LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
RAIMONDA ŢIDONYTĖ
JUODUOGIO ŠEIVAMEDŢIO (Sambucus nigra L.) EKSTRAKTŲ
ANTIOKSIDACINIO POVEIKIO ŢIURKIŲ GLIOBLASTOMOS C6
LĄSTELIŲ KULTŪRAI TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Prof. dr. Daiva Majienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS
BIOCHEMIJOS LABORATORIJA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data
JUODUOGIO ŠEIVAMEDŢIO (Sambucus nigra L.) EKSTRAKTŲ
ANTIOKSIDACINIO POVEIKIO ŢIURKIŲ GLIOBLASTOMOS C6
LĄSTELIŲ KULTŪRAI TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Prof. dr. Daiva Majienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Doc. dr. Vilma Gudienė Magistrantė
Data Raimonda Ţidonytė
Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 4
SUMMARY ... 5
SANTRUMPOS ... 6
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11
1.1. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) apibūdinimas ... 11
1.2. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų ir uogų panaudojimas ... 11
1.2.1. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) panaudojimas liaudies medicinoje ... 11
1.2.2. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų ir uogų panaudojimas šiuolaikinėje medicinoje ... 12
1.3. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų ir uogų cheminė sudėtis ... 13
1.3.1. Kvercetinas ... 14
1.4. Glioblastoma ... 15
1.5. Mitochondrijos – ROS generatorės ... 16
1.6. Laisvieji radikalai ... 18
1.6.1. Reaktyvios deguonies formos ... 18
1.6.1.1. Vandenilio peroksidas ... 19
1.6.2. Reaktyvios azoto formos ... 20
1.7. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) antioksidacinio poveikio ląstelėms tyrimai ... 21
2. METODIKA ... 25
2.1. Naudotos medţiagos ir aparatūra ... 25
2.1.1. Naudotos medţiagos ... 25
2.1.2. Naudota aparatūra ... 25
2.2. Tyrimo objektas ... 26
2.3. Ekstraktų gamyba ... 26
2.4. Fenolinių junginių kiekio nustatymas ekstraktuose ... 26
2.5. Vandenilio peroksido nustatymas fluorimetru ... 27
2.6. Ląstelių kultivavimas ... 28
2.7. Ląstelių tankio nustatymas ... 28
2.8. Viduląstelinių laisvųjų radikalų koncentracijos nustatymas fluorimetru ... 29
2.9. Superoksido koncentracijos mitochondrijose nustatymas fluorescenciniu metodu ... 30
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktuose ... 31
3.2. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikis vandenilio peroksido koncentracijai ... 32
3.3. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikis C6 ląstelių viduląstelinių radikalų generacijai ... 38
3.4. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikis superoksido koncentracijai C6 ląstelių mitochondrijose ... 46
4. IŠVADOS ... 55
5. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 56
SANTRAUKA
R. Ţidonytės magistro baigiamasis darbas „Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų antioksidacinio poveikio ţiurkių glioblastomos C6 ląstelių kultūrai tyrimas“. Mokslinio darbo vadovė – prof. dr. D. Majienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Neuromokslų instituto Biochemijos laboratorija. Kaunas, 2019.
Darbo tikslas – įvertinti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų antioksidacinį poveikį ţiurkių glioblastomos (C6) ląstelių kultūrai.
Darbo uţdaviniai:
1) Nustatyti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų gebėjimą neutralizuoti vandenilio peroksidą.
2) Įvertinti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikį viduląstelinių radikalų generacijai.
3) Nustatyti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikį mitochondrijų superoksido koncentracijai.
Darbo objektas – juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų, uogų, uogų išspaudų ekstraktai. Tyrimo metodai. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų, uogų bei uogų išspaudų ekstraktų gebėjimas neutralizuoti vandenilio peroksidą nustatytas fluorimetriniu metodu, naudojant
AmplexRed daţą. Augalo ekstraktų poveikis ţiurkių glioblastomos C6 ląstelių viduląstelinių radikalų
generacijai įvertintas fluorimetriniu metodu, naudojant DCF-DA daţą. Augalinių ekstraktų poveikis ţiurkių glioblastomos ląstelių mitochondrijų superoksido koncentracijai nustatytas fluorescenciniu metodu, naudojant MitoSox Red daţą.
Rezultatai. Juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) ţiedų (0,4 – 40 μg/ml fenolinių junginių), uogų (0,4 – 40 μg/ml fenolinių junginių), uogų išspaudų (0,4 – 40 μg/ml fenolinių junginių) ekstraktai sumaţino vandenilio peroksido koncentraciją atitinkamai: 12,5 – 87,3 %, 16,1 – 89,5 %, 14,1 – 91,6 %, lyginant su kontrole. Stipriausias ekstraktų poveikis C6 ląstelių viduląstelinių radikalų generacijai pasireiškė po 120 min. inkubavimo, esant didţiausiam fenolinių junginių kiekiui juose: ţiedų ekstraktas (40 μg/ml) sumaţino viduląstelinių radikalų generaciją 57,5 %, uogų (40 μg/ml) – 58,7 %, uogų išspaudų (40 μg/ml) – 59,1 %, lyginant su kontrole. Tirti ekstraktai sumaţino mitochondrijų superoksido koncentraciją C6 ląstelių mitochondrijose: ţiedų (1 – 40 μg/ml) – 14,9 – 44,6 %, uogų (1 – 40 μg/ml) – 15,4 – 46,7 %, uogų išspaudų (1 – 40 μg/ml) – 13,9 – 49,4 %, lyginant su kontrole.
Išvados. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų antioksidacinis poveikis vandenilio peroksidui, reaktyvių deguonies formų (ROS) generacijai bei mitochondrijų superoksido koncentracijai C6 ląstelėse yra panašus, priklauso nuo fenolinių junginių koncentracijos.
SUMMARY
R. Ţidonytė Master‘s Thesis „Antioxidant effect of elderberry (Sambucus nigra L.) extracts on rat glioblastoma C6 cell culture“. Scientific supervisor – Prof. PhD. D. Majienė. Laboratory of biochemistry, Institute of neuroscience, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2019. The aim of the research – to evaluate and compare antioxidant effect of elderberry (Sambucus nigra L.) extracts on rat glioblastoma cell culture.
Objectives:
1) To determine and compare the ability of elderberry (Sambucus nigra L.) extracts to neutralize hydrogen peroxide.
2) To evaluate and compare the effect of elderberry (Sambucus nigra L.) extracts on the generation of intracellular radicals.
3) To determine and compare the effect of elderberry (Sambucus nigra L.) extracts on the mitochondrial superoxide concentration.
The object of research – extracts of flowers, berries and berry pomace of elderberry (Sambucus nigra L.).
Methods. The ability of extracts of flowers, berries and berry pomace of elderberry (Sambucus nigra L.) to neutralize hydrogen peroxide was determined by fluorimetric method using AmplexRed dye. The effect of plant extracts on the intracellular radical generation was assessed by fluorimetric method using DCF-DA dye. The effect of plant extracts on the mitochondrial superoxide concentration of rat glioblastoma cells was determined by fluorescent method using MitoSox Red dye.
Results. The extracts of flowers (0,4 – 40 μg/ml phenolic compounds), berries (0,4 – 40 μg/ml phenolic compounds), berry pomace (0,4 – 40 μg/ml phenolic compounds) of elderberry (Sambucus
nigra L.) reduced concentration of hydrogen peroxide by 12,5 – 87,3 %, 16,1 – 89,5 %, 14,1 – 91,6 %,
respectively. The strongest effect of extracts on the generation of C6 cell intracellular radicals occurred after 120 min. incubation when there was the highest amount of phenolic compounds: extract of flowers (40 μg/ml) reduced the generation of intracellular radicals by 57,5 %, extract of berries (40 μg/ml) – 58,7 %, extract of berry pomace (40 μg/ml) – 59,1 %, compared to control sample. The extracts reduced mitochondrial superoxide concentration in rat glioblastoma cells: extracts of flowers (1 – 40 μg/ml) – 14,9 – 44,6 %, extracts of berries (1 – 40 μg/ml) – 14,4 – 46,7 %, extracts of berry pomace (1 – 40 μg/ml) – 13,9 – 49,4 %, respectively, compared to control sample.
Conclusions. The antioxidant effect of elderberry extracts (Sambucus nigra L.) on hydrogen peroxide, the generation of ROS and the concentration of mitochondrial superoxide in C6 cells is similar. It depends on the concentration of phenolic compounds.
SANTRUMPOS
ADP – adenozin 5' – difosfatas ATP – adenozin 5' – trifosfatas
C6 – ţiurkių glioblastomos ląstelių kultūra DCF-DA – 2,7 dichlorofluorescindiacetatas
DMEM – Dulbecc‘o modifikuota mitybinė terpė (angl. Dulbecc‘o Modified Eagle Medium) DMSO – dimetilsulfoksidas
FBS – fetalinis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum) HBSS – buferinė sistema (angl. Hank‘s balanced salt solution) HPR – krienų peroksidazė (angl. Horseradish peroxidase) mtDNR – mitochondrinė deoksiribonukleorūgštis
NADPH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas NO – azoto oksidas
NOS – azoto oksido sintazė
PBS –fosfatinis druskų buferis (angl. Phosphate Buffer Saline) RNS – reaktyvios azoto formos (angl. Reactive nitrogen species) ROS – reaktyvios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species)
ĮVADAS
Juoduogis šeivamedis (Sambucus nigra L.) – augalas, priklausantis ūksmininių (Adoxaceae L.) šeimai [1,2] nuo seno gana plačiai naudojamas dėl priešvirusinio [3,4], antibakterinio [4], uţdegimą [3], alergines reakcijas maţinančio, vazoprotekcinio [2] bei priešvėţinio poveikio [2,5]. Šį platų augalo panaudojimą medicinoje lemia augalinėse ţaliavose (ţieduose, uogose) aptinkami flavonoidai bei jų glikozidai, fenolinės rūgštys, antocianinai, eteriniai aliejai, vitaminai ir mineralai [1,2,6]. Fenoliniai junginiai, esantys šeivamedţio uogose ir ţieduose – antriniai augalo metabolitai, pasiţymintys stipriomis antioksidacinėmis savybėmis tiek in vitro, tiek in vivo [2]. Manoma, jog fenolinių junginių antioksidacinis poveikis lemia reaktyvių deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formų koncentracijos sumaţėjimą ląstelėse, kuriose laisvųjų radikalų koncentracija yra padidėjusi bei apsaugo sveikas ląsteles nuo oksidacinės paţaidos [7-9].
