(1)DARBAS ATLIKTAS KARDIOLOGIJOS INSTITUTE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ląstelių kultūrų tyrimai: naujos kartos antikoaguliantų metabolizmas“

(1)

DARBAS ATLIKTAS KARDIOLOGIJOS INSTITUTE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ląstelių kultūrų tyrimai: naujos kartos antikoaguliantų metabolizmas“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-05-06 Gabrielė Jablonskytė (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

2020-05-06 Gabrielė Jablonskytė (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(2)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS INSTITUTE

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABORATORIJA

GABRIELĖ JABLONSKYTĖ

LĄSTELIŲ KULTŪRŲ TYRIMAI: NAUJOS KARTOS ANTIKOAGULIANTŲ METABOLIZMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Dr. Vacis Tatarūnas

KAUNAS, 2020

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABORATORIJA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė, parašas Data (metai, mėnuo, diena)

LĄSTELIŲ KULTŪRŲ TYRIMAI: NAUJOS KARTOS ANTIKOAGULIANTŲ METABOLIZMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Vacis Tatarūnas, parašas Data (metai, mėnuo, diena)

Recenzentas Darbą atliko

Vardas, pavardė, parašas Magistrantė

Gabrielė Jablonskytė, parašas Data (metai, mėnuo, diena) Data (metai, mėnuo, diena)

(5)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 8

SĄVOKOS ... 9

ĮVADAS ... 10

1. LITERATŪROSAPŽVALGA ... 12

1.1. Antikoaguliantai ... 12

1.2. Rivaroksabanas ... 13

1.3. Rivaroksabano metabolizmas ... 16

1.4. CYP4F2 fermentas ir oksidacinis stresas ... 19

1.5. CYP4F2 fermento inhibitoriai ... 20

1.6. CYP4F2 geno variantai ... 21

1.7. HUVEC ląstelės kaip ŠKL tyrimų modeliai ... 22

2. TYRIMOMETODIKA ... 23

2.1. Tyrimo planavimas ... 23

2.2. Tyrimo objektas ... 23

2.3. Tyrimo metodai ... 23

2.3.1. Užšaldytų ląstelių atšildymas ... 23

2.3.2. Ląstelių kultivavimas ... 24

2.3.3. HUVEC persėjimas ... 24

2.3.4. HUVEC užšaldymas ... 24

2.3.5. Ląstelių mikroskopavimas ... 25

2.3.6. HUVEC veikimas rivaroksabanu ... 25

2.3.7. HUVEC transfekcija hsa-miR-24-3p ... 26

2.3.8. Vaisto ir jo metabolitų tyrimai ultraefektyviosios skysčių chromatografijos- trigubo kvadrupolio masių spektrometrijos metodu ... 26

2.3.9. Naujų junginių nustatymas skysčių chromatografijos-kvadrupolio-praskriejimo laiko masių spektrometrijos metodu ... 27

2.3.10.Genominės DNR išskyrimas iš HUVEC ... 28

2.3.11.Genotipavimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu ... 28

(6)

2.3.13.Fermento CYP4F2 kiekio nustatymas ELISA metodu ... 30

3. REZULTATAIIRJŲAPTARIMAS ... 31

3.1. Rivaroksabano ir jo metabolitų nustatymas endotelio ląstelėse UESCh-MS metodu ... 31

3.2. Naujų junginių nustatymas SC-MS Q-TOF metodu ... 39

3.3. CYP4F2 fermento kiekio nustatymas ELISA metodu ... 40

3.4. Ląstelių CYP4F2 genų variantų tyrimas ... 41

IŠVADOS ... 43

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 44

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 45

PRIEDAI ... 50

(7)

SANTRAUKA

G. Jablonskytės magistro baigiamasis darbas „Ląstelių kultūrų tyrimai: naujos kartos antikoaguliantų metabolizmas“. Mokslinis vadovas dr. Vacis Tatarūnas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorija. - Kaunas.

Darbo tikslas: nustatyti rivaroksabano metabolitus, naujus junginius, susijusius su vaisto poveikiu, ištirti CYP4F2 fermento inhibitorių įtaką antikoagulianto metabolizmui endotelio ląstelių kultūrose.

Darbo uždaviniai:

1. Identifikuoti rivaroksabano metabolitus endotelio ląstelių terpėse, paveikus HUVEC ląsteles skirtingomis vaisto koncentracijomis.

2. Nustatyti naujus junginius, kurie susidaro veikiant HUVEC ląsteles skirtingomis rivaroksabano koncentracijomis.

3. Nustatyti skirtingų rivaroksabano koncentracijų ir CYP4F2 fermentų inhibitorių įtaką CYP4F2 fermento kiekiui endotelio ląstelių lizatuose.

4. Nustatyti CYP4F2 geno variantus endotelio ląstelėse.

Darbo objektas: komercinės žmogaus virkštelės venos endotelio ląstelės (HUVEC).

Metodai: ląstelių kultūrų auginimas flakonuose, genotipavimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu, skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodai, imunofermentinis ELISA metodas.

Rezultatai ir išvados: paveikus HUVEC ląsteles rivaroksabanu, identifikuotas pats vaistas ir šie metabolitai: M-1, M-2, M-5, M-8, M-10, M-11, M-18. Be to, nustatyta, jog didėjant rivaroksabano koncentracijai, mažėjo naujos, su rivaroksabano poveikiu iki šiol nesietos, medžiagos koncentracija.

CYP4F2 fermento kiekis mažėjo didėjant rivaroksabano koncentracijai. Veikiant 0,5 µM rivaroksabano tirpalu, CYP4F2 kiekis ląstelių kultūrose sumažėjo 17,2 proc., 1 µM rivaroksabano - 81,3 proc., 2 µM rivaroksabano - 85,5 proc. Hsa-miR-24-3p mažino CYP4F2 fermento kiekį. Paveikus HUVEC ląsteles 120 nM hsa-miR-24-3p, fermento sumažėjo 11,9 proc. HUVEC ląstelėse nustatytas CYP4F2 rs2108622 C/C genotipas, CYP4F2 rs1558139 G/G genotipas, CYP4F2 rs2074902 T/T genotipas ir CYP4F2 rs3093135 A/T variantas.

(8)

SUMMARY

Final Master‘s thesis by G. Jablonskytė, title „The cell culture research: metabolism of new generation anticoagulants“. Supervisor V. Tatarūnas; Laboratory of Molecular Cardiology at the Institute of Cardiology, Lithuanian University of Health Sciences. - Kaunas.

The aim of the study: to determine the metabolites of rivaroxaban and new compounds, involved in the effect of rivaroxaban, and to investigate the influence of inhibitors of CYP4F2 enzyme on the metabolism of anticoagulant in endothelial cell cultures.

Objectives:

1. To identify metabolites of rivaroxaban in the media of endothelial cells after the exposure of HUVECs to different drug concentrations.

2. To determine new compounds that are formed upon the exposure of HUVEC cells to different concentrations of rivaroxaban.

3. To determine the effect of different concentrations of rivaroxaban and inhibitors of CYP4F2 enzyme on the levels of CYP4F2 enzyme in endothelial cell lysates.

4. To determine CYP4F2 gene variants in endothelial cells.

Object: commercial human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).

Methods: cell cultivation in flasks, genotyping by real-time polymerase chain reaction, methods of liquid chromatography and mass spectrometry, enzyme-linked immunosorbent assay ELISA.

Results and conclusions: rivaroxaban and M-1, M-2, M-5, M-8, M-10, M-11, M-18 metabolites were identified from cultured HUVEC cells after exposure with rivaroxaban. In addition, it was determined that the concentration of a new compound, which previously has not been linked with the effect of rivaroxaban, decreased as the concentration of rivaroxaban increases. CYP4F2 levels decreased with increasing rivaroxaban concentrations. Pre-treatement with 0.5 μM of rivaroxaban solution decreased the levels of enzyme in cell cultures by 17.2 %, 1 μM rivaroxaban - by 81.3 %, and 2 μM of rivaroxaban by 85.5 %. Treatment with Hsa-miR-24-3p reduced the levels of CYP4F2. Enzyme levels decreased by 11.9

% in HUVECs exposed to 120 nM hsa-miR-24-3p. The CYP4F2 rs2108622 C/C, rs1558139 G/G, rs2074902 T/T and the CYP4F2 rs3093135 A/T variants were detected in HUVEC`s cells.

