(1)DARBAS ATLIKTAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE) PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Čiobrelių genties (Thymus spp.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvu

(1)

DARBAS ATLIKTAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE) PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Čiobrelių genties (Thymus spp.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(2)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE, INSTITUTE)

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)

vardas, pavardė) Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(3)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

IEVA LIUTKUTĖ

ČIOBRELIŲ GENTIES (Thymus spp.) AUGALŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas:

Doc. dr. Raimondas Benetis

KAUNAS, 2020

(4)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė, parašas Data

ČIOBRELIŲ GENTIES (Thymus spp.) AUGALŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Darbą atliko

Doc. dr. Raimondas Benetis, parašas Magistrantė

Data Ieva Liutkutė, parašas

Data Recenzentas

Vardas, pavardė, parašas Data

KAUNAS, 2020

(5)

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1. Thymus spp. bendroji charakteristika ... 10

1.2. Thymus spp. morfologija ir paplitimas ... 10

1.3. Thymus spp. augalinių žaliavų fitocheminė sudėtis ... 12

1.4. Thymus spp. panaudojimas ... 12

1.5. Thymus spp. fitocheminės sudėties ir farmakologinio poveikio ryšys ... 13

1.6. Oksidacinis stresas ... 14

1.7. Antioksidantai ... 14

1.8. Fenoliniai junginiai ... 15

1.9. Fenolinių junginių nustatymo metodai ... 16

1.10. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ... 17

2. TYRIMO METODIKA ... 18

2.1. Tyrimo objektas ... 18

2.2. Medžiagos ir reagentai ... 19

2.3. Naudota aparatūra ... 19

2.4. Tyrimų metodai ... 19

2.4.1. Thymus spp. žaliavų ekstraktų paruošimas ... 19

2.4.2. Reagentų paruošimas ... 20

2.5. Thymus spp. žaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 21

2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 21

2.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas ... 22

2.5.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas ... 23

2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe²⁺ jonų sujungimo metodu ... 23

2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų sujungimo metodu... ... .24

(6)

2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS˙⁺ radikalų surišimo metodu ... 24

2.5.7. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu ... 25

2.6. Duomenų analizė ... 26

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 27

3.1.1. Ekstrahento poliškumo įvertinimas ... 27

3.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės nustatymas ... 28

3.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros nustatymas ... 29

3.1.4. Ekstrahento ir žaliavos santykio parinkimas ... 29

3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas Thymus spp. žaliavose ... 30

3.3. Bendro fenolio rūgščių kiekio nustatymas Thymus spp. žaliavose ... 34

3.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas Thymus spp. žaliavose ... 37

3.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Fe²⁺ jonų sujungimo metodu Thymus spp. ekstraktuose . 40 3.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu Thymus spp. ekstraktuose ... 44

3.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS surišimo metodu Thymus spp. ekstraktuose ... 47

3.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas FRAP redukciniu metodu Thymus spp. ekstraktuose... 50

3.9. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro flavonoidų, fenolinių junginių ir fenolio rūgščių kiekio Thymus spp. žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo ... 54

4. IŠVADOS ... 55

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 56

6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 57

(7)

SANTRAUKA

I. Liutkutės magistro baigiamasis darbas „Čiobrelių genties (Thymus spp.) augalų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas“. Mokslinis vadovas doc. dr. R. Benetis; Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Farmacijos fakulteto Vaistų chemijos katedra. Kaunas, 2020.

Darbo tikslas: Ištirti iš įvairių Lietuvos regionų surinktų ir kultūroje auginamų čiobrelių genties (Thymus spp.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį bei jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uždaviniai: 1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš paprastųjų čiobrelių (Thymus serpyllum L.) augalinių žaliavų. 2. Įvertinti bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose T. serpyllum L. žaliavose bei įvertinti jų įvairavimą skirtingose augalo morfologinėse dalyse. 3. Nustatyti bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį kultūroje auginamų Thymus spp. žaliavose ir šių rodiklių pokyčius skirtingų fenologinių tarpsnių kaitoje. 4. Įvertinti čiobrelių genties (Thymus spp.) ekstraktų antiradikalinį aktyvumą DPPH ir ABTS metodais bei nustatyti redukcinį jų aktyvumą taikant FRAP metodą. 5. Taikant fotometrinį dvivalentės geležies jonų sujungimo metodą, įvertinti čiobrelių genties (Thymus spp.) augalinių ekstraktų chelatines savybes. 6. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekių čiobrelių genties (Thymus spp.) augalinėse žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti naudotos kultūroje auginamų Thymus spp. antžeminės dalys, surinktos skirtingais augalo vegetacijos laikotarpiais Šiaulių universiteto botanikos sode bei Lietuvos augavietėse surinkta Thymus spp. žaliava (lapai, žiedai, stiebai). Ekstrakcijos metodas - ekstrakcija ultragarsu 30 min., 50 ^oC temperatūroje, ekstrahentas – 70 % (V/V) etanolis. Bendrajam fenolinių junginių kiekiui nustatyti pritaikytas Folin-Ciocalteu metodas, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (GRE) (mg/g). Bendrajam fenolio rūgščių kiekiui nustatyti naudotas Arnow reagentas, gauti duomenys išreikšti chlorogeno rūgštimi (mg/g). Bendrajam flavonoidų kiekiui nustatyti pritaikytas metodas naudojant aliuminio chloridą (AlCl3) ir metenaminą, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentais (RE) (mg/g).

Antioksidacinis aktyvumas vertintas pritaikant spektrofotometrinius FIC, DPPH, ABTS ir FRAP metodus.

Rezultatai ir išvados: Atlikus tyrimus nustatyta, kad bendrasis fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekiai įvairavo priklausomai nuo augalo morfologinės dalies ir vegetacijos tarpsnio.

Didžiausi kiekiai šių biologiškai aktyvių medžiagų nustatyti Thymus spp. lapuose bei antžeminėse dalyse iš masinio augimo ir butonizacijos periodais surinktos žaliavos. Stipriausiu antioksidaciniu aktyvumu tirtose sistemose (FIC, DPPH, ABTS ir FRAP) pasižymėjo masinio augimo periodu surinktų žaliavų ekstraktai. Iš atskirų morfologinių dalių, stipriausias antiradikalinis, chelacinis ir redukcinis aktyvumai nustatyti T. serpyllum L. lapų ekstraktuose. Gautų rezultatų statistinė analizė parodė statistiškai reikšmingus (p < 0,05) koreliacinius ryšius tarp bendrojo fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių Thymus spp. žaliavose ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

(8)

SUMMARY

The Master Thesis of I. Liutkutė “The evaluation of phenolic compounds and antioxidant activity of the genus Thymus plants”. Scientific advisor doc. dr. R. Benetis; Lithuanian University of Health Sciences, The Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry. Kaunas, 2020.

The aim: To analyze total phenolic compound, phenolic acid and flavonoid content in dried plant material of Thymus spp. plants cultivated and growing naturally in different regions of Lithuania and determine antioxidant activity of their extracts.

