Magistro baigiamasis darbas Darbo

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

KAMILĖ PETKŪNAITĖ

TARAXACUM OFFICINALE F.H.WIGG. LAPŲ IR ŽIEDYNŲ FENOLINIŲ

JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo Vadovė: Lekt., dr. Lina Raudonė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TARAXACUM OFFICINALE F.H.WIGG. LAPŲ IR ŽIEDYNŲ FENOLINIŲ

JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas Data KAUNAS, 2015 Darbo vadovė

Lekt. dr. Lina Raudonė Data Darbą atliko Magistrantė Kamilė Petkūnaitė Data TVIRTINU:

TURINYS

1.1. Paprastosios kiaulpienės botaninis apibūdinimas, sistematika, augimo sąlygos, prisitaikymas prie aplinkos ir paplitimas ... 13

1.2. T. officinale vaistinė augalinė žaliava ir kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos ... 14

1.3. T. officinale biologinis poveikis ... 16

1.4. Fenoliniai junginiai. Jų struktūros ypatumai ir klasifikacija ... 18

1.5. Flavonoidų ir fenolinių rūgščių poveikis ... 21

1.6. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 23

2. METODIKA ... 27

2.1. Tyrimo objektas ... 27

2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 28

2.3. Naudota aparatūra ... 28

2.4. Tyrimo metodai: ... 28

2.4.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 29

2.4.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 29

2.4.3. Suminio hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu . 30 2.4.4. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu ... 31

2.4.5. Redukcinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu. ... 31

2.4.6. T. Officinale F.H.Wigg. lapų ir žiedynų analizė ESC metodu. ... 32

2.5. Duomenų apdorojimas ir statistinis vertinimas ... 32

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34

3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 34

3.2. Spektrofotometrinė T. officinale F.H.Wigg. augalinių žaliavų junginių analizė ... 37

3.2.1. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas paprastųjų kiaulpienių žaliavose ... 37

3.2.2. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų kiaulpienių žaliavose ... 40

3.2.3. Suminio hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio įvairavimas T. officinale žaliavose ... 43

3.3. T. officinale F. H. Wigg. žaliavų antioksidantinio aktyvumo įvairavimas ... 48

3.3.1. Paprastųjų kiaulpienių lapų antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 48

3.3.2. Paprastųjų kiaulpienių žiedynų antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 52

3.4. T. officinale F.H.Wigg. augalinių žaliaų analizė ESC metodu ... 56

SANTRAUKA

K. Petkūnaitės magistro baigiamasis darbas „Taraxacum officinale F.H.Wigg. lapų ir žiedynų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai“/mokslinė vadovė lekt., dr. L.Raudonė;

SUMMARY

K.Petkūnaitė master‘s thesis „The phenolic compounds and antioxidant activity research of Taraxacum officinale F.H.Wigg. leaves and flowers“/ research supervisor lect., PhD. L.Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. - Kaunas.

SANTRUMPOS

ABTS –2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) COX – ciklooksigenazė (angl. cyclooxygenase)

CUPRAC – vario redukcijos antioksidantinė galia DPPH – 2,2 – difenil–1–pikrilhidrazilas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija FRAP – trivalentės geležies jonų redukcinė galia GAE – galo rūgšties ekvivalentai

HAT – vandenilio atomų pernaša (ang. hydrogen atom transfer)

HSV-1 – Herpes simplex 1 tipo virusas n – imties dydis

p – reikšmingumo lygmuo

PSO – Pasaulio sveikatos organizacija r – rūgštis

R2 _{– regresijos koeficientas} RE – rutino ekvivalentai;

RNS – reaktyviosios azoto formos (angl. reactive nitrogen species) ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species) RS – Spirmeno koreliacijos koeficientas

SET – elektronų pernaša (ang. single electron transfer)

ĮVADAS

Vaistiniai augalai pasaulyje nuo neatmenamų laikų vartojami kaip pagrindinis medicinos šaltinis [1]. Jie geba sintetinti įvairius cheminius junginius, kurie svarbūs biologinių funkcijų palaikymui, augimo, reprodukcijos, pigmentacijos, prisitaikymo prie nepalankių aplinkos sąlygų metu [2]. Daugelis šių fitocheminių medžiagų turi teigiamą poveikį ir žmonių sveikatai, veiksmingos gydant įvairias ligas. Šiuo metu visame sparčiai didėjant natūralių produktų paklausai, plinta ir vaistinių augalų vartojimas. Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis 37–70 tūkstančių augalų rūšių vartojami kaip vaistiniai augalai, tai 14–28 proc. visų augalų rūšių skaičiaus [3].

Paprastoji kiaulpienė (Taraxacum officinale F.H.Wigg.) – daugiametis Astrinių (Asteraceae Bercht. & J. Presl.) šeimos žolinis vaistinis augalas. Nors kiaulpienės garsėja kaip vienos iš labiausiai atpažįstamų piktžolių, liaudies medicinoje jos vartojamos kaip gydomųjų savybių turintys augalai. Paprastųjų kiaulpienių žaliavos pasižymi antioksidantiniu, priešuždegiminiu, virškinimą ir apetitą gerinančiu, šlapimą varančiu, tulžies išsiskyrimą, kepenų ir kasos fermentų veiklą skatinančiu, poveikiais. Farmakologinį aktyvumą lemia sudėtyje esantys biologiškai aktyvūs junginiai – flavonoidai, fenolinės rūgštys, kartumynai, kumarinai, karotinoidai, inulinas, vitaminai, mikroelementai, riebalų rūgštys [4,5,6,7]. Fenoliniai junginiai –ypač svarbūs, kadangi pasižymėdami antioksidantiniu aktyvumu, saugo organizmo ląsteles nuo žalingo laisvųjų radikalų poveikio, kuris siejamas su įvairių ligų atsiradimu. Laisvųjų radikalų, susidarančių normalios medžiagų apykaitos proceso metu, visiškai išvengti negalima. Tačiau galima sumažinti jų kiekį ir žalingą poveikį stiprinant antioksidantinę organizmo sistemą natūraliais antioksidantais [8,9].

Fenolinių junginių sudėties kiekybinis tyrimas ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas yra svarbūs, norint įvertinti žaliavos kokybę, ir galimybę pritaikyti preparatų, skirtų sveikatinimo tikslams, gamybai. Aktyvių junginių koncentracija augale ir atskirose jo dalyse skiriasi priklausomai nuo vaistinės augalinės žaliavos (VAŽ) rinkimo laiko, apdorojimo ir paruošos būdo, augimo vietos, meteorologinių ir kitų veiksnių [3,10]. Kadangi T. officinale lapų ir žiedynų antioksidantinį aktyvumą lemia fenoliniai junginiai, svarbu nustatyti optimalų ekstrakcijos tirpiklį ir metodą, užtikrinantį didžiausią šių biologiškai aktyvių medžiagų išeigą. Tikslinga įvertinti T. officinale lapuose ir žiedynuose esančių fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą vegetacijos laikotarpiu ir pasiskirstymą skirtingose augimvietėse augančių augalų žaliavose, taip suteikiant informacijos apie optimalų žaliavos rinkimo laiką ir perspektyvias vietoves kokybiškos paprastųjų kiaulpienių lapų iš žiedynų žaliavos paruošoms. Taip pat labai svarbu identifikuoti T. officinale žaliavose vyraujančias pagrindines veikliąsias medžiagas. Žinant jų sukeliamą efektą, galima pritaikyti tam tikru poveikiu pasižyminčių preparatų gamybai.

Tačiau veikliųjų junginių, atsakingų už farmakologinį poveikį, kiekybinė sudėtis tyrinėta nedaug. Nėra duomenų susijusių su atskirų augalo organų rinkimo laiko ir skirtingų augimviečių įtaka kaupiamam junginių kiekiui.

Šiame darbe pirmą kartą nustatytas suminio fenolinių junginių, flavonoidų, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimas vegetacijos metu ir skirtingose vietovėse rinktose T. officinale lapų ir žiedynų žaliavose. Pirmą kartą atliktas kiekybinis biologiškai aktyvių junginių sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas Lietuvos teritorijoje rinktų paprastųjų kiaulpienių lapų ir žiedynų žaliavų ėminiuose.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastųjų kiaulpienių (T. officinale F.H.Wigg.) lapų ir žiedynų ekstraktų fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą augalų vegetacijos metu ir tarp skirtingų augimo vietovių.

Darbo uždaviniai:

1. Parinkti tinkamiausią T. officinale augalinės žaliavos ekstrakcijos tirpiklį ir optimalias ekstrakcijos metodo sąlygas, užtikrinančius didžiausią fenolinių junginių išeigą.

2. Įvertinti suminio fenolinių junginių, flavonoidų, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo įvairavimą T. officinale lapuose vegetacijos metu.

3. Įvertinti suminio fenolinių junginių, flavonoidų, hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio bei antioksidantinio aktyvumo įvairavimą T. officinale žiedynuose vegetacijos metu.

4. Įvertinti individualių fenolinių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį T. officinale lapuose ir žiedynuose bei įvertinti jos įvairavimą vegetacijos metu.

