AGNĖ BRAZAITYTĖ

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS BIOCHEMIJOS LABORATORIJA

AGNĖ BRAZAITYTĖ

SKIRTINGŲ VAISTINIŲ SKAISTENIŲ (TANACETUM PARTHENIUM L.)

IŠTRAUKŲ BIOLOGINIO POVEIKIO GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELIŲ

KULTŪRAI ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Prof. dr. Daiva Majienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS BIOCHEMIJOS LABORATORIJA TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data

SKIRTINGŲ VAISTINIŲ SKAISTENIŲ (TANACETUM PARTHENIUM L.)

IŠTRAUKŲ BIOLOGINIO POVEIKIO GLIOBLASTOMOS C6 LĄSTELIŲ

KULTŪRAI ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. dr. Daiva Majienė Data Darbą atliko Magistrantė Agnė Brazaitytė Data Rezencentas

Doc. Augusta Ževžikovienė Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI... 10

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11

1.1. Vaistinių skaistenių (Tanacetum parthenium L.) morfologiniai požymiai, paplitimas gamtoje ir kokybės reikalavimai ... 11

1.2. Vaistinių skaistenių (Tanacetum parthenium L.) tradicinis vartojimas ... 12

1.3. T. parthenium cheminę sudėtį lemiantys veiksniai ... 13

1.4. Seskviterpeniniai laktonai... 14

1.5. Fenoliniai junginiai ... 15

1.6. Partenolido ir vaistinių skaistenių ekstraktų priešvėžinio aktyvumo tyrimai ... 16

1.7. Glioblastoma ... 18

1.8. Žiurkių glioblastomos (C6) ląstelių linijos ypatybės ... 19

2. DARBO METODIKA ... 21

2.1. Tyrimo objektas ... 21

2.2. Reagentai ir aparatūra ... 21

2.3. Vaistinių skaistenių ištraukų gamyba iš vaistinės augalinės žaliavos ... 22

2.4. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin–Ciocalteu metodu ... 23

2.5. Ląstelių sėjimo metodika ... 23

2.6. Ląstelių tankio nustatymas ... 23

2.7. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT metodu ... 24

2.8. Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodido/ Hoechst 33342 metodu ... 25

2.9. Ląstelių proliferacijos nustatymas ... 26

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingose T. parthenium ištraukose ... 27

3.2. MTT metodu nustatytas skirtingų T. parthenium ištraukų poveikis C6 ląstelių gyvybingumui . 28 3.3. Propidžio jodido/Hoechst 33342 metodu nustatytas T. parthenium ištraukų poveikis C6 ląstelių gyvybingumui ... 32

3.4. Skirtingų T. parthenium ištraukų poveikis C6 ląstelių proliferacijai ... 36

4. IŠVADOS ... 41

5. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42

SANTRAUKA

A. Brazaitytės magistro baigiamasis darbas ,,Skirtingų vaistinių skaistenių (Tanacetum parthenium L.) ištraukų biologinio poveikio glioblastomos C6 ląstelių kultūrai įvertinimas‘‘. Mokslinio darbo vadovė – prof. dr. Daiva Majienė. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto medicinos akademijos farmacijos fakulteto neuromokslų instituto biochemijos laboratorija. Kaunas, 2019.

Darbo tikslas: ištirti ir palyginti trijų skirtingų Tanacetum parthenium L. ištraukų įvairių polifenolinių junginių koncentracijų poveikį žiurkių glioblastomos C6 ląstelių kultūros gyvybingumui ir proliferacijai.

Darbo uždaviniai: 1) Pagaminti vandeninę, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinę vaistinių skaistenių ištraukas ir įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį; 2) Nustatyti ir palyginti tiriamų vaistinių skaistenių ištraukų skirtingų polifenolinių junginių koncentracijų poveikį C6 ląstelių gyvybingumui; 3) Ištirti ir palyginti vaistinių skaistenių ištraukų įvairių polifenolinių junginių koncentracijų poveikį C6 ląstelių proliferacijai.

Tyrimo metodai. Trys skirtingos vaistinių skaistenių ištraukos (1:5) pagamintos klasikinės maceracijos metodu, kai vaistinė augalinė žaliava – džiovinta vaistinių skaistenių žolė, o tirpikliai: išgrynintas vanduo, 10 proc. DMSO ir 40 proc. etanolis. Bendras fenolinių junginių kiekis T. parthenium ištraukose nustatytas Folin-Ciocalteu metodu, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentu. Vaistinių skaistenių ištraukų skirtingų polifenolinių junginių koncentracijų poveikis žiurkių glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumui nustatytas MTT metodu bei propidžio jodido/Hoechst 33342 metodu. Skirtingų T. parthenium ištraukų poveikis C6 ląstelių proliferacijai įvertintas ląsteles dažant fluorescenciniais Hoechst 33342 bei propidžio jodido dažais.

Rezultatai. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas 40 proc. etanolinėje T. parthenium ištraukoje, mažiausias – vandeninėje ištraukoje. Visos trys skirtingos vaistinių skaistenių ištraukos priklausomai nuo polifenolinių junginių koncentracijos mažina C6 ląstelių gyvybingumą. Apskaičiuotos IC50 vertės yra 10 ± 1,1 µg/µl 40 proc. etanolinės T. parthenium ištraukos, 13 ± 1,2 µg/µl vandeninės ištraukos ir 14±1,4 µg/µl 10 proc. DMSO ištraukos. Skirtingų T. parthenium ištraukų nedidelės polifenolių koncentracijos mažina C6 ląstelių proliferaciją. Po 48 val. vandeninės ištraukos 0,25–1,5 µg/µl polifenolinių junginių koncentracija proliferaciją sumažino 12 – 35%, 0,25–1,5 µg/µl 10 proc. DMSO ištrauka proliferaciją sumažino 13 – 30%, o 40 proc. etanolinė ištrauka C6 ląstelių proliferaciją sumažino 15 – 37% po inkubacijos su 0,25–1 µg/µl polifenolinių junginių koncentracija.

Išvados. Vandeninė, 10 proc. DMSO ir 40 proc. etanolinė vaistinių skaistenių ištraukos priklausomai nuo polifenolinių junginių koncentracijos mažina C6 ląstelių gyvybingumą ir proliferaciją.

SUMMARY

A. Brazaitytė Master Thesis: ,,Evaluation of biological activity of different extracts from Feverfew (Tanacetum parthenium L.) to Glioblastoma Multiforme C6 culture cells’’. Scientific supervisor – D. Majienė. Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Neuroscience institute, Laboratory of Biochemistry. Kaunas, 2019.

The aim of the research: to investigate and compare the effect of different concentrations of polyphenols of three different Tanacetum parthenium L. extracts on rat glioblastoma C6 cell culture viability and proliferation.

Objectives: 1) to prepare aqueous, 10% DMSO and 40% ethanolic extracts of Feverfew and to evaluate total phenolic content; 2) to determine and compare the effect of different concentrations of polyphenols of Feverfew extracts on C6 cell viability; 3) to investigate and compare the effect of various concentrations of polyphenols of different Feverfew extracts on C6 cells proliferation.

Methods. Three different T. parthenium L. extracts (1:5) were produced by classical maceration method. Extracts consisted of Feverfew dry herb and of three different solvents - purified water, 10% of dimethyl sulfoxide (DMSO) and 40% of ethanol. Total phenolic content of prepared Feverfew extracts was evaluated using Folin-Ciocalteu method and results were expressed as gallic acid equivalent. The effect of different concentrations of polyphenols of prepared Feverfew extracts was determined using MTT assay, additionally cell viability was assessed using propidium iodide and Hoechst 33342 fluorescent dyes. Cell staining with propidium iodide and Hoechst 33342 was applied to investigate the anti – proliferative effect of different Feverfew extracts.

Results. The highest content of total phenolic compounds was determined in ethanolic extract of T. parthenium, the lowest content was identified in aqueous extract. Results have shown that polyphenolic compounds of three different Feverfew extracts reduce viability of C6 glioma cells in a dose-dependent manner. The IC50 values are approximately 10 ± 1,1 µg/µl of 40% ethanolic T. parthenium extract, 13 ± 1,2 µg/µl of aqueous extract and 14 ± 1,4 µg/µl of 10% DMSO extract. Low concentrations of polyphenols of T. parthenium extracts can reduce C6 cells proliferation. After 48 h incubation with aqueous extract (0,25–1,5 µg/µl of polyphenols) C6 cells proliferation has decreased by 12 – 35%. After cell incubation with 10% DMSO extract (0,25–1,5 µg/µl of polyphenols) C6 proliferation has reduced by 13 – 30%. Incubation with 0,25–1 µg/µl of 40% ethanolic extract inhibited the growth of C6 cells by 15 – 37%.

Conclusions. Aqueous, 10% DMSO and 40% ethanolic Feverfew extracts depending on the concentration of polyphenols reduce viability and proliferation of C6 cell line.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju savo darbo vadovei, prof. dr. Daivai Majienei ir Neuromokslų Instituto, Biochemijos laboratorijos vedėjai prof. dr. Vilmantei Borutaitei už suteiktą galimybę atlikti baigiamąjį magistro darbą šioje katedroje bei kokybiškas darbo sąlygas. Taip pat dėkoju Neuromokslų Instituto, Biochemijos laboratorijos kolektyvui už vertingus patarimus, rekomendacijas apdorojant ir pateikiant tyrimų rezultatus.

