LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MINDAUGAS LAPIENIS
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS BEI
POTENCIOMETRINIO TITRAVIMO METODŲ TAIKYMAS
DIAZEPAMO IR KLONAZEPAMO ĮVERTINIMUI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. Dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis _________ Data _________
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS BEI
POTENCIOMETRINIO TITRAVIMO METODŲ TAIKYMAS
DIAZEPAMO IR KLONAZEPAMO ĮVERTINIMUI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Liudas Ivanauskas, parašas
Data ___________
Recenzentas Darbą atliko Vardas, pavardė, parašas Magistrantas
Mindaugas Lapienis, parašas Data ___________ Data ___________
TURINYS SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 7 SANTRUMPOS ... 9 1. ĮVADAS ... 10 2. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12
2.1 BENDRA BENZODIAZEPINŲ APŢVALGA ... 12
2.2 DIAZEPAMO, KLONAZEPAMO VARTOJIMO PAPLITIMAS ... 13
2.2.1 Diazepamo ir klonazepamo vartojimo paplitimas Lietuvoje ... 13
2.2.2 Diazepamo ir klonazepamo vartojimo paplitimas Baltijos šalyse ... 15
2.2.3 Benzodiazepinų vartojimo paplitimas bei gamyba kitose uţsienio šalyse ... 16
2.3 BENZODIAZEPINŲ TOKSIŠKUMAS ... 18
2.3.1 Nepageidaujamas benzodiazepinų poveikis ... 18
2.3.2 Apsinuodijimo atvejai Lietuvoje ... 18
2.3.3 Apsinuodijimo atvejai kitose šalyse ... 19
2.3.4 Ikiklinikinių saugumo tyrimų duomenys ... 20
2.3.4.1 Diazepamo tyrimo duomenys ... 20
2.3.4.2 Klonazepamo tyrimo duomenys ... 20
2.4 TIRIAMOSIOS VAISTINĖS MEDŢIAGOS ... 21
2.4.1 Diazepamo veiklioji medţiaga ... 21
2.4.2 Klonazepamo veiklioji medţiaga ... 23
2.5 BENZODIAZEPINŲ JUNGINIŲ ĮVERTINIMO METODIKOS ... 24
2.5.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodas ... 25
2.5.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodikos, tiriant diazepamo ir klonazepamo junginius bei jų mišinį ... 26
2.5.2.1 ESC analizės metodikos diazepamui:... 26
2.5.2.2 ESC analizės metodikos klonazepamui:... 27
2.5.3 Potenciometrinio titravimo analizės metodas... 27
2.5.4 Potenciometrinio titravimo analizės metodikos, tiriant diazepamo ir klonazepamo junginius ... 29
2.5.4.1 Potenciometrinio titravimo analizės metodikos diazepamui ir klonazepamui ... 29
2.5.4.2 Potenciometrinio titravimo analizės metodikos diazepamui ... 29
3.1 TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 30
3.1.1 Tyrimo objektas ... 30
3.1.2 Efektyvioji skysčių chromatografija ... 30
3.1.2.1 Cheminės medţiagos ir tirpikliai ... 30
3.1.2.2 Chromatografijos įranga ir sąlygos ... 30
3.1.2.3 Veikliųjų medţiagų standartinių ir tiriamųjų mėginių paruošimas ... 31
3.1.3 Potenciometrinis titravimas ... 32
3.1.3.1 Cheminės medţiagos ir tirpikliai ... 32
3.1.3.2 Potenciometrinio titravimo įranga ir sąlygos ... 32
3.1.3.3 Veikliųjų medţiagų standartinių ir tiriamųjų tirpalų paruošimas ... 32
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33
4.1 EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS VALIDACIJA DIAZEPAMO IR KLONAZEPAMO VEIKLIŲJŲ MEDŢIAGŲ TYRIMUI... 33
4.1.1 Metodo specifiškumas ... 33
4.1.2 Rezultatų glaudumas ... 35
4.1.3 Tiesiškumas ... 37
4.2 EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS TAIKYMAS DIAZEPAMO IR KLONAZEPAMO VAISTINĖS FORMOS BEI JŲ MIŠINIO IDENTIFIKAVIMUI ... 38
4.3 JUNGTINIŲ VALSTIJŲ FARMAKOPĖJOS ESC ANALIZĖS METODO TAIKYMAS ... 41
4.4 DIAZEPAMO IR KLONAZEPAMO ANALIZĖ POTENCIOMETRINIO TITRAVIMO METODU ... 42
4.5 POTENCIOMETRINIO TITRAVIMO TAIKYMAS ANALIZUOJANT TIRIAMŲJŲ MEDŢIAGŲ VAISTINES FORMAS ... 43
4.6 EUROPOS FARMAKOPĖJOS POTENCIOMETRINIO TITRAVIMO ANALIZĖS METODO TAIKYMAS ... 44
5. IŠVADOS ... 45
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 48
SANTRAUKA
M. Lapienio magistro baigiamasis darbas „Efektyviosios skysčių chromatografijos bei potenciometrinio titravimo metodų taikymas diazepamo ir klonazepamo įvertinimui“/ mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai ţodţiai: benzodiazepinai, diazepamas, klonazepamas, efektyvioji skysčių chromatografija,
potenciometrinis titravimas.
Darbo tikslas: Atlikti diazepamo ir klonazepamo veikliųjų medţiagų kiekybinį įvertinimą pagal
Europos ir Jungtinių Valstijų farmakopėjų metodikas. Įvertinti skirtingų farmakopėjų metodikų pasirinkimo privalumus ir trūkumus ir optimizuoti ESC metodiką veikliųjų medţiagų atskyrimui mišinyje bei kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui vaistinėje formoje.
Darbo uţdaviniai: Analizuoti ir apibendrinti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie
benzodiazepinų vartojimą, toksiškumą, farmakokinetines savybes. Išanalizuoti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie potenciometrinio titravimo, efektyviosios skysčių
chromatografijos bei kitų metodų taikymą tiriant benzodiazepinus. Atlikti kokybinį bei kiekybinį diazepamo ir klonazepamo įvertinimą ESC metodu pagal Jungtinių Valstijų farmakopėją bei kiekybiškai įvertinti diazepamą ir klonazepamą potenciometrinio titravimo metodu pagal Europos farmakopėją. Pritaikyti potenciometrinio titravimo ir efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodus vertinant diazepamą ir klonazepamą tabletėse. Įvertinti bei palyginti skirtingais metodais nustatytas veikliąsias medţiagas ir jų kiekius tiriamuosiuose mėginiuose.
Tyrimo objektas ir metodai: Standartiniai diazepamo ir klonazepamo veikliųjų medţiagų tirpalai ir
tiriamieji tirpalai, pagaminti iš „diazepeks“ ir „clonazepam“ tablečių. Metodai: efektyvioji skysčių chromatografija ir potenciometrinis titravimas.
Rezultatai ir išvados: Atlikta mokslinių literatūros šaltinių analizė apie benzodiazepinų savybes bei
jiems įvertinti taikomus analizės metodus. Vadovaujantis Jungtinių Valstijų farmakopėja, buvo pritaikytas ir validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Gavus tyrimo rezultatus, nustatyti diazepamo ir klonazepamo standartinių tirpalų UV šviesos absorbcijos spektrai ir sulaikymo trukmės (SD tirpalo UV – 230 nm, tR = 10,700 min ir SK tirpalo UV – 309 nm, tR = 7,818 min). Taip pat šia metodika tiriamos tabletės su veikliosiomis medţiagomis bei vertinami UV šviesos absorbcijos spektrai ir sulaikymo trukmės (TD tirpalo UV – 230 nm, tR = 10,713 min ir TK tirpalo UV – 309 nm, tR = 7,810 min). Vadovaujantis Europos farmakopėjos metodikomis, potenciometrinio titravimo metodu
nustatyti diazepamo 196,44mg (98,22%) ir klonazepamo 274,66mg (99,87%) kiekiai ir ekvivalentiniai taškai (diazepamo 6,9ml ir klonazepamo 8,7ml) standartiniuose mėginiuose mėginiuose. Galima teigti, kad Jungtinių Valstijų rekomenduojamas ESC metodas yra tikslesnis, atrankesnis bei ekonomiškesnis, lyginant su Europos farmakopėjos rekomenduojamu potenciometriniu titravimo metodu, tiriant
SUMMARY
The Master Thesis The application of high-performance liquid chromatographyand potentiometric titration methods in the evaluation of diazepam and clonazepam by Mindaugas Lapienis/ scientific tutor prof. Dr. Liudas Ivanauskas. Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological chemistry. Kaunas.
Key words: benzodiazepine, diazepam, clonazepam, high-performance liquid chromatography,
potentiometric titration.
The aim is to carry out the quantitative evaluation of the active substances of diazepam and
clonazepam according to the methods of the United States and European pharmacopoeias. To evaluate the advantages and disadvantages of the selection of different pharmacopoeia methods, to optimize high-performance liquid chromatography method in the detachment of active substances in the mixture as well as in the qualitative and quantitative evaluation of dosage form.
The Tasks are to analyse and summarise the information related to the usage, toxicity and
pharmacokinetic features of benzodiazepines, the application of potentiometric titration, high-performance liquid chromatography and other methods in the analysis of benzodiazepines. To carry out the quantitative and qualitative evaluation of diazepam and clonazepam using HPLC method according to the Unites States pharmacopoeia and to carry out the quantitative evaluation of diazepam and clonazepam using potentiometric titration method according to the European pharmacopoeia. To apply the methods of potentiometric titration and HPLC in the analysis of diazepam and clonazepam tablets.
The object of the Thesis is the standard solutions of the diazepam and clonazepam active substances
and investigative solutions made of diazepeks and clonazepam tablets.
The methods are high-performance liquid chromatography and potentiometric titration.
Results and conclusions: the analysis of scientific sources about benzodiazepine features and the
methods used to evaluate them were carried out. The HPLC method was applied and accepted as suitable according to the United States pharmacopoeia. On the grounds of the research results, UV spectrums and retention time of the standard solutions of clonazepam and diazepam were defined (SD solution UV – 230 nm, tR = 10,700 min and SK solution UV – 309 nm, tR = 7,818 min). Tablets with
active substances were examined using the same method, UV light absorption spectrums and retention time were evaluated (TD solution UV – 230 nm, tR = 10,713 min and TK solution UV – 309 nm, tR =
equivalent points (diazepam 6,9 ml and clonazepam 8,7ml) in solutions were determined according to the methodology of the European pharmacopoeia and potentiometric titration method. Thus, having completed the research of active ingredients and mixtures of clonazepam and diazepam, it can be proposed that HPLC method suggested by the United States is more accurate, selective and economical in comparison with the potentiometric titration method suggested by the European pharmacopoeia.