5. Nustatyti skirtingose augimvietėse surinktų T. officinale lapų ir žiedynų kaupiamą fenolinių junginių kiekį ir antioksidantinį aktyvumą.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Paprastosios kiaulpienės botaninis apibūdinimas, sistematika, augimo sąlygos,

prisitaikymas prie aplinkos ir paplitimas

Paprastoji kiaulpienė (lot. Taraxacum officinale F.H. WIGG.) astrinių (Asteraceae Bercht. & J.Presl) šeimos, kiaulpienių (Taraxacum F.H. WIGG.) genties vaistinis žolinis augalas. Anglų kalboje dažniausiai sutinkama common dandelion pavadinimu [6,11,12]. Kiaulpienės genties pavadinimas Taraxacum gali būti kilęs iš arabų kalbos žodžio Tharakhchakon, reiškiančio – „karti žolė“, arba graikų kalbos: taraxo – „sutrikimas“, akos – „vaistas“ [4,13,14]. Officinale reikšmė lotynų kalboje – „vaistas“ arba nurodoma, kad tai yra „naudojama medicinoje“, „parduodama rinkoje“, „oficialus“ [15,16]. Pavadinimas Dandelion kilęs iš prancūzų kalbos frazės Dent de lion, kuri reiškia „liūto dantis“. Tai gali būti nuoroda į nelygios formos augalo lapiją [4,13].

Sistematika

Karalystė: Augalai (Plantae)

Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Astražiedžiai (Asteridae) Eilė: Astriečiai (Asterales)

Šeima: Astriniai (Asteraceae) Gentis: Kiaulpienė (Taraxacum)

Rūšis: Paprastoji kiaulpienė (Taraxacum officinale F.H. Wigg) [17].

rugsėjį, spalį ar net lapkritį [11]. Tie patys augalai, pražydę antrą kartą, išaugina kitokius vaisius, dažniausiai neturinčius kai kurių rūšiai būdingų požymių [5]. Sėklos subręsta praėjus mėnesiui po žydėjimo. Vienas augalas užaugina iki 8000 sėklų, kurias išnešioja vėjas (amenochorija) Vaisius – 3–4 mm ilgio šviesiai rudas lukštavaisis su skristuku. Augalui nužydėjus, žiedynas (graižas) atrodo lyg pūkų kamuoliukas [11,12,14].

T. officinale gimtine laikoma Europa, tačiau ji plačiai paplitusi ir šiltesnėse Šiaurės pusrutulio klimato zonose, Azijoje, Sibire [6,7,11,12]. Auga dirvožemyje, kurio pH svyruoja nuo 4,8 iki 7,6 ir daugiau, geriausiai klesti drėgname, azotu turtingame, kokybiškame priemolyje [16, 14]. Augalas priskiriamas mezofitams – mėgsta vidutinio drėgnumo dirvas [19]. Įsitvirtinę T. officinale augalai yra atsparūs sausrai, o jauni – labai jautrūs ir turi ribotas galimybes įsikurti stambios tekstūros ar greitai džiūstančiuose dirvožemiuose [16].

Paprastoji kiaulpienė pasižymi gebėjimu prisitaikyti prie šviesos, todėl gali augti tiek stipriai saulės apšviestose vietose, tiek medžių ar pastatų šešėlyje (lapai paprastai plonesni) [16]. Vėsioje ir sausoje augimo vietoje, arba glaudžiai nupjautoje vejoje, lapai sudaro prigludusią prie pat žemės paviršiaus rozetę. Pridengdami dirvožemio paviršių apsaugo jį nuo fizinės vandens transpiracijos [19]. Šiltoje ar gausiai apsuptoje aukštesnės augmenijos augimo vietoje, lapai stovi stačiais kuokštais. Manoma jog dantyti lapai, turintys kartaus balto latekso padeda atgrasinti nuo besiganančių gyvulių [16,19] Žiedynai jautrūs šviesai ir orui – ryškioje saulės šviesoje, esant sausam orui – atsiveria, tamsiu paros metu ar „niūriomis“ dienomis, lyjant – užsiveria [8,12,1].

T. officinale lapai ir šaknys kaupia metalus: Br, Cd, Co, Cu, Cr, Hg, Mn, Pb, Sb, Se ir Zn, yra plačiai paplitusi, todėl yra geras aplinkos taršos rodiklis ir dažnai naudojamos kaip bioindikatorius. Didėjant užterštumui sėklų ilgis ir svoris mažėja, tačiau didėja pačių sėklų skaičius siekiant prisitaikyti prie nepalankių sąlygų ir išgyventi [16].

Paprastoji kiaulpienė gausiai paplitusi visoje Lietuvoje. Būdingas mindomų vietų augalų bruožas – prisitaikymas prie dirvožemio kietumo (sutrypimo), taip pat tiesioginio žmogaus ir gyvulių mechaninio poveikio [19]. Pagrindinės augimo vietos: takai, kiemai, miestų ir kaimų mindomos aikštės, kelių pakraščiai, ganyklos, pievos, šlaitai, sodai, daržai [11,19].

1.2. T. officinale vaistinė augalinė žaliava ir kaupiamos biologiškai aktyvios

medžiagos

T. officinale fitocheminė sudėtis skiriasi tarp augalo žiedynų, lapų ir šaknų. Ji priklauso nuo sezono, kurio metu ji surinkta, klimato, taip pat įtakos turi ekologiniai veiksniai, tokie kaip augimo vieta, užterštumas [7,10].

Šaknyse kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos. Terpenai. Eudesmanolido tipo seskviterpeniniai laktonai: tetrahidroridentinas B, taraksakolido-O-β-gliukopiranozidas; guaianolido tipo seskviterpeniniai laktonai: 11β,13-dihidrolaktucinas, ikserinas D; germakranolido tipo seskviterpeniniai laktonai: taraksininės rūgšties β-gliukopiranozidas ir jo darinys – 11,13-dihidrotaraksicinininės rūgšties β-D-gliukopiranozidas (ainsliozidas). Triterpenai: taraksasterolis, β-taraksasterolis, jų 16-hidroksi junginiai: arnidolis ir faradiolis, α–amirinas, β-amirinas, β-sitosterolis, β - sitosterolio- β- D- gliukopiranozidas, stigmasterolis [7,14,21,22]. Fenoliniai junginiai. Fenolinės rūgštys: kavos rūgštis, kavos rūgšties ir vyno (tartaro) rūgšties esteriai – kaftaro rūgštis (monokafeoiltartaro rūgštis); cikoro rūgštis, kavos rūgšties ir chino rūgšties esteris – chlorogeno rūgštis (3–kafeoilchino rūgštis) ir jos izomeras kriptochlorogeno rūgštis (4-kafeoilchino rūgštis), p-kumaro rūgštis, vanilino rūgštis, siringo rūgštis, protokatecho rūgštis, ρ-hidroksibenzenkarboksi rūgštis, ρ–hidroksifenilacto rūgštis. Kumarinai: umbeliferonas, eskuletinas, skopoletinas, eskulinas, cikorijinas [7,11,14,21]. Be šių medžiagų šaknys gausiai kaupia inuliną, karotinoidus (liuteinas), riebalų rūgštis (miristino rūgštis), mineralus, cukrus (fruktozė, gliukozė, manitolis), vitaminus, gleives, pektinines medžiagas [7,21,22,23].

Lapuose kaupiamos biologiškai aktyvios medžiagos. Terpenai. Seksviterpeniniai laktonai: taraksininės rūgšties β-D gliukopiranozidas, 11,13-dihidrotaraksininės rūgšties β-D-gliukopiranozidas ir triterpenai: β-sitosterolis, β-amirinas. [7;21]. Fenoliniai junginiai. Fenolinės rūgšys: kavos rūgštis, kaftaro rūgštis, chlorogeno rūgštis, cikoro rūgštis, p-hidroksifenilacto rūgštis. Flavonoidų glikozidai: liuteolino-7-O-gliukozidas (cinarozidas), liuteolino-7-O-rutinozidas (skolimozidas), izoramnetino-3-O-gliukozidas, kvercetino-7-O-gliukozidas (kvercimeritrinas), ir apigenino-7-O gliukozidas (apigetrinas). Kumarinai: cikorijinas ir eskulinas. Lapams kartų skonį suteikia taraksininės rūgšties β-D-gliukopiranozidas, 11,13-dihidrotaraksininės rūgšties β-D-β-D-gliukopiranozidas, p-hidroksifenilacto rūgštis, β-sitosterolis. [7,14,21]. Taip pat lapuose gausu vitaminų (B1, B2, B5, B6, B12, C, D) ir mikroelementų (cholino, geležies, silicio, magnio, natrio, kalio, cinko, mangano, vario, ir fosforo), beta karotino (daugiau negu morkose), ksantofilų, chlorofilo [7;11,21,23].