SANTRUMPOS

DMAPT – dimetilaminopartenolidas

DMEM – Dulbecc‘o modifikuota Eagle mitybinė terpė (angl. Dulbecc‘o Modified Eagle Medium)

DMSO – dimetilsulfoksidas

FBS – fetalinis veršelio serumas (angl. Fetal bovine serum)

GBM – multiforminė glioblastoma

HBSS – Hankso subalansuotas druskos tirpalas (angl. Hank‘s Balanced Salt Solution)

IC50 – pusė (50 proc.) maksimalios medžiagos koncentracijos, inhibuojančios ląstelių biologinę ar biocheminę funkciją

NF- κB – branduolio faktorius kappa B

PBS – fosfatinis druskos buferis (angl. Phosphate Buffer Saline)

PTL – partenolidas

ROS – reaktyvios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species)

TMZ – temozolamidas

ĮVADAS

Iš augalų išskirti fitocheminiai junginiai dėl cheminės struktūros įvairovės bei biologinio aktyvumo yra svarbus vaistinių medžiagų šaltinis [1]. Šiomis dienomis natūralūs produktai, jų dariniai bei analogai sudaro daugiau nei 50 proc. visų gydymui vartojamų vaistinių preparatų [2]. Antriniai augalų metabolitai sulaukia vis didesnio mokslininkų susidomėjimo kaip potencialūs priešvėžiniai preparatai [3],[4]. Yra aktualu ieškoti naujų citotoksiniu poveikiu pasižyminčių junginių, kuriems būtų būdingas mažesnis toksiškumas bei nepageidaujamos reakcijos ir/arba didesnis terapinis efektyvumas [5].

Multiforminė glioblastoma (GBM) arba kitaip 4 laipsnio astrocitoma – pats agresyviausias ir dažniausiai pasitaikantis pirminis galvos smegenų auglys, kuris sudaro apie 60 proc. visų suaugusiems diagnozuojamų galvos smegenų auglių [6]–[8]. GBM gydymas susideda iš chirurginio pašalinimo, radioterapijos bei chemoterapijos temozolamidu (TMZ) [9]. Nepaisant įvairios ir modernios gydymo terapijos GBM vis dar išlieka mirtina liga su niūria prognoze [7]. Pacientų išgyvenamumo vidurkis siekia apie 14–15 mėnesių nuo diagnozės nustatymo [9]. Dėl šios priežasties išlieka poreikis ieškoti inovatyvių ir efektyvių GBM gydymo strategijų [10].

Vaistinis skaistenis (Tanacetum parthenium L.) – tai medicininis augalas, kuris šiomis dienomis daugiausia vartojamas migrenos priepuolių prevencijai bei juos lydinčių simptomų malšinimui [11]. Partenolidas, natūralus seskviterpeninis laktonas, išskirtas iš vaistinio skaistenio, yra svarbiausias bioaktyvus šio medicinio augalo junginys, atsakingas už biologinį aktyvumą [12]. Partenolidas pasižymi citotoksiniu poveikiu prieš įvairias navikinių ląstelių linijas: plaučių, leukemijos, kasos bei krūties vėžio [13]. Taip pat in vitro tyrimais nustatytas partenolido priešvėžinis poveikis žiurkių glioblastomos bei žmogaus glioblastomos ląstelių linijoms [14]. Vis dėlto pagrindinis veiksnys, ribojantis partenolido galimą pritaikymą terapijoje yra junginio lipofiliškumas (logP reikšmė siekia 3,03–3,07) [12].

Kiti svarbūs T. parthenium biologiškai aktyvūs junginiai yra polifenoliai [15]. Polifenoliniai junginiai, išskirti iš augalų, tiriami dėl įvairaus biologinio poveikio įskaitant citotoksines jų savybes [16]. T. parthenium augalinėje žaliavoje – antžeminėse dalyse identifikuoti šie flavonoidai: liuteolinas, apigeninas, kvercetinas ir kt., bei fenolinės rūgštys – gentisinė, chlorogeninė, kofeino rūgštys [15]. Vaistiniame skaistenyje esančių polifenolinių junginių priešvėžinis aktyvumas iki šiol nėra pakankamai įvertintas. Šiame darbe buvo tiriamas trijų skirtingų T. parthenium ištraukų įvairių polifenolinių junginių koncentracijų poveikis C6 žiurkės glioblastomos ląstelių gyvybingumui ir proliferacijai.

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti ir palyginti trijų skirtingų vaistinių skaistenių (Tanacetum parthenium L.) ištraukų įvairių polifenolinių junginių koncentracijų poveikį žiurkių glioblastomos C6 ląstelių kultūros gyvybingumui ir proliferacijai.

Darbo uždaviniai:

1. Pagaminti vandeninę, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinę vaistinių skaistenių ištraukas ir įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį.

2. Nustatyti ir palyginti tiriamų trijų vaistinių skaistenių ištraukų skirtingų polifenolinių junginių koncentracijų poveikį C6 ląstelių gyvybingumui.

3. Ištirti ir palyginti skirtingų vaistinių skaistenių ištraukų įvairių polifenolinių junginių koncentracijų poveikį C6 ląstelių proliferacijai.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Vaistinių skaistenių (Tanacetum parthenium L.) morfologiniai požymiai,

paplitimas gamtoje ir kokybės reikalavimai

Tanacetum parthenium (L.) Schultz Bip. dar žinomas kaip vaistinis skaistenis (angl. Feverfew, Featherfew, Midsummer Daisy) yra daugiametis žolinis augalas, priklausantis Astrinių (Asteraceae arba Compositae) šeimai ir kultivuojamas jau ne vieną šimtmetį kaip medicininis bei dekoratyvinis augalas (1 pav.) [17]. Gimtine laikoma Pietryčių Europa ir Mažoji Azija, tačiau dėl savo medicininių savybių išplito ir šiuo metu aptinkama visoje Europoje, Šiaurės ir Pietų Amerikoje ir net tolimoje Australijoje [17].

Vaistinis skaistenis yra aromatinis augalas, kuriam būdingas kamparo kvapas [18],[19]. Užauga iki 0,3 –1 metro aukščio, lapai panašūs į chrizantemos, o žiedai – į vaistinės ramunės [17],[20]. Stiebas, kuris yra beveik keturkampio formos ir šiek tiek plaukuotas, skersmuo siekia iki 5 mm.; lapai ovalo formos, nuo 2 iki 5 cm ilgio, kartais pasiekia net 10 cm ilgį ir yra gelsvai žalios spalvos [18]. Žiedo skersmuo siekia nuo 12 iki 22 mm ir turi ilgus žiedkočius; geltoni žiedai, turintys baltus žiedlapius ir kurių skersmuo siekia 2 cm, žydi nuo liepos iki spalio mėnesio [17],[18].

Remiantis Europos farmakopėja kaip vaistinė augalinė žaliava yra naudojamos džiovintos antžeminės vaistinių skaistenių dalys: stiebai, lapai bei žiedai [19]. Augalinės žaliavos kokybė įvertinama, nustatant joje esančių veikliųjų medžiagų, pašalinių medžiagų, nuodžiūvio, bendro pelenų kiekio parametrus. Džiovintoje žaliavoje turi būti ne mažiau kaip 0,2% partenolido (C15H20O3) [19]. Pašalinių medžiagų gali būti: ne daugiau kaip 10,0% vaistinių skaistenių stiebų, kurių skersmuo didesnis nei 5 mm, ir ne daugiau kaip 2,0% kitų medžiagų. Nuodžiūvis gali būti ne daugiau kaip 10,0%, o bendras pelenų kiekis neturi būti didesnis kaip 12,0% [19].

1 pav. Vaistinis skaistenis (Tanacetum parthenium L.Schultz Bip): visas augalas (a), žiedai (b) ir

1.2. Vaistinių skaistenių (Tanacetum parthenium L.) tradicinis vartojimas

Vaistinio skaistenio pavadinimas yra kilęs iš lotyniško žodžio febrifugia, reiškiančio – mažinantis karščiavimą [17]. Taip pat egzistuoja legenda, kad senovės graikai augalą praminė Parthenium, nes juo buvo išgelbėta gyvybė žmogaus, nukritusio nuo Partenono šventyklos, skirtos miesto deivei Atėnei [20]. Vis dėlto, labiau tikėtina versija, kad Parthenium pavadinimas kilęs iš graikiško žodžio parthenos, reiškiančio mergelė, nes tuo metu tradiciškai augalas vartotas gydyti menstruacinius skausmus [20]. T. parthenium dar žinomas kaip ,,viduramžių aspirinas‘‘ [17].

Vaistinis skaistenis kaip medicininis augalas ir antipiretikas pirmą kartą aprašytas senovės Graikijos gydytojo Dioskorido veikale ,,De materia medica‘‘ [17]. Liaudies medicinoje šis augalas vartojamas kaip alternatyva įprastiems vaistiniams preparatams trims pagrindinėms grupėms sutrikimų: pirmoji – karščiavimo, galvos skausmo ir migrenos gydymui; antroji – moteriškų problemų tokių kaip sutrikusio menstruacinio ciklo reguliavimui, persileidimo pavojui išvengti; trečioji – pilvo, dantų skausmams bei vabzdžių įgėlimams [20].

Italijos mokslininkai S.Ferrero iki kiti atliko retrospektyvinį kohortinį tyrimą, kuriame analizavo kombinuotą resveratrolio bei vaistinio skaistenio efektyvumą gydant pirminę dismenorėją [21]. Tyrime dalyvavo 30 moterų, kenčiančių nuo pirminės dismenorėjos ir kurių amžiaus vidurkis siekė 27,5 ± 5,3 metus. Pacientėms buvo paskirtas preparatas RevifastDol®, kurio sudėtyje 400 mg vaistinių skaistenių sausojo ekstrakto (partenolidas sudarė 2 mg) ir Revifast ® 320 mg (resveratrolis sudarė 96 mg). Tyrimo dalyvėms buvo nurodyta pradėti vartoti po 2 tabletes likus 3 dienoms iki menstruacinio ciklo pradžios ir tęsti vartojimą kasdien 6 mėnesius visą menstruacinį periodą. Pacientėms leista esant reikalui vartoti NVNU (600 mg ibuprofeno) ir paprašyta pasižymėti suvartotą šių tablečių skaičių. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad jau po pirmojo mėnesio ir visą tyrimo laikotarpį lyginant su baziniu periodu pastebėtas reikšmingas dismenorėjos simptomų intensyvumo sumažėjimas (p<0,05). Taipogi po 6 mėnesių nustatytas reikšmingai sumažėjęs suvartotų analgetinių tablečių skaičius (baziniame laikotarpyje 2 (1–3), po 6 mėnesių 0,5 (0–1); p<0,05) [21].

