LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS
Kastytis Šidlauskas
5-hidroksi-1,4-naftalendiono priešvėžinis poveikis gliomos ląstelėms in vitro Magistro baigiamasis darbas
Medicinos studijų programa, valstybinis kodas 601A30002
Darbo vadovas dr. Julius Liobikas
KAUNAS 2017
TURINYS
1. SANTRAUKA ... 4
2. PADĖKA ... 6
3. INTERESŲ KONFLIKTAS ... 6
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 6
5. SANTRUMPOS ... 7
6. SĄVOKOS ... 8
7. ĮVADAS ... 9
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
9. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
9.1. Gliomų klasifikacija ... 11
9.2. Naftochinonai ir jų biologinis poveikis ... 12
9.3. Auglių energijos metabolizmas ... 13
9.4. C6 gliomos ląstelės - glioblastomos in vitro modelinė sistemą ... 14
10. TYRIMO METODAI IR METODIKA ... 15
10.1. Reagentai ir cheminės medžiagos ... 15
10.2. Ląstelių kultivavimas in vitro ... 15
10.3. Dvigubo dažymo metodas ... 15
10.4. Ląstelių proliferacijos metodas ... 15
10.5. Ląstelės ciklo nustatymas ... 16
10.6. Deguonies sunaudojimo greičio nustatymas ... 16
10.7. Superoksido anijonradikalų lygio nustatymas ... 16
10.8. Vandenilio peroksido nustatymas ... 17
10.9. Statistiniai metodai ... 17
11. REZULTATAI ... 18
11.1. Juglono poveikis C6 gliomos ląstelių proliferacijai ir ląstelės ciklui. ... 18
11.2. Juglono poveikis deguonies sunaudojimo greičiams permeabilizuotose C6 gliomos ląstelėse. ... 19
11.3. I kvėpavimo grandinės komplekso reikšmė juglonui generuojant ROS gliomos ląstelėse. 19 11.4. I kvėpavimo grandinės komplekso slopinimas sumažina priešvėžines juglono savybes. ... 20
12. REZULTATŲ APTARIMAS ... 22
13. IŠVADOS ... 26
14. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 27
15. PRIEDAI ... 32
1. SANTRAUKA
Kastytis Šidlauskas. Magistro baigiamasis darbas - ,,5-hidroksi-1,4-naftalendiono priešvėžinis poveikis gliomos ląstelėms in vitro”.
Darbo tikslas yra ištirti priešvėžinio 5-hidroksi-1,4-naftalendiono (juglono) poveikio mechanizmą sukultūrintose gliomos ląstelėse.
Darbo uždaviniai: įvertinti juglono sukeltą C6 gliomos ląstelių žūties tipą bei antiproliferacinį poveikį; nustatyti juglono poveikį C6 gliomos ląstelių ciklui tėkmės citometrija;
įvertinti juglono poveikį gliomos ląstelių mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai; nustatyti aktyvių deguonies formų (ROS) generaciją juglonu paveiktose C6 gliomos ląstelėse; nustatyti pirmojo mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso reikšmę juglono sukeltai ROS generacijai gliomos ląstelėse ir šio komplekso svarbą juglono priešvėžiniam poveikiui pasireikšti.
Metodika: C6 gliomos ląstelės buvo naudotos kaip in vitro glioblastomos modelis. Ląstelių gyvybingumas buvo vertinamas jas nudažant propidžio jodidu ir Hoechst 33342. Proliferacija vertinta pagal ląstelių skaičių šulinėliuose. Ląstelės ciklo analizė buvo atlikta su propidžio jodidu nudažytais branduoliais, juos vertinant tekmės citometru. Permeabilizuotų ląstelių mitochondrijų deguonies sunaudojimo greičiai buvo matuojami, naudojant respirometrą. Viduląstelinis ROS lygis buvo matuojamas fluorimetru, prieš tai ląsteles nudažius Ampliflu™ ar MitoSox Red™.
Rezultatai: Juglonas sukėlė C6 gliomų ląstelių žūtį nekrozės būdu, jas veikiant 16 µM ir didesnėmis koncentracijomis, inkubuojant 24 val. Veikiant mažesnėmis koncentracijomis (4 – 8 µM), juglonas pasižymėjo antiproliferaciniu ir ląstelės ciklą slopinančiu poveikiais, kai sumažėja ląstelių dalis G2/M fazėse ir padidėja - G1/G0. Juglonas sumažino permeabilizuotų gliomos ląstelių mitochondrijų deguonies sunaudojimo greičius su skyrikliu 2,4-dinitrofenoliu (DNF), esant malato ir glutamato, bei II ir III metabolinėse būsenose, ir padidino viduląstelinių ROS lygį. Juglono indukuota ROS generacija ir juglono antiproliferacinis bei citotoksinis poveikis sumažinami, naudojant I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso konkurencinį slopiklį amitalį.
Išvados: Juglonas sukelia C6 gliomos ląstelių žūtį nekrozės būdu ir pasižymi antiproliferaciniu poveikiu. Veikiant C6 gliomos ląsteles juglonu, ląstelių ciklas sutrikdomas, sumažėjus ląstelių proporcijai G2/M fazėse ir padidėjus G1/G0 stadijose. Juglonas sumažina mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitį C6 gliomos ląstelėse II-oje ir III-oje metabolinėse būsenose, naudojant I kvėpavimo grandinės komplekso substratus glutamatą ir malatą. Juglonas skatina ROS – vandenilio peroksido ir superoksido anijonradikalų – susidarymą C6 gliomos ląstelėse.
ROS susidarymas, nulemtas I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso, iš dalies sąlygoja juglono citotoksines ir antiproliferacines savybes C6 gliomos ląstelėse.
SUMMARY
Kastytis Šidlauskas. MSc thesis – “The anticancer effect of 5-hydroxy-1,4-naphthalendione on glioma cells in vitro”.
The aim of the study is to identify the mechanism of anticancer effect 5-hydroxy-1,4- naphthalendione (juglone) on cultured glioma cells.
Objectives: identify the type of cell death induced by juglone and the antiproliferative effect of juglone on C6 glioma cells; determine the effect of juglone on the cell cycle of C6 glioma cells;
identify the effect of juglone on oxidative phosphorylation system; evaluate generation of reactive oxygen species (ROS) in juglone-affected C6 glioma cells; identify the role of the mitochondrial complex I in juglone-induced ROS generation and in determining anticancer effects of juglone.
Methods: C6 glioma cells were used as an in vitro glioblastoma model. Cell viability was evaluated by propidium iodide and Hoechst 33342 staining. Cell proliferation was assessed by counting the cells in the wells. Cell cycle analysis was performed by counting propidium iodide- stained nuclei by a cytometer. Oxygen consumption rates in permeabilised cells were determined by a respirometer. Florimeter was used to assess generation of intracellular ROS after staining cells with Ampliflu™ ar MitoSox Red™.
Results: Juglone induced necrotic cell death in C6 glioma culture by treating the cells with juglone of 16 µM and higher concentrations for 24 hours. Using lower concentration range (4 – 8 µM), juglone showed proliferation inhibiting and cell cycle arresting properties when a proportion of cells in G2/M phase decreased and in G1/G0 increased. Juglone decreased oxygen consumption rate with 2,4-dinitrophenol in the presence of malate and glutamate as well as in metabolic states II and III. The inhibition of respiratory complex I by a competative inhibitor amytal decreased juglone- triggered generation of ROS and diminished juglone’s antiproliferative and cytotoxic activity.
Conclusions: juglone induces necrotic cell death in C6 glioma culture and inhibits cell proliferation. Cell cycle arrest is induced by juglone by decreasing the proportion of cells in G2/M phase decreased in expense of G1/G0 cells. Juglone decreases oxygen consumption of glioma cells in glutamate/malate-induced mitochondrial respiration in states II and III. ROS generation of hydrogen peroxide and superoxide anionradical is induced by juglone in glioma C6 cells. The respiratory complex I contributes to the generation of ROS in juglone-treated glioma C6 cells and partially determines the antiproliferative and cytoxic effects of juglone.