(9)

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju visiems, prisidėjusiems prie šio magistro baigiamojo darbo rengimo. Ypač dėkoju griežtam, bet visada teisingam ir motyvuojančiam darbo vadovui dr. Vaciui Tatarūnui. Taip pat esu dėkinga prie darbo reikšmingai prisidėjusiai Kardiologijos instituto laborantei Ievai Eitminavičiūtei bei Farmacinių technologijų instituto mokslo darbuotojui Vaidotui Žvikui. Ačiū tariu ir kitiems prisidėjusiems, bet nepaminėtiems.

(10)

SANTRUMPOS

ŠKL - širdies ir kraujagyslių ligos (angl. cardiovascular disease) FXa - Xa krešėjimo faktorius (angl. coagulation factor Xa)

20-HETE - 20-hidroksieikozatetraenoinė rūgštis (angl. 20-hydroxyeicosatetraeonic acid) VTE - venų tromboembolija (angl. venous thromboembolism)

PAR - proteazių aktyvuotas receptorius ( angl. protease-activated receptor) NGAK - naujasis geriamasis antikoaguliantas (angl. new oral anticoagulant) P-gp - p-glikoproteinas (angl. P‐glycoprotein)

Bcrp - koduotas ABCG2 geno, krūties vėžio atsparumą lemiantis baltymas (angl. breast cancer resistance protein)

ARA - arachidono rūgštis (angl. arachidonic acid)

miRNR (miR) - mikroribonukleino rūgštis (angl. microribonucleic acid, miRNA)

HUVEC - žmogaus virkštelės venos endotelio ląstelės (angl. human umbilical vein endothelial cells)

ELISA - imunofermentinės analizės tyrimo metodas (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) PBS - fosfatinis buferinis tirpalas (angl. phosphate-buffered saline)

UESCh-MS - ultraefektyvioji skysčių chromatografija-masių spektrometrija (angl. ultra-performance liquid chromatography–mass spectrometry)

SC-MS Q-TOF - skysčių chromatografija-kvadrupolio-praskriejimo laiko masių spektrometrija (angl.

liquid chromatography and time-of-flight mass spectrometry)

PGR - polimerazės grandininė reakcija (angl. polymerase chain reaction, PCR) DNR - deoksiribonukleorūgštis (angl. deoxyribonucleic acid, DNA)

m/z - masės ir krūvio santykis jonizuotoje formoje (angl. mass-to-charge ratio)

(11)

SĄVOKOS

Angiogenezė - procesas, kurio metu formuojasi naujos kraujagyslės iš jau esančios kraujagyslės [1].

Eikozanoidai (prostaglandinai, leukotrienai ir lipoksinai) - lipidai, gaunami arachidono rūgšties metabolizmo metu. Atlieka svarbias funkcijas fiziologinių bei patologinių procesų metu [2].

Oksidacinis stresas - pusiausvyros tarp oksidantų ir antioksidantų sutrikimas pirmųjų naudai, dėl kurios įvyksta oksidacinė pažaida [3].

Polimorfizmas - DNR sekos pokytis tam tikroje genetinėje srityje, kurio dažnis populiacijoje yra ne mažiau kaip 1 procentas [4].

(12)

ĮVADAS

Pasaulio sveikatos organizacija skelbia, jog nuo širdies ir kraujagyslių ligų (ŠKL) kasmet miršta apie 18 milijonų žmonių. ŠKL ligos yra dažnesnės vyresnio amžiaus žmonių populiacijoje. ŠKL - pagrindinė sergamumo ir mirštamumo priežastis pasaulyje [5]. ŠKL gydyti, kuomet gresia tromboembolinės komplikacijos, skiriami antikoaguliantai [6]. Šie vaistai leidžia išvengti tokių būklių kaip galvos smegenų insultas ar sisteminės embolijos dėl prieširdžių virpėjimo [7]. Jau daugiau kaip pusšimtį metų klinikinėje praktikoje skiriamą varfariną po truputį išstumia naujos kartos antikoaguliantai, vienas iš jų - rivaroksabanas [8]. Šis vaistas slopina Xa krešėjimo faktorių (FXa) ir yra naudojamas venų tromboembolijos gydymui bei prevencijai. Vaistas padeda išvengti insulto ar plaučių embolijos [9].

Rivaroksabanas klinikinėje praktikoje naudojamas neseniai, todėl šio vaisto metabolizmas, tikslus poveikio mechanizmas nėra gerai ištirti.

Yra gerai žinoma, jog organizmo atsakui į gydymą vaistais, įtaką daro šių vaistų metabolizmo ypatumai, kurie gali skirtis priklausomai nuo individo ypatumų. Nors šiuo metu yra žinoma, jog rivaroksabaną metabolizuoja CYP3A4, CYP3A5 ir CYP2J2 fermentai; remiantis ankstesniais laboratorijoje atliktais tyrimais, darėme prielaidą, jog vaisto biotransformacijai įtakos gali turėti ir citochromų P450 šeimos fermentas CYP4F2 [10].

Yra pastebėta, jog skiriant rivaroksabaną, yra pasiekiamas prieuždegiminis poveikis. Be to, yra žinoma, kad CYP4F2 fermentas arachidono rūgštį, kuri skatina uždegimą ir taip aktyviną krešėjimo sistemą, metabolizuoja į 20-hidroksieikozatetraenoinę rūgštį (20–HETE), kuri slopina trombocitų agregaciją [11, 12] ir turėtų slopinti uždegimą. Tačiau, tikslus šio poveikio mechanizmas nėra aiškus.

CYP4F2 koduoja genas CYP4F2, kuris pasižymi kliniškai reikšmingu polimorfizmu [13]. Genų variantai nulemia koduojamo baltymo aktyvumą [14]. Šio tyrimo metu nustatytas geno variantas, nulemiantis fermento aktyvumą HUVEC ląstelėse.

Šiame darbe endotelio ląstelėse buvo nustatytas rivaroksabanas ir dalis neaktyvių jo metabolitų.

Vykdant tyrimą buvo atrasta medžiaga, kuriai daro įtaką rivaroksabano koncentracija, nors iki šiol moksliniuose šaltiniuose apie tai duomenų nėra. Gauti rezultatai patvirtinto, jog rivaroksabanas ir CYP4F2 fermento inhibitorius mažina fermento kiekį, todėl galimai turi įtakos uždegiminiuose procesuose bei vaisto farmakokinetikai, nuo kurios priklauso ir vartojamo vaisto terapinis efektyvumas.

Šio magistro baigiamojo darbo tikslas buvo nustatyti rivaroksabano metabolitus, naujus junginius, susijusius su vaisto poveikiu, ištirti CYP4F2 fermento inhibitorių įtaką antikoagulianto metabolizmui endotelio ląstelių kultūrose.

(13)

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: nustatyti rivaroksabano metabolitus, naujus junginius, susijusius su vaisto poveikiu, ištirti CYP4F2 fermento inhibitorių įtaką antikoagulianto metabolizmui endotelio ląstelių kultūrose.

Darbo uždaviniai:

1. Identifikuoti rivaroksabano metabolitus endotelio ląstelių terpėse, paveikus HUVEC ląsteles skirtingomis vaisto koncentracijomis.

2. Nustatyti naujus junginius, kurie susidaro veikiant HUVEC ląsteles skirtingomis rivaroksabano koncentracijomis.

3. Nustatyti skirtingų rivaroksabano koncentracijų ir CYP4F2 fermentų inhibitorių įtaką CYP4F2 fermento kiekiui endotelio ląstelių terpėse.

4. Nustatyti CYP4F2 geno variantus endotelio ląstelėse.

(14)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Antikoaguliantai

Trombozė yra pagrindinė priežastis galinti sukelti venų tromboemboliją (VTE), kuri lemia vieną iš keturių mirčių visame pasaulyje. Dėl šios priežasties antikoaguliantai išlieka itin aktualūs klinikinėje praktikoje. Antikoaguliantai yra skirstomi į vartojamus parenteraliai bei geriamuosius antikoaguliantus (1 pav.). Parenteriniai antikoaguliantų preparatai yra greito veikimo ir naudojami pirminiam gydymui, o ilgalaikiam gydymui skiriami geriamieji antikoaguliantai. Stebima tendencija, jog senesnių kartų vaistai yra keičiami naujesniais preparatais, pavyzdžiui, parenteraliai vartojamą nefrakcionuotą hepariną keičia mažos molekulinės masės heparinas, vartojami fondaparinuksas ir bivalirudinas. Geriamuosius vitamino K antagonistus dažnu atveju keičia naujos kartos geriamieji antikoaguliantai [16].

