MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
EGLĖ IGNATAVIČIŪTĖ
PAPRASTOSIOS SPANGUOLĖS (VACCINIUM OXYCOCCOS L.) VAISIUOSE ESANČIŲ ANTOCIANŲ KOKYBINIS IR KIEKYBINIS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė doc. dr. Rūta Marksienė
KAUNAS, 2016
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data
PAPRASTOSIOS SPANGUOLĖS (VACCINIUM OXYCOCCOS L.) VAISIUOSE ESANČIŲ ANTOCIANŲ KOKYBINIS IR KIEKYBINIS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovė
Data doc. dr. Rūta Marksienė Data
Darbą atliko Magistrantė Eglė Ignatavičūtė Data
Kaunas, 2016
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10
1.1. Paprastosios spanguolės apibūdinimas ... 10
1.1.1. Paprastosios spanguolės paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje ... 11
1.1.2. Paprastosios spanguolės uogų cheminė sudėtis ... 11
1.1.3. Paprastosios spanguolės biologinės savybės ir naudojimas ... 13
1.2. Antocianų charakteristika ... 15
1.2.1. Antocianų struktūra ... 16
1.2.2. Antocianų pasiskistymas vaistinėse augalinėse ţaliavose ir poveikis augalams ... 17
1.2.3. Antocianų poveikis ţmogaus organizmo sistemai ... 18
1.2.4. Antocianų nustatymas augalinėse ţaliavose spektrofotometrijos metodu ... 19
1.2.5. Antocianų nustatymas augalinėse ţaliavose ESC metodu ... 20
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 22
2.1. Medţiagos ir reagentai ... 22
2.1.1. Augalinė ţaliava ... 22
2.1.2. Reagentai ... 22
2.1.3. Aparatūra ... 22
2.2. Antocianų kiekybinis nustatymas ... 23
2.2.1. Spanguolių uogų ekstraktų gamyba ... 23
2.2.2. Antocianų suminis nustatymas spektrofotometrijos metodu ... 23
2.2.3. Antocianų kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 23
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 25
3. 1. Antocianų bendro kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu ... 25
3.1.1. Antocianų bendro kiekio nustatymas spanguolių uogose rinktose 2014 m. spektrofotometrijos metodu ... 25
3.1.2. Antocianų bendro kiekio nustatymas spanguolių uogose rinktose 2015 m. spektrofotometrijos metodu ... 27
3.1.3. Antocianų nustatyto bendro kiekio palyginimas spanguolių uogose rinktose 2014 ir 2015 m.
spektrofotometrijos metodu ... 29
3.2. Antocianų kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu 30 3.2.1. Cianidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 35
3.2.2. Delfinidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 36
3.2.3. Malvidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 37
3.2.4. Petunidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 38
3.2.5. Peonidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu ... 39
3.3. Rezultatų apibendrinimas ... 40
IŠVADOS ... 42
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 44
PRIEDAI ... 48
E. Ignatavičiūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc. dr. R. Marksienė;
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologijos chemijos katedra. - Kaunas.
Pavadinimas. Paprastosios spanguolės (Vaccinium Oxycoccos L.) vaisiuose esančių antocianų kokybinis ir kiekybinis tyrimas.
Raktiniai ţodţiai. Vaccinium Oxycoccos L., efektyvioji skysčių chromatografija, spektrofotometrija, antocianai.
Tyrimo objektas ir metodai. Vaccinium Oxycoccos L. (Paprastosios spanguolės) uogos, surinktos 2014 m. ir 2015 m. rugsėjo – spalio mėnesiais, skirtingose Lietuvos vietose. Ekstrahuojama parūgštintu etanoliu (0,1M HCl). Bendras antocianų kiekis nustatomas spektrofotometrijos metodu.
Antocianų kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatoma efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo tikslas. Ištirti įvairiose Lietuvos vietose augančių paprastųjų spanguolių (Vaccinium oxycoccos L.) vaisių antocianų kokybinę ir kiekybinę sudėtį spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
Darbo uţdaviniai. Nustatyti bendrą antocianų kiekį paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) vaisiuose spektrofotometrijos būdu. Nustatyti kokybinę ir kiekybinę antocianų sudėtį paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) vaisiuose efektyviosios skysčių chromatografijos būdu. Palyginti skirtingose Lietuvos vietose surinktų paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) vaisių antocianų kokybinę ir kiekybinę sudėtį.
Rezultatai ir išvados. 2014 m. didţiausias bendras antocianų kiekis spektrofotometrijos metodu nustatytas Vaineţerio kaime (67,107±0,103 mmol/g), o maţiausias – Čepkelių raiste (33,511±0,031 mmol/g). 2015 m. rinktose uogose Aklajame eţere yra diţiausia antocianų koncentracija – 56,638±0,0838 mmol/g, o Ţuvinto paliose maţiausia – 16,689±0,038 mmol/g.
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu identifikuoti penki antocianai: cianidin-3-arabinozidas, delfinidin-3-arabinozidas, malvidin-3-gliukozidas, petunidin-3-arabinozidas, peonidinchloridas.
Atlikus tyrimus 2014 m. Ţuvinto paliose nustatyti didţiausi cianidinio (28,704±0,095 µg/g), delfinidino (23,422±0,116 µg/g), malvidino (114,644±0,026 µg/g) kiekiai. Didţiausias petunidino kiekis nustatytas 2014 m. Pagronyčio kaime (48,353±0,016 µg/g), peonidino – 2015 m. Vilkiaušio kaime (3,273±0,007µg/g).
Master Thesis by E. Ignatavičiūtė/ scientific manager dr. R. Marksienė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacia, Analytical Chemistry and Toxicology Cathedral. – Kaunas.
Title. Qualitative and Quantitative Determination of Anthocyanins In Cranberry (Vaccinium Oxycoccos L.) Fruits.
Keywords. Vaccinium Oxycoccos L., high performance liquid chromatography, spectrophotometry, anthocyanins.
Object and methods of the study. Fruits of (Vaccinium Oxycoccos L.) were collected in different regions of Lithuania in September – October in 2014 and 2015. V. oxyccocos L. fruits presscakes were extracted with ethanol containing 0.1M HCl. Total anthocyanins content in cranberry fruits were determinated using spectrophotometry. Qualitative and quantitative anthocyanins content in fruits were determinated by high perfomance liquid chromatography.
Aim of the study. Determinate qualitative and quantitative anthocyanins content in cranberry (Vaccinium oxycoccos L.) using spectrophotometry and high perfomance liquid chromatography.
Goals of the study. Determinate total anthocyanins contents in cranberries (Vaccinium oxycoccos L.) using spectrophotometry. Determinate qualitative and quantitative anthocyanins content in cranberry (Vaccinium oxycoccos L.) using high perfomance liquid chromatography. Compare consist of cranberry (Vaccinium oxycoccos L.) fruits collected in different regions of Lithuania.
Results and conclusions. In 2014 the highest value of total anthocyanin content by spectrophotometry (67.107±0.103 mmol/g) was estimated in fruits from Vaineţeris village, and the lowest (33.511±0.031 mmol/g) – from Čepkeliai region. In 2015 the highest amount of total anthocyanin was determined in Aklasis lake (56.638±0.0838 mmol/g), and the lowest in Ţuvinto palios region (16.689±0.038 mmol/g). Using High perfomance liquid chromatography were identified five anthocyanins: cyanidin-3-arabinoside, delphinidin-3-arabinoside, malvidin-3-glucoside, petunidin-3- arabinoside, peonidin chloride. The highest amount of cyanidin (28.704±0.095 µg/g), delphinidin (23.422±0.116 µg/g), malvidin were determined in Ţuvinto palios region in 2014. The highest amount of petunidin (48.353±0.016 µg/g) was estimated in Pagronyčio village in 2014, and in 2015 in Vilkiaušis village was determined the highest amount of peonidin (3.273±0.007µg/g).
SANTRUMPOS
ADP - adenozido difosfatas COX-1 - ciklooksigenazė-1 COX-2 - ciklooksigenazė-2
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija IL-8 - interleukinas- 8
MS – masių spektrometrija
TPSS - tarptautinė prostatos simptomų skalė TFA – trifluoracto rūgštis
TRAP - trombino receptorių aktyvinantis peptidas UV - ultravioletinė šviesa
VEGF - kraujagyslių endotelio augimo faktorius
ĮVADAS
Paprastoji spanguolė (Vaccinium Oxycoccos L.) priskiriama erikinių šeimai (Ericaceae), šilauogių genčiai (Vaccinium), magnolijūnų skyriui (Magnoliophyta) [1]. Paprastosios spanguolės paplitusios visoje Lietuvoje (Ignalinos, Švenčionių, Varėnos ir Marijampolės rajonuose) [2]. Lietuvoje auga dviejų rūšių spanguolės – paprastoji (laukinė) spanguolė (Vaccinium oxycoccos L.) ir smulkiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpum L.) [3].
Nuo seno ţmonės spanguoles vertina dėl jų uogų, kuriose kaupiasi daug biologiškai aktyvių medţiagų [4]. Kaupiami junginiai - antocianai uţkerta kelią infekcinėms ligoms, šlapimo takų infekcijoms, skrandţio opų, dantų ėduonies susidarymui, vėţio išsivystymui. Spanguolėms būdingos antibakterinės, antimutageninės, antikancerogeninės, antioksidantinės savybės [5,6]. Pagrindinis šlapimo takų infekcijos mechanizmas prevencijai yra bakterijų prikibimo prie uropitelio slopinimas [7].