Objectives: 1. To choose extraction conditions of phenolic compounds from Thymus serpyllum L. plant material. 2. To assess phenolic compound, phenolic acid and flavonoid contents in naturally growing T. serpyllum L. and determine their variation in different morphological parts of the plant. 3. To determine phenolic compound, phenolic acid and flavonoid contents in cultivated Thymus spp. plant material and their variation at different growth stages. 4. To evaluate the radical scavenging activity of Thymus spp. plant extracts using DPPH and ABTS methods and their reducing power applying FRAP method. 5. To evaluate chelating activity of Thymus spp. plant extracts by using photometric ferrous ion chelating activity (FIC) method. 6. To determine correlation between phenolic compound, phenolic acid and flavonoid contents in Thymus spp. plant material and the antioxidant activity of their extracts.

Methods and materials: The aerial parts of Thymus spp. were collected from cultivated plants in the Botanical Garden of Šiauliai University at different stages of growth, different parts of plant (leaves, flowers and stems) were collected from naturally growing plants in various regions of Lithuania.

Extraction method – ultrasonic extraction for 30 min. at 50 ^oC temperature, solvent – 70 % (V/V) ethanol.

Folin-Ciocalteu method was applied for evaluation the of total phenolic content, results were expressed as gallic acid equivalents (GAE) (mg/g). The Arnow reagent was used for the evaluation of phenolic acid content, results were expressed as chlorogenic acid (mg/g). For the evaluation of total flavonoid content, method using AlCl3 and methenamine was applied. Results were expressed as rutin equivalents (RE) (mg/g). Antioxidant activity was evaluated by applying FIC, DPPH, ABTS and FRAP methods.

Results and conclusions: The research identified, that total phenolic, flavonoid and phenolic acid contents are dependent on the morphological part of the plant and the stage of plant growth. The highest amounts of these contents were identified in the Thymus spp. extracts of dried leaves and extracts of aerial parts in mass growing and budding stages. The highest antioxidant activity using all methods was determined in Thymus spp. herb extracts in mass growth stage. Among different morphological parts of Thymus spp., leaves showed the most potent reducing power, radical scavenging and chelating activity.

The statistical analysis of the results demonstrated significant (p < 0,05) correlation between total phenolic, phenolic acid and flavonoid contents and the antioxidant activity of Thymus spp. plant extracts.

(9)

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono rūgštis) BAM – biologiškai aktyvi medžiaga

DNR - deoksiribonukleorūgšis DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas

FIC – geležies (II) jonų sujungimo metodas (angl. ferrous ion chelating assay)

FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl. ferric reducing antioxidant power) GRE – galo rūgšties ekvivalentai

RE – rutino ekvivalentai TE – trolokso ekvivalentai TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas UV – ultravioletinė spinduliuotė V/V – tūrio procentai

(10)

ĮVADAS

Oksidacinis stresas – procesas, kurio metu dėl padidėjusios laisvųjų radikalų sintezės organizme ar sutrikusio jų neutralizavimo, sukeliami audinių ir ląstelių pažeidimai [30]. Laisvieji radikalai yra nestabilios molekulės, turinčios laisvą elektroną ir gebančios prijungti juos iš kitų molekulių. Organizme šias nestabilias molekules nukenksmina antioksidantai [32] Kai organizmas nebepajėgia kovoti su padidėjusia laisvųjų radikalų generacija, pažeidžiami įvairūs svarbūs ląstelės komponentai. Laisvųjų radikalų padidėjimas gali lemti senėjimo procesus, didina riziką atsirasti aterosklerozei, širdies ir kraujagyslių sistemos, neurodegeneracinėms ligoms [30,31,33,34] bei turi įtakos navikų išsivystymui [33].

Augalų žaliavose randami polifenoliai gali būti naudojami kaip natūralus antioksidantų šaltinis (8,10). Moksliškai įrodyta, kad polifenoliai sulėtina reaktyviųjų dalelių oksidacinį skilimą ir gali būti naudojami įvairių ligų gydymui ir profilaktikai [10].

Čiobreliai tai nedideli aromatiniai žoliniai augalai ar puskrūmiai [8,10,11], priklausantys Thymus genčiai, notrelinių (Lamiaceae) šeimai [1,2,3]. Čiobrelių fitopreparatai plačiai vartojami peršalimo, gripo gydymui, palengvinti atsikosėjimą, sergant bronchitu [1,2,8], taip pat vertinami dėl stiprių antioksidacinių savybių [1,2,5,8]. Thymus spp. augalinėse žaliavose randama polifenolinių junginių ir eterinių aliejų.

Pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai yra timolis ir karvakrolis, kurie yra svarbūs antibakteriniam poveikiui [28]. Vienas pagrindinių fenolinių junginių, aptinkamų Thymus spp. yra rozmarino rūgštis [5], kuriai priskiriamos priešuždegiminės, antioksidacinės ir antihipertenzinės savybės [51]. Be fenolio rūgščių čiobrelių genties augalai taip pat kaupia flavonoidus, saponinus, taninus [24]. Teigiama, jog fenoliniai junginiai atsakingi už čiobrelių ekstraktų antioksidacinį poveikį [25,29].

Darbo naujumas: Pirmą kartą Lietuvoje atlikti tyrimai su atskiromis Thymus serpyllum augalų morfologinėmis dalimis (lapais, žiedais, stiebais), surinktose skirtingose gamtinėse cenopopuliacijose.

Ištirti kultūroje auginamų 8 čiobrelių genties rūšių antžeminių dalių fitocheminiai rodikliai įvairiais augalų vegetacijos laikotarpiais bei skirtingais auginimo metais. Tyrimo metu įvykdytas ekstrakcijos sąlygų parinkimas, nustatytas bendrasis fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekis bei įvertintas ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Gauti duomenys padės suprasti kokiu augimo periodu surinkta žaliava yra naudingiausia ir kurios augalo antžeminės dalys yra vertingiausios, kad būtų išgaunamas maksimalus biologiškai aktyvių medžiagų kiekis.

(11)

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš paprastųjų čiobrelių (Thymus serpyllum, L.) augalinių žaliavų.

2. Įvertinti bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose T. serpyllum L. žaliavose bei įvertinti jų įvairavimą skirtingose augalo morfologinėse dalyse.

3. Nustatyti bendrąjį fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekį kultūroje auginamų Thymus spp. augalinėse žaliavose ir šių rodiklių pokyčius skirtingų fenologinių tarpsnių kaitoje.

4. Įvertinti čiobrelių genties (Thymus spp.) augalinių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą DPPH ir ABTS metodais bei nustatyti redukcinį jų aktyvumą taikant FRAP metodą.

5. Taikant fotometrinį dvivalentės geležies jonų sujungimo (FIC) metodą, įvertinti čiobrelių genties (Thymus spp.) augalinių ekstraktų chelatines savybes.

6. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp bendrojo fenolinių junginių, fenolio rūgščių ir flavonoidų kiekių čiobrelių genties (Thymus spp.) augalinėse žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.

(12)

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Thymus spp. bendroji charakteristika

Notrelinių šeimai priklauso virš 200 genčių ir daugiau kaip 7000 augalų rūšių [1]. Viena iš populiariausių genčių, priklausančių notrelinių šeimai yra čiobreliai [1,2,3]. Šiai genčiai priklauso daugiau kaip 200 augalų rūšių [3,4,5,6]. Jie natūraliai auga Europoje [8], ypač Viduržemio regione [3], šiaurinėje Afrikoje ir Azijoje [3,8]. Lietuvoje natūraliai auga 3 čiobrelių rūšys – Thymus pulegioides L., T. serpyllum L., bei jų tarprūšinis hibridas T. x oblongifolius Opiz [7]. Čiobrelių genties rūšys apibūdinamos kaip eterinį aliejų kaupiantys daugiamečiai vaistiniai, aromatiniai ir prieskoniniai augalai [9].

