Kauno technologijos universitetas Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Cheminės technologijos fakultetas Farmacijos fakultetas
Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos
vystymas
Baigiamasis magistro projektas
Skirmantas Bieris
Projekto autorius
Prof. dr. Valdas Jakštas
Vadovas
Kauno technologijos universitetas Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Cheminės technologijos fakultetas Farmacijos fakultetas
Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos
vystymas
Baigiamasis magistro projektas
Medicininė chemija (6281CX001)
Skirmantas Bieris
Projekto autorius
Prof. dr. Valdas Jakštas
Vadovas
Dr. Mindaugas Liaudanskas
Recenzentas
Kauno technologijos universitetas Lietuvos sveikatos mokslų universitetas
Cheminės technologijos fakultetas Farmacijos fakultetas
Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos
vystymas
Akademinio sąžiningumo deklaracija
Patvirtinu, kad mano, Skirmanto Bierio, baigiamasis projektas tema „Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos vystymas“ yra parašytas visiškai savarankiškai ir visi pateikti duomenys ar tyrimų rezultatai yra teisingi ir gauti sąžiningai. Šiame darbe nei viena dalis nėra plagijuota nuo jokių spausdintinių ar internetinių šaltinių, visos kitų šaltinių tiesioginės ir netiesioginės citatos nurodytos literatūros nuorodose. Įstatymų nenumatytų piniginių sumų už šį darbą niekam nesu mokėjęs.
Aš suprantu, kad išaiškėjus nesąžiningumo faktui, man bus taikomos nuobaudos, remiantis Kauno technologijos universitete galiojančia tvarka.
Bieris, Skirmantas. Benzalkonio chlorido nustatymo ašarų skystyje metodikos vystymas. Baigiamasis magistro projektas / vadovas prof. dr. Valdas Jakštas; Kauno technologijos universitetas, Cheminės technologijos fakultetas; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas.
Studijų kryptis bei sritis: chemija, fiziniai mokslai.
Reikšminiai žodžiai: benzalkonio chloridas, ašarų skystis, Širmerio testo juostelės, sausų akių sindromas, glaukoma, metodo validavimas, ultraefektyvioji skysčių chromatografija, tandeminė masių spektrometrija.
Kaunas, 2019. 42 p.
Santrauka
Benzalkonio chloridas kaip biocidinis konservantas įeina į daugelio daugiadozių akių lašų sudėtį, dėl savo detergentinės prigimties dažnai sąlygodamas neigiamus padarinius akies audiniams, įskaitant sausų akių sindromą bei glaukomos pablogėjimą. Sunkiai prognozuojama farmakokinetika ir toksikologija, kartu su kitais veiksniais, lemia visuotinai bei rutiniškai taikomo šio junginio nustatymo akyje metodo nebuvimą. Šiuo darbu siekta sukurti validavimo kriterijus tenkinantį benzalkonio chlorido nustatymo gyvų subjektų ašarų skystyje metodą, apimantį ėminio surinkimą Širmerio testo juostelėmis, analitės perkėlimą į mėginius naudojant ekstrakciją organiniais tirpikliais ir mėginių analizę ultraefektyviąja skysčių chromatografija – tandemine masių spektrometrija. Gautieji metodikos tobulinimo rezultatai liudijo patikimą analitės ekstrakcijos efektyvumą, trumpą analizės trukmę, tinkamą glaudumą bei tiesiškumą kliniškai reikšmingų koncentracijų intervale. Tarp metodo trūkumų pažymėtinas aptiktas pašalinis analitę imituojantis signalas, dėl kurio sunkiai apibrėžiamos aptikimo bei nustatymo ribos, klinikinį pritaikymą taip pat komplikuoja nepatvirtintas ryšys tarp žinomos benzalkonio chlorido koncentracijos paciento vartojamuose akių lašuose ir nustatomos paciento ašarų skystyje. Apibendrinant, sukurtajam metodui reikalingas nuodugnesnis validavimas bei tolimesni klinikinio pritaikomumo tyrimai.
Bieris, Skirmantas. Development of Methodology to Determine Benzalkonium Chloride in Tear Fluid. Master‘s Final Degree Project / Supervisor prof. dr. Valdas Jakštas; Faculty of Chemical Technology, Kaunas University of Technology; Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Study Field and Area: Chemistry, Physical Sciences.
Keywords: Benzalkonium Chloride, Tear Fluid, Schirmer‘s Test Strips, Dry Eye Syndrome, Glaucoma, Method Validation, Ultra-High Performance Liquid Chromatography, Tandem Mass Spectrometry.
Kaunas, 2019. 42 p.
Summary
Benzalkonium chloride is used as a biocide preservative in majority of multidose eye drop formulations. Due to its detergent nature this compound can have deleterious consequences to eye tissues, including conditions such as dry eye syndrome or worsening of glaucoma. Complex and unpredictable pharmacokinetics and toxicology among other factors lead to absence of universally and routinely applied method to determine this substance in the eye. In this study we seeked to create the validation criteria meeting method to determine benzalkonium chloride in live subjects‘ tear fluid, comprising specimen collection by Schirmer‘s test strips, transfer of analyte to sample using extraction with organic solvents, and ultra-high performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry sample analysis. Methodology development results indicated reliable analyte extraction efficiency, rapidness of analysis, good precision, and suitable linearity for clinically relevant concentration range. However, some drawbacks were highlighted as well, such as analyte overlapping signal generation which in turn compromises the identification of analyte detection and quantification limits. In addition, clinical benefits of the method are elusive as no significant relationship between known concentrations of benzalkonium chloride in eye drops taken by patients and those determined in respective tear fluid samples was found. In conclusion, the developed method needs more thorough validation and further research for clinical applicability.
Turinys
Lentelių sąrašas...6
Paveikslų sąrašas...7
Santrumpų sąrašas...8
Įvadas...9
1. Literatūros apžvalga...10
1.1. Benzalkonio chlorido baktericidinio veikimo kinetika...10
1.2. Ašarų plėvelės ypatybės bei Širmerio juostelių naudojimas...12
1.3. Benzalkonijaus chlorido vartojimo oftalmologijoje problematika...12
1.3.1. Sąryšis su glaukoma...14
1.3.2. Prevencinės priemonės...15
1.4. Metodo parametrų validavimas...16
1.4.1. Validaciniai parametrai...16
1.4.2. Validuoti benzalkonio chlorido nustatymo metodai...17
2. Medžiagos ir tyrimų metodai...20
2.1. Tyrimo organizavimas...20
2.2. Tyrimo medžiagos...20
2.3. Tyrimo metodai...20
2.3.1. Ėminių surinkimas...20
2.3.2. Benzalkonio chlorido ekstrakcija iš ėminių į tiriamuosius mėginius...21
2.3.3. Mėginių chromatografinė-masių spektrometrinė analizė...22
2.4. Duomenų analizė...25
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas...26
3.1. Ėminio surinkimo problematika...26
3.2. Optimalios terpės mėginių analizei parinkimas...26
3.3. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas...28
3.4. Poekstrakcinės kalibracinės kreivės parametrai...29
3.5. Aptikimo bei nustatymo riba ir benzalkonio chloridas Širmerio juostelėse...30
3.6. Benzalkonio chlorido kiekis pacientų ašarų skysčio ėminiuose...32
3.6.1. Priklausomybė nuo surenkamo ėminio tūrio...32
3.6.2. Konservuotų akių lašų vartojimo įtaka...33
3.6.3. Ryšys su ašarų plėvelės stabilumu...34
3.6.4. Skirtumai tarp 12C ir 14C homologų kiekių tapačiuose ėminiuose...34
Išvados...36
6
Lentelių sąrašas
1 lentelė.12C BAC homologo ekstrakcijos rezultatų glaudumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių (n=7-26)
7
Paveikslų sąrašas
1 pav. Benzalkonio chlorido molekulės struktūra 2 pav. Širmerio testo juostelės
3 pav. Elmasonic P ultragarso vonelė
4 pav. Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografas (kairėje) ir Xevo TQD masių spektrometras
(dešinėje)
5 pav. Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm chromatografinė kolonėlė
6 pav. UESC-MS/MS MRM režimu gaunamos atskirų BAC homologų chromatogramos
7 pav. UESC-MS/MS 12C BAC homologo koncentracijos - detektoriaus signalo intensyvumo tiesinės
priklausomybės kalibracinės kreivės, tirpikliais naudojant metanolį, acetonitrilą ir acetoną
8 pav. 12C BAC homologo ekstrakcijos efektyvumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių
9 pav. 12C BAC homologo mėginių, gautų po pritaikytos ekstrakcijos metodikos, UESC-MS/MS
kalibracinė kreivė
10 pav. 12C BAC homologo mėginių, kurių koncentracijų vertės artimos nustatymo ribai,
UESC-MS/MS kalibracinė kreivė
11 pav. 14C BAC homologo kiekio tiesinė priklausomybė nuo ašarų skysčio nueito kelio Širmerio
juostelėje
12 pav. Ryšys tarp vartojamuose akių lašuose esančios BAC koncentracijos ir ašarų skystyje
aptinkamo 14C BAC homologo kiekio
13 pav. BAC 12C ir 14C homologų kiekių palyginimas tarp skirtingų tiriamųjų objektų ašarų skysčio
8
Santrumpų sąrašas
AcN - acetonitrilas
BAC – benzalkonio chloridas ESI – elektropurkštuvinė jonizacija
MS/MS – tandeminė masių spektrometrija EtAc – etilacetatas
MeOH - metanolis
MRM – daugialypių reakcijų stebėjimas ONP - orto-nitrofenolis
ONPG - orto-nitrofenil-β-galaktozidas SSN – santykinis standartinis nuokrypis
9
Įvadas
Konservantai yra svarbi daugiadozių oftalmologinių akių lašų preparatų pagalbinių medžiagų grupė [1;2]. Nuo XX a. 5-ojo dešimtmečio dažniausiai šiam tikslui naudojamas benzalkonio chloridas, įeinantis į 70 % šiandien rinkoje esančių daugkartinio vartojimo akių lašų sudėtį [3]. Paskutinius keletą dešimtmečių daugėja duomenų apie tokių konservuotų preparatų klinikinę žalą akims [4], o dažnas reguliaraus jų vartojimo rezultatas – akies paviršiaus sutrikimas, apimantis akies paviršiaus sausumą bei glaukomą – siejamas su neigiamu benzalkonio chlorido poveikiu [5]. Klinikinės oftalmologijos požiūriu šis detergentinės cheminės prigimties biocidas yra vertingas kaip užkertantis kelią akies infekcijoms plisti [6]. Vis dėlto, pakartotinai vartojamas ir besikaupdamas ašarų skystyje, rageną dengiančioje ašarų plėvelėje bei giliuosiuose akies audiniuose ilgalaikėje perspektyvoje lemia neigiamus histologinius, fiziologinius ir molekulinius šių akies struktūrų pokyčius [6].
