DARBAS ATLIKTAS LSMU KARDIOLOGIJOS INSTITUTE, LĄSTELIŲ KULTŪRŲ

LABORATORIJOJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Šakotos grandinės aminorūgščių įtaka navikinių ląstelių metabolizmui“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Monikos Pankevičiūtės baigiamasis magistro darbas atitinka reikalavimus, darbo tema aktuali, atlikta literatūros analizė išsami, gauti eksperimentų rezultatai pateikti ir apdoroti pagal

reikalavimus. Siūlau magistrantės Monikos Pankevičiūtės darbą vertinti aukščiausiu balu 10 (dešimt balų).

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

INSTITUTE, LĄSTELIŲ KULTŪRŲ LABORATORIJOJE

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(aprobacijos data ) (laboratorijos vadovo vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS LĄSTELIŲ KULTŪRŲ LABORATORIJA

MONIKA PANKEVIČIŪTĖ

ŠAKOTOS GRANDINĖS AMINORŪGŠČIŲ ĮTAKA NAVIKINIŲ

LĄSTELIŲ METABOLIZMUI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Dr. Ieva Sarapinienė

KAUNAS,

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS LĄSTELIŲ KULTŪRŲ LABORATORIJA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Prof. Ramunė Morkūnienė_________________

2020.____.____

ŠAKOTOS GRANDINĖS AMINORŪGŠČIŲ ĮTAKA NAVIKINIŲ LĄSTELIŲ METABOLIZMUI

Magistro baigiamasis darbas

Recenzentas ___________________________ ___________________________ 2020.____.____ Darbo vadovas Dr. Ieva Sarapinienė _______________________ 2020.____.____

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 13

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 14

1.1 Navikinių ląstelių energijos metabolizmas ... 14

1.2 Šakotos grandinės aminorūgštys ir jų svarba sveikoms ir navikinėms ląstelėms ... 15

1.3 Šakotos grandinės aminorūgščių sąryšis su kitomis ligoms ... 17

1.4 Navikinių ląstelių proliferacijos ir gyvybingumo tyrimai ... 18

1.5 Mitochondrijų membranos potencialo tyrimai ... 19

1.6 Ląstelių tyrimai naudojant tėkmės citometriją ... 20

1.7 Navikinių ląstelių kolonijų formavimo tyrimai ... 21

1.8 Genų nutildymas naudojant siRNR ... 22

1.9 Bioinformaciniai vaistų kūrimo metodai ... 22

2. TYRIMO METODIKA ... 24

2.1 Naudotos medžiagos ir įranga ... 24

2.2 Ląstelių linijos ... 25

2.3 Transfekcija ... 25

2.4 Kolonijų formavimas ... 25

2.5 Tėkmės citometrija ... 26

2.6 BCAT2 blokatoriaus paieška ... 26

2.7 Statistinė duomenų analizė ... 27

3. REZULTATAI ... 27

3.1 Ląstelių proliferacija po BCAT2 nutildymo ... 27

3.2 Ląstelių gyvybingumas po BCAT2 nutildymo ... 29

3.3 Kolonijų formavimas po BCAT2 nutildymo ... 31

3.4 Mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai po BCAT2 nutildymo ... 32

3.5 BCAT2 slopiklio paieška... 34

3.6 Ląstelių proliferacija po BCAT2 slopinimo 2FBI-1... 38

3.8 Kolonijų formavimas po BCAT2 slopinimo 2FBI-1 ... 41

3.9 Mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai po BCAT2 slopinimo 2FBI-1 ... 42

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 44

5. IŠVADOS ... 47

6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49

SANTRAUKA

M. Pankevičiūtės magistro baigiamasis darbas / mokslinė vadovė Dr. I. Sarapinienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakultetas, Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų laboratorija – Kaunas.

Šakotos grandinės aminorūgštys (BCAA) yra būtinos žmogaus organizmui ir turi reikšmingos įtakos navikų metabolizmui. Ankstesni tyrimai Lietuvos sveikatos mokslų universitete parodė, kad MCF-7 krūties naviko ląstelėse yra pernelyg išreikšta šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 2 (BCAT2). Tai rodo, jog šis fermentas turi daugiau įtakos naviko, nei sveikų ląstelių metabolizmui. Bioinformacinės analizės metu prognozuota, kad MCF-7 didžiąją dalį savo energijos gauna skaidydamos BCAA, taigi galima daryti prielaidą, kad BCAT2 nutildymas sutrikdytų navikinių ląstelių energijos ciklą. Šio tyrimo metu keliais būdais buvo slopintas BCAT2 ir buvo siekiama išsiaiškinti, kokį vaidmenį šis fermentas turi navikinių ląstelių proliferacijai, kolonijų formavimuisi, gyvybingumui ir mitochondrijų membranų potencialui (m). Norint baltymo funkcijos ištyrimą atlikti kuo tiksliau, buvo pradėta nuo siRNR prieš BCAT2 transfekcijos. Tyrimui naudotos MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa ir HCT116 ląstelių linijos. Gyvybingumui ir mitochondrijų membranos potencialo nustatymui naudoti 7-AAD (7-aminoaktinomicinas D) ir JC-1 fluorescentiniai dažai.

Ląstelių transfekcija su siRNR prieš BCAT2 neturėjo didelės įtakos MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa bei HCT116 ląstelių proliferacijai, gyvybingumui ir kolonijų formavimuisi. Priešingi rezultatai gauti su mitochondrijų membranos potencialu – pastebėta hiperpoliarizacija, t.y. mitochondrijos tapo labai aktyvios, dėl galimai įsijungusių kompensacinių mechanizmų, sutrikdžius BCAA metabolizmą. Tinkamam slopikliui BCAT2 rasti buvo naudotos kompiuterinės vaistų dizaino programos. Protein Data Bank duomenų bazėje rastas ligandas pavadinimu EL2 (PDB ID: 5HNE), kuris jau buvo žinomas dėl savo slopinančio poveikio BCAT2, todėl kaip šablonas panaudotas svarbiausias baltymo ir ligando sąveikos struktūrinis komponentas – benzimidazolo žiedas. Naudojantis vaistų panašumo filtrais, buvo patikrinti keli komerciškai prieinami benzimidazolo žiedą turintys junginiai ir, siekiant išsiaiškinti geriausią kandidatą į vaistą, dokinimui naudota QuickVina-W programa. Buvo nustatytas potencialus kandidatas – 2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolas (2FBI-1). Su nauju 2FBI-1 junginiu pakartota tėkmės citometrija. Šį kartą proliferacija ir gyvybingumas mažėjo priklausomai nuo naudotos junginio koncentracijos, kaip ir stiprėjanti mitochondrijų hiperpoliarizacija bei reikšmingai sumažėjęs navikinių ląstelių kolonijų skaičius ir užimamas plotas. Silpnesnis poveikis pastebėtas sveikų MCF-10A ląstelių linijoje.

slopiklis. BCAT2 yra atsakingas už normalų navikinių ląstelių dauginimąsi, gyvybingumą, mitochondrijų membranos potencialą ir kolonijų susidarymą.

SUMMARY

M. Pankevičiūtė's Master's Thesis / Scientific Supervisor Dr. I. Sarapinienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Laboratory of Cell Culture of Institute of Cardiology – Kaunas.

Branched-chained amino acids (BCAAs) are essential for humans and it seems they play a big role in cancer metabolism. Previous studies in Lithuanian University of Health Sciences showed an overexpression of branched-chained amino acid transferase 2 (BCAT2) in MCF-7 breast cancer cells. That indicates that BCAAs are of greater importance to tumour cells. Bioinformatic analysis predicted MCF-7 gets most of its energy from breaking down BCAAs. This suggested silencing BCAT2 to disrupt the energy cycle of tumour cells. BCAT2 was silenced in several ways during this study and flow cytometry was used to find out the role this enzyme plays in cancer cell proliferation, viability, mitochondrial membrane potential and colony formation.

Small interfering RNA (siRNA) transfection against BCAT2 gene was used for more precise examination of the enzyme. MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa and HCT116 cell lines were used as tumour models. 7-AAD and JC-1 fluorescent dyes were used for viability and mitochondrial membrane potential determination respectively.

BCAT2 transfection had slight effect on proliferation, viability and colony formation of MCF-7, MCF-10A, BCC, HeLa and HCT116 cells. In case of mitochondrial membrane potential hyperpolarisation was observed, meaning mitochondria became highly active, due to compensation of impaired BCAA metabolism. Computational drug design was used to find a molecule, that would inhibit BCAT2 effectively. A ligand named EL2 was found on Protein Data Bank (PDB ID: 5HNE) that was already known for its inhibitory effect on BCAT2, so the most important structural component of the protein-ligand interaction – the benzimidazole ring, was used as a template. A few commercially available compounds were screened through a number of drug-likeness filters and the best drug candidate was identified by docking using QuickVina-W and the result was 2-(4-(2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy)phenyl)-1H-benzimidazole (2FBI-1). The new compound was tested, and the result was significant concentration-dependent drop of proliferation and viability, highly hyperpolarised mitochondria and a decrease in cancer cell colony count and area occupied in the well. A weaker effect was observed in the normal MCF-10A cell line.

PADĖKA

Noriu nuoširdžiai padėkoti visiems, padėjusiems man rengti baigiamąjį Magistro darbą. Pirmiausia – LSMU Kardiologijos instituto Ląstelių kultūrų laboratorijos vadovui Prof. Vyteniui Arvydui Skeberdžiui, suteikusiam galimybę man vykdyti tyrimus jo vadovaujamoje laboratorijoje.

Noriu padėkoti savo Magistrinio darbo vadovei Dr. Ievai Sarapinienei už suteiktas metodines žinias ir pagalbą tyrimų metu, Dr. Vytautui Raškevičiui už pagalbą bioinformatikos srityje bei Dr. Valeryiai Mikalayevai, už nuoširdžius patarimus bei Magistro baigiamojo darbo pataisymus.