1.2. Thymus spp. morfologija ir paplitimas

Čiobrelių genties augalai – neaukšti aromatingi žoliniai augalai ar puskrūmiai, sumedėjusiais, šliaužiančiais arba kylančiais stiebais, dažniausiai augantys lengvoje dirvoje, gausioje kalcio junginių (8,10]. Žiediniai stiebai žoliniai, statūs arba kylantys, su smulkiais, įvairios formos lygiakraščiais lapais.

Žiedynai galvutės arba varpos pavidalo, taurelė varpo ar vamzdžio formos, apaugusi plaukeliais [11].

Toliau aprašomos šiame darbe tiriamos čiobrelių genties rūšys.

T. serpyllum L. – paprastasis čiobrelis - daugiametis puskrūmis [6,12], 10-30 cm ilgio [11], stiebai apskriti [11], šliaužiantys, apaugę plaukeliais [12], sumedėję prie pagrindo [6,12]. Žiedinės šakos kylančios arba stačios, 2-13 cm aukščio, apskritos arba nežymiai keturbriaunės. Lapai lancetiškos, linijinės ar elipsės formos, turi trumpus lapkočius [11]. Viršutinė ir apatinė lapo pusės be plaukelių [6], plaukuotas tik pagrindas [11]. Žiedynai išsidėstę stiebų viršūnėse [6], taurelė varpo formos, tamsiai purpurinės spalvos, išorinėje pusėje apaugusi plaukeliais. Vainikėlis didesnis už taurelę, rausvai violetinės, rausvos ar baltos spalvos [11]. Žydi nuo gegužės-birželio [12] iki rugsėjo [6]. Auga beveik visoje Europoje [6,12], Sibire [11]. Randamas sausose, akmeningose žemėse, smėlingose pievose [6], kopose [12], pakelėse [12], sausuose pušynuose [13], viržynuose, šlaituose [11].

T. pulegioides L. – keturbriaunis čiobrelis - daugiametis augalas [12], užaugantis iki 10-25 cm aukščio [11]. Stiebas besidriekiantis [12] arba kylantis, pagrindas sumedėjęs [12], viršutinė dalis keturbriaunė. Šoninės šakos stačios arba kylančios, keturbriaunės, dvi priešingos kraštinės platesnės ir plaukuotos, kitos dvi siauresnės ir be plaukelių. Lapai trumpakočiai, kiaušinio-elipsės formos ir plaukuotu

(13)

pagrindu. Žiedynai galvutės ar varpos pavidalo, susitelkę žiedinių šakelių viršūnėse. Taurelė plaukuota, rausvai violetinės - tamsiai purpurinės spalvos, vainikėlis šviesiai purpurinis, kartais baltas, pilkas. Žydi birželio-rugsėjo mėnesiais [11]. Randamas beveik visoje Europoje [12,14], Azijoje. Auga miškuose ir jų pakraščiuose, krūmynuose [12], sausose ganyklose ir pievose [12,13], kalvose [11].

T. x oblongifolius Opiz – tarprūšinis T. serpyllum ir T. pulegioides hibridas, augantis kartu su motininėmis rūšimis ar netoli jų [7,13]. Augalas randamas Lietuvoje, pietų Suomijoje. Jis pasižymi panašiomis morfologinėmis savybėmis į motinines rūšis. Į T. serpyllum šis tarprūšinis hibridas panašus savo plaukuotu stiebu, smulkiais lapais, taip pat trumpais viršutiniais žiedo taurelės danteliais. T.

pulegioides ir T. x oblongifolius yra panašūs tuo, jog abiejų stiebai yra keturbriauniai [11].

T. praecox Opiz. ssp. arcticus (Durand) Jalas – yra žemas krūmelis, dažniausiai ne aukštesnis nei 7 cm, turi šliaužiančias šakas, žiediniai stiebai išsidėstę eilėmis ant šakelių. Stiebai keturbriauniai, dvejose priešingose pusėse apaugę įvairaus ilgio plaukeliais, likusios dvi pusės mažiau plaukuotos arba visai plikos. Lapai turi silpną kvapą, yra sferiniai, lancetiški ar elipsės formos, apaugę plaukeliais arba ne, turi trumpą lapkotį. Žiedynas dažniausiai galvutės pavidalo, stipraus kvapo [15], žiedai rausvai violetiniai [16]. Augalas kilęs iš Grenlandijos ir Skandinavijos, taip pat auga Pietų ir Šiaurės-Vakarų Ispanijoje [16], Didžiojoje Britanijoje [16]. Randamas sausose pievose, viržynuose, kopose, šlaituose tarp akmenų [15].

T. sibthorpii Benth. – daugiametis [12,17] nedidelis krūmas [17]. Stiebai 10-30 cm aukščio, statūs ar kylantys, dažniausiai išsišakoję, padengti plaukeliais ir sumedėję prie pagrindo. Žiedai tamsiai rožinės – violetinės spalvos, lapai turi trumpus lapkočius, lapalakštis lancetiškos formos. Žydi balandžio – gegužės mėnesiais. Auga Šiaurės Afrikoje, Pietų Europoje, Balkanuose [12], pietvakarių Azijoje [17].

T. austriacus Bernh. ex Rchb. – daugiamečiai augalai, silpnais, plaukeliais apaugusiais pilkais stiebais. Žiedynas išsidėstęs stiebo viršūnėje, yra gausiai šakotas, 10-12 cm ilgio. Auga rytų Karpatuose, randamas akmeninguose šlaituose [12].

T. longicaulis C Presl. yra daugiametis žolinis augalas [1,18,19] ar visžalis puskrūmis [1,19].

Pagrindinės šakelės ilgos ir šliaužiančios, retai užsibaigiančios žiedynais. Žiediniai stiebai 4-10 cm ilgio, plaukuoti priešingose pusėse, žiedai išsidėstę eilėmis. Lapai elipsės, lanceto formos, prie pagrindo apaugę plaukeliais, paviršius lygus, be plaukelių. Žiedynai dažniausiai galvutės pavidalo, taurelė žaliai rausvos spalvos, viršutiniai danteliai yra apaugę plaukeliais, o apatiniai lygūs arba su nedaug plaukelių. Vainikėlis šviesiai violetinės – violetinės spalvos. Žydi nuo balandžio iki birželio-liepos mėnesio. Randamas rytų Viduržemio regione [1,18], Sicilijoje, pietinėje Austrijoje, Turkijoje, pietryčių Prancūzijoje. Auga miškingų vietovių pakraščiuose, miško proskynose, ganyklose, akmeningose pievose [18].

T. x citriodorus (Pers.) Schreb - citrininis čiobrelis – daugiametis visžalis, „kilimą“ formuojantis puskrūmis, turintis citrinų kvapą [20,21]. Tai tarprūšinis T. vulgaris L. ir T. pulegioides L. hibridas [21].

