DARBAS ATLIKTAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE) PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUM

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „GAILIŲJŲ DILGĖLIŲ (URTICA URENS L.) IR DIDŽIŲJŲ DILGĖLIŲ (URTICA DIOICA L.) LAPŲ, STIEBŲ IR ŠAKNŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO PALYGINAMASIS TYRIMAS“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020 m. gegužės 21 d. Martynas Mockus

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020 m. gegužės 21 d. Martynas Mockus

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020 m. gegužės 21 d. Sonata Trumbeckaitė

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

MARTYNAS MOCKUS

GAILIŲJŲ DILGĖLIŲ (URTICA URENS L.) IR DIDŽIŲJŲ DILGĖLIŲ

(URTICA DIOICA L.) LAPŲ, STIEBŲ IR ŠAKNŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO PALYGINAMASIS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas: Doc. dr. Deividas Burdulis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data

GAILIŲJŲ DILGĖLIŲ (URTICA URENS L.) IR DIDŽIŲJŲ DILGĖLIŲ

(URTICA DIOICA L.) LAPŲ, STIEBŲ IR ŠAKNŲ CHEMINĖS SUDĖTIES IR

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO PALYGINAMASIS TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Darbo vadovas

Data Doc. dr. Deividas Burdulis

Data Darbą atliko Magistrantas Martynas Mockus Data

KAUNAS, 2020

TURINYS

SANTRAUKA ... 7

SUMMARY ... 8

SANTRUMPOS ... 10

ĮVADAS ... 11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 13

1.1. Gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) ir didžiųjų dilgėlių (Urtica dioica L.) apibūdinimas ... 13

1.2. Augalo paplitimas ... 14

1.3. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas ... 15

1.4. Gailiųjų bei didžiųjų dilgėlių augalinės žaliavos cheminė sudėtis ... 15

1.5. Dilgėlių vartojimas medicinoje ... 16

1.6. Svarbiausių biologiškai aktyvių junginių apžvalga ... 18

1.6.1. Fenoliniai junginiai ... 18

1.6.2. Flavonoidai ... 18

1.6.2.1. Bendra flavonoidų apžvalga ... 18

1.6.3. Taninai (raugai) ... 19

1.6.3.1. Taninų (raugų) apžvalga ... 19

1.6.4. Askorbo rūgštis ... 19

1.6.5. Fenolkarboksirūgštys ... 20

1.7. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas ... 20

1.8. Antioksidantai ... 21

1.9. Urtica urens L. ir Urtica dioica L. cheminės sudėties palyginimas ... 21

2. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI ... 24

2.1. Tyrimo objektas ... 24

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai ... 24

2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ir priemonės ... 25

2.4. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 25

2.5. Tiriamųjų ekstraktų paruošimas ... 26

2.6. Tyrimo metodai ... 26

2.6.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 26

2.6.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27

2.6.4. Askorbo rūgšties nustatymas titrimetriniu metodu ... 28

2.6.5. Suminio raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu ... 29

2.7. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 30

2.7.1. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS katijonų - radikalų surišimo metodu ... 30

2.7.2. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu ... 31

2.7.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinio aktyvumo metodu ... 31

2.7.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas CUPRAC redukcinio aktyvumo metodu ... 32

2.8. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ESC metodu ... 32

2.9. Tyrimo duomenų analizė ... 33

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34

3.1. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymui ... 34

3.1.1. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenolinių junginių nustatymui ... 35

3.1.2. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas flavonoidų nustatymui ... 38

3.2. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 40

3.3. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 42

3.4. Suminio fenolkarboksirūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 44

3.5. Askorbo rūgšties kiekio nustatymas titrimetriniu metodu ... 45

3.6. Suminio raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu ... 47

3.7. Urtica urens L. ir Urtica dioica L. žolės ekstraktų cheminės sudėties ESC analizė ... 48

3.8. Urtica urens L. ir Urtica dioica L. lapų, stiebų ir šaknų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymas ... 50

3.8.1. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 51

3.8.2. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu ... 52

3.8.3. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 53

3.8.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu ... 55

3.9. Gailiųjų dilgėlių lapų fenolinių junginių kiekinės sudėties ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinių ryšių įvertinimas ... 56

4. IŠVADOS ... 58

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 59

SANTRAUKA

M. Mockaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas doc. dr. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas. Darbo pavadinimas: Gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) ir didžiųjų dilgėlių (Urtica dioica L.) lapų, stiebų ir šaknų cheminės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo palyginamasis tyrimas.

Darbo tikslas: atlikti Lietuvoje augančių gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) ir didžiųjų dilgėlių (Urtica dioica L.) lapų, stiebų ir šaknų cheminės sudėties palyginamąjį tyrimą, taip pat nustatyti jų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.

Uždaviniai: Parinkti optimaliausias ekstrakcijos sąlygas gailiųjų ir didžiųjų dilgėlių žaliavų bandiniams, užtikrinančias didžiausią fenolinių junginių ir flavonoidų išeigą. Nustatyti suminį fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolkarboksirūgščių kiekį, taip pat nustatyti askorbo rūgšties ir suminį raugų kiekį U. urens L. ir U. dioica L. lapuose, stiebuose ir šaknyse, surinktuose iš skirtingų augimviečių. Įvertinti gailiųjų ir didžiųjų dilgėlių lapų, stiebų, šaknų ekstraktų antioksidacinį poveikį. Ištirti koreliacinius ryšius tarp dilgėlių lapų mėginių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo. Atlikti U. urens L. ir U. dioica L. augalinių žaliavų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę analizę ESC metodu.

Tyrimo objektas ir metodai: Objektas – skirtingose Kretingos ir Palangos rajonų vietose surinkti gailiųjų ir didžiųjų dilgėlių lapų, stiebų ir šaknų ėminiai. Suminis fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolkarboksirūgščių kiekis, antiradikalinis aktyvumas etanoliniuose didžiųjų ir gailiųjų dilgėlių lapų, stiebų ir šaknų ekstraktuose įvertinti spektrofotometriniu analizės metodu. Suminis raugų bei askorbo rūgšties kiekiai žaliavose įvertinti titrimetriniais metodais. Kiekybinė ir kokybinė fenolinių junginių sudėties analizė atlikta naudojant ESC metodą.

Tyrimo rezultatai ir išvados: parinktos optimalios ekstrakcijos sąlygos fenoliniams junginiams (70 % etanolis, maceruojant ultragarso vonelėje 40 minučių) ir flavonoidams (85 % etanolis, maceruojant ultragarso vonelėje 30 minučių) išgauti iš gailiosios dilgėlės žolės. Vidutinis fenolinių junginių kiekis U. urens L. lapų, stiebų ir šaknų bandiniuose buvo 6,69 ± 0,58 mg/g GAE, flavonoidų 1,9 ± 0,2 mg/g RE, fenolkarboksirūgščių 3,38 ± 0,14 %, askorbo rūgšties 0,02 ± 0,006 %, raugų 1,79 ± 0,2 %. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu, pasižymėjo Kretingos raj. Želvių k. surinktų gailiųjų dilgėlių lapų ekstraktai. Nustatyta stipri koreliacija tarp suminio flavonoidų kiekio ir antioksidacinio poveikio, nustatyto ABTS metodu (0,898 ± 0,041)(p<0,05). ESC metodu buvo nustatyti keturi fenoliniai junginiai – chlorogeno rūgštis, 4 – kafeoilkvino rūgštis, izokvercetinas ir rutinas.

SUMMARY

Title: Comparative study of dwarf (Urtica urens L.) and stinging (Urtica dioica L.) nettles’ leaves, stems and roots chemical composition and radical scavenging activity.

The aim of the work: to perform comparative study of dwarf (Urtica urens L.) and stinging (Urtica dioica L.) nettles’, growing in Lithuania, leaves, stems and roots chemical composition and radical scavenging activity.

Objectives: To select the best extraction conditions of nettle leaves, stems and roots’ extracts for the highest yield of phenolic compounds and flavonoids. To determine the total content of phenolic compounds, flavonoids and phenolcarboxylic acids, as well as the total content of ascorbic acid and total tannin content in the leaves, stems and roots of U. urens L. and U. dioica L., collected from different locations. To evaluate the antioxidant activity of ethanolic extracts of stinging and dwarf nettles. To examine the correlation between the amount of nettle leave’s phytochemicals and the radical scavenging activities of their ethanolic extracts. To perform qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds of U. urens L. and U. dioica L. herbs using HPLC.

Object and methods of study: Object – dwarf and stinging nettle’s leave, stem and root samples, collected in different locations of Palanga and Kretinga districts. Total content of phenolic compounds, flavonoids and phenolcarboxylic acids, antiradical activity in Urtica extracts were evaluated by UV - VIS spectrophotometric analysis method. Total tannin and ascorbic acid contents were estimated by titrimetric methods. Quantitative and qualitative analysis of phenolic compound composition in nettle herb was performed using HPLC method.

Results and conclusions of the study: optimal extraction conditions for phenolic compounds (70 % ethanol and ultrasound assisted maceration for 40 minutes) and flavonoids (85 % ethanol and ultrasound assisted maceration for 30 minutes) in dwarf nettle’s herb were selected. The average content of phenolic compounds in U. urens L. leaves, stems and roots samples was 6.69 ± 0.58 mg / g GAE, flavonoids 1.9 ± 0.2 mg / g RE, phenolcarboxylic acids 3.38 ± 0.14 %, ascorbic acid 0.02 ± 0.006 %, tannin 1.79 ± 0.2 %. Ethanolic nettle leaves extracts from Kretinga district, Želvių village had the strongest antioxidant activity. There was a strong correlation between the total amount of flavonoids and the antioxidant activity, determined using ABTS radical scavenging method (0,898 ± 0,041)(p<0,05). Four phenolic compounds were identified using HPLC: chlorogenic acid, 4 – caffeoylquinic acid, isoquercetin and rutin.