SANTRUMPOS

m – mitochondrijų membranos potencialas;

2FBI-1 – 2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolas;

7-AAD – 7-aminoaktinomicinas D;

acetil-KoA – acetilkofermentas A;

ACLY – ATP-citrato liazė (angl. ATP-citrate lyase);

ADME – absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas ir išsiskyrimas (angl. absorption, distribution,

metabolism, and excretion);

ATP – adenozin 5' trifosfatas;

BCAA – šakotos grandinės aminorūgštys (angl. branched-chained amino acids);

BCAT – šakotos grandinės aminorūgščių transferazė (angl. branched-chained amino acid

transferase);

BCAT1 – citozolinė šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 1 (angl. cytosolic branched-chained

amino acid transferase 1);

BCAT2 – mitochondrinė šakotos grandinės aminorūgščių transferazė 2 (angl. mitochondrial

branched-chained amino acid transferase 2);

BCC – pirminė krūties naviko ląstelių kultūra (angl. breast cancer cells);

BCKA – šakotos grandinės keto rūgštys (angl. branched-chained keto acids);

CADD – kompiuterinis vaistų kūrimas (angl. computer-aided drug design);

CHO – kininio žiurkėno kiaušidės (angl. Chinese hamster ovary; CHO);

DBT – dihidrolipoamido šakotos grandinės transacilazė (angl. dihydrolipoamide branched-chain

transacylase);

DLT – dihidrolipoilo transacetilazė (angl. dihydrolipoyl transacetylase);

DMEM – Dulbeko modifikuota Eagle terpė (angl. Dulbecco's Modified Eagle Medium);

EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis;

EL2 – 1-((1R,3S)-3-(((5-bromtiofen-2-il)karbonil)amino)cikloheksil)-N-metil-2-(piridin-2-il)-1H-benzimidazolo-5-karboksamidas;

F12 – Ham's F-12 maistinių medžiagų mišinys (angl. Ham's Nutrient Mixture F-12);

FADH2 – redukuotas flavino adenino dinukleotidas;

FVS – fetalinis veršelio serumas;

HADHA – hidroksiacil-KoA dehidrogenazės trifunkcinis daugiafermentinis komplekso alfa subvienetas;

HCT116 – žmogaus storosios žarnos karcinomos ląstelės;

HeLa – žmogaus gimdos kaklelio naviko ląstelės (pavadinta pagal pacientę Henrietta Lacks);

HIBADH – 3-hidroksiizobutirato dehidrogenazė;

JC-1 – 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarbocianino jodidas;

KoA – kofermentas A;

MCF-10A – normalios žmogaus krūties epitelio ląstelės (angl. Michigan Cancer Foundation-10A);

MCF-7 – žmogaus krūties naviko epitelinės ląstelės (angl. Michigan Cancer Foundation-7);

mRNR – matricinė RNR;

mTOR – žinduolių rapamicino taikinys (angl. mammalian target of rapamycin);

MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromidas;

N/A – klaidingi duomenys (angl. not applicable);

NADH – redukuotas nikotinamido adenino dinukleotidas;

OOA – oksaloacetatas;

P/S – penicilino/streptomicino tirpalas;

PBS – fosfatinis buferis (angl. phosphate-buffered saline);

RISC – RNR-indukuoto nutildymo kompleksas (angl. RNA-induced silencing complex);

RNRi – RNR interferencija;

RPMI 1640 – Rosvelo Parko Memorialinio Instituto 1640 terpė (angl. Roswell Park Memorial Institute

siRNR – trumpos grandinės nekoduojanti ribonukleino rūgštis (angl. small interfering RNA);

TC – tėkmės citometrija;

ĮVADAS

Chemoterapinių vaistų kūrimas apsunkinamas nepageidaujamų reakcijų pavojumi žmogaus organizmui. Pirmasis klasikinių chemoterapinių vaistų kūrimo etapas buvo susitelkęs į greitai besidalijančias ląsteles, kadangi buvo paplitusi neteisinga nuomonė, kad navikinės ląstelės greitai dalinasi. Vėliau išsiaiškinta, jog dauguma vėžio ląstelių, ypač turinčių mirtinus pilnai susiformavusius navikus, dauginasi palyginti lėtai, tačiau naviko masėje yra didelė dauginimosi stadijoje esančių ląstelių dalis, ir tai lemia greitą naviko išsiplėtimą [1]. Kai kurios normalios ląstelės, pavyzdžiui, kaulų čiulpų, plaukų folikulų, virškinamojo trakto ar epidermio – dauginasi greičiau nei dauguma navikų. Chemoterapiniai vaistai, veikiantys greitai proliferuojančias ląsteles, sukelia daug nepageidaujamų reakcijų, tokių kaip: įvairių kraujo ląstelių nepakankamumas, vietinis nuplikimas, odos niežulys, bei virškinamojo trakto sutrikimai. Tokie vaistai – fluorouracilas, cisplatina bei jų analogai, tebėra vartojami iki šiol. Karcinogenezė prisitaiko prie įvairių sąlygų – piktybiniams navikams būdingas metabolizmo perprogravimas, dėl kurio chemoterapija gali tapti neveiksminga. Naujoji vaistų kūrimo banga nukreipta į tam tikrus viduląstelinius komponentus, kurių rolė ne tik keičiasi sergant onkologinėmis ligomis, bet ir negali būti kompensuojama kitų metabolinių kelių, todėl naviko ląstelėms kyla sunkumų kuriant atsparumą. Šios naujos bangos taikiniai gali būti normalūs genų produktai, kurių raiška skiriasi nuo normos [2].

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas:

Nustatyti šakotos grandinės aminorūgščių degradacijos įtaka navikinių ląstelių proliferacijai, gyvybingumui ir mitochondrijų veiklai.

Uždaviniai:

1. Įvertinti šakotos grandinės aminorūgščių degradacijos kelio slopinimo siRNR prieš BCAT2 bei molekulinio dokinimo būdu identifikuotu junginiu (2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolu) įtaką navikinių ląstelių proliferacijai.

2. Nustatyti sutrikusio leucino, izoleucino bei valino metabolizmo reikšmę navikinių ląstelių gyvybingumui.

3. Įvertinti BCAT2 slopinimo įtaką navikinių ląstelių kolonijų formavimui.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Navikinių ląstelių energijos metabolizmas

Navikinių ląstelių energijos metabolizmas skiriasi nuo sveikų organizmo audinių. Šie skirtumai pastebimi dar ankstyvose ligos stadijose. Karcinogenezė yra daugiapakopis procesas, kurio metu formuojasi piktybiniai navikai. Ji prasideda naviko iniciacija arba tam tikrų ląstelių bruožų įgyjimu, leidžiančių joms formuoti navikus. Tarp šių bruožų – onkogeno aktyvacija ir naviko supresoriaus nutildymas [7], kurių metu ląstelių metabolizmas yra perprogramuojamas. Navikai gali keisti savo metabolinius kelius tam, kad šie atitiktų naujus piktybinių ląstelių poreikius. Tokie perprogramuoti keliai yra laikomi navikinių ląstelių žymenimis [8]. Klasikinis pavyzdys yra auglių ir embronininių audinių deguonies aplinkoje sunaudojamas neįprastai didelis gliukozės kiekis – šį reiškinį pirmą kartą pastebėjo Oto Warburgas XX a. pradžioje [9]. Anot jo, navikinės ląstelės net ir pakankamai deguonies turinčioje aplinkoje energiją išgauna glikolizės būdu, o ne tik oksidacinio fosforilinimo keliu, kuris yra daug efektyvesnis ir priimtinesnis sveikoms organizmo ląstelėms. Glikolizės būdu išgaunant energiją, susikaupia didelis kiekis laktato. Šiandien šis reiškinys naudojamas diagnostikoje, nustatant 18F-2-deoksigliukozės kaupimąsi audiniuose pozitronų emisijos tomografijos metodu [7, 10]. Tačiau Oto Warburgo hipotezė, teigianti, jog aerobinės glikolizės navikuose priežastis – sutrikusi oksidacinio fosforilinimo funkcija mitochondrijose, lėmė plačiai paplitusį klaidingą įsitikinimą, jog navikų ląstelės priklausomos nuo glikolizės, kaip pagrindinio ATP gavimo šaltinio. Nepaisant ypač aktyvios glikolizės citozolyje, dauguma navikų didžiąją dalį energijos gamina mitochondrijose [5, 8]. Riebalų rūgštys ir aminorūgštys, gautos iš maisto, taip pat, kaip ir piruvatas, gali būti Krebso ciklo substratais [8]. Riebalų rūgščių skaidymo metu (β-oksidacija) mitochondrijos sintetina acetil-KoA ir redukuoja NADH ir FADH2, kurie naudojami elektronų pernašos grandinėje. Amino rūgštis glutaminas gali virsti glutamatu

1.2 Šakotos grandinės aminorūgštys ir jų svarba sveikoms ir navikinėms

ląstelėms

Siekiant suprasti, kokią reikšmę BCAA turi navikinėms ląstelėms, svarbu suvokti jų metabolizmą normaliomis sąlygomis. Valinas, leucinas ir izoleucinas yra trys iš devynių nepakeičiamų amino rūgščių žmonėms ir sudaro beveik 35% raumenų baltymo struktūroje esančių amino rūgščių, iš kurių didžiausią dalį sudaro leucinas [3, 4]. Pirmas organizme vykstančio BCAA skaidymo žingsnis yra grįžtamas transaminavimas. Šią reakciją katalizuoja baltymas šakotos grandinės aminorūgščių transferazė (BCAT) ir jos metu susidaro šakotos grandinės ketorūgštys (BCKA). BCAT2 yra fermentas, esantis mitochondrijose [13]. Struktūriškai šis fermentas sudaro dimerą [14], kuris katalizuoja pirmąjį BCAA degradacijos etapą iki BCKA [13]. Šiam procesui priešingą funkciją atlieka baltymo izoforma BCAT1, esanti citozolyje [15]. Abu baltymai atlieka svarbų vaidmenį navikinių ląstelių energijos metabolizme ir jų padidėjusi raiška yra laikoma prognostiniu žymenimi onkologijoje, o patys baltymai – galimais vaistų kūrimo taikiniais.