Antocianai - natūralūs pigmentai, kurie augalams suteikia raudoną, oranţinę, violetinę ir mėlyną spalvas [8]. Spanguolių uogose nustatomi 5 antocianidinai: cianidinas, malvidinas, petunidinas, peonidinas, delfinidinas [6,9]. Antocianai svarbūs tiek augalui, tiek ţmogaus organizmui.
Antocianai atlieka svarbų vaidmenį pritraukiant vabzdţius augalo apdulkinimui ir apsaugant nuo UV spindulių [10]. Jiems būdingas antioksidantinis, priešalerginis, priešuţdegiminis, priešvirusinis, antiproliferacinis, antimutageninis, antimikrobinis, antikancerogeninis poveikis. Antocianai pasiţymi apsauginiu poveikiu prieš širdies ir kraujagyslių paţeidimus, diabeto prevencija, gerina mikrocirkuliaciją [11].
Lyginant su kitomis šalimis, Lietuvoje augančių paprastųjų spanguolių uogų tyrimų yra atlikta maţai, todėl svarbu įvertinti uogų kokybinę ir kiekybinę antocianų sudėtį. Šiame darbe pirmą kartą yra įvertinta kokybinė ir kiekybinė antocianų sudėtis apimant 10 skirtingų Lietuvos vietų.
Šio darbo tikslas ištirti įvairiose Lietuvos vietose augančių paprastųjų spanguolių (Vaccinium oxycoccos L.) vaisių antocianų kokybinę ir kiekybinę sudėtį spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
.
DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas - ištirti įvairiose Lietuvos vietose augančių paprastųjų spanguolių (Vaccinium oxycoccos L.) vaisių antocianų kokybinę ir kiekybinę sudėtį spektrofotometrijos ir efektyviosios skysčių chromatografijos metodais.
Darbo uţdaviniai:
1. Nustatyti bendrą antocianų kiekį paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) vaisiuose spektrofotometrijos būdu.
2. Nustatyti kokybinę ir kiekybinę antocianų sudėtį paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) vaisiuose efektyviosios skysčių chromatografijos būdu.
3. Palyginti skirtingose Lietuvos vietose surinktų paprastosios spanguolės (Vaccinium oxycoccos L.) vaisių antocianų kokybinę ir kiekybinę sudėtį.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Paprastosios spanguolės apibūdinimas
Paprastoji spanguolė (Vaccinium oxycoccos L.) priskiriama erikinių šeimai (Ericaceae), šilauogių genčiai (Vaccinium), magnolijūnų skyriui (Magnoliophyta) [1].
Spanguolė yra visţalis krūmokšnis, kurios stiebai gleţni, šliauţiantys ir šakoti. Augalas neturi spyglių. Spanguolių stiebas yra nuo rudos iki tamsiai raudonos spalvos, plonas, sumedėjęs, lankstus, įsišaknijęs, išauga iki 80 cm aukščio su trumpomis šakelėmis. Lapai – praţanginiai, odiški ir smulkūs, į viršų smailėjantys, trumpakočiai, padengti storu vaško sluoksniu, lapo viršus – tamsiai ţalios, o apačia – mėlynai ţalios spalvos. Lapo kraštas lygus, nedantytas, ilgis yra 2-10 mm, o plotis – 1-3 mm.
Visą ţiemą lapai išlieka ţali. Ţiedai – smulkūs, rausvos ar avietinės spalvos, susitelkę skėtiniuose ţiedynuose, po 1-5 lapų paţastyse. Paprastoji spanguolė ţydi geguţės – liepos mėnesiais. Vaisius - per ţiemą ţiemojanti uoga. Uogos sultingos, raudonos, kartais su baltomis ar rudomis juostomis, kiekvienoje uogoje randama nuo 3 iki 11 sėklų. Sėklos yra rudos, nuo 1,5 iki 2,8 mm ilgio, vidutinė masė 0,68±0,17 mg [2,12] (1 pav.).
1 pav. Paprastoji spanguolė (Vaccinium oxycoccos L.) [13].
1.1.1. Paprastosios spanguolės paplitimas Lietuvoje ir pasaulyje
Paprastosios spanguolės paplitusios visoje Lietuvoje. Ji aptinkama drėgnose vietose, tokiose kaip tarpinio tipo pelkės, aukštapelkės, pelkėti miškai. Spanguolės auga rūgščioje (pH 3,0–4,5) durpėje, o krituliai – svarbiausias drėgmės šaltinis [14].
Spanguolės daţniausiai auga aukštumose. Lietuvoje auga dviejų rūšių spanguolės – paprastoji (laukinė) spanguolė (Vaccinium oxycoccos L.) ir smulkiauogė spanguolė (Vaccinium macrocarpum L.) [3]. Daugiausiai spanguolių yra Ignalinos, Švenčionių, Varėnos ir Marijampolės rajonuose [2].
Paprastoji spanguolė auga šiaurės vakarų ţemyno dalyje - Airijoje, Didţiojoje Britanijoje, Skandinavijoje, visoje Vidurio ir Rytų Europoje, Balkanų šalyse, Bulgarijoje, ir net išsiplėtusi Sibire ir Japonijoje (2 pav.). Taip pat šios rūšies spanguolių randama Grenlandijoje ir Šiaurės Amerikos šiaurinėje dalyje. Vaccinium macrocarpum L. auginamos JAV ir Didţiojoje Britanijoje. Komerciniais tikslais naudojamos Skandinavijoje, Baltijos šalyse, Lenkijoje, Baltarusijoje, Ukrainoje, Rusijoje, Šveicarijoje, Prancūzijoje ir Italijoje [15].
.
2 pav. Paprastosios spanguolės paplitimas Europoje [13].
1.1.2. Paprastosios spanguolės uogų cheminė sudėtis
Spanguolėse yra daug biologiškai aktyvių medţiagų. Paprastoji spanguolė kaupia kelių grupių fenolinius junginius:
flavonoidus (flavonolius, flavan-3-olius (katechinus), antocianus, proantocianinus);
fenolines rūgštis, pvz., benzoinę rūgštį, elago rūgštį.
Be polifenolinių junginių yra ir kitos organinės rūgštys, angliavandeniai, cukrai, vitaminai, pektinai, makro- ir mikroelementai [5,9,14,16,17].
Spanguolėse nustatoma antocianidinai peonidinas ir cianidinas su prijungta galaktoze, arabinoze ar gliukoze [6,18] (3 pav.). Maţesni kiekiai nustatomi petunidino-3-galaktozido [9].
Malvidinas ir delfinidinas sudaro maţiau nei 1 proc. viso raudonojo pigmento. Kvercetin-3- galaktozidas, kvercetin-3-ramnozidas, kvercetin-3-arabinozidas, miricetin-3-arabinozidas ir miricetin- 3-galaktozidas taip pat nustatomi spanguolėse ir lemia jų sulčių spalvą [6].
3 pav. Antocianai, kaupiami spanguolėse: A – peonidin-R, B – cianidin-R (R- galaktozidas, arabinozidas, gliukozidas) [18].
Spanguolių vaisiai kaupia triterpenoidinius darinius. Pagrindiniai terpenoidai – pentaciklis triterpeno alkoholis, ursolo rūgštis [18] (4 pav.).
4 pav. Spanguolėse nustatoma ursolo rūgštis [18].
Švieţiuose vaisiuose vidutiniškai 15-20 mg/100 g aptinkama hidroksicinamiono rūgšties ir hidroksibenzenkarboksirūgšties [18] (5 pav.).
5 pav. Spanguolės vaisiuose kaupiama hidroksicinamono rūgštis ir hidroksibenzenkarboksirūgštis [18].
1.1.3. Paprastosios spanguolės biologinės savybės ir naudojimas
Tradicinėje medicinoje spanguolės vertinamos dėl uogų, kuriose kaupiasi daug biologiškai aktyvių medţiagų, pasiţyminčių gydomosiomis savybėmis. Spanguolių uogos ir sultys malšina troškulį, tonizuoja organizmą, gerina darbingumą, apetitą, virškinimą. Spanguoles vartoti tinka tada, kai sumaţėjęs skrandţio sulčių rūgštingumas. Jų kaupiami organiniai junginiai gydo kraujagyslių, širdies, kepenų ir dantenų ligas. Liaudies medicina rekomenduoja uogas valgyti esant kraujavimams, aukštai kūno temperatūrai. Spanguolės maţina cholesterolį, švelniai stimuliuoja kasos veiklą [4].
Spanguolėse aptinkami polifenoliai padeda sumaţinti širdies ir kraujagyslių ligų riziką, gerina gliukoreguliaciją diabetikams, kuriems gresia širdies kraujagyslių ligos. Fenoliniai junginiai uţkerta kelią infekcinėms ligoms, šapimo takų infekcijoms, skrandţio opų, dantų ėduonies, susidarymui, vėţio išsivystymui. Spanguolės taip pat pasiţymi antibakterinėmis, antimutageninėmis, antikancerogeninėmis, antioksidantinėmis savybėmis [5,6].
Spanguolės vartojamos gydant šlapimo takų infekcijas ar jų prevencijai. Šlapimo takų infekcija – daţna problema nėščioms moterims. Šiai problemai spręsti galima vartoti spanguolių uogas ar jų ekstraktus. Atlikus klinikinius tyrimus, nebuvo pastebėta ţala motinai ir vaisiui [19].
E. coli sukelia 70-90 proc. visų šlapimo takų infekcijų. E. coli struktūra pritaikyta prisitvirtinti prie pereinamųjų ląstelių (urotelio). Spanguolėse aptinkami proantocianidinai pasiţymi antiadhezinėmis savybėmis prieš E.coli. Jie taip pat pasiţymi antibakteriniu aktyvumu prieš Klebsiella pneumonia, H. pylori, Proteus mirtabilis, Staphylococcus aureus, Salmonella ir Pseudomonas aeruginosa [6,17,20]. Salmonella, Staphylococcus, Helicobacter ir Bacillus yra antocianams
jautriausios bakterijos. Fenoliniai junginiai slopina Escherichia, Clostridium ir Campylobacter bakterijų augimą, o Lactobacillus ir Listeria ne [6].