Bioanalitinio metodo tobulinimas yra sudėtingas ir daugiapakopis procesas, iš analitiko neretai reikalaujantis griežto atidumo detalėms bei inovatyvių sprendimų. Dažniausiai pagrindiniu iššūkiu šioje srityje tampa optimalių validacinių parametrų, atitinkančių normatyvinius teisinius kriterijus, parinkimas [7]. Nepaisant neginčijamų benzalkonio chlorido neigiamo poveikio akims įrodymų, tikslus bei kliniškai reikšmingas šio junginio kiekio gyvų subjektų akyse įvertinimas yra sudėtinga užduotis dėl jo paviršinio aktyvumo savybių, sunkiai prognozuojamo pasiskirstymo tarp minėtų akies anatominių skyrių bei prasiskiedimo ašarose po preparato įlašinimo [6;8]. Todėl iki šiol nėra sukurta vieningo rutininiams tyrimams pritaikyto šio akių lašų konservanto nustatymo ašarų skystyje metodo. Šio projekto tikslas buvo sukurti akių ligų pacientų gydymo stebėsenai tinkamą ultraefektyviosios skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos metodiką benzalkonio chloridui nustatyti ašarų skystyje.
Darbo uždaviniai:
1) parinkti akių ligų pacientų gydymo stebėsenai tinkamas tyrimo sąlygas patikimam benzalkonio chlorido perkėlimui iš pacientų ašarų skysčio į tiriamuosius mėginius;
2) patikrinti kuriamos ultraefektyviosios skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos metodikos pagrindinių validacinių parametrų atitikimą normatyviniams kriterijams;
3) nustatyti benzalkonio chlorido kiekį ir jo varijavimą akių ligų pacientų ašarų skysčiuose ir susieti jį su vartotuose akių lašuose esančia šio junginio koncentracija.
10
1. Literatūros apžvalga
1.1. Benzalkonio chlorido baktericidinio veikimo kinetika
Ketvirtinio amonio junginiai yra katijoniniai surfaktantai, dažniausiai naudojami kaip vietiniai baktericidiniai preparatai [9]. Jų veikimo principas pagrįstas bakterijų membranų pažeidimu ir suardymu, kas ilgainiui sąlygoja Gram teigiamų bei Gram neigiamų ląstelių lizę [10]. Nors ketvirtinio amonio dariniai paplitę jau nuo praėjusio amžiaus 4-ojo dešimtmečio, paskutiniu metu jų plačiu naudojimu buvo susirūpinta dėl galimo jų indėlio į patogenų atsparumo antibiotikams didėjimą [11]. Žinomiausias šios klasės atstovas – benzalkonio chloridas (BAC), aromatinį žiedą α-padėtyje ketvirtinio azoto atomo atžvilgiu turintis junginys, kurio skirtingų atmainų struktūra skiriasi tik alkilinio pakaito metilo grupių skaičiumi (n=8,10,12,14,16,18) (1 pav.). BAC antibakterinį aktyvumą, manoma, lemia jo molekulės cheminė struktūra: teigiamo krūvio ketvirtinis azotas asocijuojasi su membranos fosfolipidų „galvutės“ neigiama grupe, o nepolinė dalis įsiterpia tarp hidrofobinių „uodegėlių“, sudarydama laikinas micelines struktūras bei sukeldama membranos integraliųjų baltymų disociaciją ir denatūraciją – visa tai hipotetiškai sąlygoja membranų permeabilizavimą [12;13].
1 pav. Benzalkonio chlorido molekulės struktūra
Monrealio universiteto tyrėjų grupė detaliai kiekybiškai nustatė minimalios slopinančios arba mažesnės koncentracijos BAC ilgalaikį poveikį gyvų Gram neigiamų bakterijų membranų laidumui, siekdami patikrinti prielaidą apie BAC sukeliamą bakterijų rezistentiškumo antibiotikams atsiradimą ir atskleisti jo mechanizmus [14]. Escherichia coli membranų permeabilizavimo kinetikai apibrėžti buvo pasitelktas spektrofotometrinis metodas. Jo principas remiasi konstitutyviai išreikšto citoplazmos
11 fermento β-galaktozidazės (LacZ) bei periplazminės ertmės fermento β-laktamazės aktyvumo nustatymu optiškai matuojant eksperimentiškai pridėto jų substrato orto-nitrofenil-β-galaktozido (ONPG) ir produkto orto-nitrofenolio (ONP) koncentracijas bei jų santykio kitimą mėginyje. Visa tai buvo vykdoma esant trims skirtingoms sąlygoms: kontrolinėms (tik ląstelės ir ONPG), pridėjus BAC ir lizavus ląsteles. Šios atitinkamai reiškia 0 %, X % (naudotos skirtingos BAC koncentracijos) bei 100 % memebranų pralaidumą. Išmatuotas LacZ katalizuojamos reakcijos (ONPG hidrolizės į ONP) greitis visose trijose būsenose bei apskaičiuojamas jų santykis tiesiogiai atspindi membranų permeabilizavimo lygį [14].
Remiantis šios fermentinės reakcijos kinetikos rezultatais, pirmiausiai buvo nustatyta, jog E.coli membranų laidumas žymiai išauga dar esant mažesnei negu minimali slopinanti BAC koncentracijai [14]. Tai gali turėti įtakos atsparesnių antibiotikams bakterijų klonų atrankai. Taip pat svarbus atradimas buvo tai, kad membranų laidumo priklausomybės nuo BAC koncentracijos grafike išryškėja dvi lenktos kreivės su dviem aiškiai išreikštomis pusinėmis efektyviomis koncentracijomis (EC50). Tai
rodo dvifazę dozės-atsako ryšio funkciją, kas liudija esant dviejų atskirų žingsnių procesą. Pirmoji EC50 reikšmė lygi apie 30 µg/ml, yra mažesnė negu žinoma minimali slopinanti koncentracija (45
µg/ml) ir atitinka minimalią BAC kocentraciją, reikalingą sukelti reikšmingą ONPG hidrolizę – reakcijos greičių santykis didėja nuo 20 µg/ml BAC koncentracijos iki šiai pasiekiant apytikslę 40 µg/ml ribą, nuo kurios prasideda plato fazė [14]. Koncentracijai didėjant nuo 50 µg/ml, prasideda antroji membranų permeabilizavimo fazė su antrosiomis EC50 reikšmėmis, kurios, skirtingai nuo
pirmosios fazės, reikšmingai tiesiogiai proporcingai varijuoja priklausomai nuo bakterijų populiacijos tankio, tačiau visais atvejais reakcijos greičių santykis pasiekia arba beveik pasiekia 100 % [14]. Tai atspindi visišką išorinės bei vidinės membranų vientisumo praradimą ir neribojamą substrato patekimą ant citoplazmos LacZ aktyviojo centro.
Siekiant patikrinti hipotezę, jog pirmoji membranų permeabilizavimo fazė ir pirmoji EC50 reikšmė
yra susijusi su bakterijų išorinės membranos laidumo didėjimu, buvo taikytas hidrofobinis fluorescuojantis zondas 1-N-fenilnaftilaminas (NPN) [14]. Šis junginys fluorescuoja tik hidrofobinėje aplinkoje, pvz., įsiterpęs į fosfolipidų dvisluoksnio vidų, todėl šiame tyrime yra tinkamas išorinės membranos integralumo indikatorius. Matuotas fluorescencijos intensyvumas esant skirtingoms BAC koncentracijoms bei skirtingam bakterijų tankiui mėginyje, pridėjus NPN. Gauti rezultatai rodo tiesioginę fluorescencijos intensyvumo priklausomybę nuo BAC koncentracijos, o fluorescencijos didėjimo pradžia sutampa su pirmąja EC50 (~30 µg/ml). Taip pat svarbu paminėti tai, jog neaptiktas
bakterijų tankio ir fluorescencijos ryšys, t. y. ši priklausė tik nuo BAC koncentracijos, kaip ir pirmosios permeabilizavimo fazės metu [14]. Išanalizavus šiuos duomenis peršasi išvada, kad pirmoji fazė bei pirmoji EC50 atitinka išorinės membranos struktūrinį pažeidimą ir padidėjusį jos laidumą.
12 Norint įvertinti įvairių subletalių BAC koncentracijų poveikį plazminių membranų laidumui, taip pat buvo nepertraukiamu principu matuojama LacZ vykdomos reakcijos produkto ONP koncentracija esant skirtingoms BAC koncentracijoms ir vienodai ląstelių populiacijai. Gautos fermentinės katalizės kreivės rodo, kad net ir labai mažos BAC koncentracijos gali visiškai panaikinti membranų vientisumą – skiriasi tik laikas, per kurį tai įvyksta [14].