Vitamino K antagonistai yra netiesioginio veikimo antikoaguliantai (pvz., varfarinas, acenokumarolis), kurie klinikinėje praktikoje skiriami daugelį metų, siekiant išvengti tromboembolinių komplikacijų (VTE, insultas, sisteminė embolija). Vartojant šiuos preparatus dėl siauro jų terapinio lango, neretam pacientui pasireiškia kraujavimas, kuris gali nulemti net ir paciento mirtį. Šiuos vaistus vartojantiems pacientams turi būti atliekami rutininiai laboratoriniai kraujo krešėjimo sistemos tyrimai. Be to, šiems vaistams būdinga lėta veikimo pradžia, didelė maisto ir vaisto sąveikos rizika bei dažnos sąveikos su kitais vaistiniais preparatais [17, 18]. Naujos kartos geriamieji antikoaguliantai, kaip skelbiama gamintojų pateikiamoje informacijoje apie vaistą, šiais minėtais trūkūmais nepasižymi.

Klinikinėje praktikoje dažniausiai skiriami trys aktyvuoto FXa inhibitoriai rivaroksabanas, apiksabanas ir edoksabanas bei trombino inhibitorius dabigatranas [19]. Jie užtikrina didesnį saugumą, o veiksmingumas prilygsta vitamino K antagonistams (pvz., varfarinui) [16]. Šie antikoaguliantai turi pranašumą palyginus su vitamino K antagonistais, nes jiems būdinga greitesnė veikimo pradžia, nėra būtinas reguliarus dozės monitoravimas dėl plataus terapinio lango, dėl mažesnės kraujavimo rizikos – mažas priešnuodžio poreikis, nėra sąveikų su maistu bei mažai stiprių sąveikų su kitais vaistiniais preparatais. Vienas iš šių vaistų trūkumų - jie yra gana brangūs. Klinikiniai duomenys rodo, jog naujieji antikoaguliantai yra tinkamesni už varfariną tik šių ligų gydymui: insulto, sukelto dėl prieširdžių virpėjimo, prevencijai ir gydymui bei antrinei VTE prevencijai [18, 20].

Naujausių tyrimų duomenimis, FXa ir trombinas kraujo krešėjimo procesuose dalyvauja ne tik veikdami įprastiniu keliu (kraujo krešėjimo sistemos kaskada, kurios galutinis produktas – aktyvuotas fibrinas ir susidaręs trombas), bet veikia ir proteazių aktyvuotą receptorių (PAR), kuris yra beveik visuose

(15)

audiniuose ir ląstelėse [19]. Taigi, FXa keičia su oksidaciniu stresu susijusių baltymų ekspresijos lygį pacientams, kurie serga ŠKL [19, 21]. FXa stimuliuojant PAR-1 ir PAR-2 bei suaktyvinus į insuliną panašaus augimo veiksnius jungiantį baltymą 5 (IGFBP5) sukelia priešuždegiminį efektą kraujagyslių sienelės ląstelėse [19].

Tyrimai rodo, jog naujieji geriamieji antikoaguliantai (NGAK) silpnina endotelio sąveiką su leukocitais ir trombocitais, kuri yra svarbi uždegiminiame ir antitromboziniuose procesuose [19].

1 pav. Antikoaguliantų klasifikacija [15]

1.2. Rivaroksabanas

Rivaroksabanas yra selektyvus geriamasis tiesioginis FXa inhibitorius, kuris naudojamas VTE atvejų prevencijai po viso klubo sąnario keitimo operacijų suagusiems pacientams ar viso kelio sąnario keitimo operacijų. Tai mažos molekulinės masės junginys, kuris beveik netirpsta vandenyje, bet gerai jungiasi su plazmos baltymais (92-95 proc.), daugiausia su albuminais (2 pav.) [22].

(16)

2 pav. Rivaroksabano cheminė struktūra

Veikimo mechanizmas:

Rivaroksabanas yra geriamasis tiesioginis FXa inhibitorius. Jo pagrindą sudaro oksazolidono struktūra, kuria tiesiogiai jungiasi prie FXa per šio faktoriaus S1 ir S4 kišenes [23]. Šis NGAK yra selektyvus ir grįžtamai slopina aktyvuotą FXa , kuris yra susietas su išoriniu ir vidiniu kraujo krešėjimo keliu. Slopinant FXa yra stabdomas protrombino virtimas trombinu per protrombinazės kompleksą.

Trombinas fibrinogeną verčia fibrinu, ko pasekoje susiformuoja trombas (3 pav.) [24]. Rivaroksabanas ne tik sutrikdo kraujo krešėjimo kaskadą, bet gali daryti įtaką ir uždegimo bei lipidų metabolizmo eigai [19].

Rivaroksabanas slopina tiek laisvą, tiek su krešuliu sujungtą FXa. Šio vaisto antikoaguliaciniam poveikiui nėra reikalingi kofaktoriai (pvz., antitrombinas) [23].

(17)

3 pav. Rivaroksabano veikimo mechanizmas

Struktūros-aktyvumo ryšys:

4 pav. Rivaroksabano struktūros-aktyvumo ryšys

(18)

5 pav. Xa faktorius [25]

Rivaroksabanas pagal IUPAC nomenklatūrą vadinamas 5-chlor-N-[[(5S)-2-okso-3-[4-(3- oksomorfolin-4-il)fenil]-1,3-oksazolidin-5-il]metil]tiofen-2-karboksamidas. Vaisto cheminės struktūros pagrindą sudaro oksazolidono struktūra, kuria vaistas jungiasi prie fermento. Du vandeniliai ryšiai tarp oksazolidono žiedo ir fermente esančio glicino219 turi didelį afinitetą [25, 26]. Prisijungimas prie S1 ir S4 ligandų tinkamu atstumu lemia stiprų inhibuojantį poveikį. 5-chlorotiofeno-2-karboksamido struktūra yra pagrindinis FXa inhibuojantis fragmentas, chloras jungiasi prie tirozino aminorūgšties bei susidaro vandenilinis ryšys tarp amide esančio azoto ir glicino216 [25]. S konfigūracija būtina sąveikai su FXa, kuri sudaro L formos molekulę. 4-aminomorfolino-3-onas būtinas didesniam efektyvumui, didina vaisto biopraeinamumą [26] (4 pav. ir 5 pav.).

1.3. Rivaroksabano metabolizmas

Maždaug trečdalis per os suvartoto rivaroksabano nepakitusios formos yra šalinama per inkstus, likusi dalis metaboliškai skaidoma kepenyse ir pašalinama per tulžį ir šlapimą [27]. NGAK rivaroksabaną metabolizuoja keletas CYP-nepriklausomų fermentų, todėl šis vaistas pasižymi mažesne vaistas-vaistas sąveika, palyginus su senesniais antikoaguliantais. Vis tik, yra nustatyta, jog pagrindinis šio vaisto metabolizmo kelias yra per citochromo P450 CYP3A4, CYP3A5 bei CYP2J2 fermentų sistemas [28].

(19)

Tyrimai rodo, jog vienas svarbiausių fermentų yra CYP3A4, kuris metabolizuoja 18 proc. vaisto, o taip pat ir CYP2J2, kuris nulemia 14 proc. vaisto dozės metabolizmo [29]. Biotransformacijos metu vyksta morfolinono fragmento oksidacinis skaidymas ir amidinių jungčių hidrolizė [30]. Be oksidacinės biotransformacijos, ne-CYP fermentai yra atsakingi už 14 proc. vaisto eliminacijos [24]. Metabolizmas yra susijęs su P-glikoproteinu (P-gp) ir Bcrp (koduotas ABCG2 geno, krūties vėžio atsparumą lemiantis baltymas). In vitro tyrimai patvirtino, jog P-gp ir Bcrp yra svarbūs vaisto transportavimui ir metabolizmui [30]. Rivaroksabanas yra P-gp substratas. P-gp yra daugeliui vaistų atsparus baltymas, kuris išreikštas daugelyje organų ir audinių, ypač šalinimo organuose [31], kas nulemia mažesnį rivaroksabano vaistas-vaistas sąveikų dažnį.

Rivaroksabanas yra pagrindinis junginys, kuris neturi farmakologiškai aktyvių metabolitų [30].