Antimikrobinis poveikiui prieš šlapimo takų infekciją pasiūlyti du mechanizmai: šlapimo rūgštėjimas ir bakterijų adhezinių savybių slopinimas [7]. Buvo manoma, kad spanguolių vartojimas sukelia šlapimo rūgštėjimą. Vartojant spanguolių uogas, padidėja hipuro rūgšties koncentracija, kas manyta, kad lemia šlapimo pH sumaţėjimą. Nors atlikus tyrimus buvo pastebėtas pH sumaţėjimas, tačiau nė vienas šlapimo mėginys neparodė bakteriostatinio poveikio prieš E. coli. Pripaţinta, kad norimas poveikis nepasiektas, nes nepakankama hipuro rūgšties koncentracija, kuri galėtų sukelti bakteriostatinį poveikį [21]. Naujausi tyrimai įrodė, jog šlapimo rūgštėjimas neturi jokios įtakos prieš šlapimo takų infekciją. Pagrindinis mechanizmas infekcijos prevencijai yra bakterijų prikibimo prie uropitelio slopinimas [7]. E. coli fimbrijos gamina 2 adhezinus (angl. mannose sensitive and mannose resistant), kuriomis prisitvirtina prie uropitelio ląstelių. Tačiau spanguolėse randami du junginiai, kurie slopina šiuos adhezinus – fruktozė, kuri slopina manozei jautrų ir didelės molekulinės masės junginys, kuris slopina manozei atsparų E. coli adheziną [21].
Atliktas tyrimas, norint palyginti spanguolių ekstrakto efektyvumą su trimetoprimu pasikartojančių šlapimo takų infekcijos prevencijai. Tyrimo metu 137 moterys atsitiktinai suskirstytos į dvi grupes. Vienos buvo gydomos 500 mg spanguolių ekstrakto, o kitos 100 mg trimetoprimo 6 mėnesius. Tyrimo rezultatai parodė, jog šlapimo takų infekcija pasikartojo vidutiniškai po 84,5 dienų moterims, vartojusios spanguolių ekstraktą ir vidutiniškai po 91 dienos trimetoprimą vartojusioms moterims. Remiantis tyrimų rezultatais, galima teigti, jog spanguolių ekstraktas tinkamesnis vartoti esant pasikartojančiai šlapimo takų infekcijai, nes tai pigesnis ir natūralus produktas, neišsivysto antimikrobinis atsparumas [22].
Apatinių šlapimo takų simptomai vis daţnesni vyresnio amţiaus vyrų tarpe. Jie gali būti susiję su gerybinės prostatos hiperplazija, kuri pasireiškia 50 proc. vyrų 50 metų amţiaus ir 90 proc. vyrų 80 metų. Apatinių šlapimo takų simptomai taip pat gali atsirasti dėl su amţiumi susijusios šlapimo pūslės disfunkcijos. Nors apatinių šlapimo takų simptomai nėra gyvybiškai pavojingi, tačiau gydymas yra būtinas, siekiant išvengti komplikacijų [4].
Dėl teigiamo spanguolių poveikio šlapimo takų sistemai, buvo atlikti tyrimai, siekiant išsiaiškinti spanguolių įtaką apatinių šlapimo takų simptomams vyrų tarpe. Atsitiktinių imčių, dvigubai aklas, placebo kontroliuojamas tyrimas truko 6 mėnesius. Pacientams buvo skiriama 250 mg, 500 mg spanguolių ekstrakto tabletės arba placebo per parą. Apatinių šlapimo takų infekcijos simptomai buvo vertinami remiantis TPSS, gydymo pradţioje, praėjus 3 ir 6 mėnesiams. Tyrimo rezultatai parodė sumaţėjusius TPSS rodiklius, pagerėjo šlapimo nutekėjimas [4].
Ţmogaus skrandyje H. pylori stimuliuodama skrandţio ląsteles ir skatindama interleukino-8 (IL-8) ir kitų uţdegiminių citokinų išsiskyrimą, sukelia chronišką uţdegimą ar net vėţį. Atlikus mokslinius tyrimus, išsiaiškinta, kad spanguolės slopina IL-8 sekreciją. Todėl spanguolės gali būti vartojamos siekiant sumaţinti uţdegimą ar vėţio prevencijai [23].
Spanguolių antiadhezinės savybės svarbų vaidmenį vaidina ir apsaugant burnos ertmės sveikatą. In vitro tyrimai įrodė, jog spanguolių vaisių ir ekstraktų vartojimas slopina kai kurių burnos bakterijų prikibimą prie dantų. Streptokokų ir aktinomicetų sukibimas su seilių glikoproteinais, sukelia dantų apnašų formavimąsi, periodontitą, dantenų ligas. Spanguolių vartojimas slopina šį sukibimą.
Spanguolių komponentai geba keisti burnos mikroflorą ir palaikyti burnos ertmės sveikatą [24].
1.2. Antocianų charakteristika
Antocianai yra flavonoidų junginių klasė, kuri randama vaisiuose ir darţovėse. Mokslinėje literatūroje aprašyta daugiau nei 500 skirtingų antocianų [25]. Jie yra vandenyje tirpūs augalų pigmentai, kurių molekulinė masė svyruoja nuo 400 iki 1200. Antocianai suteikia augalams raudoną, oranţinę, violetinę ir mėlyną spalvas [8]. Jie yra paplitę 27 maistinių augalų šeimose. Antocianai yra tirpūs vandenyje polihidroksilio ir polimetoksilio 2-fenilbezoprilio dariniai [11].
Pigmentai gaminasi augančių ląstelių audiniuose. Įvairūs aplinkos veiksniai turi įtakos antocianų gamybai – šviesa (jos intensyvumas, bangų ilgis), temperatūra, vandens ir angliavandenių kiekis. Didţiausia antocianų gamyba yra esant mėlynai šviesai. Skirtingas šviesos lygis sukelia skirtingų pigmentų susidarymą. Įtakos gamybai turi ir elementai – azotas, fosforas, boras [10].
Antocianų atspalvis ir struktūra priklauso nuo pH. Kai pH 1-3, flavilio katijonas yra raudonos spalvos, kai pH 5, susidaro bespalvės pseudobazės, o esant pH 7-8, susidaro mėlyna bazė [11,26].
Šviesa ir temperatūra yra pagrindiniai veiksniai, kurie lemia antocianų skilimą. Antocianus geriausia laikyti vėsioje, tamsioje vietoje. Saulės šviesa ir temperatūra panaikina pigmentaciją. SO2 daţnai naudojamas kaip vaisių ir darţovių augimo inhibitorius. Tačiau jis veikia kaip nukleofilas ir atakuoja flavilio joną antocianuose, taip efektyviai balina pigmentą [26].
Atlikti klinikiniai tyrimai su ţmonėmis parodė, jog šie pigmentai yra prastai absorbuojami.
Antocianų koncentracija kraujo plazmoje svyravo 10-15 nmol/l. Tmax 1,5 h, suvartojus 188-3570 mg visų cianidinglikozidų Cmax apie 2,3-96 nmol/l. Išsiskyrimas su šlapimu siekė tarp 0,018 proc. ir 0,37 proc. Maksimalus išsiskyrimas su šlapimu pasiekiamas per maţiau nei 4 h [25].
1.2.1. Antocianų struktūra
Antocianams būdingas C6-C3-C6 struktūra [27]. Struktūros pagrindas – du aromatiniai ţiedai (A ir B), kuriuos jungia trijų anglies atomų grandinė, kuri sudaro heterociklą ir yra prisotinta deguonimi (C ţiedas) (6 pav.). Pagrindinė struktūros dalis – anglikonas arba antocianidinas. Prie jo yra prijungti vienas ar daugiau cukrų, kurie gali būti esterinti [26].
Yra ţinoma 17 antocianidinai, tačiau randami augaluose tik 6. Jie klasifikuojami pagal hidroksilo grupių skaičių ir padėtis flavano branduolyje. Pagal tai išskiriami: cianidinas, delfinidinas, malvidinas, peonidinas, pelargonidinas, petunidinas [11,27] (6 pav.).
Antocianidinas Radikalas
R1 R2
Pelargonidinas H H
Cianidinas OH H
Delfinidinas OH OH
Peonidinas OCH3 H
Petunidinas OCH3 OH
Malvidinas OCH3 OCH3
6 pav. Antocianidinų struktūros vaisiuose ir darţovėse [8].
Antocianinai tarpusavyje skiriasi hidroksilo grupių skaičiumi ir padėtimi, hidroksilo grupių metilinimo laipsniu, cukrų vieta ir skaičiumi molekulėje, alifatinėmis arba aromatinėmis rūgštimis, prijungtomis prie cukrų [11].
Daţniausi prisijungę cukrūs yra gliukozė, galaktozė, ramnozė ir arabinozė. Šie cukrūs daţniausiai yra prisijungę prie 3-oje padėtyje esančio anglies atomo C ţiede, arba 5 ar 7 padėtyje prie B ţiedo (6 pav.). Kiek rečiau, bet taip pat galima glikolizacija 3,4,5 padėtyje B ţiede [27] (6 pav.).
Hidroksilo grupė, esanti trečioje padėtyje, glikozilinant nulemia antocianų spalvą nuo geltonai oranţinės iki raudonos (6 pav.). Antocianai gali būti suskirstyti į dvi grupes pagal spalvas ir pH poveikį. Pirmąją grupę sudaro 3-gliukozidai su antocianidinais pelargonidinu, peonidinu ir malvinidinu. Jiems būdinga mėlyna spalva. Antrąją grupę sudaro cianidinas, petunidinas ir delfinidinas. Spalva pereina nuo mėlynos iki rausvos [26].
