone (22,57 RE mg/g). Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Utenoje rinkti medetkų žiedai (22,6 RE mg/g). Šiek tiek mažesnis aktyvumas nustatytas Navickų kaime, Alytaus rajone (17,1 RE mg/g), Laugalių kaime, Klaipėdos rajone (16,97 RE mg/g) ir Dyviliškių kaime, Lazdijų
rajone (16 RE mg/g) rinktoje vaistinėje augalinėje žaliavoje. Antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo bendro fenolinių junginių kiekio.
SUMMARY
Our work was to examine marigold flowers (Calendula officinalis L.). This yearling herbaceous plant belongs to Asteraceae family. It is 30 - 40 cm tall, erect, branched, overgrown hairs mast. This well-known plant has bactericidal properties: decoction made of marigold flowers is used to rinse throat angina, or other inflammatory diseases. Ointments and tinctures are used externally to treat hard-healing wounds and burns. Preparations of this plant have antiseptic, anesthetic, inflammation – inhibiting, the driving bile properties.
The aim of this job was to determine flavonoids, phenolic compounds and antioxidant activity of marigold (Calendula officinalis L.) flowers. Marigold flowers were collected at different flowering period, at different Lithuanian places to assess the accumulated material differences. Flavonoids, phenolic compounds and antioxidant activity was determined using spectrophotometric method. Results were compared with other Marigold flowers results from other regions.
The chemical composition of marigold - carotenoids, lycopene, carotene, violaxanthin, rubixanthin, vitamin C, flavonoids, phenolcarbonic acid, mucus. Found traces of essential oil: menton, isomentane, caryophyllene, carvone, saponins, polysaccharides.
The highest content of total phenolic compounds were determined in Navicku village in Alytus collected marigold flowers (22,03 GRE mg/g). Second and third place by results belonged to Utena (18,2 GRE mg/g) and Kaunas botanic garden (17,13 GRE mg/g) plants. The highest content of total flavonoids compounds were determined in Navicku village in Alytus (25,37 RE mg/g), Laugaliu village in Klaipeda (24,03 RE mg/g) and Kartena town in Kretinga (22,57 RE mg/g). Highest antioxidant activity was found in Utena (22,6 RE mg/g), Navicku village in Alytus (17,1 RE mg/g), Laugaliu village in Klaipeda (16,97 RE mg/g) and Dyviliskiu village in Lazdijai (16 RE mg/g) marigold flowers. Antioxidant activity is dependent on the total amount of phenolic compounds.
PADĖKA
Labai norėčiau padėkoti darbo vadovui doc. dr. Audroniui Lukošiui už visas reikalingas konsultacijas, vertingus patarimus ir pagalbą.
SANTRUMPOS
ABTS (angl. 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)),
2,2' azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
AFS aflatoksinai
BMR branduolinis magnetinis rezonansas
BoP (angl. bleeding on probing) kraujavimo iš dantenų indeksas CUPRAC (angl. cupric reducing antioxidant capacity) vario redukcijos
antioksidantinė galia
DPPH 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas FC Folin-Ciocalteu reagentas
FRAP (angl. ferric reducing antioxidant power) geležies jonų redukcijos
antioksidacinės galios tyrimas
GI (angl. gingival index) dantenų indeksas GRE galo rūgšties ekvivalentas
HE hiperozido ekvivalentas
ME medetkų ekstraktas
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolino bromidas
OM (angl. oropharyngeal mucositis) burnos ir ryklės gleivinės uždegimas
OMAS (angl. oral mucositis assessment scale) burnos gleivinės vertinimo skalė PI (angl. plaque index) apnašų indeksas
Ph. Eur. Europos farmakopėja R2 regresijos koeficientas
RE rutino ekvivalentas
RNS (angl. Reactive nitrogen species) reaktyvios azoto formos ROS (angl. Reactive oxygen species) reaktyvios deguonies formos SSN santykinis standartinis nuokrypis
UV ultravioletinės šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Vaistinė medetka paplitusi Centrinėje ir Pietų Europoje (ypač Viduržemio jūros regione), taip pat Artimuosiuose Rytuose. Viduramžiais ji simbolizavo pavydą. Praeityje buvo naudojama kaip dažai sūriui dažyti, kad jis įgautų geltoną spalvą. Nenutrūkstamas vaistažolės medetkos žydėjimas simbolizavo džiaugsmą, todėl gėlė buvo auginama soduose, kad skleistų laimę. Senovės egiptiečiai tikėjo, jog medetka padeda atjaunėti. Indai vaistažole puošdavo šventyklų altorius. Persai medetką vartojo kulinarijoje [52]. Medetka yra labai gyvybingas augalas, kuris auga visur, nepaisant dirvos derlingumo. Šiomis dienomis vis dažniau yra naudojami augaliniai preparatai. Iš jų gaminami vaistai, maisto papildai, vitaminai, arbatos, ekstraktai. Gydymas augaliniais preparatais prasidėjo senovėje, kuomet nebuvo jokių pažangių technologijų ir vaistų. Žmonės iš kartos į kartą perdavė savo žinias giminėms, taip plėsdami supratimą apie gamtoje esančius augalus. Per ilgus šimtmečius ir tūkstantmečius buvo atrasta naujų augalų gelbėjančių nuo tam tikrų ligų, kiti augalai buvo išbraukti iš vaistinių sąrašų, kadangi buvo atrastos neigiamos jų savybės. Šiomis dienomis daug vartojamų vaistų yra cheminiai ir nors jie yra efektyvūs, tačiau dažnai pasižymi ir neigiamomis savybėmis, nes siekiant terapinio poveikio gali atsirasti tam tikrų pakitimų žmogaus organizme. Augaliniai preparatai retai sukelia nepageidaujamas reakcijas. Siekiant išvengti perdozavimų ir kitokių neigiamų poveikių būtina įvertinti augalinės žaliavos kokybę, nustatant joje esančių biologiškai aktyvių medžiagų kiekius.
Baigiamojo magistrinio darbo pasirinktas tiriamasis augalas yra vaistinė medetka (Calendula officinalis L.). Šis vaistinis augalas priklauso astrinių (Asteraceae) šeimai. Vaistinių medetkų vaistinė augalinė žaliava yra žiedai. Žiedų sudėtyje randama flavonoidų, fenolinių junginių, saponinų, karotenoidų, polisacharidų, eterinių aliejų.
Medetkos pasižymi antibakteriniu ir priešgrybeliniu aktyvumu, antioksidacinėmis, imunomoduliacinėmis ir antimutageninėmis savybėmis. Nuo seno šis augalas buvo naudojamas ne tik kaip dekoratyvinis augalas, bet ir vartojamas medicinoje. Medetkų žiedai plačiai vartojami įvairiems susirgimams gydyti:
apsinuodijimui mažinti, skatina gleivinės atsinaujinimą, efektyvi kaip burnos skalavimo priemonė, tepalai naudojami sumušimams, įdrėskimams, gydyti [14, 17, 50, 35, 38].
Darbo naujumas. Lietuvoje nėra atliktų tyrimų, nustatančių flavonoidų kiekio įvairavimą vaistinių medetkų žieduose taikant Europos farmakopėjos „Calendulae
flos“ 01/2011:1297 monografijoje aprašytą analizės metodiką. Taigi pirmą kartą
flavonoidai buvo nustatinėjami pagal sudėtingesnį, daugiau laiko užimantį farmakopėjinį tyrimo metodą. Kiekybinė analizė buvo atliekama spektrofotometriniu metodu, nustatant flavonoidų, išreikštų hiperozidu, kiekį (ne mažiau kaip 0,4 %).
Darbo tikslas - nustatyti vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žieduose esančių fenolinių junginių, flavonoidų kiekį, įvertinti antioksidacinį poveikį taikant įprastinius, spektrofotometrijos metodus.(Folin-Ciocalteu ir kitus dažnai naudojamus metodus). Augalinė žaliava buvo kultivuojama skirtinguose Lietuvos regionuose, siekiant įvertinti sukauptų medžiagų kiekių skirtumus ir antioksidacinio poveikio stiprumą. Surinkta žaliava buvo džiovinama, o vėliau ruošiami augaliniai ekstraktai reikalingiems tyrimams atlikti.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas:
• Nustatyti vaistinių medetkų kaupiamų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį žiedų ekstraktuose ir įvertinti žiedų ekstraktų antioksidacinį poveikį.
Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti bendrą flavonoidų ir fenolinių junginių kiekį vaistinių medetkų žieduose, taikant įprastinius spektrofotometrinius metodus.
2. Nustatyti flavonoidų kiekio įvairavimą medetkų žieduose, taikant Europos farmakopėjos monografijoje aprašytą spektrofotometrijos metodą.
3. Įvertinti medetkų žiedų ekstraktų antioksidacinį poveikį, taikant spektrofotometrijos metodą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) morfologiniai
požymiai, kokybės reikalavimai ir paplitimas gamtoje.