Skeleto raumenys laikomi pradine BCAA katabolizmo vieta, nes aminotransferazės aktyvumas raumenyse didžiausias. Kitos nepakeičiamos amino rūgštys daugiausiai skaidomos kepenyse. Po transformacijos BCKA patenka į kraujotaką ir yra išnešiojamos po kitus audinius, kur vyksta jų peramininimas, ir jos vėl naudojamos baltymų sintezėje [16]. Kaip alternatyva šiam keliui gali būti negrįžtamas BCKA oksidacinis dekarboksilinimas, kurį vykdo šakotos grandinės ketorūgščių dehidrogenazės kompleksas. Susidaro keletas kofermento A junginių, kurie gali būti toliau oksiduojami ir galiausiai sudaryti acetil-KoA ir sukcinil-KoA, skirtus naudoti Krebso cikle. BCAA katabolizmo reakcijos krypčiai įtakos turi daug veiksnių, įskaitant ir substratų prieinamumą susietose reakcijose [16, 17]. Tyrimai rodo, jog padidinus BCAA tiekimą sveikame audinyje reakcija pasikreipia oksidacijos reakcijų link, tuo tarpu padidinus glutamino kiekį oksidacinio kelio aktyvumas mažėja [4].

1 pav. BCAA skaidymo sąsajos su anaboliniais naviko metabolizmo keliais ir signalų perdavimu

Epigenetiniai pokyčiai atlieka svarbų vaidmenį naviko atsparumo gydymui susiformavimui. ACLY – ATP-citrato liazė; OOA – oksaloacetatas, −KG – α-ketoglutaratas; mTOR – žinduolių rapamicino

taikinys. Adaptuota pagal Sivanand S, Heiden MGV [3].

Pagal 2017 m. duomenis [6], gautus analizuojant didelį genų raiškos rinkinį iš įvairių navikinių ir normalių ląstelių linijų, buvo pastebėta, jog navikinės ląstelės nuo sveikų skiriasi padidėjusia penkių su valino degradacija susijusių fermentų – BCAT2, dihidrolipoamido šakotos grandinės transacilazės (angl. dihydrolipoamide branched chain transacylase; DBT), dihidrolipoilo transacetilazės (angl. dihydrolipoyl transacetylase; DLT), hidroksiacil-KoA dehidrogenazės trifunkcinio daugiafermentinio komplekso alfa subvieneto (angl. hydroxyacyl-CoA dehydrogenase trifunctional

multienzyme complex subunit alpha; HADHA) ir hidroksiizobutirato dehidrogenazės (angl. 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase; HIBADH) – genų raiška. Keturi iš šių fermentų taip pat įtraukti į

izoleucino degradaciją (BCAT2, DBT, DLT, HADHA), bei trys – į leucino (BCAT2, DBT, DLT). Taip pat, modeliavimo eksperimento metu [6], buvo nustatyta, jog nuo 12% iki 55% visos ATP yra išgaunama BCAA degradacijos būdu.

2 pav. Navikų energijos gavimo šaltiniai

Įvairiose navikinių ląstelių linijose nustatytas kiekis ATP (%) išgautas laktato fermentacijos, bei BCAA degradacijos būdais. Adaptuota pagal Antanavičiūtė I et al. [6].

nustatytas ir padidėjęs BCAT2 baltymo kiekis mitochondrijose, lyginant su sveikomis epitelio MCF-10A ląstelėmis [6].

1.3 Šakotos grandinės aminorūgščių sąryšis su kitomis ligoms

jų gavimo būdas yra dieta. Kaip jau buvo minėta, piktybinių auglių atvejais kraujyje dažnai nustatomas padidėjęs BCAA kiekis. Toks pat reiškinys pastebimas tarp diabetu sergančių, insulinui atsparių pacientų. Nustatyta, jog antro tipo cukriniu diabetu sergantys pacientai patenka į didesnės rizikos susirgti tam tikrais onkologinių ligų tipais grupę. Ankstyvieji tyrimai atskleidė 2 tipo diabeto ryšį su kasos ir kepenų navikais, o naujausi tyrimai parodė padidėjusią riziką susirgti endometriumo, krūties, gaubtinės ir tiesiosios žarnos, šlapimo pūslės ir inkstų navikinėmis ligomis [4].

1.4 Navikinių ląstelių proliferacijos ir gyvybingumo tyrimai

Proliferacija yra svarbi naviko vystymosi ir augimo dalis. Vos susidarius navikui, jo augimas ir metastazės gali būti palaikomi gaminant didesnį kiekį hormonų (nuo hormonų priklausomiems navikams), skatinant angiogenezę, epitelinėms ląstelėms virstant mezenchiminėmis (įgaunant invazyvumo), sukeliant autofagiją ar pasinaudojant aplink esančiomis jungiamojo audinio ląstelėmis. Navikinės ląstelės įgyja bruožų, kurie leidžia joms pergyventi normalių ląstelių limitus ir šios gali nevaldomai daugintis [19].

Apoptozė, arba užprogramuota ląstelių mirtis, apibūdina ląstelių genuose užkoduotą programą, morfologiškai ir biochemiškai besiskiriančią nuo nekrozės. Apoptozę lemia ciklas įvairių biocheminių reakcijų, kurios galiausiai priveda prie ląstelės žūties, tuo tarpu nekrozė yra pasyvaus ląstelių žalojimo rezultatas. Apoptozė palaiko pusiausvyrą tarp ląstelių proliferacijos ir žūties, reguliuoja ląstelių populiacijos audiniuose dydį. Jautriausios išgyvenimo signalams ląstelės lieka gyvos, tuo tarpu negalinčios su jomis konkuruoti patiria apoptozę dėl santykinių išlikimo veiksnių stokos. Per mažai apoptotinių reakcijų gali lemti supiktybėjimą, atsparumą chemoterapijai [20]. Mitochondrijos laikomos apoptozės židiniu, nes jose priimamas ląstelių išgyvenimo ar mirties sprendimas. Apoptozė prasideda ląstelių susitraukimu, dėl kurio kinta šviesos sklaida, tačiau ląstelių membrana ankstyvoje apoptozės stadijoje dar nebūna pažeista. Už užprogramuotą ląstelių mirtį atsakingi baltymai kaspazės [21]. Jiems aktyvavusis krenta mitochondrijų membranos potencialas, kinta viduląstelinio Ca2+ koncentracija bei pH, ir lizosominiai membranos siurbliai netenka funkcijos. Šioje stadijoje žala ląstelei tampa negrįžtama ir ląstelė suyra į apoptotinius kūnelius, kurie greitai fagocituojami [20].

perdavimo įvykių stebėjimui [23]. Yra daugybė būdų įvertinti ląstelių gyvybingumui. Vienas pirmųjų gyvybingumo nustatymo metodų – ląstelių dažymas tripano mėliu – vis dar plačiai taikomas šiandien. Jis pagrįstas gyvybingų ląstelių membranos vientisumu. Nepažeista membrana gali lengvai pašalinti tripano mėlį, tuo tarpu negyvų ląstelių membrana nebepajėgia pašalinti dažo molekulių, todėl ląstelės nusidažo mėlyna spalva [22]. Dažnai taikomi MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromido) redukcijos testas bei ATP kiekio nustatymas liuciferazės reagentu. Kiekvienas testas turi savo privalumų ir trūkumų. Pavyzdžiui, MTT testas priklausomas nuo ląstelės metabolinio aktyvumo, kai tetrazolas gyvybingų ląstelių yra verčiamas violetinės spalvos (570 nm) formazano druska. Tyrimo metu keičiant ląstelių metabolinius kelius gali sutrikti tetrazolo redukcijos reakcijos ir formazano susidaryti mažiau. Tai gali iškraipyti rezultatus. Tiek MTT testas, tiek ATP kiekio nustatymas nėra pakankamai tikslūs. Kiek tiksliau gyvybingumą galima nustatyti citometrijos metodu, naudojant fluorescencinius dažus. Mūsų atveju, buvo pasirinktas 7-aminoaktinomicinas D (7-AAD), specifiškas DNR struktūrai. Šiuo junginiu galima išskirstyti ląsteles į gyvybingas, apoptotines ir esančias vėlyvosios apoptozės stadijoje [24]. Jo veikimo principas gali būti paaiškinamas tuo, jog junginys nepraeina gyvų ląstelių membranos, tuo tarpu apoptozės paveiktos ląstelės praleidžia dažą per suirusią membraną ir taip šis nudažo branduolyje esantį DNR. Vėliau nudažyti branduoliai sužadinami 488 nm šviesos spinduliu, o emisijos maksimumą 7-AAD pasiekia esant maždaug 685 nm bangos ilgiui [25].

1.5 Mitochondrijų membranos potencialo tyrimai

šie veiksniai gali svyruoti ir dėl normalių fiziologinių pokyčių. Ilgalaikis ∆m mažėjimas ar didėjimas, lyginant su normaliu lygiu, gali sukelti nepageidaujamą ląstelių gyvybingumo praradimą ir būti įvairių patologijų priežastimi [30]. Kai kurie autoriai teigia, kad ∆m kritimas yra viena iš ankstyvųjų apoptozės stadijų, kiti mano, jog normali mitochondrijų veikla yra būtina apoptozės sąlyga [31].

Tiriant mitochondrijų veiklą, susijusią su metaboliniais keliais, o ypač apoptoze, taikomi citometrijos ir mikroskopijos metodai, naudojant fluorescuojančius junginius [32]. Cianino dažai JC-1 (5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraetilbenzimidazolilkarbocianino jodidas) palengvina poliarizuotų ir depoliarizuotų mitochondrijų atskyrimą [31].

3 pav. JC-1 dažytų MCF-7 ląstelių m pokytis, stebėtas fluorescencinės mikroskopijos metodu

A – ląstelės veiktos cheminiu oksidacinio fosforilinimo slopikliui karbonilcianido m-chlorfenilo hidrazonu; B – kontrolė; C – ląstelės po siRNR prieš BCAT2 transfekcijos.