2. PADĖKA
Norėčiau padėkoti dr. Juliui Liobikui už kontrybę, pastabas bei patarimus. Taip pat esu dėkingas visam Neuromokslų Instituto kolektyvui, kuris dalinosi savo patirtimi. Esu dėkingas Saimonui Raudoniui bei Gintarei Stanaitytei už pagalbą laboratorijoje. Ypatingai dėkingas esu Rūtai Šidlauskienei už palaikymą ir paramą bei Elzei Šidlauskaitei, kuri įprasmino visus nuveiktus darbus.
3. INTERESŲ KONFLIKTAS
Autoriui interesų konflikto nebuvo.
4. ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS
Etikos komiteto leidimas šiam darbui nebuvo reikalingas.
5. SANTRUMPOS
ADP – adenozino 5‘-difosfatas ATP – adenozino 5‘-trifosfatas CNS – centrinė nervų sistema
DMEM – Dulbecco modifikuota Eagle terpė (angl. Dulbecco’s modified Eagle’s medium) DMSO – dimetilsulfoksidas
DNF – 2,4-dinitrofenolis DNR – deoksiribonukleorūgštis EPG – elektronų pernašos grandinė
FAD – flavino adenino dinukleotidas (oksiduotas) FADH2 – flavino adenino dinukleotidas (redukuotas)
FDT – fosfatinis druskų tirpalas (angl. phosphate buffer saline) FJS – fetalinis jaučio serumas (angl. fetal bovine serum)
NAC – N-acetilcisteinas
NAD+ - nikotinamido adenino dinukleotidas (oksiduotas) NADH – nikotinamido adenino dinukleotidas (redukuotas) RNR – ribonukleorūgštis
ROS – aktyvios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) SOD – superoksido dismutazė
SVP – standartinė vidurkio paklaida (angl. standard error of mean) PI – propidžio jodidas
UV – ultravioletiniai spinduliai.
6. SĄVOKOS
Specifinės retai naudojamos sąvokos šiame darbe nenaudojamos.
7. ĮVADAS
Pacientų, diagnozuotų su vienu iš dažniausiai pasitaikančių smegenų auglių – aukšto laipsnio glioma - vidutinis išgyvenamumas yra mažesnis nei pusantrų metų. Šis susirgimas ne tik reikšmingai sutrumpina gyvenimo trukmę, bet ir itin pablogina gyvenimo kokybę. Šiuo metu taikoma gliomų chemoterapija bei radioterapija yra menkai veiksmingos. Taip pat gliomų atsinaujinimas bei atsparumas chemoterapijai yra dažni reiškiniai (1, 2). Visa tai lemia, kad naujų medžiagų bei metodų paieška gliomų prevencijai ir gydymui yra ypač aktuali.
Neseniai buvo nustatyta, kad juglonas slopina gliomos ląstelių proliferaciją, invaziją bei migraciją, o didesnėmis koncentracijomis sukelia ląstelių žūtį. Juglono priešvėžinis poveikis siejamas su padidėjusiu viduląstelinių aktyvių deguonies formų (ROS) susidarymu (3, 4). Vis dėlto, šio junginio priešvėžinio poveikio mechanizmo detalės išlieka neaiškios.
Vis daugėja įrodymų, kad vėžinių ląstelių metabolizmo perprogramavimas yra vienas iš svarbiausių piktybinių susirgimų požymių (5). Glikolizė yra stipriai išreikšta ir atskirta nuo oksidacinio fosforilinimo vėžinėse ląstelėse, lyginant su sveiko (nevėžinio) audinio ląstelėmis. Yra įrodymų, kad oksidacinio fosforilinimo aktyvumo pokyčiai lemia vėžinių ląstelių gyvybingumo bei metastazavimo slopinimą (6). Be to, mitochondrijų elektronų pernašos grandinės aktyvumo pokyčiai lemia ir viduląstelinių ROS lygio padidėjimą (7). Kadangi juglonas padidina ROS lygį gliomos ir kitose ląstelėse, šiame darbe buvo iškelta hipotezė, kad juglono sukelta ROS gamyba gali būti susijusi su elektronų pernašos grandinės veikla mitochondrijose. Todėl buvo įdiegta metodika, leidžianti įvertinti oksidacinio fosforilinimo sistemos komponentų aktyvumą permeabilizuotose gliomos ląstelėse, nustatant mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitį skirtingose metabolinėse būsenose (8). Remiantis gautais duomenimis, buvo ieškoma ryšio tarp juglono sukeltos ROS generacijos, nulemtos elektronų pernašos grandinės, ir juglono priešvėžinio poveikio.
Šie tyrimai gali būti svarbus pagrindas tęsti in vivo tyrimus su juglonu, kaip priešvėžiniu junginiu.
Šio darbo fomuluojamas tikslas yra ištirti juglono poveikio mechanizmą sukultūrintose gliomos ląstelėse.
8. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas:
Ištirti priešvėžinio juglono poveikio mechanizmą sukultūrintose gliomos ląstelėse.
Uždaviniai:
1. Įvertinti juglono sukeltą C6 gliomos ląstelių žūties tipą bei antiproliferacinį poveikį.
2. Nustatyti juglono poveikį C6 gliomos ląstelių ciklui tėkmės citometrija.
3. Įvertinti juglono poveikį gliomos ląstelių mitochondrijų oksidacinio fosforilinimo sistemai.
4. Nustatyti vandenilio peroksido ir superoksido generaciją juglonu paveiktose C6 gliomos ląstelėse.
5. Nustatyti pirmojo mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso reikšmę juglono sukeltai ROS generacijai gliomos ląstelėse ir šio komplekso svarbą juglono priešvėžiniam poveikiui pasireikšti.
9. LITERATŪROS APŽVALGA
9.1. Gliomų klasifikacija
Centrinės nervų sistemos (CNS) navikai yra reti, palyginus su kitais onkologiniais susirgimais, tačiau jie itin reikšmingai sumažina gyvenimo kokybę ir lemia trumpą pacientų išgyvenamumu (2, 9, 10).
CNS navikai yra klasifikuojami pagal Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) pasiūlytą klasifikacijos sistemą, kuri nuolat atnaujinama ir kurios pagrindas yra histopatologinis naviko vaizdas. Išskiriamos šios nervų sistemos navikų grupės: galvos ir nugaros nervų, smegenų dangalų navikai, limfomos, hematopoetiniai, turkiškojo balno, metastaziniai ir neuroepiteliniai navikai (10, 11). Dažniausiai pasireiškianti CNS navikų grupė yra gliomos. Šie navikai priklauso neuroektoderminių auglių grupei ir histologiškai yra panašūs į CNS glijos ląsteles, ir pagal tai jie yra skirstomi į astrocitomas, oligodendrogliomas, oligoastrocitomas ir ependimomas. PSO siūlo gliomas skirstyti į I, II, III ir IV laipsnius, kurie koreliuoja su pacientų išgyvenamumu.
Histologiniai radiniai, kuriais remiantis gliomos priskiriamos tam tikram laipsniui, yra padidėjęs ląstelių tankis, ląstelės branduolių netipiška forma, mikrokraujagyslių endotelio proliferacija, mitozių skaičius bei nekrozės. Kuo daugiau šių minėtų radinių yra auglio histologiniame vaizde, tuo aukštesnio laipsnio auglys (10, 11).
Pacientų, sergančių dažniausiu gliomos tipu – glioblastoma – išgyvenamumo mediana yra apie 12 mėnesių, nepaisant radikalaus chirurginio gydymo ir taikomos chemo- ir radioterapijų (1, 2). Didžioji dalis pacientų miršta po dviejų metų po diagnozės nustatymo. Šios ligos dažnumas yra 35 nauji atvejai 1 000 000 gyventojų per metus (JAV). Histologiškai glioblastomos yra itin heterogeniškos ir dėl šios sandaros sudėtingumo yra labai sunku suprasti šių auglių patobiologiją (1, 9, 12).