1.3. T. officinale biologinis poveikis

Poveikis inkstų ir elektrolitų pusiausvyrai. T. officinale yra natūralus diuretikas, didinantis šlapimo gamybą, skatinant druskų ir vandens išsiskyrimą. Kaip diuretinė priemonė nuo seno intensyviai naudojama tradicinėje liaudies medicinoje, o dabar ir šiuolaikinėje fitoterapijoje Europoje, Azijoje ir Amerikoje [7]. Prancūzijoje ir Italijoje trivialūs šio augalo pavadinimai "pissenlit" ir "piscialetto" suteikia užuominą į gebėjimą provokuoti enurezę [7,13]. Eksperimentinių tyrimų su pelėmis ir žiurkėmis metu, tiriant vandeninių ekstraktų gautų iš paprastųjų kiaulpienių lapų ir šaknų diuretinį poveikį, nustatyta, jog vandeninio paprastųjų kiaulpienių lapų ekstrakto diuretinis poveikis yra stipresnis nei vandeninio šaknų ekstrakto ir yra prilyginamas furozemido stiprumui [12,23,24,25]. Gausus paprastosiose kiaulpienėse esantis kalio kiekis pakeičia diurezės metu prarandamą kalį todėl nėra galimo šalutinio poveikio, tokio kaip kepenų koma ar kraujotakos kolapsas, kuris galimas furozemidui ar kitiems sintetiniams diuretikams [11,25]. Įrodyta, jog T. officinale turi didesnį diuretinį veikimą nei kiti tuo pasižymintys augalai (dirvinis asiūklis ar paprastasis kadagys) [7,12,23,24]. Iki šiol nėra išsamių pagrįstų mokslinių tyrimų su žmonėmis, vertinančių diuretinį paprastųjų kiaulpienių poveikį [12,24]. Clare ir kiti 2009 metais atlikto pirmojo tyrimo su žmonėmis metu nustatyta, kad etanolinis T. officinale lapų ekstraktas pasižymi reikšmingu diuretiniu poveikiu, padidina šlapimo kiekį ir šlapinimosi dažnumą [26].

Turėdama diuretinių savybių, T. officinale gali būti naudojama hipertenzijai, edemoms, priešmenstruaciniam sindromui, necukriniam diabetui, staziniam širdies nepakankamumui, inkstų ligoms, šlapimo takų infekcijoms, vandens susilaikymui organizme, glaukomai, kepenų ligoms ir osteoporozei gydyti [12,23,24,25].

esant kepenų perkrovai, tulžies latakų uždegimui, hepatitui, tulžies pūslės akmenligei bei geltai, gerina riebalų (įskaitant cholesterolį) apykaitą organizme [23,25,27]. Literatūros duomenimis, didelė inulino koncentracija (iki 40%) esanti kiaulpienės šaknyse pasižymi prebiotiniu veikimu [12,13,14] Tai yra mitybinė probiotikų (Lactobacilli ir Bifidobacteria) medžiaga, padedanti jiems įsitvirtinti žarnyne, skatina jų augimą ir padeda atkurti normalią žarnyno mikroflorą [7,14,28].

Antidiabetinis poveikis. Paprastoji kiaulpienė pasižymi hipoglikeminėmis savybėmis [23]. Šaknyse esanti skaidulinė medžiaga – inulinas – gali reguliuoti cukraus kiekį kraujyje [25]. Lėtindamas skrandžio ištuštinimą ir gliukozės resorbciją į kraują, gali sumažinti glikemiją ir padėti išlaikyti pastovų cukraus kiekį kraujyje po valgio, todėl gali būti puiki priemonė 2 tipo cukrinio diabeto profilaktikai [28]. Atlikto tyrimo su cukrinio diabeto neturinčiais triušiais metu nustatytas didžiausias cukraus kiekio sumažėjimas (2 g/kg paprastųjų kiaulpienių šaknų), atitinkantis 65% efekto, sukelto 500 mg/kg kūno svorio tolbutamido dozės [28]. In vitro ir su gyvūnais atliktais tyrimais įrodytas paprastųjų kiaulpienių antžeminės dalies kasos α-amilazę ir α-gliukozidazę slopintys poveikiai [23,29, 30]. α-amilazė ir α-gliukozidazė - pagrindiniai fermentai, dalyvaujantys angliavandenių virškinime iki gliukozės molekulių [18]. T. officinale pasižymėdama šiuos kasos fermentus inhibuojančiu poveikiu, lėtinant ar stabdant angliavandenių skaidymą ir gliukozės absorbciją gali sumažinti po valgio pasireiškiančią hiperglikemiją [7,18]. De Sales P.M. ir kiti Brazilijoje atlikto tyrimo duomenimis, paprastosios kiaulpienės žolės kasos α-amilazę slopinantis poveikis svyruoja nuo 20% iki 45% [29]. Didžiausią kasos α-amilazę inhibuojantį poveikį turi eskulinas ir chlorogeno rūgštis, mažesniu slopinančiu poveikiu pasižymi liuteolinas, liuteolino 7-O-gliuukozidas ir apigenino-7-gliukozidas [29,23,30].

Hipolipideminis ir antiaterogenins poveikiai. T. officinale pasižymi teigiamu poveikiu širdies ir kraujagyslių ligų rizikos veiksniams tokiems kaip nutukimas, hiperlipidemija, hipertrigliceridemija ir hipercholesterolemija [7]. Atlikto tyrimo aterogenine dieta šertomis pelėmis metu nustatyta, kad vandeniniai ir etanoliniai kiaulpienių šaknų ir lapų ekstraktai po 6 savaičių gydymo reikšmingai sumažino trigliceridų ir bendrojo cholesterolio kiekį plazmoje ir kepenyse. Priešingai, bendras lipidų, trigliceridų ir bendrojo cholesterolio kiekis išmatose buvo gerokai padidėjęs [7]. Korėjos mokslininkų Zhang J. ir kiti in vitro ir in vivo atliktais tyrimais įrodytas stiprus paprastųjų kiaulpienių kasos fermentą lipazę slopinantis poveikis, kuris priskiriamas flavonoidams [31]. In vitro atlikto tyrimo rezultatai parodė, kad T. officinale kasos lipazę slopinantis poveikis atitiko 90,2% orlistato poveikio [31]. Šiuo metu kasos lipazės inhibitorius – orlistatas – JAV vaistų ir maisto kontrolės administracijos patvirtintas kaip efektyvus ir saugus vaistas nutukimui gydyti [32].

slopina MCF–7/AF krūties vėžio ląstelių invaziją ir sukelia kraujo vėžinių ląstelių apoptozę. Nustatytas antžeminių T. officinale dalių (lapų ir žiedynų) angiogenezę slopinantis poveikis [7,13,33]

Antivirusinis poveikis. Paprastųjų kiaulpienių ekstraktai pasižymi antivirusiniu poveikiu, kuris priskiriamas fenoliniams junginiams. In vitro atlikto tyrimo metu įrodytas aktyvumas prieš žmogaus Herpex Simplex 1 tipo virusą (HHSV – 1) ir paragripo virusą. Poveikis prieš šiuos virusus priskiriamas chlorogeno ir kavos rūgštims [12,34]. Paprastųjų kiaulpienių žolės vandeninis ekstraktas pasižymi stipriu antivirusiniu poveikiu prieš žmogaus imunodeficito (ŽIV–1) retrovirusą [35,36]. Nustatyta, kad cikoro rūgštis slopina ŽIV integrazę ir trukdo ŽIV grandinės replikaciją [37]. Taip pat yra duomenų susijusių su paprastųjų kiaulpienių poveikiu prieš gripo viruso dauginimąsi [38].

1.4. Fenoliniai junginiai. Jų struktūros ypatumai ir klasifikacija

Fenoliniai junginiai yra viena iš gausiausių ir plačiausiai paplitusių fitocheminių medžiagų grupių visoje augalų karalystėje [10]. Tai augaluose vykstančių biocheminių procesų antriniai metabolitai [2,39]. Visų fenolinių junginių struktūros pagrindas – aromatinis žiedas su viena ar daugiau hidroksilo grupių. Remiantis aromatinių žiedų skaičiumi molekulėje skiriami fenoliai ir polifenoliai. Pagal struktūrą gausi fenolinių junginių klasė klasifikuojama į fenolius, taninus (hidrolizuojami ir kondensuojami), kumarinus, stilbenus, fenolines rūgštis ir flavonoidus [40,41]. Šiuo metu žinoma daugiau nei 8000 skirtingos struktūros fenolinių junginių [10].

Fenoliniai junginiai sintetinami ir randami daugelyje aukštesniųjų augalų audinių normaliu augalų vystymosi metu nuolat. Jie svarbūs augimo, reprodukcijos, pigmentacijos ir prisitaikymo prie nepalankių aplinkos salygų (abiotiniai ir biotiniai stresoriai) metu [2,41]. Šių junginių sintezė ypač sustiprėja kaip atsakas į fizines traumas, infekcijas, klimato, drėgmės, dirvožemio ar kitus poveikius, sukeliančius augalui stresą [2,39,42]. Jie atlieka gynybos (nuo žolėdžių gyvūnų, mikrobų, virusų, konkuruojančių augalų) ir signalinę (pritraukia apdulkintojus ir sėklų išnešiotojus) funkcijas, dalyvauja apsaugoje nuo žalingų UV – B spindulių ir oksidantų [2;10].

Fenoliniai junginiai yra neatsiejama žmogaus ir gyvūnų mitybos dalis. Jų gausu augaliniuose maisto produktuose, tokiuose kaip vaisiai, daržovės, grūdai, ankštiniai augalai bei augalinės kilmės gėrimuose: vyne, arbatoje, kavoje ir yra naudingi žmogaus sveikatai [10,41,43]. Pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu, mažina oksidacinio streso sukeltus audinių pažeidimus, susijusius su lėtinių ligų atsiradimu [10], antivirusiniu, priešuždegiminiu, antimikrobiniu, hipotenziniu, priešvėžiniu, teigiamu širdies ir kraujagyslių sistemai poveikiais [8].

Sintetinami iš aromatinių amino rūgščių, fenilalanino, tirozino ir acetato liekanų. Kaupiasi lapų, vaisių, šaknų, žiedų audiniuose. Suteikia skonį, kvapą ir spalvą [45,46].

Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginiai [10,47]. Pagrindinis šių junginių struktūros bruožas – flavano branduolys, kurį sudaro 15 anglies atomų. Molekulėje yra 2 benzeno žiedai (A ir B) sujungti trijų anglies atomų fragmentu, kuris su deguonies atomu sudaro heterociklinį pirano arba pirono žiedą (C) [10,45,47]. (1 pav.)

1 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas: A; B – benzeno žiedai, C– pirano žiedas.

Priklausomai nuo B žiedo prisijungimo padėties, flavonoidai gali būti skirstomi į tris klases: flavonoidai (2-fenilbenzopiranai), izoflavonoidai (3-benzopiranai) ir neoflavonoidai (4-benzopiranai) [22]. Remiantis chemine sandara ir C žiedo oksidacijos laipsniu flavonoidai skirstomi į šias grupes: flavonoliai, flavonai, flavononai, izoflavonai, flavan-3-oliai, flavanonoliai, flavan-3,4-dioliai, flavanoliai, antocianidinai, chalkonai, auronai, biflavonoidai, neoflavonoidai [26,29,61]. Individualūs skirtumai šių poklasių viduje atsiranda dėl skirtingų pakaitų A ir B žieduose – fenolinių hidroksilo grupių, kurios gali būti metilintos, acetilintos, prenilintos ar sulfatintos [40,41].

Flavonoidai augaluose aptinkami aglikonų ir glikozidų bei C-glikozidų pavidalu. O-glikozidinimas dažniausiai vyksta 3-ioje, 5-oje ir 7-oje padėtyse. C-glikozidai susidaro rečiau, cukrus per C atomą jungiasi 6-oje arba 8-oje padėtyse. Galimi prisijungę monosacharidai: gliukozė, D-galaktozė, D-ksilozė, L-ramnozė, L-arabinozė [8,48].

Fenolinės rūgštys – kita svarbi fenolinių junginių grupė. Augaluose randamos laisvos, esterifikuotos arba glikozidintos formos [40,50]. Natūraliai egzistuojančios fenolinės rūgštys skirstomos į hidroksibenzenkarboksi rūgšties ir į hidroksicinamono rūgšties darinius [8,40].

2 pav. Hidroksibenzenkarboksi rūgšties darinių struktūros pagrindas

Hidroksibenzenkarboksi rūgščių kiekis augaliniuose maisto produktuose labai mažas išskyrus tam tikrus raudonuosius vaisius, juoduosius ridikus ir svogūnus, kuriuose šių junginių kiekis siekia keliasdešimtis mikrogramų kilograme šviežios žaliavos. Hidroksibenzenkarboksi rūgštys yra sudėtingų struktūrų, tokių kaip ligninai ar hidrolizuojamieji taninai sudedamosios dalys (galotaninai randami manguose, elagotaninai – braškėse, avietėse, gervuogėse) [50].

Hidroksicinamono rūgšties dariniams būdinga C6-C3 struktūra (3 pav.), o pagal aromatinio žiedo funkcines -OH ir CH3O- grupes skiriamos cinamono, p-kumaro, kavos, ferulo, sinapo rūgštys [40,41].

3 pav. Hidroksicinamono rūgšties darinių struktūros pagrindas

1.5. Flavonoidų ir fenolinių rūgščių poveikis

Flavonoidai ir fenolinės rūgštys yra neatskiriama žmogaus mitybos dalis ir atlieka svarbų vaidmenį sveikatos palaikyme, ligų prevencijoje bei gydyme. Biologiniai ir farmakologiniai poveikiai dažniausiai sukeliami dėl tam tikrų fermentų moduliacijos (heksokinazės, aldozės reduktazės, fosfolipazės C, baltymų kinazės C, ciklooksigenazės, lipooksigenazės, NADPH oksidazės, ksantino oksidazės) ir antioksidantinio aktyvumo [41].

Priešnavikinis poveikis. Priešnavikinis veikimas glaudžiai siejamas su antioksidantiniu aktyvumu. Reaktyviosios deguonies formos gali pažeisti ląstelių DNR taip sukeliant mutacijas ir vėžio vystymąsi [39]. Įrodyta, kad flavonoidais ir fenolinėmis rūgštimis praturtinta dieta sumažina krūtinės, burnos, prostatos, gaubtinės žarnos, odos, kiaušidžių, kraujo vėžio atsiradimo riziką ir slopina jo vystymąsi. [39,42]. In vitro įrodytas polifenolių antiproliferacinis poveikis įvairių navikų ląstelių linijoms. Nustatytas flavonoidų antiproliferacinis poveikis storosios žarnos karcinomos ląstelėms, sukeliant jų apoptozę [39]. Tyrimų duomenimis šie junginiai slopina patologinę nekontroliuojamą

angiogenezę, kurios metu, formuojantis naujoms kraujagyslėms, navikas aprūpina save krauju, būtinu jo proliferacijai, migracijai ir metastazavimui. Teigiama, kad angiogenezės slopinimas susijęs su proteinkinazės inhibavimu [42,47,51].

Priešuždegiminis poveikis. Flavonoidai ir fenolinės rūgštys gali veikti imuninės sistemos funkcijas ir uždegimo ląsteles. Antiuždegiminis poveikis įrodytas in vitro ir in vivo [52] Kai kurie junginiai gali slopinti arachidono rūgšties išsiskyrimą ir metabolizmą inhibuojant fosfolipazės A2 (PLA2), ciklooksigenazės (COX) ir 5 lipoksigenazės (5-LOX) fermentus, už azoto oksido (NO) gamybą atsakingą fermentą azoto oksido sintetazę (iNOS). Šių fermentų slopinimas mažina pagrindinių uždegimo procese dalyvaujančių signalinių molekulių: arachidono rūgšties, leukotrienų, prostaglandinų, ir azoto oksido kiekį [52]. Uždegimą slopinantis poveikis galimas ir dėl tirozino kinazės, histamino išsiskyrimo iš putliųjų ląstelių, T limfocitų proliferacijos slopinimo, neutrofilų degranuliacijos. Nustatyta, kad flavonoidų fermentus inhibuojančiam poveikiui svarbi struktūra. Dviguba jungtis tarp 2 ir 3 anglies atomų C žiede, katecholio arba 4 -– hidroksi grupės buvimas B žiede lemia tai, jog flavonai ir flavonoliai pasižymi stipriausiu antiuždegiminiu poveikiu. 3-OH grupės buvimas lemia didesnį LOX slopinamąjį poveikį, o šios grupės nebuvimas – COX [37,51,52,53].

[55,57]. Flavonoidų glikozidai išskirti iš Ocimum basilicum sumažino opinį indeksą ir skrandžio rūgšties ir pepsino sekreciją žiurkėse, kurioms aspirinu sukelta opa [46]. Kavos rūgštis, ferulo rūgštis, p-kumaro rūgštis ir cinamono rūgštis žymiai sumažino etanolio, indometacino ir fizinio streso sukeltas opas [58]. Kai kurie flavonoidai pasižymi anti-Helicobacter pylori aktyvumu, todėl turi teigiamą poveiki H.pylori sukeltam gastritui gydyti [55,80].

Antidiabetinis poveikis. Flavonoidų ir fenolinių rūgščių cukraus kiekį mažinantis poveikis siejamas su maistinių angliavandenių absorbcijos mažinimu žarnyne, moduliuojant gliukozės metabolizme dalyvaujančius fermentus, β ląstelių funkcijos ir insulino veikimo gerinimu, insulino sekrecijos skatinimu bei antioksidantinėmis ir priešuždegiminėmis savybėmis [49]. Šių junginių veiksmingumas gerai ištirtas in vitro, gyvūnų modeliuose ir kai kurių klinikinių tyrimų metu. Skirtingi junginiai pasižymi skirtingais hipoglikeminiais mechanizmais. Pavyzdžiui kvercetinas ir genisteinas skatina kepenų salelių regeneracija ir stimuliuoja insulino išsiskyrimą, ferulo rūgštis didina insulino kiekį diabetinių žiurkių plazmoje aktyvinant gliukokinazės veiklą ir glikogeno sintezę kepenyse [46,49,59]. Flavonoidai gali slopinti fermentą aldozės reduktazę (kuris konvertuoja gliukozę iki sorbitolio), kuri, manoma, susijusi su diabeto komplikacijomis (katarakta neuropatija, širdies ligos ir retinopatija) [42].

Antioksidantinis poveikis. Tai svarbiausia ir geriausiai fenolines rūgštis ir flavonoidus apibūdinanti savybė. Stiprus antioksidantinis šių polifenolių aktyvumas įrodytas in vitro ir in vivo. Didžioji dalis antioksidantinio aktyvumo stiprumu pralenkia vitaminą C, vitaminą E ar β-karotiną [8, 42,51,]. Gebėjimas neutralizuoti laisvuosius radikalus glaudžiai susijęs su šių junginių struktūros ypatybėmis. Fenolinių rūgščių aktyvumas priklauso nuo laisvų -OH grupių skaičiaus ir pozicijos žiede atsižvelgiant į -COOH grupes [60]. Didėjant -OH grupių molekulėje skaičiui antioksidantinis aktyvumas didėja, tačiau šios grupės pakeitimas į -OCH3 aktyvumą mažina ( galo r. > siringo r.) [60]. Taip pat nustatyta, kad Hidroksicinamono rūgšties dariniai pasižymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei hidroksibenzkarboksi rūgšties dariniai [41,60], kadangi konjūguota dviguba jungtis šoninėje CH=CH-COOH grupėje užtikrina didesnę H atidavimo galimybę ir laisvojo radikalo stabilizavimą nei hidroksibenkarboksi rūgštyse esanti -COOH grupė [60]. Flavonoidų laisvųjų radikalų neutralizavimas susijęs su 3-ioje ir 4-oje B žiedo pozicijose esančiomis OH grupėmis, dviguba jungtimi C žiede tarp 2 ir 3 anglies atomų ir karbonilo grupe esančia 4 padėtyje. Taip pat svarbios laisvos -OH grupės C žiedo 3-ioje ir A žiedo 5-oje padėtyse. Nustatyta, jog cukraus molekulė sumažina flavonoidų aktyvumą [41,42,60]. Flavonai ir katechinai aktyviausiai neutralizuoja laisvuosius radikalus [51] Antioksidantinis aktyvumas yra pagrindas daugelio efektų, lemiančių flavonoidų ir fenolinių rūgščių teigiamą poveikį gydant daugumą ligų [53].