Glikozilinimas padidina molekulės struktūros stabilumą ir tirpumą vandenyje. Acilinant cukraus liekaną rūgštimis (pvz., p-kumarino, kofeino, acto, gintaro), gerėja antocianidino stabilumas.
Di-, tri-, ar poli- acilinti antocianai pasiţymi didesniu stabilumu lyginant su mono acilintais antocianais [11]. Acilinti antocianai maţai jautrūs pH pokyčiams ir spalva būdinga mėlynesnė nei neacilintų antocianų. Acilinti antocianai stabilesni neutraliuose ir šarminiuose tirpaluose. Tokį padidėjusį stabilumą lemia, jog acilinti antocianai yra atsparesni flavilio jono hidratacijai [26].
1.2.2. Antocianų pasiskistymas vaistinėse augalinėse ţaliavose ir poveikis augalams
Antocianai turi įtakos vaisių ir darţovių spalvingumui. Šie pigmentai nustatomi įvairiuose augaluose, tokiuose kaip obuoliai, morkos, kopūstai, raudonieji svogūnai, ridikėliai, vynuogės, uogos (juodųjų serbentų, mėlynių, bruknių, spanguolių, aviečių, gervuogių, šeivamedţių uogos, aronijų uogos ir kt.) ir kt. [11] (1 lentelė).
1 lentelė. Antocianų kiekybinė sudėtis augalinės kilmės produktuose [25].
Produktas Antocianų kiekis
Šeivamedţio uogos 664-1816 mg/100 g
Avietės 20-687 mg/100 g
Gervuogė 82,5-325,9 mg/100 g
Mėlynės 61,8-299,6 mg/100 g
Spanguolės 67-140 mg/100 g
Aronijos uogos 410-1480 mg/100 g
Juodieji serbentai 130-476 mg/100 g
Raudonieji kopūstai 322 mg/100 g
Raudonieji svogūnai 23,3-48,5 mg/100 g
Obuoliai 0,0-60,0 mg/100 g
Raudonosios vynuogės 30-750 mg/100 g
Kukurūzai 1642 mg/100 g
Antocianai atlieka svarbų vaidmenį dvejuose augaluose vykstančiuose procesuose. Visų pirma, jie padeda pritraukti vabzdţius, augalų apdulkinimui. Pigmentai sugeria ultravioletinius spindulius ir augalai tampa ypač pastebimi. Šie pigmentai dėl savo ryškių, pastebimų spalvų padeda mėsėdţiams augalams prisivilioti vabzdţius grobuoniškiems tikslams. Antrasis svarbus pigmentų vaidmuo augale yra augalo apsauga nuo UV spindulių. Antocianai reaguoja į UV spindulius ir apsaugo augalo DNR nuo paţeidimų. Kitaip gali sutrikti ląstelių dalijimasis, baltymų sintezė ir kiti gyvybiškai svarbūs ląstelės procesai [10].
1.2.3. Antocianų poveikis ţmogaus organizmo sistemai
Antocianams būdingas antioksidantinis, priešalerginis, priešuţdegiminis, priešvirusinis, antiproliferacinis, antimutageninis, antimikrobinis, antikancerogeninis poveikis. Taip pat pasiţymi apsauga prieš širdies ir kraujagyslių paţeidimus, periferine kapiliarų trapumo ir diabeto prevencija, gerina mikrocirkuliaciją [11].
Antocianams dėl jų struktūros būdingos antioksidantinės savybės ypatingai dėl hidroksilo radikalo C ţiede gebėjimo sudaryti chelatus su metalų (Fe, Cu) jonais. Antioksidantinis aktyvumas padidėja acilinant cukraus radikalus aromatinėmis rūgštimis. Tyrimai įrodė, kad antocianai gali turėti didesnį antioksidantinį aktyvumą nei vitaminas E, askorbo rūgštis, β-karotenas. Cianidin-3-rutinozidas sustiprina regėjimą dėl poveikio rodopsino regeneracijai [26].
Antocianai yra reduktoriai, kurie patys gali oksiduotis ir slopinti kitų molekulių oksidaciją.
Antocianų antioksidantinis pajėgumas susijęs su hidroksilo grupėmis B ţiede. Oksidacinės reakcijos gali būti labai pavojingos ląstelėms. Oksidacijos reakcijų metu atsiskiria laisvasis radikalas – reaktyvi molekulė su neporiniu elektronų skaičiumi. Ląstelėje prasideda grandininės laisvųjų radikalų reakcijos, kurios paţeidţia ar nuţudo pačią ląstelę. Antioksidantai slopina molekulių oksidaciją taip uţkirsdami kelią laisvųjų radikalų formavimuisi [28].
Gaubtinės ţarnos vėţys yra viena daţniausių vėţio formų tiek vyrams tiek moterims Jungtinėse Amerikos Valstijose. Atlikti tyrimai parodė, jog antocianai, esantys vaisiuose ir darţovėse, suteikia apsauginį poveikį prieš lėtines ligas, taip pat ir vėţį. Antocianinai slopina ţmogaus gaubtinės ţarnos vėţio ląstelių augimą [8]. Pavyzdţiui, vyšniose, Hibsicus, randami antocianai slopina COX-1 ir COX-2 in vitro, COX-2 svarbus dėl onkogenezinio poveikio. Antocianai turi įtakos vėţio plitimui per įvairius mechanizmus. Antocianai ir jų glikozidai, delfinidinas, cianidinas ir petunidinas, sukelia apoptozę promielocitinės leukemijos [26].
Antocianai maţina nutukimo ir diabeto pavojų. Tyrimai rodo, jog violetiniai kukurūzų pigmentai slopina tiek kūno svorio, tiek riebalinio audinio didėjimą [26]. Naujausių tyrimų
duomenimis nustatyta, kad vartojant vaisius ar darţoves praturtintus polifenoliu, sumaţėja antro tipo diabeto rizika, susijusi su insulino atsparumu. Antocianinai apsaugo kasos beta ląsteles nuo gliukozės sukelto oksidacinio streso. Atlikti tyrimai įrodė, jog antocianinai ir antocianidinai skatina gliukozės išsiskyrimą iš kasos beta ląstelių, kurį sukelia gliukozės padidėjimas. Pavyzdţiui, vyšniose esantis pelargonidin-3-galaktozidas ir jo anglikonas pelargonidinas sukelia 1,4 karto didesnę insulino sekreciją. O vynuogėse esantys antocianai ne tik sustiprina insulino sekreciją, bet ir slopina COX-2 fermentus. Vyšnios, vynuogės ir kitose uogos, kuriose aptinkama antocianų, tinkamos vartoti antro tipo cukrinio diabeto prevencijai [11].
Antocianai sumaţina uţdegimą, stiprina kapiliarų tvirtumą ir pralaidumą, slopina trombocitų agregaciją. Būdinga vazodilatacija dėl azoto oksido atsipalaidavimo [26]. Antocianai slopina trombino receptorių aktyvinantį peptidą (TRAP), kuris indukuoja trombocitų agregaciją, tačiau neturi įtakos trombocitų reaktyvumui, kai susiduria su stipriais agonistais, tokiais kaip kolagenas ir ADP [25].
Kraujagyslių endotelio augimo faktorius (VEGF) yra pagrindinis angiogezinis ir aterosklerozės veiksnys. Antocianai (ypatingai delfinidinas ir cianidinas) sustabdo VEGF, stimuliuojamą trombocitų išskiriamo augimo faktoriaus kraujagyslių raumenyse, ir taip sutrukdo mitogenų aktyvinamos proteinkinazės aktyvaciją [25].
1.2.4. Antocianų nustatymas augalinėse ţaliavose spektrofotometrijos metodu
Spektrofotometrijos metodu greitai nustatomas bendras antocianų kiekis. Tačiau šis metodas negali pateikti tikslių kiekybinio nustatymo duomenų dėl ekstraktų nepastovumo, antocianų cheminių savybių ir molinės antocianų absorbcijos, nesuteikia informacijos apie individualius antocianus [29].
Buvo analizuoti moksliniai straipsniai, kuriuose aprašoma spektrofotometrijos metodo būdai, kuriais nustatomas bendras antocianų kiekis augalinėje ţaliavoje.
20 g švieţių, uţšaldytų mėlynių sumaišyta su 150 ml metanolio:acto rūgšties:distiliuoto vandens mišiniu (25:1:24). Gautas ekstraktas centrifuguojamas (12000 rmp) 20 min. 20 °C temperatūroje. Likusi ekstrakto dalis po centrifugavimo, kai supernatantas pašalinamas, sumaišoma su 75 ml metanolio:acto rūgšties:distiliuoto vandens mišiniu, centrifuguojama, atskiriama supernatantas.
Kiekvienas mėginys ekstrahuojamas 3 kartus. Skaidrus skystis po 3 ekstrakcijų, išgarinamas vakuume esant 35 °C temperatūrai. Likusi liekana ištirpinama 5 ml 3 proc. skruzdţių rūgštyje vandenyje.
Vandeninis tirpalas adsorbuojamas ant kasetės. Kasetė plaunama 5 ml 3 proc. skruzdţių rūgštimi vandenyje ir eliuojami 3,5 ml 3 proc. skruzdţių rūgštimi metanolyje. Išgarinama vakuume iki sauso likučio (35 °C temperatūroje).