Žmogaus kraujo plazmoje rivaroksabano yra aptinkama daugiausia (apie 89 proc. AUC), tai rodo, jog susidarančių metabolitų kiekis minimalus [24]. Yra nustatyta 18 susidarančių metabolitų, kurie yra greitai pašalinami iš organizmo. Jaunų žmonių pusinės eliminacijos laikas yra 5-9 valandos, o vyresnių žmonių 11-13 valandų [32]. Vykstant oksidaciniam metabolizmui susidaro M-2, M-3, M-8, M-9 metabolitai [33].

Oksiduojant M-2 yra suskaidomas morfolinono žiedas ir susidaro M-1 metabolitas (6 pav.). Kitu metabolizmo keliu, vykstant morfolinono fragmente esančio laktamo amidinio ryšio hidrolizei susidaro M-7 [24]. Taip pat vykstant hidrolizei susidaro M-13 ir M-15. M-15 oksiduojamas į tarpinį aldehidą M-16, kuris gali būti redukuotas iki alkoholio darinio M-17 arba oksiduotas iki karboksirūgšties darinio M-18. M-13 yra M-4 pirmtakas. Rivaroksabano amidinis ryšys yra hidrolizuojamas ir susidaro M-13, kuris konjuguojamas su glicinu, susidarant M-4 metabolitui (7 pav.) [24, 33]. Yra ir kitas M-4 susidarymo kelias - oksidacinis. Rivaroksabanas skyla į M-16 ir M-14, kuris vėliau hidrolizuojamas į M-13 ir vykstant konjugacijai su glicinu susidaro M-4 (8 pav.) [33]. Mažiausias metabolitas M-5 gali susidaryti įvykus oksidaciniam morfolinono žiedo fragmentui [24, 33]. Taip pat gali būti nustatyti M-6, M-10, M-11, M-12, M-14 metabolitai [33]. Apibendrinant, rivaroksabano metabolizmas kepenyse vyksta dviem keliais: per CYP šeimos fermentus, vykstant morfolinono žiedo oksidaciniam skaidymui bei nuo CYP nepriklausančiai amidinių jungčių hidrolizei [24, 33].

(20)

6 pav. Rivaroksabano metabolizmas in vitro, adaptuota pagal Lang D. ir kt., 2009 [33]

7 pav. Hidrolizinis rivaroksabano skilimas, adaptuota pagal Lang D. ir kt., 2009 [33]

(21)

8 pav. Rivaroksabano oksidacinis metabolizmas, adaptuota pagal Lang D. ir kt., 2009 [33]

1.4. CYP4F2 fermentas ir oksidacinis stresas

CYP4F2 yra žmogaus citochromo CYP450 šeimos fermentas, kuris išreikštas inkstuose, kepenyse, širdyje, plaučiuose ir leukocituose. Daugiausiai šio fermento aptinkama inkstuose ir kepenyse, tačiau yra ir endotelio ląstelėse [34]. Fermentas reguliuoja inkstų, smegenų ir griaučių raumenų susitraukimus, dalyvaujant leukotrienui B4 ir 20-HETE, kurie susidaro vykstant arachidono rūgšties (ARA) metabolizmui [35].

ARA yra ląstelių membranose esanti polinesočioji riebalų rūgštis. Ši rūgštis gali būti metabolizuojama trimis keliais: ciklooksigenazės, lipooksigenazės bei citochromo P 450 CYP4A ir CYP4F pošeimio fermentais (9 pav.). Iš jos gali susidaryti metabolitai, turintys skirtingą poveikį uždegiminėse reakcijose: prostaglandinai, prostaciklinai, tromboksanai, leukotrienai, 20-HETE ir kt. [36].

CYP4F2 fermentas iš ARA gamina oksilipiną 20-HETE, kurį katalizuoja CYP ω-hidroksilazė.

Nustatyta, jog padidėjusi 20-HETE gamyba gali sukelti oksidacinį stresą ir endotelio ląstelių pažeidimus bei hiperlipidemiją, o tai yra ŠKL rizikos veiksnys [14, 37]. Turimi duomenys rodo, jog aukštas 20-HETE

(22)

pat, 20-HETE dalyvauja miokardo infarkto, išeminio galvos smegenų insulto bei gali būti hipertenzijos išsivystymo priežastis, nes lemia reikšmingą kraujagyslių susiaurėjimą [35, 37, 38]. Oksidacinis stresas skatina superoksidų gamybą, kuri prasideda nuo ARA. Alkoholio dehidrogenazė 20-HETE toliau oksiduoja iki 20-karboksi-arachidono rūgšties (20-COOH-AA) [34]. 20-HETE dalyvauja reguliuojant kraujagyslių tonusą, skatina endotelio ląstelių disfunkciją ir aktyvaciją [39].

Endotelio ląstelės gali pagaminti ribotą kiekį eikozanoido 20-HETE. Eikozanoidas skatina kraujagyslių susiaurėjimą bei slopina NO sintezę, ko pasekoje sutrinka acetilcholino sukelta vazorelaksacija. Įrodyta, jog 20-HETE gali lemti hipertenziją, sukelia angiogenezę bei ląstelių proliferaciją per kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ekspresijos padidėjimą [40].

9 pav. Arachidono rūgšties metabolizmas

1.5. CYP4F2 fermento inhibitoriai

Rivaroksabano metabolizme dalyvaujančius CYP3A ir P-gp inhibuoja ketokonazolas, itrakonazolas, vorikonazolas. Naujausi tyrimai rodo, jog ketokonazolas gali slopinti ir fermentą CYP4F2, bet šio vaisto poveikis silpnas [41]. Fermento kiekį galima sumažinti per genų raišką. Mikroribonukleino

(23)

rūgštis (miRNR) yra 19-25 nukleotidų sekos molekulė, kuri reguliuoja genų ekspresiją. Yra nustatyta, jog specifinės miRNR atlieka svarbų vaidmenį širdies ir kraujagyslių vystymęsi bei fiziologiniuose procesuose [42, 43]. Slopinant miR-24 padidėja endotelio kraujagyslių aktyvumas bei proliferacija [44].

Taip pat yra įrodyta, jog didesnė hsa-miR-24-3p ekspresija yra susijusi su sumažėjusiu fermento CYP4F2 kiekiu [12].

1.6. CYP4F2 geno variantai

CYP4F2 genas yra 19p13.12 chromosomoje, kuri susideda iš 13 egzonų, kurie atskirti 12 intronų [45]. Geną sudaro apie 20 000 bazių porų. CYP4F2 genas koduoja 520 aminorūgščių bei pasižymi polimorfizmu, manoma, jog geno variantai gali būti širdies ir kraujagyslių ligų, insulto bei hipertenzijos rizikos faktoriai [35, 46]. Reikšmingiausi klinikoje geno variantai rs2074902, rs3093135, rs1558139 ir rs2108622 pažymėti paveiksle (10 pav.). Žinoma, jog rs1558139 ir rs2108622 lemia ω-hidroksilazės aktyvumą, o tai daro įtaką 20-HETE gamybai [38]. Mokslinėje literatūroje nėra duomenų apie CYP4F2 geno polimorfizmo įtaką rivaroksabano dozės parinkimui, tačiau yra nemažai studijų apie CYP4F2 polimorfizmo įtaką varfarino metabolizmui.

Tyrimas su lietuvių pacientais parodė, jog dažniausiai pasitaikantis CYP4F2 rs2108622 geno variantas yra C/C (53,3 proc.), mažiau būdingi - T/C (39,1 proc.) ir T/T (7,6 proc.) [14]. Šio varianto dažnis panašus rusų, kinų, kitų azijiečių, europiečių populiacijose [14, 47]. Laukinio tipo homozigotinis variantas C/C susijęs su fermento funkcijos praradimu. Įrodyta, jog pacientams, vartojantiems varfariną, reikia mažesnių dozių [48], tačiau T/C genotipas lemia mažesnę riziką sirgti vainikinių širdies kraujagyslių ligomis [49].

Japonijoje nustatyta, jog rs1558139 yra susijęs su hipertenzijos patogeneze. Populiacijų tyrimai parodė, jog asmenys, sergantys hipertenzija, 1,24 karto dažniau turėjo homozigotinį genotipą A/A, palyginus su homozigotiniu G/G bei heterozigotiniu G/A [47]. C/T genotipas susijęs su sumažėjusia hipertenzijos rizika [51]. Lietuvoje tirta CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozei mažoje pacientų imtyje.