Ląstelėse, kurių ∆m mažas, JC-1 egzistuoja savo monomerinės formos pavidalu, todėl matoma žalia fluorescencija (emisija ~525 nm) (3 pav.). Aktyviose mitochondrijose dėl didelio m JC-1 formuoja J-agregatus, fluorescuojančius raudonai (emisija ~590 nm). Paprastai ląstelėse JC-1 egzistuoja abiem pavidalais, tačiau žalia depoliarizuotų ląstelių fluorescencija yra šiek tiek didesnė nei poliarizuotų ląstelių, nes yra didesnis JC-1 monomerų kiekis [31].

1.6 Ląstelių tyrimai naudojant tėkmės citometriją

pavienės ląsteles pasiekia ploniausią kapiliaro dalį (4 pav.). Lazerio šviesa apšvitinus ląstelių srautą, detektorius fiksuoja priekinę šviesos sklaidą ir šoninį jos išsibarstymą. Šviesos sklaida skirtingais kampais padeda atskirti dydžio ir formų skirtumus, tuo tarpu šviesa, kurią spinduliuoja fluorescenciškai paženklinti objektai, gali padėti analizuoti ląstelių struktūrinius elementus [33].

4 pav. Tėkmės citometro schematinis vaizdas

Adaptuota pagal Brown M, Wittwer C [33].

Ląstelių parametrai, kuriuos galima išmatuoti, yra geometrines savybes, tokios kaip ląstelės dydis (skersmuo, paviršiaus plotas ir tūris), fiziologinės savybės, tokios kaip membranos potencialas, vientisumas, gyvybingumas, ir DNR, RNR, citokinų, paviršiaus antigenų, branduolinių antigenų, fermentų bei baltymų kiekiai. Dažniausia taikomi fluorescencija pagrįsti metodai, tačiau vis dar naudojami šviesos sklaidymo bei elektroniniai tūrio matavimai [34].

1.7 Navikinių ląstelių kolonijų formavimo tyrimai

daugintis kolonijų formavimo tyrimų metu nebūtinai reiškia, kad ląstelė mirė ar prarado gebėjimą funkcionuoti, todėl šis tyrimas negali būti naudojamas kaip vienintelis tyrimas parodyti ląstelių mirtį ar išgyvenimą [37]. Ląstelės, kurios išgyvena, bet neplinta, vis tiek gali tenkinti svarbias organizmo funkcijas. Nors ir mažai tikėtina, kad viena ląstelė turės įtakos onkologinės ligos atkryčiui, yra galimybė jai vėl sugrįžti į normalų ląstelės ciklą. Derinant klonogeninę analizę su metodais, tiesiogiai nustatančiais ląstelių mirtį, galima daug sužinoti apie ląstelių populiaciją [37].

1.8 Genų nutildymas naudojant siRNR

siRNR (angl. small interfering RNA) yra trumpos grandinės nekoduojanti RNR, reguliuojanti genų raišką. siRNR gali būti naudojama vieno geno funkcijos tyrimams bei kaip naujos kartos tam tikrų ligų gydymo būdas (genų terapija) [35]. RNR interferencija (RNRi) – biologinis mechanizmas, sukeliantis genų nutildymą, į pasirinktą matricinę RNR (mRNR) įterpiant komplimentarią siRNR ir taip sukeliant mRNR degradaciją. Pirmas RNRi etapas prasideda ilgesnės dvigubos RNR skilimu į mažesnę siRNR, paliekant dviejų nukleotidų išsikišimą prie kiekvieno 3' galo. Už šį skilimą atsakingas į ribonukleazę panašus Dicer fermentas. Susidariusi siRNR jungiasi su daugiabaltyminiu kompleksu, vadinamu RNR-indukuoto nutildymo kompleksu (angl. RNA-induced silencing complex; RISC). RISC komplekse siRNR grandinės atskiriamos ir ta, kurios 5' galas stabilesnis, paprastai prijungiama prie RISC komplekso. Galiausiai komplimentari siRNR nukreipia RISC kompleksą į tikslinę mRNR ir ši pradedama skaidyti [35].

1.9 Bioinformaciniai vaistų kūrimo metodai

kartu šie procesai gali užtrukti nuo 10-15 metų ir kainuoti apie vieną milijardą JAV dolerių [38]. Bioinformatika apima biologinių duomenų rinkimą, organizavimą, analizę, manipuliavimą, pateikimą ir išskirstymą, siekiant padėti išspręsti biologines problemas molekuliniame lygmenyje, naudojant kompiuterines technologijas. Bioinformatika yra svarbi farmacijos pramonei (farmacinė bioinformatika), nes dalyvauja šiose srityse: vaistų atradimas, kūrimas ir tobulinimas, produktų/preparatų kūrimas, farmakokinetika ir farmakologija. Atradimo ir kūrimo procesas apima kompiuterinių vaistų projektavimo (angl. computer-aided drug design; CADD) metodų naudojimą. Metodai apima trijų dimensijų virtualių junginių bibliotekų sukūrimą in silico atrankai, dokinant junginius su validuotais vaistų taikiniais, galiausiai pagrįstai parenkant virtualius įvykius, turinčius tinkamas fizikines ir chemines savybes, kurių biologinis aktyvumas turi būti patikrintas [39]. Molekulinis dokingas yra pagrindinis struktūrinės molekulinės biologijos ir CADD įrankis. Dokinimo tikslas yra numatyti, kaip ligandas jungiasi su žinomos trimatės struktūros baltymu. Programinė įranga, tokia kaip Autodock, DOCK, GOLD, Glide bei kitos, kuria hipotezes apie galimas ligandų erdvines padėtis aktyviojoje tikslinės makromolekulės vietoje. Rezultatų įvertinimas atliekamas pagal balų skaičiavimo funkcijas (rišamąją energiją, sąlyčio paviršiaus plotą ir kt.). Remiantis šiais vertinimais, parenkami junginiai, geriausiai papildantys baltymo paviršiaus struktūrą ir savybes [40, 41]. Be dokinimo, naudojant CADD yra svarbios ir fizikocheminės bei farmakologinės vaisto savybės. Per dažnai klinikinių tyrimų metu atsisakoma geriausių kandidatų į vaistus dėl netinkamo jų bioprieinamumo, didelio toksiškumo, blogos farmakokinetikos ar reikšmingų sąveikų su kitais vaistais [42]. Dėl riboto laiko ir išteklių, tik dešimtys kandidatų į vaistus gali būti reikiamai ištirti in vivo, taigi siekiant taupyti laiką ir kitus išteklius, svarbu atsižvelgti į kompiuterinius skaičiavimus. Farmakokinetikos tyrimas susijęs su vaisto kelione nuo jo patekimo į organizmą iki patekimo į veikimo vietą. Šį procesą galima apibrėžti tokiomis fazėmis: absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas ir ekskrecija (angl. absorption, distribution, metabolism, and excretion; ADME). Tikriausiai, labiausiai žinomas šios srities tyrimas yra Lipinskio ir kolegų iš „Pfizer“ darbas [43]. Jie atliko statistinę 2200 vaistų analizę iš Pasaulio vaistų indekso. Jie nustatė, kad dauguma tyrime dalyvavusių vaistų pasižymi tam tikromis savybėmis, vadinamomis panašumu į vaistą (angl. druglikeness). Šio tyrimo metu nustatyti panašumo į vaistą kriterijai, paprastai vadinami Lipinskio penkių taisykle, kuri teigia, kad vaisto absorbcija ar pralaidumas gali sutrikti, jei [41]:

• logP > 5

• Molekulinė masė > 500

Čia logP – pasiskirstymo koeficientas. Jis apibūdina neturinčio krūvio junginio polinkį ištirpti nesimaišančioje dvifazėje lipidų (riebalų, aliejų, organinių tirpiklių) ir vandens sistemoje. LogP = 1 reiškia, kad junginys organinėje:vandeninėje fazėje pasiskirsto santykiu 10:1. Panašių „taisyklių“ yra ne viena ir ne dvi. Be Lipinskio taisyklės, dažnai vartojami Ghose [44], Veberio [45] ir Muegge [46] filtrai.

2. TYRIMO METODIKA

2.1 Naudotos medžiagos ir įranga

Ląstelių auginimui naudotos komercinės sudėtinės terpės: Dulbeko modifikuota Eagle terpė (DMEM; Sigma-Aldrich, JK), F-12 maistinių medžiagų mišinys (GibcoTM_{, Life Technologies}

Limited, JK), Rosvelo Parko Memorialinio Instituto 1640 terpė (RPMI 1640; GibcoTM, Life Technologies Limited, JK). Terpės papildytos 10% fetaliniu veršelio serumu (FVS; Sigma-Aldrich, JAV) bei 1% 100 U/ml penicilino/100 µg/ml streptomicino tirpalu (P/S; GibcoTM, Life Technologies, JAV). Kiti papildai terpėms: arklio serumas (GE Healthcare Life Sciences, JAV), rekombinantinis žmogaus epidermio augimo faktorius (angl. epidermal growth factor; EGF; GibcoTM_{, Life Technologies,}

JAV), hidrokortizonas (Sigma-Aldrich, Vokietija), choleros toksinas, išgautas iš Vibrio cholerae (Sigma-Aldrich, JAV), rekombinantinis žmogaus insulinas (GibcoTM, Life Technologies, JAV).