II, III ir IV laipsnio gliomos ląstelės pasižymi infiltracinio pobūdžio augimu į smegenų parenchimą. Tai nulemia, kad visiška auglio chirurginė rezekcija nėra galima dėl funkciškai svarbių auglį supančių audinių ir todėl recidyvų atvejai yra dažni. Šiuo metu efektyviausias chemoterapinis vaistas naudojamas glioblastomų gydymui yra temozolomidas. Vis dėlto, jo efektyvumas yra ribotas, nes pacientų išgyvenamumą jis padidina tik keliais mėnesiais (1). Dar svarbiau yra tai, kad recidyvavę augliai dažnai tampa atsparūs šiam preparatui (10, 13, 14).
Nepaisant intensyvių tyrimų, visi neseniai atlikti klinikiniai bandymai su naujais preparatais buvo nesėkmingi, nes nė vienas iš jų neprailgino pacientų išgyvenamumo, lyginant su temozolomidu (15, 16). Taigi, yra didžiulis poreikis surasti veiksmingus vaistinius preparatus gliomų gydymui.
9.2. Naftochinonai ir jų biologinis poveikis
Juglonas (1 pav.) yra vienas iš natūralių naftochinonų junginių, pagal IUPAC nomenklatūrą vadinamas 5-hidroksi-1,4-naftalendionu. Šis junginys yra randamas Juglandaceae šeimos augaluose, iš kurių pagrindiniai juglono šaltiniai yra šios šeimos atstovai - juodojo riešutmedžio (Juglans nigra L.), Mandžiūrijos riešutmedžio (Juglans mandshurica Maxim.), graikinio riešutmedžio (Juglans regia L.) ir pilkojo riešutmedžio (Juglans cinerea L.) medžių lapai, vaisiai ir jų lukštai (17).
Juglonas yra antrinis metabolitas, turintis neigiamą alelopatinį aktyvumą, kuris augalui yra naudingas konkurencijos atžvilgiu: jį išskirdamas į aplinką žalingai veikia šalia esančius augalus, keisdamas jų fotosintezės procesus ir mitochondrijų funkcijas (18).
Naftochinonai pasižymi daugeliu farmakologinių savybių, įskaitant antibakterinį ir antihelmintinį poveikį (19-21). Priešvėžinis juglono poveikis neseniai buvo aprašytas, naudojant keletą skirtingų auglių modelinių sistemų in vitro ir in vivo, įskaitant melanomą, plaučių, skrandžio ir žarnyno auglius (22-24). Hidrofobinės juglono savybės gali lemti junginio gebėjimą pereiti smegenų–kraujo barjerą ir pasiekti auglio vėžines ląsteles, tačiau tyrimų su juglono biopasisavinimu nerviniame audinyje dar nėra atlikta. Yra žinoma/nustatyta, kad juglonas gali sukelti gliomos ląstelių žūtį, sumažinti proliferaciją ir invaziškumą, veikiant mažomis, fiziologiškai pasiekiamomis koncentracijomis (3). Vis dėlto, šio preparato veikimo mechanizmas dar nėra iki galo išaiškintas.
Atliktos studijos parodė, kad juglonas skatina susidaryti viduląstelines ROS, tačiau padidėjusio ROS lygio reikšmė, nulemianti juglono priešvėžines savybes, išlieka neaiški (3, 25).
Žinoma, kad perteklinė ROS gamyba ląstelėse gali sukelti DNR, baltymų ir lipidų pažaidas, lemiančias ląstelių žūtį (26). Redokso būsenos pakitimas taip pat sukelia signalinių kelių pokyčius, kontroliuojančius ląstelės ciklą, proliferaciją, išgyvenamumą, diferenciaciją ir apoptozę (27). Auglių ląstelės yra jautresnės padidėjusiam ROS lygiui ir todėl prooksidantinės juglono
O
OH O
O
O C O
H
3C O H
3CH
3CH
3H
6-10
A B
savybės galėtų būti panaudotos vėžinių ląstelių įjautrinimui, taikant chemoterapiją (28).
Kiti atlikti tyrimai rodo, kad naftochinonai gali sąveikauti su mitochondrijų elektronų pernašos sistema (29-32). Todėl galima manyti, kad juglonas galėtų veikti vėžinių ląstelių metabolizmą ir pakeisti piktybines auglių savybes. Šį teiginį paremia Saling ir bendraautorių atlikti tyrimai, rodantys, kad juglonas slopina mitochondrijų kvėpavimą ir ATP sintezę izoliuotose kepenų mitochondrijose (33). Naftochinonai, panašūs savo struktūra į jugloną, keičia deguonies sunaudojimo greičius skirtingose Trypanosoma cruzi Chagas. formose (34). Vis dėlto, studijų, kuriose būtų nagrinėjamas juglono poveikis vėžinių ląstelių oksidacinio fosforilinimo sistemai, iki šiol nebuvo atlikta.
9.3. Auglių energijos metabolizmas
Energijos metabolizmo perprogramavimas yra vienas iš svarbiausių vėžinių susirgimų požymių, leidžiančių auglių ląstelėms prisitaikyti prie nekontroliuojamos proliferacijos (5).
Neproliferuojančių ląstelių energija yra išlaisvinama katabolinių reakcijų metu, įskaitant glikolizę, riebalų rūgščių oksidaciją ir Krebso ciklą, ir yra verčiama į redukuotų kofermentų nikotinamido adenino dinukleotido (NADH) ir flavino adenino dinukleotido formą (FADH2).
Elektronai yra pernešami nuo NADH ir FADH2 molekuliniam deguoniui per elektronų pernašos grandinę, susidedančią iš I-IV kompleksų. Išlaisvinta energija naudojama sukurti elektrocheminį vandenilio jonų gradientą ant vidinės mitochondrijų membranos. Paskutinio oksidacinio fosforilinimo etapo metu protonų srautas pagal gradientą yra naudojamas ATP sintezei. Deguonis yra galutinis elektronų akceptorius kvėpavimo grandinėje. Vis dėlto, esant anaerobinėms sąlygoms, sveikose ląstelėse vyksta glikolizė ir kvėpavimas mitochondrijose yra slopinamas.
Otto Warburg pirmasis apibūdino energijos metabolizmo pasikeitimą vėžinėse ląstelėse:
netgi esant aerobinėms sąlygoms, auglių ląstelės vykdo intensyviau glikolizę negu oksidacinį fosforilinimą (procesas, kuris vadinamas anerobine glikolize) (35). Taigi daugelyje auglių Krebso ciklas ir oksidacinis fosforilinimas yra slopinamas (36). Suintensivėjusi glikolizė leidžia greitai besidauginančioms ląstelėms apsirūpinti užtektinu kieku cheminių pirmtakų įvairiems biosintetiniams keliams gaminti nukleotidus, amino rūgštis ir makromolekules, reikalingas naujoms ląstelėms susidaryti (37).
Nors oksidacinis metabolizmas yra slopinamas, oksidacinio fosforilinimo reikšmė vėžinėse ląstelėse neturėtų būti nuvertinta. Santidrian ir bendraautoriai parodė, kad NADH:ubichinono oksidoreduktazės (I mitochondrijų komplekso) aktyvumas nulemia krūties karcinomos ląstelių agresyvų fenotipą, reguliuojant NAD+/NADH oksidacinę-redukcinę pusiausvyrą, žinduolių rapamicino taikinio komplekso 1 (angl. mammalian target of rapamycin complex 1) aktyvumą ir autofagiją (6). Žinios apie metabolinių kelių pakitimus vėžinėse ląstelėse
leido sukurti vaistus, tiesiogiai veikiančius energijos metabolizmą; keletas iš jų yra klinikinėse fazėse (38).