(14)

Jis užauga iki 20 - 40 cm aukščio, stiebai kylantys. Stiebai ir lapai tankiai padengti plaukeliais. Lapai priešiniai, pilkai žalios spalvos, su baltais krašteliais. Žiedynas smulkus, rožinės spalvos [22]. Augalas kilęs iš pietų Europos, kulinarijos tikslais yra auginamas Viduržemio regione [20,22,23].

1.3. Thymus spp. augalinių žaliavų fitocheminė sudėtis

Čiobreliuose randamos dvi pagrindinės antrinių metabolitų grupės – eteriniai aliejai ir polifenoliai, iš kurių ypač išskiriami flavonoidai [1]. Fitocheminė augalo sudėtis priklauso nuo augimo sąlygų. Daugiau fenolinių eterinio aliejaus komponentų (timolis, karvakrolis) ir polifenolinių junginių susikaupia augalui augant šiltesnėje ir sausesnėje klimato zonoje, o drėgnesnėse ir vėsesnėse vietose - daugiau ne fenolinių junginių [24]. Dažniausiai randami komponentai eteriniuose čiobrelių aliejuose yra terpernai [1,10,25]. Didžiausią čiobrelių genties augalų eterinių aliejų dalį sudaro timolis, karvakrolis [10,25], p-cimenas ir c-terpinenas [10].

Čiobrelių eterinių aliejų sudėtis yra daug plačiau ištyrinėta nei fenoliniai junginiai. Fenolinių komponentų įvairovę augaluose lemia rūšis, augimo vieta ir ekstrakcijos metodas [26]. Iš fenolinių junginių, daugumoje čiobrelių rūšių, kaip pagrindinis polifenolinis komponentas dažniausiai aptinkama rozmarino rūgštis [5]. Be rozmarino rūgšties, čiobrelių genties augalai kaupia šias fenolines rūgštis - ferulinę, kavos, p-kumaro ir chlorogeno [24,26], galo, kvino, cinamono, karnozo ir litosperminę [26]. Taip pat genties augaluose aptinkama flavonolių kvercetino [24,26] ir rutino [24], flavanolių katechino ir epikatechino, flavononų eriodiktiolio [5,24,26], naringenino, hesperitino [5,24], dihidrokvercetino ir flavonų apigenino, luteolino [5,24,26] ir jų gliukozidų [24] bei salvianolinių rūgščių [5].

1.4. Thymus spp. panaudojimas

Čiobrelių genties augalai yra vertinami dėl medicininių ir aromatinių savybių. Iš įvairių čiobrelių rūšių išgauti ekstraktai ir eteriniai aliejai plačiai naudojami kosmetikos, farmacijos ir maisto pramonėse [1]. Maisto pramonėje jie naudojami dėl savo aromatinių ir skonio savybių kaip prieskoninė žaliava [2,8]

taip pat kaip konservantai [10], dėl žaliavos antimikrobinių savybių [1,8]. Eteriniai aliejai, išgauti iš čiobrelių žaliavos, įeina į tokių kosmetikos gaminių, kaip dezodorantai, dantų pastos, burnos skalavimo skysčiai, sudėtį [10].

(15)

Čiobrelių genties augalai plačiai vartojami kaip vaistingi augalai [2,10]. Tiek čiobrelio žolė, tiek eterinis aliejus yra vartojami kaip medikamentai [9]. Bene plačiausiai pritaikomas čiobrelių poveikis kvėpavimo sistemai. Šios genties augalų preparatai vartojami peršalimo [1,8,19], gripo gydymui [8,19], atsikosėjimui lengvinti [1,2,8,10,19,27], esant bronchitui [2,5]. Čiobreliai turi teigiamą poveikį virškinimo sistemai. Jie gerina virškinimą [2,10], mažina vidurių pūtimą [1,2,10] ir pilvo skausmą [19]. Arbata, paruošta iš skirtingų augalo dalių, yra vartojama kaip pagalbinė priemonė skrandžio ir virškinamojo trakto ligų gydymui [1,8]. Įrodyta, jog čiobreliai pasižymi stipriomis priešuždegiminėmis savybėmis [2,8,10] ir yra vartojami esant uždegimui ir reumatui [2]. Taip pat pasižymi antispazminėmis [1,2,8,10], skausmą mažinančiomis savybėmis [1,2,8].

Notrelinių šeimos augalai yra natūralių antioksidantų šaltinis. Čiobrelių genties augaluose gausu skirtingos struktūros, fiziologiškai ir chemiškai stabilių polifenolinų junginių [24]. Šios genties augalai yra vertinami dėl stiprių antioksidacinių savybių [1,2,5,8]. Čiobreliai pasižymi priešvėžiniu aktyvumu [1] ir turi teigiamą įtaką padidėjusiam cholesterolio kiekiui [8]. Kai kurie autoriai nurodo, jog čiobrelis taip pat pasižymi antihelmintiniu, diuretiniu, antiseptiniu, šlapimo takus dezinfekuojančiu poveikiu [1] ir yra vartojamas nefritams gydyti [8,19].

1.5. Thymus spp. fitocheminės sudėties ir farmakologinio poveikio ryšys

Dauguma notrelinių šeimos augalų pasižymi stipriu antioksidaciniu ir antibakteriniu aktyvumu, daugiausia dėl juose esančių fenolinių junginių [28]. Čiobrelių genties augalai nėra išimtis - jų farmakologinis poveikis yra susijęs su eteriniais aliejais ir polifenoliniais junginiais [5]. Pagrindiniai eterinių aliejų komponentai – karvakrolis ir timolis, yra svarbūs bakteriocidiniam ir bakteriostatiniam poveikiui [28] bei lemia stiprias antioksidacines savybes [4,10]. Timolis taip pat pasižymi antiseptinėmis [4], priešuždegiminėmis [4,10], antibakterinėmis ir priešgrybelinėmis savybėmis [9], antimutageniniu ir priešnavikiniu poveikiu [10]. Karvakroliui priskiriamas antimikrobinis [10] ir priešgrybelinis aktyvumas [4].

Eteriniai aliejai bei flavonoidai yra siejami su čiobrelių diuretiniu, antiseptiniu, šlapimo takus dezinfekuojančiu ir antihelmintiniu poveikiu [1].Teigiama, jog fenoliniai junginiai, tokie kaip rozmarino rūgštis, flavonoidai kvercetinas, eriocitrinas, luteolinas ir andapigeninas yra atsakingi už čiobrelių preparatų antioksidacinį poveikį [25,29]. Įvairių ligų gydyme svarbūs ir kiti čiobrelių komponentai, tokie kaip kavos, rozmarino, oleanolio rūgštis, saponinai ir taninai [24].

(16)

1.6. Oksidacinis stresas

Oksidacinis stresas – procesas, sukeliantis ląstelių ir audinių pažaidą dėl suintensyvėjusios laisvųjų radikalų gamybos organizme ar sutrikusio jų nukenksminimo [30]. Laisvieji radikalai – tai nestabilios molekulės, kurios turi vieną laisvą, nesuporintą elektroną ir prisijungia elektronus iš kitų molekulių. Šios molekulės nuolatos sintetinamos žmogaus organizme. Tai aktyviosios deguonies formos - superoksido anijonas O2-, hidroksilo anijonas OH^-, vandenilio peroksidas H2O2 ir kiti [30,31]. Šios deguonies formos yra itin aktyvios ir egzistuoja tik 9-10 sekundžių [30].