Nuo 1980 metų vaistinis skaistenis sulaukė didelio susidomėjimo dėl savo efektyvumo mažinant migrenos sukeltus galvos skausmus [12],[18]. 2005 metais Vokietijoje mokslininkų Diener ir kt. buvo atliktas randomizuotas, dvigubai aklas, multicentrinis, placebo kontroliuojamas klinikinis tyrimas, kurio tikslas įvertinti superkritinio CO2 vaistinių skaistenių ekstrakto efektyvumą ir saugumą migrenos prevencijai [22]. Iš viso tyrime dalyvavo 170 pacientų, kenčiančių nuo migrenos skausmų, o prieš pradedant tyrimą buvo 4 savaičių bazinis periodas – laikotarpis, kai nebuvo taikoma jokia medikamentinė migrenos profilaktika. Po bazinio laikotarpio pacientai suskirstyti į 2 grupes ir 16 savaičių 3 kartus per dieną vartojo 6,25 mg vaistinių skaistenių ekstraktą arba placebą. Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad pacientų grupei, vartojusiai T. parthenium ekstraktą, migrenos priepuolių dažnis

lyginant su baziniu laikotarpiu sumažėjo 1,9 priepuoliais per mėnesį ir tai buvo 0,6 priepuoliais per mėnesį mažiau nei placebo grupėje [22].

1.3. T. parthenium cheminę sudėtį lemiantys veiksniai

Augalų antrinių metabolitų kokybinė ir kiekybinė sudėtis priklauso nuo abiotinių (aplinkos sąlygų) ir biotinių (augalo rūšis, genotipas, vystymosi stadijos) veiksnių [23]. Abiotiniai veiksniai dažnai turi ypatingai didelę įtaką augalų antrinių metabolitų kokybinei sudėčiai, nes negalėdami išvengti ekstremalių aplinkos sąlygų tokių kaip šviesa, temperatūra, sausra ar persikelti į vietoves, kuriose palankesnės mitybos sąlygos, yra priversti prisitaikyti, pasitelkiant fiziologines savybes ir metabolizmą [23]. Taigi, antriniai augalų metabolitai yra sudėtinė prisitaikymo mechanizmų dalis [23],[24].

Mokslininkų M. Majdi ir kitų buvo atliktas tyrimas, siekiant išsiaiškinti vaistinio skaistenio biologiškai aktyvaus junginio – seskviterpeninio laktono partenolido ir tiesioginio partenolido prekursoriaus kostunolido sudėties skirtumus priklausomai nuo T. parthenium genotipo ir vystymosi stadijos [25]. Gauti rezultatai atskleidė, jog partenolido kiekis buvo didesnis tetraploiduose nei diploiduose vaistinių skaistenių žieduose, tuo tarpu kostunolido kiekis nustatytas didesnis diploidiniame genotipe. Taip pat ištirta, kad partenolido kiekis didesnis generatyvinėje fazėje nei vegatyvinėje fazėje, išskyrus diploidinį genotipą. Kostunolido kiekis priešingai – visuose tirtuose genotipuose mažiausias kiekis nustatytas generatyvinėje fazėje [25].

J.M. Fonseca drauge su kitais mokslininkais atliko tyrimą, kuriame vertino T. parthenium antrinių metabolitų partenolido bei fenolinių junginių sudėties pokyčius priklausomai nuo kintančių aplinkos sąlygų [26]. Rezultatai parodė, kad didžiausias partenolido kiekis buvo vaistiniuose skaisteniuose, kuriems sumažintas laistymo režimas, o fenolinių junginių didžiausias kiekis nustatytas augaluose, kurie buvo laistomi kasdien. Šviesos poveikis antrinių metabolitų kiekiui įvertintas nuimant derlių skirtingu paros metu ir pastebėta, jog mažiausias partenolido kiekis buvo vaistiniuose skaisteniuose, kurie buvo nurinkti naktį, o didžiausias augaluose, kurie nurinkti vėlyvą popietę. Priešingai nei partenolido, padidėjęs fenolinių junginių kiekis buvo augaluose, kurie nurinkti nakties metu [26].

1.4. Seskviterpeniniai laktonai

Seskviterpeniniai laktonai – bespalviai, kartaus skonio, priklausantys terpenoidų pošeimiui, antriniai augalų metabolitai, kuriems būdingos lipofilinės savybės [27]. Tai 15 anglies atomų turintys junginiai, kurių struktūroje yra trys izopreno (5-C) organiniai angliavandeniliai bei laktono grupė (ciklinis esteris) [27]. Seskviterpeniniai laktonai daugiausia išgaunami iš astrinių (Asteraceae) šeimos augalų ir kurių žinoma daugiau nei 5000 skirtingų struktūrų. Šie junginiai pasižymi priešuždegiminėmis, citotoksinėmis, antibakterinėmis, antihelmintinėmis, gimdą sutraukiančiomis, antimaliarinėmis, neurotoksinėmis savybėmis [28]. Manoma, jog pagrindinė priežastis, lemianti plataus spektro biologinį poveikį yra cheminėje struktūroje esantis α-metileno-γ-laktono žiedas [29].

Remiantis karbocikliniu skeletu seskviterpeniniai laktonai kategorizuojami į šias stambias grupes: germakranolidai, turintys 10-narį žiedą; eudesmanolidai bei eremofilanolidai, turintys du sujungtus 6-narius žiedus; guaianolidai, pseudoguaianolidai ir hipokretenolidai, turintys sujungtus 7-narį ir 5-7-narį žiedus [27]. Guaianolidai ir pseudoguaianolidai turi panašų skeletą, tik skirtingą metilo grupės padėtį, kuri pas guaianolidus yra C-4, o pas pseudoguaianolidus C-5 [27]. Visų grupių atstovai struktūroje turi penkianarį laktono žiedą (γ laktoną) su karbonilo dalimi alfa padėtyje [28],[29], tačiau skiriasi alkilinančių junginių skaičiumi, lipofiliškumu ir molekulės geometrija [30]. Vaistiniame skaistenyje yra trijų grupių seskviterpeniniai laktonai – eudesmanolidai, germakranolidai bei guaianolidai [17].

Didžiausią bendrą seskviterpeninių laktonų kiekį (apie 85 proc.) T. parthenium sudaro partenolidas (PTL) (2pav.) [17][31]. M. Majdi ir kiti nustatė, kad didžiausias šio biologiškai aktyvaus junginio kiekis sukauptas vaistinio skaistenio žieduose, mažesni kiekiai lapuose ir stiebuose, o šaknyse neaptiktas [31].

Partenolidas priskiriamas germakranolidų klasei ir jo cheminę struktūrą sudaro didelio elektrofiliškumo α-metileno-γ-laktono žiedas ir epoksido radikalas, gebantis greitai sąveikauti su biologinių molekulių sritimis [32]. Tai svarbiausias seskviterpeninis laktonas, atsakingas už vaistinio skaistenio biologinį aktyvumą [12].

Pagrindinis trūkumas ribojantis partenolido kaip vaistinio preparato efektyvumą - tai nestabilus junginys, pasižymintis mažu tirpumu vandenyje, kas lemia jo prastą prieinamumą per os [12]. Šio biologiškai aktyvaus junginio vandenyje tirpus analogas 11,13-dehidro-13-dimetilamino-partenolidas (DMAPT) fumarato druskos pavidalu pasižymi daugiau nei 1000 kartų geresniu tirpumu vandenyje nei PTL ir išlaikytu priešvėžiniu aktyvumu, nes patekęs į kūno skysčius DMAPT greitai konvertuojamas į PTL (2 pav.) [2],[12],[33].

2 pav. Partenolido ir jo analogo dimetilamino partenolido bendrosios struktūrinės formulės Mokslininkas J. Long su kolegomis atliko dviejų naujų partenolido analogų sintezę ir remiantis struktūros aktyvumo ryšiu ištyrė jų in vitro priešvėžinį aktyvumą [34]. Gauti rezultatai atskleidė, kad cheminėje struktūroje laktono dalį pakeitus laktamo dalimi priešvėžinis aktyvumas sumažėja ir tai buvo įrodyta su šešiomis vėžinių ląstelių linijomis: A549, KG-1a, HL-60, HL-60/A, K562 ir K562/A. Taip pat nustatyta, kad partenolido struktūroje esanti C-14 metilo grupė gali būti svarbi priešvėžiniam aktyvumui. [34]

1.5. Fenoliniai junginiai

Biologinis vaistinio skaistenio aktyvumas priklauso ne tik nuo cheminėje struktūroje esančių seskviterpeninių laktonų, bet ir dėl fenolinių junginių [35],[36]. Šie augalų antriniai metabolitai sulaukia vis didesnio tyrėjų dėmesio dėl potencialių antioksidacinių savybių ir dėl galimo pritaikymo įvairių su oksidaciniu stresu susijusių ligų prevencijai [37].

Polifenoliai – tai plati biologiškai aktyvių junginių grupė, kuri randama augalinės kilmės produktuose (vaisiuose, daržovėse, grūduose, prieskoniuose, riešutuose, arbatoje) [38]. Skiriamos šios pagrindinės polifenolių kategorijos: flavonoidai, fenolinės rūgštys, taninai (hidrolizuoti ir kondensuoti), stilbenai bei lignanai [39].

Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginiai, sudaryti iš 15 anglies atomų, kurie išsidėstę C6-C3-C6 konfigūracijoje [39]. Svarbiausios struktūros dalys yra du aromatiniai žiedai A ir B, kurie vienas su kitu sujungti trijų anglies atomų tilteliu, įprastai heterociklinio žiedo forma C [39]. Skirtingos C žiedo variacijos lemia skirtingas flavonoidų klases, kurios yra šios: flavonoliai, flavonai, flavanonai, katechinai, izoflavonai, flavanonoliai ir antocianidinai [39],[40].