1. pav. Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.)
Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.) kilusi iš Viduržemio jūros regiono [45, 62]. Tai vienmetis arba dvimetis, nemalonaus kvapo, žolinis, 20 - 50 cm aukščio augalas žydintis birželio – rugsėjo mėnesiais. Medetka priskiriama astrinių (Asteraceae) šeimai. Augalas nuo seno auginamas kaip dekoratyvinis, pasižymi
gydomosiomis savybėmis. Stiebas stačias, šakotas, apaugęs plaukeliais. Viršutiniai lapai lancetiški arba pailgi, bekočiai, apatiniai - pailgai kastuviški, daugiausia lygiakraščiai, retai dantyti, su lapkočiu, apaugę trumpais plaukeliais. Žiedynas 3-5cm graižas. Graižai ryškūs, geltonai - oranžiniai. Kraštiniai (liežuviški) žiedai sudaro 2 - 3 eiles, viduriniai – vamzdiški, geltoni. Vaisius – lukštavaisis [49]. Subrandina karūnos formos dėžutę, kurioje randasi pjautuvo formos sėklos. Medetkų žiedai (Calendulae flos) renkami pradėjus augalams žydėti, kas 3 - 5 dienas, vėliau kas 4 - 5 dienas. Skynimas skatina naujų žiedų susidarymą, tad per sezoną skinama 15 - 18 kartų. Negalima rinkti į polietileninius maišelius, nes juose žaliava greitai kaista, tamsėja. Džiovinama paskleidus plonu sluoksniu, pavėsyje arba specialioje džiovykloje 40 - 45 ˚C temperatūroje. Svarbu, kad gerai išdžiūtų žiedynsostis [53].
Vaistinė medetka, dar kitaip vadinama nadatka, nedetka, nagatka, negetka, nuodatka, noktele auga Centrinėje ir Pietų Europoje (ypač Viduržemio jūros regione), taip pat Artimuosiuose Rytuose. Šie augalai yra labai gyvybingi, greitai auga. Gerai auga bet kokio tipo dirvoje, gausiausiai žydi saulės atokaitoje. Gali būti auginama darželiuose, gėlynuose, neretai sulaukėja ir auga šiukšlynuose, pakelėse, komposto krūvose [54].
Pagal Europos farmakopėją, kaip vaistinė augalinė žaliava farmacinių vaistinių preparatų gamybai, naudojami medetkų žiedai. Augalinės žaliavos kokybė įvertinama, nustatant joje veikliųjų medžiagų kiekį, drėgmės, šalutinių medžiagų, bendro pelenų kiekio parametrus. Žieduose turi būti ne mažiau kaip 0,4 % flavonoidų, išreikštų hiperozidu. Šalutinių medžiagų gali būti ne daugiau kaip 2 %, drėgmės žaliavoje gali būti ne daugiau kaip 12 %, bendras pelenų kiekis neturi būti didesnis kaip 10 % [23].
1.2. Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) cheminė sudėtis
Apžvelgus literatūrą ir susisteminus kitų autorių mokslinių tyrimų duomenis, įvertinta Calendula officinalis L. vaistinės žaliavos cheminė sudėtis:
Karotenoidai – dideli kiekiai karotenoidų suteikia augalui ryškią oranžinę spalvą. Žieduose nustatyta iki 3 % karotenoidų. Randami α ir β - karotenai, likopinas, violoksantinas, rubiksantinas, flavoksantinas.
Saponinai – kalendasaponinai A, B, C, D, kampesterolis, cholesterolis, sitosterolis, stigmasterolis, taraksosterolis.
Triterpenai - faradiolis, arnidiolis, eritrodiolis, kalenduladiolis, heliantriolis A1, B0, B1 ir B2, taraksasterolis, lupeolis ir ursatriolis, α ir β amirinai, longispinogeninas, breinas, maniladiolis.
Flavonoidai – dažniausiai pasitaikantys flavonoidai, tai rutinas ir hiperozidas, be jų randama izokvercitrino, narcizino, neohesperidino, izorhamnetino, kvercetino, gliukozido [45].
Seskviterpenai ir jonono glikozidai – kaupiami oficinozidai A, B, C ir D, loliolidai ir arvosidai A.
Eterinio aliejaus randama apie 0,12 %. Medetkos kaupia mentoną, izomentoną, kariofileną, pedunkulatiną ir dihidroaktinidiolidą [31, 45, 44, 51, 34, 19, 24, 47, 33].
1.3.1 Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) farmakologinės
savybės
Vaistinė medetka (Calendula officinalis L.) medicinoje vartojama nuo seno. Tai puiki priemonė apsinuodijus. Žiedai turi uždegimą slopinančių medžiagų, kurios skatina žaizdų gijimą. Iš medetkų gaminami tepalai naudojami sumušimams, įdrėskimams, žaizdoms, opoms, odos uždegimams gydyti, skatina reepitelizaciją. Arbata gali būti vartojama kaip skalaujamoji priemonė. Seniau buvo naudojama kaip afrodiziakas nuo vėžio, sifilio, kirmėlių, gydyti skrandžio ir dvylikapirštės žarnos opoms, amenorėjai, dismenorėjai, blauzdos opoms, venų varikozei, hemorojui, išangės egzemai, proktitui. Calendula officinalis L. turi antibakterinį ir priešgrybelinį aktyvumą, pasižymi antioksidacinėmis, imunomoduliacinėmis ir antimutageninėmis savybėmis [49, 31, 14, 17, 50, 35, 38]. Priešgrybeliniu poveikiu pasižymi 10 % metanoliniai medetkų ekstraktai. Skirtingų koncentracijų vandeniniai etanoliniai medetkų ekstraktai pasižymi antibakteriniu poveikiu. 70 % vandeninės etanolinės
medetkų tinktūros stipriai veikia gripo virusus ir slopina Herpes simplex virusų augimą [67, 68, 69].
1.3.1 Priešvėžinio aktyvumo vertinimas in vitro
Krūties vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių ligų tarp moterų visame pasaulyje, o per pastaruosius du dešimtmečius daugiausia šia liga sergančių moterų pasitaikė Azijos šalyse [29]. Šiuo metu pasaulyje atliekama daug tyrimų, kuriais siekiama sukurti efektyvius augalinius preparatus vėžiui gydyti. Keletas antrinių metabolitų, įskaitant alkaloidus, polifenolius, flavonoidus ir triterpenus buvo išskirti iš vaistinių augalų [39]. Šie junginiai sukelia tiesioginę arba netiesioginę ląstelių apopoptozę. Priešvėžinio aktyvumo tyrime, liuteino epoksidas, lupeolio epoksidas ir eugenolio epoksidas buvo išskirti iš C. Campestris. Liuteinas ir liuteino epoksidas yra augalų karotenoidai, kurie plačiai paplitę mandarinų, alyvmedžių ir kitų augalų lapuose ir vaisiuose [20, 26]. Tyrimas buvo atliekamas in vitro su imortalizuotomis ląstelėmis. Iš antžeminių kvapiųjų bazilikų (O. Basilicum), Alhagi maurų (A. Maurorum), vaistinių medetkų (C. officinalis L.), ir jų parazitų – auksinių brantų (C. Campestris) išdžiovintų augalų dalių miltelių buvo pagaminti metanoliniai ekstraktai. Aktyviausios frakcijos buvo nustatytos branduolinio magnetinio rezonanso metodu (BMR) [11]. Ląstelės buvo auginamos tam tikrose plokštelėse turinčiose duobutes, į kurias buvo lašinamas MTT (3 -(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolino bromidas) tirpalas. Susiformavus kristalams, buvo matuojama tirpalo absorbcija spektrofotometru prie 492 nm bangos ilgio. Rezultatai buvo lyginami pagal eugenolį. Parazitinio augalo pagamintos 23 frakcijos (geriausi rezultatai buvo nustatyti 17 ir 23 frakcijose) buvo lygintos pagal eugenolį ir eugenolio epoksidą. Antruoju atveju iš 25 alhagi maurų (A. Maurorum) augalo frakcijų efektyviausiai veikė 15, o iš 27 parazitinio alhagi maurų augalo frakcijų efektyviausiai veikė 16 ir 21 frakcijos. Šių augalų rezultatai buvo lyginti pagal lupeolį ir lupeolio epoksidą. Vaistinių medetkų geriausiai veikianti frakcija buvo 19 iš 26, o jos parazitinio augalo 14 ir 17 iš 24. Rezultatai buvo lyginti pagal liuteiną ir liuteino epoksidą. Tyrimo rezultatai parodė, kad aktyviausias frakcijas sudarė lupeolio
epoksidas, liuteino epoksidas ir eugenolio epoksidas. Šiose frakcijose buvo gauti didžiausi citotoksinio poveikio rezultatai gydant krūties vėžį [20, 26, 29, 39, 59].