Taip pat flavonoidai ir fenolinės rūgštys pasižymi, antialerginiu, estrogeniniu,

1.6. Laisvieji radikalai, antioksidantai ir antioksidantinio aktyvumo nustatymo

metodai

Normaliai funkcionuojančiame organizme vykstančios oksidacijos/redukcijos reakcijos yra įprastas medžiagų apykaitos procesas. Vidinių mechanizmų metu (mitochondrijų kvėpavimo grandinė, autooksidacija, fermentinės reakcijos, fagocitozė) kaip šalutiniai apykaitos produktai neišvengiamai susidaro nedideli kiekiai reaktyviųjų deguonies formų (ROS) ir reaktyviųjų azoto formų (RNS) [9,61]. Šie junginiai skirstomi į radikalus ir neradikalinius junginius (1 lentelė) [9,62]. Dažnai reaktyvių deguonies formų (ROS) sąvoka apima ir reaktyvias azoto formas (RNS) [62]. Tai yra laisvieji radikalai, kurie priklausomai nuo koncentracijos ir susidarymo vietos biologinėse sistemose gali būti ir naudingi ir žalingi [9,61]. Nedideli kiekiai svarbūs įvairiems fiziologiniams procesams – dalyvauja kaip antriniai signalo perdavėjai, kraujo spaudimo reguliavime, apsaugoje nuo mikroorganizmų, tiroidinių hormonų sintezėje, ląstelių dauginimesi ir kt. [9,43]. Patogeninė būklė ar egzogeniniai šaltiniai (UV spinduliuotė, stresas, cigarečių dūmai, jonizuojančioji radiacija, ozonas, oksiduotas maistas, vaistai ir kiti ksneobiotikai) gali paskatinti per didelį reaktyviųjų deguonies formų susidarymą ir sukelti žalingą organizmui būklę – oksidacinį stresą [9,62].

1 lentelė. Reaktyviųjų deguonies formų (ROS) ir reaktyviųjų azoto formų (RNS) klasifikacija Reaktyviosios deguonies formos Reaktyviosios azoto formos

Radikalai Radikalai

O2 - ● Superoksido jono radikalas NO2 ● Azoto dioksido radikalas

HO ● Hidroksilo radikalas NO ● Azoto monoksido radikalas

RO2● Peroksilo radikalas

HO2 ● Hidroperoksilo radikalas

RO ● Alkoksilo radikalas

Neradikaliniai junginiai Neradikaliniai junginiai

H2O2 Vandeilio peroksidas ONO2 - Peroksinitrito anijonas

HOCL Hipochlorito rūgštis N2O4 Diazoto tetraoksidas

HOBR Hipobromito rūgštis

O3 Ozonas

1_O

2 Singletinis deguonis

Evoliucijos eigoje gyvi organizmai įgavo galimybę apsisaugoti nuo reaktyvių deguonies formų sukeliamų pažeidimų [9]. Medžiagos, galinčios apsaugoti biomolekules nuo oksidacijos vadinamos antioksidantais. Atitinkamas terminas – prooksidantai – suteiktas ląstelę oksiduojančioms medžiagoms [9,28].

Žmonės ir gyvūnai turi sudėtingą integruotą ląstelių antioksidantinę sistemą, kurią sudaro fermentiniai ir nefermentiniai oksidantai (2 lentelė) [9,43]. Paprastai, esant nedideliam ROS/RNS kiekiui, antioksidantiniai gynybos mechanizmai palaiko prooksidantų/antioksidantų pusiausvyrą ir biomolekulės apsaugomos nuo oksidacinio pažeidimo [9,61]. Galimas radikalų susidarymo slopinimas, neutralizavimas ar irimo skatinimas [23,62]. Tačiau esant laisvųjų radikalų gamybai didesnei nei antioksidantinis pajėgumas juos neutralizuoti ir pašalinti, vystosi prooksidatų/antioksidantų disbalansas, kurio rezultatas – oksidacinis stresas (OS). Nenukenksminamos reaktyvios deguonies formos ima veikti organizmo ląsteles patogeniškai. [9,43].

Laisvųjų radikalų, susidarančių normalios medžiagų apykaitos proceso metu, visiškai išvengti negalima. Tačiau galima sumažinti jų kiekį ir žalingą poveikį stiprindami antioksidantinę organizmo sistemą natūraliais antioksidantais. [9,53].

2 lentelė. Gyvų organizmų antioksidantinės sistemos klasifikacija

Fermentai Nefermentiniai antioksidantai

Endogeniniai antioksidantai Egzogeniniai antioksidantai

Superoksido dismutazė (SOD) Glutationas Vitaminai(vitaminas C, vitaminas E)

Glutationo peroksidazė(GTPx) Šlapimo rūgštis Karotenoidai

Katalazė Trasferinas Mikroelementai (Cinkas, selenas)

Glutationo reduktazė (GTRx) Bilirubinas Fenoliniai junginiai (flavonoidai, fenolinės rūgštys)

Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodus pagal veikimo mechanizmą galima suskirstyti į dvi kategorijas: tyrimai pagrįsti vandenilio atomo perdavimo (HAT) reakcijomis ir tyrimai pagrįsti elektronų perdavimo (SET) reakcijomis. Metodai pagrįsti SET yra labiausiai žinomi, kadangi įvertina antioksidanto gebėjimą redukuoti oksidantą, kuris keičia spalvą. Spalvos pasikeitimo laipsnis priklauso nuo antioksidanto koncentracijos tiriamajame mėginyje [63]. Dažniausiai naudojami metodai antioksidantinės galios nustatymui yra DPPH radikalų surišimo ir ABTS radikalų-katijonų surišimo įvertinimas bei Fe(III) ir Cu(II) jonų redukcinio aktyvumo tyrimas. Visi šie metodai priskiriami elektronų pernaša pagrįstiems antioksidantinės analizės metodams, tačiau skiriasi vienas nuo kito tiek analizės principais tiek reakcijos sąlygomis [64].

ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas. Šis metodas pagrįstas antioksidanto gebėjimu surišti ABTS (2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) radikalus – katijonus. ABTS●+ generuojami ABTS druską veikiant stipriai oksiduojančia medžiaga (kalio permanganatas, kalio persulfatas, mangano oksidas) [65,66]. Vykstant reakcijai bespalvis ABTS reagentas atiduodamas elektroną oksiduojasi į stabilų mėlynai žalios spalvos ABTS● +_{, kuris absorbuojamas esant 415, 645,} 734 ir 815 nm bangos ilgiui [54,66,67]. Po sąveikos su junginiu, turinčiu antiradikalinių savybių, radikalai-katijonai redukuojami į pradinę bespalvę ABTS būseną. Spektrofotometriškai išmatuojamas tirpalo absorbcijos dydis, kuris proporcingas likusio ABTS● + kiekiui [65]. Antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso (vitamino E analogo) ekvivalentu (TE) [67]. ABTS metodas tinkamas ir lipofilinėms ir hidrofilinėms sistemoms ir gali būti naudojamas plataus pH intervale [67,68].

DPPH radikalų surišimo metodas. Tai vienas populiariausių ir dažniausiai taikomas kolorimetrinis antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas. Šis metodas pagrįstas antioksidanto gebėjimu surišti DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) radikalus. DPPH yra tamsiai violetinės spalvos kristaliniai milteliai, sudaryti iš stabilių radikalinių molekulių, absorbuojančių šviesą esant 515 nm bangos ilgiui [63,67]. Priešingai nei ABTS metodikoje, DPPH radikalų nereikia aktyvinti [66,67]. Reakcijos su antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčiu junginių metu susidaro šviesiai geltonos spalvos ne radikalinė DPPH forma. Nustatyta, kad reakcija su vyksta nuo 1 valandos iki 6 valandų. Antiradikalinis aktyvumas gali būti vertinamas spektrofotometriškai nustatant absorbcijos sumažėjimą arba pagal elektronų sukinio rezonansą [65,67,68].

turi vyksta tik rūgštinėje aplinkoje, taip pat negalima nustatyti antioksidantų, kurių veikimas pagrįstas H perdavimu (antioksidantai, struktūroje turintys –SH grupę) [65,67].

2. METODIKA

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas – natūraliai augančių paprastųjų kiaulpienių (Taraxacum officinale F.H.Wigg.) (Asteraceae Bercht. & J.Presl) lapai ir žiedynai, surinkti 2014 metais.