Apibendrinant, galima padaryti kelias kliniškai reikšmingas išvadas. Pirma, gyvų ląstelių membraninis laidumas pasireiškia jas paveikus ir mažesnėmis už minimalią slopinančiąją BAC koncentracijomis. Antra, E.Coli membranų permeabilizavimo procesui būdinga dviejų fazių kinetika su dviejomis aiškiai išreikštomis EC50 reikšmėmis, atitinkančiomis išorinės ir vidinės membranų
vientisumo pažeidimus. Trečia, mažesnės už minimalią slopinančią BAC koncentracijos, veikdamos ląstelių membranas, ilgainiui sąlygoja visišką jų permeabilizavimą.
1.2. Ašarų plėvelės ypatybės bei Širmerio juostelių naudojimas
Ašarų plėvelė yra labai svarbus akies dengiamasis darinys, saugantis rageną ir junginę nuo išsausėjimo bei pažeidimo. Ją apima trys sluoksniai: apatinis mukozinis, sudarytas daugiausiai iš epitelinių ląstelių išskiriamų glikoproteinų; vidurinis vandens, palaikomas ašarų liaukų išskiriamo vandeningo skysčio; išorinis lipofilinis, sudarytas iš vidinėje voko dalyje išsidėsčiusių Meibomo liaukų gaminamo riebalinio sekreto [6]. Manoma, kad būtent išorinio sluoksnio vientisumo pažeidimas sukelia sausų akių sindromą [15].
Širmerio testo juostelių panaudojimas jau yra išbandytas ašarų skysčio ėminių surinkimui iš akių, o šiuo metodu iš juostelių gauti ekstraktai buvo naudojami tirti akies proteomo pokyčius esant sausų akių sindromui. Minėtame darbe buvo sėkmingai vykdoma dvikryptė elektroforezė ir nustatomi atskiri baltymai skysčių chromatografijos – elektropurkštuvinės jonizacijos tandeminės masių spektrometrijos analize [16]. Analogiška ašarų skysčio ėminio gavimo technika buvo taikyta kitame darbe, kurio metu iš Širmerio juostelių ekstrakcijos polisorbato 20 PBS tirpalu būdu buvo gaunami akies skysčio mėginiai imunofermentiniams baltymo mucino 5AC tyrimams esant sausų akių sindromui [17].
1.3. Benzalkonio chlorido vartojimo oftalmologijoje problematika
Akių lašų konservantai yra būtina priemonė neleisti plisti bakterinei, grybelinei ar amebinei
infekcijai akyje. Nepaisant to, egzistuoja ir neigiamas šalutinis tokių konservantų poveikis akies paviršiaus audiniams. Viena dažniausiai naudojamų šios klasės medžiagų – detergentas BAC, pasižymėdamas plataus spektro antimikrobinėmis savybėmis, ne tik greitai bei efektyviai naikina bakterijas ar kitas svetimas organizmui ląsteles, tačiau yra linkęs kauptis ragenos epitelyje
13 citotoksiškai veikdamas ir jį sudarančias eukariotines ląsteles. Dėl tų pačių savybių jis kaupiasi daugelyje akies audinių, pažeidžia lipofilinio ašarų plėvelės sluoksnio vientisumą sukeldamas sausų akių sindromą, o ilgalaikis akių lašų su BAC vartojimas ilgainiui sąlygoja lėtinį uždegimo procesą [18]. Vaistuose nuo glaukomos BAC koncentracija svyruoja tarp 0,004 ir 0,05 %, proapoptotinis poveikis paviršiniams akies audiniams pastebėtas jau nuo 0,01 %, o nekrozę galimai sukelia didesnė kaip 0,05 % BAC koncentracija [18].
Triušių akis veikiant hiperosmosiniu BAC tirpalu vieną mėnesį, jų trabekuliniame tinkle, rainelėje bei lęšiuko kapsulėje po ekstrakcijos acetonitrilu skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodu buvo aptikti reikšmingi BAC kiekiai. Tai įrodo BAC kaip surfaktanto didelės skvarbos ir kumuliacines savybes [19]. Tyrimais patvirtinta, kad kasdien vietiškai vartojamas 0,1 % koncentracijos BAC tirpalas lemia stabilų sausų akių sindromą, kuris užsilaiko dar kelias savaites nutraukus akių lašų vartojimą, o genų pašalinimo studijos su triušiais įrodė apsauginę mucino svarbą – šiam nesant, minėtas sindromas išsilaiko kelis mėnesius [20].
Rath su bendradarbiais visai neseniai siekė patikrinti, ar egzistuoja koks nors sinergistinis ar antagonistinis vietinio vartojimo akių lašų aktyviųjų medžiagų, vartojamų kartu su BAC, neigiamas poveikis labiausiai pažeidžiamų tokiais atvejais akies dengiamųjų audinių ląstelėms [21]. Šiam tikslui jie panaudojo in vitro žmogaus Meibomo liaukos epitelio ląstelių kultūrą, veikdami šią BAC konservuotais prostaglandino analogais bimatoprostu, travoprostu bei latanoprostu, arba tik šiais priešglaukominiais preparatais, arba tik BAC, ir matuodami ląstelių gyvybingumą, morfologiją bei proliferaciją. Remiantis tyrimo rezultatais, ląstelių proliferacija mažėja jau nuo 0,1 µg/ml ir didesnės BAC koncentracijos, o šiai pasiekus 50 µg/ml ribą, prasideda staigūs ląstelių morfologijos pokyčiai bei gyvybingumo kritimas, tuo tarpu kartu su BAC esančios minėtos aktyviosios vaistų medžiagos sustiprina šį kenksmingą poveikį, pačios neturėdamos jokio reikšmingo efekto. Taigi, galima teigti, jog BAC pasižymi citotoksiniu poveikiu Meibomo liaukos epiteliui, o prostaglandino analogai sinergistiniu principu prisideda prie BAC toksiškumo [21].
Tyrimų su laboratorinėmis pelėmis in vivo duomenys rodo, jog pakartotinai į akis lašinamas BAC tirpalas tiesiogiai sutrikdo ragenos epitelio vientisumą, sukelia ragenos edemą ir drumstumą, kaip apsauginę reakciją iššaukia naujų kapiliarų tinklų susidarymą bei reikšmingai padidėjusį citokinų skaičių ragenoje [22]. Šie padariniai tiesiogiai priklauso nuo BAC koncentracijos.
Nors BAC vartojimas oftalmologijos praktikoje siejamas su daugeliu kliniškai reikšmingų pasekmių, įskaitant sausų akių sindromą, trabekulinio tinklo degeneraciją ir glaukomą, tikslus biocheminis šio akių lašų konservanto poveikis nėra tiksliai žinomas. Siekdami tai išsiaiškinti, prancūzų mokslininkai pasitelkė mitochondrijų kvėpavimo bei ATP sintezės greičio ir ląstelių gyvybingumo matavimo priemones žmogaus ragenos epitelio pirminių ląstelių bei žmogaus
14 trabekulinio tinklo ląstelių kultūroms prieš ir po tiesioginio poveikio skirtingų koncentracijų BAC tirpalais [23]. Gauti rezultatai liudija akivaizdų BAC toksiškumą akies audinių ląstelių mitochondrijų funkcijoms: priklausomai nuo koncentracijos sumažėja O2 suvartojimo ir ATP sintezės greitis
tiesiogiai slopinant I elektronų pernašos grandinės kompleksą NADH-ubikvinono oksidoreduktazę, taip pat reikšmingai padaugėja apoptozės atvejų, o visa tai vyksta ląstelių kultūras veikiant nuo keliskart iki keliasdešimtkart mažesnėmis BAC koncentracijomis negu randamomis farmakologiniuose akių lašuose [23]. Šis tyrimas pakloja naujus pamatus BAC klinikinio kenksmingumo akims tikslių molekulinių mechanizmų atskleidimui.
1.3.1. Sąryšis su glaukoma
Glaukomos terminas apima grupę progresuojančių degeneracinių optinių neuropatijų, kurios kartu sudėjus užima antrą vietą tarp aklumą sukeliančių veiksnių pasaulyje, o šios ligos diagnozuotumas net ir išsivysčiusiose šalyse išlieka sąlyginai mažas (~50 %). Pagrindinis glaukomos gydymo strateginis uždavinys – akies priekinės kameros skysčio spaudimo (akispūdžio) mažinimas vartojant akių lašus su prostaglandino analogais, gerinančiais skysčio ištekėjimą iš kameros, arba beta-adrenerginių receptorių antagonistais, slopinančiais paties skysčio gamybą krumplyno epitelyje [24].
BAC poveikis akiai siejamas su uždegiminių ląstelių skaičiaus junginėje didėjimu (konjunktyvitu), tačiau taip pat šis junginys pasižymi savybe ardyti ragenos epitelio tarpląstelines jungtis bei taip pagerinti vaistų prasiskverbimą į priekinę akies kamerą [24]. Yra pakankamai klinikinių duomenų, rodančių ekvivalentišką vaistų nuo glaukomos su BAC ir be BAC terapinį akispūdžio mažinimo efektyvumą [25;26;27]. Eksperimentiniai duomenys pabrėžia ilgalaikį kumuliacinį BAC poveikio pobūdį ir šio sorbciją ant akies audinių paviršinio ląstelių sluoksnio, taip pat pastebima ir BAC neigiamo poveikio priklausomybė nuo farmakologinio preparato, su kuriuo kartu jis vartojamas [28]. BAC molekulių sankaupos aptinkamos ragenoje, lęšyje, junginėje, rainelėje, krumplyno raumenų epitelyje bei trabekuliniame tinkle [29;30;31]. Lygiai kaip glaukomos atveju žalojamas trabekulinis tinklas kylant jo uždegimui, žmogaus junginės bei ragenos epitelio ląsteles veikiant BAC analogiškai mažėja ląstelių gyvybingumas, pasireiškia oksidacinis stresas ir apoptozė [32;33]. Tas pats pasakytina ir apie BAC poveikį trabekulinio tinklo ląstelėms, tuo tarpu poveikis krumplyno raumens epiteliui kur kas mažiau išreikštas, tad galima daryti prielaidą, jog BAC blogina glaukomos simptomus ne didindamas priekinės kameros skysčio gamybą, o sunkindamas jo nutekėjimą per trabekulinį tinklą [24]. Nustačius, kad beta-blokatoriai vieni nesukelia apoptotinio atsako trabekulinio tinklo ląstelių kultūrose, apoptozės žymenys aptikti tose pačiose kultūrose jas paveikus priešglaukominiais vaistais [32].