Kitame tyrime pelės sergančios karcinoma buvo padalintos į dvi grupes. Viena grupė buvo gydoma triterpeninėmis medetkų frakcijomis, o kita grupė placebo. Rezultatai parodė, kad medetkų frakcijomis gydytos pelės gyveno ilgiau lyginant su kontroline grupe [70].
1.3.2 Vaistinių medetkų poveikis gydant gingivitą
Gingivitas arba dantenų uždegimas yra lėtinis uždegiminis procesas pasireiškiantis 90 % populiacijos nepriklausomai nuo lyties ar amžiaus. Tai gana dažnai pasitaikanti liga, kuri pasireiškia dantenų kraujavimu, paburkusia burnos gleivine, dantenų skausmu. Susergama netinkamai valantis dantis, nesivalant tarpdančių, kai užsilikusios apnašos sukietėja ir virsta akmenimis. Atliktame randomizuotame placebo kontroliuojamame tyrime dalyvavo 240, 20 - 40 metų amžiaus asmenų, sergančių gingivitu. Pacientai, sergantys periodontitu, ūmiu nekrotizuojančiu opiniu gingivitu, rūkantys, sergantys bet kuria kita sistemine liga, įskaitant ir nėštumą, buvo pašalinti iš tyrimo. Tiriamieji buvo padalinti į tiriamąją ir kontrolinę grupes. Kiekvienoje grupėje buvo po 120 asmenų. Tiriamosios grupės pacientai po vieną kartą, ryte ir vakare, šešis mėnesius skalavo burną medetkų tinktūra, skiesta distiliuotu vandeniu (santykis 1 : 3). Kontrolinės grupės pacientams buvo rekomenduojama skalauti burną vandeniu du kartus per parą, šešis mėnesius. Buvo stebimi klinikiniai kriterijai: apnašų indeksas (PI), dantenų indeksas (GI), vagelės kraujavimo indeksas (SBI) ir burnos higienos indeksas (OHI). Registruoti rezultatai po pacientų pirmojo, antrojo (trečią mėnesį) ir trečiojo (šeštą mėnesį) apsilankymo. Tyrimo rezultatai buvo fiksuojami to paties žmogaus, siekiant tiksliau palyginti esamą paciento būklę su buvusia. Visiems pacientams buvo taikomas pusės metų gydymo laikotarpis. Kontrolinėje grupėje pirmojo ir antrojo apsilankymo metu, tai yra po pirmojo mėnesio ir po trečiojo mėnesio, buvo matomas rezultatų pablogėjimas ir tik po pusės metų pacientų būklė pagerėjo. Tiriamojoje grupėje pacientų būklė antro apsilankymo metu buvo ženkliai pagerėjusi, o atlikus skalavimo
procedūras dar tris mėnesius buvo pastebėta, kad visų parametrų duomenys sumažėjo dvigubai nuo tyrimo pradžios. Apibendrinus rezultatus galima daryti išvadą, kad burnos skalavimas medetkų tirpalu yra veiksminga procedūra mažinant dantų apnašas ir dantenų uždegimą. Gauti rezultatai rodo, kad medetkų preparatas veikė reikšmingai stipriau nei placebas, pacientai jautė palengvėjimą jau po pirmo apsilankymo pas gydytoją [17, 50, 35, 38, 59].
Kitame randomizuotame kontroliuojamame klinikiniame tyrime buvo tiriamas medetkų burnos skalavimo priemonės efektyvumas, mažinant burnos ir ryklės gleivinės uždegimą (OM), kuris buvo sukeltas radiacijos. Tyrime dalyvavo pacientai sergantys galvos ar kaklo vėžiu. Keturiasdešimt pacientų buvo atsitiktinai suskirstyti į dvi grupes (po 20). Kontrolinė grupė gaudavo 2 % medetkų burnos skalavimo skysčio, o placebo grupė vandens. Burnos ir ryklės gleivinės uždegimas buvo įvertintas dviejų klinikinių tyrėjų (radiacijos onkologo ir odontologo), naudojant burnos gleivinės vertinimo skalę (OMAS). Norint išsiaiškinti skalavimo skysčio efektyvumą buvo išmatuotas bendras polifenolių, flavonoidų kiekis, antioksidacinis poveikis, kvercetino koncentracija. Jau po dviejų savaičių ženkliai sumažėjo burnos ir ryklės gleivinės uždegimas, o po šešių savaičių sumažėjo dar 38 %. Atsižvelgus į rezultatus galima teigti, kad medetkų burnos skalavimo priemonės efektyviai mažina burnos ir ryklės gleivinės uždegimą pacientams sergantiems galvos ar kaklo vėžiu [58, 59, 63].
Randomizuotame dvigubai aklame klinikiniame tyrime buvo stengiamasi įvertinti dantų pastos efektyvumą, kurios sudėtyje yra medetkų ekstrakto. Dantų pasta naudojama burnos gleivinės uždegimui mažinti. Tyrime dalyvavo 40 savanorių (21 vyras ir 19 moterų). Pacientai atsitiktinai buvo suskirstyti į dvi grupes (po 20). Pirmoji buvo placebo grupė, kuri naudojo paprastą dantų pastą, o antroji (kontrolinė grupė) naudojo medetkų ekstrakto turinčią dantų pastą. Abiems grupėms buvo liepta valytis dantis keturias savaites tris kartus per dieną, naudojant tik jiems paskirtą dantų pastą. Pacientai, naudoję dantų pastą su medetkų ekstraktu, jautėsi geriau, nes stipriai sumažėjo kraujavimas iš dantenų ir uždegiminiai procesai. Pagal gautus rezultatus GI (dantenų indeksas) ir BoP (kraujavimo iš dantenų indeksas) sumažėjo dvigubai. Apibendrinus rezultatus galima teigti, kad dantų pasta su medetkų ekstraktu efektyviai mažina dantenų kraujavimą ir uždegimą [60, 63].
1.3.3 Medetkų poveikis oksidaciniam stresui ir kepenų pažeidimui,
kuris buvo sukeltas aflatoksino
Mikotoksinai yra grybų metabolitai. Tai nuodingos žmonėms ir gyvūnams medžiagos [15]. Aflatoksinai (AFS) gaunami iš Aspergillus flavus ir
Aspergillus parasiticus rūšių grybų. Šis mikotoksinas yra mutageniškas,
teratogeniškas laboratoriniams gyvūnams, labiausiai pažeidžia ląstelių imunitetą [46]. Vaistinė medetka buvo plačiai tiriama dėl savo plataus poveikio, gydant įvairias ligas. Vaistažolių arbata iš C. officinalis L. gali pagerinti kolito, dvylikapirštės žarnos opos simptomus [18]. Šio tyrimo tikslas buvo gauti daugiau informacijos apie medetkų poveikį oksidaciniam stresui lyginant etanolinius ir vandeninius ekstraktus in vitro. Atlikti tyrimai su dviem žiurkių grupėmis, kurioms aflatoksinais buvo sukeltas oksidacinis stresas. Kiekviena žiurkių grupė 6 savaites kiekvieną dieną buvo girdoma atitinkamo stiprumo medetkų ekstraktų dozėmis. Po 6 savaičių buvo imami kraujo mėginiai, tiriamos jų kepenys. Atlikus histologinius tyrimus, nustatytas superoksido dismutazės (SOD) ir glutationo peroksidazės (GPx) kepenyse sumažėjimas [36]. Rezultatai parodė, kad aflatoksinais šertų žiurkių svoris ženkliai sumažėjo, jos mažiau valgė [42]. Žiurkių šertų aflatoksinais organizme padidėjo karbamido ir kreatinino kiekiai, parodantys pokyčius kepenyse ir tulžyje [22]. Gydant medetkų ekstraktu nepasireiškė jokie toksiniai poveikiai. Geresni rezultatai gauti, žiurkes girdant didesnėmis ekstrakto dozėmis. Medetkų skystasis ekstraktas gerino kepenų veiklą, pastebėtas neuroprotekcinis poveikis prieš cisplatinos sukeltą toksinį poveikį inkstams [37]. Apibendrinant tyrimų rezultatus galima teigti, kad medetkų etanoliniai ekstraktai turintys didelį kiekį fenolinių junginių, pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu prieš alfatoksinų sukeltus kepenų pažeidimus [15, 46].