Praplovimui naudotas fosfatinis buferis (angl. phosphate-buffered saline; PBS), pH 7,4, gamintas laboratorijoje. Buferio sudėtis: dejonizuotas vanduo, NaCl (8 g/l), KCl (0,2 g/l), Na2HPO4

(1,44 g/l) ir KH2PO4 (0,24 g/l). Susidariusiam ląstelių monosluoksniui suardyti buvo naudotas 0,025%

tripsino – etilendiamintetraacto rūgšties (EDTA) tirpalas (Sigma-Aldrich, Vokietija). Tyrimams naudoti fluorescenciniai dažai JC-1 (EMD Millipore Corp., JAV) ir 7-aminoaktinomicinas D (7-AAD; InvitrogenTM_{, JAV). Kitos naudotos medžiagos: paraformaldehidas (Carl Roth, Vokietija), kristalo}

violetas (Alfa AesarTM_{, Thermo Fisher, Vokietija), absoliutus etanolis (Scharlab, Ispanija).}

Tyrimams naudota įranga: Binder CB 150 CO2 inkubatorius (Binder, JAV), Holten Safe

2.2 Ląstelių linijos

Tyrimams naudotos imortalizuotos MCF-7 žmogaus krūties adenokarcinomos ląstelės (CLS-Cell Lines Service, Vokietija), MCF-10A normalios žmogaus pieno liaukos epitelio ląstelės (ATCC, Vokietija), BCC – LSMU ląstelių kultūrų laboratorijoje iš krūties naviko audinio išskirta pirminė kultūra (Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimu nr. BE-2-6; išdavimo data: 2017 m. sausio 12 d) [6], HeLa žmogaus gimdos kaklelio naviko (ATCC CCL-2, JAV) bei HCT116 žmogaus gaubtinės žarnos karcinomos (ATCC, JAV) ląstelių linijos.

Krūties adenokarcinomos ląstelės MCF-7 ir BCC augintos DMEM/F-12, HeLa – DMEM, HCT116 – RPMI 1640 terpėje. Pastarosios terpės papildytos 10% FVS ir 1% P/S. MCF-10A ląstelių linija auginta kompleksinėje DMEM/F12 terpėje, kuri papildyta 5% arklio serumu, 20 ng/ml EGF, 0,5 μg/ml hidrokortizonu, 100 ng/ml choleros toksinu, 10 μg/ml insulinu ir 1% P/S. Ląstelės kultivuotos vienkartiniuose 25 mm2 ląstelių auginimo induose, inkubuotos 37 °C temperatūroje, 5% CO2 ir 98%

drėgmės aplinkoje.

2.3 Transfekcija

BCAT2 geno slopinimui naudota 5 nM koncentracijos siRNR prieš BCAT2 geną

(InvitrogenTM_{, JAV) ir atitinkamas kiekis transfekcijos reagento jetPRIME® (Polyplus-transfection®,}

Prancūzija). Transfekcija atlikta pagal gamintojo protokolą. Pirmiausia į sterilų mėgintuvėlį su jetPRIME® buferiu pridedamas atitinkamas kiekis siRNR, mišinys 10 s. purtomas, nusukamas centrifuga, tuomet į mėgintuvėlį suleidžiamas transfekcijos reagentas, mišinys dar kartą 10 s. suplakamas ir paliekamas stovėti kambario temperatūroje 10 min. Vėliau mišinys išdalinamas į atitinkamus šulinėlius. Tokiu pat būdu atlikta kontrolinė (mock) transfekcija be siRNR. Po transfekcijos ląstelės inkubuojamos 24, 48 ir 72 valandas. Praėjus 24 val. po transfekcijos, mitybinė ląstelių terpė su transfekcijos reagentų likučiais pakeičiama į švarią.

2.4 Kolonijų formavimas

0,5% PBS tirpalu 5 min. Nudažytos kolonijos plaunamos distiliuotu vandeniu iki vanduo nebesidažo. Tuomet kolonijos fotografuojamos G:Box Chemi įrenginiu, naudojant Genesys vaizdinimo programinę įrangą ir GeneTools kompiuterine programa skaičiuojamas jų kiekis bei plotas.

2.5 Tėkmės citometrija

Ląstelės auginamos 6-šulinėlių plokštelėse. Į kiekvieną šulinėlį sėjama 50000 ląstelių. Kitą dieną, ląstelėms prilipus prie plokštelės, jos veikiamos siRNR transfekcija arba tiriamu junginiu ir inkubuojamos 24, 48 ir 72 val. Po poveikio iš šulinėlių pašalinama terpė, jie nuplaunami PBS ir užpilami terpe, kurioje yra 1 μg/ml JC-1 dažo. Plokštelės inkubuojamos 10 min., dažo bei terpės liekanos nuplaunamos PBS tirpalu. Nudažytos ląstelės veikiamos tripsino-EDTA tirpalu (500 μl į šulinėlį) ir inkubuojamos dar 5 min. – taip suardomas prie šulinėlių dugno prilipęs ląstelių sluoksnis. Tripsinas neutralizuojamas dvigubu kiekiu terpės, papildytos 10% serumu. Ši suspensija perkeliama į 1,5 ml mėgintuvėlius ir 5 min. centrifuguojama 420 g. Supernatantas pašalinamas ir ląstelės resuspenduojamos 200 μl 1 μg/μl 7-AAD dažo PBS tirpale. Iš mėgintuvėlių suspensija perkeliama į juodo neperšviečiamo plastiko 96-šulinėlių plokšteles ir nedelsiant atliekama tėkmės citometrija.

2.6 BCAT2 blokatoriaus paieška

BCAT2 baltymo struktūra rasta RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/) duomenų bazėje, į paiešką įvedus raktažodį BCAT2. Pasirinktas failas, pavadinimu 5HNE, nes šio baltymo ligandas buvo žinomas BCAT2 slopiklis 1-((1R,3S)-3-(((5-bromtiofen-2-il)karbonil)amino)cikloheksil)-N-metil-2-(piridin-2-il)-1H-benzimidazolo-5-karboksamidas (EL2). Ieškotas panašaus aktyvumo, tačiau paprastesnės struktūros, hidrofiliškesnis cheminis junginys, kurio aktyvumą būtų galima išbandyti tiriant su anksčiau minėtomis ląstelių linijomis. Tam pasirinkti laboratorijos sudarytų sutarčių katalogai, kuriuose ieškota komerciškai prieinamų benzimidazolo junginių. Junginių-kandidatų sarašai buvo apdorojami MS Office Excel 16 (Microsoft, JAV) programa, kartu su JChem papildiniu (ChemAxon, JAV). Pirminiams duomenims (t.y. junginiams) taikomi kriterijai:

• Ghose filtras (atitinka) • Veberio filtras (atitinka) • Muegge filtras (atitinka)

• logS tirpumas > -4,5 (netirpus < -10 < mažai tirpus < -6 < vidutinio tirpumo < -4 < tirpus < -2 < labai tirpus < 0 < nepaprastai tirpus).

Antriniam duomenų apdorojimui naudotos programos: Open Babel 2.4.1 (GNU General Public Licence), UCSF Chimera 1.13.1 (Kalifornijos universitetas, JAV), QuickVina-W [47].

Bioinformacinio modeliavimo metu atrastas ir tyrimams naudotas BCAT2 slopiklis 2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolas (2FBI-1; AURUM Pharmatech, JAV).

2.7 Statistinė duomenų analizė

Duomenys, gauti tyrimų metu, kaupiami ir analizuojami naudojant MS Office Excel 16 programą. Statistinė analizė atlikta su SigmaPlot v12.0 (Systal Software Inc. JAV). Kiekvienam bandymui atlikti bent 3 biologiniai pakartojimai (n=3). Apdoroti duomenys pateikiami aritmetiniu vidurkiu ± standartine paklaida (SE) bei pavaizduoti stulpelinėmis diagramomis. Rezultatų patikimumas vertintas Stjudento T-testu nepriklausomoms imtims. Reikšmingumo lygmuo 0,95. Sudarytos hipotezės – dvipusės. Duomenys laikomi patikimais, jeigu p reikšmė <0,05 – tokie rezultatai žymimi * (lyginant su kontrole) ir/arba # (kitais atvejais).

3. REZULTATAI

3.1 Ląstelių proliferacija po BCAT2 nutildymo

išreiškiama žemiausia ribine reikšme (t.y. jeigu pokytis 20 ± 1%, tai rašoma 19%).

5 pav. siRNR prieš BCAT2 transfekcijos poveikis navikinių ląstelių proliferacijai

Kadangi iš ankstesnių tyrimų žinoma, jog normalios epitelio ląstelės, tokios kaip MCF-10A, turi žymiai mažesnį BCAT2 baltymo kiekį, po transfekcijos su siRNR lėtesnė proliferacija nepastebėta iki 72 val (5 pav. raudona). Po šio laiko galimai ląstelėms ima trūkti nepakeičiamų aminorūgščių ir proliferacija sulėtėja mažiausiai 20,84%.

Priešingų rezultatų tikėtasi tyrime su MCF-7 ląstelių linija (5 pav. oranžinė), kuri, kaip ir kitos navikinių ląstelių linijos, gamina žymiai didesnį BCAT2 baltymo kiekį, taigi, užblokavus BCAT2 buvo tikimasi sulėtėjusios ląstelių proliferacijos. Nepaisant to, atlikto tyrimo metu pastebėtas proliferacijos lėtėjimas buvo mažesnis, lyginant su mock kontrole, dėl BCAT2 geno nutildymo po 48 ir 72 val. Po 48 val. ląstelių kiekis šulinėlyje, lyginant su mock kontrole, išaugo mažiausiai 8,66%, o po 72 val. – dar bent 3,34%.

Po BCAT2 geno blokavimo HeLa ląstelių linijos proliferacija sulėtėjo tik po 72 val. (5 pav. mėlyna). Tai rodo, jog HeLa ląstelių dalijimuisi mažai įtakos turi BCAT2 baltymo veikla. Lyginant su mock kontrole, ląstelių skaičius šulinėlyje praėjus 72 val. po transfekcijos buvo mažesnis bent 6,69%.

Po 24 val. statistiškai reikšmingai sulėtėjo HCT116 ląstelių proliferacija – mažiausiai 9,15% (5 pav. violetinė). Po kurio laiko šis poveikis tapo nebereikšmingas, taigi, galima teigti, kad ir HCT116 ląstelių dalijimuisi didelės įtakos BCAT2 baltymo veikla neturi.

Transfekcijos reagentai gali turėti reikšmingos įtakos ląstelių proliferacijai, tačiau tam tikrose ribose tai yra priimtina.