15 BAC polinkis kauptis giliuosiuose akies audiniuose, ypač trabekuliniame tinkle, ir jo oksidacinis, uždegimą bei apoptozę skatinantys poveikiai trabekulinio tinklo ląstelėms in vivo, o taip pat in vitro ląstelių kultūroms, suponuoja paradoksalią prielaidą, kad BAC konservuotos akių lašų nuo glaukomos formuluotės gali pabloginti skysčio nutekėjimą iš vidinės kameros ir pasunkinti atviro kampo glaukomos simptomus [34].
Nagrinėjant naujos kartos tridimensį pirminių žmogaus trabekulinio tinklo ląstelių kultūros modelį nustatyta, jog šiose ląstelėse, pridėjus 0,001 % koncentracijos BAC į kultūros terpę, padidėja uždegimo žymenų interleukino-6 (IL-6) ir interleukino-8 (IL-8) genų raiška, taip pat pastebima suaktyvėjanti galimai apoptozėje dalyvaujančio fermento matrikso metaloproteinazės (MMP-9) biosintezė [35]. Tai patvirtina vis dažniau oftalmologijos akdeminiuose ir klinikiniuose sluoksniuose keliamas hipotezes apie uždegimą skatinantį bei proapoptotinį BAC poveikį šiam akies audiniui, laikomam kertiniu ilgalaikiame glaukomos gydyme.
1.3.2. Prevencinės priemonės
Šiuo metu jau yra apstu moksliniais tyrimais paremtų bei klinikinių įrodymų, kad ilgalaikis vietinis chroninės glaukomos ir sausų akių sindromo gydymas BAC konservuotais akių lašais pasižymi dvejopu poveikiu - greta aktyviosios medžiagos lemiamo terapinio taip pat sukelia mažesnį ar didesnį BAC sąlygojamą ragenos ir junginės epitelį pažeidžiantį efektą. Dėl šios priežasties, o taip pat nuolat didėjančių pasaulinių glaukomos epidemiologinių rodiklių, vis svarbesniais strateginiais vektoriais oftalmologijoje tampa naujų konservantų įdiegimas, vaistų formų be konservantų kūrimas bei alternatyvių ne lašų formos vaistinių aktyviųjų medžiagų pristatymo sistemų, išvengiant tiesioginio BAC patekimo ant akies paviršių, vystymas [36].
Kadangi apie 70 % daugkartinio vartojimo akių lašų sudėtyje randamas BAC, dėl jo tyrimais patvirtinto toksiškumo akims ieškoma sprendimo, kaip palaikyti sterilumą vaistų buteliukuose, tuo pačiu metu užkertant kelią BAC patekimui į pacientų akių audinius. Floridos universiteto mokslininkai šiam tikslui sukūrė specialų buteliukuose montuojamą iš 2-hidroksietil metakrilato polimero pagamintą filtrą, selektyviai nepraleidžiantį beveik 100 % akių lašuose esančio BAC, tuo tarpu tik minimaliai pakeičiantį aktyviųjų vaistų medžiagų koncentracijas į akį patenkančiame laše [37]. Tai ilgainiui gali tapti perspektyvia technologija, padėsiančia daugybei vaistus nuo glaukomos ar sausų akių sindromo vartojančių žmonių.
2015 m. buvo atliktas tyrimas, kurio rezultatai formuoja neginčijamą išvadą, kad manitolis iš dalies apsaugo akies ragenos epitelį nuo kenksmingo BAC poveikio [38]. Jo metu parodyta, jog žmogaus ragenos epitelio ląstelių liniją (HCE-T) paveikus 0,005 % BAC tirpalu su 0,5 % manitolio, ląstelių
16 gyvybingumas ilgainiui išlieka didesnis negu tas pačias ląsteles veikiant tik analogišku BAC tirpalu. Naudojant E.Coli ląstelių kultūrą nustatyta, kad antimikrobinis BAC aktyvumas pridėjus manitolio nesikeičia. Taip pat verta pažymėti, jog pasitelkus žiurkių ir triušių akis in vivo, nebuvo aptiktas reikšmingas manitolio poveikis priešglaukominio preparato timololio maleato skvarbai per rageną bei jo sukeliamam akispūdžio mažėjimui [38]. Visi šie duomenys leidžia kurti prielaidą apie galimą glaukomos ir kitų ilgalaikio gydymo akių lašais reikalaujančių ligų terapinę strategiją – kartu su konservantu naudojant manitolį išvengti BAC sąlygojamo akies audinių pažeidimo bei efektyvinti gydymo procesą.
1.4. Metodo parametrų validavimas
1.4.1. Validaciniai parametrai
Pagrindiniai bioanalitinio kiekybinio metodo validavimo parametrai yra šie: specifiškumas, tikslumas, glaudumas (atsikartojamumas, tarpinis glaudumas, atkuriamumas), aptikimo riba, nustatymo riba, tiesiškumas, kiekybinio aptikimo diapazonas ir tvirtumas [39].
Specifiškumas – metodo savybė vienareikšmiškai atskirti tiriamą analitę nuo aplinkinių giminingų junginių mėginyje. Su specifiškumu yra glaudžiai susijęs vadinamasis matricos efektas (tirpiklio ar mėginio priemaišų poveikis tyrimo rezultatui, jo kiekybinės vertės iškraipymas).
Tikslumas (tikrumas) – tiriamos analitės rezultato vertės artumas referentinei standarto vertei. Glaudumas apibūdina to paties mėginio eilės matavimų vienodomis sąlygomis rezultatų verčių artumą viena kitai, t.y. rezultatų išsibarstymą, standartinį nuokrypį arba variacijos koeficientą. Glaudumas skirstomas į pasikartojamumą (rezultatų pasikartojimas toje pačioje laboratorijoje per trumpą laiko intervalą), tarpinis preciziškumas (rezultatų išsibarstymas vienoje laboratorijoje skirtingomis dienomis, naudojant skirtingą įrangą, dirbant skirtingiems analitikams) bei atkuriamumą (rezutatų panašumas tarp skirtingų laboratorijų).
Aptikimo riba – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį galima kokybiškai aptikti naudojant tam tikrą metodą ir tam tikrus parametrus.
Nustatymo riba – mažiausias analitės kiekis mėginyje, kurį galima pakankamu tikslumu ir glaudumu įvertinti kiekybiškai.
Tiesiškumas – metodo geba išgauti tokius rezutatus, kurie yra tiesiškai proporcingi analitės koncentracijai mėginyje.
Tvirtumas – metodo savybė likti nepakitusių rodiklių mažų pokyčių parametrų nustatymuose (eliuentų koncentracijų, slėgio ir kt.) kontekste.
17 Metodo validavimas yra kritinis procesas bioanalizėje, būtinas norint pritaikyti konkretų metodą rutininiams tyrimams. Nepaisant sudarytų bendrų validavimo parametrų gairių, jų taikymo kriterijai išlieka dviprasmiški bei migloti. Tarp labiausiai problematiškų ir kontraversiškų parametrų priskiriami nustatymo riba, tvirtumas bei matricos efektas [7;40]. Egzistuoja keletas nustatymo ribos apskaičiavimo metodologijų, dėl ko pastebimas sukurtų metodų heterogeniškumas. Tvirtumas validavimo darbuose dažnai apskritai praleidžiamas dėl daugybės nevienodų jo nustatymo būdų. Matricos efektas, būdamas itin svarbus kriterijus skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodų vystyme, paprastai taip pat nesulaukia pelnyto bioanalitikų dėmesio [40].
1.4.2. Validuoti benzalkonio chlorido nustatymo metodai
Prancūzų mokslininkų grupė yra sukūrusi benzalkonio chlorido (BAC) ir kitų ketvirtinių amonio
junginių kiekybinio nustatymo pieno produktuose metodą, paremtą atvirkštinių fazių skysčių chromatografija bei elektropurkštuvinės jonizacijos tandemine masių spektrometrija [41]. BAC ekstrakcija šiuo atveju vykdoma acetonitrilo ir etilacetato mišiniu, pritaikoma silikagelio chromatografinė kolonėlė su prijungtomis C18 alkilo grupėmis, kaip eliuentai naudojami acetonitrilas bei vanduo, abu parūgštinti 0,3 % koncentracijos metano rūgšties tirpalu, o gradientiniam eliuavimui papildomai pasitelkiamas metanolis. Metodas išvystytas patikrinus visus validavimo kriterijus, įskaitant pakankamą tikslumą, glaudumą, pasikartojamumą 5-150 µg/kg koncentracijų diapazone. Matricos efekto neaptikta, o aptikimo ir nustatymo ribos tenkina validavimo reikalavimus (<1,9 µg/kg ir 5-35 µg/kg atitinkamai) [41].