Paprastųjų kiaulpienių lapai ir žiedynai rinkti vegetacijos laikotarpiu, balandžio–spalio mėnesiais Vilniaus rajone, Didžiuosiuose gulbinuose esančioje gamtinėje cenopopuliacijoje. Žiedynai ir lapai surinkti augalo vegetacijos tarpsniuose: skrotelės, butonizacijos, žydėjimo pradžios, masinio žydėjimo, žydėjimo pabaigos, sėklų brandos, masinio atžėlimo ir antro žydėjimo metu. Masinio žydėjimo metu surinkti lapai ir žiedynai iš įvairių Lietuvos augimviečių: Vilniaus rajonas (Didžiųjų gulbinų kaimas), Marijampolės miestas, Naujosios Akmenės rajonas (Ramučių kaimas), Jonavos rajonas („Lokėnėlių“ sodų bendrija), Telšių miestas, Ignalinos rajonas (Mielagėnų miestelis) ir Utenos rajonas (Sirutėnų kaimas) (4 pav.). Surinkta augalinė žaliava išdžiovinta vėsioje, gerai vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje. Visiškai išdžiūvusi žaliava fasuojama ir popierinius maišelius ir laikoma sausoje, tamsioje patalpoje.

4 pav. Paprastųjų kiaulpienių žaliavų teritorinis pasiskirstymas.

2.2. Naudoti reagentai ir tirpikliai

96 proc. V/V etanolis (UAB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), Folin-Ciolteu reagentas („Sigma-Aldrich Chemie“, Šveicarija), natrio karbonatas (Na2CO3) („Roth“,Vokietija), Galo rūgšties monohidratas („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija), Heksametilentetraminas („Roth“, Vokietija); acto rūgštis 99,8–100,5% (CH3COOH) („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija); aliuminio trichlorido heksahidratas (AlCl3 x 6H2 O) („Fluka“, Vokietija), kvercetino dihidratas (C15H10O7 x 2H2O) („Roth“, Vokietija), natrio nitritas (NaNO2) („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija), natrio molidbatas (Na2MoO4) (Alfa Aesar“, Vokietija, natrio hidroksidas (NaOH) (Chempur, Lenkija), 37% vandenilio chlorido rūgštis (HCl) („Sigma-Aldriche Cheme“, Vokietija), ABTS (2,2'-azino-bis-(3 etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) reagentas („Alfa Aesar“, Vokietija), kalio persulfatas (K2S2O8) („Alfa Aesar“,Vokietija), Vario (II) chlorido dihidratas (Cu(II)Cl x 2H2O) („Roth“, Vokietija); amonio acetatas (CH3COONH4 ) („Sigma–Aldriche Chemie“, Vokietija), troloksas ((+-)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetra-metillchromano-2-karboksilinė rūgštis) („Sigma-Aldriche Chemie“, Vokietija), acetonitrilas (ESC grynumo) („Sigma-Aldrich Chemie“, Vokietija), 99,8 proc. trifluoracto rūgštis („Carl Roth Gmbh“, Vokietija), chlorogeno rūgštis, cikoro rūgštis, kaftaro rūgštis, liuteolino-7-O-gliukozidas („Sigma-Aldrich Chemie“, Šveicarija).

2.3. Naudota aparatūra

Analitinės svarstyklės „Sartorius AG Gottingen CP64-OCE“ (Vokietija); nuodžiūvio matuoklis „Swiss Quality“ (Vokietija); ultragarso vonelė „Elmasonic P“ (Elma, Vokietija) ; laboratorinė purtyklė „Laboratory shaker 358S“ (Lenkija); spektrofotometras „Beckman DU – 70“ (Beckman Coulter, JAV). Fitocheminė analizė atlikta atvirkščių fazių efektyviąja skysčių chromatografija. Naudotas chromatografas Waters 2695 Alliance su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, USA).

2.4. Tyrimo metodai:

30 minučių, iš žiedynų – 15 minučių). Procesui pasibaigus, filtruojama pro popieriaus filtrą į naują tamsaus stiklo buteliuką. Pagamintas ekstraktas užsandarinamas ir ženklinamas.

2.4.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas Folin-Ciocalteu metodu

Bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų kiaulpienių ekstraktuose nustatytas Folin-Ciocalteu metodu.

400 µl tiriamojo ekstrakto sumaišoma su 2000 µl darbinio Folin-Ciocalteu reagento (motininis Folin-Ciocalteu tirpalas skiestas distiliuotu vandeniu 10 kartų) ir 1600 µl 7,5% Na2CO3 tirpalo. Gerai sumaišytas mėginys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Palyginamasis tirpalas ruošiamas 400 µl 40 proc. V/V etanolio sumaišant su 2000 µl darbinio Folin-Ciocalteu reagento ir 1600 µl 7,5% Na2CO3 tirpalo. Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 765 nm bangos ilgiui.

Suminis fenolinių junginių kiekis paprastųjų kiaulpienių augalinėje žaliavoje išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui sausos žaliavos (mg/g), naudojantis galo rūgšties kalibracinės kreivės tiesine regresijos lygtimi (y = 12,944x+0,0007; R2 _{= 0,9998; p<0,001).} Apskaičiuojama pagal formulę:

; m a V c GAE   mg/g

c – galo rūgšties koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis g.

2.4.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Suminis flavonoidų kiekis paprastųjų kiaulpienių ekstraktuose buvo nustatomas naudojant aliuminio chlorido reagentą.

chloridas ir urotropinas, vandeniu skiedžiama iki 5 ml. Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 407 nm bangos ilgiui.

Suminis flavonoidų kiekis paprastųjų kiaulpienių augalinėje žaliavoje išreikštas kvercetino ekvivalentais gramui absoliučiai sausos žaliavos (mg/g), pagal kvercetino kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtį (y = 1,7811x-0,007; R2 _{= 0,9972; p<0,001). Apskaičiuojama pagal formulę:}

; m a V c C   mg/g

c – kvercetino koncentracija mg/ml nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

M – tikslus atsvertos žaliavos kiekis g.

2.4.3. Suminio hidroksicinamono rūgšties darinių kiekio nustatymas

spektrofotometriniu metodu

Suminis hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis paprastųjų kiaulpienių žaliavose buvo nustatomas naudojant farmakopėjinį metodą su Arnow reagentu [70].

Kiekvieno tiriamojo ekstrakto analizei paruošiami 2 mėginiai – tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamasis mėginys ruošiamas į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml Arnow reagento (mišinys sudarytas iš 10 proc. natrio molidbato tirpalo ir 10 proc. pr. natrio nitrito tirpalo santykiu 1:1), 2 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 1 ml tiriamojo ekstrakto pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalo, 2 ml praskiesto natrio šarmo tirpalo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml.

Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu, esant 525 nm bangos ilgiui. Suminis procentinis hidroksicinamono rūgšties darinių kiekis išreikštas chlorogeno rūgšties ekvivalentais. Apskaičiuota pagal formulę:

; 188 10 ) ( (%) m S važ V A X     

A – tiriamojo mėgino absorbcijos dydis esant 525 nm bangos ilgiui; V(važ) – pagaminto ekstrakto tūris ml;

S – skiedimas;

2.4.4. Antiradikalinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu metodu

Laisvųjų radikalų surišimas T. officinale. žaliavų ekstraktuose buvo vertinamas ABTS metodu, kaip standartą naudojant troloksą.

Motininis ABTS tirpalas ruošiamas 0,0548 g ABTS miltelių ištirpinant 50 ml distiliuoto vandens, tamsaus stiklo buteliuke ir pridedant 0,0095 g kalio persulfato. Mišinys laikomas tamsoje 16 valandų. Darbinis ABTS tirpalas paruošiamas motininį tirpalą skiedžiant distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui.

Tiriamasis mėginys ruošiamas į 5 ml tamsaus stiklo buteliuką įpilant 3000 µl darbinio ABTS reagento ir 20 µl augalinės žaliavos ekstrakto. Mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Spektrofotometru matuojama tiriamojo mėginio absorbcija ir lyginama su palyginamuoju tirpalu (vandeniu) , esant 734 nm bangos ilgiui.

Paprastųjų kiaulpienių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi (y = 1,2214x+0,0132; R2 _{= 0,9987; p < 0,001) Apskaičiuojama pagal} formulę: ; m a V c TE   µg/g

c – trolokso koncentracija µmol/L, nustatyta iš trolokso kalibracinės kreivės; V – pagaminto ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis g.

2.4.5. Redukcinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu.

Redukcinis aktyvumas paprastųjų kiaulpienių žaliavos ekstraktuose buvo vertinamas CuPRAC metodu, kaip standartą naudojant troloksą.

Redukcinio aktyvumo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui sausos žaliavos, remiantis trolokso kalibracinės kreivės tiesinės regresijos lygtimi (y = 0,1125x-0,0016; R2 = 0,9994; p < 0,001) Apskaičiuojama pagal formulę:

; m a V c TE   µg/g

C – trolokso koncentracija µmol/ml, nustatyta iš trolokso kalibracinės; V – pagaminto ekstrakto tūris ml;

a – skiedimo faktorius;

m – tikslus atsvertos žaliavos kiekis g.

2.4.6. T. Officinale F.H.Wigg. lapų ir žiedynų analizė ESC metodu.

Fenolinių junginių analizė buvo atlikta Waters 2695 Alliance sistema (Milfordas, MA) su Waters 2998 diodų matricos detektoriumi. Chromatografininis skirstymas atliktas ACE kolonėle (C18, 250 mm x 4,6 mm, dalelių dydis 5 μm), turinčia ACE prieškolonėlę (C18, 20 × 4.0 mm, dalelių dydis 5 μm) (Aberdeen, Scotland), palaikant 25° C temperatūrą.