Kitame atliktame tyrime buvo nustatytas medetkų veiksmingumas mažinant oksidacinį stresą odoje, kuris buvo sukeltas UV. Pirmiausia nustatyta medetkų cheminė sudėtis, po to antioksidacinis aktyvumas, taikant įvairias metodologijas. Atliktas citotoksinio aktyvumo naudojant MTT (3-(4 ,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolino bromidas) in vitro vertinimas. Galiausiai buvo tiriamas medetkų ekstrakto apsauginis poveikis prieš pilkosioms pelėms UV sukeltą odos oksidacinį stresą. In vitro antioksidacinio aktyvumo tyrimas parodė nuo dozės priklausomą poveikį prieš skirtingus radikalus. Toksinis medetkų ekstrakto poveikis pasireiškė
vartojant 30 mg/ml ir didesnės koncentracijos ekstraktus. Pelėms skiriant atitinkamai 150 ir 300 mg/kg medetkų ekstrakto nustatytas glutationo kiekis organizme buvo panašus, kaip ir nešvitintų pelių. Tačiau reikalingi papildomi išsamesni tyrimai, kad įrodyti medetkų ekstrakto efektyvumą mažinant odos oksidacinį stresą [61].
1.3.4 Žaizdų gydymas, naudojant medetkų preparatus
Medetkos pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, taip pat plačiai vartojamos žaizdoms gydyti. Iš Brazilijoje augančių medetkų žiedų buvo pagamintos etanolio ekstrakto ir dichlormetano, heksano frakcijos. Ekstrakto odos žaizdų gydomasis poveikis buvo nustatomas atliekant makroskopinę, morfometrinę, histopatologinę ir imunohistocheminę analizę. Buvo vertintas antibakterinis ekstrakto ir jo frakcijų aktyvumas. Šiais preparatais buvo gydomos pelių žaizdos. Eksperimentinio tyrimo rezultatai parodė, kad C. officinalis preparatai pasižymėjo antiuždegiminiu ir antibakteriniu poveikiu, taip pat greitino odos gijimo procesus [62].
Atvirame, nekontroliuojamame, bandomajame tyrime dalyvavo 30 pacientų su nudegimais. Jiems buvo paskirtas gydymas hidrogeliu, kurio sudėtyje buvo medetkų ekstrakto. Preparatas buvo vartojamas tris kartus per parą, dvi savaites. Po dviejų savaičių pacientai jautėsi geriau, sumažėjo pūslių skausmas, uždegimas, paraudimas, jautrumas šilumai. Nurodyta, kad 20 % medetkų tinktūra padeda gydyti lėtinį pūlinį otitą [64, 65].
Kitame randomizuotame, atvirame, kontroliuojamame tyrime buvo lyginamas trijų tepalų efektyvumas, gydant antro ir trečio laipsnio nudegimus. Pacientai 17 dienų buvo gydomi medetkų tepalu (tepalo pagrindas vazelinas), vazelinu ir proteolitiniu tepalu. Medetkų tepalas efektyviausiai gydė nudegimus, lyginant su kitais preparatais. 37 iš 53 pacientų, naudojusių medetkų tepalą, žaizdos gijo greičiau. Tik 27 iš 50 gydžiusių žaizdas vazelinu buvo jaučiamas pagerėjimas, tuo tarpu gydymo proteolitiniu tepalu rezultatai buvo labai panašūs į gydymo medetkų tepalu rezultatus. 35 iš 53 pacientų žaizdos gijo greičiau. Rezultatai parodė, kad medetkų tepalas pagamintas vazelino pagrindu yra efektyvesnis už gryną vazeliną (placebą) [66].
Atlikti ikiklinikiniai tyrimai su triušiais, kurių žaizdos buvo gydomos hidrogeliu arba medetkų žiedų sausuoju ekstraktu. Rezultatai parodė, kad vartojant šiuos preparatus žaizdos triušiams gijo 25 % greičiau, nei gydant kitais būdais [71].
Kitame tyrime buvo atliekamas eksperimentinis buivolų veršiukų žaizdų gydymas. Veršiukai buvo padalinti į dvi grupes. Viena grupė buvo gydoma tepalu, kurio sudėtyje buvo 5 % medetkų žiedų sausojo ekstrakto, o antra - fiziologiniu tirpalu. Gydymo kurso pabaigoje buvo pastebėta, kad, vartojant medetkų tepalą, žaizdos gijo greičiau.
1.4. Fenolinių junginių apžvalga
Fenoliniai junginiai sudaryti iš aromatinio žiedo, prie kurio būna viena ar kelios hidroksilo grupės. Jų struktūra gali būti sudaryta iš paprasto žiedo arba sudėtingų polimerų. Yra išskiriamos 8 pagrindinės fenolinių junginių grupės: flavonoidai, fenolinės rūgštys, stilbenai, chinonai, kumarinai, ligninai, ksantonai ir chromonai [41]. Šie junginiai pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, todėl kelia didžiulį dėmesį tyrinėtojams. Fenolinių junginių antioksidacinio poveikio stiprumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus ir išsidėstymo aromatiniame žiede. Šie junginiai yra antriniai augalų metabolitai. Jie yra dažniausiai pasitaikanti medžiagų grupė augaluose ir turi didelę fiziologinę ir morfologinę reikšmę augalui. Fenoliai atlieka svarbų vaidmenį augimui ir reprodukcijai, apsaugo nuo ligų sukėlėjų ir kenkėjų, turi įtakos augalų spalvai ir juslinėms savybėms [55]. Jie kaip cheminiai signalai dalyvauja ląstelinių ir tarpląstelinių fiziologinių procesų valdyme, o kaip vaizdiniai signalai privilioja apdulkinančius vabzdžius [2].
1.5 Flavonoidų apžvalga
Flavonoidai – geltoni, heterocikliniai, organiniai junginiai [16]. Tai yra mažos molekulinės masės junginiai sudaryti iš 15 anglies atomų. Flavonoidų aglikono pagrindas susideda iš dviejų aromatinių žiedų A ir B sujungtų trijų anglies atomų
tilteliu, kuris kartu su deguonies atomu sudaro heterociklinį žiedą [2]. Flavonoidai randami vaisiuose, daržovėse, kai kuriuose grūduose. Tai antriniai augalų metabolitai turintys naudingų antioksidacinių ir antimikrobinių savybių. Šie junginiai dar skirstomi į 6 poklasius: flavonoliai, flavonai, flavanonai, flavanoliai, antocianidinai ir izoflavonai [12].
1. Flavonoliai (kvercetinas, kempferolis, miricetinas, izoramnetinas, morinas, rutinas, kvercetrinas, miricitrinas, spirenosidas, galanginas, robininas, kemferidas, fisetinas, ramnetinas ir kt.).
2. Flavonai (flavonas, luteolinas, apigeninas, viteksinas, orientinas, izoviteksinas, izoorientinas, rpoifolinas, tangeretinas, baikaleinas, diosmetinas, diosminas. ir kt.).
3. Flavanoliai (katechinas, epikatechinas, galokatechinas ir kt.). 4. Flavanonai (flavanonas, likviritigeninas, likviritinas, eriodiktinas,
hesperidinas, naringinas, naringeninas, hesperidinas, pinocembrinas ir kt.) 5. Antocianidinai (pelargonidinas, cianidinas, delfinidinas, peoninas, malvidinas
ir kt.).
6. Izoflavonoidai (genisteinas, formononetinas, biochaninas, daidzeinas ir kt.) [28].
1.6 Flavonoidų medicininė reikšmė
Flavonoidai yra pagrindiniai daugelio augalinių ir kitokių preparatų komponentai, kurie nuo seno naudojami medicinoje. Jie įeina į medaus, propolio sudėtį. Paros flavonoidų dozė gaunama su vaisiais ar daržovėmis, yra 1 - 2 g. Šiomis dienomis gydytojai rekomenduoja vartoti didesnes grynų flavonoidų dozes, siekdami gydyti tam tikras ligas. Įrodyta, kad flavonoidai gali slopinti specifinius fermentus, aktyvuoti hormonus ir neurotransmiterius [57]. Flavonoidai turi daug biocheminių savybių, tačiau geriausia iš jų yra ta, kad beveik kiekviena grupė flavonoidų pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo funkcinių grupių išsidėstymo struktūroje [21, 4].
1.6.1 Hepatoprotekcinis poveikis
Katechinas, apigeninas, kvercetinas, rutinas, naringeninas ir venorutoninas pasižymi hepatoprotekciniu poveikiu. Įvairios lėtinės ligos, tokios kaip diabetas, gali sukelti kepenų vystymosi pakitimų [9]. Tyrimais įrodyta, kad flavonoidų vartojimas mažina kepenų disfunkciją, virškinamo trakto sutrikimus, pykinimą, pilvo skausmus [27, 43].
1.6.2 Antibakterinis poveikis
Augalai flavonoidus gamina kaip atsaką į mikrobinę infekciją, todėl jie yra efektyvūs prieš platų spektrą mikroorganizmų. Dideliu antibakteriniu poveikiu pasižymi apigeninas, galanginas, flavonas, flavonolio glikozidai, izoflavonai, flavonoidai ir chalkonai. Šie flavonoidai dažnai turi kelis taikinius. Jie formuoja baltymų kompleksus naudodami hidrofobinių jėgų ir kovalentinių ryšių pagalbą [5, 6, 7, 8].