SANTRUMPOS
ATC – Anatominė terapinė cheminė klasifikacijaBZD – Benzodiazepinai; DC – Dujų chromatografija
DDD - Nustatyta paros vaisto dozė, kuri yra vaisto suvartojimo techninis vienetas; ESC – Efektyvioji skysčių chromatografija;
GABA – Gama amino sviesto rūgštis; LD – Mirtina dozė
MS – Masių spektrometrija
N03A – Antiepilepsiniai dariniai (Pagal ATC klasifikaciją) N05BA – Benzodiazepinų dariniai (Pagal ATC klasifikaciją) NTIC - Nacionalinis Toksikologijos Informacijos Centras; PVDF – Polivinilideno fluoridas
SD – Standartinis diazepamo veikliosios medţiagos tirpalas SK – Standartinis klonazepamo veikliosios medţiagos tirpalas tR – Sulaikymo laikas
TD – Tiriamasis diazepamo tirpalas (pagamintas iš tabletės) TK – Tiriamasis klonazepamo tirpalas (pagamintas iš tabletės) UV – Ultravioletinė spinduliuotė
1. ĮVADAS
Neracionalus ir didėjantis vaistinių preparatų suvartojimas Lietuvoje bei pasaulyje sukelia daug problemų (priklausomybė, įvairūs nepageidaujami poveikiai) bei sunkina pacientų socialinę gerovę. „Baltic Statistics of Medicine“ duomenimis, Lietuva lyginant su kitomis Baltijos šalimis yra pirma pagal parduodamų vaistų kiekį (2012m. Lietuvoje vaistų pardavimai siekė 473mln. Eurų, tuo tarpu Latvijoje 260mln. ir Estijoje 222mln. Eurų). Taip pat paţymima, kad nuo 2009m. iki 2012m. širdies ir kraujagyslių, virškinimo trakto ir metabolizmo bei nervų sistemą veikiančių vaistų rinka Lietuvoje išaugo 15,3%.[5] Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis, vertinant vaistų suvartojimą pagal ATC grupes, nervų sistemą veikiantys vaistai uţima antrą vietą tarp visų grupių ir 2013m. Lietuvoje seikė net 140,919 DDD/ 1000 gyvent. /dieną, taip pat kartu fiksuojamas šios vaistų grupės vartojimo didėjimas 2009-2013m., kuris lygus 3,31%.[4]
Kartu su šia opia problema atsiranda kitos, ne ką maţiau svarbios problemos, tai yra tyčiniai bei atsitiktiniai apsinuodijimai, daţniau pasireiškiantys nepageidaujami poveikiai. Dėl šių prieţasčių būtina kurti prevencines sistemas, skatinti racionalų vaistų vartojimą, plėsti farmakologinio budrumo veiklą, sveikatos prieţiūros specialistams būti atidesniems išrašant ar atleidţiant vaistinį preparatą. Tačiau bet kokiu atveju šiomis dienomis ūmūs atsitiktiniai ar tyčiniai apsinuodijimai yra neišvengiami, todėl taip pat būtina plėtoti instrumentinius analizės metodus, leidţiančius greitai ir atrankiai įvertinti veikliųjų medţiagų kokybę bei kiekybę.
Analitinės toksikologijos disciplina tiria įvairių junginių, vaistų ir jų komponentų
identifikavimą, aptikimą bei kiekio nustatymą biologiniuose skysčiuose, vaistiniuose preparatuose. Analizės yra plačiai taikomos ligoninėse, įskaitant apsinuodijimų atvejus, taip pat labiau
specializuotose kategorijose – teismo toksikologijos laboratorijose, vaistų ar narkotinių medţiagų piktniaudţiavimo patikros centruose, terapinių vaistų stebėjimo tyrimuose bei darbo ir aplinkos toksikologijos tyrimuose.[21]
Darbo tikslas: Atlikti diazepamo ir klonazepamo veikliųjų medţiagų kiekybinį įvertinimą pagal
Europos ir Jungtinių Valstijų farmakopėjų metodikas. Įvertinti skirtingų farmakopėjų metodikų pasirinkimo privalumus ir trūkumus ir optimizuoti ESC metodiką veikliųjų medţiagų atskyrimui mišinyje bei kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui vaistinėje formoje.
Darbo uţdaviniai:
1. Analizuoti ir apibendrinti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie benzdiazepinų vartojimą, toksiškumą, farmakokinetines savybes;
2. Išanalizuoti ir apibendrinti moksliniuose šaltiniuose pateiktą informaciją apie potenciometrinio titravimo, efektyviosios skysčių chromatografijos bei kitų metodų taikymą tiriant
benzodiazepinus;
3. Atlikti kokybinį bei kiekybinį diazepamo ir klonazepamo įvertinimą ESC metodu pagal Jungtinių Valstijų farmakopėją bei kiekybiškai įvertinti diazepamą ir klonazepamą potenciometrinio titravimo metodu pagal Europos farmakopėją;
4. Pritaikyti potenciometrinio titravimo ir efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodus vertinant diazepamą ir klonazepamą tabletėse.
5. Įvertinti bei palyginti skirtingais metodais nustatytas veikliąsias medţiagas ir jų kiekius tiriamuosiuose mėginiuose;
2. LITERATŪROS APŢVALGA
2.1 Bendra benzodiazepinų apţvalga
Benzodiazepinai(BZD) plačiai vartojami raminamieji – migdomieji vaistiniai preparatai.[2] Jie skiriami gydyti nerimo, nemigos, konvulsinius ir judėjimo sutrikimus bei gydyti įvairias manijas kartu su skirtingų vaistų deriniais.[8] Jų struktūra sudaryta iš 1,4-benzodiazepinų, dauguma turi karboksamido grupę septynariame heterociklo ţiede. 7-oje struktūros padėtyje įvestas pakaitas halogenas (-Cl) arba nitro grupė, kuri yra būtina raminamajam – migdomajam poveikiui sukelti. [2]
1950 metais atlikus pirmus klinikinius bandymus buvo tiriama bei stengiamasi išaiškinti BZD veikimo mechanizmą. Tik 1974 metais Roche diagnostinėje laboratorijoje Jungtinėse Valstijose buvo išaiškintas šios vaistinių preparatų grupės specifinis afinitetas gamaamino sviesto rūgšties (GABA) receptoriams, esantiems centrinėje nervų sistemoje. [1] GABAa receptoriai turi penktinę struktūrą,
sudarytą iš penkių subvienetų (įvairios polipeptidų klasės α,β,γ,δ,ε,π,ρ ir t.t). Pagrindinės GABAa
izoformos receptoriai randami smegenyse, kurios yra sudarytos iš dviejų α1 subvienetų, dviejų β2
subvienetų ir vieno γ2 subvieneto. Šioje izoformoje dvi prisijungimo zonos GABA yra tarp α1 ir β2
subvienetų ir prisijungimo zona benzodiazepinams tarp α1 ir γ2 subvienetų. GABAa receptoriai
skirtingose centrinės nervų sistemos lokalizacijose susidaro iš skirtingų polipeptidų subvienetų ir BZD jungiasi prie daugelio jų, įskaitant receptorių izoformas sudarytas iš α2, α3, ir α5. [2]
Benzodiazepinai veikia maţindami intraląstelinės ir ekstraląstelinės potencialų skirtumą, o kartu ir maţina ląstelės gebėjimą perduoti nervinį impulsą.[8] Todėl šie psichotropiniai vaistai sukelia raminamąjį poveikį, susijusį su nerimo maţinimu vartojant santykinai maţomis dozėmis. Daugelyje tyrimų stebimas anksiolitinis raminamasis poveikis kartu su antidepresantiniu bei kognityvinėmis funkcijoms. Tyrimuose su gyvūnais įrodyta, kad benzodiazepinai geba slopinti baimės-nerimo jausmą. Šis gebėjimas tapatinamas su raminamųjų-migdomųjų vaistų nerimą maţinančiu poveikiu, tačiau priskiriamas ne visiems raminamiesiems, pavyzdţiui, tricikliniams antidepresantams ar
antihistamininiams vaistams.[2] Migdomasis preparatų poveikis priklauso nuo kelių svarbių faktorių – įskaitant specifinį vaisto veikimą, dozę bei paskirtą vartojimo laiką. Pagrindiniai benzodiazepinų migdomieji poveikiai: latentinis miego pradţios sumaţėjimas (laikas iki uţmigimo), padidėjusi akies nejautrumo fazės trukmė, sumaţėjusi „banguoto miego“ fazės trukmė.[2]
2.2 Diazepamo, klonazepamo vartojimo paplitimas
2.2.1 Diazepamo ir klonazepamo vartojimo paplitimas Lietuvoje
Norint nustatyti bei analizuoti vaistų suvartojimą Lietuvoje bei pasaulyje remiamasi ATC/DDD metodologija, kuri yra patvirtinta Pasaulinės Sveikatos Organizacijos(PSO). ATC/DDD sistemos tikslas padėti išaiškinti vaistų kiekio suvartojimą, siekiant pagerinti vaistų vartojimo kokybę. Tai yra viena iš priemonių pristatyti ir palyginti suvartotų vaistų statistiką tarptautiniuose bei kituose lygmenyse. [3]
Benzodiazepino darinių – nervų sistemą veikiančių, pagal ATC kodą N05BA preparatų suvartojimas 2013 metais uţregistruotas didţiausias kiekis – 41,371 DDD/1000 Lietuvos
gyventojų/per dieną lyginant statistinius duomenis nuo 2009 metų. Daugiausiai šios grupės preparato – Lorazepamo – suvartojama 19,88 DDD/1000 gyvent./per dieną remiantis 2013 metų statistika. Tai sudaro 48% visų vartojamų benzodiazepino darinių. Kitų benzodiazepinų darinių suvartojimas yra vidutinis lyginant visoje grupėje esančius preparatus – diazepamas 5,913 DDD/1000 gyvent./per dieną, bromazepamas 6,071 DDD/1000 gyvent./per dieną, Alprazolamas 7,429 DDD/1000 gyvent./per
dieną.[4] Taigi, galima teigti, kad tyrimui pasirinktas preparatas diazepamas yra gan daţnai vartojamas visuomenėje.