Esant oksidaciniam stresui, ląstelėse sutrinka pusiausvyra tarp ROS ir RNS sintezės bei jų neutralizavimo, todėl laisvųjų radikalų koncentracija ląstelėse padidėja [10,11]. Laisvųjų radikalų padidėjimas ląstelėse sukelia DNR, baltymų, lipidų paţaidą, skatina genetinį nestabilumą bei tumorogenezę [7,9]. Šie procesai lemia lėtinių ligų, piktybinių navikų, jų metaztazių išsivystymą [9].
Tyrimų Kumar B. et al. 2008 metu nustatyta, jog ţmogaus prostatos vėţio ląstelės, generuoja daugiau ROS (identifikuoti superoksido radikalai bei vandenilio peroksidas), lyginant su sveikomis prostatos ląstelėmis [12]. Šis skirtumas lėmė tolimesnius antioksidantų (tarp jų ir augalinių ekstraktų) poveikio tyrimus vėţinių ląstelių kultūroms. Teoh-Fitzgerald M. L. et al. 2014 atliko in vivo tyrimus, kurių metu nustatyta, jog padidėjusi antioksidanto (superoksido dismutazės-3) gamyba sumaţino krūties vėţio metastazių skaičių [13]. Dėl šios prieţasties, antoksidaciniu aktyvumu pasiţymintys junginiai bei augaliniai ekstraktai vis daţniau yra įtraukiami į piktybinių navikų gydymo strategijas, kaip priemonė, galinti sumaţinti padidėjusią laisvųjų radikalų generaciją paţeistose ląstelėse, apsaugoti sveikas ląsteles [7,13]. Taip pat vertėtų paminėti ir tai, jog augaliniai ekstraktai, veikdami į ROS ir RNS, veikia selektyviai tik vėţines ląsteles [1,14], t.y. sveikos ląstelės nėra paveikiamos, todėl nėra daroma ţala organizmui [5].
Augalinės kilmės ţaliavos, tarp jų ir juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedai bei uogos, vis daţniau tampa mokslinių tyrimų objektu [5,15]. Mokslininkai visame pasaulyje tiria šio vaistinio augalo augalinių ţaliavų poveikį tiek sveikoms, tiek paţeistoms ląstelėms [16]. Nustatytas antioksidacinis poveikis ţmogaus kiaušidţių karcinomos (OAW-42) [5], storosios ţarnos adenokarcinomos (Caco-2) [15], krūties adenokarcinomos (MCF-7) [17] ląstelių kultūroms.
Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) vaistinių augalinių ţaliavų ekstraktų antioksidacinis poveikis navikinėms ląstelėms pastebėtas jau prieš 30 metų [18], tačiau toks augalų ekstraktų poveikis nėra plačiai aptartas (tyrimai atlikti tik su keliomis ląstelių kultūromis). Taip pat
trūksta informacijos apie uogų išspaudų antioksidacinį poveikį. Dėl šių prieţasčių, trys juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktai (uogų, ţiedų bei uogų išspaudų) buvo tiriami, naudojant ţiurkių glioblastomos C6 ląstelių kultūrą, siekiant išsiaiškinti antioksidacininio poveikio panašumus ir skirtumus. Šiame darbe tirtas augalo ekstraktų poveikis navikinių ląstelių ekstraląstelinių ir viduląstelinių radikalų generacijai.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų antioksidacinį poveikį ţiurkių glioblastomos (C6) ląstelių kultūrai.
Darbo uţdaviniai:
1) Nustatyti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų gebėjimą neutralizuoti vandenilio peroksidą.
2) Įvertinti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikį viduląstelinių radikalų generacijai.
3) Nustatyti ir palyginti juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikį mitochondrijų superoksido koncentracijai.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) apibūdinimas
Juoduogis šeivamedis (Sambucus nigra L.) – tai visame pasaulyje plačiai paplitęs ūksmininių (Adoxaceae L.) šeimos augalas, augantis Europoje, Azijoje, Šiaurės Afrikoje, Šiaurės Amerikoje [1,2]. Tai daugiametis lapuotis krūmas ar nedidelis medis, augantis iki 6 m aukščio, ţydintis birţelio – liepos mėnesiais [1,19]. Augalui būdingas gausus šakojimasis, šakos trapios, lengvai nusvyra nuo ţiedų bei vaisių. Lapai gana dideli, išaugantys nuo 5 iki 15 cm ilgio, praţanginiai, sudėtiniai (sudaryti iš 5 – 11 lapelių), lapo kraštas aštriai dantytas [19]. Ţiedai baltai gelsvi, kreminiai, sukrauti į skėtiškus ţiedynus, kvapnūs. Vaisiai juodi, juodai violetiniai kaulavaisiai, subręstantys rugpjūčio – rugsėjo mėnesiais, uţaugantys iki 6 mm skersmens [1]. Vienoje kekėje gali būti net iki 2000 uogų [19]. Europos Farmakopėjoje, kaip augalo vaistinė augalinė ţaliava, yra aprašyti ţiedai, tačiau farmacijoje plačiai naudojamos ir augalo uogos [1,2]. Kitos augalo dalys yra nuodingos, todėl nėra vartojamos [2].
1.2. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų ir uogų panaudojimas
1.2.1. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) panaudojimas liaudies
medicinoje
Senovėje juoduogis šeivamedis Europoje, Šiaurės Afrikoje, Azijoje buvo laikomas šventu medţiu [19]. Buvo manoma, jog būtent šis augalas apsaugo nuo piktųjų dvasių, raganų ir mirties. Viduramţiais iš Sambucus nigra L. ţievės buvo gaminami amuletai, talismanai [19,3].
Juoduogį šeivamedį (S. nigra L.) liaudies medicinoje ţmonės naudoja jau keletą tūkstantmečių, gydymui naudojamos visos augalo dalys [20]. Jau 400 metų pr. Kr. Hipokratas aprašė
S. nigra L. kaip gydomosiomis savybėmis pasiţymintį augalą ir naudojo jį gydymui. Taip pat dėl jo
gydomųjų savybių šį augalą savo praktikoje naudojo ir Teofrastas, Dioskoridas bei Galenas [4,20]. Indėnai juoduogį šeivamedį (S. nigra L.) naudojo kosuliui, viršutinių kvėpavimo takų infekcijoms bei odos ligoms gydyti [4]. Ţiedai buvo naudojami kaip insekticidas. Senovės egiptiečiai ţiedų uţpilus naudojo išoriškai kaip odą šviesinančią priemonę, kompresais gydė ţaizdas [3].
Pastaruoju metu juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogos naudojamos kaip atsikosėjimą gerinanti, vidurius laisvinanti ir diurezę skatinanti priemonė [19]. Uogos taip pat naudojamos maisto pramonėje, kepinių, sulčių, vyno gamyboje [3,19]. Augalo ţiedai liaudies medicinoje naudojami kaip atsikosėjimą gerinanti, diurezę skatinanti, kraujotaką suaktyvinanti, uţdegimą maţinanti priemonė.
Manoma, jog ţiedai taip pat gydo kataraktą [19]. Ţievė ir lapai liaudies medicioje naudojami išoriškai kaip kompresai ţaizdų gijimui skatinti, skausmui ir uţdegimui maţinti, esant reumatoidiniam artritui.
Per os vartojama kaip vidurius laisvinanti ir vėmimą skatinanti priemonė [3,19].
1.2.2. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų ir uogų panaudojimas
šiuolaikinėje medicinoje
Priešvirusinis veikimas. Juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų bei ţiedų ekstraktai maţina Influenza A ir B sukeliamus simptomus [3,21]. Krawitz et al. 2011 in vitro ištyrė, jog juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų ekstraktas 1:100 pasiţymi priešvirusinėmis savybėmis ir per 48 h apie 30 % sumaţina Influenza A ir B viruso štamų gyvybingumą, inhibuoja jų replikaciją [4]. Taip pat augalo uogų bei ţiedų ekstraktai veikia ir paragripo virusą [21]. Kadangi ekstraktai slopina virusų plitimą ir dauginimąsi, jie kartu maţina gripo simptomus: karščiavimą, šaltkrėtį, galvos skausmą, silpnumą, gerklės skausmą, kosulį, nosies uţgulimą, raumenų skausmą [3]. Kong et al. 2009 atliko dvigubai aklą, placebo kontroliuojamą klinikinį tyrimą. Jo metu buvo tirtas juoduogio šeivamedţio (S.
nigra L.) uogų ekstrakto poveikis pacientams, sergantiems gripu (Influenza A ir B) ir
besiskundţiantiems gripo simptomais. Pastebėta, jog vartojant augalo uogų ekstrakto (300 mg) kapsules, jau po 24 h gripo simptomai statistiškai reikšmingai sumaţėjo, lyginant su placebo grupe [22]. Pastebėtas inhibuojantis veikimas ir prieš Herpes simplex-1 bei ŢIV virusus in vitro [23]. Todėl galima teigti, jog juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų bei ţiedų ekstraktai veikia tiek RNR, tiek DNR virusus.
Antibakterinis veikimas. Juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų ekstraktas pasiţymi ne tik priešvirusiniu poveikiu, bet ir veikia bakteriostatiškai. Krawitz et al. 2011 atliko tyrimą in vitro, kurio metu buvo tiriamas augalo uogų ekstrakto poveikis gram-teigiamoms bakterijoms: Streptococcus
pyogenes, Streptococcus C ir G štamams, gram-neigiamai Branhamella catarrhalis bakterijų rūšiai.