Egzistuoja ryšys tarp ROS gamybos ir energijos metabolizmo: mitochondrijų kvėpavimo grandinės I-III kompleksai, manoma, yra pagrindinis ROS šaltinis ląstelėje. Šių kompleksų slopinimas ar jų pažeidimas gali padidinti ROS gamybą ir sukelti ląstelių pažeidimus bei žūtį (7).
9.4. C6 gliomos ląstelės - glioblastomos in vitro modelinė sistema
C6 gliomos ląstelės yra dažnai naudojamos kaip glioblastomos modelis, nes jos turi tuos pačius biožymenis kaip ir glioblastomos ląstelės: glijos fibrilinį rūgštujį baltymą (angl. glial fibrillary acidic protein), PDGFβ (angl. platelet-derived growth factor β), IGF-1 (angl. insulin- like growth factor 1) ir EGFR (angl. epidermal growth factor receptor) (39). Dalis C6 ląstelių kultūroje turi kamienių ląstelių savybių, nustatant CD133 ir nestino raišką (40). Manoma, kad vėžinės kamieninės ląstelės nulemia auglio recidyvumą bei atsparumą radio- bei chemoterapijai (41).
10. TYRIMO METODAI IR METODIKA
10.1. Reagentai ir cheminės medžiagos
Juglonas (>97% grynumo) buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), ištirpintas 70% (v/v) etanolyje ir laikytas kaip motininis tirpalas -20ºC. Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM) + GlutaMax™ bei penicilino/streptomicino tirpalas buvo įsigyti iš Gibco; Ampliflu™, Tripsinas/EDTA, poli-L-lizinas, fetalinis jaučio serumas (FJS) ir RNazė A buvo iš Sigma-Aldrich;
MitoSox™ Red ir MitoTracker® Green iš Invitrogen. Visos kitos naudotos cheminės medžiagos buvo pirktos analizinės kokybės iš komercinių šaltinių.
10.2. Ląstelių kultivavimas in vitro
C6 gliomos ląstelės įsigytos iš ,,Cell Lines Service GmbH” (Vokietija). Ląstelės kultivuotos mitybinėje terpėje, turinčioje DMEM + GlutaMAX™ papildyta 10% FJS ir 1%
penicilino/streptomicino tirpalu drėkinamame 5% CO2 ląstelių inkubatoriuje, palaikant 37°C temperatūrą.
10.3. Ląstelių dvigubo dažymo metodas
Hoechst 33342 ir propidžio jodidas (PI) buvo naudojami atpažinti žuvusias ląsteles ir atskirtį žūties tipą – nekrozę nuo apoptozės. Hoechst 33342 turi hidrofobinių savybių ir todėl gali pereiti per ląstelių membranas. Šis dažas ląstelių branduoliuose jungiasi su DNR ir susidaręs kompleksas švyti mėlyna spalva, apšvietus ultravioletiniais spinduliais (UV). Vykstant apoptozei, ląstelių branduoliai tampa kondensuoti ir fragmentuoti, todėl esant Hoechst 33342, branduoliai švyti ryškiai mėlyna spalva. PI negali pereiti ląstelės membranų ir todėl patenka į ląsteles tik vykstant nekrozei – suirus membranų vientisumui. Patekęs į ląsteles PI jungiasi su RNR ir DNR, ir susidarę kompleksai švyti raudonai, ląsteles apšvietus UV.
Ląstelių vienasluoksnis buvo veikiamas juglonu (koncentracijos nurodytos atitinkamuose paveikslėliuose žemiau), amitaliu (1,2 mM) ir N-acetilcisteinu (NAC, 5 mM). Po inkubacijos, Hoechst 33342 ir PI buvo naudojami nudažyti ląsteles (galutinės koncentracijos po 1,2 µM). Ląstelės buvo skaičiuojamos, naudojant OLYMPUS IX71S1F-3 fluorescencinį mikroskopą.
10.4. Ląstelių proliferacijos metodas
C6 gliomos ląstelės pasėtos 96 šulinėlių lėkštelėse 700 ląstelių šulinėlyje ir paliktos 24 valandoms aklimatizuotis. Po to ląstelės buvo veikiamos juglonu (koncentracijos nurodytos atitinkamuose paveikslėliuose žemiau), amitaliu (1,2 mM) ir N-acetilcisteinu (NAC, 5 mM).
Ląstelės buvo fotografuojamos šviesiniu mikroskopu po 3 dienų ir visos ląstelės šulinėlyje suskaičiuotos, naudojant Image J programą.
10.5. Ląstelės ciklo nustatymas
Mitybinė C6 ląstelių terpė buvo pašalinta, ląstelės perplautos su fosfatiniu druskų tirpalu (FDT), tripsinizuotos, centrifuguotos 300 ´ g 5 min. ir po to dukart perplautos su FDT. Ląstelės fiksuotos, naudojant šaltą 70% etanolio tirpalą. Fiksuotos ląstelės buvo laikomos 4°C iki dviejų savaičių. Tuomet ląstelės buvo sušildytos iki kambario temperatūros, nucentrifuguotos 450 ´ g 5 min., perplautos dukart su FDT, nudažytos su PI, turinčio 50 µg/ml RNazės A, ir inkubuotos tamsoje 15 min. Ląstelių branduolių DNR buvo analizuojama su tekmės citometru (Accuri C6™, Guava).
10.6. Mitochondrijų deguonies sunaudojimo greičio nustatymas
C6 gliomos ląstelių mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitis buvo matuojamas, naudojant Oksigrafą-2k (Oroboros®, Austrija) 37°C temperatūroje. C6 ląstelės tripsinizuotos, 5 min.
centrifuguotos 1500 apsisukimų/min., dukart perplautos su FDT ir praskiestos pašildytoje kvėpavimo terpėje (110 mM KCl, 2,24 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 5 mM KH2PO4, pH = 7,2, 37°C temperatūra), naudojant 2 ´ 106 ląstelių/ml. Oksigrafas sukalibruotas su natrio tiosulfatu. Bazinis deguonies sunaudojimo greitis buvo nustatytas oksigrafo kiuvetėje esant nepermeabilizuotoms ląstelėms. Tolimesnė analizė buvo atlikta su permeabilizuotomis ląstelėmis, pridėjus 10 µg/ml digitonino. Atskirta būsena buvo pasiekta pridėjus 2,4-dinitrofenolio (DNF). Antra metabolinė būsena buvo registruojama, naudojant 1 mM gutamatą su 0,5 mM malatu; trečia metabolinė būsena – papildomai pridėjus 0,4 mM ADP. Juglonas (1-8 µM) buvo tiesiagiai sušvirkščiamas į kvėpavimo terpę su ląstelėmis. Ląstelių mitochondrijų deguonies sunaudojimo greičiai buvo vertinti po 6 valandų ląstelių inkubacijos su necitotoksine 8 µM juglono koncentracija. Rezultatai išreiškšti pmol/O/min./2´106 ląstelių.
10.7. Superoksido anijonradikalų lygio nustatymas
MitoSox™ Red ištirpintas dimetilsulfokside (DMSO) buvo naudojamas neviršijant 0,2 µM koncentracijos, kad būtų išvengta signalo persotinimo. Motininis MitoTracker® Green tirpalas buvo paruoštas su DMSO ir naudojamas 0,5 µM koncentracija. C6 gliomos ląstelės buvo inkubuotos su juglonu 30 min. MitoSox™ Red ir MitoTracker® Green praskiesti HBSS tirpalu ir laikyti 10 min.
37°C temperatūroje. Tuomet ląstelės buvo perplautos 3 kartus pašildytu HBSS. Ląstelės buvo fotografuojamos, nuodojant OLYMPUS IX71S1F-3 fluorescencinį mikroskopą, o duomenys analizuojami Image J programa. Nuotraukos buvo apdorojamos ir analizuojamos pagal (42).
Rezultatai pateikti kaip santykis tarp MitoSox™ Red fluorescencijos intensyvumų, inkubuojant ląsteles su juglonu ir kontrolinių (tirpiklio) ląstelių.