Aktyviosios deguonies formuojasi mitochondrijose, vykstant ląsteliniam kvėpavimui, arachidono rūgšties metabolizmo metu, veikiant fermentams lipooksigenazėms ir ciklooksigenazėms [31]. Šios deguonies formos taip pat sintetinamos organizme vykstant ksenobiotikų oksidaciniam metabolizmui, taip pat prasidėjus uždegiminėms reakcijoms, kurių metų gaminamas azoto monoksidas ir vandenilio peroksidas [32], vykstant nefermentinėms Fentono bei Haberio-Weiso reakcijoms, dalyvaujant vario ir geležies druskoms, kurių metu susidaro hidroksilo radikalas. Aktyviųjų deguonies formų susidarymui įtakos turi ir išoriniai veiksniai, tokie kaip saulės spinduliai, traumos, ultragarsas, infekcijos, rūkymas, užteršta aplinka, alkoholio vartojimas, geležies ir vario perteklius organizme [33].

Organizme laisvuosius radikalus neutralizuoja antioksidantai, tokie kaip tokoferolis, askorbo rūgštis, glutationas [32] arba fermentai – peroksidazė, katalazė ir superoksido dismutazė [31,32]. Kai vidiniai ląstelės gynybiniai mechanizmai nebegali susidoroti su padidėjusia laisvųjų radikalų koncentracija, pažeidžiami svarbūs ląstelės komponentai – DNR [30,32,33], membranos baltymai ir lipidai [30,31,32,33], branduolio membrana, fermentai [30]. Aktyviųjų deguonies formų pagausėjimas gali lemti senėjimo procesus, didina riziką atsirasti tokioms ligoms, kaip cukrinis diabetas [8,31], kaip atesklerozė [30,31,33,34], širdies ir kraujagyslių sistemos ligos [31,33,34], neurodegeneracinės ligos, reumatoidinis artritas, katarakta, turi įtakos piktybinių navikų [33] ir vėžio išsivystymui [8,31].

1.7. Antioksidantai

Atliekama vis daugiau tyrimų, įrodančių oksidacinio streso ir laisvųjų radikalų svarbą įvairių lėtinių ligų atsiradimui [8]. Epidemiologiniais tyrimais nustatyta, jog riziką susirgti lėtinėmis ir su senėjimu susijusiomis ligomis mažina antioksidantų vartojimas [2]. Maisto pramonėje naudojami sintetiniai antioksidantai, tokie kaip butilintas hidroksianizolas, butilintas hidroksitoluenas, tret-butilo hidrochinonas, yra pigūs ir efektyvūs, tačiau saugumo prasme jie nėra tinkamiausias pasirinkimas -

(17)

nustatyta, jog jie turi kancerogeninį poveikį [34]. Dėl nepageidaujamo sintetinių antioksidantų poveikio, atliekama vis daugiau tyrimų su natūraliais antioksidantais, išskirtais iš vaistinių augalų, kurie galėtų turėti teigiamos įtakos apsisaugant nuo įvairių ligų, susijusių su laisvaisiais radikalais ir oksidaciniu stresu [2,8,34,35]. Nemažai augalinių ekstraktų ir grynų natūralių komponentų pasižymi antioksidacinėmis savybėmis [2]. Natūralūs antioksidantų šaltiniai yra augalai ir jų atskiros jų dalys, kuriuose randami flavonoidai, taninai, kumarinai, kurkuminoidai, ksantonai, fenoliai, lignanai ir terpenoidai [34].

Augalų polifenoliniai junginiai gali potencialiai būti naudojami kaip natūralūs antioksidantai, apsaugantys nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio [8,10]. Kaip vieni stipriausių junginių, pasižyminčiu antioksidaciniu aktyvumu yra išskiriami fenoliniai junginiai ir flavonoidai [2]. Polifenoliai dėl lipidų peroksidacijos slopinimo [8,10], antiradikalinio aktyvumo, chelatinių savybių gali padėti išvengti oksidacinio streso [8]. Jie gali būti vartojami įvairių ligų gydymui ir profilaktikai [8,10], nes sulėtina oksidacinį skilimą, kurį sukelia itin reaktyvios dalelės, pavyzdžiui, aktyviosios deguonies formos [10].

Manoma, kad kasdien su maistu suvartojant didelius kiekius flavonoidų gali sumažėti rizika susirgti storosios žarnos, krūties ir kasos vėžiu [10]. Taip pat Viduržemio dieta yra siejama su sumažėjusia kardiovaskulinių ligų rizika, iš dalies dėl sudėtyje esančių flavonoidų ir fenolinių junginių [25].

1.8. Fenoliniai junginiai

Fenoliniai junginiai savo struktūroje turi aromatinį žiedą su viena ar daugiau hidroksilo grupių [36]. Augalų polifenoliai yra tam tikra antrinių metabolitų grupė [1]. Jiems priskiriamos fenolinės rūgštys, flavonoidai, lignanai [24,36], antocianinai, stilbenai [24], kumarinai ir taninai [36,37]. Fenolinėms rūgštims priskiriamos ferulinė rūgštis, kavos rūgštis ir jos dariniai p-kumaro, rozmarino ir chlorogeno rūgštys. Flavonoidams priskiriami flavonoliai (pvz. rutinas ir kvercetinas), flavanoliai (pvz. katechinas ir epikatechinas), flavanonai (pvz. naringeninas, eridioktiolis, hesperitinas ir dihidrokvercetinas), flavonai ( pvz. apigeninas ir apigenin-7-gliukozidas) bei chalkonai [24].

Polifenoliniai junginiai kaupiasi įvairiose augalo dalyse [24]. Vaistiniai augalai vis dažniau vartojami maisto ir farmacijos pramonėje kaip antioksidantai, siekiant sumažinti laisvųjų radikalų sukeliamą žalą organizmo audiniams. [1]. Didelę dalį BAM, pasižyminčių antioksidacinėmis savybėmis sudaro flavonoidai ir kiti fenoliniai junginiai. Vaistingi augalai kaupia ir kitus antioksidaciniu poveikiu pasižyminčius komponentus, tarp kurių ubichinonas (kofermentas Q10), vitaminai A, B6, C ir E, karotenoidai, cinkas, selenas [35]. Polifenolių galima gauti ir su maistu. Jų gausu vaisiuose, daržovėse, grūduose, prieskoniuose, arbatose, kavoje, sultyse, vynuose [24].

(18)

Fenoliniai junginiai yra svarbūs organizmo apsaugai nuo žalingo aktyviojo deguonies poveikio.

Polifenoliai pasižymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis [1,26] ir yra svarbūs lėtinių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, profilaktikai. Jie svarbūs kardiovaskulinių, cerebrovaskulinių, neurodegenerecinių, uždegiminių ligų, Alzheimerio ligos, diabeto ir vėžio gydymui [1]. Didelis fenolinių junginių kiekis ir jų įvairovė taip pat yra susijusi su anticholinesteraziniu ir antimikrobiniu aktyvumu [26].