PADĖKA

Nuoširdžiausiai dėkoju už visokeriopą pagalbą šio mokslinio darbo vadovui doc. dr. Deividui Burduliui. Už atsakymus į įvairius klausimus, pagalbą dirbant laboratorijoje ir skaičiuojant rezultatus, dėkoju farmakognozijos katedros mokslininkui dr. Mindaugui Liaudanskui.

SANTRUMPOS

ASE – ekstrakcija pagreitintu tirpikliu (angl. accelerated solvent extraction); CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė geba;

DCPIP - natrio 2,6 – dichlorfenolindofenoliatas; DNR – deoksiribonukleorūgštis;

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas; ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP - geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia; GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. gallic acid equivalents);

HPLC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high performance liquid chromatography); MAE – ekstrakcija mikrobangomis (angl. microvawe assisted extraction);

NVNU – nesteroidinis vaistas nuo uždegimo; RE – rutino ekvivalentai (angl. rutin equivalents);

ROS – reaktyviojo deguonies formos (angl. reactive oxygen species);

SFE – superkritinių skysčių ekstrakcija (angl. supercritical fluid extraction); SOD – superoksido dismutazė (angl. superoxide dismutase);

TE – trolokso ekvivalentai (angl. trolox equivalents); TPSS – tarptautinė prostatos simptomų skalė;

TPTZ - 2,4,6-Tripyridyl-s-triazinas;

UAE – ekstrakcija ultragarsu (angl. ultrasound – assisted extraction); UV – ultravioletinis.

ĮVADAS

Šiuo metu yra pradedama vis labiau domėtis antioksidantais ir jų laisvuosius radikalus surišančiomis savybėmis. Laisvieji radikalai yra žinomi kaip sukeliantys širdies ligas, vėžį, diabetą, taip pat spartina senėjimą. Dilgėlėse gausiai randami fenoliniai junginiai yra žinomi kaip antioksidantai, todėl jie ir jų gebėjimas surišti laisvuosius radikalus yra vis labiau tyrinėjami [1].

Urtica urens L. priklauso dilgėlinių (Urticaceae) šeimai. Urtica genčiai priklauso 46 augalai [2]. Dažniausiai sutinkamos dilgėlių rūšys yra didžioji dilgėlė (Urtica dioica L.) ir gailioji dilgėlė (Urtica urens L.), jos gausiai randamos Europoje, Afrikoje, Azijoje ir šiaurės Amerikoje. Genties pavadinimas „Urtica“ kilęs iš lotyniško žodžio „urere“, reiškiančio „deginti“, dėl deginančių plaukelių, prie kurių prisilietus jie lūžta ir išteka skruzdžių rūgštis bei acetilcholinas, serotoninas [3].

Dilgėlių šaknų preparatai yra vartojami gydyti gerybinę prostatos hiperplaziją, taip pat preparatai su dilgėlių lapų ekstraktais turi antioksidacinį, antiuždegiminį ir skausmą malšinantį poveikius [4][5][6]. Senovėje, dilgėlės buvo vartojamos maistui, kaip daug naudingų medžiagų turintis šaltinis. Senovės graikai žinojo šį augalą, ir apibūdino jį kaip turintį tonizuojančias, diuretines, kraują valančias ir virškinimą gerinančias savybes [7]. Dilgėlių žolė ir šaknys kaupia įvairius veikliuosius junginius – terpenoidus, karotenoidus (β – karoteną, neoksantiną, violaksantiną, liuteiną ir likopeną), riebalų rūgštis, polifenolinius junginius (flavonoidus, raugus, fenolkarboksirūgštis, ligninus, lignanus, kumarinus), nepakeičiamas aminorūgštis, chlorofilą, vitaminus (A, E, C, K, D, P, B grupę), sterolius, polisacharidus, izolektinus ir mineralus, iš kurių svarbiausia yra geležis [8][9][10][11][12][13].

Nors Europos Farmakopėjos skyriuje „Dilgėlių lapai (Urticae folium)“ yra nurodoma, kad lapų žaliava gali būti tiek Urtica dioica L., tiek Urtica urens L. lapai ar šių dilgėlių lapų mišinys, tačiau didžiosios dilgėlės fitocheminė sudėtis ir jos ekstraktų antioksidacinis poveikis yra daug plačiau išnagrinėti nei gailiosios dilgėlės [14]. Trunkant tyrimų, yra tikslinga sulyginti gailiosios ir didžiosios dilgėlių sudėtis bei antioksidacinę gebą.

Darbo tikslas: atlikti Lietuvoje augančių gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) ir didžiųjų dilgėlių (Urtica dioica L.) lapų, stiebų ir šaknų cheminės sudėties palyginamąjį tyrimą, taip pat nustatyti jų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Tikslas: atlikti Lietuvoje augančių gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) ir didžiųjų dilgėlių (Urtica dioica L.) lapų, stiebų ir šaknų cheminės sudėties palyginamąjį tyrimą, taip pat nustatyti jų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti optimaliausias ekstrakcijos sąlygas gailiųjų ir didžiųjų dilgėlių žaliavų bandiniams, užtikrinančias didžiausią fenolinių junginių ir flavonoidų išeigą

2. Nustatyti suminį fenolinių junginių, flavonoidų bei fenolkarboksirūgščių kiekį, taip pat nustatyti askorbo rūgšties ir suminį raugų kiekį U. urens L. ir U. dioica L. lapuose, stiebuose ir šaknyse, surinktuose iš skirtingų augimviečių.

3. Įvertinti gailiųjų ir didžiųjų dilgėlių lapų, stiebų, šaknų ekstraktų antioksidacinį poveikį.

4. Ištirti koreliacinius ryšius tarp dilgėlių lapų mėginių fenolinių junginių kiekio ir jų ištraukų antioksidacinio aktyvumo.

5. Atlikti U. urens L. ir U. dioica L. žolių fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę analizę ESC metodu.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) ir didžiųjų dilgėlių (Urtica dioica L.)

apibūdinimas

Botaninis Urtica urens L. aprašymas. Karalystė – augalų (Plantae), skyrius – magnolijūnų (Magnoliophyta), klasė – magnolijiniai (Magnoliopsida), poklasis – erškėčiažiedžiai (Rosidae), eilė – dilgėliečiai (Urticales), šeima – dilgėlinių (Urticaceae), gentis – dilgėlė (Urtica), rūšis – gailioji dilgelė (Urtica urens L.) [15]. Galioji dilgelė anglų kalboje yra vadinama dwarf nettle, annual nettle, small nettle.

1 pav. Gailioji dilgėlė (Urtica urens L.)

U. urens L. yra vienmetis, 10 – 75 cm aukščio žolinis augalas. Šaknis nedidelė, liemeninė. Stiebas status, keturbriaunis, šakotas ir lapuotas. Lapai 1 – 6 cm ilgio, priešiniai, kotuoti, kiaušiniški, pjūkliškai dantyti, žalios ar tamsiai žalios spalvos, padengti plaukeliais, viršūnė dažniausiai buka. Žiedai vienalyčiai, žaliai baltos spalvos, augantys iš stiebo – lapo sankirtos. Kuokeliniai žiedai iš keturių balsvai žalių apyžiedžių lapelių ir keturių kuokelių, piesteliniai iš keturių žalių apyžiedžio lapelių ir vienos piestelės. [15] Augalai vienanamiai. Vaisius – mažas, pilkai žalios spalvos, kiaušiniškas, sveria apie 0,5 mg.

Sėklos turi daug aliejingo endospermio ir nesilaiko ant vandens paviršiaus. Vienas augalas subrandina apie 1500 sėklų, dauginasi tik sėklomis [16]. Gailioji dilgelė dygsta pavasarį ir vasarą šaltesnio klimato šalyse, o šiltesnio – visus metus [17]. Žydi liepos – rugsėjo mėnesiais Lietuvoje, šilto klimato šalyse nuo ankstyvo pavasario iki vėlyvo rudens [18][15].

Urtica dioica L. yra daugiametis dvinamis 60 – 150 cm aukščio žolinis augalas. Šakniastiebis ilgas, šliaužiantis, briaunotas, geltonas. Stiebas stačias, keturbriaunis, apaugęs, kaip ir visas augalas,

dilginamaisiais plaukeliais. Lapai priešiniai, pailgai kiaušiniški, beveik trikampiški, dantyti, 8 – 17 cm ilgio ir 2 – 8 cm pločio, smailėjančiomis viršūnėmis. Viršutinė lapo pusė tamsiai žalia, apatinė žalia arba pilkai žalia. Žiedai susitelkę lapų pažastyse, šluotelėmis. Žydi birželį – spalį, sėklos sunoksta liepą – spalį. Vaisius – kiaušiniškas arba ovalus mažas riešutėlis [17].

2 pav. Didžioji dilgėlė (Urtica dioica L.)

