CAPITOLO 4 RISULTATI

57

CAPITOLO 4

RISULTATI

4.1. CARATTERIZZAZIONE MECCANICA

La caratterizzazione dei vari materiali è servita come prima fase di screening utile alla comprensione delle caratteristiche fisiche dei prodotti presi in esame. Tale analisi ha permesso di comprendere quali materiali potessero presentare parametri biomeccanici comparabili col tessuto da sostituire.

4.1.1. PROVE DI TRAZIONE SU STRUTTURE DI GELATINA

Sulle strutture a base di gelatina fornite Politecnico di Torino (Diparimento di Ingegneria Meccanica e Aerospaziale, DIMEAS) sono state effettuate le prove meccaniche, ricordando che la forza massima a cui può essere sottoposta la parete addominale va da 11 a 27 N/cm, si può affermare che dal punto di vista meccanico tutti i campioni analizzati superano questi valori prima di rompersi.

Figura 13. Modulo Elastico e Deformazione massima di film di gelatina e film di gelatina con GPTMS. Per il modulo elastico i valori di rifermento sono: CMC 32 MPa; Tessuto 42,5 KPa. Per deformazione massima i valori di riferimento sono: CMCPCL 2,5 MPa; Tessuto 1,9 MPa

58

Figura 14. Modulo Elastico e Deformazione massima di spugne di gelatina e spugne di gelatina con GPTMS. Per il modulo elastico i valori di rifermento sono: CMC 32 MPa; Tessuto 42,5 KPa. Per deformazione massima i valori di riferimento sono: CMCPL 2,5 MPa; Tessuto 1,9 MPa

Confrontando i valori del modulo elastico del film di gelatina e della gelatina con GPTMS (γ-glicidossipropiltrimetossisilano) non si riscontrano differenze tra i due materiali (Figura 13), mentre l'effetto del GPTMS porta ad una diminuzione dei valori di deformazione massima prima della rottura. Al contrario le spugne di gelatina e la gelatina con GPTMS hanno proprietà meccaniche molto diverse (Figura 14). L'aggiunta del GPTMS rende le spugne più rigide, aumentandone la forza massima di carico. Il valore del modulo elastico e della forza massima di carico delle spugne risulta minore rispetto ad i film di gelatina di due ordini di grandezza.

L'effetto del GPTMS di creare legami crociati nella gelatina porta a modifiche nel modulo elastico delle spugne di gelatina, mentre nei film riduce la possibilità di deformazione massima.

4.1.2. PROVE DI TRAZIONE SU STRUTTURE A BASE DI

PCL

Sulle strutture a base di PEG (polietilenglicole) e PCL (policaprolattone) fornite dal Politecnico di Torino (come su) sono stati effettuati i medesimi test meccanici. In questi campioni il PEG è utilizzato come porogeno per il PCL a diverse concentrazioni, le due forme PEG1 e PEG2 differiscono solo per il peso molecolare che è 1x104 Da nel primo

caso e 3,5x104 Da nel secondo. Sono testati campioni prima e dopo un lavaggio di 48 ore con acqua che elimina il PEG liberando i pori, come controllo è testato PCL puro.

59

 PCL/PEG1 60/40 compact

 PCL/PEG1 70/30 compact

 PCL/PEG2 60/40 compact

 PCL/PEG2 70/30 compact

 PCL/PEG1 60/40 porous (rinominato PCL1-6i)

 PCL/PEG1 70/30 porous (rinominato PCL1-7i)

 PCL/PEG2 60/40 porous (rinominato PCL2-6i)

 PCL/PEG2 70/30 porous (rinominato PCL2-7i)

Figura 15. Modulo elastico e Carico di forza massima dei campioni costituiti dalle varie miscele di PCL/PEG1 PCL/PEG2 sia compatti che porosi. Per il modulo elastico i valori di rifermento sono: CMC 32 MPa; Tessuto 42,5 KPa. Per massimo stress i valori di riferimento sono: CMCPCL 2,5 MPa; Tessuto 1,9 MPa

60 Il comportamento meccanico dei 9 materiali è mostrato nella Figura 15 che raffigurano rispettivamente il modulo elastico e il carico di forza massima. Come aspettato, il modulo elastico incrementa con l'incremento del contenuto di PCL sia nei campioni compatti che in quelli porosi. I campioni con PEG2 usato come porogeno dimostrano un maggiore modulo elastico rispetto ai campioni con PEG1. In tutti i casi i campioni porosi hanno minore rigidità rispetto a quelli compatti. Il carico massimo sopportato aumenta con l'aumentare del contenuto di PCL. Campioni con PEG2 sopportano il carico di forza massima maggiore rispetto a quelli contenenti PEG1; il valore massimo registrato si ha con PCL puro.