1.6.3 Antiuždegiminis poveikis
Uždegimas yra normalus biologinis procesas, atsirandantis organizmui reaguojant į audinių sužalojimą, mikrobams, patogenams patekus į pažeistą vietą ir cheminio dirginimo metu. Uždegimas inicijuoja imuninių ląstelių migraciją iš kraujagyslių į pažeistą vietą. Šio proceso metu stengiamasi sunaikinti visus svetimkūnius ir gydyti pažeistus audinius. Uždegimas yra greitas ir savaiminis procesas, tačiau tinkamai nesirūpinant gali prasidėti įvairūs lėtiniai susirgimai [30]. Imuninė sistema gali kisti dėl mitybos, farmakologinių preparatų, aplinkos teršalų. Kai kurie flavonoidai gali paveikti imuninę sistemą. Hesperidinas, apigeninas,
luteolinas ir kvercetinas pasižymi priešuždegiminiu ir skausmą malšinančiu poveikiu. Flavonoidai gali paveikti baltymus dalyvaujančius uždegiminių procesų slopinime, gali inhibuoti fosfodiesterazių dalyvavimą ląstelių aktyvacijoje [32].
1.6.4 Antivėžinis poveikis
Vaisiai ir daržovės, turintys flavonoidų yra puiki vėžio prevencijos priemonė. Svogūnuose ir obuoliuose esantis kvercetinas sumažina tikimybę sirgti prostatos, plaučių, skrandžio ir krūties vėžiu. Teigiama, kad saikingi vyno mėgėjai taip pat turi mažesnę riziką susirgti plaučių, stemplės, storosios žarnos, skrandžio vėžiu [13]. Žinomi keli naudojami mechanizmai siekiant geresnio flavonoidų priešvėžinio poveikio: mutanto p53 baltymo slopinimas, ląstelės ciklo stabdymas, tirozinkinazės slopinimas, temperatūrinio šoko baltymų ir Ras baltymų ekspresijos slopinimas.
Flavonoidai mažina mutanto p53 baltymo ekspresiją krūties vėžio ląstelėse. Manoma, kad vaistai, slopinantys tirozino kinazės aktyvumą, gali būti vartojami kaip priešvėžiniai preparatai, kadangi jie nesukelia šalutinio poveikio. Kvercetinas buvo pirmasis tirozino kinazę slopinantis preparatas bandytas tyrimuose [48].
1.7 Antioksidacinis poveikis ir jo įvertinimas
Antioksidantai – medžiagos, kurios efektyviai redukuoja prooksidantą sudarydamos netoksiškus arba maž̌ai toksiškus junginius, taip išvengiant arba sumažinant biologinių taikinių oksidacinius pažeidimus. Tai medžiagos slopinančios oksidacijos procesus. Antioksidantai žmogaus organizme sudaro sudėtingą daugiakomponentinę gynybinę sistemą, kuri užtikrina ROS (reaktyvios deguonies formos), RNS (reaktyvios azoto formos) radikalų ir neradikalų sujungimą, modifikaciją, slopinimą arba ardymą [2]. Nepakankamas kiekis antioksidantų ar
antioksidantinių fermentų slopinimas gali sukelti oksidacinį stresą, pakenkti ląstelėms arba jas sunaikinti. Oksidacinis stresas pažeidžia ląstelės struktūrą ir funkcijas. Antioksidantai vartojami neurodegeneracinių ligų ir infarkto gydymo profilaktikai. Oksidacinis stresas gali būti laikomas šių ligų priežastimi [10]. Daugelis augalinės kilmės vaistų gali būti naudojami žaizdų ir nudegimų gydymui. Calendula officinalis L. taip pat plačiai vartojama homeopatijoje. Pastebėta, kad medetka pasižymi antioksidaciniu, priešuždegiminiu, antibakteriniu, priešgrybeliniu ir antivirusiniu poveikiu [36]. Medetkų preparatai vartojami nudegimams gydyti. Antioksidacinė terapija naudojama siekiant užkirsti kelią žalingam laisvųjų deguonies radikalų poveikiui. Flavonoidai yra svarbiausi, aktyvūs ir natūralūs antioksidantai. DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil-hidratas) laisvųjų radikalų metodas taikomas antioksidaciniam poveikiui įvertinti. Tyrimas paremtas elektronų mainais, kurių metu gaunamas violetinės spalvos tirpalas etanolyje. Naudojant DPPH galima lengvai įvertinti antioksidacinį poveikį spektrofotometro pagalba [25]. Kitas plačiai naudojamas metodas yra ABTS, (angl.), (2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid), 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis), kuris taip pat pagrįstas jonų mainais. Sumaišius spalvotą ABTS tirpalą su medžiaga, kuri gali būti oksiduota, ABTS tirpalas praranda spalvą, o medžiaga įgauna kitą spalvą [40]. Antioksidacinis aktyvumas gali būti vertinamas taikant FRAP (angl. ferric reducing antioxidant power), (geležies jonų redukcijos, antioksidacinės galios tyrimas) metodą. FRAP metodas mažai skiriasi nuo ABTS radikalo - katijono surišimo metodo, išskyrus tai, kad reakcija tarp antioksidanto ir ABTS dažniausiai atliekama neutralioje (pH 7,4) terpėje, o FRAP metodui būtinos rūgštinės (pH 3,6) sąlygos [38]. CUPRAC metodas pagrįstas dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-di-metil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) komplekso redukcija antioksidantu į chromogeninį Cu(I)-Nc kompleksą, kurio absorbcijos maksimumas yra prie 450 nm bangos ilgio [57].
1.8 Fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymo metodai
Fenolinių junginių ir flavonoidų kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui naudojama IR, UV spektroskopija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, masių spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija su ultravioletinės ir diodų matricos detektoriais ir kai kuriais, rečiau
taikomais metodais, kaip rentgeno spindulių difrakcija. Kiekybiniam flavonoidų nustatymui naudojama ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, skysčių chromatografija, dujų chromatografija ir kapiliarinė elektroforezė. Ultravioletinė spektrometrija yra vienas paprasčiausių flavonoidų struktūros analizės metodų. Spektras susideda iš dviejų sugerties maksimumų. Tiksli smailių padėtis suteikia informacijos apie flavonoidų prigimtį, jo hidroksilinimo laipsnį.
Analitiniai skirstymo metodai. Nėra bendro flavonoidų vertinimo metodo.
Ankstesniais metais polifenoliams atskirti buvo naudojama plonasluoksnė chromatografija, poliamidinė chromatografija, popieriaus elektroforezė. Iki šių dienų naudojama plonasluoksnė chromatogafija. Tai greitas, paprastas, lengvai atliekamas metodas polifenoliams atskirti iš augalinių ekstraktų. Didelis sunkumas pasirenkant skirstymo metodą, yra flavonoidų tirpumas naudojamuose tirpikliuose. Mažas tirpumas gali skatinti nuosėdų susidarymą [3].
1.8.1 Efektyvioji skysčių chromatografija
Tai šiuolaikinė, atranki, efektyvi, paskutiniu metu populiariausia flavonoidų skirstymo technika naudojama kokybiniam ir kiekybiniam flavonoidų įvertinimui. Nustatant flavonoidus dažnai vartojamas gradientinis skirstymas. Eliuavimui naudojamas vanduo ir acetonitrilas arba metanolis. Flavonoidų detekcijai dažniausiai naudojami spektrofotometriniai, UV, ar diodų matricos detektoriai. Kiekybinė analizė atliekama prie 340 - 370 nm bangos ilgio. Šis metodas informatyvesnis nei spektrofotometrija ir jautresnis nei kapiliarinė elektroforezė, tačiau pagrindiniai jo trūkumai yra ilgas analizės laikas ir maža skiriamoji geba [3].
1.8.2 Spektrofotometrija
Kadangi fenolinių junginių struktūroje yra nors vienas aromatinis žiedas, tai jie gali absorbuoti UV šviesą, dėl to spektrofotometrijos metodu galima įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą [3]. Spektrofotometrija yra vienas iš naudingiausių kiekybinės analizės metodų įvairiose srityse. Ji naudojama chemijoje, fizikoje, biochemijoje, cheminėje inžinerijoje ir klinikinėje praktikoje. Spektrofotometriškai matuojama kiek šviesos cheminė medžiaga absorbuoja. Matuojamas šviesos intensyvumas, kuris eina per cheminės medžiagos tirpalą. Pagrindinis principas yra toks, kad kiekvienas junginys sugeria arba praleidžia šviesą per tam tikrame diapazone esantį bangos ilgį [73].