Analizė atliekama UV-Vis spektrofotometru. Liekana praskiedţiama iki 25 ml su metanoliu ir 0,1M HCl santykiu 85:15. Absorbcija matuojama esant 538 nm bangos ilgiui. Bendras antocianų kiekis išreiškiamas cianidin-3-rutinozidu [30].
Surinktos uogos uţaldomos – 18 °C temperatūroje. 50 g mėlynių uogų homogenizuojami ir ekstrahuojami 100 ml 80 proc. etanoliu 12h. Bendras antocianų kiekis nustatomas UV-Vis spektrofotometrijos metodu. Į du mėginius įdedama 1 cm3 ekstrakto ir 1 cm3 0,01 proc. HCl 80 proc.
etanolyje. Tuomet į vieną mėginį pilama 10 cm3 HCl ir 10 cm3 Mcllvain buferio (citrato-fosfato buferis, pH 3,5). Matuojama absorbcija esant 520 nm bangos ilgiui [31].
1.2.5. Antocianų nustatymas augalinėse ţaliavose ESC metodu
Mokslinėje literatūroje buvo analizuoti straipsniai, kuriuose aprašomi ESC metodo būdai, kuriais remiantis nustatomi antocianai augalinėje ţaliavoje.
Efektyvioji skysčių chromatografija pasiţymi dideliu jautrumu ir leidţia aptikti įvairius antocianus, efektyviai juos atskirti, atpaţinti ir kiekybiškai nustatyti tiriamuosiuose produktuose [28].
ESC su diodinės matricos ar MS detektoriais yra jautrus metodas ir efektyviai aptinka ir atskiria antocianus, remiantis UV absorbcija ir MS fragmentacija. Antocianai turi anglikonus antocianidinus pvz., cianidiną, delfinidiną, petunidiną, pelargonidiną, peonidiną, pagal kuriuos nustatomas kiekybinė antocianų sudėtis vaisiuose [29].
Ekstraktai iš augalinių ţaliavų (gervuogių, šilkmedţio, mėlynių vaisių) gauti ekstrahuojant sušaldytas uogas parūgštintu metanoliu (0,1 proc. HCl) ultragarso sąlygomis (59 kHz, 60 min., 25 °C temperatūroje). Ekstraktai filtruojami per Whatman 1 numerio popierinius filtrus ir garinami vakuume (40-45 mbar) 30–35 °C temperatūroje. Ekstraktai praskiedţiami metanoliu iki 25 ml tūrio.
Gauti ekstraktai analizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Chromatografijos sistemą sudaro DIONEX Ultimate 3000 įrenginys su fotodiodo detektoriumi, 20 µl injekcijos kilpa, 4,6x150 mm kvarcinė kolonėlė.
Ekstraktai praskiesti 0,5 proc. trifluoracto rūgštimi (TFA). Judančioji fazė – 20 proc.
metanolis, kuriame yra 0,5 proc. TFA (tirpiklis A) ir metanolis (tirpiklis B). Tėkmės greitis – 1,5 ml/min. 30 min. – izokratinės sąlygos su 100 proc. tirpiklio A, kitas 30 min. gradientinės sąlygos – 100 proc. tirpiklio A ir 90 proc. B, iki analizės pabaigos – izokratinės sąlygos su 90 proc. tirpiklio A ir 10 proc. tirpiklio B. Detekcija atlikta prie 520 nm bangos ilgio [32].
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu pagal pirštų antspaudus buvo analizuotos mėlynės. Uogos sutrintos naudojant skystą azotą. Pulverizuoti mėlynių mėginiai (5 g) ekstrahuojami
100 ml parūgštintu metanoliu (0,1 proc. HCl) 2h 40 °C temperatūroje. Ekstraktai filtruojami ir iš naujo ekstrahuojami su 100 ml organinio tirpiklio 2 h. Supernatantai sausai išgarinti vakuuminėse sąlygose esant 35 °C temperatūrai. Gautas likutis ištirpinamas 15 ml parūgštinto vandens (pH 3,0). Prieš ESC analizę ekstraktai praskiesti judančia faze ir centrifuguoti (8000 rmp).
Analizė atlikta ESC metodu su PDA detektoriumi. Detekcija atlikta prie 520 nm bangos ilgio.
Judančiąją fazę sudaro vanduo:skruzdţių rūgštis:acetonitrilas (87:10:3, V/V/V) – tirpiklis A, ir vanduo:skruzdţių rūgštis:acetonitrilas (40:10:50, V/V/V) – tirpiklis B. Gradiento kitimas: nuo 10 proc.
iki 14 proc. tirpiklis B per 40 min., nuo 14 proc. iki 20 proc. tirpiklis B per 4 min., nuo 21 proc. iki 30 proc. tirpiklis B per 6 min., nuo 31 proc. iki 40 proc. tirpiklis B per 10 min. Tėkmės greitis – 1,0 ml/
min. [33].
Efektyvioji skysčių chromatografija su masių spektrometrija veiksmingas metodas, skirtas kiekybinei antocianų analizei ir jų identifikavimui. Efektyvioji skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija padeda išsiaiškinti antocianų struktūrą ir identifikuoti pagal anglikono fragmentą, cukrų skaičių. Kapiliarinė temperatūra – 300 °C, purškimo įtampa – 4 kV. MS/ MS eksperimentams, molekuliniai jonai išskiriami iš jonų gaudyklės. Individualūs antocianai identifikuojami susiejant masių ir absorbcijos spektrus [33].
2. EKSPERIMENTINĖ DALIS
2.1. Medţiagos ir reagentai 2.1.1. Augalinė ţaliava
Tyrimams naudotos Vaccinium Oxycoccos L. (Paprastosios spanguolės) uogos, surinktos 2014 m. ir 2015 m. rugsėjo – spalio mėnesiais, skirtingose Lietuvos vietose: Kamanuose (Akmenės r.), Pagronyčio kaime (Merkinė), Vaineţerio kaime (Lazdijų r.), Dubičiuose (Varėnos r.), Vilkiaušio kaime, (Joniškio r.), Aklajame eţere (Jonavos r.), Čepkelių raiste (Varėnos r.), Labanoro girioje (Utenos r.), Vosiliškių pelkėje (Raseinių r.), Ţuvinto paliose (Alytaus r.). Uogos rinktos jų nokimo metu. Surinkti švieţi spanguolių vaisiai uţšaldyti ir laikyti -19±1 °C.
2.1.2. Reagentai
Išgrynintas vanduo (vandens grynumo sistema Milipore, JAV);
Etanolis (,,Stumbras“, Lietuva);
Vandenilio chlorido rūgštis (Lachema, Neratovice, Čekija);
Antocianidinų standartai - malvidinas, cianidinas, delfinidinas, petunidinas, peonidinas (,,Roth“, Karlsruhe, Vokietija ir ,,Chromadex“, Santa Ana, JAV);
Acetonitrilas (Sigma-Aldrich, Buch, Šveicarija);
Metanolis (Sigma-Aldrich, Buch, Šveicarija);
Bevandenė skruzdţių rūgštis (Sigma-Aldrich, Buch, Šveicarija).
2.1.3. Aparatūra
Purtyklė (Laboratory shaker type 358S, Lenkija);
Svarstyklės (AUW120D, Vokietija);
Spektrofotometras - Halo DH–20 UV–Vis (Dinamika GmbH, Šveicarija);
,,Waters 2695“ chromatografas (Waters Corporation, Milfordas, CT, JAV);
Detektorius ,,Waters 996 PDA“ (Waters Corporation, Milfordas, CT, JAV).
2.2. Antocianų kiekybinis nustatymas 2.2.1. Spanguolių uogų ekstraktų gamyba
Grūstuvėje sutrinamos uţšaldytų spanguolių uogos. Tyrimui naudota uogos ir uogų išspaudos.
Atsveriama 3 g sutrintų uogų ir ekstrahuojama parūgštintu etanoliu (0,1M HCl). Ekstahuojama tol, kol ekstrahentas tampa bespalvis. Ekstraktai pro popierinį filtrą filtruojami į 100 ml matavimo kolbą.
Gauti ekstraktai praskiedţiami parūgštintu etanoliu iki 100 ml. Gauto ekstrakto pH 1,2 [16].
2.2.2. Antocianų suminis nustatymas spektrofotometrijos metodu
Antocianų suminis kiekis spanguolėse nustatytas HALO-DH 20 spektrofotometru. Absorbcija matuojama prie 544 nm šviesos bangos ilgio. Lyginamasis tirpalas – parūgštintas etanolis (0,1M HCl).
Bendras visų antocianų kiekis išreikštas cianidin-3-gliukozidu. Antocianų koncentracija (mmol/ml) apskaičiuojama pagal kalibracinę kreivę [16].
C = A1*ABS + A0
A1, A0 – konstantos ABS - absorbcija
Antocianų koncentracija perskaičiuojama 1 g uogų pagal formulę:
𝐶 =𝑐x𝑉 𝑚 c – antocianų koncentracija, mmol/ml;
V – ekstrakto tūris, ml;
m – ekstrakcijai naudotas uogų kiekis, g.
2.2.3. Antocianų kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Antocianidinų nustatymui naudota 2 ml paruošto ekstrakto. Filtracija atlikta per membraninius 0,22 µm porų dydţio filtrus. Analizė atliekama naudojant ,,Waters 2695“ chromatografą su detektoriumi ,,Waters 996 PDA“. Kolonėlė – ACE (C18) 250x4,6 mm, su prieškolonėle. Sorbento
dalelių dydis – 5 µm. Detekcija atlikta esant 535 nm bangos ilgiui. Injekuota 10 µl tiriamojo ekstrakto.
Tėkmės greitis – 1 ml/min. Kolonėlė termostatuojama esant 30 °C temperatūrai [34].