Genties pavadinimas „Urtica“ kilęs iš lotyniško žodžio „urere“, reiškiančio „deginti“, dėl deginančių dilgėlių plaukelių, prie kurių prisilietus yra „išpilama“ skruzdžių rūgštis bei kitos cheminės medžiagos [3]. Kiekvienas U. urens L. ir U. dioica L. plaukelis yra kūgiška, pailga ląstelė, susiaurėjanti prieš pat galą, su svogūnišku pamatu, kuris yra įterptas į daugialąstelinį pagrindą. Kada plaukelis yra užkliūnamas, galas nulūžta ir plaukelis tampa miniatiūrine hipodermine adatėle, kuri atakuoja odą ir injekuoja savo dirginančias chemines medžiagas. Plaukelio gale yra randama daug silicio, tačiau silicio koncentracija, einant labiau link augalo apačios, mažėja, po to jį pakeičia kalcis [19]. Kiekvienas plaukelis yra apie 100 µm ilgio ir turi apie 10 µg skysčio, į kurį įeina histaminas, acetilcholinas ir serotoninas. Acetilcholinas taip pat yra randamas ir lapuose, šaknyse ir stiebuose. Stiebai kaupia betainą ir choliną. Sutrinti lapai taip pat gali dirginti odą, tačiau ne taip stipriai kaip plaukeliai. Dirginimas daugiausia žmonių praeina per 1 – 3 valandas, tačiau plaukeliai gali likti įstrigę odoje ir ją dirginti dar 24 – 36 valandas. Augalas neskaitomas kaip nuodingas ar pavojingas gyvūnams, tačiau žinoma, kad jo dirginimo poveikį jaučia visi gyvūnai [20].

1.2. Augalo paplitimas

U. urens L. yra kilusi iš Europos, bet dabar randama visuose žemynuose daugiau nei 50 šalių ir taip pat gali augti dideliuose aukščiuose. Urtica genčiai priklauso apie 40 augalų, viena iš žinomiausių ir labiausiai rytų Europoje paplitusi yra didžioji dilgelė (Urtica dioica L.).

Gailioji dilgėlė yra prisitaikiusi augti įvairiose aplinkose, plinta ūkininkų laukuose [21]. Ji dažnai randama lengvoje žemėje, ypač kuri yra praturtinta organiniais junginiais. U. urens L. mėgsta daug azoto turinčią žemę. Auga daržuose, patvoriuose, šiukšlynuose, drėgnuose lapuočių miškuose, prie sodybų, pakrūmėse. Ši dilgėlė Lietuvoje yra gan dažna ir paplitusi visoje teritorijoje, tačiau darosi vis sunkiau ją aptikti [15].

1.3. Vaistinė augalinė žaliava, jos ruošimas ir laikymas

Žaliava – dilgėlių žolė (Urticae herba), šaknys (Urticae radix), vaisiai/sėklos (Urticae fructus/semen), dilgėlių lapai (Urticae folium) [14]. Europos Farmakopėja teigia, kad žaliava yra U. dioica L. ir U. urens L. lapai arba jų mišinys [14]. Dilgėlių žolė pjaunama 2 – 3 kartus per vegetaciją (birželį – rugpjūtį). Žaliavai renkami visiškai susiformavę ir sveiki lapai augalui žydint. Šaknys kasamos vėlai rudenį arba anksti pavasarį, vaisiai (sėklos) renkami liepą – rugpjūtį. Dilgėlių viršūnės pjaunamos peiliu, dalgiu, pjautuvu mūvint apsaugines pirštines. Nupjauta žaliava tuojau pat džiovinama. Džiovinama tolygiai paskleidus, ją reikią nuolatos vartyti, gerai vėdinamoje patalpoje, pavėsyje arba džiovyklėje 45 – 50 ̊C temperatūroje. Pašalinamos priemaišos – parudavę lapai, stambesni stiebai ir kitos priemaišos. Išdžiūvusi žaliava yra tamsiai žalia, trupanti, specifinio kvapo, kartoka. Iš 1 kg šviežios žolės gaunama 220 – 230 g orasausės. Žaliava laikoma maišuose, tamsioje, gerai vėdinamoje patalpoje. Žaliava tinkama vartoti 2 – 3 metus. Šaknys yra išdžiovinamos ir laikomos tamsioje, vėsioje vietoje [22].

1.4.

Gailiųjų bei didžiųjų dilgėlių augalinės žaliavos cheminė sudėtis

Skirtingi faktoriai veikia Urtica genties kaupiamus junginius bei jų kiekius. Pavyzdžiui genotipas, įvairovė, klimatas, dirva, vegetacinė fazė, žaliavos surinkimo laikas, laikymo sąlygos, apdorojimas. Dilgėlės yra geras naudingųjų medžiagų šaltinis. Iš atliktų fitocheminių dilgėlių augalinių žaliavų tyrimų, galime teigti, kad 90% augalo sudaro drėgmė, iki 3,7% baltymų, 0,6% riebalų, 6,4% maistinių skaidulų ir 7,1% angliavandenių [23].

Mokslininkai teigia, kad daugiau baltymų buvo rasta lapuose, nei stiebuose ar šaknyse. Daugiausia baltymų lapuose buvo rasta 16,08% - 26,89%, o šaknyse ir stiebuose – 14,54% ir 10,89% [24]. Remiantis įvairiais atliktais tyrimais galima teigti, kad dilgėlės žolė ir šaknys kaupia daug naudingų medžiagų. Dilgėlių lapuose galima rasti terpenoidų, karotenoidų, tokių kaip β – karotenas, neoksantinas, violaksantinas, luteinas ir likopenas, riebalų rūgščių – daug palmitino, cis-9,12-linoleno ir α – linoleno rūgščių, polifenolinių

junginių, būtinųjų amino rūgščių, chlorofilo, vitaminų, raugų, sterolių, polisacharidų, izolektinų ir mineralų [5][2][23][9][10].

Dilgėlių lapuose yra randama apie 4,8 mg/g chlorofilo, jo kiekis priklauso nuo aplinkos sąlygų, klimato, taip pat ar augalas augo šviesioje vietoje ar tamsioje. Daugiau karotenoidų randama augaluose, kurie augo šešėlyje [25]. Šviežiuose lapuose randama daug vitaminų A, C, D, E, F, K, P bei vitamino B kompleksų [12][13]. Yra žinoma, kad lapai kaupia daug metalų – seleno, cinko, geležies bei magnio [26]. Yra nustatyta, kad didžiosios dilgėlės lapai, stiebai ir šaknys turi daugiau kalcio, nei magnio. Šie metalai buvo tris kartus dažnesni lapuose, nei stiebuose ar šaknyse. Kalcio kiekis įvairavo nuo 2,63 – 5,09 % lapuose, 0,76 – 1,42 % stiebuose ir 0,61 – 0,92 % šaknyse. Cinko (27,44 mg/kg išdžiovintos masės), vario (17,47 mg/kg išdžiovintos masės) ir mangano (17,17 mg/kg išdžiovintos masės) daugiausia randama lapuose. Taip pat yra randama kobalto, bario, natrio, jodo, chromo, sieros [24].

1 g dilgėlių miltelių suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas 129 mg/g GAE (Galo rūgšties ekvivalento) [23]. Mokslininkai ištyrė, kad daugiausiai randama flavonoidų rutino ir izokvercetino [27]. Taip pat rasta ferulo, kofeino, chlorogeno ir sinapo rūgščių [5].

Šaknų kiekybinė bei kokybinė sudėtys skiriasi nuo lapų ar stiebų sudėties. Lyginant su lapais ir stiebais, šaknyse yra randama žymiai mažiau fenolinių junginių, daugiausia randama lignano sekoizolaricirezinolio. Todėl galima teigti, kad dilgėlių šaknys yra nenaudingiausia šio augalo dalis fenolinių junginių atžvilgiu. Šaknyse randama krakmolo, cukrų, albuminų, dervų, histamino, acetilcholino, cholino ir serotonino [10].

Manoma, kad U. dioica L. yra vienintelis augalas, kuris kaupia cholino acetiltransferazę, acetilcholiną gaminantį fermentą. Penkiolika hidroksicinamono rūgšties junginių ir šešiolika flavonoidų, flavonų ir flavonolinių glikozidų buvo aptikta U. urens L., U. dioica L. ir U. membranaceae Poir.. Iš šių junginių 4-kafeoil-5-p-kumaroilchino rūgštis ir trys 3-hidroksi-3-metilglutaroilo flavonų junginiai buvo pirmą kartą nustatyti U. urens L. ir U. membranaceae Poir [28].

1.5. Dilgėlių vartojimas medicinoje

Gerybinės prostatos hiperplazijos gydymas

Vienas labiausiai ištirtų dilgėlių žaliavų panaudojimo medicinoje atvejų yra gerybinės prostatos hiperplazijos gydyme. Daugiau nei keturi dvigubai akli iki - klinikiniai tyrimai patvirtino dilgelės šaknų

ekstraktų efektyvumą jas vartojant gerybinės prostatos hiperplazijos simptomams mažinti, vartojant vieną, ar kartu su kitais preparatais [2].