2015 m. atliktas atvirkštinių fazių ultraefektyviosios skysčių chromatografijos metodo BAC
koncentracijos nustatymui konservuotose vaistų formuluotėse optimizavimas ir validavimas [42]. Jo rezultatai parodė, kad geriausiai BAC koncentracijai nustatyti tinka gradientinis eliuavimas, naudojant 10 mM amonio fosfato buferį (pH=3,3) kaip vandeninę judančią fazę bei metanolį/acetonitrilą tūriniu santykiu 85/15 kaip organinę judančią fazę, detekciją vykdant 214 nm ilgio UV bangomis. Naudojant šias sąlygas, pagrindiniai BAC homologai (C12 ir C14) buvo patikimai atskirti per mažiau kaip 2 minutes, su pakankamu tikslumu, glaudumu, tvirtumu bei tiesiškumu BAC koncentracijoms tarp 0,025 ir 0,075 mg/ml [42].
Taip pat jau yra sukurtas modernus popieriaus purkštuvinės jonizacijos masių spektrometrinis metodas greitai ir patikimai nustatyti BAC kiekį akių lašuose ir kūno skysčiuose [43]. Šiuo atveju naudojamas filtrinis popierius, kuris mirkomas į mėginį, o naudojama aukšta įtampa (3,5 kV) jonizuoja BAC molekules į jonus – taip per kelias sekundes apeinamos ekstrakcijos bei chromatografinio
18 atskyrimo fazės, o tai savo ruožtu sumažina reikalingų validavimo parametrų skaičių. Pagrindinių BAC homologų (C12, C14, C16) kiekybinis nustatymas šiuo metodu įvykdomas tiksliai, glaudžiai ir tiesiškai 1-100 µg/ml koncentracijos ribose, nustatyta aptikimo riba - 0,1 µg/ml, nustatymo riba < 1 µg/ml. Lyginant su anksčiau kurtais skysčių chromatografijos-masių spektrometrijos metodais, šis nepasižymi dideliais kiekybinio nustatymo validavimo parametrų skirtumais, tik mažesne trukme (apie 2 min) [43].
Tiriant vieną mirtino apsinuodijimo BAC atvejį Japonijoje, buvo atliktas teisminės ekspertizės skrodimas, po kurio buvo išvystytas skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos (LC-MS/MS) metodas BAC kiekybinei analizei kraujyje [44]. Trijų BAC homologų – C12, C14 ir C16 - ekstrakcijai buvo pasitelkiama pakoreguota „QuEChERS“ metodika, pagrįsta centrifugavimu bei kietafaziu ekstrahavimu. Metodo validacijos metu buvo pasiektas analitinius kriterijus atitinkantis rezultatų tikslumas ir glaudumas BAC koncentracijoms nuo 10 iki 200 ng/ml. Naudojant šį metodą minėto mirusio asmens širdies bei šlauninės venos kraujyje buvo aptikti reikšmingi konservanto kiekiai net praėjus 18 dienų nuo jo suvartojimo, todėl galima darsyk pabrėžti rimtas prielaidas apie šio detergento sudėtingą ekskreciją ir ypatingas kumuliacines savybes daugelyje organizmo audinių bei skysčių [44].
Lenkų mokslininkai savo ruožtu sukūrė BAC kiekybinio nustatymo aplinkos vandens mėginiuose metodą, kuris apima kietafazę ekstrakciją, jonų chromatografinį atskyrimą ir konduktometrinę detekciją [45]. Naudojant šią procedūrą buvo pasiektas tarp 79 ir 93 % analitės atkūrimas bei nustatymo intervalas tarp 0,0018 ir 0,038 µg/ml [45]. Tokia metodologija apeina toksiškų tirpiklių naudojimą bei pasižymi paprastumu, greitumu ir pigumu lyginant su skysčiųskysčių ekstrakcijos -skysčių chromatografijos - masių spektrometrijos metodais.
BAC kaip priedas taip pat įeina ir į kitų formų vaistinių ir kosmetikos produktų sudėtį – pavyzdžiui,
drėgnose servetėlėse jo koncentracija svyruoja 0,005-0,5 % ribose [46]. Kadangi pasiekęs didesnę koncentraciją šis detergentas dirgina odą, jo kiekis turi būti tiksliai įvertinamas ir tokiose odos priežiūros priemonėse. Šiam tikslui yra sukurtas kapiliarinės elektroforezės metodas kiekybiniam BAC nustatymui drėgnose servetėlėse, susidedantis iš šios veiksmų sekos: tiriamos servetėlės išgręžiamos nenaudojant ekstrakcijos, mėginiai injekuojami į kapiliarą hidrodinaminiu principu į kamerą, pripildytą 75mM fosfatinio buferio (pH=6,0) su 30 % elektrolito acetonitrilo, elektroforetinis separavimas vykdomas pritaikant 10 kV įtampą [46]. Palyginti su ESC ir SC-MS metodų validavimo rezultatais, šiuo būdu gaunamas toks pat geras tiesiškumas, tačiau šio metodo jautrumas nusileidžia minėtųjų ribinėms koncentracijų vertėms (aptikimo riba siekia 0,3 µg/ml, o nustatymo – net apie 1 µg/ml C10 bei C12 analogams) [46].
19 Atvirkštinių fazių ultraefektyvioji skysčių chromatografija atskiria BAC homologus pagal jų giminingumą nepolinei kolonėlei, t.y. pagal homologų poliškumą. Naudojant eliuavimo mišinį, sudarytą iš 60 % acetonitrilo ir 40 % 0,1 M natrio acetato buferio (pH~5), 4,6 x 250 mm kolonėlę su 5 µm dydžio poromis, gaunamas geras tiesiškumo rodiklis (r2
=0,99) visiems BAC homologams (n=8-18) 0,025 ir 0,8 mg/ml koncentracijų ribose [47]. Toks UESC metodas pasižymi geru homologų smailių atsiskyrimu chromatogramose, jautrumu bei glaudumu [47].
20
2. Medžiagos ir tyrimų metodai
2.1. Tyrimo organizavimas
Tyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Farmacijos fakulteto biofarmacinių tyrimų laboratorijoje 2019 m. sausio-gegužės mėnesiais. Tiriamieji ašarų skysčio ėminiai buvo renkami LSMU ligoninės Kauno klinikų Akių ligų klinikoje. Šiam tikslui pasitelkti anoniminiai pacientai, kuriems skirtingais intervalais prieš ėminio surinkimą į akis buvo lašinami skirtingi farmakologiniai akių lašų preparatai, į kurių sudėtį įeina arba neįeina tiriamasis junginys benzalkonio chloridas. Šiam darbui vykdyti 2018 m. rugpjūčio 2 d. buvo išduotas Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimas Nr. BE-2-52.
2.2. Tyrimo medžiagos ir prietaisai
MEDŽIAGA GAMINTOJAS
Acetonas, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)
Metanolis, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)
Acetonitrilas, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV) Etilacetatas, grynumas >99 % Sigma-Aldrich (JAV)
Širmerio testo juostelės OptiTech Eyecare (Indija) Metano rūgštis, grynumas >99,9 % Sigma-Aldrich (JAV) Benzalkonio chlorido standartas, grynumas >99,9
%
Sigma-Aldrich (JAV)
Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm chromatografinė
kolonėlė
Waters Corporation (JAV)
Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografas Waters Corporation (JAV)
Xevo TQD masių spektrometras Waters Corporation (JAV)
Elmasonic P ultragarso vonelė Elma Schmidbauer (Vokietija)
2.3. Tyrimų metodai
2.3.1. Ėminių surinkimas
Ašarų skystis buvo surenkamas oftalmologiniam ašarojimo testui skirtomis Širmerio juostelėmis (2 pav.), šias laikant apatiniu voku primerktas paciento apatiniame junginės skliaute 5 min. Juostelėse jas
21 ištraukus tiksliai pažymimas ašarų skysčio nueitas kelias (mm), vėliau lyginamas su tikslaus žinomo tūrio etaloninio BAC tirpalo nueitu keliu. Tokios juostelės su sugertais anoniminių pacientų ašarų skysčių ėminiais buvo renkamos viso tyrimo metu ir patalpintos Eppendorf mėgintuvėliuose laikomos šaldiklyje –80 °C temperatūroje neribotą laiką iki ekstrakcijos stadijos.
2 pav. Širmerio testo juostelės
2.3.2. Benzalkonio chlorido ekstrakcija iš ėminių į tiriamuosius mėginius
BAC ekstrakcija buvo vykdoma juosteles su tiksliai žinomu ašarų skysčio nueitu keliu (mm) pilnai įmerkiant į 1 ml metanolio ir acetonitrilo mišinio (50/50) Eppendorf mėgintuvėliuose bei šiuos inkubuojant ultragarso vonelėje (3 pav.) 40 °C temperatūroje 30 min. Po to juostelės išimamos, o mėgintuvėliuose esantis tirpiklis išgarinamas azoto dujomis. Sausas išgauto BAC likutis naujai tirpinamas 100 µl acetonitrilo – gaunamas mėginys, paruoštas skysčių chromatografinei - masių spektrometrinei analizei.
22
3 pav. Elmasonic P ultragarso vonelė
BAC koncentracijos kiekybiniam nustatymui naudojamas išorinio standarto metodas. Lygiagrečiai tiriamiesiems ruošiami etaloniniai mėginiai kalibracinei kreivei: nuo 0 iki 100,0 µg/ml koncentracijų BAC tirpalai. Šie tirpalai gaunami iš gryno BAC standarto. Ant juostelės lašinama 10 µl metanolinio BAC tirpalo, užrašomas skysčio nueitas kelias (mm) bei juostelė džiovinama 15 min traukos spintoje. Po to iš juostelės analogiškai 30 min ultragarso vonelėje vykdoma BAC ekstrakcija į 1 ml metanolio bei acetonitrilo mišinio (50/50), tirpiklis išgarinamas ir sausas BAC likutis tirpdomas 100 µl acetonitrilo, gaunant 10 kartų mažesnes kalibracinių tirpalų koncentracijas.