Ištirta, jog augalo uogų ekstraktas sustabdo bakterijų augimą ir dauginimąsi > 70 %, lyginant su kontrole [4]. Klinikiniais tyrimais įrodyta, jog juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų bei ţiedų ekstraktai gali sumaţinti bakterijų sukeliamus viršutinių kvėpavimo takų uţdegimus (sinusitą, bronchitą, laringitą), bei jų sukeliamus simptomus: intensyvų sekreto išsiskyrimą iš sinusų, galvos skausmą, nosies paburkimą, kosulį bei padidėjusią temperatūrą, kartu vartojant antibiotikus, lyginant su placebu (vartojant tik antibiotikus) [3]. Tyrimais in vitro ištirta, jog šeivamedţio ţiedų etanoliniai ekstraktai pasiţymi stipresnėmis bakteriostatinėmis savybėmis nei tokios pačios koncentracijos uogų ekstraktai [24].
Priešuţdegiminis veikimas. Juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) etanoliniai uogų bei ţiedų ekstraktai pasiţymi imunomoduliaciniu poveikiu [3]. Yra ţinoma, jog makrofagai ir dendritinės ląstelės reaguodamos į dirgiklius išskiria azoto oksidą (NO), kuris lemia uţdegiminius procesus organizme [25]. In vitro tyrimais nustatyta, jog juoduogių šeivamedţių (S. nigra L.) ţiedų bei uogų etanoliniai ekstraktai pasiţymi NO inhibuojančiu veikimu, todėl slopina uţdegiminius procesus. Vertėtų paminėti, jog augalo ţiedų ekstraktas pasiţymi stipresniu imunomoduliaciniu poveikiu nei uogų ekstraktas [25,26]. Taip pat in vitro tyrimais nustatyta, jog juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) ţiedų ekstraktas veikia į uţdegiminius mediatorius interleukiną (IL – 1) bei naviko nekrozės faktorių (TNF – α) ir taip slopina uţdegiminius procesus ląstelėse [3]. Būtent todėl juoduogių šeivamedţių (S.
nigra L.) ţiedų bei uogų ekstraktai naudojami kaip papildoma terapija tokioms uţdegiminėms ligoms,
kaip reumatoidinis artritas, autoimuninėms širdies ligoms, išsėtinei sklerozei gydyti bei būklei lengvinti, taikant medikamentinį gydymą [25].
Gliukozės koncentraciją maţinantis veikimas, sergant II tipo cukriniu diabetu. II tipo cukriniu diabetu serga apie 90 % visų sergančiųjų cukriniu diabetu. Ši liga pasireiškia, kuomet vystosi organizmo rezistentiškumas insulinui [27]. In vitro tyrimais nustatyta, jog juoduogio šeivamedţio (S.
nigra L.) uogų ekstraktas bei sultys inhibuoja α gliukozidazę (skaido disacharidus į gliukozę) bei α
amilazę (skaido krakmolą į oligosacharidus), todėl sumaţėja gliukozės koncentracija kraujyje, daugiau gliukozės patenka į audinius [27,28].
Priešvėţinis veikimas. Neseniai in vitro pastebėta, jog juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų ekstraktas citotoksiškai veikia epitelines kiaušidţių karcinomos ląsteles. Poveikis pasireiškia dėl toksinio poveikio į navikinių ląstelių mitochondrijas, sutrikdomas ląstelių kvėpavimas, augimas bei įvyksta ląstelių apoptozė [5]. Taip pat in vitro pastebėta, jog iš augalo išskirti lektinai citotoksiškai veikia ir gaubtinės ţarnos adenokarcinomos ląsteles [29].
1.3. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų ir uogų cheminė sudėtis
Cukrūs sudaro apie 8 – 9 % visų biologiškai aktyvių junginių, esančių uogose. Taip pat sudėtyje yra organinių rūgščių, antocianinų, askorbo rūgšties, pektinų, flavonoidų bei jų glikozidų (hiperozidas, kvercetinas, kvercetin-3-O-glikozidas, kvercetin-3-O-rutinozidas), aminorūgščių [1,6]. Aptinkama ir mineralų, tokių kaip: K (apie 390 mg/100 g), P (apie 54 mg/100 g), Ca (apie 28 mg/100 g), Mg (apie 26 mg/100 g), Fe (apie 1,8 mg/100 g) [6]. Ištirta, jog uogose yra specifinio baltymo – aglutinino, kuris, manoma, citotoksiškai veikia pakitusias vėţines ląsteles. Taip pat uogose nustatomi ribosomas inaktyvuojantys baltymai (RIP), kurie pasiţymi N-gliukozidazės aktyvumu (negrįţtamai inhibuoja naujų baltymų sintezę) [30,31]. Uogose, o ypač jų kauliukuose, aptinkamas
nedidelis kiekis cianogeninio glikozido – sambunigrino, kuris organizme skyla iki vandenilio cianido (HCN), cianido jonas prisijungia prie hemoglobino ir sudaro gana patvarų kompleksą. Šis kompleksas neleidţia prsijungti deguonies, todėl vystosi ląstelių hipoksija, cianozė [32].
Eterinis aliejus, esantis augalo ţieduose, sudaro iki 0,2 % visų biologiškai aktyvių medţiagų. Jo sudėtyje yra daugiau nei 80 skirtingų komponentų [6]. Ţieduose taip pat aptinkama flavonoidų (iki 3 %), iš jų daugiausiai – flavonolių: kvercetino, kemferolio ir jų glikozidų, iš kurių dominuoja: rutinas, izokvercetinas, astragalinas bei hiperozidas [30]. Taip pat ţieduose aptinkami triterpeniniai junginiai, organinės rūgštys, steroliai, gleivės, rauginės medţaigos. Ţieduose, kaip ir uogose, aptinkami pėdsakai cianogeninio glikozido – sambunigrino bei antrojo tipo ribosomas inaktyvuojančių baltymų [30].
1.3.1. Kvercetinas
Kvercetinas – tai flavonoidas, aptinkamas įvairiuose augaluose, taip pat ir juoduogiame šeivamedyje (S. nigra L.). Kvercetinas priklauso flavonoliams (vienai iš šešių flavonoidų poklasių). Pavadinimas kilęs iš ţodţio lot. Quercus liet. – ąţuolas [33]. Kvercetinas kaupiamas S. nigra L. vaisiuose, ţieduose, lapuose bei ţievėje. Pagal IUPAC nomenklatūrą, kvercetinas yra 3,3‘,4‘,5,7-pentahidroksiflavonas. Kvercetinas (1 pav.) yra aglikonas, kuriame nėra cukraus liekanos. Cukrūs (ramnozė, gliukozė, rutinozė) daţniausiai jungiasi per 3 padėtyje esančią OH grupę ir taip susidaro kvercetino glikozidai [34].
1 pav. Kvercetino struktūrinė formulė
Tiek in vitro, tiek in vivo tyrimais įrodyta, jog kvercetinas, kaip ir kiti fenoliniai junginiai, maţomis koncentracijomis apsaugo ląsteles nuo oksidacinės paţaidos, maţina laisvųjų radikalų generaciją. Taip pat junginys pasiţymi mastocitus stabilizuojančiu bei virškinamąjį traktą apsaugančiu veikimu, veikia imunosupresuojančiai dentritines ląsteles [35], inhibuoja ciklooksigenazės (COX) ir lipoksigenazės (LOX) – uţdegiminių fermentų gamybą [13].
Neseniai pastebėtas kvercetino citotoksinis veikimas in vitro gaubtinės ţarnos naviko ląstelėms. Nustatyta, jog etanolinis kvercetino tirpalas modifikuoja ląstelių proliferaciją ir diferenciaciją [36]. Pozsgai E. et al 2013 klinikinių tyrimų metu ištyrė, jog kvercetinas inhibuoja U87MG (ţmogaus glioblastomos ląstelės) gliomos ląstelių augimą ir proliferaciją. Jis sumaţina auglio
augimą, neveikdamas sveikų ląstelių [35]. Kvercetinas veikia tik į molekules – taikinius, kurie lemia navikinių ląstelių augimą, pvz.: fosfoinozitido-3-kinazę, baltymą p53, baltymą p21, kaspazę-3, todėl yra inhibuojamas tik naviko ląstelių augimas ir diferenciacija [35,36].
1.4. Glioblastoma
Glioblastoma multiforme – tai daţniausiai pasitaikantis kietasis piktybinis smegenų navikas
suaugusiems, klasifikuojamas Pasaulio Sveikatos Organizacijos, kaip IV laipsnio glioma [37-40]. Navikui būdinga greita proliferacija, agresyvi infiltracija bei spartus dauginimasis [32,41]. JAV sergamumas šiuo piktybiniu smegenų naviku siekia 3,19 100 000-iui gyventojų [37]. Tuo tarpu, Jungtinėje Karalystėje sergamumas šia liga siekia 5,0 100 000-iui gyventojų [38]. Nors pastaraisiais metais pastebima paţanga ir vis daugėja inovatyvių vėţio gydymo metodų, glioblastomos gydymas išlieka iššūkis onkologams [35]. Per paskutiniuosius tris dešimtmečius sergančiųjų išgyvenamumas nei kiek nepasikeitė. Vidutinis išgyvenamumas vis dar siekia 14,6 mėn. [37-40]. Maţiau nei 5 % pacientų išgyvenamumas siekia 5 metus, diagnozavus ligą [38,40]. Glioblastoma multiforme išsivystymui įtakos turi keletas signalinių kelių, vienas jų – dalyvaujant gliomos ląstelių tarpmembraniniams baltymams – Notch (1-4) [42]. Šie baltyminiai receptoriai yra atsakingi uţ ląstelių diferenciaciją ir augimą, valdo šių procesų pagrindinius ţingsnius [43,44].