1.8.3 Kapiliarinė elektroforezė
Tai vis dažniau naudojamas tyrimo metodas, pasižymintis didele skiriamąja geba, analizės spartumu ir mažu reagentų ir tiriamų pavyzdžių sunaudojamu kiekiu. Cheminė flavonoidų struktūra lemia tai, kad jie analizuojami kaip anijonai. Kaip buferis naudojamas natrio boratas, nes jis chelatuoja su flavonoidais ir suformuoja tirpesnius, daugiau neigiamo krūvio turinčius kompleksinius anijonus. Skiriamą gebą ir atrankumą gerina nedideli tirpiklio kiekiai. [3]
2. TYRIMO METODIKA
2.1 Tyrimo objektas
Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedai kultivuojami, 8 skirtinguose Lietuvos miestuose ir miesteliuose. Žaliavos rinkimo vietos ir data:
1. VDU Botanikos sodas, Kaunas. Rinkta 2013-06-15 2. Aleksotas, Kaunas. Rinkta 2013-06-15.
3. Užpalių miestelis, Utenos apskr. Rinkta 2013-07-04 4. Kartenos miestelis, Kretingos rajonas. Rinkta 2013-06-22 5. Eigirdžių miestelis, Telšių rajonas. Rinkta 2014-06-22 6. Navickų kaimas, Alytaus rajonas. Rinkta 2014-07-05 7. Laugalių kaimas, Klaipėdos rajonas. Rinkta 2014-06-22 8. Dyviliškių kaimas, Lazdijų rajonas. Rinkta 2014-07-05.
Surinkti augalinės žaliavos žiedai buvo laikomi kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant žaliavą nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinti medetkų žiedai buvo laikomi popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25 o
C temperatūroje, sausoje vietoje.
2.2. Reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Merck, Vokietija)
DPPH reagentas (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl, ALDRICH, Vokietija) Acto rūgštis (99,8 %, Lachner, Čekija)
Vandenilio chlorido rūgštis Acetonas (ALDRICH, Vokietija) Etilacetatas (ALDRICH, Vokietija) Natrio sulfatas
Etanolis 96 %
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV) Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija)
Natrio karbonatas (bevandenis, CHEMPUR, Lenkija) Natrio acetatas (≥99,9 %, CHEMPUR, Lenkija) Rutinas (≥95 %, SIGMA-ALDRICH, Vokietija) Acetonitrilas (99,9 %, Roth, Vokietija)
Galo rūgštis (>99 %, Fluka, Lenkija)
2.3. Aparatūra
Vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) augalinės žaliavos ekstraktai buvo gaminami naudojant orbitalinę purtyklę. Bendras fenolinių junginių, flavonoidų kiekis ir antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą Beckman (JAV). Bandiniams tirti buvo naudotos 1 cm skersmens kiuvetės. Flavonoidų kiekis, išreikštas hiperozidu buvo nustatomas Europos farmakopėjoje aprašytu spektrofotometriniu metodu.
2.4 Tyrimų metodai
2.4.1 Tiriamo pavyzdžio ruošimas
Nuodžiūvio vertinimas. Nuodžiūvis vertintas pagal galiojančio leidimo
Europos farmakopėjoje (Ph. Eur. 2.2.32) nurodytą metodiką. Atsveriamas 1 g susmulkintos (mažiausiai 95 %, 1400 µm dydžio dalelių pagal Ph. Eur 2.9.12) žaliavos, džiovinama 105°C temperatūroje 2 val. Atlikus analizę nuodžiūvis atitiko reglamentuojamas ribas, t.y. buvo mažesnis kaip 12 % [23].
Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,5 g (0,001 g tikslumu) susmulkintų vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų. Ekstrakcija buvo vykdoma 20 min. su 20 ml, 70 % (v/v) etanoliu orbitalinėje purtyklėje, purtant 200 k/min greičiu. Gautas
ekstraktas filtruojamas per 0,2 mikrometrų porų dydžio filtravimo popierių. Ekstraktai laikomi tamsaus stiklo buteliukuose tolimesniems tyrimams.
2.4.2 Spektrofotometriniai metodai
2.4.2.1 Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties
ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu.
Pirmiausia ruošiami tyrimui reikalingi tirpalai. Motininis Folin-Ciocalteu (toliau FC) reagentas 10 kartų skiedžiamas distiliuotu vandeniu ir gaunamas darbinis FC reagentas. 7,5 % natrio karbonato tirpalas ruošiamas 7,5 g medžiagos tirpinant 100 ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1 ml vaistinės augalinės žaliavos etanolinio ekstrakto, kuris sumaišomas su 5 ml FC reagento ir 4 ml 7,5 % natrio karbonato tirpalu. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 1 val. kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija prie 760 nm bangos ilgio. Palyginamas tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj augalinės žaliavos ekstrakto pilamas distiliuotas vanduo. Ekstraktai gaminami reagentus pilant nustatyta eiliškumo tvarka, kitaip mėginiuose iškrenta nuosėdos. Matavimai kartojami tris kartus.
Tokiomis pačiomis sąlygomis ruošiami tiriamieji ir palyginamasis skirtingų koncentracijų (0,03125 – 0,5 mg/ml) galo rūgšties tirpalai. Kalibracinis galo rūgšties grafikas sudaromas iš 5 – 7 skirtingų tirpalo koncetracijų.
Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) gramui žaliavos.
Apskaičiuojama pagal formulę: GRE = , mg/g; c - galo rūgšties
koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml; m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.
Duomenys įvertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį
y = 2,1318x – 0,0471;
R2= 0,9991;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml.
2 pav. Galo rūgšties kalibracinis grafikas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti.
2.4.2.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu,
nustatymas spektrofotometriniu metodu.
Tyrimui gaminamas reagentas iš 60 ml, 96,3 % etanolio, 3 ml, 33 % acto rūgšties (16,5 ml, 99,8 % acto rūgšties + distiliuotas vanduo iki 50 ml), 12 ml, 5 % heksametilentetramino (2,5 g medžiagos tirpinama 50 ml distiliuoto vandens), 9 ml,
y = 2,1318x - 0,0471 R² = 0,9991 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Ab so rb cijos dyd is
10 % aliuminio chlorido (5 g aliuminio chlorido miltelių tirpinami 50 ml distiliuoto vandens) ir 60 ml distiliuoto vandens. Šis reagentas laikomas šaldytuve. Ruošiant tiriamuosius mėginius imama 1920 µl paruošto mėginio, 80 µl vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, gerai sumaišius paliekama stovėti 30 min. šaldytuve. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoj augalinio ekstrakto naudojamas 70 % (v/v) etanolis. Praėjus pusvalandžiui atliekami matavimai su spektrofotometru prie 407 nm bangos ilgio. Visi mėginiai tiriami tris kartus.
Tiriamieji ir palyginamasis tirpalai kalibracinei kreivei ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis. Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,2 – 1 mg/ml) rutino tirpalai. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5 – 7 skirtingų tirpalo koncentracijų.
Duomenys įvertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 0,9465x – 0,0950;
R2= 0,9960;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
3 pav. Rutino kalibracinė kreivė bendram flavonoidų kiekiui nustatyti.
0,8609 0,6657 0,4531 0,2652 0,1147 y = 0,9465x - 0,0959 R² = 0,9965 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Ab so rb cijos dydis Rutino konc. mg/ml
2.4.2.3 Bendras flavonoidų kiekio išreikšto hiperozidu, nustatymas
pagal Europos farmakopėjoje aprašytą metodiką.
0,8 g susmulkintos augalinės žaliavos supilama į apvaliadugnę 100 ml talpos kolbą, įpilama 1 ml 5 % heksametilentetramino, 7 ml praskiestos vandenilio chlorido rūgšties (70 g konc. vandenilio chlorido rūgšties sumaišyta su 100 ml distiliuoto vandens) ir 20 ml acetono. Kolba prijungiama prie grįžtamojo šaldytuvo ir 30 min. vykdoma ekstrakcija. Tirpalas filtruojamas per vatą į 100 ml matavimo kolbą. Vata grąžinama į apvaliadugnę kolbą, įpilama 20 ml acetono ir virinama 10 min. (ši procedūrą kartojama du kartus). Gautas tirpalas filtruojamas per 0,2 mikrometrų porų dydžio filtravimo popierių. Po filtravimo įpilama acetono iki 100 ml žymės. 20 ml šio paruošto tirpalo įpilama į dalomąjį piltuvą ir ekstrahuojama su 20 ml distiliuoto vandens ir 15 ml etilacetato mišiniu. Turinys lengvai maišomas, biologiškai aktyvios medžiagos iš acetoninio sluoksnio pereina į etilacetato sluoksnį (viršutinis sluoksnis). Po to dar tris kartus acetoninis tirpalas maišomas su 10 ml etilacetato tirpalu, kol visos medžiagos pereina iš acetoninio tirpalo. Etilacetato tirpalas dar du kartus plaunamas vandeniu, kaskart po 50 ml. Viršutinis etilacetato sluoksnis filtruojamas į 50 ml talpos matavimo kolbą naudojant bevandenį natrio sulfatą. Į kolbą iki žymės įpilama etilacetato. Į 25 ml matavimo kolbą įpilama 10 ml paruošto medetkų tirpalo, 1 ml aliuminio chlorido reagento (2 g aliuminio chlorido ištirpinti 5 ml 99,8 % acto rūgšties ir 95 ml 96,3 % etanolio tirpale). Kolboje iki žymės įpilama parūgštinto etanolio (5 ml 99,8 % acto rūgšties ir 95 ml 96,3 % etanolio. Palyginamas tirpalas ruošiamas taip pat, tik nepilamas aliuminio chlorido reagentas. Šiuos du tirpalus paliekame 30 min. stovėti. Tirpalų absorbcija matuojama spektrofotometru prie 425 nm bangos ilgio. Pagal Europos farmakopėją flavonoidų kiekis, išreikštas hiperozidu turi būti ne mažesnis kaip 0,4 %. Flavonoidų kiekis, išreikštas hiperozidu apskaičiuojamas pagal formulę: ;
A – absorbcija;
2.4.2.4 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas pagal DPPH
(2,2-difenil-1-pikrihidrazil hidrato) radikalų surišimo metodą.