Apibendrinant šią dalį, galima teigti, kad BCAT2 raiškos slopinimas siRNR transfekcijos metodu buvo pakankamai veiksmingas, kad būtų galima stebėti skirtingus rezultatus tarp ląstelių linijų. Visų pirma, siRNR prieš BCAT2 transfekcija turėjo neigiamos įtakos MCF-10A ląstelių proliferacijai. Tai gali reikšti, kad prieš kuriant vaistus reikia išspręsti BCAA trūkumo sveikose ląstelėse problemą, pavyzdžiui – kartu su gydymu skiriant BCAA. Visų antra, MCF-7 ir BCC ląstelių linijos rodė sumažėjusį proliferacijos lėtėjimą po BCAT2 nutildymo. Tai susiję su pasikeitusiu šių ląstelių metabolizmu ir galimai aktyvesne mitochondrijų funkcija, bandant kompensuoti BCAA trūkumą. Gebėjimas metaboliniais keliais prisitaikyti prie pakitusių sąlygų yra būdingas navikinių ląstelių bruožas bei pagrindinė problema, su kuria susiduriama ankstyvose vaistų kūrimo stadijose.

3.2 Ląstelių gyvybingumas po BCAT2 nutildymo

Ne ką mažiau už proliferaciją svarbus rodiklis yra ląstelių gyvybingumas, jis leidžia suprasti, kiek procentų ląstelių yra vėlyvosios apoptozės stadijoje. Fluorescencinis dažas 7-AAD patenka į ląsteles ir nudažo DNR raudona fluorescencija tik tada, kai ląstelės membrana turi įtrūkimų, kas dažniausiai būna ląstelei žūstant. Dėl šios priežasties 7-AAD yra geras gyvybingumo žymuo. Šio tėkmės citometrijos būdu atlikto tyrimo duomenys pateikti visiškai gyvybingas ląsteles prilyginant 100% – kuo mažesnis gyvybingumo procentas, tuo daugiau negyvų ląstelių.

6 pav. Ląstelių gyvybingumo įvertinimas po BCAT2 geno nutildymo.

Gyvybingumas įvertintas su 7-AAD fluorescenciniu dažu

Kiek didesnės neigiamos įtakos transfekcijos reagentai turėjo MCF-7 ląstelių gyvybingumui (6 pav. oranžinė), o didžiausias pokytis matomas po 24 val. – gyvybingumas sumažėjo bent 8,54% (lyginant kontrolę su mock kontrole). Tai gali vykti dėl transfekcijos reagentų lipofilinių savybių, pažeidžiančių ląstelės membranos vientisumą – dažas lengviau patenka į ląstelę, tačiau nekeičia ląstelių gyvybingumo, ką matome grafike po ilgesnio laiko. Reikšmingos įtakos gyvybingumui BCAT2 nutildymas (lyginant su mock kontrole) šiai ląstelių linijai neturėjo.

BCC ląstelių (6 pav. žalia) gyvybingumas reikšmingai sumažėjo praėjus 24 val. po transfekcijos – gyvybingumas sumažėjo bent 4,60%, lyginant su mock kontrole. Vėliau, padidėjus ląstelių kiekiui (po 48 val.), ląstelių gyvybingumas atsistatė, taigi skirtumas tarp mock kontrolės ir su siRNR transfekuotų BCC ląstelių tapo nebereikšmingas.

Reikšmingas pokytis tarp mock kontrolės ir transfekuotų HeLa ląstelių (6 pav. mėlyna) buvo stebimas po 24 val. (sumažėjo bent 5,01%) ir po 72 val (sumažėjo bent 3,69%). Jokio reikšmingo pokyčio nepastebėta po 48 val. Tai gali būti susiję su tuo, jog tuo metu ląstelės buvo pasiekusios savo aukščiausią proliferacijos tašką, ir tik dar vėliau ląstelių gyvybingumą vėl ėmė veikti BCAT2 nutildymas.

Nutildžius BCAT2, stipriausias poveikis gyvybingumui visose linijose pasireiškė po 24 val. Vėliau, proliferacijai didėjant, gyvybingų ląstelių skaičius taip pat didėja.

3.3 Kolonijų formavimas po BCAT2 nutildymo

Kolonijų formavimo tyrimas atskleidžia vienos ląstelės gebėjimą formuoti klonus, t.y. dalintis, tokiu būdu suformuojant koloniją. Nudažius kristalo violeto tirpalu galima kolonijas matyti plika akimi, o suskaičiavus jų kiekį – galima spręsti apie ląstelių gyvybingumą. Ši savybė būdingesnė navikinėms ląstelėms – normalios MCF-10A ląstelės kolonijų neformavo. Tyrimo pradžioje, į 12-šulinėlių plokštelę sėjamas nedidelis kiekis ląstelių, kurios paskleidžiamos taip, kad iš vienos ląstelės galėtų susidaryti atskira kolonija (sėjama 100 ląstelių į šulinėlį).

7 pav. Klonogeninės analizės vaizdas

A - scheminis kolonijos, susidariusios iš vienos ląstelės, vaizdas; B – kolonijų skaičiaus ir ploto skaičiavimas naudojant Genesys vaizdinimo programinę įrangą (plokštelės nuotraukai) ir GeneTools

kompiuterine programą.

Tiriamieji šulinėliai transfekuojami arba paveikiami tam tikromis medžiagomis ir inkubuojami 5 paras. Vėliau plokštelė dažoma ir kolonijos skaičiuojamos tam skirtomis

8 pav. siRNR prieš BCAT2 transfekcijos įtaka navikinių ląstelių kolonijų formavimui

Klonogeninės analizės duomenys su nutildytu BCAT2 nerodė statistiškai reikšmingų pokyčių, išskyrus vieną liniją – BCC ląstelės (8 pav. žalia), kurios po transfekcijos siRNR statistiškai patikimai skyrėsi nuo mock kontrolės – tiek kolonijų skaičius, tiek jų plotas sumažėjo. Tad stebima BCC ląstelių mažesnė kolonijų formavimo tendencija, slopinant ląstelių BCAT2 raišką.

3.4 Mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai po BCAT2 nutildymo

Kadangi šiame tyrime mus domina mitochondrijose esantis BCAT2 (bet ne citozolio BCAT1) ir jo galima įtaka energetiniam metabolizmui, pasirinkome mitochondrijų membranos potencialą, kaip mitochondrijų energetinės būsenos rodiklį. Mitochondrijos buvo dažomos fluorescenciniu JC-1 dažu, o mitochondrijų membranos potencialas išreiškiamas raudonos/žalios fluorescencijos santykiu (R/G).

Didžiausias m MCF-10A ląstelių linijoje (9 pav. raudona) pastebimas kontrolinėje grupėje po 24 val., tačiau pastebimas didelis rezultatų išsibarstymas. Lyginant kontrolę su mock kontrole m sumažėjo 55,03%. Reikšmingos įtakos BCAT2 transfekcija MCF-10A ląstelių mitochondrijų membranos potencialui neturėjo.

reikšti, jog ląstelių metabolizmas prisitaiko prie BCAA stygiaus ir aktyvina mitochondrijas kitokiai energijos gamybai. Praėjus 24 val. po transfekcijos m padidėjo 6,29% lyginant mock kontrolę su BCAT2 siRNR grupe.

9 pav. BCAT2 geno nutildymo įtaka mitochondrijų membranos potencialo pokyčiui

m matavimas citometrijos būdu atliktas ląsteles dažant JC-1 fluorescenciniu dažu.

BCC ląstelėse (9 pav. žalia), labiau nei MCF-7, išreikštas mitochondrijų membranos potencialo pokytis po transfekcijos. Reikšmingą hiperpoliarizaciją po 24, 48 ir 72 val. rodo nutildyto BCAT2 grupė (atitinkamai bent 26,15%, 132,74% ir 188,34%), lyginant su mock kontrole.

HeLa ląstelių (9 pav. mėlyna) mitochondrijos po 24 val. jautriausiai iš visų tirtų ląstelių linijų reagavo į BCAT2 nutildymą. Po transfekcijos praėjus parai, nutildyto BCAT2 grupės m pakilo mažiausiai 4,79 karto, lyginant su mock kontrole. Praėjus 48 val. m po transfekcijos buvo 46,15% didesnis už mock kontrolės, taigi skirtumas tarp šių dviejų grupių sumažėjo. Nepaisant to, po 72 val. transfekcijos/mock kontrolės m skirtumas jau siekė 2,59 karto.

HCT116 (9 pav. violetinė) į BCAT2 nutildymą reagavo panašiai kaip ir visos navikinių ląstelių linijos – mitochondrijų membranos potencialas po 24 val. po transfekcijos pakilo mažiausiai 28,12%. Praėjus 48 val. m nuo mock kontrolės skyrėsi mažiausiai 18,33%, o po 72 val. – 21,15%.

ATP kiekį, kita vertus, ilgą laiką didelei m reikšmei išliekant, mitochondrijose padidėja aktyvių deguonies formų kiekis, žalojantis ląsteles iš vidaus.

3.5 BCAT2 slopiklio paieška

10 pav. 1-((1R,3S)-3-(((5-bromotiofen-2-il)karbonil)amino)cikloheksil)-N-metil-2-(piridin-2-il)-1H-benzimidazol-5-karboksamido (EL2) sąveika su BCAT2 baltymu

A – EL2 cheminė struktūra; B – EL2 sąveika su svarbiausiomis BCAT2 aktyviajame centre esančiomis amino rūgštimis. Juodos punktyrinės linijos vaizduoja vandenilinius ryšius, druskų tiltelius ir sąveikas

su metalais. Žalios vientisos linijos rodo hidrofobines sąveikas, o žali punktyrai – π-π ir π-katijonų sąveikas; C – BCAT2 baltymo dimero struktūros trimatis vaizdas, parengtas Chimera 1.13.1

Tirpumui apibūdinti naudojamas LogS kriterijus – kuo didesnė jo reikšmė, tuo junginys tirpesnis. Galiausiai, pritaikius filtrus ir atmetus 14 junginių dėl netinkamų vaistui savybių, dokinimui atrinkta 20 junginių. Šių 20ties junginių Gibso laisvoji energija BCAT2 aktyviąjame centre svyravo nuo 5,9 iki -9,0 J. Pastaroji – mažiausia laisvosios energijos vertė – priklausė junginiui 2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolui, kuriam sugalvotas trumpinys – 2FBI-1 (11 pav. A ir B). Šio junginio aktyvumą toliau ir tyrėme darbe.