1 lentelė. Benzodiazepinų darinių suvartojimas Lietuvoje 2009-2013 metais. [4]
ATC kodas
Pavadinimas DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai N05BA Benzodiazepino dariniai 37,197 36,339 37,099 40,463 41,371
N05BA01 Diazepamas (DDD 10 mg) 5,635 5,947 5,843 6,083 5,913
N05BA02 Chlordiazepoksidas (DDD 30 mg/O; 50 mg/P)
0,159 0,136 0,115 0,115 0,108
N05BA03 Medazepamas (DDD 20 mg) 1,183 0,915 0,895 0,795 0,871
N05BA04 Oksazepamas (DDD 50 mg) 0,440 0,354 0,333 0,332 0,301
N05BA05 Klorazepato kalio druska (DDD 20 mg)
N05BA06 Lorazepamas (DDD 2,5 mg) 19,772 18,768 18,565 19,973 19,88
N05BA08 Bromazepamas (DDD 10 mg) 4,940 4,826 5,207 5,907 6,071
N05BA12 Alprazolamas (DDD 1 mg) 4,478 4,690 5,431 6,485 7,429
Nervų sistemą veikiančių, antiepilepsinių vaistų, pagal ATC kodą N03A preparatų
suvartojimas 2013 metais – 9,226 DDD/1000 gyvent./per dieną. Šios vaistinių preparatų grupės pagal ATC terapinį pogrupį stebimas 1% augimas lyginant 2009-2013 metus.[4] Šios grupės pasirinktas tiriamasis preparatas klonazepamas taip pat benzodiazepinų grupės atstovas, tačiau pagal
farmakologinį poveikį priskiriamas antiepilepsiniams vaistams. Šio preparato suvartojimas 2,385 DDD/1000 gyvent./per dieną registruojamas didţiausias 2009-2013 metų statistikoje antiepilepsinių vaistų grupėje.[4]
2 lentelė. Antiepilepsinių preparatų suvartojimas Lietuvoje 2009-2013 metais. [4]
ATC kodas
Pavadinimas DDD /1000 Lietuvos gyventojų/per dieną 2009 metai 2010 metai 2011 metai 2012 metai 2013 metai N03A Antiepilepsiniai 7,483 7,807 8,198 9,092 9,226 N03AE01 Klonazepamas (DDD 8 mg) 2,612 2,298 2,324 2,417 2,385 N03AF01 Karbamazepinas (DDD 1 g) 1,421 1,186 1,249 1,437 1,395 N03AF02 Okskarbazepinas (DDD 1 g) 1,153 1,356 1,394 1,478 1,419
N03AG01 Valproinė rūgštis (DDD 1,5 g) 1,473 1,623 1,698 1,867 1,964
N03AG06 Tiagabinas (DDD 30 mg) 0,037 0,034 0,030 0,026 0,019
N03AX09 Lamotriginas (DDD 0,3 g) 0,319 0,492 0,537 0,670 0,617
N03AX11 Topiramatas (DDD 0,3 g) 0,271 0,313 0,328 0,360 0,365
N03AX12 Gabapentinas (DDD 1,8 g) 0,197 0,247 0,256 0,278 0,29
N03AX16 Pregabalinas (DDD 0,3 g) * 0,251 0,367 0,517 0,639
N03AX21 Retigabinas (DDD 0,9 g) - - - 0,003 0,005
2.2.2 Diazepamo ir klonazepamo vartojimo paplitimas Baltijos šalyse
Vertinant benzodiazepinų darinių suvartojimą Baltijos šalyse, Lietuvoje fiksuojami didţiausi rezultatai – 40,46 DDD/ 1000 gyvent./per dieną remiantis 2012 metų statistika, tuo tarpu Estijoje bei Latvijoje 13,83 ir 13,40 DDD/1000 gyvent./per dieną. Konkretaus benzodiazepinų darinio diazepamo suvartojimas Lietuvoje 6,08 DDD/ 1000 gyvent./per dieną yra artimas Estijos valstybėje, o Latvijoje stebimas maţiausias diazepamo suvartojimas 3,51 DDD/ 1000 gyvent./per dieną. Bendras
benzodiazepinų suvartojimas 2010-2012 metais santykinai augo visose Baltijos šalyse, Lietuvoje stebimas didţiausias santykinis pokytis 9%.
Diazepamo vartojimas didėjo, tačiau reikšmingų pokyčių atskirose Baltijos šalyse nepastebima. Klonazepamo vartojimo paplitimas Lietuvoje lyginant su kitomis Baltijos šalimis
didţiausias – 2,42 DDD/ 1000 gyvent./per dieną 2012 metais. Abiejų vaistinių preparatų diazepamo ir klonazepamo santykinis pokytis 2010-2012 metais didėjo pagal Baltijos šalių statistinius duomenis vienodai - 4%.[5]
3 lentelė. Benzodiazepinų darinių, diazepamo ir klonazepamo suvartojimas Baltijos šalyse 2010-2012 metais. [5]
ATC kodas
Pavadinimas DDD /1000 gyventojų/per dieną 2010 metai 2011 metai 2012 metai Santykinis pokytis, % N05BA Benzodiazepinų dariniai
Estija 13,10 13,33 13,83 4
Latvija 11,44 12,37 13,40 8
Lietuva 36,34 37,10 40,46 9
Estija 6,10 6,14 6,46 5 Latvija 3,26 3,37 3,51 4 Lietuva 5,95 5,84 6,08 4 N03AE01 Klonazepamas Estija 0,67 0,67 0,74 10 Latvija 1,68 1,68 1,83 -1 Lietuva 2,30 2,32 2,42 4
2.2.3 Benzodiazepinų vartojimo paplitimas bei gamyba kitose uţsienio
šalyse
Vertinamas kitų pasaulio šalių, esančių skirtinguose pasaulio ţemynuose, benzodiazepinų suvartojimas, norint įrodyti jų populiarumą bei svarbą visuomenėje. Remiantis Tarptautine narkotikų kontrolės valdybos statistika, galima teigti, kad didţiausi N05BA psichotropinių medţiagų kiekiai suvartojami Europoje.[6] Slovėnijoje 2010-2012 metais registruojamas didţiausias benzodiazepinų suvartojimas – net 534,01 DDD/ 1000 gyvent./ per dieną lyginant su kitomis pasaulio šalimis. Šiaurės Amerikoje bei Austrailijoje stebimi kiek maţesni rodikliai – Kanadoje 74,60, Jungtinėse Valstijose 37,55 ir Australijoje 47,36 DDD/ 1000 gyvent./ per dieną. Maţiausias psichotropinių medţiagų – benzodiazepinų kiekis suvartojamas Pietų Amerikos, Rytų Azijos bei Afrikos ţemynuose, tai yra Čilėje – 28,34, Tailande 9,82 ir Pietų Afrikoje 6,06 DDD/ 1000 gyvent./ per dieną.[6]
4 lentelė. Benzodiazepino darinių suvartojimas skirtingose pasaulio šalyse 2010-2012 metais. [6] ATC kodas N05BA Pavadinimas Benzodiazepinų dariniai DDD /1000 gyventojų/per dieną 2010-2012 metai Slovėnija 534,01
Šveicarija 128,17 Belgija 162,67 Kanada 74,60 Jungtinės valstijos 37,55 Australija 47,36 Čilė 28,34 Tailandas 9,82 Pietų Afrika 6,06
Remiantis Tarptautinės narkotikų kontrolės valdybos duomenimis, diazepamas vis dar yra populiariausias benzodiazepinų grupės anksiolitikas visame pasaulyje. 2012 metų duomenimis 98 proc. viso pasaulyje pagaminto diazepamo buvo susintetinta Italijoje 17,7t., Kinijoje 16,1t., Brazilijoje 6,9t. ir Jungtinėse Valstijose 1,4t. Tarptautinė diazepamo apyvarta, kuri vidutiniškai kasmet siekė 57,2t., pastaruosius dešimt metų (2003-2012 m.) neţymiai sumaţėjo iki 54,7t. 2012 m. Todėl kartu stebimas sumaţėjęs globalinis diazepamo suvartojimas 2012m. 4,6 mlrd. S-DDD, lyginant su 2010m. 5,7 mlrd. S-DDD. Italija ir Kinija įvardijamos kaip didţiausią šios psichotropinės medţiagos kiekį eksportuojamos valstybės. [6]
Pastaraisiais dešimtmečiais stebima itin sparčiai padidėjusi klonazepamo gamyba nuo 3,9t. 2003m. iki rekordinės 12t. 2011m. Šveicarija pastaruosius dešimtmečius buvo pirmaujanti
klonazepamo gamintoja iki 2010m., tačiau 2011m. intensyviausia klonazepamo sintezė buvo atliekama Italijoje ir 2012m. gamyba siekė 43proc. (4,4t.) pasaulio produkcijos. Pasaulinė klonazepamo apyvarta penkerius metus (2008-2012m.) buvo gan stabili ir vidutiniškai siekė 1,2 mlrd. S-DDD.[6]
Apibendrinant galima teigti, kad benzodiazepinų grupės, diazepamo ir klonazepamo
suvartojimas didėja tiek Lietuvoje, tiek pasaulyje, todėl būtina plėtoti instrumentinius analizės metodus leidţiančius greitai ir tiksliai atlikti šių veikliųjų medţiagų kokybinius ir kiekybinius įvertinimus.