4.2. DETERMINAZIONE DELLA CITOTOSSICITA'

La valutazione del saggio di vitalità cellulare è effettuata tramite test dell’Alamar Blue (CellTiter Blue®, Promega, Madison U.S.A.) su cellule incubate per 72h con terreno condizionato. La diminuzione del valore di fluorescenza prodotta è correlata al grado di citotossicità dovuto dall’esposizione delle cellule al terreno condizionato. Quando il valore della VC (Vitalità Cellulare) diminuisce oltre il 70% il campione è ritenuto citotossico e viene escluso dai successivi test.

Considerando i risultati ottenuti dal test di citotossicità (Figura 16), ad esclusione dei materiali CMCPCL154 e CMCPUP100, tutti materiali presentano una elevato grado di citocompatibilità (superiore al 70% come VC).

61

Figura 16. Risultati del protocollo di citotossicità effettuato sui campioni FILMPU50 lotto P00152; 2P1824EV lotto P00153; CMCPCL154 lotto P00154; CMCPUP100 lotto P00155; CMCPU50 lotto P00156; 120MLPUP50 lotto P00157; filmPCL; CMCPCL .

Per quanto concerne la sperimentazione con i materiali a base di gelatina e miscele di PEG e PCL, questi presentano tutti una vitalità comparabile al controllo negativo (VC uguale 100%). -20 0 20 40 60 80 100 120 140 V it ab ilit y (% )

CITOTOSSICITA'

62

Figura 17. Risultati del protocollo di citotossicità effettuato sui campioni: spugna di Gelatina+GPTMS; film di Gelatina +GPTMS; film PCL; PCL/PEG1 60/40; PCL/PEG1 70/30; PCL/PEG2 60/40; PCL/PEG2 70/30; PCL6-1i; PCL6-2i; PCL7-PCL6-1i; PCL7-2i.

Tutte le strutture a base di gelatina e di PCL (Figura 17) hanno riportato valori di VC al di sopra del 70%. Le strutture in gelatina hanno presentato un problema di dissoluzione in terreno che ne ha escluso l’impego nella fase successiva di crescita cellulare.

Per quelle in PCL e PEG, il test di crescita è stato condotto solo su PCL/PEG1 60/40, PCL6-1i, PCL6-2i, PCL7-1i e PCL7-2i: questi materiali presentavano valori di modulo di Young più vicini a quelli tissutali.

4.3. CURVE DI CRESCITA

Su campioni che sono risultati biocompatibili e con parametri meccanici ottimali è stato valutato il profilo di crescita cellulare determinando la vitalità cellulare con il test dell’Alamar Blue (CellTiter Blue®

, Promega, Madison U.S.A.) ai giorni 1, 3, 7, 10, 14, 17, 21. La vitalità dei campioni è espressa come RFU a 150'.

Figura 18. Curve di crescita ricavate sui due lati del campione di CMCPCL e cellule di controllo. -10000 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 1 3 7 10 14 17 21 Va ib ili ty (RFU ) Time (day)

CELL GROWTH

63

Figura 19. Curve di crescita cellulare ricavate dai campioni di FILMPU50, 2P1824EV, 120MLPUP50 e cellule di controllo.

Figura 20. Curve di crescita cellulare ricavate dai campioni di PCL/PEG1 60/40, PCL6-1i, PCL6-2i, PCL7-1i, PCL7-2i, PCL e cellule di controllo.