2.3.3. Mėginių chromatografinė - masių spektrometrinė analizė
Paruošti mėginiai perkeliami į ultraefektyviosios skysčių chromatografijos analizei skirtus 2 ml talpos buteliukus ir injekuojami į Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografo (4 pav.) atvirkštinių fazių sistemą. Naudojama 50 mm ilgio bei 2,1 mm pločio kolonėlė 1,7 µm dalelių dydžio silikageliniu pagrindu su prijungtų C18 etileno hibridinių tiltelių (BEH) technologija (5 pav.). Eliuentu naudotas metanolinis 0,1 % metano rūgšties tirpalas, taikytas izokratinis eliucijos režimas, vieno mėginio analizės trukmė – 1 min.
23
4 pav. Acquity UPLC H-Class skysčių chromatografas (kairėje) ir Xevo TQD masių spektrometras (dešinėje)
5 pav. Acquity UPLC BEH C18 1,7 µm chromatografinė kolonėlė
Skirtinga sulaikymo trukme chromatografijos stadijoje pasižymintys BAC C8-C18 homologai atskiriami, atpažįstami bei kiekybiškai nustatomi pritaikant tandeminės masių spektrometrijos technologiją daugialypių reakcijų stebėjimo (MRM, angl. Multiple reaction monitoring) režimu. Kolonėlėje atskirtos analitės patenka į elektropurkštuvinį jonizatorių, kuriame veikiant mėginio terpėje esančiai metano rūgščiai susidaro skirtingų dydžių molekuliniai katijonai. Šie toliau keliauja į pirmąjį trigubo kvadrupolinio jonų masių filtro analizatorių, kur yra atskiriami pagal masę, o prieš patekdami į antrąjį analogišką analizatorių pereina argono dujomis užpildytą ardymo kamerą, kurioje skyla į kelių
24 kombinacijų neutralius molekulės fragmentus bei fragmentinius jonus. Pastarieji paeiliui atpažįstami ir fiksuojami diodinio elektronų daugintuvo detektoriumi (4 pav.). MRM principas šiuo atveju reiškia, kad kiekybiškai įvertinami visi galimi BAC homologai (6 pav.).
6 pav. UESC-MS/MS MRM režimu gaunamos atskirų BAC homologų chromatogramos
Atskirų BAC homologų koncentracijos mėginiuose nustatomos pagal MRM gaunamą precizišką chromatografinių smailių plotą, pritaikius kalibraciniais mėginiais paremtą tiesinės regresijos modelį. Ekstrakcijos efektyvumas įvertinamas pagal tapačios koncentracijos mėginių, gautų po ekstrakcijos ir
25 nevykdant jos, santykį. BAC kiekis pacientų ašarų skysčio ėminiuose sužinomas perskaičiuojant gautąsias mėginiuose: atsižvelgiama į ekstrakcijai naudoto tirpiklio tūrį, koncentravimą bei skiedimą, tad galutinis kiekis (µg) tiriamajame ėminyje apibrėžiamas kaip lygus 10 % gautos koncentracijos (µg/ml) skaitinės vertės. Analizei reikšmingi laikomi 12C bei 14C homologų koncentracijos ir kiekiai.
2.4. Duomenų analizė
Eksperimentiškai gauti duomenys statistiškai apdorojami SPSS programiniu paketu. Statistiniam patikimumui nustatyti ir skirtumų tarp skirstinių įvertinimui buvo atliekamas Mann-Whitney U testas. Tiesiškumas įvertintas taikant tiesinės regresijos modelį ir apskaičiuojant determinacijos koeficientą (r2). Rezultatų glaudumą lemia apskaičiuojamas santykinis standartinis nuokrypis (SSN, %). Taikomas reikšmingumo lygmuo α lygus 0,05.
26
3. Tyrimų rezultatai ir jų aptarimas
3.1. Ėminio surinkimo problematika
Širmerio testas klinikinėje oftalmologijoje sausų akių sindromui įvertinti plačiai taikomas dar nuo XX a. pradžios [48;49]. Vis dėlto, ašarų skysčio surinkimas Širmerio testo juostelėmis turi privalumų ir trūkumų. Tarp pastarųjų svarbu paminėti gaunamas netikslias, t. y. dirbtinai padidintas ar sumažintas, tam tikrų junginių koncentracijas. Pavyzdžiui, serumo kilmės baltymų – albumino, transferino, imunoglobulino G - koncentracijos šia procedūra surinktuose ėminiuose gaunamos reikšmingai didesnės negu alternatyviais metodais surenkamame ašarų skystyje [49;50]. Taip pat lieka nepaneigta hipotezė, jog tyrimo rezultatai šiuo atveju tampa nepatikimi dėl refleksinio ašarojimo sukėlimo [50]. Šio tyrimo metu, atsižvelgiant į gausius duomenis apie BAC paviršinio aktyvumo savybes ir polinkį kauptis paviršinėse akies struktūrose [19;22], prie privalumų priskirtina tyrimais įrodyta sąlyginai geresnė Širmerio juostelių geba sugerti junginės bei ragenos epitelį dengiančioje ašarų plėvelėje aptinkamus vadinamuosius surfaktantinius baltymus [48;49]. Tarp kitų pabrėžtinų šio metodo pranašumų yra net ir be refleksinio dirginimo surenkamas didelis ašarų skysčio tūris bei didesnis rezultatų glaudumas, o analičių stabilumas užtikrinamas juosteles laikant – 80°C temperatūroje [49].
Laiko intervalo tarp akių lašų vartojimo ir ašarų skysčio paėmimo aktualumą pabrėžia klinikinių tyrimų duomenys apie greitą (įvykstantį per kelias minutes) BAC koncentracijos mažėjimą ašarų plėvelėje iš karto po konservuoto vaisto dozės patekimo ant akies paviršiaus [8].
Tačiau pagrindine tokio ėminių surinkimo būdo kliūtimi šio tyrimo metu tapo atradimas, kad Širmerio juostelės po ekstrakcijos į analizei tinkamus mėginius generuoja šalutinį UESC-ESI-MS/MS signalą, visiškai atitinkantį BAC lemiamą signalą (žr. 3.5 skyrių). Tai galime laikyti arba BAC pėdsakų juostelėse buvimo prielaida, arba juostelių struktūrinių komponentų (pvz. celiuliozės arba gradavimo linijų dažų molekulių) gebėjimu panašiais sulaikymo chromatografinėje kolonėlėje, jonizacijos bei fragmentacijos dėsningumais detektoriuje sukurti persidengiantį signalą su BAC generuojamuoju.
3.2. Optimalios terpės mėginių analizei parinkimas
Siekiant išsiaiškinti optimalią terpę tiksliam BAC UESC-MS/MS kiekybiniam nustatymui, iš BAC standarto buvo ruošiami kalibraciniai tirpalai (0; 0,001; 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 25,0; 50,0; 100,0; 500,0; 1000,0; 2000,0 µg/ml koncentracijų) naudojant skirtingus tirpiklius: metanolį,
27 acetonitrilą ir acetoną. Reprezentaciniu BAC junginių grupės nariu dėl sąlyginai didžiausio aptinkamo jo kiekio pasirinktas 12C homologas. Išmatavus kiekvieno mėginio penkių dozavimų sukuriamų signalų dydžius (chromatografinės smailės plotą), buvo daromos prielaidos apie tiriamų tirpiklių lemiamą koncentracijos-signalo intensyvumo tiesinį priklausomybės ryšį ar galimą matricos efektą. Tiesiškumo matu laikytinas determinacijos koeficientas (r2). Didžiausia jo vertė, kurią galima laikyti
pakankama bioanalizėje (>0,99), gauta koncentracijoms nuo 0,05 iki 10 µg/ml mėginius skiedžiant metanoliu (r2=0,9941), mažai atsiliko acetonitrilas (r2=0,9914), mažiausia tame pačiame koncentracijų diapazone – acetonu (r2=0,9837) (7 pav.). Tokiu būdu visose tirtose terpėse BAC kiekybinio nustatymo riba lygi 0,005 µg/ml, o aptikimo riba – 10-4 µg/ml. Remiantis SSN rodikliais, geriausias glaudumas aptiktas tarp mėginių, ruoštų su acetonitrilu (SSN<2,0 %), metanoliniuose tirpaluose šis rodiklis tarp visų koncentracijų siekė daugiausiai 2,5 %, o acetonu skiestuose mėginiuose rezultatų išsibarstymas buvo sąlyginai didžiausias (SSN<10,5 %). Svarbu pažymėti, jog acetonitrile ištirpusių mėginių sukuriamų smailių plotai buvo reikšmingai didesni negu kitų tirpiklių visame kiekybinio nustatymo 0,05-10,0 µg/ml koncentracijų intervale (p<0,03175). Šis atradimas, kartu su geresniais glaudumo rodikliais, galimai paaiškinamas efektyvesne analitės jonizacija masių spektrometro ESI fazėje bei mažesniais pašaliniais “triukšmo” signalais, kadangi analogiškas efektas jau yra pastebėtas ESI-MS/MS proteomikos analizės darbuose [51]. Remiantis šiais duomenimis, tolimesniam tiriamųjų mėginių tirpinimui ar skiedimui pasirinktas acetonitrilas.