2.3 Benzodiazepinų toksiškumas
2.3.1 Nepageidaujamas benzodiazepinų poveikis
Vartojant benzodiazepinų grupės vaistus daţniausiai uţregistruoti apsinuodijimai, kurie pasireiškė mieguistumo, silpnumo bei ataksijos simptomais. Vidutinio sunkumo ar sunkaus
apsinuodijimo atvejais stebimas paciento svaigulys, apatija, nerišli kalba, nistagmas (nevalingas akių obuolio judėjimas) ir koma. Lėtinis šių psichotropinių preparatų apsinuodijimas daţniausiai pasireiškia ilgai vartojant šiuos vaistus, pasireiškianti tolerancija iššaukia nerimo, nemigos, galvos skausmo, tremoro simptomus, stebima parestezija nutraukus ilgalaikį benzodiazepinų vartojimą.[8] Nors teigiama, kad ši vaistų grupė santykinai yra saugi,[8] gan daţnai stebimi pasireiškiantys nepageidaujami poveikiai, kurie sukelia psichologinę priklausomybę, atminties bei mąstymo pablogėjimą, kitų vaistų bei alkoholio sąveikos sukeliamą sąmoningą norą nuodytis ir ryţtis
saviţudybei. Todėl sutinkama, kad psichotropiniai vaistai (ypač benzodiazepinai ir barbituratai) daţnai vartojami savarankiškam apsinuodijimui.[7]
2.3.2 Apsinuodijimo atvejai Lietuvoje
Atliktame retrospektyviniame tyrime Vilniaus miesto klinikinės ligoninės Vaikų reanimacijos ir intensyviosios terapijos skyriuje buvo tiriami atsitiktinių apsinuodijimų atvejai. Iš viso buvo
hospitalizuoti 1609 vaikai, iš jų atsitiktinai apsinuodiję - 588. Atsitiktinai apsinuodijusių vaikų amţiaus vidurkis buvo 4 m. 7 mėn. ± 4m. 3 mėn. Tyrimo laikotarpiu ţymaus skirtumo tarp hospitalizuotų mergaičių ir berniukų nebuvo pastebėta – mergaičių buvo hospitalizuota 283, berniukų – 305 (pasiskirstymas 1:1). Tačiau buvo pastebėti ryškūs skirtumai tarp hospitalizuotų vaikų amţiaus grupių: daugiausia atsitiktinai apsinuodijusių buvo jaunesnio ikimokyklinio amţiaus (1-2 m.) amţiaus vaikų grupėje, kurią sudarė 275 vaikai (p ≤ 0,05, palyginti su bet kuria kita grupe). Kiek maţiau hospitalizacijų pasitaikė 3–6 metų amţiaus grupėje, kurioje buvo 169 vaikai. Dar maţiau
hospitalizacijų pasitaikė kitose amţiaus grupėse: 7–11metų buvo 52 vaikai, 12–15 metų – 45 vaikai, 0– 12 mėn. – 28 vaikai, 16–17m. – tik 19 vaikų.[10]
Iš visų vaikų, kurie per tyrimo laikotarpį buvo hospitalizuoti į VRITs dėl atsitiktinio
apsinuodijimo, 61 proc. buvo stacionarizuoti dėl apsinuodijimo medikamentais, 18 proc. –įvairiomis cheminėmis medţiagomis, tokiomis kaip skalbinių balikliai, spiritinis jodo tirpalas, stabdţių skystis ir kt., 11 proc. – dėl apsinuodijimo anglies monoksidu. [10] Daţniausia medikamentų, kuriais vaikai atsitiktinai apsinuodija, grupė yra benzodiazepinai. Jie sudarė net 41 proc. visų apsinuodijimų
apie 7 proc. Neuroleptikų (antipsichotikų) grupės vaistai liko trečioje vietoje, taip pat sudarydami beveik 7 proc. visų atsitiktinių apsinuodijimų.[10]
Lietuvoje aiškiai matomas benzodiazepinų grupės preparatų vyravimas, nors uţsienyje vaikai daţniau atsitiktinai apsinuodija kitų grupių preparatais, pvz., vaistais nuo kosulio. Iš to galima spręsti, kad Lietuvoje benzodiazepinų grupės medikamentai yra labai paplitę arba jie pernelyg neatsakingai saugomi ir lengvai prieinami vaikams.[10]
2.3.3 Apsinuodijimo atvejai kitose šalyse
Tyrimo Švedijoje metu buvo analizuojami vaistų perdozavimo atvejai, įvykus saviţudybėms. Duomenys buvo renkami trejus metus Lundo miesto apylinkėje. Nustatyta, kad benzodiazepinai buvo daţniausiai vartojami vaistiniai preparatai, sukelti saviţudybėms, ir net 51% tiriamųjų vartojo šios grupės vaistus. Populiariausi benzodiazepinai buvo diazepamas, flunitrazepamas ir oksazepamas. Toksikologiniai tyrimai po vaistų perdozavimo parodė, kad benzodiazepinai buvo nustatomi
daţniausiai (55% atveju) po analgetikų ir antidepresantų. Flunitrazepamas buvo identifikuotas 39% aukų ir yra laikomas pagrindine mirčių prieţastimi. Tyrėjai pateikė išvadą, kad gydytojai privalo būti atsargesni, skirdami psichotropinių bei analgetinių vaistų dozes.[7]
Epidemiologiniame apsinuodijimo tyrime, atliktame Irano valstybėje, Mazenderano provincijos apylinkėje, buvo tiriamos 1751 bylos, susijusios su atsitiktiniais bei tyčiniais
apsinuodijimais. Išaiškinta, kad dauguma apsinuodijimų 81% patyrė suaugusieji ir didţioji dalis 55,5% tiriamųjų buvo vyrai, tuo tarpu apsinuodijusių moterų – 44,5%. Apsinuodijimo daţnis vaistiniais preparatais siekė 79% visų tiriamųjų. Lyginant apsinuodijimą vaistais, daugiausia aukų 21,5% vartojo anksiolitiką diazepamą, 14,4% apsinuodijimų buvo nustatyta vartojant triciklinius antidepresantus, 14% vartojant nesteroidinius vaistus nuo uţdegimo bei 10,5% tiriamųjų vartojant karbamazepiną. Taigi šiame tyrime vaistai lėmė daugelį apsinuodijimų tiek vaikų, tiek suaugusiųjų atvejų, o diazepamas nustatytas kaip daţniausia prieţastis, susijusi dėl apsinuodjimų.[9]
Apsinuodijimo klonazepamu tyrimas buvo atliekamas bendradarbiaujant su Nacionaliniu Toksikologijos Informacijos Centru (NTIC) Bratislavoje, Slovakijoje. Buvo tiriamos 431 bylos
vertinant pacientus pagal lytį, amţių, prieţastį, apsinuodijimo sunkumą bei suteiktą terapiją. 57% visų pacientų buvo moterys, 43% - vyrai. Daugiausia aukų, 123, buvo tarp 19-35 metų amţiaus ir 117 aukų tarp 36-50 metų amţiaus ir dauguma šių apsinuodijimų buvo nustatyti, kaip bandymai atlikti
saviţudybę (85% ir 90%). Atsitiktiniai apsinuodijimai daţniausiai buvo nustatomi vaikams iki 5 metų (65 tiriamieji) ir pagyvenusiems ţmonėms virš 65 metų amţiaus (4 tiriamieji). Taigi, 69% tiriamų bylų buvo priskiriama saviţudybės atvejams ir 18% atsitiktiniams apsinuodijimams. Daugelio
apsinuodijimo atvejų (68% bylų) pagrindiniai simptomai buvo nuovargis, mieguistumas ir ataksija, kurie pasireiškė lengvomis, trumpalaikėmis bei spontaniškomis formomis. Šiame tyrime buvo nustatytos penkios mirtinos saviţudybės bylos dėl kombinuoto vaistų apsinuodijimo. Daugeliui apsinuodijusių pacientų buvo teikiamas nespecifinis simptominis gydymas, tai yra skrandţio plovimas ir gydymas aktyvuota anglimi ir 12 pacientų buvo skiriamas specifinas priešnuodis – flumazenilas. Atlikus retrospektyvią analizę nustatyta didėjanti klonazepamo vartojimo tendencija, siekiant apsinuodyti ar atlikti saviţudybę. [11]
2.3.4 Ikiklinikinių saugumo tyrimų duomenys
2.3.4.1 Diazepamo tyrimo duomenys
Ūminis toksinis poveikis: tyrimų su gyvūnais metu gauti tokie LD50 duomenys: geriamoji
dozė pelėms – 720 mg/kg, ţiurkėms – 1240 mg/kg.
Poveikis reprodukcinei sistemai: tirtos ţiurkių reprodukcinės savybės (vaisingumas) skiriant labai dideles diazepamo dozes (100 mg/kg), kurios sumaţino nėštumų skaičių ir palikuonių
išgyvenamumą. Tolesni tyrimai su ţiurkėmis parodė, kad diazepamo dozė iki 80 mg neveikia teratogeniškai. [13]
2.3.4.2 Klonazepamo tyrimo duomenys
Poveikis reprodukcinei sistemai: Klonazepamo poveikio dauginimuisi tyrimo metu ţiurkėms kasdien buvo sugirdoma 10 arba 100 mg/kg kūno svorio dozė (10 mg/kg kūno svorio dozė yra 5 kartus didesnė, uţ didţiausią, t. y. 20 mg, ţmogui rekomenduojamą paros dozę epilepsijai gydyti ir 24 kartus didesnė uţ didţiausią, t. y. 4 mg, ţmogui rekomenduojamą paros dozę panikai šalinti). Tiriamųjų gyvūnų grupėje, palyginti su kontroline grupe, maţiau patelių tapo vaikingomis ir buvo didesnis ţindomų jauniklių krintamumas. Klonazepamo kancerogeninio poveikio tyrimų neatlikta.[12]
Išanalizavus pateiktus apsinuodijimų atvejus, atliktus tyrimus galima teigti, kad šia medţiaga yra gan daţnai piktnaudţiaujama, norint svaigintis ar atlikti saviţudybę. Taip pat pastebimi daţni vaikų apsinuodijimai dėl netinkamoje vietoje laikomų preparatų. Šių psichotropinių vaistų grupė daţnai sukelia nepageidaujamus poveikius, kurie sunkina paciento socialinį gyvenimą ir netgi gali kelti pavojų paciento gyvybei. Taip pat remiantis ikiklinikinių tyrimų duomenimis, vartojami didelėmis dozėmis pasirinktieji preparatai neigiamai veikia reprodukcinę sistemą.