Kitas, plačiau aptartas signalinis kelias – padidėjusi reaktyvių deguonies ir azoto formų gamyba ląstelėse [7]. Ją gali išprovokuoti tiek vidiniai (uţdegiminiai procesai, metabolizmo sutrikimai mitochondrijose), tiek išoriniai veiksniai (rūkymas, ksenobiotikų metabolizmas, jonizuojančioji spinduliuotė, sunkieji metalai) [7,8]. Vėţinėse ląstelėse viduląstelinė ROS ir RNS gamyba yra padidėjusi, tai yra siejama su pagreitėjusiu metabolizmu, genotoksiškumu, onkogenų stimuliavimu [7,45]. Smegenų ląstelės, dėl maţo regeneracijos pajėgumo bei didelio metabolinio aktyvumo, yra ypač jautrios ţalingam ROS poveikiui [7]. Padidėjusi reaktyvių deguonies formų gamyba lemia ne tik onkogenezę ląstelėje, rezistentiškumą, tačiau paţeidţia aplink esančias sveikas ląsteles bei audinius [45]. Tai palengvina naviko augimą bei invaziją [7,8,45].
Ląstelės gali keistis informacija ne tik cheminiais ar elektriniais signalais, tačiau ir mikrovezikulėmis, kurios daţniausiai aptinkamos tarpląstelinėje erdvėje [7]. Tyrimais įrodyta, jog įvairios ląstelių kultūros geba išskirti maţas pūsleles – egzosomas, kuriomis jos sąveikauja ir siunčia signalus kitoms ląstelėms. Signalai daţniausiai uţkoduoti pūslelių membranoje arba jų viduje [46]. Mokslinių tyrimų, Guescini M. et al. 2010, metu buvo nustatyta, jog astrocitai bei ţmogaus glioblastomos ląstelės išskiria egzosomas, kuriose yra mitochondrinių baltymų bei mitochondrinė
deoksiribonukleorūgštis (mtDNR). Manoma, jog taip paţeistos ląstelės gali sąveikauti su sveikomis ląstelėmis ir plisti (Alzheimerio liga, glioblastoma) [46].
Šiuo metu piktybinis navikas gydomas chirurginiu būdu, pašalinant auglį, kartu taikoma adjuvantinė radioterapija ar chemoterapija temozolomidu [7,8,32]. Piktybiniai smegenų navikai išlieka iššūkis onkologams dėl efektyvių gydymo metodų stokos, kurie nedarytų ţalos aplinkiniams gyvybiškai svarbiems audiniams [32]. Vėţinės ląstelės naudoja įvairias gynybos sistemas, tam, kad išlaikytų reikiamą aplinką ląstelių augimui bei apoptozės išvengimui [5]. Todėl glioblastomos gydymas yra gana keblus. Daugeliu atvejų piktybinis navikas nepasiduoda gydymui, pastebėtas padidėjęs atsparumas radioterapijai bei chemoterapijai [5,35]. Chirurginis gydymas taikomas labai retai, nes daţniausiai liga diagnozuojama vėlyvose stadijose, kuomet navikas būna paţengęs [35]. Gydymas chemoterapija yra ribotas dėl toksiškumo visam organizmui, maţos medikamentų skvarbos pro hematoencefalinį barjerą bei atsparumo chemoterapijai [7,35]. Siekiant pagerinti ligonių gyvenimo kokybę ir išgyvenamumą, ieškoma efektyvesnių gydymo metodų, kurie nedarytų ţalos, turėtų apsauginį poveikį aplink esantiems gyvybiškai svarbiems audiniams [35].
1.5. Mitochondrijos – ROS generatorės
2 pav. Mitochondrijų struktūra [47]
Mitochondrija – tai tik eukariotiniams organizmams būdinga ląstelės organelė, turinti dvigubą membraną [47-52]. Jos dydis varijuoja maţdaug nuo 0,75 iki 3 μm [52]. Mitochondrijų skaičius ląstelėse priklauso nuo audinio bei ląstelės tipo. Daugiausiai mitochondrijų aptinkama kardiomiocituose, miocituose bei hepatocituose [51]. Jų struktūra yra gana sudėtinga (2 pav.), kiekvieną mitochondriją supa išorinė bei vidinė membranos [50,51]. Išorinė membrana pasiţymi didesniu laidumu (praleidţia molekules iki 4 – 5 kDa), tuo tarpu, vidinė membrana, kurios paviršiaus
plotas yra didesnis dėl kristų, praleidţia tik labai maţas, krūvio neturinčias molekules (pvz.: O2, CO2)
[48,49]. Vidinėje membranoje yra išsidėstę baltyminiai mitochondrijų nešikliai, kurie perneša įvairius metabolitus, ATP sintazė, kuri adenozindifosfatą (ADP) verčia į adenozintrifosfatą (ATP) [50]. Mitochondrijų matriksas uţpildo mitochondriją, jame gausu ribosomų, ATP sintazės dalių, fermentų, baltymų taip pat yra ţiedinė mtDNR [51].
Tai viena iš svarbiausių ląstelės organelių, gaminanti energiją (ATP), trikarboksi rūgščių ciklo metu bei oksidacinio fosforilinimo metu [53]. Mitochondrijos – tai labai išplėtota koordinavimo sistema, kuri pagal ląstelių poreikį, kalorijų bei deguonies kiekį, gamina energiją [10]. Tačiau mitochondrijos turi ir kitų funkcijų. Daugelis gyvybiškai svarbių ląstelės funkcijų yra kontroliuojama mitochondrijų pagalba [10,54]. Jos atsakingos uţ redokso potencialo kitimus ląstelėje, reaktyvių deguonies formų sintezę, Ca2+
koncentraciją ląstelės citozolyje, prisideda prie acetil-CoA, pirimidinų pirmtakų sintezės ląstelės citozolyje, inicijuoja ląstelės apoptozę [10,48,54]. Šių funkcijų ir parametrų pasikeitimas gali lemti pokyčius ląstelės signalų perdavime, transkripcijos faktoriaus bei chromatino struktūroje, todėl ląstelės iš ramybės stadijos gali pereiti į aktyvų dalijimąsi [10].
Yra ţinoma, jog mitochondrijos – vienos iš didţiausių endogeninių ROS generuojančių organelių ląstelėje [53]. Sveikose ląstelėse reaktyvios deguonies formos sintetinamos maţais kiekiais [11]. Vėţinėse ląstelėse ROS generacija mitochondrijose yra ţenkliai padidėjusi. Viena iš galimų ROS padidėjimo prieţasčių – mutacijos mtDNR [10,11]. Skelbiama, jog mutacijos mitochondrinėje DNR aptinkamos, esant inkstų adenokarcinomai, storosios ţarnos vėţiui, galvos ar kaklo piktybiniams navikams, astrocitiniams navikams, skydliaukės navikams, krūties, kiaušidţių, prostatos, šlapimo pūslės piktybiniams navikams, onkocitomoms [10] bei glioblastomoms [55]. Mutacijos pasireiškia ne tik DNR, tačiau ir fermentuose, esančiuose mitochondrijose (matrikse) [10,54]. Įvairių tipų gliomose ir kituose piktybiniuose navikuose stebimi struktūriniai mitochondrijų pokyčiai: dalinis ar visiškas kristų sunykimas, patinimas, pakitusi skilimo/sintezės dinamika [55]. Medţiagų apykaitos sutrikimai gliomos mitochondrijose yra siejami su genų, koduojančių izokrilato dehidrogenazę mutacijomis [11,48,55]. Šis fermentas dalyvauja α-keto glutarato redukciniame karboksilinime, susidarant izocitratui, kuris virsta citratu [11,55]. Citratas yra vienas iš pagrindinių Krebso ciklo komponentų [55]. Genų mutacijos lemia tai, jog ląstelėse kaupiasi 2-hidroksiglutaratas (onkometabolitas) [11].
Superoksidas (vienas iš ROS) yra sintetinamas fiziologinių metabolinių reakcijų metu mitochondrijose [48]. Tam, kad uţkirsti kelią pernelyg dideliam kiekiui ROS, mitochondrija turi keletą būdų kaip juos neutralizuoti. Tam naudojama: superoksido dismutazė, glutationas, tioredoksinas, peroksiredoksinas [11,48]. Reaktyvių deguonies formų generacija bei redokso potencialas mitochondrijose yra reguliuojamas mitochondrijų vidinės membranos elektrocheminio gradiento [10,49]. ATP sintazė, esanti mitochondrijose, dalyvauja H+ translokacijoje bei ATP sintezėje iš ADP ir neorganinio fosfato. Slopinant ATP sintezę, didėja mitochondrijos vidinės membranos poliarizacija,
kuri stabdo elektronų transportavimą grandinėje [50]. Didėjant laisvų elektronų, jie jungiasi tiesiogiai prie molekulinio deguonies ir sudaro superoksido radikalą [10]. Apskaičiuota, jog fiziologinėmis sąlygomis 0,2 % viso mitochondrijų suvartojamo deguonies kiekio yra panaudojama superoksido gamybai [56]. Superoksido radikalas, esantis mitochondrijų matrikse, dalyvaujant mangano superoksido dismutazei, yra paverčiamas vandenilio peroksidu [10,11,48,54]. Tarpmembraninėje erdvėje esantis superoksido radikalas yra verčiamas į vandenilio peroksidą, dalyvaujant tarpmembraniniams ar citozoliniams fermentams – vario/cinko superoksido dismutazėms. Vandenilio peroksidas difunduoja ir veikia kaip tarpląstelinė signalinė molekulė [10].
1.6. Laisvieji radikalai
1.6.1. Reaktyvios deguonies formos
Reaktyvios deguonies formos (ROS) – tai deguonies metabolitai, susidarę ląstelėse metabolizmo metu dalinai redukuojant molekulinį deguonį [7,8]. Manoma, jog padidėjęs ROS kiekis ląstelėse sukelia DNR, baltymų, lipidų paţaidą, skatina genetinį nestabilumą bei tumorogenezę [7,9]. Deguonies metabolitai veikia kaip signalinės molekulės, skatina nenormalų ląstelių augimą, lemia metastazių išsivystymą, didina atsparumą apoptozei [9].