Mobili fazė A sudaryta iš bevandenės skruzdţių rūgšties ir vandens (8,5:91,5 V/V), o mobili fazė B iš bevandenės skruzdţių rūgšties, acetonitrilo, metanolio, vandens (8,5:22,5:22,5:41,5 V/V/V/V) [34].
Eliuavimas – gradientinis (2 lentelė).
2 lentelė. Naudotas gradiento kitimas
Laikas (min.) Mobili fazė A (%) Mobili fazė B (%)
0 - 35 93 → 75 7 → 25
35 - 45 75 → 35 25 → 65
45 - 46 35 → 0 65 → 100
46 - 50 0 100
Analizuojama 30 °C temperatūroje. Antocianidinų tapatybė nustatyta lyginant analičių sulaikymo trukmes su standartų sulaikymo trukmėmis ir spektrais, gautais su PDA detektoriumi.
Sudaromi antocianidinų standartų kalibraciniai grafikai.
Standartai: delfinidinas – r2=0,9992, cianidinas – r2=0,9997, petunidinas - r2=0,9991, peonidinas - r2=0,9928, malvidino - r2=0,9744.
Statistinis duomenų įvertinimas. Statistiškai įvertinti gautus duomenis naudotos Microsoft Excel 2007 (Microsoft, JAV), Empower® ir ,,SPSS“ (Chigago, JAV) programos. Analizuojant, bandymai kartoti 3 kartus, rezultatai pateikti apskaičiavus vidurkį ± standartinis nuokrypis (SN).
Duomenys įvertinami statistiškai reikšmingais, jei p<0,05. Sudarytos klasterinės analizės dendrogramos pagal augimo vietą.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3. 1. Antocianų bendro kiekio nustatymas spektrofotometrijos metodu
Spektrofotometrijos būdu analizuojant medţiagas, turi būti parinktas tinkamas bangos ilgis.
Pasirenkama toks bangos ilgis, kuriam esant absorbcija yra didţiausia [35]. Antocianų rūgštiniai tirpalai daţniausiai analizuojami spektrofotometriniu metodu, esant didesniam nei 500 nm bangos ilgiui, nes absorbcijos reikšmė proporcinga pigmento koncentracijai [36].
Spektrofotometrijos metodu bendro antocianų kiekio nustatymas pagrįstas skaičiavimais išreiškiant bendrą kiekį cianidin-3-gliukozidu [37].
Spektrofotometrijos metodu buvo tirtos spanguolių uogos, rinktos 2014 ir 2015 m. skirtingose Lietuvos vietose.
3.1.1. Antocianų bendro kiekio nustatymas spanguolių uogose rinktose 2014 m.
spektrofotometrijos metodu
Duomenys gauti tiriant spektrofotometrijos metodu spanguolių uogas, rinktas 2014 m., pristatyti mokslinėje konferencijoje (1 priedas).
2014 m. rinktų spanguolių uogose didţiausias antocianų kiekis nustatytas Vaineţerio kaime, Lazdijų rajone, surinktose uogose (67,107±0,103 mmol/g). Maţiau jų yra Ţuvinto paliose ir Pagronyčio kaime rinktose uogose, antocianų kiekiai atitinkamai pasiskirsto 54,021±0,031 ir 52,285±0,084 mmol/g. Maţiausias antocianų kiekis nustatytas Čepkelių raiste surinktose spanguolėse (33,511±0,031 mmol/g). Panašus kiekis antocianų įvertintas uogose, rinktose Aklajame eţere ir Labanoro girioje (atitinkamai 36,107±0,054 ir 35,091±0,027 mmol/g) (7 pav.).
7 pav. Antocianų bendras kiekis (mmol/g) spanguolių uogose, rinktose 2014 m.
Įvertinus uogų, rinktų 2014 m., bendrą antocianų kiekį, išsiaiškinta, kad rezultatai statistiškai reikšmingi (p<0,05), tačiau tarp Kamanų ir Vosiliškių pelkės, Dubičių ir Vilkiaušio kaimo, Dubičių ir Vosiliškių pelkės, nustatyti rezultatai statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
Lyginant 2014 m. rinktų spanguolių antocianų bendrą kiekį, nustatyta, jog didţiausia koncentracija yra Vaineţerio kaimo uogose (67,107±0,103 mmol/g), o maţiausia – Čepkelių raisto (33,511±0,031 mmol/g). 2014 m. surinktose spanguolėse vidutinė antocianų koncentracija – 46,387 mmol/g.
Sudaryta 2014 m. nustatyto antocianų bendro kiekio pasiskirstymo pagal uogų augimo vietą klasterinės analizės dendrograma (8 pav.). Ji vietas, kuriose buvo surinktos spanguolių uogos padalija į dvi grupes. Pirmajai grupei priskiriamos uogos, surinktos Vaineţerio kaime. Jose bendras antocianų kiekis vyrauja didţiausias. Antroji grupė padalinta į du pogrupius. Pirmąjį pogrupį sudaro – Kamanuose, Čepkelių raiste, Labanoro girioje, Aklajame eţere rinkta ţaliava. Čia antocianų bendras kiekis nustatytas maţiausias. Antrąjį pogrupį sudaro – Ţuvinto paliose, Pagronyčio kaime, Vosiliškių pelkėje, Vilkiaušio kaime, Dubičiuose rinktos spanguolės. Jose nustatytas bendras kiekis yra didesnis nei pirmojo pogrupio, tačiau maţesnis nei pirmos grupės.
41,691
52,285
67,107
49,002 49,074
36,107 33,511 35,091
45,940
54,021
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000
Koncentracija, mmol/g
8 pav. 2014 metais rinktų spanguolių antocianų bendro kiekio pasiskirstymo dendrograma pagal augvietes. 1 - Kamanai (Akmenės r.), 2 - Pagronyčio kaimas (Merkinė), 3 - Vaineţerio kaimas (Lazdijų r.), 4 - Dubičiai (Varėnos r.), 5 - Vilkiaušio kaimas, (Joniškio r.), 6 -
Aklasis eţeras (Jonavos r.), 7 - Čepkelių raistas (Varėnos r.), 8 - Labanoro giria (Utenos r.), 9 - Vosiliškių pelkė (Raseinių r.), 10 - Ţuvinto paliai (Alytaus r.).
3.1.2. Antocianų bendro kiekio nustatymas spanguolių uogose rinktose 2015 m.
spektrofotometrijos metodu
Ištyrus 2015 m. rinktas spanguoles, didţiausias antocianų kiekis rastas Aklojo eţero spanguolėse (antocianų kiekis - 56,638±0,038 mmol/g). Vilkiaušio ir Pagronyčio kaimuose rinktose spanguolėse antocianų kiekis vyrauja panašus, atitinkamai nustatyta 45,399±0,038 ir 43,716±0,076 mmol/g. Kiek maţesnė koncentracija yra Vosiliškių pelkėje (41,360 mmol/g) ir Vaineţerio kaime rinktoje ţaliavoje (40,128±0,038 mmol/g). Maţiausias antocianų kiekis nustatytas Ţuvinto paliose rinktose spanguolėse (antocianų rasta 16,689±0,038 mmol/g). Didţiausia ir maţiausia nustatytos koncentracijos skiriasi 3,39 karto (9 pav.).
9 pav. Antocianų bendro kiekis (mmol/g) spanguolių uogose, rinktose 2015 m.
Įvertinus uogų, rinktų 2015 m., bendrą antocianų kiekį, išsiaiškinta, kad rezultatai statistiškai reikšmingi (p<0,05).
Lyginant 2015 m. rinktos ţaliavos bendrą antocianų kiekį, nustatyta, kad didţiausias bendras kiekis vyrauja Aklojo eţero uogose (56,638±0,038 mmol/g), o maţiausias – Ţuvinto palių (16,689±0,038 mmol/g). Vidutinė antocianų koncentracija spanguolių uogose yra 37,259 mmol/g.
Sudaryta 2015 m. nustatyto antocianų bendro kiekio pasiskirstymo pagal uogų augimo vietą klasterinės analizės dendrograma (10 pav.). Duomenys suskirstyti į dvi grupes. Pirmajai grupei priskiriama – Ţuvinto palios, kur bendras antocianų kiekis nustatytas maţiausias. Antroji grupė suskirstyta į du pogrupius. Pirmajam pogrupiui priklauso Aklasis eţeras. Čia rinktoje ţaliavoje apskaičiuotas didţiausias antocianų kiekis. Antrasis pogrupis suskirstytas į 2 grupeles. Vienai grupelei priskirta Vilkiaušio kaimas, Pagronyčio kaimas, Vosiliškio pelkė, Vaineţerio kaimas. Šioje pogrupio ţaliavoje vyrauja panaši antocianų koncentracija, tačiau ji yra maţesnė uţ pirmojo pogrupio. Kitai grupelei priklauso Labanoro giria, Kamanai, Čepkelių raistas, Dubičiai. Šiose vietose rinktose spanguolėse vyrauja maţesnis antocianų kiekis lyginant su pirma grupele, tačiau ne tiek maţas, kad pakliūtų į pirmąją grupę (10 pav.).
34,076
43,716
40,128
29,634
45,399
56,638
28,735
36,211 41,360
16,689
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000
Koncentracija, mmol/g
10 pav. 2015 metais rinktų spanguolių antocianų bendro pasiskirstymo dendrograma pagal augvietes. 1 - Kamanai (Akmenės r.), 2 - Pagronyčio kaimas (Merkinė), 3 - Vaineţerio kaimas (Lazdijų r.), 4 - Dubičiai (Varėnos r.), 5 - Vilkiaušio kaimas, (Joniškio r.), 6 - Aklasis eţeras (Jonavos r.), 7 - Čepkelių raistas (Varėnos r.), 8 - Labanoro giria (Utenos r.), 9 - Vosiliškių
pelkė (Raseinių r.), 10 - Ţuvinto paliai (Alytaus r.).