2.4 Tiriamosios vaistinės medţiagos
2.4.1 Diazepamo veiklioji medţiaga
1pav. Struktūrinė diazepamo formulė [14]
Molekulinė masė: 284,7g/mol; [14] Molekulinė formulė: C16H13ClN2O; [14]
ATC kodas: N05BA01 [14]
Tarptautinis IUPAC pavadinimas:
7-Chloro-1-metil-5-fenil-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-vienas; [14]
Savybės: Balti ar gelsvi kristaliniai milteliai, tirpūs chloroforme, eteryje, etanolyje (96 %), sunkiai
tirpsta propilenglikolyje bei vandenyje. Lydymosi temperatūra 132º C. [14]
Vaisto formos: Gelis, injekcinis tirpalas, tabletės, geriamoji suspensija. [14]
Farmakokinetika: Diazepamas vartojamas per burną, tiesiąją ţarną ir parenteraliai: į veną (turi būti
skiedţiamas, nes jis yra skausmingas) ir į raumenis. Išgertas diazepamas lengvai ir beveik visiškai (>90%) absorbuojamas iš virškinamojo trakto. Didţiausia koncentracija kraujo plazmoje pasireiškia per 30-90 minučių po suvartojimo. Absorbcija sutrinka bei sulėtėja, kai vaistas vartojamas kartu su riebiu maistu. Diazepamas yra greitai absorbuojamas iš tiesiosios ţarnos, didţiausia koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama per 10-30 minučių. Leidţiant vaistą į raumenį, stebima maţesnė koncentracija kraujo plazmoje, lyginant su per os vartojimu.[16]
Diazepamas ir jo metabolitai labai gerai jungiasi su kraujo plazmos baltymais (>95%). Šio preparato pasiskirstymo tūris, jaunų, sveikų vyrų, vyrauja nuo 0,7 iki 2,6 L/kg. Diazepamas turi dvifazį pusinį eliminacijos laiką, kuris gali būti greito pasiskirstymo ir trukti maţdaug 1 valandą ir ilgo
pasiskirstymo, kur eliminacijos fazė gali vykti nuo 24 iki 48 valandų. Diazepamo ir jo metabolitų ilgesnis pusinis eliminacijos periodas nustatytas naujagimiams, senyviems pacientams ir pacientams, sergantiems kepenų ligomis. Taip pat šis preparatas gali akumuliuotis skiriant daugkartinį gydymą. Tai yra labai gerai lipiduose tirpstantis, greitai į smegenis bei kitus gerai krauju aprūpinamus organus patenkantis vaistas, kuris vėliau pasiskirsto raumeniniame ir riebaliniame audiniuose. Diazepamas ir jo metabolitai lengvai praeina placentos barjerą ir taip pat aptinkami maitinančios motinos piene.[16] Diazepamas yra demetilinamas CYP3A4 ir 2C19 izofermentų pagalba į aktyvų metabolitą N-desmetildiazepamą ir hidroksilinamas CYP3A4 fermentų pagalba į kitą aktyvų temazepamo
metabolitą.[14] CYP2C19 ir CYP3A4 yra įvardijami kaip pagrindiniai izofermentai, kurie dalyvauja diazepamo metabolizme. Atitinkamai 33 ir 40% desmetildiazepamo metabolizme bei 9 ir 86% temazepamo metabolizme.[17] N-Desmetildiazepamas ir temazepamas toliau metabolizuojami į oksazepamą.(2pav.) Temazepamas ir oksazepamas daugiausiai eliminuojami vykstant
gliukuronizacijos reakcijoms.[14]
2.4.2 Klonazepamo veiklioji medţiaga
3pav. Struktūrinė klonazepamo formulė[15]
Molekulinė masė: 315,7 g/mol; [15]
Molekulinė formulė: C15H10ClN3O3; [15] ATC kodas: N03AE01; [15]
Tarptautinis IUPAC pavadinimas:
5-(2-Chlorofenil)-7-nitro-1,3-dihidro-2H-1,4benzodiazepin-2-vienas; [15]
Savybės: Balti ar gelsvi kristaliniai milteliai, tirpūs vandenyje, sunkiai tirpūs acetone, chloroforme,
netirpus benzene, metanolyje, eteryje. Lydymosi temperatūra 237,5º C. [15]
Vaisto formos: burnoje tirpios tabletės, tabletės, . [15]
Veikliosios medţiagos kiekiai vaistinėse formose: 0,125mg, 0,25mg, 0,5mg 1mg, 2mg. [15] Farmakokinetika: Klonazepamas yra greitai ir gerai absorbuojamas iš virškinamojo trakto.
Absoliutus preparato biopasisavinimas - 90%. Viename tyrime, didţiausia koncentracija kraujyje 6,5-13,5ng/ml buvo pasiekta per 1-2 valandas skiriant vienkartines 2mg klonazepamo dozes per os sveikiems suaugusiems. Tačiau kai kuriems asmenims didţiausia koncentracija buvo nustatoma 4-8 valandos po vaisto skyrimo. Atlikus tyrimus nustatyta, kad klonazepamo koncentracija kraujo plazmoje, reikalinga sukelti antikonvulsiniam efektui - 20-80ng/ml. Koncentracija plazmoje šiame intervale buvo nustatoma pacientams, vartojusiems po 6mg klonazepamo 3 kartus per dieną ir 6-13 metų vaikams, vartojusiems 1,5-4mg klonazepamo 3 kartus per dieną. Prieštraukulinio veikimo pradţia paprastai pasireiškia per 20-60 minučių, o veikimo trukmė paprastai yra 6-8 valandos
kūdikiams ir maţiems vaikams ir iki 12 valandų suaugusiems. Kaip ir kiti benzodiazepinai, vaistas pereina hematoencefalinį barjerą ir placentą. [15]
Klonazepamas jungiasi apytiksliai 86% su kraujo plazmos baltymais, o pasiskirstymo tūris lygus 1,5-4,4 L/kg. Sveikų suaugusiųjų pusinis eliminacijos laikotarpis 17-56 valandos, o pacientams su
indukuotais fermentais – 12-46 valandos. Vaikų pusinis eliminacijos laikotarpis svyruoja nuo 22 iki 33 ir naujagimių nuo 22 iki 81 valandų. [18]
Klonazepamas yra metabolizuojamas kepenyse CYP3A4 izofermento pagalba į pagrindinį metabolitą 7-amino-klonazepamą, vykstant 7-nitro redukcijos reakcijai. Toliau vyksta šio metabolito acetilinimo reakcija, susidarant 7-acetamidoklonazepamui.(4pav.) Nei vienas iš šių metabolitų nėra
farmakologiškai aktyvus.[18] Kurie toliau yra gliukuronizuojami ir pašalinami iš organizmo.[19]
4pav. Klonazepamo metabolizmo schema[19]
2.5 Benzodiazepinų junginių įvertinimo metodikos
Daţniausiai naudojami benzodiazepinų ar jų darinių nustatymo metodai yra (ESC) ir Dujų chromatografija/Masių spektrometrija (DC/MS). ESC metodas turi pranašumą, nes gali būti
automatizuota bei vykdoma rutininė vaistų analizė. Analizuojant tiriamąjį objektą nereikalinga biologinių mėginių cheminė derivatizacija, nes šie preparatai tinkamai atsiskiria naudojant skysčių chromatografijos (SC) metodą. Leidţiant galimybėms, analizuoti BZD darinius, pirmenybė teikiama DC/MS arba SC/MS metodams. Šiais metodais galima nustatyti daug maţesnę preparatų
koncentraciją, ypač kai DC/MS identifikuojami neigiami cheminių junginių laipsniai. Tačiau šis analizės būdas reikalauja cheminės derivatizacijos daugeliui benzodiazepinų metabolitų.[7]
2.5.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodas
Chromatografija yra fiziko-cheminis įvairių medţiagų skirstymo metodas, kuris ankstyvame XX a. buvo atrastas rusų-italų botaniko M. S. Cvet‘o. Mokslininko pranešime „On the new form of adsorption phenomena and its application in biochemical analysis“, pristatytame 1903 m. kovo 21 d., reguliariame Varšuvos Visuomenės Gamtos Mokslų susitikime, Cvet‘as pristatė labai detalų, naujai atrastą adsorbcijos – paremtos junginių atskyrimu, fenomeną, kurį jis pavadino chromatografija (Graik. Spalvos registravimas).[20] Bėgant laikui, chromatografija buvo sparčiai vystoma ir kuriama daug šio metodo atmainų. Viena jų bei pati svarbiausia – Efektyvioji skysčių chromatografija. 1970 m.
Profesorius Horvatas Dvidešimt pirmoje Pitsburgo konferencijoje Klivlande pirmą kartą pristatė ir paminėjo Efektyviosios skysčių chromatografijos sąvoką (angl. High-performance liquid
chromatography). Šių dienų modernioje farmacijos industrijoje šis analitinis metodas yra pagrindinis ir neatsiejamas instrumentas kuriant bei identifikuojant įvairias chemines struktūras.[20]
Modernioje ESC analičių skirstymas vis dar paremtas skirtingu analitės giminingumu (afinitetu) stacionariam fazės paviršiui. Analičių skirstymas ESC metode vyksta kolonėlėje, kuri pavadinta šio prietaiso širdimi. Daugelis šio metodo kolonėlių yra nerūdijančio plieno vamzdeliai su maţomis (1-5 μm) dalelių poromis. Kolonėlės turi daugelį porų, kurios pripildytos tam tikra
stacionaria faze, [20] daugelyje atvirkštinės fazės kolonėlių, paviršius chemiškai modifikuotos bei padengtos akytu siliciu.[20] Visuose ESC tyrimų metoduose vyksta teigiama analičių bei stacionarios fazės sąveika, nustatyta, kad kuo didesnis adsorbento paviršiaus plotas, tuo ilgesnis analitės sulaikymo laikas ir santykinai geresnis medţiagos atsiskyrimas. Skiriami du pagrindiniai ESC technikos reţimai - normalių fazių (nejudri fazė labiau polinė nei judri fazė) bei atvirkštinių fazių (judri fazė labiau polinė nei nejudri fazė).[20]
Atvirkštinės fazės efektyvioji skysčių chromatografija yra viena populiariausių
chromatografijos reţimų. Beveik 90% visų maţos molekulinės masės analizių atliekama atvirkštinės fazės būdu. Šioje fazėje daugiausia taikomos dispersinės (hidrofobinės ar Van Der Waals sąveikos) jėgos. Viena iš prieţasčių, kodėl šis reţimas yra toks populiarus, tai yra gebėjimas diskriminuoti panašius tiriamuosius komponentus ir taip palengvinti selektyvumo ir sulaikymo variacijas.[20]
2.5.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos analizės metodikos, tiriant
diazepamo ir klonazepamo junginius bei jų mišinį
Moksliniuose literatūros šaltiniuose pateikiami ESC analizės metodai, kurie taikomi vertinant šių atsikrų cheminių medţiagų identifikavimą bei kiekybę biologiniuose skysčiuose ar vaistiniuose preparatuose, taip pat taikomi tiriant šių psichoaktyvių medţiagų suderinamumą, cheminį stabilumą bei galimas sąveikas su kitomis cheminėmis medţiagomis.