Fenolinės rūgštys sudaro apie vieną trečdalį visų fenolinių junginių, aptinkamų augaluose, kurios gali būti laisvos arba surištos formos [39]. Fenolinės rūgštys klasifikuojamos į du pogrupius: į

hidroksibenzoinės ir hidroksicinamono rūgštis [40]. Hidroksibenzoinių rūgščių struktūra yra C6-C1, o hidroksicinamono rūgščių struktūroje yra trijų anglies atomų šoninė grandinė (C6-C3) [39],[40].

Mokslininkai D. Hanganu ir kiti atliko tyrimą, kurio tikslas buvo nustatyti Romunijoje kultivuoto vaistinio skaistenio 70% etanolinio ekstrakto polifenolinių junginių cheminę sudėtį, tam pasitelkiant greitą, tikslų ir jautrų efektyviosios skysčių chromatografijos – masių spektrometrijos analizės metodą [15]. Iš viso identifikuoti šeši polifenoliai, iš kurių trys fenolinės rūgštys: gentisinė, chlorogeninė ir kofeino, kurių koncentracijos buvo mažesnės nei 0,2 µg/g. Taip pat identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti trys flavonoidų aglikonai – kvercetinas, apigeninas ir liuteolinas. Kvercetino aptikta didžiausia koncentracija (27,61 ± 0,39 µg/g), antra pagal dydį koncentracija apigenino (9,71 ± 0,18 µg/g), o mažiausia koncentracija buvo liuteolino (< 0,2 µg/g) [15].

K. Vegh drauge su kitais mokslininkais taikydami superkritinės skysčių ekstrakcijos analizės metodą (kai superkritinis skystis CO2) T. parthenium lapų ektraktuose identifikavo ne tik šiuos flavonoidus: apigeniną, liuteoliną, kasticiną ir aksilariną, bet taip pat tris naujus lipofilinius flavonoidus: sudachitiną, aceroniną bei nevadensiną [41]. Nors sudachitinas ir nevadensinas jau anksčiau buvo aptikti Astrinių (Asteraceae) šeimoje, tačiau nei vienas iš naujų lipofilinių flavonoidų dar nebuvo identifikuoti vaistiniame skaistenyje [41].

F. Rezaei ir kiti ištyrė Irane kultivuotų vaistinių skaistenių eterinio aliejaus fenolinių junginių kiekį efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodu [24]. Eterinio aliejaus sudėtyje identifikuotos šios fenolinės rūgštys: 4-hidroksibenzoinė rūgštis (3,92±0,3 mg/g), sinapo rūgštis (3,86±0,2 mg/g), ferulinė rūgštis (2,59±0,1 mg/g), p-kumarino rūgštis (2,05±0,2 mg/g), siringinė rūgštis (1,96±0,1mg/g) bei vanilino rūgštis (0,18±0,1 mg/g) [24].

1.6. Partenolido ir vaistinių skaistenių ekstraktų priešvėžinio aktyvumo tyrimai

Pastaruoju metu partenolidas - svarbiausias seskviterpeninis laktonas, aptinkamas vaistiniame skaistenyje, sulaukia vis didesnio mokslininkų susidomėjimo kaip potencialus priešvėžinis preparatas [2]. Partenolido priešvėžinis poveikis apima navikinių ląstelių proliferacijos slopinimą, apoptozės indukciją, gyvavimo ciklo sutrikdymą bei metastazių atsiradimo stabdymą [42]. Nustatyta, kad šis biologiškai aktyvus junginys pasižymi citotoksiniu poveikiu prostatos [43], kasos [44], šlapimo pūslės [45], storosios žarnos COLO 205 [46], bei SW620 [47] vėžinių ląstelių linijoms. Taipogi ištirta, jog partenolidas pasižymi proliferaciją slopinančiu poveikiu šioms ląstelių linijoms: nesmulkialąstelinio plaučių vėžio linijai GLC-82 [13], gimdos kaklelio (SiHa) bei krūties vėžio (MCF-7) ląstelių linijoms [48], hepatoceliulinės karcinomos HepG2 linijai [49].

Vienas svarbiausių partenolido veikimo mechanizmų - branduolio faktoriaus kappa B (NF-κB) slopinimas [12],[14],[32]. NF-κB yra transkripcijos faktorius, kuris atlieka svarbų vaidmenį įvairiuose biologiniuose procesuose įskaitant imuninį atsaką, uždegimą, ląstelių augimą, išgyvenamumą ir vystymąsi [50],[51]. κB yra būtinas žmogaus organizmui, tačiau neįprasta NF-κB aktyvacija prisideda prie įvairių autoimuninių, uždegiminių bei piktybinių sutrikimų tokių kaip reumatoidinis artritas, aterosklerozė, išsėtinė sklerozė, piktybiniai augliai, susiformavimo [52]. Daugelis skirtingų žmogaus piktybinių navikų turi sutrikusią NF-κB reguliaciją. Aktyvus NF-κB faktorius skatina genų ekspresiją, o to pasekmė - vyksta ląstelių proliferacija ir jos apsaugojamos nuo sąlygų, kurios įprastai sukeltų jų žūtį apoptozės būdu [51],[53]. NF-κB transkripcijos faktoriaus blokavimas gali lemti vėžinių ląstelių proliferacijos slopinimą, žūtį arba padidinti jų jautrumą priešnavikiniams vaistiniams preparatams [51],[54].

Kitas plačiai ištirtas priešvėžinis partenolido veikimo mechanizmas – didina vėžinėse ląstelėse reaktyvių deguonies formų sintezę ir sukelia oksidacinį stresą [2],[32]. Reaktyvios deguonies formos (ROS) yra chemiškai reaktyvios molekulės, sudėtyje turinčios deguonies atomą. Deguonies turintiems laisviesiems radikalams priskiriami: superoksido anijonas, hidroksilo radikalas, peroksidas, vandenilio peroksidas, hidroksilo jonas ir kt. Fiziologiškai maži ROS kiekiai yra svarbūs įvairių ląstelinių procesų tokių kaip genų ekspresijos, metabolizmo, ląstelių diferenciacijos, proliferacijos bei apoptozės reguliavime [2]. Vis dėlto, didelėmis koncentracijos ROS tampa toksiški ir sukelia ląstelių pažeidimus [2]. Tuomet pasireiškia oksidacinis stresas – sutrikusi pusiausvyra tarp viduląstelių ROS produkcijos ir ląstelių gebėjimo greitai detoksikuoti reaktyvius junginius arba atstatyti susidariusius pažeidimus [55]. ROS perteklius sukelia lipidų ir baltymų oksidacines modifikacijas ir DNR pažeidimą ir to pasekmė – apoptozinė ląstelių žūtis arba kancerogeninė ląstelių transformacija [56]. Nustatyta, kad vėžinėse ląstelėse lyginant su normaliomis ląstelėmis yra didesni kiekiai endogeninių ROS dėl suaktyvėjusio metabolizmo [57]. Didesni kiekiai endogeninių ROS navikinėse ląstelėse padidina jų jautrumą oksidacinio streso sukeltai ląstelių žūčiai ir tai galėtų būti išnaudota vėžio gydymo terapijai [57].

D‘Anneo kartu su kitais mokslininkais ištyrė partenolido citotoksinį poveikį MDA-MB231 žmogaus krūties vėžio ląstelių linijai [58]. Pirmosiomis valandomis (1-3 val.) partenolidas stipriai stimuliavo reaktyvių deguonies formų (ROS) generaciją. ROS generacija sukėlė glutationo ir tiolio grupių išeikvojimą dėl NF-kB slopinimo. Po ilgesnio laiko (5-20 val.) ROS generacija iššaukė mitochondrijų membranų potencialo išeikvojimą bei nekrozės atsiradimą ląstelėse [58].

R. Shanmugam su kolegomis analizavo vandenyje tirpaus partenolido analogo DMAPT veikimo mechanizmą, nulemiantį jo priešvėžinį aktyvumą [59]. Tyrimui buvo pasirinktos nesmulkialąstelinio plaučių vėžio ląstelių linijos A549 bei H522. Nustatyta, kad DMAPT generuoja reaktyvias deguonies formas (ROS) ir sumažina NF-κB transkripcijos faktoriaus aktyvumą. Taip pat

pateikta, jog 5–20 µM DMAPT koncentracijos slopina ląstelių proliferaciją abiejose ląstelių linijose daugiau nei 95% [59].

Daugumoje mokslinių tyrimų dėmesys sutelktas į partenolido citotoksines savybes, tuo tarpu vaistinių skaistenių ekstraktų biologinis poveikis vėžinių ląstelių linijoms mažai ištirtas [60]. Mokslininkai C. Wu ir kiti atliko tyrimą, kuriame vertino ne tik partenolido, bet ir etanolinio vaistinių skaistenių ekstrakto citotoksinį poveikį dviems žmogaus krūties vėžio ląstelių linijoms (Hs605T ir MCF-7) ir vienai žmogaus gimdos kaklelio vėžio linijai (SiHa). Buvo nustatyta, kad etanolinis T. parthenium esktraktas slopino visų trijų vėžinių ląstelių linijų augimą. Tarp tirtų vaistinių skaistenių biologiškai aktyvių junginių (partenolido, kamparo, liuteolino bei apigenino), partenolidas pasižymėjo didžiausiu slopinamuoju poveikiu ląstelių kultūroms. Taip pat rezultatai atskleidė, jog flavonoidai apigeninas ir liuteolinas gali turėti silpną ar vidutinio stiprumo sinergistinį poveikį su partenolidu slopinant vėžinių ląstelių Hs605T, MCF-7 ir SiHa dalijimąsi [60].