DPPH tirpalo ruošimas. 10 mg DPPH medžiagos tirpinama 125 ml
acetonitrilo ir 125 ml etanolio. Pagamintas tirpalas iki naudojimo turi būti laikomas tamsioje vietoje. Analizei imama 3000 µl DPPH tirpalo, pilama 77 µl augalinės žaliavos ekstrakto ir gerai sumaišius laikoma 15 min. tamsioje vietoje. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj augalinio ekstrakto pilamas toks pat kiekis 70 % (v/v) etanolio. Prieš matuojant tiriamųjų tirpalų absorbcijas spektrofotometras nukalibruojamas 70 % (v/v) etanoliu. Pirmiausia matuojamas palyginamasis tirpalas, o vėliau visi tiriamieji ekstraktai. DPPH surišimo absorbcija apskaičiuojama iš palyginamo tirpalo absorbcijos atėmus tiriamo ekstrakto absorbcijos dydį. Absorbcija matuojama prie 515 nm bangos ilgio.
Tokiomis pat sąlygomis ruošiami skirtingų koncentracijų (0,1 – 0,3 mg/ml) tiriamieji ir palyginamieji tirpalai. Kalibraciniam grafikui naudojami 5 - 7 skirtingų rutino koncentracijų tirpalai.
Gauti rezultatai vertinami pagal rutino kalibracinės kreivės regresijos lygtį y = 0,7506x + 0,118;
R2= 0.9955;
y = absorbcijos dydis;
4 pav. Rutino kalibracinis grafikas antioksidaciniam aktyvumui nustatyti
2.5 Statistinė duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta „MS Excel 2008“ (Microsoft, JAV) programine įranga. Gauti tyrimų duomenys apskaičiuoti pagal formules ir suvesti į duomenų bazę. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis. Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas, taikant „IBM SPSS Statistics 22.0“ programą.
y = 0,7506x + 0,1181 R² = 0,9955 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 Rutino konc. mg/ml Ab so rb cijos dyd is
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 Skirtingose kultivavimo vietose rinkti vaistinių medetkų žiedai
5 pav. Skirtingose auginimo vietose rinktos žaliavos
Tyrimams buvo naudojami vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žydėjimo metu surinkti žiedai iš skirtingų auginimo vietų. Iš viso buvo surinktos 8 žaliavos. Daugiausia medetkų žiedų buvo surinkta Aukštaitijos ir Žemaitijos regionuose, po 3. Dzūkijoje vaistinė augalinė žaliava buvo surinkta iš dviejų skirtingų kultivavimo vietų.
3.2 Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Atliekant spektrofotometrinius tyrimus buvo naudojami etanoliniai 70 % (v/v) vaistinių medetkų (Calendula officinalis L.) žiedų ekstraktai. Ekstraktai paruošti iš 8 skirtingose kultivavimo vietose surinktų medetkų žiedų. Tiriant ekstraktus buvo nustatytas bendras flavonoidų, fenolinių junginių kiekio įvairavimas ir antioksidacinis aktyvumas. Bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE mg/g, o bendras
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Aukštaitija Žemaitija Dzūkija Suvalkija
3 3 2 0 Augi n imo viet ų sk aičiu s
flavonoidų kiekis kaip ir antioksidacinis aktyvumas išreikšti RE mg/g orasausės žaliavos. Bendras flavonoidų kiekio įvairavimas buvo nustatinėjamas ir pagal Lietuvoje nenaudotą galiojančio leidimo Europos farmakopėjos monografijoje aprašytą spektrofotometrijos metodą. Šiame tyrime rezultatai reiškiami HE %. RE mg/g parodo koks junginių kiekis, išreikštas rutino ekvivalentu gali neutralizuoti DPPH radikalus ir taip sukelti antioksidacinį poveikį.
Analizuota skirtinguose Lietuvos regionuose rinkta žaliava, tiriant medetkų žiedų ekstraktus. Bandymai buvo atliekami tris kartus. Gauti rezultatai pateikiami 6 10 paveiksluose.
3.2.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas vaistinių medetkų
žiedų ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu.
6 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas vaistinių medetkų žiedų ekstraktuose.
Suskaičiavus bendrą fenolinių junginių kiekį rezultatai buvo suvestį į diagramą. Pagal gautus duomenis matyti, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas Navickų kaime, Alytaus rajone rinktoje žaliavoje (22,03 GRE mg/g).
22,03 12,4 17,13 15 14,8 18,2 16,1 13,3 0 5 10 15 20 25 Navickų k., Alytaus raj. Aleksotas, Kaunas Kauno botanikos sodas Eigirdžių k., Telšių raj. Kartenos miestelis, Kretingos raj. Užpalių miestelis, Utenos apskr. Laugalių k., Klaipėdos raj. Dyviliškių k., Lazdijų raj. Fenoli ni ų j ungi ni ų ki ek is G R E m g/ g
Šiek tiek mažesni rezultatai buvo Utenos (18,2 GRE mg/g) ir Kauno botanikos sodo (17,13 GRE mg/g) vaistinių augalinių žaliavų. Matomas ryškus skirtumas tarp Navickų kaime rinktų vaistinių medetkų nustatyto bendro fenolinių junginių kiekio ir Kauno botanikos sode augintų medetkų. Mažiausi rezultatai buvo užfiksuoti Kaune, Aleksote (12,4 GRE mg/g), Dyviliškių kaime, Lazdijų rajone (13,3 GRE mg/g) ir Kartenos miestelyje, Kretingos rajone (14,8 GRE mg/g) augintose vaistinėse medetkose. Apskaičiuotas visų gautų rezultatų statistinis vidurkis (16,12 GRE mg/g). Lyginant vidurkį su didžiausiu ar mažiausiu rezultatu matyti aiškūs skirtumai. Galima teigti, kad skirtingose vietovėse surinktose augalinėse žaliavose bendras fenolinių junginių kiekis yra labai skirtingas. Skirtumas tarp didžiausio fenolinių junginių gauto kiekio Navickų kaime ir mažiausio rezultato Kaune rinktose medetkose yra beveik dvigubas.
3.2.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas vaistinių medetkų žiedų
ekstraktuose, spektrofotometriniu metodu.
7 pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas vaistinių medetkų žiedų ekstraktuose. 25,37 17,8 21,9 21,77 22,57 20,3 24,03 19,2 0 5 10 15 20 25 30 Navickų k., Alytus Aleksotas, Kaunas Kauno botanikos sodas Eigirdžių k., Telšių raj. Kartenos miestelis, Kretingos raj. Užpalių miestelis, Utenos apskr. Laugalių k., Klaipėdos raj. Dyviliškių k., Lazdijų raj. Flavonoi dų k iek is R E m g/ g
Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas RE mg/g. Didžiausias flavonoidų kiekis buvo nustatytas Navickų kaime, Alytaus rajone (25,37 RE mg/g), Laugalių kaime, Klaipėdos rajone (24,03 RE mg/g) ir Kartenos miestelyje, Kretingos rajone (22,57 RE mg/g) augintuose medetkų žieduose. Mažiausias flavonoidų kiekis buvo nustatytas Kaune, Aleksote (17,8 RE mg/g), Dyviliškių kaime, Lazdijų rajone (19,2 RE mg/g) ir Užpalių miestelyje, Utenos raj. (20,3 RE mg/g) rinktose medetkose. Skirtumai tarp didžiausių ir mažiausių gautų rezultatų yra gana ryškūs. Apskaičiuotas ir visose auginimo vietose gautų rezultatų statistinis vidurkis (21,62 RE mg/g).
3.2.3 Bendras flavonoidų kiekio išreikšto hiperozidu, nustatymas
pagal Europos farmakopėjoje aprašytą metodiką.
8 pav. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas vaistinių medetkų žieduose, taikant Europos farmakopėjoje aprašytą spektrofotometrinį tyrimo metodą.