2.5.2.1 ESC analizės metodikos diazepamui:
Kolonėle: n-oktadecilfosfoninė rūgštis modifikuota cirkoniu ir magniu (C18PZM) (150,0 x 4,6
mm x 4,0 μm);
Mobili fazė: Metanolis – vanduo (60:40, v/v), koreguoti fazės iki pH 4,0 pasirinktinai pridedama NaOH arba HCl tirpalai;
Analizės temperatūra: 27 ±2 ºC;
Tekėjimo greitis:1ml/min;
Detektorius: Shimadzu SPD-10A kintamo bangos ilgio UV detektorius. Bangos ilgis, naudojamas aptikimui: 220 arba 254nm.[22]
Kolonėlė: Merck C8 silicio darinio kolonėlė (250,0 x 4,0 mm, x 5,0- μm) su tokia pačia
stacionaria faze uţpildyta prieškolonėle (4,0 x 4,0 mm);
Mobili fazė: susidaro iš 0.5 M Natrio acetato trihidrato buferio, kuriame yra 5 mM
1-heptansulfoninės rūgšties monohidrato natrio druska ir metanolis (30:70, v/v), koreguojama iki pH 6 su ledine acto rūgštimi;
Analizės temperatūra: 50 ºC;
Tekėjimo greitis: 1ml/min;
Detektorius: 1040M diodų-matricos detektorius, λ = 230; 254; 290nm;
Diazepamo sulaikymo trukmė: 3,98min., standartinė kreivė: nuo 0,010 iki 0,080 mg/ml, koreliacijos koeficientas: 1,0. [23]
Kolonėlė: Thermo Scientific ODS C18 HYPERSIL atvirkštinės fazės kolonėlė (250,0 x 4,6 mm, 5-μm).
Analizės temperatūra: 25 ºC;
Tekėjimo greitis: 1ml/min
Detektorius: SPD-10Avp Shimadzu UV-detektorius, λ = 230nm;
Diazepamo sulaikymo trukmė: 8min.[27]
2.5.2.2 ESC analizės metodikos klonazepamui:
Kolonėlė: YMC Slimbore C18 kolonėlė (150,0 x 3,0 mm, 3,0-μm);
Mobili fazė: Susidaro iš vandens, metanolio ir acetonitrilo (40:30:30, v/v/v);
Gradientinis eliuavimas: -
Analizės temperatūra: 25 ºC;
Tekėjimo greitis: 400μl/min;
Detektorius: Waters 996 fosfodiodų matricos detektorius, λ = 254nm;
Klonazepamo sulaikymo trukmė: 4min., standartinė kreivė: nuo 50 iki 200 μg/ml, koreliacijos koeficientas: 0,999. [25]
Kolonėlė: BakerBond C18 kolonėlė (250,0 x 4,6 mm);
Mobili fazė: susidaro iš vandens, metanolio ir acetonitrilo (4:3:3, v/v/v);
Gradientinis eliuavimas: -
Analizės temperatūra: 25 ºC;
Injekcijos kiekis: 20 μl;
Detektorius: Diodų matricos detektorius, λ = 254nm;
Klonazepamo sulaikymo trukmė: 6,9min., standartinė kreivė: nuo 1 iki 50 μg/ml, variacijos koeficientas 1,8 %.[26]
2.5.3 Potenciometrinio titravimo analizės metodas
Potenciometrija yra klasikinė analitinė technika, kuri pradėjo plėtotis dar prieš XX a. Tiriant šiuo metodu yra nustatomas tiriamojo junginio tirpalo potencialas (elektrovaros jėga) tarp dviejų elektrodų. Naujų selektyvių, stabilesnių ir labiau jautresnių elektrodų vystymas nuo 1970 m.
plačiai taikomi daugelyje analizės sričių, įskaitant klinikinę diagnostiką, pramonės procesų valdymą, aplinkos monitoringą, fiziologiją. [28]
Įranga, reikalinga potenciometriniam nustatymui, susidaro iš indikatorinio (matuojančiojo) elektrodo, lyginamojo elektrodo ir potencialo skirtumo matavimo prietaiso.[28] Potenciometrinio titravimo matavimui daţniausiai naudojami sidabro chlorido arba kalomėlio lyginamieji elektrodai. Indikatorinis elektrodas susidaro iš pH-jautrios stiklo membranos, kurios vidus pripildytas 0,1N vandenilio chlorido rūgšties tirpalo. Tirpalas kontaktuoja su vidiniu lyginamuoju elektrodu, kuris sudarytas iš sidabrinės vielos. Sistemos grandinė yra uţdaroma ties antruoju lyginamuoju elektrodu, kuris yra modernios sidabro/sidabro chlorido kombinacijos. Išorinis elektrodas tiesiogiai kontaktuoja su tiriamuoju tirpalu ir nustato potencialų skirtumų kitimus, kuriuos sukelia vandenilio jonų sąveikos su pH-jautraus stiklo membranos paviršiumi.[29]
Potencialas, kuris susidaro ant vidinio ir išorinio elektrodo stiklo paviršiaus yra dėl šių pusiausvyrų:
H+ + Gl- ↔ H+Gl -Išorinė membrana H+ + Gl- ↔ H+Gl -Vidinė membrana
Gl- vietų skaičius ant išorinės membranos didėja su maţėjančiu [H+] kiekiu, todėl potencialas tampa vis neigiamesnis, lyginant su vidiniu paviršiumi, o pH artimesnis šarminei terpei. Nernsto lygtis gali būti supaprastinta ir uţrašyta tokia forma, tinkančia stiklo elektrodui, kai temperatūra yra 20 ºC.
E=Ek – 0,0591pH
Kur E yra išmatuota ekektrovaros jėga voltais standartiniame ţinomo aktyvumo tirpale, Ek –
išmatuotas potencialas voltais tiriamajame tirpale.[29]
Potenciometrinio titravimo metodo matavimai turi privalumų tiriant spalvotus ar šiek tiek drumstus tirpalus, lyginant su primityviais indikatoriniais titravimo metodais. Šio metodo trūkumas, lyginant su kitais instrumentinės analizės būdais, yra santykinai lėtas metodas. Tačiau šiomis dienomis daugelis potenciometrinio titravimo mechanizmų yra automatizuoti ir ekvivalentinis taškas yra
nustatomas automatinių titratorių pagalba, leidţiant titrantą į tiriamąjį tirpalą mikroprocesorių valdymo pagalba.[29]
2.5.4 Potenciometrinio titravimo analizės metodikos, tiriant diazepamo ir
klonazepamo junginius
2.5.4.1 Potenciometrinio titravimo analizės metodikos diazepamui ir klonazepamui
Naujai išvystyti vientiso kontakto jonų-selektyvūs elektrodai (VK-JSE) buvo taikomi
diazepamo ir klonazepamo nustatymui veikliojoje medţiagoje ir vaistinėje formoje. Išoriniai elektrodai sudaryti iš polivinilchlorido (PVC) membranų, padengtų tetrafenil borato (TFB) arba fosfotungestinės rūgšties (FTR) medţiagų jonų kompleksų, kaip elektro aktyvios medţiagos. Gerai apibrėţtas vidinio elektrodo potencialas buvo gautas naudojant Ag/AgCl plokštelę, kontaktuojant su jonų-porų elektro aktyvia membranos faze. Naujieji elektrodai įrodė aukštą selektyvumą, kur selektyvumo koeficientas svyruoja nuo 10-4 iki 10-6 ir aptikimo ribos – nuo 0,1 iki 0,63 μg/ml. Taip pat su naujais išvystytais elektrodais, sėkmingai buvo atliekami vaistinių formų tyrimai. Kalibracinės kreivės linijinės reikšmės buvo gautos tarp 0,29-71,20 ir 0,32-31,57 μg/ml diazepamui ir klonazepamui, pH ribos nuo 4 iki 7.[31]
2.5.4.2 Potenciometrinio titravimo analizės metodikos diazepamui
Šis tyrimas apibūdina protonų ir metalų ligandų stabilumą sąveikaujant su diazepamo jonais. Titravimo tyrimui naudota Eleco-120 modelio priemonė su stiklo kalomėlio elektrodu.
Potenciometrinio titravimo tyrimas atliekamas su Fe(III), Cd(II), Ni(II), Zn(II) metalų kompleksais ir diazepamu. Kalibracija atliekama su buferiniu tirpalu, kurio pH 7 ir 9,2 , temperatūra 28 ºC. Atliekant titravimą buvo sukuriamos skirtingos tiriamojo tirpalo sistemos:
1. Laisvoji rūgštis HNO3 (0,04 M) = A ;
2. Laisvoji rūgštis HNO3 (0,04 M) ir ligandas (20 x 10-4) = A+R ;
3. Laisvoji rūgštis HNO3 (0,04 M), ligandas (20 x 10-4) ir metalo jonas (4 x 10-4 M) = A+R+M
[30] .
Kiekvienas tiriamasis tirpalas buvo sudarytas iš 50ml tūrio, 60% etanolio koncentracijos. Jonų koncentracijos visuose tirpaluose buvo 0,1M.
Potenciometrinio titravimo metodu gauti rezultatai buvo naudojami vertinant disociacijos ir stabilumo konstantas. Nustatyta, kad didėjant metalų jonų koncentracijai, maţėja tiriamojo komplekso stabilumo konstanta.[30]
3. EKSPERIMENTINĖ DALIS
3.1 Tyrimo objektas ir metodai
3.1.1 Tyrimo objektas
Standartiniai diazepamo ir klonazepamo veikliųjų medţiagų tirpalai ir tiriamieji tirpalai, pagaminti iš Lietuvos vaistinėse įsigytų vaistinių preparatų (tablečių) „diazepeks“ ir „clonazepam“.
3.1.2 Efektyvioji skysčių chromatografija
3.1.2.1 Cheminės medţiagos ir tirpikliai
Standartiniams tirpalams gaminti diazepamas (7-Chloro-1-metil-5-fenil-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-vienas) ir klonazepamas
(5-(2-Chlorofenil)-7-nitro-1,3-dihidro-2H-1,4benzodiazepin-2-vienas) (Sigma-Aldrich, JAV), taip pat vaistinės diazepamo „Diazepeks“ 5mg ir klonazepamo „Clonazepam“ 2mg tabletės, organiniai tirpikliai metanolis ir acetonitrilas (Sigma-Aldrich, JAV), fosforo rūgštis (Sigma-(Sigma-Aldrich, JAV) išgrynintas dejonizuotas vanduo ruošiamas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema.
3.1.2.2 Chromatografijos įranga ir sąlygos
Analizei atlikti naudojamas chromatografo „Waters 2695“ atskyrimo modelis su fotodiodų matricos detektoriumi „Waters 996“. Naudota chromatografinė ACE C18 (250 x 4,6 mm) kolonėlė, kurios sorbento dalelių dydis 5μm.