11 pav. Junginio 2-(4-(2-(1-pirolidinil)etoksi)fenil)-1H-benzimidazolo (2FBI-1) cheminė struktūra (A) ir išsidėstymas BCAT2 aktyviąjame centre (B)

Lyginant 2FBI-1 su pradiniu EL2 (1 priedas) matoma, kad naujo junginio apskaičiuotas tirpumas geresnis nei pradininko (LogS vertė iš -6,04 pakilo iki -4.20), numatoma geresnė absorbcija virškinamajame trakte, patikimesni vaistų dizaino filtrų duomenys. Šešiakampė diagrama rodo ribas (12 pav. A, rausvas plotas), į kurias patenkanti molekulė dar yra pakankamai bioprieinama. EL2 molekulinė masė yra 538,46 g/mol, taigi ji nebepatenka į optimalias panašumo į vaistą ribas (150 – 500 g/mol) [48], tuo tarpu 2FBI-1 molinė masė yra 309,41 g/mol. „Virto kiaušinio“ diagrama (12 pav. B) atskleidžia absorbcijos ypatumus – EL2 neturėtų būti pasyviai absorbuojamas virškinamajame trakte, tuo tarpu 2FBI-1 buvo numatytas geras pasisavinimas virškinamajame trakte ir prasiskverbimas pro hematoencefalinį barjerą. Svarbu paminėti, jog šis junginys nėra gerai žinomas ir su juo nėra atlikta saugumo bei kitų eksperimentų, todėl jokios informacijos nei apie junginio laikymo sąlygas, nei apie saugumo klasę mes neturime. Nors junginio tirpumas geresnis už jo pirmtako, PBS tirpale reikiamas kiekis medžiagos vis tiek mažai tirpo. Dėl šios priežasties buvo nuspręsta junginį tirpinti absoliučiame etanolyje ir tik tada skiesti ląstelių mitybine terpe iki reikiamos koncentracijos.

12 pav. EL2 ir 2FBI-1 bioprieinamumą sąlygojančių savybių palyginimas

Šešiakampė diagrama (A): LIPO – molekulės lipofiliškumas; SIZE – molekulės dydis; POLAR – molekulės poliškumas; INSOLU – molekulės netirpumas vandenyje; INSATU – molekulės neprisisotinimas; FLEX – molekulės lankstumas; „Virto kiaušinio“ diagrama (B): WLOGP –

lipofiliškumas ; TPSA - topologinis polinio paviršiaus plotas.

3.6 Ląstelių proliferacija po BCAT2 slopinimo 2FBI-1

Ląstelės buvo veiktos 4 skirtingomis 2FBI-1 koncentracijomis: 10 M, 30 μM, 50 μM ir 100 μM. Kadangi jokios informacijos apie šio junginio toksiškumą neturime, pastaroji koncentracija buvo pasirinkta patikrinti didelės koncentracijos poveikį skirtingoms ląstelių linijoms. Kaip ir siRNR transfekcijos atveju, poveikis tirtas po 24, 48 ir 72 val.

Po poveikio praėjus 24 val. MCF-10A ląstelių proliferacija nerodė reikšmingo skirtumo tarp kontrolės ir tirtų naujo junginio koncentracijų (13 pav.). Tik praėjus 48 val. pastebėtas pirmas reikšmingas ląstelių skaičiaus sumažėjimas su 30 μM (mažiausiai 7,24%) ir 50 μM (mažiausiai 33,27%) 2FBI-1 koncentracijomis. Praėjus 72 val. 30μM ir 50μM 2FBI-1 koncentracijos mažino ląstelių proliferaciją atitinkamai bent 20,66% ir 58,92%.

24 val. grupėje MCF-7 ir BCC ląstelių proliferaciją reikšmingai lėtino 50 μM (atitinkamai bent 39,48% ir 30,31%) ir 100 μM (atitinkamai bent 42,70% ir 44,91%) 2FBI-1 koncentracijos. Po 48 val. pastebėtas ir 30 μM 2FBI-1 koncentracijos poveikis (MCF-7 grupėje ši medžiaga mažino proliferaciją bent 19,45%, o BCC – didino mažiausiai 38,15%). Kitos naudotos 2FBI-1 koncentracijos MCF-7 ląstelių proliferaciją lėtino bent 51,80% (50 μM) ir 78,27% (100 μM), o BCC ląstelių – 50 μM 2FBI-1 koncentracija ląstelių skaičių didino bent 29,10%. Po poveikio praėjus 72 val. 10 μM 2FBI-1 koncentracija šiose abiejose linijose vis dar nerodė skirtumo nuo kontrolės. Kitos naudotos 30μM, 50 μM, 100 μM 2FBI-1 koncentracijos MCF-7 ląstelių skaičių mažino atitinkamai bent 15,15%, 75,70% ir 93,21%. Statistiškai reikšmingai BCC ląstelių proliferaciją lėtino tik 50μM (bent 26,69%) ir 100 μM (bent 67,90%) 2FBI-1 koncentracijos.

13 pav. 2FBI-1 poveikis ląstelių proliferacijai

N/A – klaidingi duomenys (angl. not applicable)

Panašu, jog vienintelė ląstelių linija, kurią nuo pat pradžių veikia 10 µM 2FBI-1 koncentracija yra HCT116. Po poveikio praėjus 24 val., proliferacija sumažėjo visuose junginiu veiktuose šulinėliuose. Grupėje po 48 val. matomas proliferacijos pagreitėjimas veikiant 10 µM 2FBI-1 koncentracija. Praėjus 72 val. šios koncentracijos grupė statistiškai jau nebesiskyrė nuo kontrolės. Čia atsikartoja tas pats reiškinys, kaip HeLa ląstelių linijoje. HCT116 ląsteles veikiant didžiausia 2FBI-1 koncentracija, pastebėtas statistiškai reikšmingas ląstelių skaičiaus padidėjimas bent 11,50% (lyginant su kontrole). Per didelė junginio koncentracija galėjo iškreipti rezultatus, ląstelės galėjo sprogti ir jų dalis citometro detektorius skaičiuoti kaip atskiras ląsteles.

3.7 Ląstelių gyvybingumas po BCAT2 slopinimo 2FBI-1

Kadangi jau žinome, kad 2FBI-1 mažina proliferuojančių ląstelių skaičių, svarbu atsižvelgti ir į tai, ar likusios ląstelės lieka gyvybingos. Tam tikslui, kaip ir ankstesniuose eksperimentuose, buvo panaudotas 7-AAD dažas.

Sveikų krūties audinio epitelio ląstelių MCF-10A gyvybingumas statistiškai reikšmingai sumažėjo praėjus 24 val. po poveikio, naudojant 30 µM (bent 2,69%) ir 50 µM (bent 2,25%) 2FBI-1 koncentracijas (13 pav.). Nors ir statistiškai patikimas, toks gyvybingumo sumažėjimas neturi didelės reikšmės, tiek po 48 val. (mažiausiai 2,80% prie 30 µM ir 4,02% prie 50 µM koncentracijos), tiek po 72 val. (bent 4,03% prie 30 µM koncentracijos) jis išliko panašus. Labiausiai gyvybingumas pakito po 72 val., naudojant 50 µM 2FBI-1 koncentraciją – sumažėjo bent 13,71%.

13 pav. 2FBI-1 poveikis 7-AAD dažytų ląstelių gyvybingumui

N/A – klaidingi duomenys (angl. not applicable)

tampa mažiau patikimi dėl didesnio išsibarstymo. Į tai svarbu atsižvelgti interpretuojant tolimesnius rezultatus.

BCC ląstelės dar kartą parodė, jog per maža medžiagos koncentracija gali net padidinti gyvybingumą – tokie duomenys stebimi po 24 val., esant 10 µM 2FBI-1 koncentracijai. Vėliau ši koncentracija neberodo reikšmingo pokyčio, lyginant su kontrole. Visos kitos didesnės 2FBI-1 koncentracijos efektyviai mažina ląstelių gyvybingumą visais tiriamais laiko tarpais, nors panašu, kad mažiau negu MCF-7 ląstelių linijoje. Po 24 val. gyvybingumas sumažėjo 2,62%, 13,11% ir 24,14% (atitinkamai 30 µM, 50 µM ir 100 µM), taigi, beveik trimis kartais mažiau, negu sumažėjo MCF-7 ląstelių grupėje.

Po 24 val. HeLa ląstelių gyvybingumą neigiamai veikė net ir 10 µM koncentracija (mažiausiai 6,58%). Panašiai veikė ir 30 µM 2FBI-1. Žymiai geresni rezultatai matomi naudojant 50 µM slopiklio koncentraciją – gyvybingumas sumažėjo bent 38,14%. Tuo tarpu 100 µM sumažino gyvybingumą mažiausiai 83,92%. Kitais laikais rezultatai panašūs, išskyrus 100 µM koncentraciją po 72 val. – ji gyvybingumą mažino bent 45,01%, t.y. beveik du kartus mažiau negu po 24 ir 48 val. Tai taip pat gali būti susiję su duomenų išsibarstymu dėl didelės koncentracijos, kaip jau buvo anksčiau paminėta. Be to, po 72 val. reikšmingo skirtumo nuo kontrolės neberodė 10 µM ir 30 µM slopiklio koncentracijos. Galbūt dėl to, kad ląstelių skaičius 10 µM 2FBI-1 grupėje buvo išaugęs beveik 2 kartus, lyginant su kontrole. Didėjant ląstelių skaičiui mažėja junginio poveikis joms.