Ląstelėse ROS susidaro dalyvaujant NADPH oksidazei, skaidant molekulinį deguonį iki nestabilių junginių – reaktyvaus superoksido radikalo O2• bei hidroksilo radikalo OH•. Jie greitai virsta
stabiliais junginiais – vandenilio peroksidu H2O2 bei hipochloro rūgštimi HClO [53]. Vandenilio
peroksidas skiriasi savo signaliniu aktyvumu, jis oksiduoja nukleorūgštis bei baltymus, kurie yra pagrindinis reaktyvių deguonies formų taikinys [8]. Padidėjusi ROS generacija lemia grįţtamas cisteino, selenocisteino, metionino, histidino potransliacines modifikacijas [7,9]. Oksiduojamos aminorūgščių tiolinės grupės, esančios daugelyje baltymų, iš jų: kinazėse, fosfatazėse, transkripcijos faktoriuose [9].
Reaktyvių deguonies formų kiekio padidėjimą gali lemti fermentų, šalinančių laisvuosius radikalus, sumaţėjusi veikla, padidėjęs gliukozės metabolizmas (Varburgo efektas), ląstelės receptorių aktyvumas, onkogenetinis aktyvumas, padidėjusi augimo faktorių, citokinų gamyba, oksidantų gamyba ląstelių mitochondrijose bei NADPH oksidazės, ciklooksigenazės, lipooksigenazės, ksantinooksidazės, citochromo P450 fermentų veikla [7-9,45].
Toksiniai ROS kiekiai ląstelėse (tiek sveikose, tiek pakitusiose) sukelia apoptozę, sustabdo ląstelės gyvavimo ciklą [7]. Neproporcingai padidėjęs ROS kiekis gali būti sukeltas chemoterapijos, organizmo imuninių ląstelių ar sumaţėjus antioksidantų organizme. Todėl ROS ne tik gali sukelti
navikinius susirgimus, tačiau ir juos gydyti (priklausomai nuo rekatyvių deguonies formų kiekio ląstelėse) [9]. ROS toksinių kiekių produkcija bei antioksidacinių sistemų išeikvojimas lemia uţprogramuotą ląstelių ţūtį, tačiau citotoksiškumas pasireiškia tiek sveikoms, tiek paţeistoms ląstelės, todėl šis gydymo būdas yra ribotas [8,9].
ROS gamybos slopinimas navikinėse ląstelėse – tai priešingas gydymo būdas anksčiau aprašytajam [9]. Reaktyvių deguonies formų sumaţėjimas navikinėse ląstelėse lemia sumaţėjusią proliferaciją, išgyvenamumą, maţesnius DNR pokyčius, sumaţėjusį genetinį nestabilumą [7]. Gydymas antioksidaciniu aktyvumu pasiţyminčiais junginiais gali padėti sumaţinti reaktyvių deguonies formų gamybą paţeistose ląstelėse ir apsaugoti sveikus audinius bei ląsteles nuo oksidacinės paţaidos [7-9,45]. Teoh-Fitzgerald M. L. et al. 2014 atliko in vivo tyrimus, kurių metu nustatyta, jog padidėjusi antioksidanto (superoksido dismutazės-3) gamyba sumaţino krūties vėţio metastazių skaičių [13]. Todėl antoksidaciniu aktyvumu pasiţymintys junginiai vis daţniau yra įtraukiami į piktybinių navikų gydymo strategijas, kaip priemonė, norint sumaţinti ROS generaciją [7,13]. Tačiau reikėtų atsiţvelgti į skiriamų antioksidantų kiekius ir dozavimą, yra duomenų, jog antioksidantai didelėmis dozėmis veikia kaip prooksidantai, kurie pasiţymi priešingu aktyvumu – didina oksidacinį stresą bei laisvųjų radikalų gamybą [8,9].
1.6.1.1. Vandenilio peroksidas
Vandenilio peroksidas – tai oksidantas, priskiriamas reaktyvioms deguonies formoms, susidarantis ląstelėse kvėpavimo metu bei kitų metabolinių reakcijų metu [57]. Taip pat ši molekulė yra svarbi signalo nešėja ląstelėse [57,58]. Maţomis koncentracijomis vandenilio peroksidas inicijuoja įvairius biologinius atsakus ląstelėse: skatina ląstelių augimą, dalijimąsi, diferenciaciją, migraciją bei apoptozę [58]. Ši molekulė pasiţymi ilgesniu pusiniu eliminacijos periodu nei anksčiau aprašyti – hipochloro rūgštis ar peroksinitritas [57].
Organizme vandenilio peroksidas tiesiogiai jungiasi prie baltymų, turinčių cisteino liekanas, maţos molekulinės masės tiolių, taip pat reaguoja su anglies dioksidu, ketoninėmis rūgštimis bei fermentais [57,59]. Tačiau jo ţalingas oksidacinis poveikis nėra toks stiprus, kaip hidroksilo radikalo, kuris susidaro vandenilio peroksidui reaguojant su redukuota geleţimi ar variu gyvame organizme, ar vandenilio peroksidą paveikus UV šviesa [59]. Vandenilio peroksidui reaguojant su dvivalente geleţimi (3 pav.), vyksta oksidacija, kurios metu dvivalentė geleţis virsta trivalente geleţimi, o vandenilio peroksidas skyla į hidroksilo radikalą ir hidroksilo joną [58,59].
Kadangi baltymuose geleţis (ar kitas redukuotas metalas) daţniausiai būna svarbiausioje baltymo dalyje, atsakingame uţ atliekamą funkciją, didesnėmis koncentracijomis vandenilio peroksidas veikia tiksliai ir negrįţtamai pakeičia baltymo struktūrą [57-59]. Toks pokytis lemia baltymo funkcijos pasikeitimą [57].
Gyvame organizme vandenilio peroksidą peroksisomose suskaido katalazė iki netoksiškų junginių – deguonies bei vandens, tačiau organizmą veikiant oksidaciniam stresui, šio fermento veikla neuţtikrina visiško vandenilio peroksido suskaidymo, todėl pasireiškia vandenilio peroksido bei hidroksido radikalo ţalingas poveikis ląstelėms [60].
Hidroksilo radikalas yra labai reaktyvus, greitai oksiduoja įvairias molekules: angliavandenius, nukleorūgštis (sukelia negrįţtamus DNR pokyčius), aminorūgštis ir riebalus (sukelia lipidų peroksidaciją) bei tampa hidroksilo (OH
-) jonu [59]. Hidroksilo radikalas pasiţymi trumpu pusinės eliminacijos pusperiodţiu, tačiau skirtingai nei vandenilio peroksidas, jis negali būti suskaidomas fermentų, todėl šis junginys yra toksiškesnis uţ vandenilio peroksidą [57].
Didelės vandenilio peroksido koncentracijos yra siejamos su ląstelių baltymų paţaida, kuri lemia piktybinių navikų, Parkinsono ligos bei kitų lėtinių ligų išsivystymą [59,61]. Kumar B. et al.
2008, pastebėjo, jog ţmogaus prostatos vėţio ląstelės, dalyvaujant NADPH oksidazei, generuoja
daugiau ROS (identifikuoti superoksido radikalai bei vandenilio peroksidas) lyginant su sveikomis prostatos ląstelėmis [12]. Atliktų mokslinių tyrimų metu taip pat buvo nustatyta, jog padidėjęs riebiųjų rūgščių kiekis, sergant cukriniu diabetu, kardiomiocituose lemia geleţies patekimą į ląstelių mitochondrijas, kuriose vandenilio peroksidas verčiamas hidroksilo radikalu [60]. Reaktyvi molekulė gali sukelti kraujotakos sutrikimus (hidroksilo radikalas didina trombocitų agregaciją, todėl didėja širdies ir kraujagyslių ligų rizika) taip pat aktyvuojamas arachidono rūgšties metabolizmas, lipidų peroksidacija, aterosklerozės vystymasis dėl stimuliuojamo baltymo kinazės-C [60,61].
1.6.2. Reaktyvios azoto formos
Azoto oksidas (NO) – tai maţa, neutrali, hidrofobinė, labai reaktyvi molekulė, lengvai praeinanti ląstelių membranas, turinti daugybę funkcijų bei veikimo mechanizmų ţmogaus organizme [53,56,62]. Molekulės yra sintetinamos iš aminorūgšties L-arginino, dalyvaujant fermentams azoto oksido sintazėms [53]. Išskiriamos 3 azoto oksido sintazės izoformos: pirmojo tipo arba neuroninė NOS, antrojo tipo arba indukuojamoji NOS bei trečiojo tipo arba endotelinė NOS [53,61]. Neuroninio bei endotelinio NO išsiskyrimas organizme yra reguliuojamas kalcio, veikiant į kalmodulino receptorius ląstelės citoplazmoje [61]. Pirmojo tipo azoto oksido sintazės pagalba išskirtas NO reguliuoja neuronų funkcijas, jų išgyvenamumą bei diferenciaciją, viduląstelinį signalų perdavimą
[53]. Antrojo tipo azoto oksido sintazės pagalba NO išskiriamas kaip atsakas į įvairius endotoksinų ar citokinų signalus [43,61]. Trečiojo tipo azoto oksido sintazės išskiriamas NO yra susijęs su kraujagyslių vazodilatacija, šio proceso reguliavimu [61].
Azoto oksidas organizme veikia kaip laisvasis radikalas, labiausiai paţeidţiamos aminorūgštys: cisteinas, tirozinas [56]. Tačiau daugiau ţalos organizmui turi ne pats azoto oksidas, bet jo darinys, susidarantis veikiant superoksido radikalui. Reaguojant šiems junginiams susidaro labai toksiškas ir reaktyvus junginys – peroksinitritas (4 pav.), kuris skatina reaktyvių deguonies formų sintezę organizme ir didina oksidacinę paţaidą [53].
