3. RISULTATI 2. MATERIALI E METODI 1. INTRODUZIONE ABSTRACT RIASSUNTO

RIASSUNTO

ABSTRACT

1. INTRODUZIONE

1.1. XENOPUS COME ORGANISMO MODELLO 10

1.2. PRIME FASI DELLO SVILUPPO 11

1.3. LA NEURULAZIONE 12

1.3.1. Compartimentazione del tubo neurale 13

1.4. REGIONALIZZAZIONE DELLA PIASTRA NEURALE ANTERIORE 15

1.5. MORFOGENESI DELL’OCCHIO 16

1.5.1. Il cristallino 18 1.5.2. La retina neurale 19

1.6. INDUZIONE E SPECIFICAZIONE DEL CAMPO MORFOGENETICO DELL’OCCHIO 21

1.6.1. I fattori di trascrizione specifici del campo dell’occhio 23

1.7. IL FATTORE DI TRASCRIZIONE RX 29

1.8. LA ZONA CILIARE MARGINALE 34

1.9. LA SPECIFICAZIONE DEL DESTINO RETINICO: COINVOLGIMENTO

DELL’ENDOMESODERMA ERRORE.IL SEGNALIBRO NON È DEFINITO.

1.10. SCOPO DELLA TESI 39

2. MATERIALI E METODI

2.1. TRASFORMAZIONE DI CELLULE DI E.COLI ED AMPLIFICAZIONE DEL DNA PLASMIDICO.

42

2.1.1. Vettori plasmidici 42 2.1.2. Cloni di ESTs 44

2.1.3. Preparazione di cellule competenti 45 2.1.4. Trasformazione batterica 46

2.1.5. Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina ("mini-prep”) 47

2.1.6. Estrazione di DNA plasmidico su media scala (“midi-prep”) mediante colonne NUCLEOBOND© AX-100 (Macherey-Nagel) 47

2.2. ELETTROFORESI SU GEL DI AGAROSIO 47

2.3. STIMA DELLA CONCENTRAZIONE DI DNA E RNA IN SOLUZIONE 49

2.4. DIGESTIONE DI DNA CON ENZIMI DI RESTRIZIONE E PURIFICAZIONE DI DNA 50

2.4.1. Digestione di DNA con enzimi di restrizione 50 2.4.2. Purificazione del DNA 50

2.5. TRASCRIZIONE IN VITRO DI UNA SONDA ANTISENSO E PURIFICAZIONE DI RNA 51

2.6. IBRIDAZIONE IN SITU SU EMBRIONI INTERI (WHOLE MOUNT) 52

2.6.1. Embrioni di Xenopus laevis 52

2.6.2. Microiniezione di embrioni di Xenopus laevis 54 2.6.3. Microdissezione di embrioni 55

2.6.4. Reazione cromogenica della β-galattosidasi 55

2.6.5. Ibridazione in situ su embrioni interi (whole mount) 56 2.6.6. Depigmentazione degli embrioni (“bleaching”) 60

2.7. IBRIDAZIONE IN SITU SU SEZIONI 61

2.7.1. Sezioni al criostato 61

2.7.2. Ibridazione in situ per sezioni al criostato 62

2.8. FOTOGRAFIE 64

2.9. STRUMENTI BIOINFORMATICI 64

3. RISULTATI

3.1. PREMESSA 66

3.2. IDENTIFICAZIONE DI POSSIBILI TRASCRITTI REGOLATI DA XRX1 66

3.3. PROGETTO DI LAVORO 67

3.4. ANALISI DELL’ESPRESSIONE DEI TRASCRITTI SELEZIONATI 67

3.5. STUDIO FUNZIONALE DELL’ESPRESSIONE DI XENF IN EMBRIONI INIETTATI CON XRX1

4. DISCUSSIONE

4.1. ANALISI CRITICA DEI RISULTATI OTTENUTI 88

4.2. CONCLUSIONI E SVILUPPI FUTURI 97