Nustatyta, jog pacientams, turintiems G/G variantą, reikalinga didesnė įsotinimo dozė, bet mažesnė dozė ilgalaikiam vartojimui, palyginus su G/A ir A/A genotipą turinčiais [49].

Apie CYP4F2 rs2074902 tyrimų atlikta labai mažai. Žinoma, jog jis yra susijęs su Krono liga [51]. CYP4F2 rs3093135 yra susijęs su širdies ir kraujagyslių sistemos ligų rizika. Kinijoje atliktas tyrimas parodė, jog T/C/G haplotipas yra susijęs su padidėjusia širdies miokardo infarkto rizika vyrams

(24)

10 pav. CYP4F2 genas su pažymėtais geno variantais.

1.7. HUVEC ląstelės kaip ŠKL tyrimų modeliai

ŠKL ligos dažnai susijusios su endotelio disfunkcija, kuri progresuoja vykstant kraujagyslių pažeidimams. Siekiant ištirti ŠKL patogenezę, vykdomi tyrimai su gyvūnais, tačiau tokie modeliai dažnai tiksliai neatkuria žmogaus organizmo sąlygų. Tyrimai in vitro, taikant žmogaus ląsteles, leidžia detaliau išnagrinėti mechanizmus, kurie vyksta pasirinktose tirti ląstelėse – taikiniuose arba net gi ląstelių kultūrų modeliuose, kas priartina in vitro eksperimentus prie in vivo sąlygų.

Gilinantis į ŠKL ligas yra pasitelkiamos žmogaus virkštelės venos endotelio ląstelės (HUVEC).

Nors ši ląstelių kultūra neatspindi visų žmogaus endotelio ląstelių tipų, bet ji yra tinkamas žmogaus endotelio tyrimų modelis, įgalinantis atlikti kraujagyslių endotelio savybių tyrimus [5].

(25)

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo planavimas

Magistro baigiamojo darbo tyrimai buvo atliekami LSMU MA KI Molekulinės kardiologijos laboratorijoje. Pirmo etapo metu buvo analizuojama mokslinė literatūra, susijusi su baigiamojo darbo tema, bei susipažinta su darbo laboratorijoje taisyklėmis. Sekančių etapų metu buvo atliktas ląstelių kultūrų auginimas flakonuose, genotipavimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodu, pasitelkti skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos metodai, imunofermentinės analizės tyrimo metodas ELISA. Tyrimui vykdyti buvo gautas LSMU Bioetikos centro leidimas Nr. BEC-FF-09, 2019-12-05 (priedas Nr.1).

2.2. Tyrimo objektas

Magistro baigiamojo darbo tyrimai buvo atlikti pasitelkiant komercines HUVEC ląsteles, kuriose yra išreikštas CYP4F2 aktyvumas. Ląstelių efektyvumas yra patvirtintas gamintojo. Garantuojama, kad gyvybingumas bus ≥ 70 proc. Gamintojas nurodo, jog ląstelėse neturėjo būti mikoplazmų, bakterijų, mielių ar kitų grybelių, hepatito B, hepatito C ir ŽIV-1 virusų.

2.3. Tyrimo metodai

2.3.1. Užšaldytų ląstelių atšildymas

HUVEC buvo auginamos Medium 200 terpėje su antibiotiku (penicilino-streptomcino mišinys 10,000 U/ml) bei praturtintoje Large Vessel Endothelial Supplement (LVES) (50X) terpės priedu. Prieš užsėjant, -80 °C temperatūroje kriomėgintuvėlyje užšaldytos HUVEC ląstelės atšildomos ir perkeliamos į mėgintuvėlį. Užpilama 5 ml 37 °C temperatūroje sušildytos terpės ir centrifuguojama 5 minutes 700 × g greičiu, kambario temperatūroje. Viršutinis sluoksnis nupilamas, ant ląstelių užpilama 5 ml šviežios terpės su antibiotiku ir perkeliama į 25 cm²flakoną. Kitą dieną po užsėjimo, pakeičiama terpė.

(26)

2.3.2. Ląstelių kultivavimas

HUVEC ląstelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje, inkubatoriuje palaikant 5 proc. anglies dioksido (CO2) hipoksines sąlygas. Kas 2-3 dienas pakeičiama šviežia Medium 200 ląstelių mitybinė terpė su antibiotiku bei yra pašalinamos neprikibusios ir žuvusios ląstelės. Ląstelės yra auginamos 25 cm² flakone, į jį pilama 5 ml šviežios terpės su antibiotiku. Ląstelių kultūra auginama iki reikiamo tankio, kol prikibusios ląstelės padengia apie 80 proc. flakono augimo paviršiaus (nuo ląstelių užsėjimo praėjus maždaug 7 dienoms) ir tada ląstelės persėjamos arba ląstelių suspensija panaudojama tyrimams.

2.3.3. HUVEC persėjimas

Kai ląstelės padengia 80 proc. flakono augimo paviršiaus, būtina atlikti persėjimą. Tokiu atveju, sena terpė yra nupilama, ląstelės plaunamos du kartus po 2 ml fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), tirpalas nupilamas. Užpilama 1,5 ml tripsino (tripsinas atkelia ląsteles nuo flakono augimo paviršiaus ir suardo baltyminius ryšius tarp ląstelių) ir 3-5 minutes inkubuojama 37 °C temperatūroje, esant 5 proc. CO2 ir inversiniu mikroskopu stebima, ar ląstelės atkibo nuo paviršiaus. Flakonas gali būti švelniai pastuksenamas pirštais, kad ląstelės geriau atkibtų nuo paviršiaus. Ląstelėms atkibus, tripsinas neutralizuojamas užpilant 4 ml Medium 200 terpės be antibiotikų, tuomet ląstelių suspensija perkeliama į centrifuginį mėgintuvėlį. Centrifuguojama 5 minutes 700 × g greičiu, kambario temperatūroje. Iš nucentrifuguoto mėgintuvėlio viršutinis sluoksnis nupilamas iki 1 ml ribos ir užpilama 2 ml mitybinės terpės su antibiotiku, suspenduojama. Į du naujus flakonus pilama po 5 ml terpės su antibiotiku bei po 1,5 ml ląstelių suspensijos ir flakonai su ląstelių kultūra laikomi inkubatoriuje, kuriame palaikoma 37 °C temperatūra, pripildytame 5 proc. CO2 dujomis. Tolimesniuose pasažuose ląstelės kultivuojamos taip pat:

mitybinė terpė keičiama kas 2-3 dienas iki tol, kol ląstelės dengia 80 proc. flakono augimo paviršiaus ploto.

2.3.4. HUVEC užšaldymas

Jei reikia ląsteles užšaldyti, vykdomi persėjimo procedūros etapai, išskyrus paskutinįjį. Į kriomėgintuvėlį yra pilama 900 µl ląstelių suspensijos ir 100 µl dimetilsulfoksido, švelniai supipetuojama.

(27)

kriomėgintuvėlis su ląstelėmis įdedamas į termoizoliacinę dėžę (pvz., putų polistirolo) ir yra perkeliamas į -80 °C temperatūros šaldiklį.

2.3.5. Ląstelių mikroskopavimas

Ląstelės yra mikroskopuojamos, norint vizualiai įvertinti ląstelių kiekį bei flakono paviršiaus padengimą. Taip pat mikroskopuojama vykdant ląstelių persėjimą, kai ląstelės paveikiamos tripsinu ir inkubuojamos, stebima ar atkibo ląstelės nuo flakono paviršiaus. Molekulinės kardiologijos laboratorijoje mikroskopavimas vykdomas su EVOS inversiniu mikroskopu, kurio objektyvas didina 10x, okuliaras 10x, t.y. vaizdas padidinamas 100 kartų. Ląstelės joms būdingą morfologiją įgyja jau sekančią dieną po užsėjimo. Per maždaug septynias dienas, ląstelės padengia apie 80 proc. flakono ploto. Atliekamas persėjimas. Ląstelėms yra būdinga verpstės forma ir plonėjantys galai. HUVEC ląstelės susietos viena su kita kolonijomis (11 pav.).