Eksperimento metu optimizuota mobilioji fazė, atsiţvelgiant į tiriamųjų medţiagų sulaikymo laikus, kuri susidaro iš išgryninto vandens, parūgštinto fosforo rūgštimi iki pH 2,5 ir acetonitrilo
(100:58v/v) (taikytas izokratinis eliuavimas), kolonėlės temperatūra - 25 ºC, tekėjimo greitis – 1ml/min, injekcijos tūris - 10μl.
3.1.2.3 Veikliųjų medţiagų standartinių ir tiriamųjų mėginių paruošimas
Standartiniai diazepamo (SD tirpalas) ir klonazepamo (SK tirpalas) tirpalai gaminami iš „Sigma-Aldrich“ įsigytų ESC grynumo medţiagų. Analitinėmis svarstyklėmis sveriamas 1mg (tikslus svoris) diazepamo ir tirpinama 10ml metanolio tirpalo. Tirpalas filtruojamas pro PVDF (0,45μm) filtrą, gauta tirpalo 0,1mg/1ml koncentracija. Analogiškai ruošiamas klonazepamo standartinis 0,1mg/1ml koncentracijos tirpalas.
Tiriamieji tirpalai gaminami iš vaistinių preparatų, kurie parduodami Lietuvos vaistinėse. Tiriamasis diazepamo tirpalas (TD tirpalas) ruoštas iš vaistinio preparato „Diazepeks“ (Grindex) 5mg tablečių. 3 „Diazepeks“ 5mg tabletės perkeliamos į grūstuvę ir smulkinamos iki vienalytės smulkios masės. Analitinėmis svarstyklėmis sveriama 262mg (tikslus svoris) smulkintų miltelių (1 tabletės masė 131mg – 5mg diazepamo). Milteliai perkeliami į 10ml matavimo kolbą ir pilama metanolio iki 10ml ribos. Gauta suspensija paliekama ultragarso vonelėje 15min. Nuosėdos centrifuguojamos ir tirpalas filtruojamas pro PVDF (0,45μm) filtrą. 1ml gauto tirpalo matavimo kolboje praskiedţiamas iki 10ml metanolio tirpalu. Gautas tiriamasis diazepamo metanolinis tirpalas naudojamas chromatografijos analizei.
Tiriamasis klonazepamo tirpalas (TK tirpalas) ruoštas iš vaistinio preparato „Clonazepam“ (Polfa Tarchomin) 2mg tablečių. 6 „Clonazepam“ 2mg tabletės perkeliamos į grūstuvę ir smulkinamos iki vienalytės smulkios masės. Analitinėmis svarstyklėmis sveriama 760mg (tikslus svoris) smulkintų miltelių (1 tabletės masė 152mg – 2mg klonazepamo) Milteliai perkeliami į 10ml matavimo kolbą ir tirpinami metanolyje iki 10ml ribos. Gauta suspensija paliekama ultragarso vonelėje 15min. Nuosėdos centrifuguojamos ir tirpalas filtruojamas pro PVDF (0,45μm) filtrą . 1ml gauto tirpalo matavimo kolboje praskiedţiamas iki 10ml metanolio tirpalu. Gautas tiriamasis klonazepamo metanolinis tirpalas naudojamas tolimesnei chromatografijos analizei.
3.1.3 Potenciometrinis titravimas
3.1.3.1 Cheminės medţiagos ir tirpikliai
Standartiniams tirpalams gaminti diazepamas (7-Chloro-1-metil-5-fenil-1,3-dihidro-2H-1,4-benzodiazepin-2-vienas) ir klonazepamas
(5-(2-Chlorofenil)-7-nitro-1,3-dihidro-2H-1,4benzodiazepin-2-vienas) (Sigma-Aldrich, JAV), acto rūgšties anhidridas (Sigma-Aldrich, JAV), perchlorato rūgštis 70% (Sigma-Aldrich, JAV).
3.1.3.2 Potenciometrinio titravimo įranga ir sąlygos
Analizei atlikti naudojamas „Titration unit TitroLine“ automatinis potenciometras.
Tiriamos medţiagos tirpinamos 50ml acto rūgšties anhidrido reagente, titravimui naudojama 0,1M perchlorato rūgštis. Remiantis Europos farmakopėja, nustatant veikliųjų medţiagų kiekį
mėginyje, 1ml titranto 0,1M perchlorato rūgšties yra ekvivalentiškas 28,47mg diazepamo ir 31,57mg klonazepamo veikliosioms medţiagoms. Atliekant analizę titrantas periodiškai leidţiamas automatiniu titratoriumi 0,1ml tikslumu. Ekvivalentinis taškas nustatomas automatiškai „Titration unit TitroLine“ titratoriaus pagalba.
3.1.3.3 Veikliųjų medţiagų standartinių ir tiriamųjų tirpalų paruošimas
Standartiniai tirpalai gaminami iš „Sigma-Aldrich“ įsigytų ESC grynumo tiriamųjų medţiagų. Analitinėmis svarstyklėmis sveriama 200mg (tikslus svoris) diazepamo ir tirpinama 50ml acto rūgšties anhidrido reagento. Analogiškai sveriama 275mg (tikslus svoris) klonazepamo veikliosios medţiagos miltelių ir tirpinama 50ml acto rūgšties anhidrido. Tirpalai, pagaminti remiantis Europos farmakopėjos metodika[33], paruošti potenciometrinio titravimo tyrimui.
Tiriamieji diazepamo ir klonazepamo mėginiai negaminami dėl reikalingo didelio kiekio tablečių (diazepamo 40 tablečių * 5mg = 200mg, klonazepamo 137,5 tablečių * 2mg = 275mg).
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
4.1 Efektyviosios skysčių chromatografijos validacija diazepamo ir
klonazepamo veikliųjų medţiagų tyrimui
Tiriant veikliųjų medţiagų standartinius tirpalus, tirpalus pagamintus iš tablečių bei jų mišininius, būtina įrodyti pasirinkto analizės metodo tinkamumą, todėl yra atliekama ESC validacija. Remiantis ICH (International Conference on Harmonisation) analitinių procedūrų validacijos
gairėmis[24] buvo pasirinkti ir įvertinti šie paramentrai: specifiškumas, rezultatų glaudumas (pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas), tiesiškumo ribos ir kalibracinė kreivė.
4.1.1 Metodo specifiškumas
Chromatografijos metodams plėtojant junginių atskyrimą, kartu pateikiamas metodo specifiškumas, kuris suteikia galimybę metodui tiksliai nustatyti komponento analitės buvimą tiriamąjame mėginyje.[24] Vienas iš tyrimo metodo specifiškumo kriterijų yra tiriamos analitės smailės akivaizdţiai (1,5 karto) padidėjusi chromatografinė rezoliucija, lyginant su kitais mėginio komponentais.[24] Metodo specifiškumui įrodyti tiriami benzodiazepinų standartiniai tirpalai, vertinami jų UV spektrai ir sulaikymo trukmės.
5 pav. Diazepamo standartinio metanolinio tirpalo chromatograma, tR = 10,700 min ir UV
6 pav. Klonazepamo standartinio metanolinio tirpalo chromatograma, tR = 7,818min ir UV
šviesos absorbcijos spektras
7 pav. Klonazepamo (1-tR = 7,818) ir diazepamo (2-tR = 10,700 min) standartinių metanolinių
8 pav. A) veikliųjų medţiagų SK (1-tR = 7,818) ir SD (2-tR = 10,700 min) tirpalų mišinio
chromatograma, B) tirpiklio (acetonitrilo) chromatograma
Vertinant chromatogramas (5 ir 6 pav.), matyti, kad tiriant mėginių standartinius tirpalus gaunamos analičių smailės, kurių sulaikymo laikai diazepamo tR = 10,700 min ir klonazepamo tR =
7,818 min. Tiriant diazepamo ir klonazepamo standartų mišinį (7pav.), gaunamos tokios pačios sulaikymo trukmės, lyginant su pavienių standartinių mėginių tyrimais. Vertinant veikliųjų medţiagų mišinio (8pav. A chromatograma) ir „Tuščio“ mėginio analizės chromatogramoje (8 pav. B
chromatograma), tai yra tirpiklio acetonitrilo, neuţfiksuojama jokia smailė ties 7 ir 10 minutėmis. Tai įrodo ESC metodo specifiškumą tiriant pasirinktus preparatus.
4.1.2 Rezultatų glaudumas
Rezultatų glaudumas yra nustatomas pakartojamumu, atliekant to pačio mėginio analizę viena analitine metodika bei vienodomis sąlygomis, kuris paprastai yra išreiškiamas procentais ir vadinamas santykiniu standartiniu nuokrypiu (SSN) statistiškai reikšmingiems mėginių skaičiams.[24]
Pakartojamumui nustatyti tą pačią dieną leidţiamos šešios tiriamojo mėginio injekcijos tomis pačiomis sąlygomis (9pav.). Apskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis smailės plotui ir sulaikymo
9 pav. Šešių standartinių diazepamo ir klonazepamo tirpalų injekcijų chromatograma, pakartojamumui nustatyti
Glaudumas taip pat vertinamas tarpiniu preciziškumu,[24] kuris gaunamas analizuojant tiriamąjį mėginį dvi dienas iš eilės, atliekant po šešias injekcijas. Iš atliktų analizės duomenų apskaičiuoti santykiniai standartiniai nuokrypiai smailės plotui ir sulaikymo trukmei. (5 lentelė) Tarpinio preciziškumo ribos < 5%.
5. lentelė. Rezultatų glaudumo įvertinimas Tiriamasis
preparatas
Pakartojamumas Tarpinis preciziškumas SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) SSN smailės plotui (proc.) SSN sulaikymo laikui (proc.) Diazepamas 0,3 0,05 1,0 1,18 Klonazepamas 0,3 0,05 0,6 1,12
Atlikus pakartojamumo tyrimus buvo gautos diazepamo ir klonazepamo sulaikymo trukmės, kurios atitinkamai svyravo 10,697-10,713 min, 7,807-7,818 min (1 priedas) Nustatytas santykinis standartinis nuokrypis abiejų tiriamųjų medţiagų lygus 0,05%, kuris neviršija nustatytos 5% ribos. Tęsiant pakartojamumo tyrimus apskaičiuotos diazepamo ir klonazepamo smailės plotai, kurie atitinkamai svyravo 12314596-12409230 mAU*s, 5396018-5435419 mAU*s. (2 priedas) Santykinis
standartinis nuokrypis tiriamosioms medţiagoms nustatytas 0,3%, kuris taip pat neviršija nustatytos 5% ribos.