3.1.3. Antocianų nustatyto bendro kiekio palyginimas spanguolių uogose rinktose 2014 ir 2015 m. spektrofotometrijos metodu
Lyginant dvejų metų spanguolių uogų antocianų bendrą kiekį, paaiškėjo, jog beveik visuose 2014 metais rinktuose mėginiuose nustatyta didesnė antocianų koncentracija (išskyrus Jonavos ir Utenos rajonuose rinktas uogas). Didţiausias nustatytos antocianų koncentracijos pokytis pastebėtas spanguolių uogose, surinktose Ţuvinto paliose (2014 m. nustatytas antocianų kiekis didesnis 3,24 karto uţ 2015 m. nustatyta antocianų bendrą kiekį). Spanguolėse iš Aklojo eţero antocianų rasta daugiau 2015 m. nei 2014 m. (atitinkamai 56,638±0,038 ir 36,107±0,054 mmol/g). Maţiausias nustatytų koncentracijų pokytis yra Labanoro girioje rinktose uogose (2015 m. daugiau 1,12 mmol/g) (11 pav.).
11 pav. Antocianų bendro kiekio (mmol/g) spanguolių uogose, rinktose 2014 ir 2015 m., palyginimas.
Įvertinus bendro antocianų kiekio priklausomybę nuo uogų rinkimo metų, svyravimai nustatyti statistiškai reikšmingi (p<0,05), išskyrus Vosiliškių pelkę, kur svyravimai yra statistiškai nereikšmingi (p=0,0525).
Apibendrinant 2014 ir 2015 m. antocianų bendro kiekio rezultatus, nustatyta, jog didţiausias skirtumas tarp 2014 ir 2015 metų rezultatų, nustatytas Ţuvinto paliose surinktose uogose. Bendras antocianų kiekis beveik nesiskyrė Labanoro girioje rastose uogose.
3.2. Antocianų kokybinis ir kiekybinis nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Antocianų kokybinis ir kiekybinis nustatymas buvo atliktas efektyviosios skysčių chromatografijos būdu. Efektyvioji skysčių chromatografija efektyviai atskiria, atpaţįsta ir kiekybiškai nustato antocianus tiriamuosiuose produktuose. Šis metodas pasiţymi dideliu jautrumu ir leidţia aptikti įvairius antocianus [28]. Individualūs antocianai atskiriami pagal jų poliškumą, dėl kurio jie yra išplaunami skirtingais laikais [38].
Buvo analizuota moksliniai straipsniai parinkti geriausią ekstraktų ruošimo būdą.
Analizuotame straipsnyje taikyta rūgštinė hidrolizė. Pavyzdţiui, 15 g mėginio ekstrahuota 135 ml acetono, vandens ir acto rūgšties (70:29,5:0,5 V/V) mišiniu. Gautas mišinys laikytas 5 min. ultragarso
0,000 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000
Koncentracija, mmol/g
2014 m.
2015 m.
vonelėje 50 °C temperatūroje. Po to centrifuguojamas 3300 rpm 15 minučių ir vėl laikomas ultragarso vonelėje 30 min. Gautas mėginys sukoncentruotas naudojant rotacinį garintuvą. Sukoncentruota medţiaga (maţdaug 12 ml) praskiedţiama iki 25 ml [39]. Kitas ekstrakcijos metodas aprašytas moksliniame straipsnyje skiriasi ekstrahentu. 5 g uţšaldytų uogų ekstrahuota 10 ml acetono ir acto rūgšties (99:1 v/v) tirpalo. Ekstraktai laikomi ultragarso vonelėje 15 min ir centrifuguojami 15 min esant 3000 rpm. Sukoncentruota rotaciniu garintuvu. Ekstraktai 20 proc. metanoliu praskiedţiami iki 10 ml [40].
Pasirinktas optimaliausias rūgštinės hidrolizės variantas dėl metodo paprastumo, efektyvumo ir greitumo. 3 g sutrintų uogų ir ekstrahuojama parūgštintu etanoliu (0,1M HCl). Ekstahuojama tol, kol ekstrahentas tampa bespalvis. Ekstraktai pro popierinį filtrą filtruojami į 100 ml matavimo kolbą.
Gauti ekstraktai praskiedţiami parūgštintu etanoliu iki 100 ml [16].
Efektyviąja skysčių chromatografija kokybiškai nustatyti 5 antocianai: cianidin-3- arabinozidas, delfinidin-3-arabinozidas, malvidin-3-gliukozidas, petunidin-3-arabinozidas, peonidinchloridas. Įvertintų veikliųjų junginių sulaikymo laikai sulyginti su standartinių tirpalų sulaikymo laikais (12 pav.).
12 pav. Paprastosios spanguolės uogų ekstraktų chromatograma. 1 - delfinidin-3- arabinozidas, 2 - cianidin-3-arabinozidas, 3 - petunidin-3-arabinozidas, 4 - malvidin-3-
gliukozidas, 5 – peonidinchloridas.
Įvertinus spanguolių uogų kiekybinę sudėtį gauti rezultatai pateikiami 3 ir 4 lentelėse.
3 lentelė. Antocianidinų koncentracija (µg/g) spanguolių uogose, rinktose 2014 m.
skirtingose Lietuvos vietose.
Antocianidinas Rinkimo vieta
Koncentracija, µg/g
Cianidinas Delfinidinas Malvidinas Petunidinas Peonidinas Kamanai (Akmenės r.) 12,955±0,037 11,786±0,064 72,891±0,068 30,812±0,058 0,883±0,002 Pagronyčio kaimas (Merkinė) 25,139±0,093 17,868±0,010 95,628±0,098 48,353±0,016 1,906±0,010 Vaineţerio kaimas (Lazdijų r.) 21,620±0,043 13,646±0,047 94,758±0,063 27,514±0,008 0,970±0,009 Dubičiai (Varėnos r.) 21,003±0,130 10,981±0,037 106,347±0,015 33,660±0,020 1,414±0,007 Vilkiaušio kaimas (Joniškio r.) 23,437±0,055 22,707±0,103 67,48±0,056 30,594±0,025 0,536±0,006 Aklasis eţeras (Jonavos r.) 0,000 0,000 54,869±0,053 13,865±0,010 0,624±0,005 Čepkelių raistas (Varėnos r.) 0,000 0,000 65,590±0,111 14,626±0,040 0,809±0,004 Labanoro giria (Utenos r.) 17,746±0,077 16,747±0,084 81,944±0,037 33,476±0,026 1,054±0,003 Vosiliškių pelkė (Raseinių r.) 15,991±0,033 13,315±0,089 69,858±0,041 46,621±0,035 0,912±0,005 Ţuvinto palios (Alytaus r.) 28,704±0,095 23,422±0,116 114,644±0,026 29,543±0,029 1,089±0,008
Vidurkis 16,660 13,047 82,401 30,906 1,020
2014 m. rinktose spanguolėse didţiausias nustatytas kiekis yra malvidino, vidutiniškai 82,401 µg/g. Didţiausia malvidino koncentracija yra spanguolėse rinktose Ţuvinto paliose (114,644±0,026 µg/g). Šiek tiek maţesnis kiekis rastas Dubičių uogose (106,347±0,015 µg/g). Maţiausia koncentracija - Čepkelių raisto spanguolėse (65,590±0,111 µg/g). Peonidino vidutiniškai nustatyta 1,020 µg/g.
Didţiausias peonidino kiekis yra Pagronyčio kaime surinktose spanguolių uogose, o maţiausias – Vilkiaušio kaimo uogose (atitinkamai 1,906±0,010 ir 0,536±0,006 µg/g). Delfinidino vidutiniškai nustatyta 13,047 µg/g, o cianidino – 16,660 µg/g. Didţiausias cianidino ir delfinidino kiekis nustatytas Ţuvinto paliose (atitinkamai 28,704±0,095 ir 23,422±0,116 µg/g ). Aklojo eţero ir Čepkelių raisto uogose nenustatyta nei cianidino nei delfinidino (3 lentelė).
Gauta klasterinės analizės dendrograma pagal uogų augimo vietą (13 pav.). Duomenys padalyti į dvi grupes. Vienai grupei priskirta Aklasis eţeras ir Čepkelių raistas. Tai vietos, kurių uogose antocianų kiekis vyravo maţiausias. Kita grupe suskirstytas į du pogrupius. Pirmajam priklauso Kamanai, Labanoro giria, Vilkiaušio kaimas, Vosiliškio pelkė, antrajam – Dubičiai, Vaineţerio kaimas, Ţuvinto palios, Pagronyčio kaimas. Antrajam pogrupyje vyrauja didţiausias antocianų kiekis.
O pirmajam – kiek maţesnis, tačiau nepakankamas, jog pakliūtų į pirmąjį pogrupį.
13 pav. 2014 m. antocianų pasiskirstymo pagal augimo vietą dendrograma. 1 - Kamanai (Akmenės r.), 2 - Vosiliškių pelkė (Raseinių r.), 3 – Vilkiaušio kaimas (Joniškio r.), 4 - Labanoro
giria (Utenos r.), 5 - Dubičiai (Varėnos r.), 6 - Aklasis eţeras (Jonavos r), 7 - Čepkelių raistas (Varėnos r.), 8 - Vaineţerio kaimas (Lazdijų r.), 9 - Pagronyčio kaimas (Merkinė), 10 - Ţuvinto
palios (Alytaus r.).