Atsitiktine tvarka atliktas, dvigubai aklas klinikinis mokslinis tyrimas, kuriame tirti vyrai, sergantys gerybinės prostatos hiperplazijos ankstyva faze, naudojant sudėtinį vaistą, susidedantį iš gulsčiosios serenojos (Serenoa repens Hook. F.) vaisių ekstrakto ir didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) šaknų ekstrakto (160 mg/120 mg, atitinkamai) kartu su 5α – reduktazės inhibitoriumi finasteridu. Buvo tirtas prostatos tūris ir terapinis rezultatas. Pacientai gavo fiksuotas dozes gulsčiosios serenojos vaisių ir dilgėlių šaknų ekstraktų mišinio arba 5α – reduktazės inhibitoriaus finasterido. Rezultatai parodė, kad maksimalus šlapimo pratekėjimo greitis po 24 savaičių abiejų preparatų vartojimo padidėjo 1,9 mL/s sudėtinį dilgėlių preparatą vartojusioje grupėje, o finasteridą vartojusioje grupėje padidėjo 2,4 mL/s. Rezultatų pagerėjimas buvo beveik toks pats ir vertinant pagal tarptautinę prostatos simptomų skalę (TPSS). Saugumo analizė parodė, jog daugiau pacientų skundėsi pašaliniais poveikiais finasteridą vartojusioje grupėje, nei sudėtinį dilgėlių preparatą vartojusioje grupėje. Šis tyrimas neparodo, jog dilgėlių šaknų preparatai yra geresni ar efektyvesni, nei finasteridas, tačiau jie jam nenusileidžia, taip pat pacientai dilgėlių šaknų preparatą geriau toleravo. Be to, gydymas fitoterapija yra pigesnis, nei gydymas cheminiu preparatu [29].

Mohammad Reza Safarinejad atsitiktine tvarka atliko dvigubai aklą, placebu kontroliuojamą tyrimą, kurio metu nustatinėjo U. dioica L. galimybes sumažinant gerybinės prostatos hiperplazijos bei apatinių šlapimo takų simptomus. Tyrimas truko 6 mėnesius, jo pabaigoje 81% pacientų, esančių U. dioica L. preparatus vartojančioje grupėje, nurodė, kad apatinių šlapimo takų simptomai sumažėjo. Palyginimui, placebo gavusiųjų pacientų grupėje pagerėjimą pajautė tik 16%. Tiek vertinant tarptautinę prostatos simptomų skalę, tiek maksimalų šlapimo tekėjimo greitį, rezultatai buvo geresni vartojant didžiosios dilgėlės preparatus nei placebo. TPSS nuo 19,8 krito iki 11,8 U. dioica L. vartojusioje grupėje ir 19,2 iki 17,7 vartojusioje placebo. Maksimalus šlapimo tekėjimo greitis padidėjo 8,2 mL/s dilgelės preparatus gavusioje grupėje ir 3,4 mL/s gavusioje placebo. Jokie pašaliniai poveikiai nepasireiškė nei vienoje grupėje. Galima teigti, kad U. dioica L. žaliavų preparatai yra efektyvi gydant gerybinę prostatos hiperplaziją, tačiau šiam efektyvumui galutinai įrodyti reiktų daugiau klinikinių tyrimų [4].

Kitos dilgėlių preparatų indikacijos

Dilgėlių lapų preparatai gali sumažinti osteoartrito ir sąnarių skausmą. Jų ekstraktai gali būti kartu vartojami su NVNU, tam kad būtų suvartojama mažiau šių vaistų. Mokslininkai tyrė 37 žmones, sergančius ūmiu osteoartritu. Dvi savaites, kiekvieną dieną, jiems buvo duodama 50 g dilgėlių lapų kartu su 50 mg

diklofenako. Rezultatai parodė, kad 2 savaičių periode šis derinys buvo toks pat efektyvus kaip ir 200 mg diklofenako kas dieną [30].

Dilgelių žolės ir lapų preparatai turi antiuždegiminį, antihistamininį aktyvumą, todėl gali būti gydomos tokios ligos kaip reumatoidinis artritas ir alerginis rinitas. Fenoliai taip pat gali būti naudingi aterosklerozės ir vėžio pristabdymui, taip pat nuo amžiaus priklausomoms smegenų ligoms [31].

Sudėtinis vaistas, susidedantis iš 6 mg didžiosios dilgėlės šaknų ekstrakto, 5 mg paprastojo čiobrelio žolės ekstrakto, 9 mg saldymedžio lapų ekstrakto, 8 mg vynuogės lapų ekstrakto ir 7 mg vaistinės alpinijos lapų ekstrakto yra žinomas Turkijoje kaip „Ankaferd“ kraujo krešumą didinantis preparatas. Šis tradicinis vaistinis preparatas veikia endoteliumą, kraujo ląsteles, angiogenezę, ląstelių proliferaciją, pasižymi kraujavimą stabdančiomis savybėmis. Šios savybės gali būti lemiamos dėl dilgelių lapuose ir žolėje randamų ursolinės rūgšties ir kvercetino [32].

1.6. Svarbiausių biologiškai aktyvių junginių apžvalga

1.6.1. Fenoliniai junginiai

Augalinis maistas yra praturtintas fenoliniais junginiais, kurie turi antioksidacines, širdies ligas stabdančias, priešuždegimines, priešdiabetines savybes. Antioksidacinis ir apsaugantis augalinio maisto pagrindas yra fenoliniai junginiai. Fenoliniai junginiai augaluose susidaro kaip atsakas į išorinius veiksnius (vabzdžių sukeliamus pažeidimus, saulės skleidžiamus UV spindulius) [33].

Fenolinių junginių pagrindas yra aromatinis žiedas, turintis vieną ar kelias hidroksilo grupes. Augalų fenoliniai junginiai yra skirstomi į paprastus fenolius arba polifenolius, priklausomai nuo fenolinių darinių molekulėje. Todėl į fenolinius junginius įeina paprastieji fenoliai, kumarinai, ligninai, lignanai, kondensuoti ir hidrolizuojamieji raugai, fenolinės rūgštys ir flavonoidai [34].

1.6.2. Flavonoidai

1.6.2.1. Bendra flavonoidų apžvalga

Flavonoidai, tai natūralių medžiagų su įvairiomis fenolinėmis struktūromis grupė, randama vaisiuose, daržovėse, kruopose, žievėje, šaknyse, stiebuose, žieduose, arbatoje ir vyne. Šie natūralūs junginiai yra gerai žinomi dėl jų gydomųjų ir naudingųjų savybių. Flavonoidai yra laikomi nepakeičiamais medicinos, farmacijos ir kosmetikos produktuose [35][36]. Taip yra dėl to, jog jie turi antiuždegiminį, antioksidacinį, priešvėžinį poveikius [37].

1930 metais pirmas flavonoidas buvo išgautas iš apelsinų. Tada buvo manyta, jog tai yra naujai atrastas vitaminas ir jis buvo pramintas vitaminu P. Vėliau išaiškėjo, kad šis „vitaminas“ iš tikro yra flavonoidas rutinas, o iki šiandien dienų yra atrasta daugiau nei 4000 įvairių flavonoidų [37].

1.6.3. Taninai (raugai)

1.6.3.1. Taninų (raugų) apžvalga

Taninai yra unikali fenolinių metabolitų grupė, galinti sudaryti stiprius ryšius su angliavandeniais ir baltymais, kurios junginių molekulinis svoris yra tarp 500 ir 30000 Da. Jie randami daugumoje augalinio maisto, taip pat gėrimuose. Taninai jau nuo seno buvo naudojami gyvūnų odos apdirbime. Gamtoje taninų galima rasti įvairiuose augaluose: riešutmedžiuose, ąžuoluose, taip pat augalų galuose (cecidijose). Didelės taninų koncentracijos yra visame augale: žievėje, lapuose, vaisiuose, šaknyse ir sėklose. Dažnai, padidėjusi taninų gamyba augale, gali parodyti, kad augalas serga kokia nors liga. Todėl yra manoma, jog taninai atlieka augalą apsaugančią ir į infekciją reaguojančią funkciją. Taninai yra šviesiai geltonos ar baltos spalvos amorfiniai milteliai arba spindintys, beveik bespalviai dariniai, turintys charakteringą, keistą kvapą ir liežuvį sutraukiantį skonį [38][39].

Taninai naudojami kaip natūralių gydymo priemonių dalys. Jie naudojami kaip sutraukiantys preparatai, diarėjos simptomus lengvinantys, taip pat kaip diuretikai. Turi priešuždegimines, antiseptines savybes. Taninai taip pat gali surišti sunkiuosius metalus ir alkaloidus (išskyrus morfiną), todėl gali įeiti į priešnuodžių sudėtį. Industrijoje taninai naudojami dažiklių gamybai kaip katijoninių dažų surišėjai ir taip pat rašalo gamyboje. Maisto industrijoje taninai vartojami kaip skaidrintojai vyne, aluje ar sultyse [38].

1.6.4. Askorbo rūgštis

Askorbo rūgštis veikia kaip antioksidantas, fermentų kofaktorius ir kaip prekursorius oksalato ir tartrato sintezėje. Ji dalyvauja įvairiuose procesuose, tokiuose kaip fotosintezė, fotoprotekcija, ląstelės sienelės augimas, suteikia atsparumo neigiamiems aplinkos veiksniams [40]. Vitaminas C yra stiprus antioksidantas ir pasižymi dideliu teigiamu poveikiu žmogaus organizmui. Atlikti epidemiologiniai tyrimai parodė, kad vartojant askorbo rūgštį sumažėja rizika susirgti stemplės, skrandžio vėžiu ir kiek sumažina storosios žarnos ir plaučių vėžio atsiradimą [41].