Nustatant tarpinį preciziškumą buvo vertinami diazepamo ir klonazepamo dviejų dienų tyrimo rezultatai, kurie atitinkamai svyravo 10,697-10,954min, 7,807-8,008min (3 priedas) Sulaikymo
trukmei ir 12094504-12409230 mAU*s, 5345061-5435419 mAU*s (4 priedas) smailės plotui. Apskaičiuotas sulaikymo trukmės santykinis standartinis nuokrypis diazepamui ir klonazepamui 1,18% ir 1,12% bei smailės plotui 1,0 ir 0,6%. Gauti tarpinio preciziškumo rezultatai svyruoja didesniuose intervaluose, lyginant su pakartojamumo duomenimis, tačiau SSN reikšmės neviršija nustatytos 5% ribos.(5 lentelė)
4.1.3 Tiesiškumas
Tiesiškumas yra metodo gebėjimas gauti tiesiogiai proporcingus rezultatus analitės kiekybinei koncentracijai tiriamajame mėginyje.[24] Remiantis ICH gairėmis, būtina pateikti maţiausiai penkis koncentracijos lygius, kartu su nurodomu minimaliu intervalu.[24] Tiesiškumas vertinamas
kalibravimo kreivės metodu. (10 ir 11 pav.)
11 pav. Klonazepamo kalibracinė kreivė, y=2,29*107x - 7,26*103
6 lentelė. Kalibracinių kreivių charakteristikos Tiriamoji medţiaga Sulaikymo trukmė tR,min Koreliacijos koeficientas R2 Regresijos lygtis Diazepamas 10,700 0,998 y=2,51*107x - 5,17*104 Klonazepamas 7,818 0,992 y=2,29*107x - 7,26*103
Diazepamo ir klonazepamo kalibraciniai grafikai nubrėţti nuo 0,1 iki 0,0015625mg/ml konncentracijos. Nustatyti abiejų grafikų išbarstymo koeficientai, atitinkamai 0,998 ir 0,992,(6
lentelė), kurie atitinka keliamus reikalavimus >0,99.[24] Tai įrodo analitinio metodo tiesiškumą tiriant pasirinktus preparatus.
4.2 Efektyviosios skysčių chromatografijos taikymas diazepamo ir
klonazepamo vaistinės formos bei jų mišinio identifikavimui
Atlikus ESC metodikos validaciją, tiriant pasirinktų medţiagų standartinius tirpalus, galima identifikuoti diazepamo ir klonazepamo veikliąsias medţiagas vaistinėje formoje (tabletėje) bei jų mišinyje. Atlikus vaistų tiriamųjų tirpalų analizę, buvo vertinamos ir lyginamos sulaikymo trukmės bei UV šviesos absorbcijos spektrai.
Pateikiama tiriamojo diazepamo (TD) tirpalo chromatograma bei UV spektras (12 pav.), sudaryto iš vaistinio preparato „diazepeks“, kurio sulaikymo trukmė – 10,713 min, yra artima tiriamosios medţiagos standartinio tirpalo (10,700 min). Gautas vaistinio preparato UV absorbcijos
spektras yra identiškas, lyginant su standartinio diazepamo tyrimo rezultatais. Šviesos bangų absorbcijos maksimumas nustatytas esant 230nm bangos ilgiui.
12 pav. (TD) tirpalo chromatograma (tR = 10,713) ir UV šviesos absorbcijos spektras
Tiriamosios klonazepamo medţiagos, išskirtos iš vaistinio preparato „clonazepam“,
chromatograma ir UV spektras pateikiami (13 pav.). Nustatyta sulaikymo trukmė lygi 7,810 min, tuo tarpu šios medţiagos standartinio tirpalo – 7,818 min, todėl galima teigti, kad tiriamosios medţiagos analitinės sulaikymo trukmė yra artima standartui. UV šviesos absorbcijos spektras, lyginant su standartinio klonazepamo tirpalo rezultatais, yra identiški. Šviesos bangų absorbcijos maksimumas nustatytas esant 309nm bangos ilgiui.
13 pav. Tiriamojo klonazepamo (TK) tirpalo chromatograma (tR = 7,810) ir UV šviesos
absorbcijos spektras
Atlikus pavienių tiriamųjų medţiagų analizes bei įvertinus teigiamus rezultatus, galima tirti vaistinių medţiagų mišinį pagal validuotą ESC metodiką. Pagrindiniai vertinimo kriterijai –
absorbcijos spektras ir analičių sulaikymo trukmės laikas, pagal kuriuos galima teigti arba neigti tiriamosios medţiagos buvimą mėginyje. Identifikuojant tiriamąsias medţiagas mišinyje gauti artimi sulaikymo laikai, lyginant su pavienių tiriamųjų medţiagų rezultatais (14 pav.).
14 pav. Klonazepamo (1 - tR = 7,808) ir diazepamo (2 - tR = 10,715) tiriamųjų tirpalų mišinio
Siekiant įrodyti metodo tinkamumą ir atrankumą tiriamosioms medţiagoms, taip pat buvo analizuojamos pagalbinės medţiagos (PM) (15 pav. C chromatograma), esančios „diazepeks“ ir „clonazepam“ tabletėse bei eksperimentui naudotas tirpiklis acetonitrilas (15 pav. B chromatograma). Analizuojant chromatogramas matyti, kad ties 7 ir 10 minutėmis nėra jokių smailių, todėl galima teigti, kad pagalbinės vaistinės formos medţiagos ir tirpiklis nesukelia matricos efekto ir netrukdo tiriamųjų medţiagų analizei.
15 pav. A) TK (1-tR = 7,818) ir TD (2-tR = 10,700 min) tirpalų mišinio chromatograma, B)
tirpiklio (acetonitrilo) chromatograma
4.3 Jungtinių Valstijų farmakopėjos ESC analizės metodo taikymas
Tiriant junginius bei jų mišinius Jungtinių Valstijų farmakopėjoje nurodyta ESC metodika[32] nebuvo gaunami tikslūs ir pasikartojantys analizės rezultatai, todėl metodika buvo koreguota
atsiţvelgiant į tiriamųjų medţiagų sulaikymo laikus. Optimizuota mobilioji fazė susidaro iš išgryninto vandens, parūgštinto fosforo rūgštimi iki pH 2,5 ir acetonitrilo (100:58v/v) (taikytas izokratinis eliuavimas), kolonėlės temperatūra - 25 ºC, tekėjimo greitis – 1ml/min, injekcijos tūris - 10μl. ESC analizės metodikai buvo atlikta validacija, kuri, remiantis ICH gairėmis, [24] atitiko visus keliamus reikalavimus.
4.4 Diazepamo ir klonazepamo analizė potenciometrinio titravimo metodu
Remiantis Europos farmakopėjos metodikomis[33], pagaminti bei tiriami diazepamo ir klonazepamo standartinių tirpalų mėginiai. Siekiant patvirtinti potenciometrinio titravimo tinkamumą ir tikslumą nustatomi veikliųjų medţiagų kiekiai mėginiuose. Remiantis gautais tyrimo duomenimis brėţiama titravimo kreivė (16, 17 pav.), kur ekvivalentiniai taškai buvo nustatyti „Titration unit TitroLine“ automatizuotu aparatu.
16 pav. Diazepamo standartinio tirpalo potenciometrinio titravimo kreivė
Atliekant diazepamo tiriamojo tirpalo analizę titrantas leidţiamas 0,1ml tikslumu ir stebimas pH reikšmės kitimas. Ekvivalentinis šuolis stebimas tarp pH 6 ir pH 8, nustatytas ekvivalentinis taškas – 6,9ml. Remiantis gautais duomenimis, (16 pav.) apskaičiuojamas veikliosios medţiagos kiekis standartiniame tirpale. 1ml 0,1M perchlorato rūgšties atitinka 28,47mg diazepamo medţiagos. Nustatytas ekvivalentinis taškas –6,9ml, kuris atitinka 196,44mg tiriamosios medţiagos. Metodo tikslumas 98,22%, tai yra p<0,05.
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH Tūris, ml
Diazepamo titravimo kreivė
17 pav. Klonazepamo standartinio tirpalo potenciometrinio titravimo kreivė
Tiriant klonazepamo standartinį tirpalą titrantas leidţiamas 0,1ml tikslumu ir stebimas pH reikšmės kitimas. Ekvivalentinis šuolis fiksuojamas nuo pH 8 iki pH 9. Remiantis duomenimis (17 pav.) apskaičiuojamas klonazepamo kiekis standartiniame mėginyje. 1ml 0,1M perchlorato rūgšties atitinka 31,57mg klonazepamo medţiagos. Nustatytas ekvivalentinis taškas – 8,7ml, kuris atitinka 274,66mg tiriamosios medţiagos. Metodo tikslumas 99,87%, tai yra p<0,05.
4.5 Potenciometrinio titravimo taikymas analizuojant tiriamųjų medţiagų
vaistines formas
Potenciometrinio titravimo analizės metodas pasirinktoms veikliosioms medţiagoms,
esančioms tabletėse netaikomas, nes reikalingas didelis tablečių kiekis (diazepamo 40 ir klonazepamo 137,5 tablečių). Gaminant tiriamuosius tirpalus iš tablečių, dėl didelio pagalbinių medţiagų kiekio susidarytų drumsti tirpalai (suspensijos), kurie neleistų tiksliai nustatyti veikliosios medţiagos kiekį tiriamajame tirpale. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH Tūris, ml Ekvivalentinis taškas
4.6 Europos farmakopėjos potenciometrinio titravimo analizės metodo
taikymas
Tiriant standartinius medţiagų tirpalus, taikoma Europos farmakopėjoje[33] nurodyta potenciometrinio titravimo metodika. Nustatyti veikliųjų medţiagų kiekiai (diazepamo 196,44mg 98,22% ir klonazepamo 274.66mg 99.87%) bei ekvivalentiniai taškai (diazepamo 6,9ml ir
klonazepamo 8,7ml) tiriamuosiuose mėginiuose. Europos farmakopėjoje nustatyti ekvivalentiniai taškai: diazepamo 7,02ml ir klonazepamo 8,71ml, kurie atitinkamai skiriasi 0,12 ir 0,01ml, lyginant su standartinių mėginių rezultatais.