Viena iš polifenolinių junginių grupių – flavonoidai. Jie pasižymi antioksidaciniu veikimu, dėl antiradikalinio aktyvumo, mažina skausmą ir uždegimą, slopina vėžinių ląstelių augimą. Jie taip pat pasižymi kardioprotekciniu poveikiu, dėl antihipertenzinio, antiaritminio bei teigiamo poveikio aterosklerozės prevencijai, mažina eritrocitų ir/ar trombocitų agregaciją. Flavonoidai taip pat turi hepatoprotekcinį ir gastroprotekcinį poveikį – padeda išvengti opų susidarymo. Jie pasižymi ir antimikrobiniu veikimu - yra aktyvūs prieš kai kurias bakterijas, grybelius ir virusus. Sintetiniai flavonoidai pasižymi į diazepamo panašiu anksiolitiniu poveikiu [24].

1.9. Fenolinių junginių nustatymo metodai

Fenolinių junginių augalų mėginiuose nustatymui yra naudojami spektrofotometrijos ir chromatografijos metodai [36]. Dujų chromatografija yra tinkama siekiant atskirti, kiekybiškai ir kokybiškai nustatyti fenolines rūgštis, kondensuotus taninus ir flavonoidus [36]. Šiuo metodu norint atskirti fenolinius komponentus reikia atlikti papildomus žingsnius, tokius kaip ekstraktų išvalymas nuo lipidų, fenolinės dalies atskyrimas nuo glikozidų. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu galima atskirti ir kiekybiškai nustatyti fenolinius junginius. Kiekybiniam nustatymui dažniausiai naudojama mobili fazė iš acetonitrilo, metanolio ar jų vandeninių formų. Skirtingų klasių fenolinių junginių identifikavimui naudojama C18 kolonėlė. Atliekant tyrimą svarbu palaikyti pH 2-4, siekiant išvengti fenolinių junginių jonizacijos [36].

Nors chromatografiniai metodai yra tikslūs, tačiau jie brangūs ir sudėtingi. Spektrofotometriniai metodai yra praktiškesni, greitesni, pigesni ir lengviau pritaikomi nei kiti metodai [37,38].

Spektrofotometriškai galima nustatyti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį. Fenoliniai junginiai turi charakteringą spektrą, dėl dvigubųjų jungčių aromatiniame žiede ir pakaituose, kurie padeda juos identifikuoti spektrofotometrijos metodu [37]. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti plačiausiai tyrimuose pritaikomas Folin-Ciocalteu metodas. Fenoliniai junginiai mėginyje yra oksiduojami Folin- Ciocalteu reagentu, o reagento sudėtyje esančias fosfovolframo ir fosfomolibdato rūgštis į oksidus redukuoja fenoliniai junginiai [37]. Volframo ir molibdeno oksidai šarminėje terpėje mėginiui suteikia

(19)

mėlyną spalvą, absorbcijos maksimumas yra matuojamas esant 760 nm šviesos bangos ilgiui [36,37].

Gauta absorbcija yra proporcinga bendrai fenolinių junginių koncentracijai [37].

Bendram flavonoidų kiekiui mėginyje nustatyti yra pritaikomi kolorimetriniai metodai. Dažnai taikomas metodas, naudojant aliuminio chloridą [36]. Aliuminio jonas reaguoja su flavonoidais, suformuodamas stabilų, geltonos spalvos kompleksą, kurio spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas flavonoidų koncentracijai [37]. Absorbcija matuojama spektrofotometru, nustačius 410-423 nm šviesos bangos ilgį [36].

1.10. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai

Dauguma antioksidacinio aktyvumo nustatymui skirtų spektrofotometrinių metodų yra pagrįsti spalvoto oksidatoriaus redukcija. Vienas plačiausiai naudojamų metodų - DPPH metodas. Šis metodas nesudėtingas, nebrangus ir greitas. DPPH yra stabilus laisvasis radikalas, turintis tamsią violetinę spalvą ir stiprią absorbciją 517 nm šviesos bangos ilgyje [39]. Ši absorbcija sumažėja, kuomet DPPH yra redukuojamas antioksidantu [40]. Mėginio spalvos kitimas dėl redukuoto DPPH mėginio iš tamsiai violetinės į gelsvą, leidžia spektrofotometriškai nustatyti antioksidacinį aktyvumą. Rezultatai išreiškiami antioksidanto koncentracija, kuri išsklaido 50 % DPPH radikalų IC50 [39].

Kitas stabilus laisvasis radikalas – ABTS, dažnai naudojamas polifenolių, fenolinių rūgščių, flavonoidų ir kitų junginių antioksidacinio aktyvumo įvertinimui [41]. ABTS metodas yra pagrįstas mėlynai žalio ABTS radikalo redukcija antioksidantais. Absorbcija matuojama nustačius 734 nm šviesos bangos ilgį [40,42].

Dar vienas metodas, naudojamas antiradikalinio aktyvumo nustatymui yra FRAP. Jis skiriasi nuo DPPH ir ABTS metodų tuo, jog tyrime nenaudojami laisvieji radikalai. Metodas pagrįstas trivalentės geležies Fe³⁺ redukcija iki dvivalentės Fe²⁺ [42]. Metodui naudojama gelsva Fe³⁺-TPTZ druska, kurią antioksidantai redukuoja iki mėlynos Fe²⁺-TPTZ druskos. Nustatomas absorbcijos padidėjimas matuojant 593 nm šviesos bangos ilgyje [43].

FIC – geležies jonų surišimo metodas, naudojamas antioksidacinio aktyvumo nustatymui. Geležis dalyvauja Fentono ir Haberio-Weiso reakcijoje [33,44] ir išskiria laisvuosius radikalus [44]. Metalų jonus surišantys antioksidantai slopina šią reakciją ir laisvųjų radikalų formavimąsi [33,44]. Dvivalentė geležis Fe²⁺ sudaro raudonos spalvos kompleksą su ferozinu. Esant chelatoriams, kompleksas nebesusidaro ir pakinta reakcijos mišinio spalva. Spalvos pakitimas leidžia įvertinti antioksidantų chelatų sudarymo efektyvumą [45]. Metodas pagrįstas absorbcijos sumažėjimu 562 nm šviesos bangos ilgyje [44].

(20)

2. TYRIMO METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tiriamasis objektas - Thymus spp. genties augalų, surinktų iš skirtingų Lietuvos regionų ir Šiaulių Universiteto Botanikos sodo, augalinės žaliavos. Natūraliai įvairiuose Lietuvos regionuose augančių paprastųjų čiobrelių (T. serpyllum L.) žaliavos, rinktos masinio žydėjimo metu, 2019 m. birželio-rugpjūčio mėnesiais (1 lentelė). Augalinė žaliava rinkta smėlingose pievose, pamiškėse, pakelėse, upių šlaituose. Iš skirtingų augaviečių surinkta augalinė žaliava buvo suskirstyta į atskiras augalo dalis - stiebus, lapus ir žiedus. Tokiu būdu gauti trijų morfologinių dalių analitiniai pavyzdžiai. Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama ant popierinės medžiagos paskleidus ją plonu sluoksniu, apsaugota nuo drėgmės ir tiesioginių saulės spindulių. Susmulkinta išdžiovinta žaliava buvo laikoma tamsioje, sausoje vietoje, popieriniuose maišeliuose.