1.6.5. Fenolkarboksirūgštys

Fenolkarboksirūgštys priklauso didelei veikliųjų junginių klasei – fenoliniams junginiams. Terminas „fenolkarboksirūgštys“ apibūdina tokius fenolinius junginius, kurie turi vieną karboksilinę rūgšties grupę [42]. Fenolkarboksirūgštys didžiausiomis koncentracijomis yra randamos įvairiame augaliniame maiste – augalų sėklose, luobelėse, vaisiuose ir lapuose. Dažniausiai jie yra amidų, esterių arba glikozidų forma, retai yra randami laisvoje formoje [43].

Fenolkarboksirūgštys yra skirstomos į dvi pagrindines grupes: hidroksibenzoines (C6 – C1 fragmentai) ir hidroksicinamono rūgštis (C6 – C3 fragmentai). Daugiausiai randama fenolkarboksirūgštis yra chlorogeno rūgštis (kafeinės ir kvininės rūgščių kombinacija). Keturios dažniausiai sutinkamos hidroksicinamono rūgštys yra ferulinė r., kafeinė r., p – kumarino ir sinapinė rūgštys [44][45][43].

Hidroksibenzoinės rūgštys su C6 – C1 fragmentu yra kildinamos iš benzoinės rūgšties. Jos yra randamos tirpios formos (susijungusios su cukrumis ir organinėmis rūgštimis). Hidroksibenzoinės rūgštys randamos mažomis koncentracijomis raudonuose vaisiuose, svogūnuose ir juoduosiuose ridikuose. Dažniausiai aptinkamos hidroksibenzoinės rūgštys yra p – hidroksibenzoinė r., vanilino r. ir siringinė rūgštis [44][45][43].

Fenolkarboksirūgštys turi antioksidacinį, priešvėžinį, antimikrobinį, priešuždegiminį ir neuroprotekcinį poveikius [42].

1.7. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas

Laisvasis radikalas gali būti apibrėžiamas kaip visokios molekulinės formos, kurios geba būti nepriklausomos ir turi nesuporuotą elektroną atominėje orbitalėje [1]. Nesuporuotas elektronas lemia laisvųjų radikalų savybes. Dauguma radikalų yra nestabilūs ir labai reaktyvūs. Jie gali arba prisijungti elektroną arba jį atiduoti, todėl jie yra ir oksidatoriai ir reduktoriai. Labiausiai ligų etiologijose yra svarbiausi deguonį turintys radikalai – hidroksilo radikalas, superoksido anijojinis radikalas, vandenilio peroksidas. Tai labai reaktyvios dalelės, jos geba pažeisti ląstelių sieneles ir branduoliuose esančias molekules, pavyzdžiui, DNR, baltymus, angliavandenius ir lipidus [46].

Laisvieji radikalai ir kitos ROS (angl. reactive oxygen species, reaktyvaus deguonies formos) formos yra išskiriamos normalių, kasdienių žmogaus organizmo procesų metu. Taip pat jie gali atsirasti ir iš išorinių veiksnių – cigarečių dūmų, rentgeno spindulių, ozono, industrinių chemikalų. Ląstelėse laisvieji radikalai atsiranda pastovių fermentinių ir nefermentinių reakcijų metu [47].

Oksidaciniu stresu yra laikoma būsena, kuomet laisvųjų radikalų gaminimasis yra didesnis nei antioksidacinė apsauga. Oksidacinio streso metu, yra pagaminama daugiau laisvųjų radikalų, nei tuo metu mūsų antioksidacinės sistemos gali eliminuoti, todėl per ilgą laiką gali būti pažeidžiami DNR, lipidai, baltymai. Trumpalaikis oksidacinis stresas gali būti, kuomet yra fiziškai pažeidžiami audiniai, todėl audiniai pradeda didesnę laisvųjų radikalų gamybos fermentų gamybą (ksantino oksidazė, lipogenazė, ciklooksigenazė) [48].

Manoma, kad oksidacinis stresas yra vienas iš veiksnių, sukeliančių vėžį ir osteoartritą. Taip pat oksidacinis stresas gali įtakoti širdies ligų atsiradimą, didinti karcinogenezę, sendinti žmogaus organizmą, taip pat pažeisti DNR, lipidus ir baltymus.

1.8. Antioksidantai

Antioksidantas yra tokia molekulė, kuri yra pakankamai stabili ir geba atiduoti elektroną laisvajam radikalui ir jį neutralizuoti. Antioksidantai gali neutralizuoti laisvąjį radikalą, greičiau, nei jis gali pakenkti kokiai sistemai. Kai kurie antioksidantai, tokie kaip gliutationas, ubikvinolis ir šlapimo rūgštis pasigamina organizme normalių metabolizmo procesų metu [1]. Kiti antioksidantai yra randami mūsų maiste – tokie kaip vitaminai E ir C ir β – karotenas. Žmogaus organizmas šių antioksidantų pats pasigaminti negali, todėl juos yra privaloma įtraukti į mūsų racioną [49][50].

Antioksidantai yra skirstomi į fermentinius ir nefermentinius. Fermentiniams priklauso superoksido dismutazė (angl. SOD – superoxide dismutase). Tai yra fermentų ir kofermentų sistema, kurie katalizuoja superoksido anijonų skilimą. SOD yra randami visose aerobinėse ląstelėse, taip pat ekstra ląsteliniame skystyje. Fermentiniams antioksidantams dar priklauso katalazės bei gliutationo sistema. Nefermentiniams antioksidantams priklauso mažo molekulinio svorio junginiai – vitaminai C ir E, šlapalo rūgštis [1].

1.9. Urtica urens L. ir Urtica dioica L. cheminės sudėties palyginimas

Dilgėlių žaliavos pasižymi gana dideliu fenolinių junginių kiekiu. Fenolinių junginių kiekiai ir kokybinė sudėtis priklauso ir nuo augalo organo, kuris yra tiriamas. Taip pat veikliųjų junginių kiekybinės ir kokybinės sudėtys skiriasi tarp dilgėlių rūšių, kurių yra žinoma apie 50. Apžvelgiami didžiosios bei gailiosios dilgėlės kaupiamų veikliųjų junginių sudėtys, antioksidacinio aktyvumo skirtumai ir veikliųjų junginių pasiskirstymas po augalo organus (lapus, stiebus ir šaknis).

2017 metais paskelbtame Ana Rita Carvalho et al. tyrime buvo lyginama trijų rūšių dilgėlių (U. dioica L., U. urens L. ir U. membranacea Poir.) antžeminės dalys (žolė). Naudotas ekstrakcijos tirpiklis buvo 50 % V/V etanolis. Ekstrakcijos metodas – maceracija kolboje naudojant magnetinę maišyklę, trukmė - 24 valandos. Naudotas ekstraktų tyrimo metodas – HPLC – PDA – ESI/MS. Šiuo metodu didžiojoje dilgėlėje nustatyta 12 skirtingų fenolinių junginių, gailiojoje digėlėje – 7 [28]. Nustatyti junginiai U. dioica L. ir U. urens L. pateikiami 1 lentelėje.

1 lentelė. Junginio numeris, pavadinimas ir jo būsena augale [28] Nr. Junginys Urtica dioica Augalas

L. Urtica urens L.

1 3 - O - kafeoilkvino r. + +

2 Kafeoiltartaro r. + -

3 Hidroksiferulo rūgšties _{deoksiheksozidas} + -

4 4 - O - kafeoilkvino r. + + 5 5 - O - kafeoilkvino r. + + 6 Feruloilmalo r. - + 7 4 - kafeoil - 5 - p - _{kumaroilkvino r.} - + 8 Kafeoilmalo r. + - 9 Apigenino di - C - _heksosidas - + 10 p - kumaroilkvino r. + - 11 p - kumaroilmalo r. + -

12 Izorhamnetino heksosil - _{malonil - heksosidas} + - 13 Kvercetino O - rutinozidas + - 14 Kempferolio O - _rutinozidas + - 15 Diosmetino O - rutinozidas - + 16 Izorhamnetino O - _rutinozidas + - (+ - augale nustatytas; - - augale nenustatytas)

2016 metais atliktame tyrime, LC/MS metodu buvo ištirti etanoliniai U. urens L. lapų ekstraktai. Ekstrakcijos tirpiklis - 70 % V/V etanolis [5]. Ištirti junginiai ir jų procentiniai kiekiai pateikiami 2 lentelėje.

Iš lentelėje pateiktų duomenų, galime matyti, jog daugiausia U. urens L. lapų etanoliniame ekstrakte buvo rasta chlorogeno rūgšties (21,34 %). Šiek tiek mažiau rasta miricetino (19,72 %) ir japono rūgšties (19,22 %) [5].

2 lentelė. Junginio numeris, pavadinimas ir procentinis kiekis etanoliniame U. urens L. lapų ekstrakte [5] Nr. Junginys Kiekis, _% 1 p - hidroksibenzono _r. 8,58 2 Sinapo r. 13,75 3 Chlorogeno r. 21,34 4 Japono r. 19,22 5 Miricetinas 19,72 6 p - kumaroil _malatas 17,36

2. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Buvo tirti gailiųjų dilgėlių (Urtica urens L.) lapų, stiebų ir šaknų ėminiai, surinkti trijose skirtingose vietovėse Kretingos ir Palangos rajonuose 2019 metų vasarą. Kaupiamų junginių kiekių ir antioksidacinio aktyvumo palyginimui buvo paimtas didžiosios dilgėlės (Urtica dioica L.) lapų, stiebų ir šaknų ėminys, surinktas Kretingoje 2019 metais. Duomenys pateikti 3 lentelėje.