Malvidinas – vyraujantis antocianidinas 2015 m. rinktose spanguolėse, kurio vidutiniškai nustatyta 46,350 µg/g. Didţiausia jo koncentracija spanguolėse iš Aklojo eţero (91,837±0,112 µg/g), o maţiausia iš Ţuvinto palių (15,412±0,007 µg/g). Peonidino uogose nustatyta maţiausiai, vidutinis kiekis – 0,763 µg/g. Daugiausiai peonidino rasta Vilkiaušio kaimo uogose (3,273±0,007 µg/g), o maţiausiai – Ţuvinto palių (0,281±0,020 µg/g). Cianidino ir delfinidino 2015 m. rinktose uogose rastas panašus kiekis. Vidutiniškai cianidino nustatyta 12,041 µg/g, o delfinidino 12,001 µg/g. Labanoro girioje ir Ţuvinto paliose surinktose uogose nenustatyta nei cianidino nei delfinidino, o Dubičiuose – cianidino. Cianidino ir delfinidino daugiausiai nustatyta Aklojo eţero uogose (cianidino – 24,040±0,006 µg/g, delfinidino – 27,664±0,021 µg/g). Ţuvinto paliose rinktuose mėginiuose vyrauja maţiausias visų antocianidinų kiekis (4 lentelė).
4 lentelė. Antocianidinų koncentracija (µg/g) spanguolių uogose, rinktose 2015 m.
skirtingose Lietuvos vietose.
Antocianidinas Rinkimo vieta
Koncentracija, µg/g
Cianidinas Delfinidinas Malvidinas Petunidinas Peonidinas Kamanai (Akmenės r.) 17,682±0,030 17,185±0,015 37,488±0,057 26,870±0,029 0,350±0,023 Pagronyčio kaimas (Merkinė) 16,037±0,036 12,856±0,077 81,707±0,022 38,571±0,054 0,401±0,014 Vaineţerio kaimas (Lazdijų r.) 18,040±0,008 16,496±0,008 67,166±0,037 29,368±0,012 0,478±0,013 Dubičiai (Varėnos r.) 0,000 13,444±0,017 21,117±0,072 14,627±1,171 0,291±0,005 Vilkiaušio kaimas (Joniškio r.) 15,834±0,034 19,610±0,018 47,964±0,069 35,408±0,015 3,273±0,007 Aklasis eţeras (Jonavos r.) 24,040±0,006 27,664±0,021 91,837±0,112 33,592±0,026 0,771±0,010 Čepkelių raistas (Varėnos r.) 10,699±0,021 2,625±0,027 15,883±0,048 19,177±0,034 0,405±0,025 Labanoro giria (Utenos r.) 0,000 0,000 37,274±0,028 34,567±0,039 0,694±0,007 Vosiliškių pelkė (Raseinių r.) 18,076±0,019 10,135±0,011 47,649±0,034 19,537±0,019 0,683±0,013 Ţuvinto palios (Alytaus r.) 0,000 0,000 15,412±0,007 0,654±0,010 0,281±0,020
Vidurkis 12,041 12,001 46,350 25,237 0,763
Sudaryta klasterinės analizės dendrograma, vaizduojanti antocianidinų pasiskirstymą spanguolėse pagal augimo vietą (14 pav.). Pirmajai grupei priklauso pavyzdţiai iš Pagronyčio kaimo, Vaineţerio kaimo, Aklojo eţero. Juose vyrauja didţiausias antocianidinų kiekis. Antra grupė padalyta į du pogrupius. Pirmajam priskirta pavyzdţiai, turintys maţiausią kiekį antocianidinų (Dubičiai, Čepkelių raistas, Ţuvinto palios). O antrajam priklauso analizės pavyzdţiai iš Kamanų, Vilkiaušio kaimo, Vosiliškių pelkės, kuriuose vyrauja taip pat didelis kiekis antocianidinų, tačiau nepakankamas ir nepatenka į pirmąją grupę (14 pav.).
14 pav. 2015 m. antocianų pasiskirstymo pagal augimo vietą dendrograma. 1 - Kamanai (Akmenės r.), 2 - Pagronyčio kaimas (Merkinė), 3 - Vaineţerio kaimas (Lazdijų r.), 4 - Dubičiai
(Varėnos r.), 5 - Vilkiaušio kaimas, (Joniškio r.), 6 - Aklasis eţeras (Jonavos r), 7 - Čepkelių raistas (Varėnos r.), 8 - Labanoro giria (Utenos r.), 9 - Vosiliškių pelkė (Raseinių r.), 10 -
Ţuvinto palios (Alytaus r.).
3.2.1. Cianidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Cianidino kiekis tirtuose pavyzdţiuose vyravo diapozone nuo 0,000 µg/g iki 28,704±0,095 µg/g. Ţuvinto paliose rinktose spanguolėse nustatytas didţiausias cianidino kiekio svyravimas per metus (2014 m. – 28,704±0,095 µg/g, o 2015 m. jo visai nenustatyta). Didelis skirtumas rastas Aklajame eţere rinktose spanguolėse, kur 2014 m. cianidino nenustatyta, o 2015 m. koncentracija siekia 24,040±0,006 µg/g. Vosiliškio pelkės spanguolėse cianidino koncentracija 2014 ir 2015 m.
skiriasi maţiausiai (skirtumas 2,085 µg/g). Nedidelis koncentracijų skirtumas yra Vaineţerio kaime (2014 m. – 21,620±0,043 µg/g, 2015 m. – 18,040±0,008 µg/g) ir Kamanuose (2014 m. – 12,955±0,037 µg/g, 2015 m. – 17,682±0,030 µg/g) (15 pav.).
15 pav. Cianidino koncentracija spanguolėse 2014 ir 2015 m.
Įvertinus cianidino koncentracijų priklausomybę nuo uogų rinkimo metų, svyravimai buvo statistiškai reikšmingi (p<0,05).
Apibendrinant cianidino koncentracijų skirtumus 2014 ir 2015 m., matoma, kad cianidino kiekis labiausiai skiriasi Ţuvinto paliose ir Aklajame eţere rinktuose pavyzdţiuose. Maţiausias skirtumas nustatytas Vosiliškių pelkėje. Uţsienyje anksčiau atliktuose tyrimuose cianidino koncentracija nustatyta 283,9 µg/g, tai beveik 20 kartų daugiau, nei Lietuvoje rinktose spanguolių uogose [41].
3.2.2. Delfinidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Nustačius delfinidino kiekį tirtose uogose, matoma, kad kiekis vyrauja nuo 0,00 µg/g iki 27,664±0,021 µg/g (16 pav.). Aklajame eţere surinktose spanguolėse didţiausias delfinidino koncentracijų skirtumas 2014 ir 2015 m. (2014 m. nenustatyta delfinidino, o 2015 m. koncentracija siekia 27,664±0,021 µg/g). Delfinidino koncentracijos nustatytos Aklojo eţero uogose yra didţiausios abejuose metuose. Ţuvinto palių uogose nustatytas ţenklus delfinidino kiekio skirtumas. Atvirkščiai nei Aklajame eţere, Ţuvinto paliose rinktose uogose 2014 m. buvo nustatyta 23,422±0,116 µg/g, o 2015 m. visai nerasta. Maţiausias delfinidino kiekis tiek 2014 m., tiek 2015 m. yra spanguolėse iš Čepkelių raisto. Maţiausias koncentracijų skirtumas nustatytas Dubičiuose rinktose uogose (2015 m.
delfinidino nustatyta 2,463 µg/g daugiau nei 2014 m.) (16 pav.).
0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 35,000
Cianidino koncentracija, µg/g
2014m.
2015m.
16 pav. Delfinidino koncentracija spanguolėse 2014 ir 2015 m.
Įvertinus delfinidino koncentracijų priklausomybę nuo uogų rinkimo metų, svyravimai buvo statistiškai reikšmingi (p<0,05).
Nustačius delfinidino koncentracijas 2014 ir 2015 m. rinktose uogose, pastebėta, kad didţiausias koncentracijos skirtumas nustatytas Aklajame eţere rinktoms ţaliavoms. Maţiausias kiekio skirtumas nustatytas Dubičiuose surinktose uogose.
3.2.3. Malvidino kiekio nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu
Analizuotuose moksliniuose straipsniuose malvidino koncentracija buvo nenustatinėjama. O nustatinėjant ESC metodu šiame darbe visuose tirtuose mėginiuose buvo nustatytas malvidinas, kurio vidutinė koncentracija lyginant su kitais antocianidinais yra didţiausia.
Malvidino kiekis įvairavo nuo 15,412±0,007 µg/g iki 114,644±0,026 µg/g. Malvidino didţiausias kiekis yra 2014 m. Ţuvinto palių spanguolėse (114,644±0,026 µg/g), o 2015 m. čia nustatytas maţiausias (15,412±0,007 µg/g). Malvidino koncentracija Ţuvinto paliose 2014 m. didesnė 7,44 karto uţ koncentraciją, nustatytą 2015 m. Dubičiuose rinktose spanguolėse nustatytas ryškus malvidino skirtumas tarp 2014 ir 2015 m. uogų. 2014 m. rasta 106,347±0,015 µg/g, o 2015 m. – 21,117±0,072 µg/g. Iš visų vietų surinktos spanguolės 2014 m. pasiţymi didesniu kiekiu malvidino nei 2015 m. Pagronyčio kaime tiek 2014 m., tiek 2015m. rinktose uogose malvidino koncentracijos skiriasi maţiausiai (atitinkamai 95,628±0,098 ir 81,707±0,022 µg/g). Tik Aklajame eţere rinktos spanguolės turi didesnę malvidino koncentracija 2015 m. (2014 m. – 54,869±0,053 µg/g, 2015 m. – 91,837±0,112 µg/g) (17 pav.).
0,000 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000
Delfinidino koncentracija, µg/g
2014m.
2015m.