10.8. Vandenilio peroksido nustatymas
Reakcijos atliktos matavimo buferyje (120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 5 mM MgCl2, pH 7,4) 37°C temperatūroje. Buferis buvo papildytas krienų perokside (20 U/ml), superoksido dismutaze (35 U/ml) ir Amplifluä (1 µM). Reakcija pradėta pridėjus C6 ląstelių suspensiją (5 ´ 106 ląstelių/ml). Amplifluä oksidacija buvo registruojama su fluorometru (Ascent Fluoroskan, Thermo Fisher Scientific) su λex = 544 nm ir λem = 590 nm. Ląstelės permeabilizuotos su 5 µM digitoninu. Naudoti substratai ir slopikliai glutamatas (1 mM), malatas (1 mM), juglonas (8 µM ir 32 µM) ir/ar amitalis (1,2 mM). Eksperimentai matavimo buferyje be ląstelių atlikti su juglonu (8 µM ir 32 µM) ir/ar amitaliu (1,2 mM). Duomenys pateikti kaip santykis tarp vandenilio peroksido susidarymo kontrolinėse ląstelėse ir ląstelėse paveiktose juglonu ir/ar amitaliu.
10.9. Statistiniai metodai
Statistinė analizė atlikta iš 3-8 atskirų eksperimentų. Visi rezultatai pateikti kaip vidurkis ± standartinė vidurkio paklaida (SVP). Stjudento t-testas ir vienkryptė ANOVA atlikti rezultatams palyginti su GraphPad Prism® 5 ir Microsoft® Excel for Mac 2015. Pasikliautinis lygmuo p < 0,05 laikytas kaip statistiškai reikšmingas.
11. REZULTATAI
11.1. Juglono poveikis C6 gliomos ląstelių proliferacijai ir ląstelės ciklui.
Juglonas sukelia C6 gliomos ląstelių žūtį, esant ³16 µM, priklausomai nuo koncentracijos (2 pav. A). Nekrozė yra pagrindinis ląstelės žūties tipas, o apoptozė sudaro žymiai mažesnę dalį (2 pav.
A ir B). Mažesnėmis koncentracijomis nei 16 µM, juglonas neveikia citotoksiškai, bet efektyviai slopina ląstelių proliferaciją (2 pav. C). Šį faktą patvirtina ir ląstelių ciklo analizė, nudažant ląstelių branduolius PI ir suskaičiuojant juos tekmės citometru: 8 µM juglono koncentracija sumažina ląstelių dalį, esančią G2/M fazėje ir padidina G0/G1 (2 pav. D ir E). Taigi didesnėmis koncentracijomis juglonas veikia citotoksiškai, o mažesnėmis – pasižymi proliferaciją slopinančiu poveikiu.
2 pav. Juglonas slopina C6 gliomos ląstelių proliferaciją bei veikia citotoksiškai. (A) Juglono poveikis C6 ląstelių proliferacijai, vertinant ląstelių skaičių viename šulinėlyje 96 šulinėlių lėkštelėje po 4 dienų inkubacijos su nurodytomis juglono koncentracijomis. (B) Citotoksinis juglono poveikis gliomos ląstelėms, įvertinant gyvų, apoptozinių ir nekrozinių ląstelių santykį, veikiant 8-64 µM juglono koncentracijomis 24 valandas. (C) Pavyzdinės kontrolinių gliomos ląstelių ir paveikus citotoksine 16 µM juglono koncentracija nuotraukos po 24 h inkubacijos.
Nekrozinės ląstelės nusidažusios propidžio jodidu (PI, raudonos) bei apoptozinės ląstelės su kondensuotais Hoechst 33342 (ryškiai mėlynai) nusidažiusiais branduoliais; nekondensuoti branduoliai nusidažę tamsiai mėlyna spalva. Juoda juostelė – 200 µm. (D) Gliomos ląstelių ciklo pokyčiai, sukelti 24 valandų inkubacijos su 8 µM juglonu, įvertinant propidžio jodidu nusidažusių ląstelių branduolius tekmės citometru. (E) Pavyzdinės tekmės citometro histogramos iš (D) dalies duomenų. Stulpeliai vaizduoja vidurkį ± SVP. *, p < 0,05 lyginant su atitinkamomis kontrolinėmis grupėmis.
11.2. Juglono poveikis deguonies sunaudojimo greičiams permeabilizuotose C6 gliomos ląstelėse.
Naudojant aukštos skyros respirometrą Oxygraph-2k buvo įvertintas C6 gliomos ląstelių mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitis ir juglono sukeliami pokyčiai. Šiems eksperimentams pasirinktos necitotoksinės juglono koncentracijos nuo 1 iki 8 µM. Atlikti dviejų tipų eksperimentai:
(1) įšvirkščiant jugloną tiesiogiai į C6 gliomos ląstelių suspensiją ir registruojant kvėpavimo pokyčius (3 pav. A-C) ir (2) inkubuojant ląsteles su juglonu 6 valandas ir tuomet užrašant kvėpavimo kreives (3 pav. D).
Ląstelės buvo permeabilizuotos, naudojant digitoniną, tad substratai ir slopikliai galėjo pasiekti mitochondrijas. Pirmojo tipo eksperimentų metu buvo nustatyta, kad juglonas mažina deguonies sunaudojimo greitį atskirtoje būsenoje su 2,4-dinitrofenoliu (DNF) (3 pav. A). Taip pat antroje metabolinėje būsenoje (substratų skatintoje), naudojant I kvėpavimo grandinės komplekso substratus glutamatą ir malatą, juglonas slopina deguonies sunaudojimą priklausomai nuo koncentracijos, kai juglono koncentracija ³ 4 µM (3 pav. B). Panašiai juglonas veikė ir ląsteles trečiojoje metabolinėje būsenoje (ADP skatintoje), esant substratams glutamatui ir malatui (3 pav. B). Juglonas neveikė deguonies sunaudojimo greičio ląstelėse su IV kvėpavimo grandinės komplekso (citochromo oksidazės) slopikliu natrio azidu NaN3 (3 pav. C).
Atliekant antrojo tipo eksperimentus, C6 gliomos ląstelės buvo inkubuojamos su 8 µM juglonu 6 valandas. Juglonas sumažino deguonies sunaudojimą, esant substratams glutamatui ir malatui antrojoje ir trečiojoje metabolinėse būsenose, tačiau neveikė kvėpavimo atskirtoje būsenoje ir esant slopikliui NaN3 (3 pav. D). Juglono tirpiklio (etanolio) pridėjimas kontrolinėse grupėse neturėjo įtakos ląstelių deguonies sunaudojimo greičiams.
11.3. I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso reikšmė juglonui generuojant ROS gliomos ląstelėse.
MitoSox™ Red buvo naudojamas nustatyti superoksido anijonradikalų lygio pokyčius C6 gliomos ląstelėse, veikiant jas juglonu. Gauti duomenys parodė, kad juglonas didina šių ROS lygį ląstelėse priklausomai nuo juglono koncentracijos (4 pav. A ir B). Taip pat vandenilio peroksido H2O2 susidarymo greičiai, naudojant AmplifluÔ, permeabilizuotose C6 gliomos ląstelėse su I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso substratais glutamatu ir malatu, buvo žymiai didesni nei kontrolinėse ląstelėse (tirpiklio kontrolė) (4 pav. C). H2O2 susidarymo lygiai, esant juglonui, buvo statistiškai reikšmingai mažesni pridėjus I kvėpavimo kvėpavimo grandinės komplekso slopiklio amitalio. Tai rodo, kad juglonui gaminti ROS yra iš dalies reikalingas aktyvus I kompleksas.
Matavimo terpėje be ląstelių atlikti eksperimentai parodė, kad juglonas generuoja ROS mažais kiekiais terpėje, tačiau amitalis tam įtakos neturi. (4 pav. C).