3 lentelė. Tiriamųjų vaistinių augalinių žaliavų rinkimo vieta ir data Urtica urens L.

Eilės numeris Rinkimo data Rinkimo vieta

1 2019-07-24 Kretinga, Riešuto g.

2 2019-08-10 Palanga, Bijūnų tak.

3 2019-08-06 Želvių k.

Urica dioica L.

Eilės numeris Rinkimo data Rinkimo vieta

1 2019 – 07 – 20 Kretinga, Muitinės g.

Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinta kambario temperatūroje, apsaugant nuo saulės šviesos poveikio. Išdžiūvusi žaliava buvo laikoma popieriniuose maišeliuose, sausoje vietoje, kambario temperatūroje.

2.2. Tyrimo metu naudoti reagentai

Tyrimų metu naudoti reagentai: rektifikuotas etilo alkoholis 96,3 % V/V (AB „Vilniaus degtinė“, Lietuva), vandenilio chlorido rūgštis („Sigma – Aldrich“, Vokietija), aliuminio chloridas („Fluka“, Vokietija), heksametilentetraminas („Sigma – Aldrich“, Anglija), rutinas („Carl Roth GmbH“, Vokietija), Folin – Ciocalteu reagentas („Sigma – Aldrich“, Šveicarija), natrio karbonatas („Sigma – Aldrich“, Prancūzija), galo rūgštis („Sigma – Aldrich“, Kinija), 2,6 – dichlorfenolindofenoliatas („SIAL“, Kanada), DPPH reagentas („Sigma – Aldrich”, Vokietija), išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV), metanolis (≥99,9%, SIGMA-ALDRICH, Vokietija), troloksas (,,Sigma - Aldrich Chemie GmbH‘‘, Danija), kalio persulfatas, geležies (III) chlorido heksahidratas („Vaseline – Fabrik Themania“, Vokietija), natrio molibdatas („Alfa Aesar“, Vokietija), TPTZ („Carl Roth, Karlsruhe“,

Vokietija), vario (II) chlorido dihidratas („Alfa Aesar GmbH & Co KG“, Vokietija), neokuproinas („Sigma - Aldrich Chemie“, Vokietija), amonio acetatas („Sigma-Aldrich“, Belgija), ABTS reagentas („Sigma – Aldrich”, Kanada), acto rūgštis (99,8%, „Lachner“, Čekija), natrio acetatas (≥99,9%, „Chempur“, Lenkija), kalio permanganato 0,02 M tirpalas („Fluka“, Šveicarija), natrio hidroksidas („Chempur“, Lenkija), natrio nitritas („Sigma-Aldrich“, Vokietija), indigosulfonrūgšties tirpalas („Fluka“, Šveicarija).

2.3. Tyrimo metu naudota aparatūra ir priemonės

Vaistinė augalinė žaliava buvo susmulkinta elektriniu malūnėliu „Retsch GM 200“ (Vokietija). Svėrimai buvo atlikti svarstyklėmis „Sartorius Cp6M-0CE” (Vokietija). Ekstrahavimas iš vaistinės augalinės žaliavos buvo atliktas naudojant ultragarso vonelę „Bandelin Sanorex Digital 10P“ (Vokietija), taip pat ekstrahavimui buvo naudota mechaninė purtyklė - „Laboratory shaker 358S” (Lenkija). Ekstraktų filtravimui naudota vakuuminė pompa „Dry vacuum pump - compressor”, „Welch, 2511C – 02“ (JAV). Mikropipetės „Eppendorf Research”, (JAV). Spektrofotometrinė analizė atlikta naudojant UV-VIS spektrofotometrą „CamSpec – M550“ (Jungtinė Karalystė). Flavonoidų kokybinei ir kiekybinei analizei naudota ESC sistema „Waters“ (JAV) su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998“ (JAV).

2.4. Nuodžiūvio nustatymas vaistinėje augalinėje žaliavoje

Nuodžiūvis nustatytas pagal Europos farmakopėją. [14] Tiriamoji žaliava smulkinama elektriniu malūnėliu iki tamsiai žalios spalvos miltelių. Džiovinimo indai išdžiovinami iki pastovios masės džiovinimo spintoje. Pasvėrus džiovinimo indą yra sveriami trys mėginiai po 2 g (±0,01 g). Žaliava džiovinama 100-105 °C temperatūroje iki pastovios masės. Džiovinimo pradžia - kada džiovinimo spintoje temperatūra siekia 100-105 °C. Pirmą kartą mėginiai sveriami po 2 val., o pastovioji masė nustatoma jei du paskutinieji svėrimai, praėjus 30 min. po džiovinimo ir dar 30 min. po vėsinimo eksikatoriuje, skiriasi ne daugiau kaip ± 0,001 g.

Nuodžiūvis skaičiuojamas, naudojant formulę: 𝑚𝑚1−𝑚𝑚2

𝑚𝑚0

× 100

Galutinis rezultatas apskaičiuojamas iš trijų svėrimų rezultatų išvedant vidurkį. Išanalizavus, dilgėlių lapuose ir šaknyse nustatytas nuodžiūvis atitiko Europos Farmakopėjos ,,Urticae folium” 01/2011:1897 ir ,,Urticae radix” 01/2015:2538 monografijose reglamentuojamas ribas (ne daugiau kaip 12%). [14]

2.5. Tiriamųjų ekstraktų paruošimas

Išdžiovinti U. urens L. ir U. dioica L. lapai, stiebai, šaknys ir žolė susmulkinami elektriniu malūnėliu. Gaminami ekstraktai su pasirinktu ekstrakcijos tirpikliu (skirtingų koncentracijų V/V etanoliu, metanoliu ir vandeniu) iš kiekvieno vaistinės augalinės žaliavos mėginio santykiu 1:10, todėl atsveriama po 2 g (±0,01g) susmulkintos, tamsiai žalios spalvos augalinės žaliavos miltelių ir užpilama 20 ml reikiamos koncentracijos ekstrakcijos tirpikliu (30%, 50%, 70%, 85% V/V etanoliu ir 30%, 50%, 70%, 85% metanoliu), vandeniu. Atsargiai pamaišoma stikline lazdele, stengiantis nesuplakti ir nepalikti žaliavos dalelių ant buteliuko sienelių. Ekstrahuojama ultragarsinėje vonelėje ir purtyklėje pasirinktu laiku, užsuktuose rudo stiklo buteliukuose, ekstrakcija vykdoma kambario temperatūroje, ultragarso vonelėje nustačius 20 kHz dažnį. Gauti ekstraktai filtruojami per reikiamu tirpikliu sudrėkintą popierinį filtrą, sudrėkintą ekstrakcijos tirpikliu, naudojant vakuuminę pompą ir išpilstomi į tamsaus rudo stiklo buteliukus, laikomi nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje.

2.6. Tyrimo metodai

2.6.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Suminiam fenolinių junginių kiekiui nustatyti buvo naudojamas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas.

Šiam metodui yra reikalingi 7,5% natrio karbonato tirpalas ir darbinis Folin – Ciocalteu tirpalas (Folin-Ciocalteu reagentas buvo praskiedžiamas distiliuotu vandeniu santykiu 1:9).

Mėgintuvėlyje 1 ml tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 5 ml 10% Folin-Ciocalteu reagento ir pridedama 4 ml 7,5% natrio karbonato tirpalo. Gautas mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru buvo išmatuota mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui. Esant per didelei absorbcijai – ekstraktai yra skiedžiami ir eksperimentas pakartojamas. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tačiau vietoje tiriamojo ekstrakto dedama parinktos koncentracijos ekstrakcijos tirpiklio, vandens.

Kalibracinei kreivei sudaryti, naudojami 5 skirtingų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Išmatavus galo r. tirpalų absorbciją, sudaroma galo rūgšties kalibracinė kreivė (y = 2,1441x + 0,0319; R2 _{= 0,9947).}

Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu gramui sausos žaliavos (mg/g) yra apskaičiuojamas pagal formulę:

GAE =

C – galo rūgšties koncentracija (mg/ml) nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

a – skiedimo faktorius; m – sausos žaliavos masė (g).

2.6.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Pagamintuose gailiųjų ir didžiųjų dilgėlių ekstraktuose buvo įvertinamas suminis flavonoidų kiekis, išreikštas rutino ekvivalentais.

Tiriamasis tirpalas buvo ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpylus 1 ml vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, 10 ml 96 % V/V etanolio, 0,5 ml 30% druskos rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10% aliuminio chlorido tirpalo ir 2 ml 5% heksametilentetramino tirpalo. Gautas tirpalas praskiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymos kolbutėje ir tada 30 minučių laikomas visiškoje tamsoje, apsaugant jį nuo tiesioginių saulės spindulių.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml kolbutę įpylus 1 ml vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto, 10 ml 96% V/V etanolio, 0,5 ml 30% druskos rūgšties tirpalo ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės. Spektrofotometru matuojamas tiriamųjų tirpalų absorbcijos dydis naudojant palyginamąjį tirpalą ir esant 407 nm bangos ilgiui.

Rutino kalibracinei kreivei sudaryti yra naudojami skirtingų koncentracijų rutino tirpalai.

Suminio flavonoidų kiekio nustatymui sudaroma kalibracinė rutino kreivė (3,6246x + 0,0537; R2 = 0,9982).