1.7. Glioblastoma

Glioma – tai bendrinis terminas, skirtas apibrėžti pirminius smegenų auglius. Gliomos klasifikuojamos remiantis navikinių ląstelių kilme ir gali būti: astrocitiniai navikai (astrocitoma, anaplazinė astrocitoma, glioblastoma), oligodendroglioma, ependimoma bei mišrios gliomos [61]. Tai dažniausiai pasitaikantys centrinės nervų sistemos (CNS) augliai, kurie sudaro beveik 80% visų piktybinių pirminių smegenų auglių [7],[61]. Multiforminė glioblastoma (GBM) – pats agresyviausias, labiausiai invazyvus, nediferencijuotas smegenų navikų tipas ir dėl šių savybių pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) CNS navikų klasifikacijoje yra priskiriamas 4 laipsnio astrocitomoms [61]. GBM sudaro apie 60% visų piktybinių smegenų auglių atvejų suaugusiems [6],[7]. 2013 metais Jungtinėse Amerikos valstijose glioblastomos susirgimų dažnis siekė 3,19 atvejų 100 000 žmonių [9]. Vidutinis išgyvenamumo vidurkis po diagnozės nustatymo siekia 14–15 mėnesių o negydant tiktai 3 mėnesius [9]. Niūrios išgyvenamumo prognozės patvirtina, kad GBM gydymas išlieka aktualia problema [8].

Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, kad GBM dažniausiai diagnozuojama vyresnio amžiaus pacientams, kurių amžiaus vidurkis siekia 64 metus [9]. JAV centrinio smegenų navikų registro duomenimis GBM pikas fiksuojamas pacientams, kurių amžius svyruoja nuo 75 iki 84 metų [9]. Kiti autoriai nurodo, jog ligos pikas pasiekiamas tarp 55 – 60 metų amžiaus ligonių [62]. Taip pat nustatyta, jog didesnė GBM rizika pasireiškia vyrams nei moterims. Vieni autoriai nurodo, jog vyrų sergamumo dažnis yra 1,6 kartus didesnis nei moterims [9], kiti pateikia informaciją, kad vyrų sergamumo dažnio santykis lyginant su moterimis yra 1,26:1 [63]. GBM etiologija nesiejama su

gyvenimo būdo charakteristikomis tokiomis kaip: rūkymas, alkoholio, vaistinių preparatų vartojimas bei mityba, praturtinta N-nitrozo junginiais. Taip pat tyrimais nenustatyta mobiliųjų prietaisų naudojimo įtaka GBM atsiradimui [9].

GBM gydymas vis dar išlieka vienu didžiausiu iššūkiu klinikinėje onkologijoje [7]. Keletas faktorių: navikinių ląstelių rezistentiškumas standartiniam gydymui, ribota smegenų geba atsistatyti po padarytos žalos bei sudėtingas chemoterapinių vaistinių preparatų parinkimas, kurie pereitų kraujo – smegenų barjerą ir nesukeltų sisteminio nepageidaujamo poveikio, apsunkina GBM gydymą [8]. Chirurginis naviko pašalinimas, chemoterapija bei radioterapija šiuo metu yra pagrindinė taikoma terapija [7]. GBM lokaliai yra labai invazyvus navikas, todėl chirurginiu būdu negali būti visiškai pašalintas [8]. Dėl šios priežasties pacientų išgyvenamumo padidinimui kartu su chirurginiu gydymu taikoma radioterapija bei chemoterapija temozolamidu (TMZ) [9]. TMZ priklauso imidazotetrazino dariniams ir yra provaistas, kuris pagal veikimo mechanimą yra klasifikuojamas į alkilinančius priešvėžinius preparatus [7],[61],[64]. Pagrindiniai TZM nepageidaujami poveikiai yra hematologiniai (limfopenija, trombocitopenija, neutropenija ir leukopenija), hepatotoksiškumas (padidėjęs kepenų fermentų kiekis, hiperbilirubinemija, cholestazė ir hepatitas) ir kitos dažnai su chemoterapinių vaistų vartojimu susijusios nepageidaujamos reakcijos: alopecija, nuovargis, pykinimas, vėmimas, galvos skausmas, anoreksija, konstipacija ar diarėja ir kt. [64]

GBM gydymo veiksmingumui bei pacientų išgyvenamumui padidinti yra aktualu ieškoti inovatyvių ir efektyvių terapinių metodų, kurie galėtų papildyti šiuo metu taikomą terapiją [10]. Biologiškai aktyvūs junginiai, išskirti iš medicininių augalų, sulaukia vis daugiau dėmesio kaip potencialūs priešvėžiniai preparatai [4]. Pastaruoju metu atliekami tyrimai, analizuojantys skirtingų augalų rūšių poveikį įvairių vėžio tipų vystymosi prevencijai ir/arba gydymui [4],[65]. Vienas iš tokių medicininių augalų, kurių bioaktyvūs komponentai pasižymi priešvėžinėmis savybėmis, yra vaistinis skaistenis (Tanacetum parthenium L.) [20].

1.8. Žiurkių glioblastomos (C6) ląstelių linijos ypatybės

Šiomis dienomis eksperimentinėje neuroonkologijoje vis dar išlieka gyvūnų modelių poreikis, kad būtų tiksliai įvertintas inovatyvių metodų efektyvumas gydant piktybinius smegenų auglius [66]. Žiurkės yra vienos iš plačiausiai naudojamų eksperimentinių gyvūnų ir jų smegenų auglių modeliai pritaikomi moksliniams tikslams jau nuo XX a. 8 dešimtmečio [66]. Lyginant žiurkių smegenų auglio modelius su pelių modeliais pastebimi šie skirtumai: 1) žiurkių smegenys didesnės ( ̴ 1200 mg) nei

pelių ( ̴ 400mg) ir tai leidžia tikslesnę navikinių ląstelių implantaciją 2) žiurkėse susiformavęs didesnis smegenų auglys iki mirties suteikia galimybę skirti didesnes koncentracijas tiriamųjų terapinių junginių ir įvertinti jų efektyvumą 3) daugiau ir išsamenės mokslinės literatūros apie in vitro ir in vivo tyrimus atliktus su žiurkių augliais lyginant su pelių augliais [66].

C6 gliomos ląstelės gaunamos Wistar žiurkėms kartą per savaitę apie 8 mėnesius skiriant intraveninę N-metil-nitrozošlapalo injekciją. Kai žiurkėms pasireiškia neurologiniai požymiai, joms atliekama eutanazija ir susiformavęs auglys pašalinamas [66].

Histologiškai C6 glioma priklauso astrocitomoms bei yra sudaryta iš pleomorfinio tipo ląstelių su branduoliais, kurių forma būna įvairi: apvali arba pailga [66]. Atlikus molekulinę charakterizaciją, kurioje lyginta genų ekspresijos skirtumai tarp C6 gliomos ir iš žiurkių kamieninių ląstelių išskirtų astrocitų, buvo gauti rezultatai, kad genų ekspresijos skirtumai C6 ląstelių linijoje buvo labiausiai panašūs į žmogaus smegenų auglių skirtumus [67].

C6 žiurkių gliomos modelis plačiai taikomas eksperimentinėje neuroonkologijoje siekiant įvertinti chemoterapijos efektyvumą [68], toksinų poveikį [69], radiacinės terapijos [70] ir genų terapijos [71] veiksmingumą. Pagrindinis šio žiurkių modelio trūkumas – Wistar žiurkėse nustatytas imunogeniškumas C6 gliomai ir dėl šios priežasties jos negali būti naudojamos vertinant imunoterapijos efektyvumą [66]. Nepaisant šio apribojimo C6 gliomos modelis toliau naudojamas tyrimuose, kuriuose vertinama smegenų auglių biologija: naviko augimas, invazija, migracija, vaistinių medžiagų perėjimas per kraujo smegenų barjerą ir kiti procesai [72].

Šiame magistriniame darbe bus tiriama trijų skirtingų vaistinių skaistenių ištraukų įvairių polifenolinių junginių koncentracijų galimas citotoksinis poveikis žiurkių glioblastomos C6 ląstelėms po to, kai ankstesnių tyrimų Lietuvos sveikatos mokslų universiteto farmacijos fakultete buvo nustatytas T. parthenium etanolinės ištraukos antioksidacinis poveikis C6 ląstelių linijai.

2. DARBO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Ląstelių linija – tyrimuose naudotos žiurkių gliomos ląstelių linija C6 (C6, Cell Lines Service, Vokietija).

Tiriamosios medžiagos – vaistinių skaistenių žolė, įsigyta iš UAB vaistinės ,,Širdažolė‘‘. Ištraukų gamybai naudoti šie tirpikliai: išgrynintas vanduo, 10 proc. DMSO ir 40 proc. etanolis.

2.2. Reagentai ir aparatūra

Reagentai:

1) Ląstelių mitybinė terpė (Dulbecco‘s Modified Eagle Medium) (DMEM GlutaMAX, Gibco) 2) Fetalinis veršelio serumas (Fetal Bovine Serum, Gibco)

3) Sudėtinis penicilino – streptomicino tirpalas (P4333 Sigma-Aldrich) 4) Fosfatinis druskos buferis (PBS) (Sigma-Aldrich)

5) Tripsinas/EDTA (Sigma-Aldrich)

6) Tripano mėlio dažų tirpalas (0,4%) (Sigma-Aldrich)

7) Dažas 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas (MTT) (Sigma-Aldrich) 8) HBSS buferinė sistema (Hank‘s balanced salt solution) (Sigma-Aldrich)

9) Tirpiklis dimetilsulfoksidas (DMSO) (Sigma-Aldrich) 10) Propidžio jodidas (C27H34I2N4) (Sigma-Aldrich) 11) Bisbenzimido dažai (Hoechst 33342) (Sigma-Aldrich) 12) Vaistinių skaistenių žolė (UAB ,,Širdažolė‘‘)

13) Etanolis (C2H5OH) 96% (UAB ,,Stumbras’’) 14) Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (Sigma-Aldrich)

Aparatūra:

2) Laboratorinės analizinės svarstyklės (0,0001 tikslumo) HF-1200 GD, A&D Company; 3) Spektrofotometras - ,,UNICOM UV/VIS‘‘;

4) Mikroplokštelių spektrofotometras – Multiskan go (Thermo Scientific); 5) Fluorescencinis mikroskopas – OLYMPUS IX71S1F-3.

2.3. Vaistinių skaistenių ištraukų gamyba iš vaistinės augalinės žaliavos

Ištraukos gaminamos klasikinės maceracijos metodu, santykiu 1:5. Šio metodo privalumai – tai paprastas ir nebrangus ekstrakcijos metodas, kuris yra tinkamas termolabilių komponentų ekstrakcijai, o trūkumas – ilga ekstrakcijos trukmė [73].