11.4. I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso slopinimas sumažina priešvėžines juglono savybes.
Kadangi juglonas slopina deguonies sunaudojimą, esant I kvėpavimo grandinės komplekso substratams glutamatui ir malatui, iškėlėme hipotezę, kad juglono priešvėžiniam poveikiui pasireikšti gali būti reikalingas aktyvus I kompleksas. Todėl C6 gliomos ląsteles veikėme kartu su juglonu ir amitaliu. Amitalio koncentracija pilnai slopinant I komplekso veiklą buvo nustatyta 1,2 mM, nustatant oksigrafiniu metodu. Rezultatai atskleidė, kad slopinant I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksą amitaliu, sumažėjo juglono citotoksinis poveikis ląstelėms (5 pav. A). Tai leidžia teigti, kad aktyvus I kompleksas iš dalies yra reikalingas ląstelių žūties sukėlimui. Amitalis (1,2 mM) nesumažino ląstelių gyvybingumo (5 pav. A). Egzogeniškai pridėtas stiprus antioksidantas N-acetilcisteinas (NAC) sumažino citotoksines juglono savybes gliomos ląstelėms. Tai leidžia teigti, kad ROS yra svarbios pasireikšti juglono priešvėžiniam poveikiui.
Amitalis ir NAC susilpnino juglono antiproliferacines savybes panašiai kaip ir citotoksines (5 pav.
B). Amitalis slopino ląstelių proliferaciją, tačiau nepasiekė juglono slopinimo lygio.
3 pav. Juglonas sukelia C6 gliomos ląstelių deguonies naudojimo pokyčius, veikdamas mitochondrijų elektronų pernašos grandinę. (A) Naudojant skyriklį DNF, juglonas sumažina mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitį permeabilizuotose gliomos ląstelėse. (B) Permeabilizuotose ląstelėse juglonas sumažina deguonies sunaudojimo greičius, esant antrajai (substrato) ir trečiajai (ADP stimuliuotai) būsenoms, naudojant substratus glutamatą ir malatą. (C) Juglonas nekeičia gliomos ląstelių deguonies sunaudojimo greičio, naudojant IV komplekso slopiklį NaN3. (D) Šešių valandų gliomos ląstelių inkubacijos su necitotoksine juglono 8 µM koncentracija įtaka mitochondrijų deguonies sunaudojimo greičiui permeabilizuotose ląstelėse, naudojant nurodytus substratus ir skyriklį. Stulpeliai ir taškai vaizduoja vidurkį ± SVP. * ir #, p < 0,05 lyginant su atitinkamomis kontrolinėmis grupėmis. *, viršutinei kreivei; #, apatinei kreivei; n.s.,
4 pav. Pirmasis mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas yra svarbus juglonui gaminti ROS gliomos ląstelėse. (A) Juglonas sukelia superoksido anijonradikalų gamybą C6 gliomos ląstelėse, nustatant MitoSoxTM Red. (B) Pavyzdinės gliomos ląstelių nuotraukos, veikiant ląsteles 16 µM juglono koncentracija 30 min. ir tuomet nudažius jas MitoSoxTM Red ir MitoTracker®
Green. (C) Amitalis sumažina ROS gamybą gliomos ląstelėse, inkubuotose su juglonu, naudojant AmplifluÔ metodą. Ląstelės buvo permeabilizuotos digitoninu, pridėta glutamato ir malato, ir tuomet inkubuotos su juglonu ir/ar amitaliu kaip nurodyta. Eksperimentai matavimo terpėje buvo atlikti be ląstelių. Stulpeliai vaizduoja vidurkį ± SVP. #, p < 0,05 lyginant su atitinkamomis kontrolinėmis grupėmis; *, p < 0,05 tarp nurodytų grupių; n.s., statistiškai nepatikimas skirtumas tarp nurodytų grupių.
5 pav. Pirmojo kvėpavimo grandinės komplekso aktyvumas ir ROS gamyba yra svarbūs juglono priešvėžiniam poveikiui pasireikšti gliomos ląstelėse. Konkurencinis slopiklis amitalis ir antioksidantas NAC sumažina juglono citotoksiškumą, nustatant dvigubo dažymo metodu po 24 val. inkubacijos (A) bei sumažina antiproliferacinį juglono poveikį gliomos ląstelėse po 72 val.
inkubacijos (B). Stulpeliai vaizduoja vidurkį ± SVP. #, p < 0,05 lyginant su atitinkamomis kontrolinėmis grupėmis; *, p < 0,05 tarp nurodytų grupių.
12. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiame darbe pateikėme duomenis, rodančius, kad juglonas pasižymi priešvėžinėmis savybėmis – citotoksinėmis ir antiproliferacinėmis – gliomos ląstelėms. Svarbu, kad juglonas skatina ROS susidarymą gliomos ląstelėse (4 pav ir (3)). Tai, kad NAC, stiprus antioksidantas, statistiškai reikšmingai sumažina citotoksines ir antiproliferacines juglono savybes, rodo, kad viduląstelinių ROS susidarymas yra svarbus juglono priešvėžiniam poveikiui pasireikšti. Šis reiškinys buvo pastebėtas ir kitose auglių modeliuose, veiktuose juglonu (25, 43).
Juglono selektyvumas vėžinėms ląstelėms, lyginant su nevėžinėmis ląstelėmis, yra svarbus veiksnys, galintis nulemti klinikinį pritaikymą. Deja, selektyvumas daugelyje studijų, tyrinėjančių juglono priešvėžinį poveikį įvairiose auglių modelinėse sistemose, nebuvo aptartas.
Mūsų tyrimų grupė parodė, kad juglonas veikia citotoksiškai C6 gliomos ląsteles žymiai mažesnėmis koncentracijomis negu pirmines glijos ląsteles, kurios yra normalios – nevėžinės – nervinio audinio ląstelės (44). Tai rodo, kad juglonas iš dalies gali būti selektyvus vėžinėms ląstelėms, tačiau tolimesni tyrimai yra reikalingi su neuronų kultūra, kraujagyslių endotelio ląstelėmis ir kitomis sistemomis.
Žinoma, kad vėžinės ląstelės yra jautresnės ROS susikaupimui negu normalios audinių ląstelės ir tai galėtų nulemti dalinį juglono selektyvumą gliomos ląstelėms (7, 28).
Viduląsteliniai ROS gali susidaryti daugelio skirtingų reakcijų metu, įskaitant mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksų vykdomas reakcijas, oksidoreduktazes ir metalų katalizuojamą oksidaciją (7). Kadangi juglono sąlygojama O2•- sintezė priklauso nuo amitalio, iškėlėme hipotezę, kad juglono sukelta ROS gamyba gali būti susijusi su elektronų pernašos grandinės I komplekso veikla mitochondrijose (4 pav. A).
Šiai hipotezei patvirtinti, buvo atlikti oksidacinio fosforilinimo sistemos aktyvumo priklausomybės nuo juglono eksperimentai digitoninu permeabilizuotose ląstelėse. Ląstelių membranos permeabilizacija leidžia substratams ir slopikliams difunduoti į ląsteles ir pasiekti mitochondrijas. Šis metodas, priešingai nei mitochondrijų izoliavimas, pranašesnis tuo, kad leidžia ištirti mitochondrijų funkcijas fiziologinėje aplinkoje, išsaugant jų sąveiką su kitomis organelėmis ir leidžia išvengti mitochondrijų fragmentacijos, kuri įvyksta organelių išskyrimo metu (8).