7 pav. UESC-MS/MS 12C BAC homologo koncentracijos - sąlyginio signalo intensyvumo tiesinės priklausomybės kalibracinės kreivės, tirpikliais naudojant metanolį, acetonitrilą ir acetoną (n=5)
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 Metanolis Acetonitrilas Acetonas C, µg/ml Sąlyginis signalo intensyvumas
28
3.3. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Dauguma ankstesnių BAC kiekybinio nustatymo validavimui skirtų mokslinių darbų rėmėsi patikimu analitės išgavimu tiesiogiai iš skysčių, išvengiant ekstrakcijos stadijos [46;52], arba pasitelkiant kietafazės ekstrakcijos metodiką [44;53;54;55;56;57]. Nepaisant to, taip pat galima rasti duomenų apie validuotą BAC išskyrimą iš kietų tiriamųjų ėminių naudojant ekstrakciją organiniais tirpikliais acetonitrilu [19] arba acetonitrilo ir etilacetato mišiniu [41]. Atsižvelgiant į tai bei žinomas geras BAC tirpumo savybes alkoholiuose ir acetone, analitės ekstrakcijos iš ėminių efektyvumui tirti kandidatais pasirinkti šie tirpikliai: acetonas, acetonitrilas, etilacetatas, metanolis, acetonitrilo ir metanolio mišinys (santykiu 1/1), acetonitrilo ir etilacetato mišinys (1/1) bei metanolio ir etilacetato mišinys (1/1). Šiam tikslui buvo ruošiami į tiesiškumo intervalą patenkančios 5 µg/ml koncentracijos (žr. 3.2 skyrių) standartiniai etaloniniai BAC tirpalai kiekviename iš minėtų tirpiklių, o taip pat lygiagrečiai šiais skirtingais tirpikliais (1 ml) bandyta iš Širmerio juostelių ekstrahuoti 5 µg BAC. Tikslus jo kiekis buvo absorbuojamas ant juostelės užlašinant 10 µl 500 µg/ml koncentracijos standartinio metanolinio tirpalo ir išdžiovinant traukos spintoje. (Metanolis pasirinktas dėl artimiausios dielektrinės konstantos reikšmės iš turimų tirpiklių ašarų terpėje pagrindą sudarančiam vandeniui, o distiliuoto bei dejonizuoto vandens naudojimas šiame tyrime buvo atmestas dėl jame aptiktų BAC pėdsakų.) Šios identiškos juostelės po to buvo įmerkiamos į skirtingus tirpiklius Eppendorf mėgintuvėliuose ir inkubuojamos ultragarso vonelėje 40 °C temperatūroje 30 min. Ekstrakcijos efektyvumas įvertintas apskaičiavus kiekvieno tirpiklio ekstrakto 12C BAC homologo UESC-MS/MS signalo intensyvumo (chromatogramos smailės integralo) santykį su atitinkamo tirpiklio etaloninio mėginio analogišku dydžiu bei išreikštas procentais (8 pav.). Kaip matyti iš diagramos, efektyviausiai BAC ekstrahavo acetonitrilo ir metanolio mišinys (92,5 %), statistiškai reikšmingai pranokęs etilacetatą (p=0,0159), acetonitrilo ir etilacetato mišinį (p=0,0174) bei etilacetato ir metanolio mišinį (p=0,0342). Acetono, acetonitrilo bei metanolio ekstrakcijos efektyvumai nuo favorito reikšmingai nesiskyrė, tačiau jų glaudumo rodikliai buvo prastesni (1 lentelė; atitinkamos SSN reikšmės 4,26 %, 1,94 % ir 2,30 %, lyginant su 1,30 %). Apibendrinus visus duomenis, tolesnei analitės ekstrakcijai iš ėminių pasirinktas metanolio ir acetonitrilo mišinys.
1 lentelė. 12C BAC homologo ekstrakcijos rezultatų glaudumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių (n=7-26)
Tirpiklis Acetonas Acetonitrilas Etilacetatas Metanolis AcN+ EtAc AcN+ MeOH EtAc+ MeOH SSN, % 4,26 1,94 1,06 2,30 0,62 1,30 0,59
29
8 pav. 12C BAC homologo ekstrakcijos efektyvumo palyginimas tarp skirtingų tirpiklių (%, n=5-7)
3.4. Poekstrakcinės kalibracinės kreivės parametrai
Pasitelkus metanolyje ištirpintus tiesiškumo intervalą apimančių koncentracijų (0,05-10 µg/ml; žr. 3.2 skyrių) BAC standarto etaloninius tirpalus ir atsižvelgus į ekstrakcijos efektyvumo rezultatus (3.3 skyrius) toliau buvo tikrinama, ar analogiški tiesiškumo bei glaudumo rodikliai išlieka parinktomis sąlygomis generuojant kalibracinę kreivę mėginiams, išgaunamiems po BAC ekstrakcijos iš Širmerio juostelių. Kitaip negu 3.3 skyriuje aprašytoje ekstrakcijos procedūroje, šiuo atveju koncentravimo ir labiau išreikšto signalo labui (žr. 3.2 skyrių) pabaigoje iš mėgintuvėlių su ekstraktais azoto dujomis išgarinamas metanolio/acetonitrilo mišinys, o sausas likutis naujai tirpinamas 100 µl acetonitrilo. Tiriant 12C homologą (9 pav.), gautas kiek mažesnis determinacijos koeficientas (r2=0,9857), indikuojantis švelnų rezultatų patikimumo sumažėjimą pritaikius parinktas analitės ekstrakcijos iš imitacinių ėminių sąlygas. Šią prielaidą patvirtina ir didesnis rezultatų išsibarstymas (SSN siekė 7,6 %). Mažai skiriasi ir antro pagal dažnį 14C homologo analogiški dydžiai (r2=0,9883; SSN iki 12,8 %). Šie rezultatai aiškintini tuo, jog prie savaime UESC-MS/MS signalui būdingo standartinio nuokrypio prisideda ir ekstrakcijos iš juostelių į mėginius proceso heterogeniškumas, todėl abu šiuos veiksnius sujungus į vientisą metodiką ir gaunami mažesni tiesiškumo ir glaudumo rodikliai.
88,3 84,1 52,6 89,7 56,4 92,5 77,1 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Acetonas, % Acetonitrilas, % Etilacetatas, % Metanolis. % Acetonitrilas+etilacetatas, % Acetonitrilas+metanolis, % Etilacetatas+metanolis, %
30
9 pav. 12C BAC homologo mėginių, gautų po pritaikytos ekstrakcijos metodikos, UESC-MS/MS kalibracinė kreivė (r2
=0,986; n=5)
3.5. Aptikimo bei nustatymo riba ir benzalkonio chloridas Širmerio juostelėse
Pakartotinai tikrinant mėginių, gaunamų po ekstrakcijos iš Širmerio juostelių, tiesiškumą su mažesnių koncentracijų BAC kalibraciniais tirpalais (nuo 0,005 iki 1,0 µg/ml), buvo pastebėtas dar labiau sumažėjęs determinacijos koeficientas r2
(0,973 ir 0,962 atitinkamai 12C bei 14C homologams). Ne mažiau dėmesio verta aplinkybė buvo tai, jog žemiausios tirtos koncentracijos (0,005 µg/ml) mėginio rezultatų glaudumas buvo akivaizdžiai mažesnis, lyginant su didesnių koncentracijų tirpalais (SSN=11,2 %, lyginant su 0,7-2,9 % 12C homologo; SSN=11,1 %, lyginant su 0,35-3,0 % 14C homologo). Visa tai suponavo mintį, kad galimai esama rezultatus iškreipiančio ir jautrumą mažesnėms BAC kocentracijoms mažinančio šalutinio UESC-MS/MS signalo, o mažesnės už 0,005 µg/ml koncentracijos gali apskritai pakliūti už kiekybinio nustatymo ribos. Todėl eksperimentas buvo pakartotas naudojant dar labiau praskiestus kalibracinius tirpalus (nuo 0,0005 iki 1,0 µg/ml). Šiame etape nauja buvo tai, jog taip pat naudotas nulinis etaloninis mėginys, gautas tokiomis pat sąlygomis kaip kiti mėginiai, ant Širmerio juostelės prieš ekstrakciją lašinant gryno metanolio (žr. 3.3 skyrių). Nulinės koncentracijos mėginys generavo ryškų interferuojantį MRM signalą, šiuo atveju reikšmingai nesiskiriantį nuo 0,005 µg/ml (p=0,3095) ir mažesnių koncentracijų BAC kalibracinių tirpalų kuriamų signalų. Mažiausia koncentracija, laiduojanti statistiškai reikšmingą signalo intensyvumo skirtumą nuo nulinio mėginio generuojamo signalo, buvo 0,01 µg/ml. Kadangi signalo intensyvumo rezultatų glaudumo rodikliai visoms koncentracijoms tenkino normatyvinius reikalavimus (mažiausias būdingas nuliniam mėginiui, SSN lygus 6,15 ir 5,08 atitinkamai 12C bei 14C homologams), 0,01 µg/ml koncentracija buvo apibrėžta kaip metodo aptikimo bei kiekybinio nustatymo riba remiantis tik BAC
0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10 Sąlyginis signalo intensyvumas C, µg/ ml
31 UESC-MS/MS signalo intensyvumo skirtumu nuo bazinės linijos, kuri buvo nustatyta kaip nulinio mėginio generuojamas signalas. Validavimo kriterijus atitinkantis tiesiškumas šiuo atveju buvo gautas tik 0,01-0,25 µg/ml koncentracijų intervale, signalo intensyvumo reikšmės gautos atėmus nulinio mėginio signalą (r2
=0,964 ir r2=0,963 atitinkamai 12C bei 14C homologui; 10 pav.). Patikrinti, ar signalo generavimas priklauso tik nuo Širmerio juostelių, lygiagrečiai buvo ruošiamas nulinės koncentracijos mėginys nenaudojant juostelės, atkartojant visas kitas metodo sąlygas. Pastarojo mėginio MRM signalas buvo apie 20 kartų mažiau intensyvus (p=0,0079; SSN=7,9 %), todėl teko patvirtinti hipotezę apie Širmerio juostelių esminį neigiamą poveikį metodo validavimui.