Gaminamos trys vaistinių skaistenių ištraukos, kai kiekvienos tūris 5 ml. Skirtingų ištraukų gamybai imta po 1,0 g išdžiovintos vaistinių skaistenių žolės, kuri prieš tai susmulkinama. Vaistinė augalinė žaliava užpilama 8 ml vienu iš trijų skirtingų tirpiklių: išgrynintu vandeniu, 10 proc. dimetilsulfoksido (DMSO) tirpalu bei 40 proc. etanoliu, kurių kiekis apskaičiuojamas atsižvelgiant į žaliavos sugėrimo koeficientą.

Tirpiklių kiekis apskaičiuotas remiantis formule: X= V+M* Ks; kur:

X – tirpiklio kiekis, reikalingas ištraukai gaminti (ml); V – norimas pagaminti ištraukos kiekis (ml);

M – augalinės žaliavos masė (g);

Ks – sugėrimo koeficientas (minkštųjų augalų dalių – 3).

Ekstrakcijos tirpiklis yra vienas svarbiausių faktorių, lemiančių biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijos efektyvumą [74]. Dėl šios priežasties pasirinkti trys skirtingi tirpikliai, kad būtų įvertinta jų įtaka bendram fenolinių junginių kiekiui vaistinių skaistenių ištraukose bei citotoksiniam poveikiui C6 ląstelėms.

Ekstrahavimosi metu pagamintos ištraukos laikomos 7 dienas uždarame inde, kambario temperatūroje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių vietoje, kartkartėmis pamaišant. Praėjus šiam laikui gautos ištraukos filtruojamos per marlę, augalinė žaliava nuspaudžiama.

2.4. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin–Ciocalteu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis vandeninėje, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinėje vaistinių skaistenių ištraukose nustatytas pasitelkiant Folin–Ciocalteu reagentą ir spektrofotometrinį analizės metodą. Tai Europos farmakopėjoje 2.8.14 skyriuje aprašytas analizės metodas, taikomas farmakognozijoje [19],[75].

Analizei imta 799 µl išgrynintojo vandens ir po 1 µl tiriamosios T. parthenium ištraukos ir sumaišoma su 50 µl Folin-Ciocalteu reagentu, po 5-8 min. įpilama 150 µl Na2CO3 7,5 % vandeninio tirpalo. Po 30 min. matuojamas optinis tankis, esant 760 nm šviesos bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas 800 µl išgrynintas vanduo su 50 µl Folin-Ciocalteu reagentu ir 150 µl Na2CO3 7,5 % vandeniniu tirpalu. Kiekvienas mėginys iš skirtingų ištraukų matuojamas mažiausiai 3 kartus. Bendras fenolinių junginių kiekis yra išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GRE), remiantis NI biochemijos laboratorijoje esančia kalibracine kreive.

2.5. Ląstelių sėjimo metodika

Tyrimams atlikti buvo naudojama žiurkės smegenų auglio Glioblastoma multiforme C6 ląstelių kultūra. Ląstelės augintos flakonuose, auginimo terpėje, sudarytoje iš DMEM mitybinės terpės (Dulbecco‘s Modified Eagle‘s medium), FBS (fetalinio veršelio serumo) ir antibiotiko Penicilino/Streptomicino sudėtinio tirpalo (10000IU/ml – 10000 µg/ml). Ląstelės inkubuotos termostate, 37°C temperatūroje ir 5% CO2 atmosferai. Ląstelių atkėlimui nuo flakono pagrindo bei tarpląstelinėms jungtims suardyti buvo naudojamas 0,25% tripsino/EDTA tirpalas. Atšokusios ląstelės buvo centrifuguojamos 5 minutes 1500 apsisukimų per minutę greičiu. Ląstelės persėjamos kas 3-4 dienas.

2.6. Ląstelių tankio nustatymas

Gyvybingų ląstelių skaičiui ląstelių suspensijoje įvertinti buvo naudojamas hemocitometras (Marienfeld) ir 0,4% tripano mėlio dažų tirpalas. Į Eppendorf mėgintuvėlį pilama 20 µl ląstelių suspensijos ir sumaišoma su 20 µl tripano mėlio dažų. Šie dažai mėlynai nudažo ląstelių terpę bei negyvas ląsteles, bet neprasiskverbia pro gyvybingų ląstelių membranas, todėl yra matomos mėlyname fone. Tuomet dengiamasis stiklelis yra prispaudžiamas prie hemocitometro kameros, o į tarp jų esantį

tarpą įvedama 20 µl ląstelių suspensijos ir tripano mėlio mišinio. Stebima pro šviesinį mikroskopą ir skaičiuojamos sveikos ląstelės keturiuose langeliuose.

Norint apskaičiuoti ląstelių skaičių 1 ml taikoma ši formulė: X= (a+b+c+d)*4*2*5000, kur:

X – ląstelių skaičius 1 ml;

a, b, c, d – ląstelių skaičius 4 langeliuose; 2 – skiedimų skaičius;

5000 – konstanta.

2.7. Ląstelių gyvybingumo nustatymas MTT metodu

Šiame darbe MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido) metodo tikslas yra įvertinti tiriamų vaistinių skaistenių ištraukų citotoksinį poveikį žiurkių glioblastomos ląstelėms priklausomai nuo polifenolinių junginių koncentracijos. Tai kolorimetrinis analizės metodas, kuris pagrįstas C6 ląstelių metabolinio aktyvumo nustatymu. Šio testo metu įvyksta MTT geltonos spalvos dažo redukcija į violetinės spalvos formazano kristalus veikiant nuo NAD(P)H priklausomiems ląsteliniams oksidorektuzės fermentams (3pav.). Susidarę formazo kristalai yra ištirpinami DMSO ir koncentracija išmatuojama spektrofotometru: kuo intensyvesnė violetinė spalva, tuo didesnis ląstelių gyvybingumas ir atvirkščiai – kuo silpnesnis spalvos intensyvumas, tuo mažesnis ląstelių skaičius ir tiriamoji medžiaga pasižymi didesniu citotoksiniu poveikiu.

3 pav. Geltonos spalvos MTT veikiant mitochondrinei reduktazei redukuojasi į violetinės spalvos

Ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokštelę, kai viename šulinėlyje ląstelių skaičius siekė 20 000. Praėjus 24 valandoms į šulinėlius buvo dedamos tiriamosios medžiagos: skirtingus polifenolinių junginių kiekius turinčios vandeninė, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinė T. parthenium ištraukos. Praėjus dar 24 valandoms iš šulinėlių DMEM terpė buvo nupilta ir šulinėliai praplauti 200µl/šul. kambario temperatūros HBSS buferinės sistemos (Hank‘s balanced salt solution) tirpalu. Po praplovimo buvo įdėta 180µl/šul. HBSS tirpalo ir 20 µl/šul. geltonos spalvos MTT dažo mišinio, kuris dėl jautrumo šviesai turi būti apsaugotas nuo šviesos šaltinių. 96 šulinėlių plokštelė su ląstelėmis ir MTT dažais inkubuojamos 2 valandas termostate, o praėjus šiam laikui dažai pašalinami bei susidarę netirpūs formazano kristalai ištirpinami DMSO (100µl/šul.) ir plokštelė laikoma tamsoje dar apie 15 min. Absorbcija spektrofotometru išmatuota esant 550 nm bei 620 nm bangos ilgiams.

Gauti duomenys analizuojami Microsoft Office Excel 2010 programa. Su GraphPad Prism programa nustatomos tiriamų junginių efektyviosios koncentracijos, mažinančios 50 proc. ląstelių gyvybingumą (IC50).

2.8. Ląstelių gyvybingumo nustatymas propidžio jodido/ Hoechst 33342 metodu

Žiurkių glioblastomos C6 ląstelių gyvybingumas tiriant tris skirtingas T. parthenium ištraukas buvo taip pat įvertintas pasitelkiant propidžio jodido ir Hoechst 33342 metodą. Tai fluorescenciniai dažai, skirti ląstelių branduoliams dažyti. Propidžio jodidas negeba pereiti per ląstelių membranas, todėl naudojamas kaip negyvybingų (nekrozinių) ląstelių fluorescencinis indikatorius ir jas nudažo raudona spalva. Hoechst 33342 dažas geba pereiti per gyvybingų ląstelių membranas, todėl mėlyna spalva nudažo šių ląstelių branduolius.

Ląstelės buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokštelę (10 000 ląstelių viename šulinėlyje), praėjus 24 valandoms į juos buvo dedamos tiriamosios medžiagos: vandeninė, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinė T. parthenium ištraukos, turinčios skirtingą polifenolinių junginių kiekį (5, 10, 15, 17,5, 20, 22,5 ir 25 µg/µl). Praėjus 24 valandoms gyvybingos ir nekrozinės ląstelės fotografuotos, pasitelkiant fluorescencinį mikroskopą (OLYMPUS IX71S1F-3).

Gyvybingų ir negyvybingų ląstelių skaičius apskaičiuojamas, naudojant ImageJ programą. Procentinė gyvybingų ir negyvybingų (nekrotinių) ląstelių dalis nuo bendro ląstelių skaičiaus įvertinta, pasitelkiant Microsoft Office Excel 2010 programą. Naudojant GraphPad Prism programą nustatytos tiriamų junginių efektyviosios koncentracijos, mažinančios 50 proc. ląstelių gyvybingumą (IC50).

2.9. Ląstelių proliferacijos nustatymas

Trijų skirtingų T. parthenium ištraukų poveikis žiurkių glioblastomos ląstelių proliferacijai buvo įvertintas propidžio jodido/Hoechst 33342 metodu. Šiai eksperimentų serijai atlikti buvo pasirinktos tos T. parthenium vandeninės, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinės ištraukų polifenolinių junginių koncentracijos, kurios neinicijuoja C6 ląstelių žūties, bet turi tiesioginį poveikį jų dalijimuisi. Gauti rezultatai palyginti su kontrolinėmis grupėmis.