4 pav. peroksinitrito susidarymas organizme [56]
Yra ţinoma, jog peroksinitritas veikia polinesočiąsias riebalų rūgštis (turinčias dvigubas jungtis), vykdo lipidinių membranų, lipoproteinų peroksidaciją [56]. Polinesočiųjų riebiųjų rūgščių peroksidacija – grandininė reakcija [53,63]. Reakcijos metu susidaro lipidinis alkilo radikalas, kuris greitai reaguoja su molekuliniu deguonimi ir sudaro lipidinį peroksidinį radikalą, kuris inicijuoja lipidų peroksidaciją [63]. Vykstant lipidų peroksidacijai, suardomos ląstelių membranos, todėl įvyksta paţeistų ląstelių ţūtis [53,63]. Paţeidţiami ne tik lipidai, tačiau ir baltymai [56]. Lipidinis alkilo radikalas sukelia aminorūgščių bei baltymų oksidaciją, kurios metu didėja aminorūgščių šoninių grandinių hidrofiliškumas, vyksta baltymų skeleto fragmentacija, konformacijos pokyčiai, išsivyniojimas bei agregacija [56,63]. Tai lemia įvairių fermentų, receptorių bei membraninio transporto veiklos sutrikimus [63].
Padidėjusi peroksinitrito bei NO• radikalų generacija organizme siejama su tokiais procesais, kaip: aterosklerozė, hipertenzija, neurodegeneracija, piktybiniai navikai, uţdegiminės ligos bei sepsis [56,64]. Todėl tirozino nitrato kiekio nustatymas gali padėti nustatyti ligos progresiją bei NO• sukeltą oksidacinę paţaidą bei jos mastą [56,64].
1.7. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) antioksidacinio poveikio
ląstelėms tyrimai
Mokslininkai visame pasaulyje tiria juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) ţiedų bei uogų antioksidacinį poveikį, pasitelkę įvairias ląstelių kultūras. In vitro atlikti tyrimai pateikti 1 lentelėje.
1 lentelė. Juoduogio šeivamedžio (S. nigra L.) poveikis įvairioms ląstelių kultūroms
šeivamedţio (S. nigra L.) ekstraktas etanolinis (96 %) uogų išspaudų; etilacetatatinis uogų išspaudų ţiurkių mikroglijos (bv-2) fluorimetrinis ROS generacijos nustatymas etanolinis ekstraktas reikšmingai sumaţino ROS koncentraciją ląstelėse [20] etanoliniai (96 %, 50 %) uogų, ţiedų; vandeniniai uogų, ţiedų; dichlormetano uogų, ţiedų ţiurkių makrofagų (RAW 264,7), ţiurkių dentritinių (D2SC-1) fluorimetrinis ROS generacijos nustatymas etanoliniai eksraktai reikšmingai sumaţino ROS generaciją ląstelėse [25]
vandeninis iš uogų išskirto agliutinino tirpalas ţmogaus kiaušidţių karcinomos (OAW-42), ţmogaus kiaušidţių epitelio (IOSE-364) superoksido koncentracijos nustatymas mitochondrijose didėjant agliutinino koncentracijai, superoksido koncentracija mitochondrijose maţėja [5]
vandeninis uogų ţmogaus storosios ţarnos adenokarcinomos (Caco-2); ţmogaus storosios ţarnos (NCM 460), paveiktos H2O2 viduląstelinių radikalų generacijos nustatymas didėjant fenolinių junginių koncentracijai, viduląstelinių radikalų koncentracija maţėja [15], [65] dichlormetaninis ţiedų kiaulių raumenų skaidulos, paveiktos H2O2 viduląstelinių radikalų generacijos nustatymas didėjant fenolinių junginių koncentracijai ekstraktuose, viduląstelinių radikalų generacija ląstelėse maţėja [66]
vandeninis uogų Wistar ţiurkių smegenų mitochondrijos, paveiktos rotenonu superoksido koncentracijos nustatymas mitochondrijose superoksido koncentracija maţėja, didėjant fenolinių junginių koncentracijai [67]
ekstraktuose vandeninis uogų, vandeninis ţiedų Ţmogaus glioblastomos (U-87), ţmogaus gliomos (Hs683); ţmogaus storosios ţarnos adenokarcinomos (HT29) ląstelių proliferacijos nustatymas Didėjant fenolinių junginių koncentracijai ekstraktuose, ląstelių proliferacija maţėja, stabdomas jų augimas [68,69] Etanolinis (96 %) ţiedų Ţmogaus krūties adenokarcinomos (MCF7) Ląstelių išgyvenamumo nustatymas Statistiškai reikšmingo pokyčio nepasebėta [17]
Kaip matoma iš 1 lentelėje pateiktų duomenų, juoduogis šeivamedis (S. nigra L.) ir jo ištraukos yra gana plačiai tiriamos in vitro. Plačiausiai išnagrinėtas juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų antioksidacinis poveikis [25,65,67]. Tyrimų metu nustatyta, jog didėjant fenolinių junginių koncentracijai ekstraktuose, ROS koncentracija ląstelėse maţėja (tiek ekstraląstelinių, tiek viduląstelinių) [20,65,67]. Atliktų tyrimų metu nustatytas poveikis vandenilio peroksidui [15,20,25,65] bei superoksido radikalui [5,67]. Tačiau Olejnik A. et al. 2016 pastebėjo, jog didesnės uogų ekstraktų koncentracijos pasiţymėjo prooksidaciniu poveikiu [65]. Taip pat pastebėtas ir uţdegiminio mediatoriaus NO reikšmingas koncentracijos sumaţėjimas tirtose ląstelėse, paveikus jas uţdegiminiais mediatoriais [20,25]. NO koncentracijos sumaţėjimas nustatytas ir tiriant ţmogaus storosios ţarnos adenokarcinomos ląsteles, paveiktas uogų ekstrakto [15]. Todėl galima teigti, jog uogų išspaudų, ţiedų, uogų ekstraktai ne tik pasiţymi antioksidaciniu poveikiu, bet ir veikia priešuţdegimiškai in
vitro.
Tyrimų metu taip pat pastebėta ir ekstraktų tirpiklio įtaka jų poveikiui. Pavyzdţiui, analizuojant uogų išspaudų etanolinių ir etilacetatinių ekstraktų poveikį ţiurkių mikroglijos ląstelėms, pastebėti ekstraktų poveikio skirtumai. Veikiant etanoliam ekstraktui, nustatytas statistiškai reikšmingas ROS pokytis. Tuo tarpu, etilacetatinio ekstrakto poveikis ROS koncentracijai nebuvo statistiškai reikšmingas [20]. Kituose tyrimuose taip pat pastebėta, jog etanoliniai ekstraktai turėjo stipresnį antioksidacinį poveikį, nei kitų tirpiklių ekstraktai [20,25].
Mokslininkai ištyrė ne tik vaistinių augalinių ţaliavų ekstraktų poveikį, tačiau iš augalo uogų išskyrė vieną biologiškai aktyvią medţiagą – lektiną (agliutininą), kuris pasiţymėjo selektyviu poveikiu vėţinėms ląstelėms. Nustatytas ne tik antioksidacinis junginio poveikis, tačiau ir priešvėţinis (statistiškai reikšmingai sumaţino kiaušidţių karcinomos ląstelių gyvybingumą, paskatino jų apoptozę, neveikdamas sveikų kiaušidţių ląstelių) [5]. Priešvėţinis aktyvumas nustatytas ir augalo ţiedų [68] bei
uogų [68,69] vandeninių ekstraktų. Mokslininkai nustatė, jog antiproliferacinis uogų ekstraktų poveikis ţmogaus glioblastomos ląstelėms yra stipresnis nei ţiedų ekstraktų [68]. Tiriant ţiedų ekstraktus, reikšmingo poveikio ţmogaus krūties vėţio ląstelėms nenustatyta [17].
Kaip matoma iš 1 lentelėje pateiktų duomenų, augalo ţiedų ekstraktai ir jų antioksidacinis poveikis ląstelėms ištirtas maţiau nei uogų ekstraktų. Tyrimuose, atliktuose su šeivamedţio ţiedų ekstraktais, pastebėta labai panaši poveikio dinamika (poveikis priklauso nuo fenolinių junginių koncentracijos) kaip ir tyrimuose su augalo uogų ekstraktais [25,66].
Apţvelgus literatūros duomenis, galima teigti, jog juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) augalinės ţaliavos pasiţymi antioksidaciniu poveikiu, maţina laisvųjų radikalų generaciją tiek ląstelių išorėje, tiek viduje. Tačiau plačiau išnagrinėti tik augalo uogų bei ţiedų ekstraktai, beveik nieko nėra ţinoma apie uogų išspaudų ekstrakto poveikį. Todėl yra aktualu palyginti visų trijų ţaliavų (uogų, ţiedų bei uogų išspaudų) ekstraktų poveikį ekstraląstelinių bei viduląstelinių radikalų generacijai.
2. METODIKA
2.1. Naudotos medţiagos ir aparatūra
2.1.1. Naudotos medţiagos
1) 2,7-dichlorofluorescindiacetatas (DCF-DA) (Sigma Aldrich) 2) 10-acetil-3,7-dihidroksifenoksazinas (AmplexRed) (Sigma Aldrich) 3) Antimicinas 20 μM (Sigma Aldrich)
4) Buferinė sistema HBSS (Hank‘s balanced salt solution) (Sigma Aldrich) 5) Dimetilsulfoksidas (DMSO) (Sigma Aldrich)
6) Etanolis 96 % (UAB „Stumbras“)
7) Fetalinis veršelio serumas (FBS) (Sigma Aldrich) 8) Folin Ciocalteu reagentas (Sigma Aldrich)
9) Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma Aldrich)
10) Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) išspaudų ekstraktas (KTU) 11) Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) uogos (Kaunas, Lietuva) 12) Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedai (Kaunas, Lietuva) 13) Krienų peroksidazė (HPR) (Sigma Aldrich)
14) Kvercetinas (Sigma Aldrich)
15) Ląstelių augimo terpė (DMEM) (Sigma Aldrich) 16) MitoSoxTM Red daţai (Molecular probes)
17) Natrio karbonatas (Na2CO3) 20 % (Sigma Aldrich)
18) Penicilino – streptomicino sudėtinis antibiotikų tirpalas (Sigma Aldrich) 19) Tripano mėlio daţų tirpalas 0,4 % (Sigma Aldrich)
20) Tripsinas/EDTA (Sigma Aldrich)
21) Vandenilio peroksidas 3 % (UAB Valentis)
2.1.2. Naudota aparatūra
1) Centrifuga „Eppendorf centrifuge 5810R“
2) Fluorescencinis mikroskopas „OLYMPUS IX71S1F-3“ 3) Fluorimetras „Thermo scientific Fluoroskan Ascent“
5) Spektrofotometras Implen NanoPhotometer® Pearl
2.2. Tyrimo objektas
Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) uogų, ţiedų bei uogų išspaudų etanoliniai ekstraktai.