Suminis flavonoidų kiekis procentais, išreikštas rutino ekvivalentu, apskaičiuojamas pagal formulę:

X

=

V (VAŽ) – visas paruoštos vaistinės augalinės žaliavos tūris mililitrais;

A (VAŽ) – paruoštos vaistinės augalinės žaliavos tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; m (VAŽ) – vaistinės augalinės žaliavos masė gramais, sunaudota ištraukai ruošti; A (r) – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis.

2.6.3. Suminio fenolkarboksirūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Suminis fenolkarboksirūgščių kiekis U. urens L. ir U. dioica L. ekstraktuose buvo nustatytas spektrofotometriniu metodu naudojant Arnow reagentą.

Arnow reagentas susideda iš 10 g natrio molibdato, 10 g natrio nitrito, ištirpinant ir praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki 100 ml žymės matavimo kolbutėje.

Tiriamasis tirpalas gaminamas sumaišius kolbutėje 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, dedama 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišoma. Iš karto matuojama gauto tirpalo absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui.

Lyginamuoju tirpalu buvo naudojamas tirpalas pagamintas kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml praskiesto natrio šarmo ir praskiedžiant išgrynintu vandeniu.

Suminis procentinis fenolkarboksirūgčių kiekis ekstrakte, perskaičiuotas chlorogeno rūgštimi, remiantis formule:

X

=

A – tiriamo tirpalo absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui; m – tiriamos augalinės žaliavos masė gramais.

2.6.4. Askorbo rūgšties nustatymas titrimetriniu metodu

Vaistinė augalinė žaliava susmulkinama elektriniu malūnėliu iki tamsiai žalios spalvos miltelių. 2,5 g tokios vaistinės augalinės žaliavos užpilama 25 ml distiliuoto vandens kūginėje kolboje. Gautas mišinys paliekamas stovėti 10 min. Vėliau jis sumaišomas ir filtruojamas. Į kitą 25 ml talpos kūginę kolbą mikropipetėmis įpilama 0,5 ml praskiestos vandenilio chlorido rūgšties, 0,5 ml šviežiai gautos ir nufiltruotos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos ir 6,5 ml distiliuoto vandens. Gautas tirpalas titruojamas natrio 2,6 –

dichlorfenolindofenoliato (DCPIP) 0,001 M tirpalu iki blyškios rožinės spalvos, kuri turi neišnykti bent 10 sekundžių.

1 ml DCPIP 0,001 M tirpalo atitinka 0,000088 g askorbo rūgšties.

Askorbo rūgšties kiekis procentais (X%) absoliučiai sausai vaistinei augalinei žaliavai

apskaičiuojamas naudojantis formule:

X

=

𝑚𝑚 × 𝑉𝑉2 × (100−𝑊𝑊) V – titravimui sunaudotas DCPIP 0,001 M tirpalo kiekis ml; V1 – ištraukos tūris ml;

m – vaistinės augalinės žaliavos masė g; V2 – ištraukos, paimtos titravimui, tūris ml; W – žaliavos drėgmės kiekis %.

2.6.5. Suminio raugų kiekio nustatymas titrimetriniu metodu

Laboratorijoje prieš suminio raugų kiekio tyrimą pagaminamas indigosulfonrūgšties tirpalas. 1 g indigokarmino ištirpinama 25 ml sulfato rūgšties, ištirpinus įpilama dar 25 ml sulfato rūgšties ir praskiedžiama distiliuotu vandeniu iki 100 ml.

Atsveriama 2 g susmulkintos vaistinės augalinės žaliavos ir 500 ml talpos kūginėje kolboje užpilama 250 ml distiliuoto verdančio vandens. Toks mišinys virinamas 30 min vandens vonelėje su grįžtamuoju kondensatoriumi, tam, kad nesumažėtų vandens kiekis ekstrakte. Virinant mišinys dažnai pamaišomas. Po 30 min. virinimo vandens vonelėje ekstraktas atvėsinamas iki kambario temperatūros. Apie 100 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos nukošiama per vatą į 200 ml talpos kūginę kolbą atidžiai saugant, kad į nukoštą ekstraktą nepatektų vaistinės augalinės žaliavos dalelių. Po to į 750 ml talpos kūginę kolbą įpilama 25 ml gautos vaistinės augalinės žaliavos ištraukos, 500 ml distiliuoto vandens ir 25 ml indigosulfonrūgšties tirpalo. Mišinys titruojamas šviežiai laboratorijoje pagamintu kalio permanganato 0,02 M tirpalu nuolat maišant iki tol, kol atsiranda geltona spalva. Ji palyginama su tuščiojo mėginio, atliekamo kartu, tirpalo spalva.

Visiškai sausos vaistinės augalinės žaliavos suminis raugų kiekis procentais (X%) apskaičiuojamas naudojant formulę:

X

=

=

V – tiriamosios žaliavos ištraukai titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris ml; V1 – tuščiajam mėginiui titruoti sunaudotas kalio permanganato 0,02 M tirpalo tūris ml;

m – žaliavos masė g; W – žaliavos drėgmė %.

2.7. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas

2.7.1. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS katijonų - radikalų surišimo metodu

Paruošiamas 2 mM koncentracijos motininis ABTS tirpalas, atsveriant 0,0548 g ABTS miltelių ir ištirpinant distiliuotame vandenyje. Į gautą tirpalą pridedama 0,0095 g kalio persulfato, mišinys sumaišomas ir paliekamas tamsoje 16 val.

Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas praskiedžiant motininį ABTS tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų, esant bangos ilgiui 734 nm. Palyginamasis tirpalas – distiliuotas vanduo.

Į mėgintuvėlį analizei imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir įpilama 20 μl tiriamojo ekstrakto, gerai sumaišoma ir laikoma tamsoje 1 valandą. Po to spektrofotometru išmatuojama absorbcija esant 734 nm bangos ilgiui.

Gaminami 5 žinomų koncentracijų trolokso tirpalai. Išmatavus jų absorbciją, brėžiama žinomų trolokso tirpalų koncentracijų (0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml ir 0,5 mg/ml) kalibracinė kreivė (y = 0,9875x + 0,1475; R2 _{= 0,9967).}

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama antioksidanto trolokso ekvivalentais gramui žaliavos ir apskaičiuojama pagal formulę:

TE

=

𝑚𝑚 µmol/g

C – trolokso koncentracija μM nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.

2.7.2. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu

Etaloninis DPPH tirpalas buvo paruoštas sveriant 0,0024 g DPPH radikalo, kuris buvo ištirpintas 96% V/V etanolyje 100 ml tūrio matavimo kolboje, praskiedžiant iki žymos. Paruošto tirpalo absorbcija buvo matuojama esant 515 nm bangos ilgiui. 96% V/V etanolis panaudotas kaip palyginamasis tirpalas.

Tiriamasis tirpalas buvo ruošiamas paimant 60 μl tiriamojo ekstrakto, įpilant ir sumaišant su 3 ml etaloninio DPPH tirpalo. Palyginamajam tirpalui pagaminti panaudota 60 μl 96% V/V etanolio ir 3 ml etaloninio DPPH tirpalo. Gauti mišiniai buvo laikomi visiškoje tamsoje 0,5 valandos. Praėjus šiam laikui, išmatuotas absorbcijos pokytis esant 515 nm bangos ilgiui.

Apskaičiuojamas tiriamųjų tirpalų inaktyvuoto DPPH radikalo kiekis %:

SAA

=

𝑉𝑉(𝑝𝑝𝑎𝑎𝑝𝑝.)

× 100%

A(tir.) – tiriamojo tirpalo absorbcijos reikšmė; A(pal.) – palyginamojo tirpalo absorbcijos reikšmė.

2.7.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukcinio aktyvumo metodu

FRAP metodui yra reikalingi šie reagentai: 300 mmol/l acetatinis buferis, 10 mmol/l TPTZ tirpalas, 20 mmol/l geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas.

Darbinis FRAP reagentas yra gaunamas sumaišius pagamintus reagentus santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo). Tiriamajam tirpalui paruošti imama 3 ml darbinio FRAP reagento ir sumaišoma su 20 μl tiriamojo vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoj tiriamojo vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto pilamas reikiamos koncentracijos ekstrakcijos tirpiklis, vanduo. Praėjus 1 val., spektrofotometru matuojama mišinio absorbcija, esant 593 nm bangos ilgiui.

Trolokso kalibracinės kreivės (y = 0,6952x + 0,0354; R² = 0,9962) sudarymui naudojamas trolokso standartas.

Redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:

TE

=

𝑚𝑚 µmol/g C – trolokso koncentracija μM nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.

2.7.4. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas CUPRAC redukcinio aktyvumo metodu

U. urens L. ir U. dioica L. augalų ekstraktų antioksidacinė geba taip pat buvo vertinama taikant vario redukcijos antioksidacinės galios (CUPRAC) metodą.

CUPRAC reagentui paruošti reikia: vario (II) chlorido tirpalo, neokuproino tirpalo ir acetatinio buferio (pH = 7). Šie trys tirpalai sumaišomi santykiu 1:1:1. Sumaišytas CUPRAC reagentas 1 valandą laikomas kambario temperatūroje, laikomas tamsoje - saugomas nuo tiesioginių saulės spindulių.

Vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto analizei į kiuvetę įpilama 3 ml sumaišyto CUPRAC reagento tirpalo ir automatinėmis pipetėmis įpilama 10 μl tiriamojo ekstrakto mėginio. Tirpalo šviesos absorbcija matuojama spektrofotometru esant 450 nm šviesos bangos ilgiui. Antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu yra apskaičiuojamas pagal trolokso kalibracinę kreivę (y = 0,7879x + 0,0168; R2_=0,9987).

Antioksidacinis aktyvumas CUPRAC metodu išreiškiamas trolokso ekvivalentais ir yra apskaičiuojamas pagal šią formulę:

TE

=

C – trolokso koncentracija μM nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g.

2.8. Fenolinių junginių kiekybinis ir kokybinis nustatymas ESC metodu

ESC analizė atlikta naudojant „Water e2695 Alliance“ sistemą su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 2998“. Buvo naudojama 3 μm ACE analitinė kolonėlė (C18, 150 mm x 4,6 mm). Gradientas

sudarytas iš A eliuento (0,05% trifluoracto rūgštis) ir B eliuento (acetonitrilas). Naudotas gradiento kitimas: 0-5 min – 12% tirpiklis B, 5-50 min – 12-30% tirpiklis B, 50-51 min – 30-90% tirpiklis B, 51-56 min – 90% tirpiklis B, 57 min – 12% tirpiklis B. Tėkmės greitis 0,5 ml/min, injekcijos tūris 10 μl. Chromatografinių smailių identifikavimas atliktas pagal analitės ir etaloninio mėginio sulaikymo trukmę ir UV absorbcijos spektrus.

2.9. Tyrimo duomenų analizė

Statistinė duomenų analizė atlikta naudojantis „MS Excel 2016“ („Microsoft“, JAV) ir SPSS 26.0 (2019) („IBM“, JAV) programomis. Apskaičiuoti trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai. Koreliacinių ryšių stiprumas nustatytas taikant Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas taikant vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenolinių junginių ir flavonoidų

nustatymui

Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenoliniams junginiams ir flavonoidams priklauso nuo ekstrakcijai pasirinkto tirpiklio, jo poliškumo, koncentracijos, taip pat nuo temperatūros, esančios ekstrahavimo metu, ekstrakcijos trukmės, ekstrahuojamų dalelių dydžio, pH, norimų išekstrahuoti junginių poliškumo, tirpumo, jų fizikinių ir cheminių savybių [51][52][53].

Vaistinė augalinė žaliava gali būti tiriama šviežia arba džiovinta, taip pat tiesiog susmulkinta arba sumalta iki miltelių. Kuo smulkesnė žaliava, tuo ji turi daugiau paviršiaus ploto liestis su pasirinktu ekstrakcijai tirpikliu. Dalelių dydis, mažesnis nei 0,5 mm yra vienas iš geriausių didžiausiai ekstrakcijos išeigai gauti [52].

Vaistinei augalinei žaliavai apdoroti gali būti naudojami įvairūs metodai – džiovinimas ore, džiovinimas mikrobangų krosnelės ar orkaitės pagalba, taip pat liofilizacija (džiovinimas šaldant). Šiame tyrime tirtos vaistinės augalinės žaliavos buvo džiovinamos ore. Šis metodas pasižymi ilgesne trukme (priklauso nuo džiovinamos augalo dalies), tačiau jo metu nėra naudojamas karštis, todėl aktyviosios medžiagos, kurios yra termolabilios, yra išsaugomos.

Dažniausiai pasirenkami ekstrakcijos metodai yra maceracija, infuzija, perkoliacija, nuvirų ruošimas (angl. decoction), soksleto ekstrakcija, ekstrakcija naudojant mikrobangas (angl. microwave assisted extraction (MAE)), pagreitinto ekstrahento ekstrakcija (angl. accelerated solvent extraction (ASE)), superkritinių skysčių ekstrakcija (angl. supercritical fluid extraction (SFE)) ir maceracija naudojant ultragarsą (angl. ultrasound – assisted extraction (UAE)) [53][54]. Ultragarsas dideliu dažniu veikia vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto daleles, taip padidindamas jų susidūrimo su ekstrakcijos tirpikliu paviršiaus plotą. Tuomet pagerėja ekstrahento pereinamumas per augalo ląstelių sieneles, taip išgaunama daugiau aktyviųjų medžiagų ir pagerėja ekstrakcijos išeiga [54].

Šiame tyrime ekstraktų paruošimui buvo naudojami du ekstrakcijos metodai – maceracija purtyklėje ir ekstrakcija naudojant ultragarsą.

Ultragarsinei ekstrakcijai buvo naudojama ultragarso vonelė, pasirinkus 20 kHz dažnį ir kambario temperatūrą. Pasirinktos ekstrahavimo ultragarsu trukmės buvo 5, 10, 20, 30, 40, 50 ir 60 min.

Maceruojant automatinėje purtyklėje yra padidinamas dalelių pasiskirstymas po ekstrakcijos tirpiklį, taip pat padidėja dalelių ir ekstrahento lietimosi paviršiaus plotas, biomolekulės geriau ir tolygiau pasiskirsto po tirpiklį, lyginant su paprasta maceracija, užpilant tirpiklį ant vaistinės augalinės žaliavos ir paliekant stovėti.

Maceraciją buvo pasirinkta atlikti automatinėje purtyklėje, kambario temperatūroje. Pasirinktos maceracijos trukmės – 0,5, 1, 2, 4 ir 8 val.

Ekstrakcijos iš vaistinių augalinių žaliavų didžiausiai išeigai pasiekti yra labai svarbus ekstrakcijos tirpiklio pasirinkimas. Pirmiausia – reikia apibrėžti, kokios medžiagos bus ekstrahuojamos. Tada yra pasirenkamas ekstrakcijos tirpiklis, dažniausiai renkamasi pagal ekstrahuojamų veikliųjų medžiagų poliškumą. Ekstrakcijos tirpiklis turi būti mažai toksiškas, mažai degus ir, geriausia, nenuodingas [55]. Tokių tirpiklių atitinkančių šiuos kriterijus nėra daug, todėl šiame darbe yra pasirinkti tokie ekstrakcijos tirpikliai: vanduo, skirtingų koncentracijų V/V etanolis (30%, 50%, 70% ir 85%), taip pat skirtingų koncentracijų metanolis (30%, 50%, 70% ir 85%).

Ekstrakcijos sąlygos buvo parenkamos dvejoms junginių grupėms – fenoliniams junginiams ir flavonoidams. Naudota žaliava – U. urens L. žolė, surinkta Kretingos raj., Želvių kaime. Vaistinė augalinė žaliava buvo susmulkinta elektriniu malūnėliu iki miltelių pavidalo.

3.1.1. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas fenolinių junginių nustatymui

Pirmiausia yra parenkamas optimalaus poliškumo tirpiklis. Tyrime naudoti skirtingų koncentracijų V/V etanolis bei tokių pačių koncentracijų metanolis ir vanduo. Ekstrakcija vykdoma maceracijos ultragarso vonioje metodu. Ekstrakcijos trukmė – 40 min. Gauti rezultatai pateikiami 11 pav.

Įvertinus gautus duomenis, galima teigti, kad geriausias ekstrakcijos tirpiklis gailiosios dilgėlės fenoliniams junginiams išekstrahuoti yra 70% V/V etanolis (10,58 ± 0,14 mg/g GAE) (p<0,05). Tuo tarpu mažiausia fenolinių junginių išeiga gauta kaip ekstrakcijos tirpiklį naudojant 85% V/V etanolį (2,19 ± 0,16 mg/g GAE). Tyrime naudotas distiliuotas vanduo (5,26 ± 0,22 mg/g GAE) išekstrahavo 2,4 karto daugiau fenolinių junginių nei 85% V/V etanolis. Vertinant rezultatus, neaptikta beveik jokio skirtumo tarp vandens (5,26 ± 0,22 mg/g GAE), 30% metanolio (5,27 ± 0,18 mg/g GAE), 50% metanolio (5,54 ± 0,2 mg/g GAE) ir 70% metanolio (5,58 ± 0,11 mg/g GAE) (p>0,05). Kadangi gauti duomenys parodė, kad didžiausia fenolinių junginių išeiga gauta naudojant 70% V/V etanolį, jis yra pasirenkamas tolimesniems fenolinių junginių tyrimams.

11 pav. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeigos priklausomybė nuo ekstrahento poliškumo (p<0,05)

Maceracija purtyklėje

Žemiau pateiktas 12 pav. parodo fenolinių junginių išeigos priklausomybę nuo pasirinktos trukmės maceruojant purtyklėje. Maceracijai naudotas 70% V/V etanolis. Pasirinktos trukmės – 0,5, 1, 2, 4, 8 val.

12 pav. Fenolinių junginių kiekio priklausomybė nuo ekstrakcijos trukmės maceruojant purtyklėje (p<0,05)

Iš gautų duomenų galime spręsti, kad geriausia maceracijos trukmė purtyklėje yra 4 valandos (8,23 ± 0,19 mg/g GAE) (p<0,05). Įvertinus gautus duomenis, yra matoma fenolinių junginių išeigos

3.94 5.84 10.58 2.19 5.26 5.27 5.54 5.58 2.90 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Fe nol ini ų jungi ni ų ki eki s, m g/ g GAE Ekstrahentas/Koncentracija 3.08 4.04 5.41 8.23 6.41 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

30 min 1 val. 2 val. 4 val. 8 val.

Fe nol ini ų jungi ni ų ki eki s, m g/ g GAE Ekstrakcijos laikas