11 pav. HUVEC ląstelių vaizdas per inversinį mikroskopą

2.3.6. HUVEC veikimas rivaroksabanu

Eksperimentui atlikti ląstelės užauginamos 6 šulinėlių plokštelėse, 1 šulinėlio paviršiaus plotas yra 8,96 cm², kol monosluoksniu padengia 80 proc. šulinėlio paviršiaus ploto. Pakeičiama ląstelių terpė,

(28)

rivaroksabano (0,1 µM, 0,2 µM, 0,5 µM, 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM) tirpalu bei vienas šulinėlis paliekamas kontrolei. Inkubuojama 24 valandas.

2.3.7. HUVEC transfekcija hsa-miR-24-3p

Eksperimentui atlikti ląstelės auginamos šulinėliuose. Kai ląstelės monosluoksniu padengia apie 80 proc. šulinėlio paviršiaus ploto, mitybinė terpė nupilama ir vykdoma ląstelių transfekcija 120 nM hsa-miR-24-3p imitatorių mišiniu, kurį sudaro transfekcijos reagentas lipofektaminas ir specifinė miRNR hsa-miR-24-3p santykiu 1:1. Mišinys turėtų sumažinti fermento CYP4F2 geno raišką HUVEC ląstelėse.

Užpilama šviežia Medium 200 mitybinė terpė be antibiotikų. Inkubuojama 24 valandas ir vykdomi tolimesni tyrimai.

2.3.8. Vaisto ir jo metabolitų tyrimai ultraefektyviosios skysčių chromatografijos- trigubo kvadrupolio masių spektrometrijos metodu

Praėjus 24 valandoms, surenkamos ląstelių augimo terpės. 1,5 ml pradinės terpės koncentruojamos vakuume esant 65 °C temperatūrai, kol tūris pasiekia 300 µl. Terpės perpilamos į chromatografinius mėgintuvėlius (vialus) su integruotu stiklo įdėklu.

Rivaroksabano ir jo metabolitų atskyrimui chromatografavimo mobilią fazę sudarė šie tirpikliai (eliuentai): 0,1 proc. skruzdžių rūgštis (A) ir acetonitrilas (B), santykiu 75A/25B. Tėkmės greitis buvo 0,4 ml/min. Chromatografija atlikta, naudojant Acquity H-class UPLC system (Waters, USA) chromatografą. Detekcijai naudotas trigubo kvadrupolio masių spektrometras (Xevo, Waters, USA) su elektropurkštuviniu jonizacijos šaltiniu. Atliktas teigiamos jonizacijos skenavimo metodas. Tyrimui naudota prieškolonėlė ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard (1,7 µm, 2,1 mm x 5 mm) ir kolonėlė ACQUITY UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 mm x 100 mm).

(29)

2.3.9. Naujų junginių nustatymas skysčių chromatografijos-kvadrupolio- praskriejimo laiko masių spektrometrijos metodu

Paveiktų HUVEC ląstelių terpės buvo tiriamos ne tik ultraefektyviąja skysčių chromatografija-trigubo kvadrupolio masių spektrometrija (UESCh-MS), bet ir buvo taikoma skysčio chromatografija-kvadrupolio-praskriejimo laiko masių spektrometrija (SC-MS Q-TOF). Terpės buvo koncentruojamos ir perkeliamos į chromatografinius mėgintuvėlius (vialus) su integruotu stiklo įdėklu.

Tyrimo sąlygos pateiktos lentelėje.

1 lentelė. Tyrimo sąlygos naudojant SC-MS Q-TOF

Parametras Sąlygos

Chromatografinė kolonėlė ACQUITY UPLC BEH C18 Column 1,7 µm, 2,1 x 100 mm

Eliuentai A: 0,1 proc. skruzdžių rūgštis

B: acetonitrilas

Pradinės sąlygos 75A/25B

Tėkmės greitis 0,4 ml/min

Jonizacija Teigiama (+)

Kapiliarinė įtampa 4000 V (-)

Purkštuvo įtampa 500 V (-)

Džiovinimo temperatūra 200 °C

Džiovinimo dujų tėkmė 10 l/min

MS ribos 80 - 1200 m/z

(30)

2.3.10. Genominės DNR išskyrimas iš HUVEC

Genominė deoksiribonukleorūgštis (DNR) išskirta naudojant Thermo Scientific „GeneJet Genomic DNA Purification Kit“ rinkinį. Pirmiausia HUVEC ląstelės yra tripsinizuojamos (žiūrėti metodiką auksčiau „HUVEC persėjimas“). Po centrifugavimo terpė nupilama ir užpilama 200 µl PBS ir perkeliama į eppendorf tipo mėgintuvėlį. Tuomet vykdomas genominės DNR išskyrimas:

1. Pridedama 20 µl proteinkinazės K bei 400 µl lizės tirpalo.

2. Mėginys inkubuojamas 56 °C temperatūroje 10 minučių retkarčiais pavartant mėgintuvėlį, kol ląstelės visiškai sulizuojamos.

3. Pridedama 200 µl 96 proc. etanolio ir papipetuojama.

4. Tirpalas perkeliamas į gryninimo kolonėlę ir centrifuguojamas 1 minutę 6000 × g. Kolonėlė perkeliama į 2 ml surenkamąjį mėgintuvėlį.

5. Pridedama 500 µl plovimo buferio I ir centrifuguojama 1 minutę 8000 × g. Pratekėjęs tirpalas pašalinamas ir gryninimo kolonėlė vėl įdedama į surenkamąjį mėgintuvėlį.

6. Pridedama 500 µl plovimo buferio II (su pridėtu etanoliu) į kolonėlę. Centrifuguojama 3 minutes 20 000 × g. Pratekėjęs tirpalas pašalinamas, gryninimo kolonėlė grąžinama į mėgintuvėlį ir centrifuguojama 1 minutę 20 000 × g.

7. Pridedama 200 µl eliuento (buferio), siekiant eliuoti genominę DNR. Inkubuojama 2 minutes kambario temperatūroje, tuomet centrifuguojama 1 minutę 8000 × g.

8. Gryninimo kolonėlė pašalinama. Išgryninta DNR laikoma -20 °C iki tyrimo.

2.3.11. Genotipavimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu

Išskyrus genominę DNR iš HUVEC, galima atlikti genotipavimą tikro laiko PGR metodu.

Tyrimui reikalingi reagentai: 2X TaqMan universalus reakcijos mišinys, vanduo be nukleazių, specifiniai genų sekai pradmenys ir genominė HUVEC ląstelių DNR. Kiekvienai reakcijai naudojama 10 µl reakcijos mišinio ir 1 µl genominės DNR. Genotipavimo reakcijos sudėtis nurodyta 2 lentelėje. Komponentai supilami į 96 šulinėlių plokštelę. Plokštelė užklijuojama optine plėvele ir centrifuguojama 10 sekundžių.

Tuomet gali būti vykdoma reakcija. Reakcijos sąlygos nurodytos 3 lentelėje.

(31)

2 lentelė. Genotipavimo tikro laiko PGR metodu mišinio sudėtis

3 lentelė. Genotipavimo tikro laiko PGR metodu reakcijos sąlygos

2.3.12. Ląstelių lizavimas

Paveikus HUVEC ląsteles rivaroksabanu (0,5 µM, 1 µM, 2 µM) ir 120 nM hsa-miR-24-3p imitatoriumi jos inkubuojamos 24 valandas. Po inkubacijos ląstelių suspensijos paveiktos skirtingų koncentracijų rivaroksabanu, hsa-miR-24-3p bei kontrolinė ląstelių suspensijos buvo užšaldytos -80 °C.

Norint atlikti CYP4F2 kiekio nustatymą ELISA metodu, reikalingi ląstelių lizatai, kurie paruošiami:

1. Atšildyti ląstelių suspensiją.

2. Plauti 1 ml lediniu PBS (4 °C).

3. Centrifuguoti 5 minutes 1500 rpm.

4. Nusiurbti PBS.

5. Įpilti 300 µl lizės buferio, 30 µl homogenato, 5 µl BHT (antioksidantas). Papipetuoti.

6. 10 minučių vykdoma inkubacija ant ledo, retkarčiais pasitelkiant sūkurinę maišyklę.

7. Centrifuguoti 10 minučių 15 000 rpm.

8. Viršutinį sluoksnį perpilti į naują 2 ml eppendorf tipo mėgintuvėlį.

(32)

2.3.13. Fermento CYP4F2 kiekio nustatymas ELISA metodu

CYP4F2 fermento kiekis gali būti nustatomas ELISA metodu. Tyrimo metu fermento CYP4F2 koncentracija buvo nustatyta naudojant komercinį Cloud-Clone CorpELISA rinkinį „Enzyme-linked immunosorbent Assay Kit“. Didelėms molekulėms aptikti, tokioms kaip baltymai, yra naudojamas

„sumuštinio“ tipo ELISA imunofermentinis metodas, paremtas antikūno prisijungimu prie antigeno.