2.3. Ekstraktų gamyba
Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedai surinkti augalo ţydėjimo fazėje (liepos mėnesį), uogos – subrendus vaisiams (rugsėjo mėnesį), Kauno mieste (ţiedai ir uogos surinkti nuo to paties augalo) 2017 metais. Surinkta ţaliava perrūšiuota, išdţiovinta gerai vėdinamoje patalpoje ir susmulkinta [70].
Ekstraktai gaminti pagal bendrąsias ekstraktų gamybos taisykles, klasikinės maceracijos metodu. Į indą suberta 10 g susmulkintų juoduogio šeivamedţio ţiedų, į kitą – 10,0 g susmulkintų juoduogio šeivamedţio uogų. Į abu indus piltas reikiamas kiekis 70 % (V/V) etanolio (atsiţvelgus į ţaliavos sugėrimo koeficientą). Ţaliavos ir ekstrahento santykis 1:1. Maceracija vykdyta 7 paras, kambario temperatūroje (20 – 22 °C), vis pamaišant. Po 7 dienų ekstraktai nupilti, nuspausti nuo ţaliavų. Ţaliava praplauta nedideliu kiekiu ekstrahento ir vėl nuspausta (gauta 10 ml ekstrakto). Gauti ekstraktai 24 val. laikyti 4 – 7 °C temperatūroje (šaldytuve). Po paros laiko, ekstraktai filtruoti pro 0,45 μm membraninį PES (polietersulfono) filtrą.
Juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) uogų išspaudų ekstraktas gautas iš Kauno Technologijos Universiteto, pagamintas superkritinės skysčių ekstrakcijos metodu.
2.4. Fenolinių junginių kiekio nustatymas ekstraktuose
Fenolinių junginių kiekis ekstraktuose nustatytas Folin – Ciocalteu metodu. Metodas naudojamas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui. Šiuo metodu nustatomi ne tik fenoliniai junginiai, tačiau ir visi redukuojantys junginiai. Metodas pagrįstas molibdeno (šešiavalenčio) virtimu į penkiavalentį (5 pav.).
5 pav. Molibdeno oksido redukcija
Reakcijos mišinys keičiasi iš geltonos spalvos į mėlyną spalvą, kuri įvertinama spektrofotometriškai, esant 760 nm bangos ilgiui.
Kontrolinio (palyginamojo) tirpalo gamyba: į mėgintuvėlį pilama 800 μl išgryninto vandens ir 50 μl Folin Ciocalteu reagento, gerai sumaišoma ir laukiama 8 minutes. Po 8 minučių, į mėgintuvėlį pilama 150 μl natrio karbonato (20 %) tirpalo, gerai suplakama ir reakcijos mišinys inkubuojamas 2 valandas.
Tiriamųjų tirpalų gamyba: į 3 mėgintuvėlius pilama 790 μl išgryninto vandens, 10 μl juoduogio šeivamedţio ţiedų (1:10), uogų (1:10) arba išspaudų (1:10) ekstrakto, 50 μl Folin Ciocalteu reagento, gerai sumaišoma ir laukiama 8 minutes. Po 8 minučių, į mėgintuvėlį pilama 150 μl natrio karbonato (20 %) tirpalo, gerai suplakama ir laukiama 2 valandas.
Po 2 valandų spektrofotometru matuojamas tirpalų optinis tankis. Pirmiausiai matuojamas palyginamasis tirpalas, vėliau, pagal jį – tiriamieji tirpalai. Fenolinių junginių kiekis nustatomas pagal galo rūgšties ekvivalentą.
2.5. Vandenilio peroksido nustatymas fluorimetru
Vandenilio peroksidas gali būti nustatomas dideliu jautrumu bei specifiškumu pasiţyminčiu metodu, naudojant daţą 10-acetil-3,7-dihidroksifenoksaziną (Amplex Red) bei fermentą – HPR (krienų peroksidazę). HPR – tai 40 kDa baltymas, išgaunamas iš krienų šaknies ekstrakto. Dalyvaujant šiam fermentui, Amplex Red reaguoja su vandenilio peroksidu (santykiu 1:1), susidarant reakcijos produktui – rezorufinui (6 pav.), kuris pasiţymi raudona fluorescencija. Fermento katalizuojamos reakcijos metu, vandenilio peroksidas redukuojamas iki hidroksilo radikalo, vėliau – vandens, o bespalvis Amplex Red (elektronų donoras) oksiduojamas iki fluorescuojančio rezorufino. Fluorescencijos emisija pasiekiama, esant 544 nm bangos ilgiui, o maksimalus suţadinimas pasiekiamas, esant 590 nm bangos ilgiui [71].
6 pav. Rezorufino susidarymas, reaguojant Amplex Red su vandenilio peroksidu, dalyvaujant HPR Į fluorimetrinę lėkštelę (96 šulinėliai), piltas apskaičiuotas kiekis išgryninto vandens, skirtingas kiekis juoduogio šeivamedţio uogų, ţiedų bei išspaudų 70 % etanolinių ekstraktų (į kontrolinius šulinėlius ekstraktai nepilti). Taip pat tyrimas atliktas su vienu iš uogų ir ţiedų sudėtyje esančiu flavonoidu – kvercetinu (70 % etanolinis tirpalas). Į visus šulinėlius pilta 10 μl 3% vandenilio peroksido tirpalo, 2 μl daţo Amplex Red bei 5 μl fermento krienų peroksidazės. Fluorimetru matuotas
fluorescencijos intensyvumas, esant fluorescencijos emisijai ties 544 nm bei maksimaliam suţadinimui – 590 nm.
2.6. Ląstelių kultivavimas
Šiame tyrime naudota ţiurkės smegenų auglio (Glioblastoma multiforme) ląstelių kultūra (C6). Ląstelės augintos flakonuose su mitybine terpe, sudaryta iš: sudėtinio antibiotikų (Penicilino/Streptomicino 10000 IU/ml – 10000 μg/ml) tirpalo, fetalinio veršelio serumo (FBS), DMEM (Dulbecco‘s Modified Eagle‘s medium), santykiu 1:10:100. Ląstelės kultivuotos inkubatoriuje, esant 37 °C temperatūrai ir 5 proc. CO2 atmosferai.
Ląstelių persėjimas: mitybinė terpė nupilama nuo ląstelių, flakonas praplaunamas fosfatiniu druskos tirpalu (PBS). Uţpilamas reikiamas kiekis tripsino/EDTA (0,25 %) tirpalo, laukiama keletą minučių, kol bus suardytos tarpląstelinės jungtys ir ląstelės atkibs nuo flakono sienelių. Atkibus ląstelėms, į flakoną pilamas nedidelis kiekis pagamintos terpės (neutralizuoti tripsinui). Ląstelės perkeliamos į centrifuginį mėgintuvėlį ir centrifuguojama „Eppendorf centrifuge 5810R“ centrifuga 22 °C temperatūroje 5 minutes, esant 1500 apsisukimų/min. greičiui. Ląstelės atskiriamos nuo terpės, nupilant mėgintuvėlyje esantį supernatantą. Į mėgintuvėlį su ląstelėmis pilama 1 ml terpės, viskas homogenizuojama. Į flakoną su paruošta švieţia terpe perkeliamas reikiamas kiekis ląstelių suspensijos.
2.7. Ląstelių tankio nustatymas
Ląstelių skaičius nustatomas hemocitometru Neubauer. Į mėgintuvėlį perkeliama 20 μl ląstelių suspensijos (ląstelių suspensija gaunama persėjant ląsteles) bei 20 μl tripano mėlio (0,4 %). Daţai veikia tik terpę ir negyvas ląsteles (nusidaţo mėlynai), sveikos ląstelės lieka nenusidaţiusios, nes daţas negali pereiti ląstelių membranų. Hemocitometro kamera uţdengiama dengiamuoju stikleliu ir į tarpą tarp stiklelio ir kameros leidţiamas nudaţytų ląstelių suspensija. Uţpildytas daţais hemocitometras apţiūrimas pro šviesinį mikroskopą (padidinimas 20 kartų), skaičiuojamos daţais nenusidaţiusios ląstelės, esančios keturiuose kampiniuose hemocitometro langeliuose.
Ląstelių skaičiui 1 ml suskaičiuoti naudojama formulė: a, b, c, d – ląstelių skaičius, esantis 4 langeliuose;
5000 – hemocitometro konstanta.
Skaičiuojamas reikiamas suspensijos su ląstelėmis kiekis, norint uţsėti 96 šulinėlių lėkštelę. Apskaičiuojamas reikiamas terpės kiekis (1 šulinėlio tūris – 200 μl). Ląstelės kultivuojamos inkubatoriuje, esant 37 °C temperatūrai ir 5 proc. CO2 atmosferai, vieną parą.