-20000 -10000 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 1 3 7 10 14 17 21 Vai b ili ty (R FU ) Time (day)

CELL GROWTH

CELL GROWTH

64 Il campione di CMCPCL, protesi DIPROMED, è stato testato sia sulla faccia che viene applicata sul difetto erniale, sia sulla faccia opposta a contatto con i visceri. Come è evidente dal grafico (Figura 18), la colonizzazione da parte dei fibroblasti delle due superfici è paragonabile.

Nel secondo esperimento (Figura 19 ), in cui sono state testate protesi composte da materiali tradizionali ottenute con metodiche solvent casting, le strutture che hanno portato ad una colonizzazione efficace da parte delle cellule sono 2P1824EV (riferimento per gli altri materiali) e 120MLPUP50.

Per quanto riguarda le nuove strutture a base di PEG/PCL (Figura 20), come detto nel paragrafo precedente, sono state selezionate per questo test solo quelle che presentavano un modulo di Young comparabile col tessuto di riferimento. Di tutti i materiali, solo PCL7-2i ha mostrato un trend di crescita comparabile con il film di PCL e 2P1824EV.

4.4. INTERLEUCHINA 10 ed INTERLEUCHINA 6

Come per la produzione di collagene di tipo I e III, i materiali che hanno mostrato un buon trend di crescita sono stati testati sotto il profilo della riposta anti- e pro-infiammatoria valutando la produzione di Interleuchina-10 (IL-10) ed Interleuchina-6 (IL-6). Perché una mesh sia ben tollerata da parte del paziente è importante che il processo infiammatorio non si cronicizzi dato che lo sviluppo di adesioni tra protesi e visceri e del dolore cronico sono correlati ad un alto livello infiammatorio prolungato nel tempo.

I livelli di IL-10, nei controlli, aumentano, a parità di numeri cellulari, con l'aumentare dei giorni di coltura (Figura 21). Il trend indotto dai campioni testati risulta essere opposto: sia ha una grande produzione di IL-10 nei primi giorni di coltura e un graduale decremento con il passare del tempo.

65

Figura 21. Concentrazioni di IL-10 nel mezzo di coltura dei campioni 2P1824EV, 120MLPUP50, CMCPCL , PCL e PCL7-2i al giorno 7, 14, 21.

In generale i composti a base di PCL mostrano una produzione maggiore di IL-10 rispetto agli altri campioni testati.

I risultati ottenuti dall'analisi dell'IL-6 mostrano come i campioni inducono un grande aumento nella secrezione (di 2 ordini di grandezza) di questa citochina pro-infiammatoria rispetto al controllo (Figura 22). Il PCL7-2i ha invece indotto livelli di IL-6 paragonabili a quelli dei controlli, mostrando le potenzialità di portare ad una diminuzione dell'entità dell'infiammazione acuta postoperatoria.

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

CTRL 2P1824EV 120MLPUP50 CMCPCL PCL PCL7-2i

IL -10 (n g/ m l* 10^ 5 ce lls)

IL-10

CTRL 2P1824EV 120MLPUP50 CMCPCL PCL PCL7-2i

IL -6 ( n g/ m l* 10^ 5 ce lls)

IL-6

66

Figura 22. Concentrazioni di IL-6 nel mezzo di coltura dei campioni 2P1824EV, 120MLPUP50, CMCPCL, PCL e PCL7-2i al giorno 7, 14, 21.

Il calcolo del rapporto tra le concentrazioni di IL-6/IL-10 ci mostra, ancora una volta, come le protesi inducano una maggiore espressione dei marker pro-infiammatori rispetto al controllo (Figura 23). Dal grafico si può notare che, sebbene i dati siano comparabili nei primi giorni di coltura, al 21° giorno ci sia un brusco cambiamento nel profilo infiammatorio dovuto all'incremento nell'espressione dell'IL-6 e alla contemporanea diminuzione dell'IL-10. I valori ottenuti per il PCL7-2i non mostrano un grande squilibrio nell'induzione di marker pro- ed anti-infiammatori, rimanendo praticamente costante in tutte le fasi della coltura cellulare proprio come accade per i controlli.

Figura 23 Rapporto dei valori di IL-6/IL-10 dei campioni 2P1824EV, 120MLPUP50, CMCPCL, PCL e PCL7-2i al giorno 7, 14, 21.