Tai, kad juglonas sumažina mtochondrijų deguonies sunaudojimo greitį atskirtoje būsenoje su skyrikliu DNF rodo, kad juglonas gali tiesiogiai veikti elektronų pernašos grandinės komponentus (3 pav. A). Detali mitochondrijų funkcijų analizė parodė, kad juglonas slopina deguonies sunaudojimą, naudojant I kvėpavimo grandinės komplekso substratus ir nekeičia
deguonies sunaudojimo nuslopinus elektronų pernašos grandinę natrio azidu. (4 pav. B ir C). Vis dėlto, galima manyti, kad juglonas slopina I kompleksą netiesiogiai, nukreipdamas elektronus nuo elektronų pernašos grandinės (6 pav.). Žinoma, kad chinonai dėl jų redukcinių-oksidacinių savybių gali būti dalinai redukuojami elektronų pernašos grandinės, suformuojant semichinonų radikalus hepatocituose ir keratinocituose (29, 45). Susidarę radikalai yra nestabilūs ir dalis jų gali sureaguoti su molekuliniu deguonimi, pagaminant O2•-, kurie superoksido dismutazės (SOD) yra paverčiami į H2O2 taip ląstelėje sukeliant oksidacinį stresą (46). Manome, kad juglonas gali generuoti O2•- šiuo būdu. Ši hipotezė yra remiama faktu, kad amitalis, I kvėpavimo grandinės komplekso slopiklis, sumažina juglono indukuotą ROS gamybą (4 pav. C) bei priešvėžines savybes (5 pav.). Taigi, I mitochondrijų kvėpavimo grandinės kompleksas gali būti viena iš ląstelės vietų, kur juglonas generuoja ROS.
Pirmojo kvėpavimo grandinės komplekso slopikliai, įskaitant ir amitalį, sukelia ROS lygio padidėjimą ląstelėse dėl elektronų nutekėjimo deguoniui I komplekse įvariuose audiniuose (47, 48). Nors amitalis padidino ROS lygį gliomos ląstelėse, šis ROS padidėjimas nebuvo pakankamas sukelti ląstelių žūtį (5 pav.). Vis dėlto, tai, kad I komplekso slopinimas nesumažina juglono sukeltos ROS generacijos rodo, jog redokso pusiausvyra gliomos ląstelėse gali būti keičiama ir kitais būdais. Pavyzdžiui, naftochinonai gali sudaryti semichinonus, iš kurių susidaro O2•- katalizuojant keletui skirtingų fermentų, įskaitant NAD(P)H:chinono oksidoreduktazei-1, ksantino oksidazei ir citochromo P450 reduktazei (20). Tačiau šių fermentų reikšmė gliomos ląstelėms dar turi būti ištirta ateityje.
Vis labiau atkreipiamas dėmesys į vėžinių ląstelių energijos perprogramavimą (5).
Neseniai buvo nustatyta, kad didesnis IV mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso aktyvumas augliuose koreliuoja su pacientų, sergančių glioblastoma, ilgesniu išgyvenamumu, rodančiu, kad suaktyvėjęs oksidacinis fosforilinimas augliuose yra susijęs su geresne prognoze (49). Oksidacinio fosforilinimo slopinimas, naudojant IV komplekso slopiklius, efektyviai sumažino gliomos ląstelių proliferaciją (50). Panašiai ir amitalis, konkurenciniu būdu slopindamas I kompleksą, sumažina gliomos ląstelių proliferacinį potencialą (5 pav. B). Taigi bioenergetikos reguliavimas vėžinėse ląstelėse gali būti potencialus gliomų terapijos taikinys.
Taip pat buvo pastebėta, kad gliomos ląstelių mitochondrijų kvėpavimas su I komplekso substratais sumažėjo po 6 valandų ląstelių inkubacijos su juglonu (3 pav. D). Šis fenomenas gali būti paaiškinamas įvykusiu elektronų pernašos pažeidimu, sukelto susikaupusių ROS – reiškinys, kuris yra išsamiai ištirtas, vykstant reperfuzijai po infarkto miokarde ir nerviniame audinyje (51, 52).
Antiproliferacinės juglono savybės, mažinant ląstelių skaičių G2/M fazėje, gali būti nulemtos viduląstelinio ROS lygio padidėjimo, nes ląstelinis stresas aktyvuoja p21/p53
signalinius kelius ir blokuoja ląstelės ciklą (53). Vis dėlto, yra duomenų, kad juglonas gali sustabdyti ląstelės ciklą ir S fazėje HCT-15 starosios žarnos karcinomos ląstelėse (54). Taip pat buvo įrodyta, kad juglonas gali tiesiogiai paveikti daugelį signalinių molekulių, tokių kaip peptidil-prolil cis/trans izomerazė NIMA-sąveikaujanti 1, kuri reguliuoja baltymus, dalyvaujančius kertiniuose ląsteliniuose signaliniuose keliuose, reguliuojančiuose ląstelių proliferaciją, ląstelės ciklą, diferenciaciją ir apoptozę (55).
Juglono klinikinis pritaikymas gali būtų susijęs ir su tam tikra rizika. Iš rezultatų, gautų iš Saling et al ir Makawiti et al, yra aišku, kad juglonas gali būti klasifikuojamas kaip mažo terapinio lango skyriklis kepenų audiniuose (33, 56). Perfūzuotose kepenyse, juglono poveikis
6 pav. Hipotetinis juglono priešvėžinio poveikio mechanizmas C6 gliomos ląstelėse.
Ubichinonai (oksiduota forma, Q, ir redukuota forma, QH2) perneša elektronus nuo I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso į II kompleksą. Hidrofobinėmis savybėmis pasižymintis juglonas gali patekti į mitochondrijų vidinę membraną ir prisijungti elektronus iš pirmojo kvėpavimo grandinės komplekso. Dalis molekulių gali būti tik dalinai redukuojamos suformuodamos semichinono radikalus, kurie virsta superoksido anijonradikalais (O2•−).
Superoksido dismutazė (SOD) paverčia O2•− į vandenilio peroksidą (H2O2). O2•− ir H2O2
nulemia priešvėžines juglono savybes. Amitalis, konkurencinis I komplekso slopiklis, mažina juglono semichinonų susidarymą ir kartu O2•− ir H2O2 gamybą, sumažindamas šio naftochinono priešvėžines savybes. Vis dėlto, kitos oksidoreduktazės, kaip NAD(P)H:chinono
pasireiškia nuo 1 iki 20 µM koncentracijų spektre. Tokiu būdu šis junginys yra panašus į tipinį skyriklį DNF. Didesnių dozių juglono vartojimas gali sukelti panašius nepageidaujamus poveikius, kaip ir DNF – hipertermiją ir net mirtį (33). Iš kitos pusės, nedidelis atskyrimas, manoma, yra naudingas, skatinant molekulinius mechanizmus, didinančius mitochondrijų genų raišką ir mitochondrijų tūrį (57). Vis dėlto, nėra atliktų studijų, kaip juglonas galėtų paveikti sveiką nervinį audinį ir smegenų kraujagysles. Taip pat nėra duomenų apie naftochinonų biopasisavinimą centrinėje nervų sistemoje ir auglio masėje nerviniame audinyje.
13. IŠVADOS
1. Juglonas sukelia C6 gliomos ląstelių žūtį nekrozės būdu ir pasižymi antiproliferaciniu poveikiu.
2. Veikiant C6 gliomos ląsteles juglonu, ląstelių ciklas sutrikdomas, sumažėjus ląstelių proporcijai G2/M fazėse ir padidėjus G1/G0 stadijose.
3. Juglonas sumažina mitochondrijų deguonies sunaudojimo greitį C6 gliomos ląstelėse II-oje ir III-ioje metabolinėse būsenose, naudojant I mitochondrijų kvėpavimo grandinės substratus glutamatą ir malatą.
4. Juglonas skatina aktyvių deguonies formų – vandenilio peroksido ir superoksido anijonradikalų – susidarymą C6 gliomos ląstelėse.
5. Aktyvių deguonies formų susidarymas, nulemtas I mitochondrijų kvėpavimo grandinės komplekso, iš dalies sąlygoja juglono citotoksines ir antiproliferacines savybes C6 gliomos ląstelėse.
14. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Stupp R, Hegi ME, Mason WP, van den Bent MJ, Taphoorn MJ, Janzer RC, et al. Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study: 5-year analysis of the EORTC-NCIC trial. The lancet oncology. 2009;10(5):459-66.