Tyrimo eiga:

1. Ląstelių lizatai centrifuguojami 10 minučių 1500 × g.

2. 100 µl lizato įpilama į šulinėlį. Plokštelė užklijuojama originalia plėvele ir inkubuojama 1 valandą 37 °C temperatūroje.

3. Po inkubacijos lizatai iš šulinėlių pašalinami. Į kiekvieną šulinėlį įpilama 100 µl reagento A. Plokštelė užklijuojama originalia plėvele ir inkubuojama 1 valandą 37 °C temperatūroje.

4. Po inkubacijos reagentas nusiurbiamas. Į kiekvieną šulinėlį pilama 350 µl plovimo buferio. Palaikoma 1-2 minutes ir skystis nusiurbiamas. Šulinėliai nusausinami ant popieriaus. Taip plaunama 3 kartus.

5. Pilama į kiekvieną šulinėlį po 100 µl reagento B. Plokštelė užklijuojama originalia plėvele ir inkubuojama 30 minučių 37 °C temperatūroje.

6. Po inkubacijos reagentas nusiurbiamas. Į kiekvieną šulinėlį pilama 350 µl plovimo buferio. Palaikoma 1-2 minutes ir skystis nusiurbiamas. Šulinėliai nusausinami ant popieriaus. Taip plaunama 5 kartus.

7. Saugant nuo šviesos, pilama į kiekvieną šulinėlį po 90 µl substrato. Plokštelė užklijuojama originalia plėvele ir inkubuojama 10-20 minučių 37 °C temperatūroje. Tirpalas tampa mėlynas.

8. Į kiekvieną šulinėlį pilama 50 µl „sustabdymo“ tirpalo. Šulinėliuose esantis tirpalas tampa geltonas.

9. Ploštelė dedama į plokštelių skaitytuvą. Absorcija matuojama spektrofotometru 450 nm bangos ilgyje.

(33)

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Rivaroksabano ir jo metabolitų nustatymas endotelio ląstelėse UESCh-MS metodu

Tyrimo metu buvo gilinamasi į rivaroksabano metabolizmo ypatumus HUVEC ląstelėse in vitro sąlygomis. Atlikta kokybinė rivaroksabano ir jo metabolitų analizė ląstelių kultūrų terpėse, naudojant UESCh–MS metodą, kuris dabar yra populiariausias metodas analizuojant vaistus ir jų metabolitus [52].

Rivaroksabanas buvo aptiktas visuose tirtuose HUVEC ląstelių kultūrų terpių mėginiuose, kurie buvo paveikti skirtingomis vaisto koncentracijomis: 0,1 µM, 0,2 µM, 0,5 µM, 1 µM, 2 µM, 5 µM, 10 µM.

Kiekvienos koncentracijos buvo tirta po du mėginius bei du kontroliniai mėginiai. Rivaroksabano teorinis masės/krūvio santykis yra 436 m/z. Sulaikymo laikai pateikti 4 lentelėje. Vidutinis sulaikymo laikas buvo 2,34 min. Duomenų bazėse daugiausia tyrimų yra atlikta rivaroksabaną nustatant iš žmogaus kraujo plazmos, tačiau 2013 metais Turkijoje buvo taikytas atvirkštinių fazių efektyviosios skysčių chromatografijos metodas, siekiant kokybiškai nustatyti rivaroksabaną tabletėse. Atlikus tyrimą nustatyta, jog rivaroksabano sulaikymo laikas yra 2,37 min. Abiejų tyrimų metu gauti rivaroksabano sulaikymo (laiko) rezultatai labai panašūs [22]. Tai parodo, jog šio tyrimo metodika yra tinkama nustatyti vaistą mėginyje net ir nenaudojant standartinio vaisto mėginio su žinoma medžiaga ir jos kiekiu.

4 lentelė. Rivaroksabano sulaikymo laikai

Mėginys Rivaroksabano sulaikymo laikas

Kontrolė (1 mėginys) -

Kontrolė (2 mėginys) -

0,1 µM rivaroksabano (1 mėginys) 2,38 min

1 µM rivaroksabano (1 mėginys) 2,27 min

(34)

Remiantis mokslinėje literatūroje nurodytais metabolitų m/z buvo nustatyti šie metabolitai: M-1, M-2, M-5, M-8, M-10, M-11, M-18 [33]. Tik 5 µM paveiktame rivaroksabano mėginyje nustatytas M-2 metabolitas. Reikia pažymėti, jog šį metabolitą, remiantis literatūros duomenimis yra sunku aptikti, nes jis skyla [33]. Šio tyrimo metu M-2 metabolito sulaikymo laikas buvo 0,53 min (12 pav.). Vykdant tyrimą buvo ieškomi junginiai pagal literatūros šaltiniuose nurodytus m/z, todėl nustatytos metabolitų teorinės masės atitinka literatūros duomenis. M-2 metabolito teorinė masė buvo 452 m/z.

12 pav. M-2 metabolito chromatograma 5 µM rivaroksabano koncentracijos mėginyje

M-2 metabolitas metabolizuojamas ir iš jo susidaro M-1. M-1 metabolitas nustatytas mėginiuose, kurių koncentracija 0,1 µM, 1 µM, 5 µM. Sulaikymo laikai buvo 0,33 min, 0,35 min ir 0,30 min (13 pav.).

Junginio teorinė masė 468 m/z [12]. Didėjant rivaroksabano koncentracijai, didėja metabolito santykinis intensyvumas, tačiau nustatyti metabolitų kiekio iš turimų duomenų negalima.

(35)

13 pav. M-1 metabolito chromatogramos 0,1 µM, 1 µM, 5 µM rivaroksabano koncentracijos mėginiuose

M-5 metabolitas aptiktas mažesnės vaisto koncentracijos mėginiuose. 0,1 µM rivaroksabano koncentracijos mėginyje metabolito sulaikymo laikas buvo 4,29 min, 0,2 µM – 4,24 min, 1 µM- 4,29 min (14 pav.). 0,5 µM rivaroksabano koncentracijos mėginyje metabolitas galbūt nenustatytas dėl klaidos ruošiant mėginį. Nustatyto junginio teorinė masė buvo 454 m/z.

(36)

14 pav. M-5 metabolito chromatogramos 0,1 µM, 0,2 µM, 1 µM rivaroksabano koncentracijos mėginiuose

M-8 metabolitas nustatytas mėginiuose, kurių koncentracija 0,2 µM, 0,5 µM, 1µM, 2 µM.

Sulaikymo laikai: 0,2 µM – 2,95 min, 0,5 µM – 2,97 min, 2 µM – 2,98 min (15 pav.). Junginio teorinė masė 452 m/z.

(37)

M-10 metabolitas nustatytas mėginiuose, kurių koncentracija 0,1 µM, 0,2 µM, 0,5 µM, 2 µM, 10 µM. Metabolito sulaikymo laikai: 0,1 µM – 0,55 min, 0,2 µM – 0,55 min, 0,5 µM – 0,53 min, 2 nm – 0,59 min, 10 µM – 0,57 min (16 pav.). Junginio teorinė masė 468 m/z.

(38)

16 pav. M-10 metabolito chromatogramos 0,1 µM, 0,2 µM, 0,5 µM, 2 µM, 10 µM rivaroksabano koncentracijų mėginiuose

(39)

M-11 metabolitas nustatytas mėginiuose, kurių koncentracija 0,1 µM, 0,2 µM, 5 µM. Metabolito sulaikymo laikai: 0,1 µM rivaroksabano mėginyje – 3,07 min, 0,2 µM – 3,01 min ir 5 µM – 3,01 min (17 pav.). Junginio teorinė masė 468 m/z.

M-15 metabolitas mėginiuose nenustatytas, nes jis metabolizuojamas į M-16. Iš M-16 susidaro M-17 ir M-18 metabolitai. M-18 metabolitas nustatytas visų rivaroksabano koncentracijų mėginiuose.

Sulaikymo laikai: 0,1 µM – 2,81 min, 0,2 µM – 2,80 min, 0,5 µM – 2,85 min, 1 µM – 3,11 min, 2 µM – 2,90 min, 5 µM – 2,90 min, 10 µM – 2,86 min (18 pav.). Junginio teorinė masė 307 m/z.