24 šulinėlių plokštelėje kiekviename šulinėlyje į 500 µl auginimo terpę buvo pasėta po 10 000 ląstelių. Praėjus 24 valandoms dedamos tiriamosios medžiagos: 0,25 µg/µl, 0,5 µg/µl, 1 µg/µl bei 1,5 µg/µl polifenolinių junginių turinčios vandeninė ir 10 proc. DMSO T. parthenium ištraukos bei 0,25 µg/µl, 0,5 µg/µl, 0,75 µg/µl ir 1 µg/µl polifenolinių junginių turinti 40 proc. etanolinė vaistinių skaistenių ištrauka. Skirtingais laiko tarpais (t=0, 24, 48 val.) fluorescenciniu mikroskopu (OLYMPUS IX71S1F-3) fotografuotos ląstelės, prieš tai jų branduolius nudažant fluorescenciniais propidžio jodido bei Hoechst 33342 dažais. Ląstelių kiekis skaičiuojamas, naudojant ImageJ programą, duomenys apdorojami Microsoft Office Excel 2010 programa.

2.10. Statistinė duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė buvo atlikta pasitelkiant SigmaPlot 14.0 versiją Windows OS (Systat Software Inc.). Gauti eksperimentų rezultatai pateikiami, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida. Skirtumas tarp dviejų reikšmių, kai p < 0,05 buvo priimtas, kaip statistiškai reikšmingas.

3. DARBO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas skirtingose T. parthenium

ištraukose

Fenoliniai junginiai – tai vieni iš plačiausiai aptinkamų augalų antrinių metabolitų [76]. Nors kiekybinį polifenolinių junginių nustatymą apriboja struktūros kompleksiškumas ir įvairovė, tačiau yra analizės metodų, kurie pritaikomi šių junginių įvertinimui augalų ekstraktuose [77]. Vienas tokių – kolorimetrinis Folin-Ciocalteu analizės metodas, kuris yra lengvai bei greitai atliekamas ir pritaikomas laboratorijos sąlygomis [76]. Polifenoliai junginiai, esantys augalų ekstraktuose, reaguoja su specifiniu reagentu (Folin-Ciocalteu) ir sudaro mėlynos spalvos kompleksą, kuris gali būti kiekybiškai įvertintas pasitelkiant matomos šviesos spektrofotometriją [76].

Pirmuoju tyrimu buvo siekiama nustatyti bendrą fenolinių junginių koncentraciją skirtingose T. parthenium ištraukose spektrofotometriniu Folin-Ciocalteu metodu, rezultatus išreiškiant galo rūgšties ekvivalentu (µg/µl).

4 pav. Fenolinių junginių kiekis skirtingose T. parthenium ištraukose (n=4)

Remiantis gautais rezultatais didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis yra 40 proc. etanolinėje ištraukoje (4233 µg/µl) ir tai yra 1,45 karto daugiau nei 10 proc. DMSO ištraukoje (2928 µg/µl) bei 2,7 karto daugiau nei vandeninėje T. parthenium ištraukoje (1564 µg/µl).

C. Wu ir kiti tyrė T. parthenium biologiškai aktyvius junginius bei Folin-Ciocalteu metodu nustatė, jog 80 % etanoliniame ekstrakte bendras fenolinių junginių kiekis siekia 21,21 ± 2,11 µg galo rūgšties ekvivalentu [35]. Taip pat D. Hanganu su kolegomis tirdami 70 % etanolinį T. parthenium ekstraktą nustatė, kad bendras polifenolinių junginių kiekis yra 3,48 ± 0,17/100 g galo rūgšties ekvivalentu [15].

E. N. Marete ir kitų mokslininkų atliktame tyrime buvo siekiama nustatyti, kokią įtaką ekstrakcijos temperatūra daro fenolinių junginių kiekiui T. parthenium vandeniniame ekstrakte [36]. Rezultatai parodė, kad didinant ekstrakcijos temperatūrą nuo 20°C iki 70°C fenolinių junginių kiekis statistiškai reikšmingai nepakito, tačiau nuo 75°C fenolinių junginių kiekis statistiškai reikšmingai padidėjo, o didžiausia polifenolinių junginių koncentracija (31 ± 1 mg/g galo rūgšties ekvivalentu) nustatyta, kai temperatūra siekė 100°C [36].

Lyginant su kitų mokslininkų paskelbtais duomenimis bei šiuose eksperimentuose gautais rezultatais pastebima, kad bendras fenolinių junginių kiekis ištraukose išekstrahuotas nedidelis. Taip galėjo nutikti dėl pasirinkto ištraukų gamybos metodo, nes klasikinės maceracijos trūkumas – mažas ekstrakcijos efektyvumas [73]. Taipogi atliktų eksperimentų rezultatai parodė, kad kambario temperatūroje ekstrahuotose T. parthenium ištraukose didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis yra etanolinėje, o mažiausias vandeninėje ištraukose.

3.2. MTT metodu nustatytas skirtingų T. parthenium ištraukų poveikis C6 ląstelių

gyvybingumui

Šiose eksperimentų serijose buvo siekiama nustatyti kaip trys skirtingos T. parthenium ištraukos (vandeninė, 10 proc. DMSO bei 40 proc. etanolinė) veikia C6 ląstelių kultūros gyvybingumą. Tyrimai, skirti ląstelių gyvybingumo įvertinimui, buvo atlikti MTT analizės metodu. Rezultatai pateikti 5, 6 bei 7 paveiksluose matuojant ląstelių gyvybingumą po 24 valandų.

5 pav. Vandeninės T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 val. (n=3),

*p<0.05 vs kontrolė

5 paveiksle pateikti vandeninės T. parthenium ištraukos poveikio ląstelių gyvybingumui rezultatai buvo lyginami su kontrole. Paveikus ląsteles 1 µg/µl – 5 µg/µl polifenolinių junginių koncentracijomis ląstelių gyvybingumas sumažėjo (84% - 47%). Dar didesnės polifenolinių junginių koncentracijos (10 µg/µl – 25 µg/µl) lyginant su kontrole C6 ląstelių gyvybingumą sumažino iki minimumo (16% - 5%).

C6 ląstelių gyvybingumą mažinančiu poveikiu taip pat pasižymi ir T. parthenium biologiškai aktyvus junginys - seskviterpeninis laktonas partenolidas [14]. A. Zanotto-Filho ir kiti tyrė partenolido poveikį glioblastomos (GBM) ląstelių linijoms C6 bei U138MG. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad 5 µM partenolido koncentracija C6 ląstelių gyvybingumą sumažino iki 80±12 %, o U138MG ląstelių gyvybingumą sumažino iki 91±5 %. Statistiškai reikšmingas ląstelių gyvybingumo sumažėjimas nustatytas esant 25 µM partenolido koncentracijai (C6 ląstelių gyvybingumas 54±5 %, o U138MG - 48±7 %) bei 50 µM koncentracijai (C6 ląstelių gyvybingumas sumažėjo iki 15±6 %, o U138MG ląstelių iki 19±4 %). Taip pat buvo apskaičiuotos IC50 vertės U138MG ląstelių linijai (22±5 %) bei C6 ląstelių linijai (29±6 %) [14].

6 pav. 10 proc. DMSO T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 val. (n=3),

*p<0.05 vs kontrolė

6 paveiksle pateiktuose tyrimo rezultatuose matoma, jog lyginant su kontrole, 1 µg/µl polifenolinių junginių koncentracija tik nežymiai sumažino C6 ląstelių gyvybingumą (88%). Didėjant polifenolinių junginių koncentracijai (3 µg/µl – 10 µg/µl) pastebimas statistiškai reikšmingas ląstelių gyvybingumo mažėjimas (72% – 16%). Ląsteles paveikus 15 µg/µl – 25 µg/µl polifenolinių junginių koncentracijomis gyvybingumas sumažėjo iki minimumo (8% - 4%).

W. Liu su kolegomis atliko tyrimą, kurio tikslas buvo ištirti vaistinio skaistenio biologiškai aktyvaus junginio partenolido poveikį žmogaus kasos vėžio Panc–1 ir BxPC3 ląstelių linijoms. Ląstelių gyvybingumo įvertinimui buvo pasirinktas MTT analizės metodas [78]. Mokslininkų gauti rezultatai parodė, kad partenolidas sumažina šių ląstelių linijų gyvybingumą priklausomai nuo koncentracijos bei inkubacijos trukmės. Lyginant su kontrole buvo nustatytas Panc–1 ląstelių gyvybingumas 93,2%, 79,7%, 36,9% ir 15,5% jas paveikus 24 val. atitinkamai 2,5, 5, 10 ir 15 μM partenolido koncentracijomis. Po 48 val. inkubacijos tokie patys partenolido kiekiai Panc–1 ląstelių gyvybingumą sumažino atitinkamai iki 88,7%, 73,7%, 21,9% ir 9,5%. Nustatytas BxPC3 ląstelių gyvybingumas po 24 val. paveikus jas 2,5, 5, 10, ir 15 μM partenolido koncentracijomis: 89,1%, 73,7%, 18,2% ir 9,3%, po 48 val. tie patys kiekiai gyvybingumą sumažino iki 83,1%, 60,1%, 13,2% bei 4,3%. Apskaičiuota IC50 vertė Panc–1 ląstelėms 9 µM bei 7,5 µM po 24 val. ir 48 val. Panašios IC50 vertės nustatytos BxPC3 ląstelėms 7,5 µM bei 6 µM po 24 val. ir 48 val. [78]

7 pav. 40 proc. etanolinės T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 val.

(n=3), *p<0.05 vs kontrolė

7 paveiksle pateikti etanolinės vaistinių skaistenių ištraukos poveikio gyvybingumui rezultatai buvo lyginti su kontrole. Grafike matyti, jog nedidelės polifenolinių junginių koncentracijos (1 µg/µl – 3 µg/µl) gyvybingumą sumažino (84% – 64%). Didėjant polifenolinių junginių koncentracijai (4 µg/µl – 5 µg/µl) ląstelių gyvybingumas mažėja (36% - 26%), o dar didesnės koncentracijos (10 µg/µl – 25 µg/µl) ląstelių gyvybingumą sumažino iki minimumo (10% – 5%).