2. McGuire S. World Cancer Report 2014. Geneva, Switzerland: World Health Organization, International Agency for Research on Cancer, WHO Press, 2015. Adv Nutr. 2016;7(2):418-9.
3. Meskelevicius D, Sidlauskas K, Bagdonaviciute R, Liobikas J, Majiene D. Juglone exerts cytotoxic, anti-proliferative and anti-invasive effects on Glioblastoma multiforme in a cell culture model. Anti-cancer agents in medicinal chemistry. 2016 16(9):1190-7.
4. Redaelli M, Mucignat-Caretta C, Isse AA, Gennaro A, Pezzani R, Pasquale R, et al. New naphthoquinone derivatives against glioma cells. European journal of medicinal chemistry.
2015;96:458-66.
5. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 2011;144(5):646- 74.
6. Santidrian AF, Matsuno-Yagi A, Ritland M, Seo BB, LeBoeuf SE, Gay LJ, et al.
Mitochondrial complex I activity and NAD+/NADH balance regulate breast cancer progression. The Journal of clinical investigation. 2013;123(3):1068-81.
7. Sabharwal SS, Schumacker PT. Mitochondrial ROS in cancer: initiators, amplifiers or an Achilles' heel? Nature reviews Cancer. 2014;14(11):709-21.
8. Kuznetsov AV, Veksler V, Gellerich FN, Saks V, Margreiter R, Kunz WS. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature protocols.
2008;3(6):965-76.
9. Stupp R, Mason WP, van den Bent MJ, Weller M, Fisher B, Taphoorn MJ, et al.
Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England journal of medicine. 2005;352(10):987-96.
10. Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, Cavenee WK, Burger PC, Jouvet A, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta neuropathologica.
2007;114(2):97-109.
11. Louis DN, Perry A, Reifenberger G, von Deimling A, Figarella-Branger D, Cavenee WK, et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta neuropathologica. 2016;131(6):803-20.
12. Furnari FB, Fenton T, Bachoo RM, Mukasa A, Stommel JM, Stegh A, et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev. 2007;21(21):2683-710.
13. Soffietti R, Baumert BG, Bello L, von Deimling A, Duffau H, Frenay M, et al. Guidelines on management of low-grade gliomas: report of an EFNS-EANO Task Force. European journal of neurology : the official journal of the European Federation of Neurological Societies.
2010;17(9):1124-33.
14. Sanai N, Chang S, Berger MS. Low-grade gliomas in adults. Journal of neurosurgery.
2011;115(5):948-65.
15. Ajaz M, Jefferies S, Brazil L, Watts C, Chalmers A. Current and investigational drug strategies for glioblastoma. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2014;26(7):419-30.
16. Nieder C, Mehta MP, Jalali R. Combined radio- and chemotherapy of brain tumours in adult patients. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2009;21(7):515-24.
17. Kot M, Karcz W, Zaborska W. 5-Hydroxy-1,4-naphthoquinone (juglone) and 2-hydroxy-1,4- naphthoquinone (lawsone) influence on jack bean urease activity: Elucidation of the difference in inhibition activity. Bioorganic chemistry. 2010;38(3):132-7.
18. Babula P, Vaverkova V, Poborilova Z, Ballova L, Masarik M, Provaznik I. Phytotoxic action of naphthoquinone juglone demonstrated on lettuce seedling roots. Plant physiology and biochemistry : PPB / Societe francaise de physiologie vegetale. 2014;84:78-86.
19. Thomson RH. Naturally occurring quinones. 2d ed. London, New York,: Academic Press;
1971. vii, 734 p. p.
20. Klotz LO, Hou X, Jacob C. 1,4-naphthoquinones: from oxidative damage to cellular and inter-cellular signaling. Molecules. 2014;19(9):14902-18.
21. Wang J, Cheng Y, Wu R, Jiang D, Bai B, Tan D, et al. Antibacterial Activity of Juglone against Staphylococcus aureus: From Apparent to Proteomic. International journal of molecular sciences. 2016;17(6):965.
22. Aithal KB, Kumar S, Rao BN, Udupa N, Rao SB. Tumor growth inhibitory effect of juglone and its radiation sensitizing potential: in vivo and in vitro studies. Integr Cancer Ther. 2012;11(1):68- 80.
23. Sugie S, Okamoto K, Rahman KM, Tanaka T, Kawai K, Yamahara J, et al. Inhibitory effects of plumbagin and juglone on azoxymethane-induced intestinal carcinogenesis in rats. Cancer letters.
1998;127(1-2):177-83.
24. Zhang XB, Zou CL, Duan YX, Wu F, Li G. Activity guided isolation and modification of juglone from Juglans regia as potent cytotoxic agent against lung cancer cell lines. BMC Complement Altern Med. 2015;15:396.
25. Seshadri P, Rajaram A, Rajaram R. Plumbagin and juglone induce caspase-3-dependent apoptosis involving the mitochondria through ROS generation in human peripheral blood lymphocytes. Free radical biology & medicine. 2011;51(11):2090-107.
26. Circu ML, Aw TY. Reactive oxygen species, cellular redox systems, and apoptosis. Free radical biology & medicine. 2010;48(6):749-62.
27. Ray PD, Huang BW, Tsuji Y. Reactive oxygen species (ROS) homeostasis and redox regulation in cellular signaling. Cell Signal. 2012;24(5):981-90.
28. Trachootham D, Alexandre J, Huang P. Targeting cancer cells by ROS-mediated mechanisms: a radical therapeutic approach? Nat Rev Drug Discov. 2009;8(7):579-91.
29. Ollinger K, Brunmark A. Effect of hydroxy substituent position on 1,4-naphthoquinone toxicity to rat hepatocytes. The Journal of biological chemistry. 1991;266(32):21496-503.
30. Powis G. Metabolism and reactions of quinoid anticancer agents. Pharmacology &
therapeutics. 1987;35(1-2):57-162.
31. Monks TJ, Hanzlik RP, Cohen GM, Ross D, Graham DG. Quinone chemistry and toxicity.
Toxicology and applied pharmacology. 1992;112(1):2-16.
32. Zhang R, Hirsch O, Mohsen M, Samuni A. Effects of nitroxide stable radicals on juglone cytotoxicity. Archives of biochemistry and biophysics. 1994;312(2):385-91.
33. Saling SC, Comar JF, Mito MS, Peralta RM, Bracht A. Actions of juglone on energy metabolism in the rat liver. Toxicology and applied pharmacology. 2011;257(3):319-27.
34. Menna-Barreto RF, Goncalves RL, Costa EM, Silva RS, Pinto AV, Oliveira MF, et al. The effects on Trypanosoma cruzi of novel synthetic naphthoquinones are mediated by mitochondrial dysfunction. Free radical biology & medicine. 2009;47(5):644-53.
35. Warburg O. On the origin of cancer cells. Science. 1956;123(3191):309-14.
36. Weinhouse S. The Warburg hypothesis fifty years later. Zeitschrift fur Krebsforschung und klinische Onkologie Cancer research and clinical oncology. 1976;87(2):115-26.
37. Vander Heiden MG, Cantley LC, Thompson CB. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009;324(5930):1029-33.
38. Bost F, Decoux-Poullot AG, Tanti JF, Clavel S. Energy disruptors: rising stars in anticancer therapy? Oncogenesis. 2016;5:e188.
39. Barth RF, Kaur B. Rat brain tumor models in experimental neuro-oncology: the C6, 9L, T9, RG2, F98, BT4C, RT-2 and CNS-1 gliomas. Journal of neuro-oncology. 2009;94(3):299-312.
40. Zhou XD, Wang XY, Qu FJ, Zhong YH, Lu XD, Zhao P, et al. Detection of cancer stem cells from the C6 glioma cell line. J Int Med Res. 2009;37(2):503-10.
41. Safari M, Khoshnevisan A. Cancer Stem Cells and Chemoresistance in Glioblastoma Multiform: A Review Article. J Stem Cells. 2015;10(4):271-85.