Analizės metu naudotą judrią fazę sudarė 0,05 proc. trifluoracto rūgštis (eliuentas A) ir acetonitrilas (eliuentas B). Naudotas šis gradiento kitimas: 5 min. 10 proc. eliuento B, 5–30 min. – 10 – 30 proc. eliuento B, 30–35 min. – 30–90 proc. eliuento B, 37–40 min. 90-100 proc. eliuento B. Tėkmės greitis – 1 ml/min., tiriamųjų ektraktų injekcijos tūris – 10 μl.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu gautų chromatogramų smailės identifikuotos lyginant analičių ir etaloninių junginių sulaikymo trukmes ir absorbcijos spektrus (λ = 200–600 nm).

Paprastųjų kiaulpienių lapų ir žiedynų ekstraktuose identifikuotų junginių kiekybinei analizei buvo sudarytos kalibracinės kreivės, injekuojant žinomos koncentracijos (2,5–100 μg/ml) standartinių junginių tirpalus. Chlorogeno rūgšties, kaftaro rūgšties ir cikoro rūgšties absorbcijos ir kiekiai apskaičiuoti esant 320 nm bangos ilgiui, liuteolino-7-O-gliukozido – 360 nm bangos ilgiui. Duomenys gauti su visais žaliavos mėginiais atliekant 3 pakartojimus ir išvedant gautų rezultatų vidurkį.

2.5. Duomenų apdorojimas ir statistinis vertinimas

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas

Ekstrakcijos sąlygų nustatymas yra vienas svarbiausių žingsnių, siekiant užtikrinti maksimalią vaistinės augalinės žaliavos biologiškai aktyvių junginių išeigą ir farmakologinį aktyvumą [71]. Pagrindinės veikliosios medžiagos, atsakingos už farmakologinį poveikį T. officinale augalinėje žaliavoje, yra fenoliniai junginiai. Kadangi nėra vienos universalios ekstrakcijos procedūros, tinkamos visų augalų fenolinių junginių maksimaliai išeigai gauti [71], atliekama ekstrakcijos tirpiklio, metodo bei trukmės įtaka suminiam fenolinių junginių kiekiui T. officinale žaliavų ekstraktuose, siekiant užtikrinti didžiausią biologiškai aktyvių junginių išeigą.

Optimalaus tirpiklio parinkimas, užtikrinantis didžiausią fenolinių junginių išeigą buvo atliekamas naudojant įvairios koncentracijos vandens – etanolio mišinius (5 pav.). Šie tirpikliai pasirinkti todėl, nes yra tinkami fenolinių rūgščių ekstrahavimui ir yra saugūs vartoti [72]. Ekstrakcijos tirpiklio efektyvumas vertinamas pagal kiekviename ekstrakte (n=3) gautą suminį fenolinių junginių kiekį. Rezultatai gauti atlikus spektrofotometrininę fenolinių junginių analizę pateikti 5 paveiksle.

5 pav. Fenolinių junginių ekstrakcijos išeiga (mg/g) naudojant skirtingos koncentracijos vandens – etanolio mišinius; (n=3)

Didžiausia fenolinių junginių išeiga žiedynų ekstraktuose (18,20 ± 1,08 mg/g) nustatyta naudojant 70 proc. V/V etanolį (p<0,05). Mažiausiai efektyvūs tirpikliai yra 96,3 proc V/V etanolis ir vanduo (atitinkamai 3,99 ± 1,11 mg/g ir 6,88 ± 1,38 mg/g) (p<0,05).

Tyrimais pagrįstas 70 proc V/V etanolio tinkamumas fenolinių rūgščių ekstrahavimui [73,74]. Remiantis literatūros duomenimis didžiausią paprastųjų kiaulpienių lapuose ir žiedynuose esančių fenolinių junginių procentą sudaro fenolinės rūgštys [73], todėl tyrimo metu nustatytas 70 proc. V/V etanolis pagrįstai tinkamas biologiškai aktyvių ekstraktų gamybai. Mokslinių tyrimų duomenimis įrodytas 70 proc.V/V etanolinių kiaulpienių žaliavų ekstraktų sukeliamas farmakologinis poveikis [21,22].

Kadangi didžiausia fenolinių junginių išeiga T. officinale lapų ir žiedynų ekstraktuose nustatyta naudojant 70 proc. V/V etanolį (ir yra statistiškai reikšminga; p<0,05), sekančiame žingsnyje, vertinant optimalų ekstraktų gamybos metodą ir ekstrakcijos laiką, kaip tirpiklis pasirinktas būtent šios koncentracijos vandens ir etanolio mišinys.

Ekstrakcijos metodo nustatymui pasirinkta laboratorinė purtyklė ir ultragarso vonelė. Ekstrahavimas maišant purtyklėje vykdomas 15; 30; 45 ir 60 minučių (6 pav.).

6 pav. Fenolinių junginių išeiga (mg/g) priklausomai nuo augalinės žaliavos maišymo purtyklėje laiko; (n=3)

Vertinant fenolinių junginių išeigos priklausomybę nuo maišymo purtyklėje laiko nustatyta, kad iki 45 minučių trunkantis lapų žaliavos ir tirpiklio maišymas ją didina, trunkantis ilgiau – mažina (p<0,05). Po 45 minučių ekstrakcijos purtyklėje, lapų ekstraktuose nustatyta didžiausia fenolinių junginių koncentracija – 59,08 ± 0,3 mg/g (p<0,05). Atliktos vienfaktorinės dispersinės analizės metu įvertinta, kad 15, 30 ir 45 minučių trukmės maišymas turi vienodą įtaką fenolinių junginių iš lapų ekrahavimui– reikšmingas skirtumas tarp gautų koncentracijų nenustatytas.

10 20 30 40 50 60 15 30 45 60 S u m in is f en oli n ių jun gin ių k ieki s; m g/g

Maišymo purtyklėje laikas, min

Žiedynų ekstraktuose fenolinių junginių kiekis didėja iki 30 minučių trukusio maišymo, o vėliau mažėja (p<0,05). Po pusės valandos ekstrakcijos nustatyta didžiausia junginių išeiga (20,43 ± 0,35 mg/g) (p<0,05).

Ultragarsinėje aplinkoje užpilta augalinė žaliava laikoma 5; 15; 30; 45 minutes (7 Pav.) .

7 pav. Fenolinių junginių išeiga (mg/g) priklausomai nuo augalinės žaliavos veikimo ultragarsu laiko; (n=3)

Vertinant ultragarso poveikį vaistinės augalinės žaliavos ir tirpiklio mišinio sąveikai nustatyta, kad fenolinių junginių išeiga reikšmingai didėja ultrgarsu veikiant lapus iki 30, o žiedynus iki 15 minučių (p<0,05). Ilgiau trunkančios ekstrakcijos metu, dėl galimo biologiškai aktyvių medžiagų skilimo, fenolinių junginių kiekis ekstraktuose mažėja (p<0,05). Efektyviausias ekstrahavimo ultragarsu laikas lapų žaliavai yra 30 minučių, žiedynų – 15 minučių, kadangi būtent tiek trukusios ekstrakcijos metu nustatytas junginių kiekis žaliavų ekstraktuose turi didžiausias reikšmes: lapų – 65,85 ± 0,89 mg/g (p<0,05); žiedynų – 23,3 ± 0,8 mg/g (p<0,05). Po 45 minučių ekstrakcijos gautos mažiausios junginių išeigos (iš lapų – 39,39 ± 1,34 mg/g, iš žiedynų – 12,8 46 ± 1,3 mg/g) (p<0,05).

Nustatyta, kad toks pat fenolinių junginių kiekis ultragarso aplinkoje pasiekiamas per daug trumpesnį laiką nei maišant purtyklėje. Tai rodo, kad biologiškai aktyvių junginių iš žaliavos ekstrahavimas ultragarso aplinkoje yra efektyvesnis.

Įvertinus gautus rezultatus, jų statistinį patikimumą bei literatūros duomenis, nustatyta, kad tinkamiausios sąlygos fenolinių junginių ekstrakcijai iš paprastųjų kiaulpienių augalinių žaliavų (lapų; žiedynų) yra ekstrahentu naudojant 70 proc. V/V etanolio ir vandens mišinį, ekstrakciją vykdant ultragarso vonelėje (30 minučių ekstrahuojant lapų ir 15 minučių ekstrahuojant žiedynų bandinius).

0 10 20 30 40 50 60 70 5 15 30 45 Su m in is f enol in ių jun gin ių k ieki s; m g/g

Veikimo ultragarsu laikas; min

3.2. Spektrofotometrinė T. officinale F.H.Wigg. augalinių žaliavų junginių analizė

3.2.1. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas paprastųjų kiaulpienių

žaliavose

Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas lapuose augalų vegetacijos metu

Nustatyta, kad suminis fenolinių junginių kiekis paprastųjų kiaulpienių lapuose vegetacijos metu reikšmingai kinta nuo 57,74 ± 0,55 mg/g iki 118,46 ± 1,91 mg/g (p<0,05), o vidutinis kiekis siekia 91 mg/g. Didžiausi fenolinių junginių kiekiai (100,23 ± 0,95 mg/g – 118,47 ± 1,91 mg/g) nustatyti žydėjimo ir sėklų brandinimo metu (04.28–06.11; 09.13) (p<0,05). Maksimali išeiga (118,46 ± 1,93 mg/g) nustatyta augalų sėklų brandinimo pabaigoje (06.11) (p<0,05).