1 lentelė. Paprastųjų čiobrelių (T. serpyllum L.) žaliavų rinkimo vieta ir data Eilės

Nr. Rinkimo vieta Rinkimo data Eilės

Nr. Rinkimo vieta Rinkimo data

1 Jonavos raj. 2019.06.12 8 Širvintų raj. 2019.06.15

2 Ukmergės raj. 2019.06.27 9 Klaipėdos raj. 2019.07.11

3 Klaipėdos raj. 2019.07.09 10 Kėdainiai 2019.07.15

4 Lazdijų raj. 2019.07.17 11 Šiaulių raj. 2019.07.20

5 Kauno raj. 2019.07.30 12 Molėtų raj. 2019.08.04

6 Kupiškio raj. 2019.08.12 13 Kauno raj. 2019.08.14

7 Jonavos raj. 2019.06.12

Kultūroje auginamų čiobrelių genties augalinė žaliava buvo renkama Šiaulių botanikos sode 2017 ir 2019 metų gegužės-rugpjūčio mėnesiais. Antžeminės augalų dalys, surinktos skirtingais vegetacijos tarpsniais: masinio augimo, butonizacijos ir masinio žydėjimo. Iš viso 2017 metais surinktos 7 Šiaulių botanikos sode auginamos čiobrelių genties rūšių žaliavos: T. serpyllum L., T. pulegioides L., T.

longicaulis C Presl., T. x oblongifolius Opiz, T. praecox Opiz. ssp. arcticus (Durand) Jalas, T. sibthorpii Benth., T. austriacus Bernh. ex Rchb. 2019 metais surinktos tų pačių 7 Thymus spp. rūšių bei T. x citriodorus (Pers.) Schreb augalinės žaliavos. Be to, visų rūšių augalinės žaliavos surinktos dar vienu augalo vegetacijos laikotarpiu – sėklų brandinimo.

(21)

2.2. Medžiagos ir reagentai

Tyrimai atlikti naudojant analitinio švarumo tirpiklius ir reagentus: išgrynintą vandenį (Ph.Eur.

01/2009:0008), maistinį rektifikuotą 96% etilo alkoholį (UAB “Stumbras”, Kaunas, Lietuva), fenolinį 2M Folin-Ciocalteu reagentą (,,Sigma –Aldrich“, Šveicarija), 99,5- 100,5% natrio karbonatą (,,Sigma – Aldrich“, Prancūzija), ≥ 98% galo rūgšties monohidratą (,,Sigma –Aldrich“, Kinija), 100% acto rūgštį (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 95% aliuminio chlorido heksahidratą (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 94% rutino hidratą (,,Sigma – Aldrich“, Vokietija), ≥ 99,5% metenaminą (,,Sigma – Aldrich“, Rusija), ≥ 97% feroziną (,,Sigma – Aldrich“, JAV), 99,5% bevandenis geležies (II) chloridas (,,Alfa Aesar“, Vokietija), 95%

DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazilas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3- etilbenzotiazolin-6-sulfono) rūgštis) (,,Sigma-Aldrich“, Kanada), kalio persulfatą (,,SIAL“, Kanada), troloksą (,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Danija), analitinio švarumo natrio nitritą (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatą (≥ 99%) (SigmaAldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštį (37%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio hidroksidą (99%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio acetatą (≥99,9 %) (CHEMPUR, Lenkija), geležies (III) chloridą (“Scharlau”, Ispanija), TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija).

2.3. Naudota aparatūra

Tyrimams atlikti buvo naudota ultragarso vonelė – „ElmaSonic S40H“ (U=230V) (gamintojas Elma Schmidbauer, Vokietija), orbitalinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic (gamintojas IKA-WERKE, Vokietija) ir spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) bei „Agilent Technologies“

(Cary 60, JAV).

2.4. Tyrimų metodai

2.4.1. Thymus spp. žaliavų ekstraktų paruošimas

Analitinėmis svarstyklėmis atsveriamas tikslus 0,020 g Thymus spp. žaliavos (stiebų, žiedų ir lapų) svėrinys ir užpilamas 10 ml 70% (V/V) etilo alkoholiu. Ekstraktai ruošiami tamsaus stiklo

(22)

buteliukuose. Iš kiekvienos žaliavos dalies (stiebų, žiedų ir lapų) ruošiama po 2 mėginius. Mėginiai 30 minučių veikiami ultragarsu, esant 50 ^oC temperatūrai. Pagaminti etanoliniai ekstraktai filtruojami pro popieriaus filtrus į matavimo cilindrus. Žaliavos likutis ant filtro praplaunamas 70% (V/V) etanoliu iki 10 ml. Paruošti 108 ekstraktai iš įvairių Lietuvos augaviečių T. serpyllum. žaliavų ir 106 ekstraktai iš kultūroje auginamų Thymus spp. žaliavų. Iš viso paruošta 214 Thymus spp. etanolinių ekstraktų.

2.4.2. Reagentų paruošimas

70 % (V/V) etanolio - vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 665 ml 96% (V/V) etanolio ir 335 ml išgryninto vandens.

0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas ruošiamas 10 ml 2 M Folin-Ciocalteu fenolinio reagento praskiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

7,5 % (W/V) natrio karbonato tirpalas ruošiamas 7,5 g bevandenio natrio karbonato ištirpinant 100 ml išgryninto vandens.

5% metenamino tirpalas gaminamas 2,5 g heksametilentetramino tirpinant 50 ml išgryninto vandens.

33 % acto rūgšties tirpalas ruošiamas 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties skiedžiant vandeniu iki 100 ml žymos.

10 % aliuminio chlorido tirpalas - 5,0 g aliuminio chlorido tirpinami 50 ml išgryninto vandens.

Rutino etanolinis tirpalas gaminamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99% grynumo rutino tirpinant 25 ml 70 % (V/V) etanolio.

2 mM geležies (II) chlorido tirpalas ruošiamas 0,0063g (tikslus svėrinys) bevandenio FeCl2

tirpinant 25 ml išgryninto vandens.

5 mM ferozino tirpalas gaminamas 0,0616 g ferozino tirpinant 25 ml išgryninto vandens.

6×10^-5 M DPPH tirpalas gaminamas ir laikomas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugančiame nuo šviesos. 0,00118g (tikslus svėrinys) DPPH reagento ištirpinama 50 ml 96% (V/V) etanolyje.

ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. Tikslus svėrinys 0,0548 g ABTS miltelių tirpinamas 50 ml išgryninto vandens, pridedama kelis lašus 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys 15 – 16 val. laikomas kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS^•+ tirpalą.

0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas gaminamas išmatuojant 42 ml 37% vandenilio chlorido rūgšties ir ją maišant su išgrynintu vandeniu iki 1 litro.

(23)

Natrio šarmo praskiestas tirpalas gaminamas pasveriant tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį, ištirpinus jį išgrynintame vandenyje ir praskiedžiant iki 100 ml.

Arnow reagentas gaminamas pasveriant tikslų 10,000 g natrio molibdato kiekį, ištirpinant jį 70- 80 ml išgryninto vandens. Sveriamas tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris ištirpinamas gautame tirpale ir praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

300 mM acetatinis buferis gaminamas 3,1 g natrio acetato užpilant 16 ml ledinės acto rūgšties ir skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 1000 ml (pH 3,6).