Nauja tai, jog šiame tyrime, naudojant UESCh–MS metodą, HUVEC ląstelių terpėse buvo nustatytas rivaroksabanas ir kai kurie metabolitai, kurie įprastai nustatomi tiriant kepenų ląsteles. T.y.

tyrimai parodė, jog endotelio ląstelėse vyksta tirto antikoagulianto metabolizmas. Kepenų ląstelėse yra nustatomas didesnis spektras metabolitų, nes kepenyse dažniausiai ir vyksta egzogeninių molekulių metabolizmas, inaktyvacija. Rivaroksabanas organizme metabolizuojamas neintensyviai. Todėl, kaip ir kituose rivaroksabano metabolizmo tyrimuose, rivaroksabanas buvo pagrindinis junginys nustatytas

(40)

18 pav. M-18 metabolito chromatogramos skirtingų rivaroksabano koncentracijų mėginiuose

(41)

3.2. Naujų junginių nustatymas SC-MS Q-TOF metodu

Atlikus detalią SC-MS Q-TOF analizę iš HUVEC ląstelių terpių, kurios paveiktos su skirtingų rivaroksabano koncentracijų tirpalais, nustatytas pikas 5,4-5,5 min, kuris mažėja didinant auginamų endotelio ląstelių rivaroksabano koncentraciją (19 pav.). Nustatyta nauja, su rivaroksabano poveikiu iki šiol nesieta, medžiaga. Šiuo metu rengiama mokslinė publikacija, todėl detalūs šios medžiagos parametrai nebus nurodomi. Yra žinoma, jog nustatytas junginys veikia centrinę nervų sistemą bei skatina angiogenezę, pasižymi priešvėžinėmis bei antimikrobinėmis savybėmis.

19 pav. Kontrolės ir skirtingų rivaroksabano koncentracijų bandinių chromatograma

(42)

3.3. CYP4F2 fermento kiekio nustatymas ELISA metodu

Tyrimo metu buvo siekiama atrasti naują rivaroksabano metabolizmo kelią, kuriame dalyvauja CYP4F2 fermentas. Hipotezės patvirtinimui buvo nustatoma CYP4F2 koncentracija. CYP4F2 fermento kiekis ELISA metodu buvo nustatytas 5 mėginiuose: kontroliniame HUVEC mėginyje, mėginiuose, kuriuose HUVEC ląstelės paveiktos 0,5 µM, 1 µM, 2 µM koncentracijos rivaroksabano tirpalu bei transfekuotų HUVEC ląstelių mėginyje su 120 nM has-miR-24-3p imitatoriumi (20 pav.). Gauti rezultatai parodė, jog rivaroksabanas bei hsa-miR-24-3p imitatorius daro įtaką fermento CYP4F2 koncentracijai.

Visuose mėginiuose fermento CYP4F2 koncentracija buvo mažesnė nei kontroliniame mėginyje, kuriame baltymo koncentracija siekė 230,3 ng/ml. Paveikus HUVEC ląsteles 0,5 µM rivaroksabanu CYP4F2 fermento koncentracija sumažėjo 17,2 proc. ir siekė 190,6 ng/ml. Ryškiausias pokytis gautas paveikus 1 µM rivaroksabanu. Baltymo kiekis sumažėjo 81,3 proc. ir koncentracija siekė 43,1 ng/ml. Didinant koncentraciją iki 2 µM rivaroksabano, tiriamo fermento kiekis sumažėjo iki 33,3 ng/ml, palyginus su kontroliniu mėginiu, t.y. sumažėjo 85,5 proc.

Hsa-miR-24-3p imitatoriumi transfekuotame mėginyje nustatytas CYP4F2 fermento kiekis buvo 203,0 ng/ml, fermento koncentracija sumažėjo 11,9 proc., palyginus su kontroliniu mėginiu (230,3 ng/ml) Tai parodo, jog imitatorius mažina CYP4F2 fermento raišką ir gali būti naudojamas kaip fermento inhibitorius. Įrodžius, jog fermentas dalyvauja rivaroksabano metaboliniuose procesuose, imitatorius galėtų daryti įtaką ir vaisto farmakokinetikai, nuo kurios priklauso vaisto poveikis.

Ieškant ryšio tarp CYP4F2 fermento ir rivaroksabano aktyvumo, tyrimo rezultatai parodė, jog vaistas mažino fermento kiekį. Gauti duomenys prisideda prie hipotezės patvirtinimo, jog vaisto metabolizme dalyvauja CYP4F2 fermentas. Imitatoriaus poveikis padarė mažiausią poveikį CYP4F2 fermento koncentracijai, bet leido patvirtinti hipotezę, jog gali daryti įtaką fermento aktyvumui. Norint tiksliau įvertinti inhibicinį imitatoriaus aktyvumą, reikėtų vykdyti ląstelių transfekciją veikiant skirtingomis hsa-miR-24-3p koncentracijomis. Dėl sumažėjusio fermento kiekio turėtų kisti uždegiminiai procesai bei gali kisti rivaroksabano metabolitų profilis, tačiau šiai hipotezei patvirtinti reikia atlikti detalesnius tyrimus. Priklausomai nuo uždegimo, gali kisti ir vaisto dozė skirtingiems pacientams.

(43)

230.3 ng/ml

190.6 ng/ml

43.1 ng/ml

33.3 ng/ml

203.0 ng/ml

0 50 100 150 200 250

ng/ml

CYP4F2 fermento kiekis

HUVEC

HUVEC + 0,5 µM rivaroksabano HUVEC + 1 µM rivaroksabano HUVEC + 2 µM rivaroksabano

HUVEC + hsa-miR-24- 3p

20 pav. CYP4F2 fermento koncentracija skirtinguose bandiniuose

3.4. Ląstelių CYP4F2 genų variantų tyrimas

Šiame tyrime tikro laiko PGR metodu buvo tiriami 4 CYP4F2 geno variantai: CYP4F2 rs2108622, CYP4F2 rs1558139, CYP4F2 rs3093135 ir CYP4F2 rs2074902. HUVEC ląstelėse buvo nustatyti šie genotipai, kurie lemia koduojamo baltymo aktyvumą: CYP4F2 rs2108622 C/C, CYP4F2 rs1558139 G/G, CYP4F2 rs3093135 A/T, CYP4F2 rs2074902 T/T. Nustatyti genotipai pateikti 6 lentelėje.

Moksliniuose šaltiniuose susijusių duomenų apie nustatytų genotipų įtaką rivaroksabano metabolizmui nepavyko rasti.

CYP4F2 rs2108622 C/C variantas nėra susijęs su fermento funkcijos praradimu, t.y. nulemia gerai išreikštą fermento aktyvumą, kas gali daryti reikšmingą įtaką rivaroksabano metabolizmui. Vartojant varfariną ar acenokumarolį rs2108622 T alelis pasižymi mažesne kraujavimo rizika ilgalaikėje antikoaguliantų vartojimo perspektyvoje lyginant su C aleliu, todėl tikėtina, jog vartojant rivaroksabaną pacientams, turintiems C alelį, ypač įprastomis dozėmis, gali būti didesnė kraujavimo rizika [53]. Geno variantas CYP4F2 rs1558139 G/G nulemia gerai išreikštą fermento aktyvumą. Literatūros duomenimis, jis gali lemti mažesnę riziką susirgti hipertenzija, priešingai nei C/T variantas [49]. Yra duomenų, jog CYP4F2 rs3093135 A/T variantas lemia mažesnį antitrombocitinį poveikį tikagrelorą vartojantiems pacientams nei A/A bei T/T variantų nešiotojams [54]. Taigi, šis variantas gali nulemti mažesnį fermento aktyvumą. Nustatytas rs2074902 T/T variantas taip pat nulemia gerai išreikštą fermento funkciją.

Atsižvelgiant į gautus rezultatus, galima daryti išvadą, jog tyrimams pasirinktos HUVEC ląstelės

(44)

pasižymėjo geru CYP4F2 fermento aktyvumu. Genų variantas neturėjo daryti reikšmingos įtakos tyrimams.

6 lentelė. HUVEC ląstelėse nustatyti vieno nukleotido polimorfizmo genotipai

Genas Genotipas

CYP4F2 rs2108622 C/C

CYP4F2 rs1558139 G/G

CYP4F2 rs3093135 A/T

CYP4F2 rs2074902 T/T