Tyrimas buvo atliekamas pagal Europos farmakopėjoje aprašytą spektrofotometrinį metodą, kuris skirtas bendram flavonoidų, išreikštų hiperozidu, kiekiui (ne mažiau kaip 0,4 %) nustatyti. Atlikus spektrofotometrinę analizę,
0,38 0,45 0,397 0,46 0,386 0,416 0,553 0,37 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Kauno botanikos sodas Aleksotas, Kaunas Užpalių miestelis, Utenos apskr. Kartenos miestelis, Kretingos raj. Eigirdžių k., Telšių raj. Dyviliškių k., Lazdijų raj. Navickų k., Alytaus raj. Laugalių k., Klaipėdos raj. Flavonoi dų k iek is H E %
didžiausias suminio flavonoidų kiekio įvairavimas nustatytas Navickų kaime, Alytaus raj., Kartenos miestelyje, Klaipėdos raj. ir Kauno mieste (Aleksote) rinktose vaistinėse augalinėse žaliavose. Mažiausias kiekis flavonoidų buvo nustatytas Laugalių kaimo, esančio Klaipėdos rajone augalinėje žaliavoje. Žvelgiant į grafiką galima matyti, kad nėra labai ryškaus skirtumo tarp duomenų. Rezultatai gali skirtis dėl nevienodu metu surinktų žaliavų, dėl tyrimuose atliktų paklaidų. Medetkos žydėjimo periodas yra pakankamai ilgas, o didžiausias kiekis flavonoidų būna vaistinės augalinės žaliavos žydėjimo pradžioje. Skirtingose kultivavimo vietose rezultatai buvo labai panašūs. Apskaičiuotas ir visų auginimo vietų bendro flavonoidų kiekio vidurkis. Jis viršija minimalią 0,4 % ribą nustatytą Europos farmakopėjos „Calendula flos“ monografijoje.
3.2.4 Bendro Flavonoidų kiekio, nustatyto dviem skirtingais
spektrofotometriniais metodais, rezultatų palyginimas.
9 pav. Suminio flavonoidų kiekio, nustatyto dviem skirtingais metodais, rezultatų palyginimas.
Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatytas dviem skirtingais metodais. Įprastiniu spektrofotometriniu metodu gauti rezultatai pažymėti mėlyna spalva, o Europos farmakopėjoje aprašyto metodo – raudona. Abiejų tyrimų rezultatai buvo išreikšti skirtingais ekvivalentais. Siekiant juos palyginti buvo atliktas hiperozido
25,37 17,8 21,9 21,77 22,57 20,3 24,03 19,2 7,3 5,9 5 5,1 6 5,2 4,9 5,5 0 5 10 15 20 25 30 Spektrofotometrinis tyrimo metodas Europos farmakopėjoje aprašytas tyrimo metodas
Flavonoi dų k iek is R E m g/ g
ekvivalentu išreikštų (Europos farmakopėjoje aprašyto metodo) rezultatų perskaičiavimas į rutino ekvivalentą. Iš grafiko matyti, kad įprastiniu spektrofotometriniu metodu atliktų tyrimų rezultatai skyrėsi nuo rezultatų, gautų naudojant Europos farmakopėjos metodiką. Tam įtakos galimai turėjo analizei naudotos skirtingos, metodikosjų sudėtingumas, analitinių markerių parinkimas. Taip pat įtakos rezultatams galėjo turėti ir skirtingas metoduose naudotas bangos ilgis.
3.2.5 Antioksidacinio aktyvumo nustatymas vaistinių medetkų žiedų
ekstraktuose.
10 pav. Antioksidacinio aktyvumo įvairavimas vaistinių medetkų žieduose, rinktuose skirtingose auginimo vietose.
Atlikus antioksidacinio aktyvumo analizę, naudojant DPPH radikalus, nustatyta, kad didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasižymėjo Užpalių miestelyje, Utenos raj. rinktų medetkų žiedų ekstraktai (22,6 RE mg/g). Šiek tiek mažesnis aktyvumas buvo Navickų kaimo, Alytaus rajone (17,1 RE mg/g), Laugalių kaime, Klaipėdos rajone (16,97 RE mg/g) ir Dyviliškių kaime, Lazdijų rajone (16 RE mg/g)
17,1 13 14,73 15,37 11,9 22,6 16,97 16 0 5 10 15 20 25 Navickų k., Alytaus raj. Aleksotas, Kaunas Kauno botanikos sodas Eigirdžių k., Telšių raj. Kartenos miestelis, Kretingos raj. Užpalių miestelis, Utenos apskr. Laugalių k., Klaipėdos raj. Dyviliškių k., Lazdijų raj. A nti ok si daci ni s ak tyvum as R E m g/ g
rinktoje vaistinėje augalinėje žaliavoje. Pats mažiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas Kartenos miestelyje, Kretingos rajone (11,9 RE mg/g) ir Kaune, Aleksote (13 RE mg/g) rinktoje žaliavoje. Apskaičiuotas visų regionų antioksidacinio poveikio vidurkis (16 RE mg/g). Antioksidacinis aktyvumas yra priklausomas nuo bendro fenolinių junginių kiekio. Yra daug įvairių metodų bendram flavonoidų kiekiui, bendram fenolinių junginių kiekiui, antioksidaciniam aktyvumui nustatinėti, todėl galimi skirtumai tarp rezultatų.
Rezultatus galima palyginti su anksčiau Lietuvoje atliktais
Silybum marianum L (Tikrųjų margainių) antioksidacinio aktyvumo tyrimais.
Nustatytas antioksidacinis aktyvumas buvo apie 25 % [1]. Šio darbo atliktame tyrime antioksidacinio poveikio vidurkis buvo 1,6 %. Rezultatai labai skiriasi, tačiau reikia atsižvelgti, kad DPPH radikalo surišimas vertintas Brand–Williams metodu. Ši grupė mokslininkų tyrė augalą, turintį diploidinį genų rinkinį, užaugintą in vitro sąlygomis [60]. Rezultatų skirtumai ir galimos paklaidos atsiranda dėl skirtingų tyrimams naudojamų vaistinių augalinių žaliavų, skirtingų metodikų, atlikimo principų ir kitų reikšmingų sąlygų, todėl rezultatus lyginti nėra korektiška.
IŠVADOS
1. Spektrofotometriniu metodu nustatyti rezultatai: didžiausias fenolinių junginių kiekis (22,03 GRE mg/g) buvo nustatytas Navickų kaime, Alytaus raj. augintų medetkų žieduose.Didžiausias flavonoidų kiekis (25,37 RE mg/g) buvo nustatytas Navickų kaime, Alytaus raj. augintų medetkų žieduose.
2. Pagal Europos farmakopėjoje aprašytą tyrimo metodą didžiausias flavonoidų kiekio įvairavimas buvo Navickų kaime, Alytaus rajone - 0,553% HE augintų medetkų žieduose.
3. Didžiausias antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas Užpaliuose,Utenos apskrityje augintų vaistinių medetkų žieduose (22,6 RE mg/g).
Antioksidacinis aktyvumas yra statistiškai priklausomas nuo bendro fenolinių junginių kiekio (koreliacijos koeficientas 0,523).
PRIEDAI
Augimvietė Rezultatai Vidurkis
Navickų k., Alytaus raj.
26,4 25,4 24,1 25,6 Kaunas, Aleksotas 17,8 17,8 17,8 17,8
Kauno botanikos sodas
21,1
21,9 23,9
20,7
Eigirdžių k., Telšių raj.
21,1 21,8 22,7 21,5 Kartenos miestelis, Kretingos raj. 21,9 22,6 24,7 21,1
Užpaliai, Utenos raj.
19,4 20,3 21,8 19,8 Laugalių k., Klaipėdos raj. 22,6 24 26,5 23 Dyviliškių k., Lazdijų raj. 18 19,2 21,2 18,4
1 pav. Spektrofotometriniu metodu vaistinių medetkų žieduose nustatytų flavonoidų kiekio rezultatai mg/g.
Augimvietė Rezultatai Vidurkis
Navickų k., Alytaus raj.
27,6 22,0 16 22,5 Kaunas, Aleksotas 13,3 12,4 11,8 12,1
Kauno botanikos sodas
23,7
17,1 13,2
14,5
Eigirdžių k., Telšių raj.
15,6 15 14,3 15,1 Kartenos miestelis, Kretingos raj. 15,5 14,8 14,6 14,3
Užpaliai, Utenos raj.
18,6 18,2 17,4 18,6 Laugalių k., Klaipėdos raj. 17,1 16 15,9 15,2 Dyviliškių k., Lazdijų raj. 14,4 13,3 12,4 13,2
2 pav. Spektrofotometriniu metodu vaistinių medetkų žieduose nustatytų fenolinių junginių kiekio rezultatai mg/g.