2.8. Viduląstelinių laisvųjų radikalų koncentracijos nustatymas fluorimetru
Viduląstelinė laisvųjų radikalų koncentracija ląstelėse nustatyta fluorimetru „Thermo
scientific Fluoroskan Ascent“. Laisvųjų radikalų koncentracijos nustatymas paremtas specifinio daţo –
2,7-dichlorofluorescindiacetato (DCF-DA), transformacija ląstelėse. DCF-DA patekęs į ląstelę (praėjęs pro plazminę membraną) virsta nefluorescuojančiu junginiu (2,7-dichlorofluorescinas, DCFH), tačiau veikiant laisviesiems radikalamas (oksidantams), nefluorescuojantis junginys virsta fluorescuojančiu 2,7-dichlorofluorescinu (DCF). Ląstelėse vykstančios reakcijos pavaizduotos 7 pav. Fluorescencijos intensyvumo padidėjimas yra siejamas su viduląstelinių radikalų koncentracijos didėjimu ląstelėse, o maţėjimas – atvirkščiai.
7 pav. 2,7-dichlorofluoresceindiacetato virtimas 2,7-dichlorofluorescinu ląstelėse, veikiant ROS Po ląstelių inkubacijos praėjus vienai parai, terpė šulinėliuose nupilama ir kiekvienas šulinėlis praplaunamas HBSS (Hank‘s balanced salt solution). Į kiekvieną šulinėlį su ląstelėmis pilama reikiamas kiekis 10 μM DCF-DA daţo. Lėkštelė su šulinėliais inkubuojama 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje, 15 min. Praėjus 15 minučių, daţai nupilami, šulinėliai plaunami HBSS
tirpalu. Į kiekvieną šulinėlį pilama 200 μl HBSS ir apskaičiuotas kiekis skirtingų juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) uogų, ţiedų, uogų išspaudų ekstraktų. Fluorimetru „Thermo
scientific Fluoroskan Ascent“ matuojamas fluorescencijos intensyvumas tik įpylus ekstraktų, po 30,
60, 90, 120 min. Bangos ilgiai: suţadinimo – 485 nm, emisijos – 583 nm. Po pirmojo matavimo lėkštelės laikomos tamsoje, inkubatoriuje 37 °C temperatūroje, 5 proc. CO2 atmosferoje ir kas 30 min.
atliekami fluorescencijos intensyvumo matavimai.
Viduląste-linės esterazės Patekimas į ląstelę
2.9. Superoksido koncentracijos mitochondrijose nustatymas fluorescenciniu
metodu
Superoksido koncentracijai ląstelių mitochondrijose nustatyti, naudojamas specifinis daţas –
MitoSox red, kuris patenka į ląstelių mitochondrijas ir sąveikauja su superoksidu. Laisvasis radikalas
oksiduoja MitoSox red daţą iki fluorescuojančio junginio (8 pav.). Fluorescencijos intensyvumas stebimas pro fluorescencinį mikroskopą, naudojant UV šviesą.
8 pav. MitoSox red dažo oksidacija, vykstanti ląstelių mitochondrijose, veikiant superoksidui Ląstelių daţymas: terpė, esanti šulinėliuose, nuo ląstelių yra nupilama. Ląstelės praplaunamos
HBSS tirpalu. Į kiekvieną šulinėlį pilamas reikiamas kiekis buferinės sistemos HBSS ir paruošto
specifinio MitoSox red daţo (6 μM). Inkubuojama 37 °C temperatūroje ir 5 proc. CO2 atmosferoje
15 min. Po 15 min. daţai nuo ląstelių nupilami, pilama HBSS tirpalo ir apskaičiuoti kiekiai skirtingų juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų. Ląstelės fotografuojamos fluorescenciniu mikroskopu „OLYMPUS IX71S1F-3“. Fluorescencijos analizė atlikta, naudojant atvirojo kodo ImageJ vaizdo apdorojimo programinę įrangą. Kaip teigiama kontrolė, naudotas antimicino 20 μM tirpalas.
2.10. Statistinis duomenų įvertinimas
Tyrimo metu gauti duomenys apdoroti, naudojant „MS Excel 2010“ paketą. Vertinami 3 – 4 matavimų vidurkiai. Gautų rezultatų palyginimui naudotas Student‘o t kriterijus. Rezultatai pateikti kaip vidurkiai ± standartinis nuokrypis. Skirtumai tarp dviejų reikšmių laikomi statistiškai reikšmingais, kuomet p < 0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas juoduogio šeivamedţio (Sambucus
nigra L.) ekstraktuose
Spektrofotometru buvo nustatytas fenolinių junginių kiekis tiriamuosiuose juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) ekstraktuose Folin – Ciocalteu metodu. Gauti rezultatai pateikti 9 pav.
9 pav. Fenolinių junginių kiekis juoduogio šeivamedžio (S. nigra L.) uogų išspaudų, uogų bei žiedų ekstraktuose
Tirti praskiesti (1:10) ekstraktai, todėl norint suţinoti ekstrakto fenolinių junginių kiekį, rezultatai dauginti iš 10. Iš 9 pav. pateiktų duomenų galima teigti, jog šeivamedţio išspaudų ekstraktas, pagamintas superkritinės skysčių ekstrakcijos metodu, pasiţymėjo didţiausia fenolinių junginių koncentracija (49,2 ± 1,69 μg/ml). Tyrimo metu nustatytas 11,2 % maţesnis fenolinių junginių kiekis šeivamedţio uogų ekstrakte – 38 ± 1,22 μg/ml. Maţiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas šeivamedţio ţiedų ekstrakte – 20,7 ± 1,61 μg/ml. Tai 57,9 % maţiau fenolinių junginių nei išspaudų ekstrakte ir 45,5 % maţiau nei nustatyta fenolinių junginių uogų ekstrakte. Iš gautų tyrimo rezultatų galima teigti, jog maceracijos būdu pagaminti šeivamedţio uogų bei ţiedų ekstraktai savo sudėtyje turi maţesnį kiekį fenolinių junginių nei superkritinės skysčių ekstrakcijos būdu pagamintas šeivamedţio uogų išspaudų ekstraktas.
Puidokaitė E., Ramanauskienė K. 2018, taip pat nustatė fenolinių junginių kiekį 70 % etanoliniame juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) ţiedų ekstrakte. Nustatytas fenolinių junginių kiekis
0 10 20 30 40 50 60
Išspaudų Uogų Ţiedų
Ekstraktai F en oli n iai j u n gin iai ( μ g/m l)
Fenoliniai junginiai juoduogio šeivamedţio
(Sambucus nigra L.) ekstraktuose
(7,48 mg/ml) ţenkliai didesnis, nei šiame tyrime [72]. Tokiems skirtumams atsirasti galėjo turėti įtakos kita fenolinių junginių nustatymo metodika, augalo augavietė, augimo sąlygos.
Atliktame Akbulut M. et al., 2009 moksliniame tyrime nustatytas juoduogio šeivamedţio (S.
nigra L.) uogų 80 % etanolinių ekstraktų fenolinių junginių kiekis Folin – Ciocalteu metodu.
Nustatyta, jog etanoliniuose uogų ekstraktuose yra 37,1 – 43,2 μg/ml fenolinių junginių [73]. Gauti tyrimo rezultatai labai panašūs į šio tyrimo rezultatus, kurio metu nustatytas fenolinių junginių kiekis – 38 μg/ml.
Tuo tarpu, mokslininkai Silva P. et al., 2017, atliko fenolinių junginių kiekio nustatymą šeivamedţio uogų etanoliniams (95 %) ekstraktams Folin – Ciocalteu metodu, gauti ţenkliai didesni rezultatai. Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis siekė 119,1 μg/ml (beveik trigubai didesnis kiekis nei šiame tyrime). Šiam skirtumui turėjo reikšmės augalo augavietė (Portugalija), temperatūra, saulės šviesos kiekis, drėgmė, dirvoţemio kokybė, ekstrakto gamyba (ekstraktas gamintas purtyklėje) bei metodo modifikacija (metodas atliktas 70 °C temperatūroje, laikant 30 min.) [74].
Viapiana A. et al., 2017 nustatė šeivamedţio ţiedų uţpilų (vandeninių) fenolinių junginių
kiekį. Nustatytas fenolinių junginių kiekis siekė 15,23 – 27,02 μg/ml [2]. Mokslininkų gauti rezultatai yra panašūs į fenolinių junginių kiekį, nustatytą šiame darbe (20,7 μg/ml), tačiau tirta ne etanolinė ištrauka, o vandeninis uţpilas.
Dulf F., M. et al., 2015 nustatė fermentuotų šeivamedţio uogų išspaudų ekstraktų
(ekstrahentas – druskos rūgštis/metanolis/vanduo, santykiu 1:80:19) fenolinių junginių kiekį. Nustatyta, jog išspaudų ekstraktuose yra 32,2 – 45,0 μg/ml fenolinių junginių [75]. Gauti rezultatai yra panašūs į šio tyrimo metu gautus rezultatus (49,2 μg/ml), nors ir skiriasi ekstraktų gamybos metodas (mokslininkai paruošė ekstraktą ultragarso vonelėje) bei ekstrahentas.
Galima teigti, jog fenolinių junginių kiekis skirtinguose ekstraktuose gali varijuoti dėl daugelio prieţasčių: augalo augavietės, augimo sąlygų (temperatūros, drėgmės, saulės šviesos kiekio), ekstrakto gamybos metodo, metodikos, ekstrahento bei, ţinoma, pasirinktos ţaliavos (juoduogio šeivamedţio (S. nigra L.) ţiedai, uogos ar uogų išspaudos).
3.2. Juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ekstraktų poveikis vandenilio
peroksido koncentracijai
Fluorimetru „Thermo scientific Fluoroskan Ascent“ buvo nustatomas juoduogio šeivamedţio (Sambucus nigra L.) ţiedų, uogų bei uogų išspaudų ekstraktų gebėjimas neutralizuoti vandenilio peroksidą, gauti rezultatai palyginti tarpusavyje. Tyrimas atliktas ir su kvercetinu – rutino glikozidu, kurio gana didelis kiekis yra aptinkamas tiek šeivamedţio uogose, tiek ţieduose. Šiuo tyrimu norėta