HCT116 ląstelių gyvybingumą 2FBI-1 veikė pagal koncentracijos gradientą, panašiai kaip HeLa. Slopiklio 30 µM koncentracija mažino HCT116 ląstelių gyvybingumą labiau negu MCF-10A, MCF-7, BCC ar HeLa ląstelių (mažiausiai 29,43%). Po 72 val. vėl pasikartoja tas pats duomenų išsibarstymas, kuris atsispindėjo ir kalbant apie ląstelių skaičių šulinėlyje.

3.8 Kolonijų formavimas po BCAT2 slopinimo 2FBI-1

14 pav. 2FBI-1 įtaka navikinių ląstelių kolonijų formavimui

Kolonijų skaičius reikšmingai kito tik BCC ir HCT116 ląstelių linijose (14 pav. A). Abi pasirinktos potencialaus vaisto koncentracijos patikimai didino BCC ląstelių kolonijų skaičių (maždaug 30%), tai patvirtina anksčiau gautus proliferacijos rezultatus su 2FBI-1 po 48 val. Tuo tarpu HeLa ląstelių kolonijų formavimą 2FBI-1 keitė į priešingą pusę – kolonijų kiekis sumažėjo bent 26,90%.

Nors kolonijų kiekis sumažėjo ne visose ląstelių linijose, labai svarbu atsižvelgti ir į kolonijų plotą – jis patikimai sumažėjo kiekvienoje linijoje (14 pav. B). Veikiant ląsteles 2FBI-1 slopikliu, kolonijų plotas sumažėjo MCF-7 ląstelių bent 26,57% (30 µM) ir 33,14% (50 µM), BCC – 21,77% (30 µM) ir 36,16% (50 µM), HeLa – 36,14% (50 µM), HCT116 – 6,41% (30 µM) ir 40,29% (50 µM).

3.9 Mitochondrijų membranos potencialo pokyčiai po BCAT2 slopinimo 2FBI-1

15 pav. 2FBI-1 poveikis ląstelių mitochondrijų membranos potencialui

Nors navikinėse linijose ir matomas labai ryškus teigiamas potencialo pokytis, paveikus jas 2FBI-1, MCF-10A ląstelių linijoje po 24 val. nebuvo gauta statistiškai reikšmingų skirtumų nuo kontrolės (15 pav.). Po 48 valandų 30 µM 2FBI-1 koncentracija m pakėlė mažiausiai 26,90%, tačiau 50 µM koncentracijos poveikio nepastebėta. Toks rezultatas nestebina, pažiūrėjus į kitas ląstelių linijas – m iki maksimumo didina tam tikra koncentracija, ir, galiausiai, mitochondrijų membranos potencialo reikšmė ima mažėti 2FBI-1 koncentracijai didėjant. Tokie duomenys susiję su tuo, jog ženkliai pakilus m, dauguma ląstelių to neišgyvena ir dėl šios priežasties jų mitochondrijų membranos potencialas krenta. Taip pat, esant aukštoms potencialaus vaisto koncentracijoms didėja ląstelių heterogeniškumas, jos susitraukia, plyšta, ir citometro detektorius jas fiksuoja kaip skirtingo dydžio daleles, todėl tampa sunku interpretuoti rezultatus. Po 72 val. 30 µM 2FBI-1 koncentracija vis dar didina m (bent 48,69%), tuo tarpu 50 µM – mažina (bent 4,67%).

po 24 val.). Paveikus kai kuriomis 2FBI-1 koncentracijomis po 48 val. mitochondrijų membranos potencialas viršija kontroles net iki 20 kartų.

BCC ląstelių grupėje po 24 val. poveikio 2FBI-1 koncentracijų didėjimo tvarka m atitinkamai didėja mažiausiai 1, 4, 7 bei 8 kartus. Po 48 val. didžiausia pasiekta m reikšmė kontrolės reikšmę viršija 16 kartų, o po 72 val. mitochondrijų membranos potencialas išlieka panašus.

Po 24 val. didžiausią m skirtumą (104 kartus viršijo kontroles) pasiekė HeLa ląstelių linija su 50 µM 2FBI-1. Anksčiausiai pasiekus maksimalią reikšmę, po 72 val. tos pačios koncentracijos ir kontrolės mitochondrijų membranos potencialų santykis buvo 13,18%.

Aukščiausią potencialo reikšmę (203,85 ± 28,34) tarp visų rezultatų pasiekė HCT116 ląstelių linija po 72 val, paveikta 50 µM slopiklio koncentracija. Ši reikšmė net 39 kartus viršijo kontroles. Kitais laiko tarpais taip pat stipriausiai veikė 50 µM 2FBI-1 koncentracija. Po 24 val. ji mitochondrijų membranos potencialą didino net 52 kartus, ir pasiekė 68,03 ± 7,63 reikšmę, o po 48 val. siekė 84,45 ± 18,62 (44 kartus didesnė už kontrolę).

Akivaizdu, jog paveikus ląsteles junginiu 2FBI-1, mitochondrijų membranos pastebimai hiperpoliarizuojasi. Toks poveikis pasireiškia ir sveikose MCF-10A ląstelėse, tačiau lėčiau, pvz., veiksmingiausia 50 µM 2FBI-1 koncentracija po 24 val. neturėjo reikšmingo poveikio, bet poveikis pasireiškė tik po 48 val. Tai gali būti siejama su mažesniu BCAT2 baltymo reikšmingumu sveikoms ląstelėms.

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Taip pat, BCAT1 geno slopinimas mažina laktato išskyrimą CHO ląstelėse, tuo tarpu BCAT2 slopinimas neturi įtakos šių lastelių šalutinių produktų profiliui [49]. Sumažėjęs laktato išskyrimas gali reikšti sumažėjusį gliukozės suvartojimą ląstelių energijai, o tai – intensyvesnį oksidacinį fosforilinimą mitochondrijose. McBrayer su bendradarbiais tyrimais įrodė, jog BCAT1 ir BCAT2 slopinimas žmogaus gliomos ląstelėse sukelia kompensuojančias glutamino metabolizmo reakcijas, kurias vykdo fermentas glutaminazė, verčiantis glutaminą glutamatu [50]. Mūsų tyrimų metu pastebėtas mitochondrijų suaktyvėjimas navikinėse ląstelėse, slopinant BCAT2 tiek RNRi būdu, tiek slopiklio 2FBI-1 pagalba. Beje, kad kai kurių ląstelių (BCC, HeLa ir HCT116) proliferacija, veikiant jas mažomis 2FBI-1 dozėmis tam tikrą laiką po poveikio netgi padidėjo, taigi šioms ląstelėms galėjo pasireikšti kompensuojančių glutamino metabolizmo reakcijų poveikis. Tiesa, Li su kolegoms, kaip ir mes, tyrė m pokytį navikinėse ląstelėse (kasos) slopinant BCAT2 RNRi – rezultatai priešingi: m sumažėjo, kaip sumažėjo ir aktyvių deguonies formų mitochondrijose [51]. Dėl pastarųjų tyrimų rezultatų negalime teigti, jog mitochondrijų aktyvumo padidėjimas yra būdingas visoms navikinių ląstelių linijoms. Nepaisant nesutapimų, BCAT2 svarba kasos latakų adenokarcinomai yra gerai ištirta. Pavyzdžiui, Li ir kolegų tyrimų metu slopinant BCAT2 baltymą, reikšmingai sumažėjo kasos latakų naviko organoidų formavimas. Jis vėl atsistatė, papildžius mitybinę terpę BCKA [51]. Tyrimų su pelėmis, kurioms paskirta BCAA ribojanti dieta, rezultatai rodo, jog mitybos reguliavimas taip pat gali būti efektyvus, kovojant su kasos latakų adenokarcinoma [51]. Taip pat, Lee ir bendradarbiai atliktų tyrimų metu atskleidė, jog BCAT2 slopinimas pastebimai sutrikdo žmogaus kasos latakų adenokarcinomos ląstelių proliferacija, tačiau neveikia normalių žmogaus kasos latakų ląstelių dalijimosi. Adenomos ląstelėse buvo pastebėtas BCAT2 kiekio padidėjimas, lyginant su normaliomis ląstelėmis, tačiau jokių glutamato kiekio ar reaktyvių deguonies formų pokyčių tyrimo metu nepastebėta [52], taigi, kasos liaukų adenomos ląstelės galimai nesinaudoja prieš tai minėtomis kompensuojančiomis glutaminazės reakcijomis, dėl to nepasireiškia aktyvesnis oksidacinis fosforilinimas bei m hiperpoliarizacija, kuri matoma mūsų tirtų ląstelių (MCF-7, BCC, HeLa bei HCT116) atvėju.

HCT116 linija mūsų tyrimui buvo pasirinkta palyginimui, kadangi ankstesnių Antanavičiūtės ir kolegų modeliavimo tyrimų metu buvo išsiaiškinta, kad HCT116 BCAA metabolizmo metu gauna mažesnį kiekį ATP, nei krūties naviko ląstelės MCF-7. Šis teiginys pasitvirtino tyrimuose su siRNR prieš BCAT2, kuomet HCT116 gyvybingumas ir proliferacija sumažėjo tik iš dalies. Grankvist su grupe proteomikos tyrimai parodė, kad BCAT2 galimai yra dominuojanti BCAT izoforma HCT116 ląstelėse, lyginant su BCAT1 [56], tuo tarpu Xie ir kolegų tyrimų metu išsiaiškinta, jog ilga nekoduojanti RNR prieš BCAT1 vis tiek mažina HCT116 ląstelių proliferaciją ir invazyvumą [57]. Mūsų tyrimo su 2FBI-1 metu gauti rezultatai rodė ryškų HCT116 proliferacijos ir gyvybingumo sumažėjimą. Benzimidazolo fragmentą turinčius junginius BCAT2 slopinimui taip pat taikė GlaxoSmithKline tyrimus vykdanti grupė. Po ilgų struktūros-aktyvumo ryšio modeliavimo eksperimentų rasti junginiai buvo tirti ikiklinikinuose tyrimuose su pelėmis, kurių rezultatai rodė padidėjusį plazmoje cirkuoliuojančių BCAA kiekį [58].