10 mM TPTZ reagentas gaminamas 0,1562 g TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazino) miltelių ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

20 mM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas gaminamas 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

2.5. Thymus spp. žaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė

2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas

Bendrajam fenolinių junginių kiekiui etanoliniuose Thymus spp. ekstraktuose nustatyti atlikta spektrofotometrinė analizė panaudojant Folin-Ciocalteu reagentą. 1 ml tiriamojo ekstrakto ir sumaišoma su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu. Po 4 min. įpilami 4 ml 7,5 % (W/V) natrio karbonato tirpalo ir sumaišoma. Pagamintas tirpalas paliekamas 60 min. tamsoje. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.

1 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė. (n=3)

y = 6,559x + 0,0485 R² = 0,9992

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1

Absorbcijos dydis

Galo rūgšties koncentracija mg/ml

(24)

Gauti rezultatai išreiškiami galo rūgšties ekvivalentais (GRE) remiantis galo rūgšties kalibracine kreive (1 pav.) ir formule:

GRE (mg/g) = c x V / m,

kur c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml); V – pagaminto ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

2.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas

Bendrasis flavonoidų kiekis Thymus spp. augaliniuose ekstraktuose nustatytas ekstraktus veikiant aliuminio chlorido (AlCl3) ir metenamino tirpalais, parūgštintoje aplinkoje. 25 ml matavimo kolbutėse paruošiami tiriamieji ir palyginamieji tirpalai. Tiriamajam tirpalui pagaminti imamas 1 ml tiriamojo ekstrakto, įpilama 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33 % acto rūgšties, 1,5 ml 10 % AlCl3, 2 ml 5 % metenamino tirpalų ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki 25 ml žymės, gerai sumaišoma. Pagamintas tirpalas paliekamas 30 min. pastovėti. Palyginamasis tirpalas ruošiamas kaip ir tiriamasis, tik nepridedama aliuminio chlorido ir metenamino tirpalų. Tiriamojo tirpalo optinis tankis matuojamas esant 475 nm šviesos bangos ilgiui ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu. Kiekvienas mėginys matuojamas bent 2 kartus.

Bendras flavonoidų kiekis vertinamas lyginant tiriamojo ir etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydžius. Etaloninis ir palyginamasis rutino tirpalai ruošiami vietoj 1 ml tiriamojo ekstrakto, imant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) mg rutino/ml ekstrakto), pagal formulę:

𝒙 (𝒎𝒈

𝒈 ) = 𝒎_𝑹× 𝑨 × 𝑽

𝒎 × 𝑨_𝑹× 𝑽_𝑹× 𝟏𝟎𝟎𝟎

kur mR – rutino masė etanoliniam rutino tirpalui paruoši (g); A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas žaliavos kiekis (g); AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis; VR – etaloninio rutino tirpalo tūris (ml).

(25)

2.5.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas

Bendrajam fenolio rūgščių nustatymui iš kiekvieno Thymus spp. etanolinio ekstrakto gaminamas tiriamasis ir palyginamasis tirpalai. Tiriamajam tirpalui pagaminti imama 1 ml tiriamojo ekstrakto, pridedama 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat kaip tiriamasis, tik nededama Arnow reagento. Abu tirpalai gerai sumaišomi ir matuojamas jų optinis tankis, nustačius 525 nm šviesos bangos ilgį.

Bendrasis fenolio rūgščių kiekis išreiškiamas chlorogeno rūgštimi ir skaičiuojamas remiantis formule:

𝑿 (%)𝑨 𝒙 𝟓, 𝟑 𝒎

kur A – tiriamojo tirpalo absorbcija; m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe²⁺ jonų sujungimo metodu

Fenolinių junginių chelatinis aktyvumas nustatomas spektrofotometriniu Fe²⁺ jonų surišimo metodu. Šis metodas pagrįstas Fe (II) ir ferozino komplekso absorbcijos mažėjimu esant 562 nm šviesos bangos ilgiui (44). Tiriamasis tirpalui pagaminti imamas 1 ml tiriamojo ekstrakto, pridedama 50 µl 2 mM FeCl2 ir 0,2 ml 5 mM ferozino tirpalų. Gautas tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas 10 min. pastovėti kambario temperatūroje. Tuščiam bandiniui pagaminti, 1 ml 70 % (V/V) etanolio sumaišomas su 50 µl 2 mM FeCl2 ir 0,2 ml 5 mM ferozino tirpalais. Palyginamasis tirpalas – 70 % (V/V) etanolis. Ekstrakto gebėjimas surišti Fe²⁺ jonus išreiškiamas procentais ir yra apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑭𝒆^𝟐+𝒔𝒖𝒓𝒊š𝒊𝒎𝒂𝒔 (%) = (𝑨_𝒃× 𝑨_𝒂

𝑨_𝒃 ) × 𝟏𝟎𝟎 %

kur, Aa – tiriamojo bandinio absorbcijos dydis; Ab – tuščiojo bandinio absorbcijos dydis.

(26)

2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų sujungimo metodu

Antioksidaciniam Thymus spp. ekstraktų aktyvumui nustatyti DPPH (2,2-difenil-1- pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodu, tiriamasis bandinys pagamintas iš 50 μl etanolinio ekstrakto ir 2 ml paruoštu 6 x 10^-5M DPPH tirpalu. Tuščias bandinys paruošiamas taip pat, tik vietoje tiriamojo tirpalo pilamas 70 % (V/V) etanolis. Palyginamasis tirpalas – 70 % (V/V) etanolis. Paruoštų bandinių absorbcija matuojama spektrofotometru, nustačius 515 nm šviesos bangos ilgį. Matuojama, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 30 min.). Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais ir apskaičiuojamas pagal formulę:

𝑫𝑷𝑷𝑯 𝒔𝒖𝒓𝒊š𝒊𝒎𝒂𝒔 (%) = (𝑨_𝒃× 𝑨_𝒂

𝑨_𝒃 ) × 𝟏𝟎𝟎 %

kur, Aa – tiriamojo bandinio absorbcijos dydis (t = 30 min.); Ab – tuščiojo bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min.).

2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS˙⁺ radikalų surišimo metodu

Antiradikalinio aktyvumo nustatymui taikomas ABTS (2,2‘-azino-bis(3-etilbenzotiazolino-6- sulfono rūgšties) radikalo surišimo metodas. Reagentas gaminamas 0,0548 g (tikslus svėrinys) ABTS miltelių tirpinant 50 ml išgryninto vandens. Gautas motininis tirpalas aktyvuojamas 70 mM kalio persulfato tirpalu. Sumaišoma ir paliekama tamsioje vietoje 15 – 16 val. Pasiekus reakcijos pusiausvyrą ruošiamas darbinis ABTS^.+tirpalas, skiedžiant motininį tirpalą išgryninti vandeniu, kol 734 nm šviesos bangos ilgyje bus pasieka tiksli tirpalo absorbcija – 0,800 ± 0,03, palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Tiriamieji tirpalai ruošiami į 3 ml darbinio ABTS^.+ tirpalo įpylus 30 µl Thymus spp. etanolinio ekstrakto. Gautas tirpalas sumaišomas ir paliekama 1 val. kambario temperatūroje. Tiriamųjų tirpalų absorbcija matuojama spektrofotometru, nustačius 734 nm šviesos bangos ilgį.

Antiradikalinis Thymus spp. ekstraktų aktyvumas apskaičiuojamas trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos, pagal kalibracinę kreivę ir formulę (2 pav.):