Tokio BAC imituojančio signalo aptikimas “tuščiuose” mėginiuose kenkia metodo jautrumui (didina aptikimo bei nustatymo ribas), iškelia jo specifiškumo problemą ir komplikuoja jo panaudojimo rutininiams klinikiniams tyrimams perspektyvas. Nėra visiškai aišku, kas nulemia šio rezultatus iškreipiančio signalo atsiradimą, tačiau prielaida apie BAC panaudojimą konservuoti Širmerio juosteles gamybos proceso metu yra labiausiai tikėtina. Taip pat neatmestina šio reiškinio priežastis yra į tiriamąjį mėginį kartu su BAC molekulėmis patenkančių Širmerio juostelės struktūrinių medžiagų (pvz. celiuliozės mikroatplaišų arba gradavimo linijų dažų) sąlygojamas matricos efektas arba šių junginių panaši sulaikymo trukmė chromatografinėje kolonėlėje bei BAC giminingų jonų susidarymas jonizacijos ir/arba fragmentacijos stadijose. Vis dėlto, pastarojo sutapimo tikimybę galime laikyti minimalia dėl metodikoje pritaikyto jautraus MRM režimo.
10 pav. 12C BAC homologo mėginių, kurių koncentracijų vertės artimos nustatymo ribai, UESC-MS/MS kalibracinė kreivė (r2 =0,964; n=5) 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 C, µg/ml Sąlyginis signalo intensyvumas
32
3.6. Benzalkonio chlorido kiekis pacientų ašarų skysčio ėminiuose
BAC kiekis glaukoma sergančių pacientų ašarų skysčio ėminiuose nustatytas kalibracine kreive, gauta lygiagrečiai su tiriamaisiais mėginiais per UESC-MS/MS sistemą perleidžiant etaloninius BAC tirpalus (žr. 2.3.3 poskyrį). Daugiafaktorinei lyginamajai analizei pasirinkti šešių tiriamųjų objektų, iš kurių trys vartoja BAC konservuotus akių lašus, o trys tokių preparatų nesilašina, ašarų skysčio ėminiai (2 lentelė). Šie buvo surinkti praėjus mažiausiai trims valandoms po paskutinės dozės sulašinimo, todėl neabsorbuoto ant akies paviršių arba nepasiskirsčiusio ašarų skystyje BAC tiesioginį surinkimą iš lašų galime atmesti. Reprezentaciniais homologais dėl didžiausio ir stabiliausiai aptinkamo kiekio pasirinkti 12C bei 14C homologai. Visuose ėminiuose nustatytas 12C homologo kiekis svyravo tarp 9,3 ir 17,7 ng, 14C – tarp 9,1 bei 25 ng (2 lentelė).
2 lentelė. Tiriamųjų pacientų ašarų skysčio ėminių duomenys (S – skysčio nueitas kelias Širmerio juostelėje, arba sąlyginis ėminio tūris; C – paciento vartojamų akių lašų BAC koncentracija; TBUT – paciento ašarų plėvelės trūkimo laikas, arba ašarų plėvelės vientisumo ir akių sausumo matas)
Ėminio nr. S, mm C, % TBUT, s 12C kiekis, ng 14C kiekis, ng
039 10 0,05 5 13,28 21,35 040 15 - 3 9,38 9,1 041 15 - 15 10,26 11,31 042 10 - 14 12,23 14,27 043 12 0,02 14 17,66 25,05 044 5 0,02 3 10,82 11,25
3.6.1. Priklausomybė nuo surenkamo ėminio tūrio
Visi tiriamieji ašarų skysčio ėminiai buvo suskirstyti į dvi pagrindines grupes: pacientų, kuriems į akis reguliariai lašinami BAC konservuoti akių lašai, ir pacientų, kurie tokių preparatų nevartoja. Atmetus BAC lašinimo įtaką, abiejose grupėse atskirai buvo vertinamas ryšys tarp Širmerio juostelėje skysčio nueito kelio, tiesiogiai rodančio surinktą ašarų tūrį, bei nustatomo BAC kiekio. Pirmojoje grupėje, tarpusavyje lyginant ėminius su 10 ir 15 mm ašarų skysčio nueitu keliu, nebuvo pastebėtas reikšmingas BAC kiekio skirtumas (p=0,2865). Antrojoje grupėje analogiška 14C homologo tiesinė priklausomybė buvo nustatyta (r2
=0,9953; 11 pav.), tačiau 12C homologui buvo gerokai mažesnė (r2=0,8381). Galbūt tai galima paaiškinti didesne 14C homologo kumuliacija akies paviršiuose dėl
33 didesnio nepolinio šios molekulės fragmento, kadangi jo kiekis kai kuriuose ėminiuose buvo aptiktas didesnis negu 12C homologo.
11 pav. 14C BAC homologo kiekio tiesinė priklausomybė nuo ašarų skysčio nueito kelio Širmerio juostelėje (r2
=0,995; n=5)
3.6.2. Konservuotų akių lašų vartojimo įtaka
Lyginant vartojančių akių lašus pacientų grupę su nevartojančių, nebuvo nustatytas reikšmingas skirtumas tarp ėminiuose aptinkamų BAC kiekių (p=0,2 12C homologui ir p=0,4 14C homologui). Tiriant BAC kiekio ašarų skystyje priklausomybę nuo vartojamuose vaistuose randamos BAC koncentracijos, patikimo ryšio taip pat nebuvo aptikta (r2
=0,19 C12 homologui; r2=0,42 14C homologui; 12 pav.). Sunku pasakyti, kodėl net ir atėmus Širmerio juostelėse aptinkamų BAC pėdsakų poveikį (žr. 3.5 skyrių), nevartojančių jokių preparatų pacientų ašarų skysčiuose randami panašūs BAC kiekiai. Tam įtakos gali turėti ir anksčiau vartoti oftalmologiniai ar ėminio rinkimo metu sistemiškai vartoti vaistai, ir ėminio surinkimo arba mėginio paruošimo klaidos, ir mažos imties sąlygojamos atsitiktinės paklaidos. Galutinai išsiaiškinti, ar egzistuoja tiesinė priklausomybė tarp vartojamuose akių lašuose randamos BAC koncentracijos bei nustatomo BAC kiekio ašarų skystyje, reikia papildomų tyrimų su didesne imtimi.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0 24,0 26,0 0 2 4 6 8 10 12 m, ng S, mm
34
12 pav. Ryšys tarp vartojamuose akių lašuose esančios BAC koncentracijos ir ašarų skystyje aptinkamo 14C BAC homologo kiekio (r2=0,42; n=5)
3.6.3. Ryšys su ašarų plėvelės stabilumu
Kadangi ašarų plėvelės vientisumo pažeidimas yra kliniškai bei moksliškai patvirtinta ilgalaikio BAC poveikio pasekmė [6;18;19;20;24], taip pat buvo tikrinama, ar esama tiesioginio ryšio tarp paciento ašarų plėvelės trūkimo laiko TBUT (angl. Tear film break-up time) rodiklio ir atitinkamame ėminyje nustatomo BAC kiekio. Reikšmingos koreliacijos tarp šių dydžių apibrėžti nepavyko (r2
=0,17 C12 homologui; r2=0,09 14C homologui). Šiam atvejui galime priskirti panašias prielaidas į jau išsakytas 3.6.2 poskyryje, pridedant tik tai, kad galimai BAC vartojimas šiems pacientams dar nėra pakankamai chroniškas, jog sukeltų negrįžtamus ašarų plėvelės riebalinio sluoksnio pažeidimus.
3.6.4. Skirtumai tarp 12C ir 14C homologų tapačiuose ėminiuose
Nors statistiškai vertinant šešių tirtų pacientų ėminių visumą nėra reikšmingo skirtumo tarp nustatomų 12C ir 14C homologų kiekių (p=0,485), kiekvieno iš ėminių kelis UESC-MS/MS matavimus vertinant atskirai, keturiuose iš šešių buvo rastas reikšmingai didesnis 14C homologo kiekis lyginant su 12C homologu (13 pav.). 14C homologo molekulė yra labiau hidrofobinė, todėl įmanoma, jog šis BAC šeimos atstovas ilgiau išsilaiko prisijungęs prie akies paviršinių struktūrų – ašarų plėvelės išorinio lipidų sluoksnio, ragenos epitelio ir kt. – ilgainiui lemdamas jų degeneraciją.
0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 14,0 16,0 18,0 20,0 22,0 24,0 26,0 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 m, ng C, %
35
13 pav. BAC 12C ir 14C homologų kiekių palyginimas tarp skirtingų tiriamųjų objektų ašarų skysčio ėminių (*statistiškai reikšmingas skirtumas tarp 12C ir 14C homologų; n=5)
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 39 40 41 42 43 44 12C 14C * * * * m, ng Ėminio kodas
36
Išvados
1. Ištobulinta benzalkonio chlorido perkėlimo iš ašarų skysčio į tiriamuosius mėginius procedūra vertintina kaip pakankamai efektyvi mėginius laikyti reprezentaciniais atitinkamiems ašarų skysčio ėminiams;
2. Sukurtasis ultraefektyviosios skysčių chromatografijos – tandeminės masių spektrometrijos metodas benzalkonio chloridui nustatyti pasižymi didele sparta, geba atskirti skirtingus šio junginio homologus, pakankamu glaudumu, tinkamu tiesiškumu kliniškai reikšmingame koncentracijų intervale, tačiau patikimai neapibrėžia aptikimo bei nustatymo ribų, nepaneigia specifiškumo stokos ir galimo matricos efekto buvimo;
3. Sukurtasis benzalkonio chlorido kiekybinio nustatymo ašarų skystyje metodas geba aptikti tikslius bei pasikartojančius šio akių lašų konservanto skirtingų homologų kiekius akių ligų pacientų ašarų skysčiuose ir atskleidžia logišką tiesinę priklausomybę tarp surenkamo ašarų skysčio tūrio bei jame aptinkamo benzalkonio chlorido kiekio.