8 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio (mg/g) lapuose įvairavimas vegetacijos metu; (n=3), *p<0,05

Atliktos statistinės duomenų analizės (ANOVA) metu reikšmingas fenolinių junginių kiekio lapuose didėjimas nuo pat augalų vegetacijos pradžios (04.12) iki sėklų brandos pabaigos (06.11) (p<0,05). Po to šių junginių kiekis mažėjo iki 67,21 ± 1,93 mg/g (08.15) (8 pav.). Statistinė analizė parodė, kad reikšmingi koncentracijų sumažėjimai yra tarp 06.11– 06.25 ir 07.25–08.15 rinktų žaliavų mėginių, o 06.25; 07.08; 07.25 rinktų lapų ekstraktuose nustatytos statistiškai reikšmingo skirtumo neturinčios reikšmės. Galima teigti, kad žydėjimo ir sėklų brandos tarpsniai lemia didesnį fenolinių junginių lapuose kiekį. Taip pat įvertinta, kad rugpjūčio mėnesio viduryje lapuose sukauptas fenolinių junginių kiekis (67,21 ± 1,93 mg/g) neturi statistiškai reikšmingo skirtumo nuo kiekio sukaupto vegetacijos pradžioje. Toliau iki pat vegetacijos pabaigos nustatytas fenolinių junginių kiekio kitimas yra statistiškai reikšmingas (p<0,05). Nustatyti vėl didesni junginių kiekiai, tačiau didesnė nei nustatyta vidutinė sukaupiama koncentracija gauta tik rugsėjo mėnesio viduryje, esant pakartotinam

pavienių augalų žydėjimui, surinktų lapų žaliavoje (102,66 ± 0,69 mg/g). Vegetacijos pabaigoje (10.13) nustatyta mažiausia per visą rinkimo laikotarpį sukaupta koncentracija (57,7 ± 0,55mg/g) (p<0,05).

Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas žiedynuose augalų vegetacijos metu

Žiedynuose fenolinių junginių kiekis įvairuoja nuo 21,69 ± 1,45 mg/g iki 33,33 ± 0,55 mg/g, vidurkis siekia 26,92 mg/g. Tai yra 3,27 kartus mažesnis kiekis nei lapuose. Didžiausia išeiga (33,33 ± 0,56 mg/g) nustatyta masinio žydėjimo metu (05.14) rinktų žiedynų mėginiuose (p<0,05).

9 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio (mg/g) įvairavimas žiedynuose vegetacijos metu; (n=3); (*p<0,05)

T. officinale vegetacijos metu bendras fenolinių junginių kiekis žiedynuose kito statistiškai reikšmingai (p<0,05) (9 pav.). Tarp žydėjimo pradžioje (04.28) ir pabaigoje (05.24) rinktų žiedynų sukauptų fenolinių junginių koncentracijų statistiškai reikšmingas skirtumas nenustatytas, todėl galima teigti, kad šių tarpsnių metu žiedynai sukaupė vienodą fenolinių junginių kiekį. Literatūros duomenimis pavieniai augalai gali pražįsti pakartotinai, tačiau tie patys augalai, pražydę antrą kartą, išaugina kitokius vaisius, dažniausiai neturinčius kai kurių rūšiai būdingų požymių [5]. Antro žydėjimo metu (09.13) surinktų žiedynų mėginiuose nustatytas fenolinių junginių kiekis (21,69 ± 1,5 mg/g) yra mažesnis nei esant pirmam augalų žydėjimui (p<0,05), todėl galima teigti, kad skiriasi ir žieduose kaupiamų junginių kiekis.

Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas tarp žaliavų rinktų skirtingose vietovėse

Nustačius, kad suminis fenolinių junginių kiekis T. officinale žaliavose reikšmingai įvairuoja priklausomai nuo rinkimo laiko, įvertintas sukaupiamas junginių kiekis ir skirtingose Lietuvos

Nustatyta, kad fenolinių junginių kiekis paprastųjų kiaulpienių lapuose įvairuoja nuo

47,02 ± 0,76 mg/g iki 105,9 ± 1,12 mg/g, vidurkis – 68,69 mg/. Žiedynuose įvairuoja nuo 12,23 ± 0,44 mg/g iki 33,33 ± 0,55 mg/g, vidurkis siekia – 18,6 mg/g.

10 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio (mg/g )žaliavose įvairavimas tarp skirtingų rinkimo vietų; (n=3)

Didžiausią junginių kiekį lapuose (105,955 ± 0,73 mg/g) sukaupė Vilniaus rajone rinkta T. officinale žaliava (p<0,05). Naujosios Akmenės ir Ignalinos rajonuose surinkti lapai sukaupė didesnes nei vidutinė fenolinių junginių koncentracijas. Kitose vietovėse rinktuose lapuose nustatyti kiekiai vidutinio nesiekia. Tarp Jonavos ir Utenos rajonuose sukaupto kiekio reikšmingas skirtumas nenustatytas. Mažiausia fenolinių junginių koncentracija (47,02 ± 0,76 mg/g) nustatyta Marijampolėje rinktoje augalinėje lapų žaliavoje (p<0,05), nežymiai didesnė – Telšių rajone. (10 pav.)

Didžiausia fenolinių junginių koncentracija žiedynuose (33,34 ± 0,55 mg/g) nustatyta taip pat Vilniaus rajone rinktoje žaliavoje (p<0,05). Didesne nei vidutinė koncentracija pasižymi Utenos, Ignalinos ir Jonavos rajonų mėginiai. Marijampolės ir Telšių miestuose masinio žydėjimo metu surinktuose žiedynuose nustatyti junginių kiekiai yra mažiausi (atitinkamai 12,23 ± 0,44 ir 14,85 ± 0,83 mg/g) (p<0,05). Nežymiai didesnis sukauptas N.Akmenės rajone. (10 pav.)

Lyginant su kitų tyrėjų duomenimis, mūsų atlikto tyrimo rezultatų reikšmės nustatytos T. officinale vegetacijos metu (57,74 mg/g – 118,46 mg/g) ir skirtinguose Lietuvos regionuose (47,02– 105,955 mg/g) rinktose lapų žaliavose yra didesnės už Bulgarijoje Ivanov atlikto tyrimo metu nustatytą fenolinių junginių kiekį lapuose – 33,90 ± 0,9 mg/g [75]. Prancūzijoje Fraisse ir kiti atlikto tyrimo metu nustatyta 53,59 ± 2,47 mg/g fenolinių junginių T. officinale lapuose koncentracija [76], kuri atitinka vegetacijos metu nustatytą mažiausią kiekį. Taip pat pastebėta, kad ši koncentracija atitinka Telšiuose sukauptą kiekį (52,61 mg/g). Pietų Korėjoje Kim Y.C. atlikto tyrimo metu T. officinale lapų žaliavoje nustatyta 94 ± 0,3 mg/g fenolinių junginių koncentracija [73] patenka ir į vegetacijos metu ir

105,95 78,26 47,02 63,16 52,61 62,98 70,83 33,33 16,96 12,23 19,34 14,85 20,59 19,58 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Vilniaus r. N.Akmenės r.

Marijampolė Jonavos r. Telšiai Utenos r. Ignalinos r.

į skirtingose augimvietėse nustatytų reikšmių intervalus. Ši koncentracija beveik atitinka vegetacijos metu sukaupiamą vidutinį fenolinių junginių kiekį.

Mūsų žiedynų tyrimo gautos rezultatų reikšmės T. officinale vegetacijos metu yra didesnės nei Kipre Stylianou ir kiti nustatyta 14,87 mg/g [74 ] bei Čekijoje Garcia-Lopez ir kiti nustatyta 17,20 mg/g fenolinių junginių žiedynuose koncentracijos [77]. Telšų mieste žiedynuose sukaupta fenolinių junginių koncentracija atitinka Kipre atlikto tyrimo metu nustatytą koncentraciją, o Naujojoje Akmenėje – Čekijoje atlikto tyrimo metu žiedynuose nustatytą fenolinių junginų kiekį.

Atsižvelgiant į gautus rezultatus, galima teigti, kad vegetacijos tarpsnis ir rinkimo vieta turi įtakos fenolinių junginių T. officinale žaliavose kiekiui. Lyginant paprastųjų kiaulpienių žaliavose (lapuose; žiedynuose) nustatytą suminį fenolinių junginių kiekį, įvertinta, kad lapuose šių junginių sukaupiama daugiau. Palyginus su kitų tyrėjų duomenimis, galimi skirtumai dėl skirtingo ekstrakcijos tirpiklio, metodo ar trukmės pasirinkimo, augalo geografinė padėties, klimatinių sąlygos, dirvožemio, žaliavos rinkimo metų ir vegetacijos tarpsnio bei kitų veiksnių.

3.2.2. Suminio flavonoidų kiekio įvairavimas paprastųjų kiaulpienių žaliavose

Gautų rezultatų duomenimis, suminis flavonoidų kiekis T. officinale lapuose vegetacijos metu kinta nuo 3,44 ± 0,16mg/g iki 8,58 ± 0,29 mg/g, (p<0,05), vidutinis kiekis siekia 6,37 mg/g. Maksimalus flavonoidų kiekis lapuose sukauptas – sėklų brandinimo pabaigoje (06.11) (8,58 ± 0,29 mg/g).

11 pav. Suminio flavonoidų kiekio (mg/g) įvairavimas lapuose vegetacijos metu; (n=3); *p<0,05