Tyrimo rezultatai atskleidžia, kad skirtingų T. parthenium ištraukų įvairios polifenolinių junginių koncentracijos (1 µg/µl – 25 µg/µl) priklausomai nuo kiekio mažina C6 ląstelių gyvybingumą. Taip pat gauti rezultatai parodo, kad skirtingų ištraukų panašūs fenolinių junginių kiekiai statistiškai reikšmingo skirtumo C6 ląstelių kultūros gyvybingumui neturėjo.

Ląstelių gyvybingumas gali sumažėti ne tik dėl sumažėjusio ląstelių skaičiaus, taipogi šis poveikis gali įvykti dėl ląstelių metabolinio aktyvumo pokyčių bei dėl fitocheminių medžiagų, esančių augalinėse ištraukose, sąveikos su MTT dažais [79],[80]. Dėl to yra aktualu ląstelių gyvybingumą papildomai įvertinti propidžio jodido/Hoechst 33342 metodu.

3.3. Propidžio jodido/Hoechst 33342 metodu nustatytas T. parthenium ištraukų

poveikis C6 ląstelių gyvybingumui

Sekančiose eksperimentų serijose vertinome skirtingų vaistinių skaistenių ištraukų poveikį C6 ląstelių gyvybingumui pasitelkiant propidžio jodido ir Hoechst 33342 ląstelių dažymo metodiką. Citotoksinis T. parthenium ištraukose esančių polifenolinių junginių poveikis įvertintas nudažytus ląstelių branduolius fotografuojant fluorescenciniu mikroskopu.

8 pav. Pavyzdinės nuotraukos, vaizduojančios 10 proc. DMSO T. parthenium ištraukos citotoksinį

poveikį po 24 val. A nuotraukoje matomas 5 µg/µl polifenolinių junginių turinčios ištraukos poveikis C6 ląstelėms, B - ląstelių nuotrauka be fluorescencijos, C – 25 µg/µl polifenolinių junginių

turinčios ištraukos poveikis C6 ląstelėms, D – 25 µg/µl poveikis be fluorescencijos

Tyrimų rezultatai pateikti 9, 10 bei 11 paveiksluose vertinant gyvybingų ir negyvybingų ląstelių santykį po 24 valandų.

9 pav. Vandeninės T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 val.(n=3), *p<0,05 vs kontrolė

9 paveiksle pateikti duomenys apskaičiuoti gyvybingų ląstelių vidurkiu 6 fotografijose matomame lauke. Vandeninės T. parthenium ištraukos 5 µg/µl – 15 µg/µl polifenolinių junginių koncentracijos gyvybingų ląstelių skaičių sumažino atitinkamai (81% - 49%). 17,5 µg/µl polifenolinių junginių gyvybingų ląstelių skaičių sumažino daugiau nei 2,5 karto (36% gyvybingų ląstelių). Paveikus ląsteles 20 µg/µl – 25 µg/µl polifenolinių junginių koncentracijomis ląstelių gyvybingumas statistiškai reikšmingai sumažėjo nuo 31% iki 15%. Taip pat apskaičiuota vandeninės T. parthenium ištraukos IC50 – 13 ± 1,2 µg/µl.

G. Cheng ir L. Xie tyrė vaistinių skaistenių biologiškai aktyvaus komponento partenolido poveikį žmogaus šlapimo pūslės 5637 vėžinių ląstelių linijai in vitro [45]. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad partenolidas priklausomai nuo koncentracijos (2,5 µM -10 µM) ir laiko (24val. ir 48val.) mažina 5637 vėžinių ląstelių linijos gyvybingumą [45].

10 pav. 10 proc. DMSO T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 val.(n=3), *p<0,05 vs kontrolė

10 pav. matyti, kad 10 proc. DMSO T. parthenium ištraukos 5 µg/µl – 10 µg/µl polifenolinių junginių koncentracijos C6 ląstelių skaičių sumažino atitinkamai (85% - 75%). 15 µg/µl koncentracija ląstelių gyvybingumą sumažino 2 kartus (47%). Didėjant polifenolinių junginių kiekiui nuo 17,5 µg/µl iki 25 µg/µl, ląstelių gyvybingumas reikšmingai sumažėjo (41% - 12%). Apskaičiuota 10 proc. DMSO T. parthenium ištraukos IC50 reikšmė 14 ± 1,4 µg/µl.

Mokslininkai J. Sun bei kiti tyrė T. parthenium svarbiausio seskviterpeninio laktono partenolido priešvėžinį poveikį HepG2 žmogaus hepatoceliulinės karcinomos ląstelėms [49]. Gauti rezultatai parodė, kad priklausomai nuo partenolido koncentracijos (0, 2.5, 5, 10, 20 ir 40 µg/mL) po 48 val. HepG2 ląstelių gyvybingumas sumažėjo, apskaičiuota IC50 vertė 23,23 μg/mL bei IC10 – 1,78 μg/mL [49].

11 pav. 40 proc. etanolinės T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių gyvybingumui po 24 val.

(n=3), *p<0,05 vs kontrolė

11 pav. stebima, jog 40 proc. etanolinės T. parthenium ištraukos 5 µg/µl – 10 µg/µl polifenolinių junginių kiekiai ląstelių skaičių sumažino (79% - 51%). Daugiau nei per pusę ląstelių gyvybingumą sumažino 15 µg/µl polifenolinių junginių koncentracija (44%). Ląsteles paveikus didesnėmis koncentracijomis 17,5 µg/µl – 25 µg/µl gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo nuo 33% iki 2%. Apskaičiuota 40 proc. etanolinės vaistinių skaistenių ištraukos IC50 yra 10 ± 1,1 µg/µl.

Y.C. Liu ir kiti tyrė iš vaistinių skaistenių išskirto biologiškai aktyvaus komponento partenolido poveikį kolorektalinio vėžio SW620 ląstelių linijai [47]. Rezultatai parodė, partenolidas priklausomai nuo koncentracijos (0, 5, 10, 20 ir 40 µM) po 24 val. sumažina šių ląstelių gyvybingumą [47].

C6 ląstelių, paveiktų įvairiomis tirtų T. parthenium ištraukų polifenolinių junginių koncentracijomis, gyvybingumas buvo įvertintas dviem metodais: MTT bei propidžio jodido/ Hoechst 33342. Abiejų metodų rezultatai parodė, jog priklausomai nuo polifenolinių junginių koncentracijos C6 ląstelių gyvybingumas mažėja. Propidžio jodido/ Hoechst 33342 metodu apskaičiuotos IC50 reikšmės: vandeninės vaistinių skaistenių ištraukos IC50= 13 µg/µl, 10 proc. DMSO ištraukos IC50=14 µg/µl, 40 proc. etanolinės ištraukos IC50= 10 µg/µl. Vandeninės bei 10 proc. DMSO ištraukų

citotoksinis poveikis C6 ląstelių gyvybingumui statistiškai reikšmingai nesiskyrė, o 40 proc. etanolinės ištraukos poveikis buvo stipriausias bei statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kitų ištraukų (p < 0,05).

Ištyrus vaistinių skaistenių ištraukų poveikį C6 ląstelių gyvybingumui, yra aktualu nustatyti T. parthenium ištraukose esančių polifenolinių junginių poveikį C6 ląstelių proliferacijai.

3.4. Skirtingų T. parthenium ištraukų poveikis C6 ląstelių proliferacijai

Paskutinėse eksperimentų serijose vertinome vandeninės, 10 proc. DMSO ir 40 proc. etanolinės vaistinių skaistenių ištraukų poveikį C6 ląstelių proliferacijai fluorescencinės mikroskopijos metodu. Kaip ir ląstelių gyvybingumo nustatymui buvo naudojama propidžio jodido/ Hoechst 33342 ląstelių branduolių dažymo metodika. Tyrimui pasirinktos tos polifenolinių junginių koncentracijos, kurios nesukelia ląstelių žūties, tačiau daro įtaką jų dalijimuisi. Rezultatai pateikti 14 - 16 paveiksluose.

12 pav. Pavyzdinės C6 žiurkių glioblastomos ląstelių kontrolinės grupės nuotraukos, šviesinė

nuotrauka (kairėje) ir fluorescencinė nuotrauka (dešinėje)

ištraukos poveikį C6 ląstelėms po 24 valandų (A-kontrolė, B-0,25 µg/µl, C-0,5 µg/µl, D-1 µg/µl, E-1,5 µg/µl) ir po 48 valandų (F-kontrolė, G-0,25 µg/µl, H-0,5 µg/µl, I-1 µg/µl, J-E-1,5 µg/µl)

14 pav. Vandeninė T. parthenium ištraukos poveikis C6 ląstelių proliferacijai po 24 ir po 48

valandų inkubacijos, (n=3), *p<0,05 vs kontrolė

C6 ląsteles paveikus 0,25 µg/µl ir 0,5 µg/µl polifenolinių junginių koncentracija turinčia vandenine T. parthenium ištrauka po 48 valandų ląstelių skaičius sumažėjo atitinkamai 12% ir 20%. Didesnės polifenolinių junginių koncentracijos (1 µg/µl bei 1,5 µg/µl), lyginant su kontrole, ląstelių skaičių po 48 valandų inkubacijos sumažino 29% bei 35%.

Mokslininkas V. C. George ir kiti tyrė iš vaistinio skaistenio išskirto partenolido citotoksinį poveikį dviems ląstelių linijoms: HaCaT (imortalizuotiems žmogaus keratinocitams) bei A375 (melanomai) [81]. Buvo nustatyta, kad net mažos partenolido koncentracijos mažina šių ląstelių kultūrų gyvybingumą: IC50 vertė HaCaT ląstelėms apskaičiuota 1,45 µM, o IC50 vertė A375 ląstelėms 2,9 µM. Didžiausia tirta partenolido koncentracija 10 µM negyvybingų ląstelių skaičių padidino iki 82,32 ± 2,15 % HaCaT bei iki 89,90 ± 1,87 % A375 ląstelėms [81].