In Figura 24 si può ossevare nello specifico il rapporto dei valori IL-6/IL-10 nel controllo, in CMCPCL e in PCL7-2i. Confrontando questi dati si può notare che le mesh, in maniera opposta rispetto al controllo, portano ad un incremento nell'espressione dell'IL-6. Nello specifico per quanto riguarda la CMCPCL si hanno al 21 giorno valori di IL-6 100 volte maggiori rispetto all'IL-10, mentre, per PCL7-2i i valori sono comparabili proprio come per i controlli (Figura 26).

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

CTRL 2P1824EV 120MLPUP50 CMCPCL PCL PCL7-2i

IL -6/IL -10 ratio

IL-6/IL-10 Ratio

67

Figura 24. Rapporto dei valori di IL-6/IL-10 nei controlli, in CMCPCL ed in PCL7-2i al giorno 7, 14, 21.

Confrontando il trend dell'espressione dell'IL-6 e dell'IL-10 al 7, 14, 21 giorno si può osservare come nel controllo le due citochine abbiano un andamento opposto: IL-6 tende a diminuire con il progredire dei giorni di coltura, mentre l'10 tende lievemente ad incrementare (Figura 25).

Figura 25. Trend di produzione dell'Interleuchina 6 e dell'Interleuchina 10 nei controlli al giorno 7, 14, 21. 0 500 1000 1500 2000 2500 7 14 21 Int e rl e uki n co nc e nt ra ti o n ( ng /ml *1 0 ^5 c e lls) Time (day)

RATIO

CTRL: Interleukin trend

68

Figura 26. Trend di produzione dell'interleuchina 6 e dell'interleuchina 10 nei campioni di PCL7-2i al giorno 7, 14, 21.

4.5. IMMUNOISTOCHIMICA

I test precedentemente descritti hanno permesso di selezionare una serie di materiali sui quali effettuare test utili a caratterizzare in maniera più specifica il comportamento biologico degli stessi. Per valutare possibili alterazioni della matrice extracellulare dovute all'utilizzo delle protesi abbiamo analizzato la produzione del collagene di tipo I e di collagene di tipo III dopo 21 giorni di coltura. I risultati ottenuti indicano una maggiore secrezione fisiologica da parte delle cellule del collagene di tipo III, ovvero quello neoformato, rispetto al collagene di tipo I. Rispetto al controllo, dove la produzione di collagene I è limitata, alcuni campioni come CMCPCL e PCL7-2i (Figura 28), mostrano una tendenza all'aumento della produzione di collagene I e ad una diminuzione nella secrezione di collagene III. Questo risultato è incoraggiante in quanto un aumento del collagene maturo a discapito di quello neoformato indica un aumento della resistenza della matrice extracellulare e, di conseguenza, della parete addominale.

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 7 14 21 Int e re luki n co nc e nt ra ti o n (n g/ml *1 0 ^5 c e lls) Time (day)

PCL7-2i: Interleukin trend

IL-6 IL-10

69

COLLAGENE I COLLAGENE III NUCLEO

CTRL

CMCPCL

PCL7-2i

Figura 27. Immagini (10X) acquisite su cellule di controllo e da colture sulle strutture di CMCPCL e d PCL7-2i. Il collagene di tipo I è messo in evidenza con anticorpo secondario conniugato al fluoroforo FITC, il collagene di tipo III con anticorpo coniugato a rodamina ed i nuclei grazie a trattamento con DAPI.

70

Figura 28. Comparazione semi quantitativa del collagene di tipo I e di tipo III per 2P1824EV, 120MLPUP50, CMCPCL, PCL, PCL7-2i e controllo.

Il rapporto tra il collagene di tipo I e quello di tipo III è molto importante, in quanto, un suo squilibrio a favore del collagene di tipo III porta all'indebolimento della parete addominale e a recidive. Dal confronto del rapporto del controllo e dei campioni che hanno mostrato un buon trend di crescita cellulare si può notare come questo tenda ad essere simile per 2P1824EV, 120MLPUP50 e PCL rispetto al controllo (Figura 29). L'aumento di questo rapporto osservato su CMCPCL e PCL7-2i (ambedue p<0.05 rispetto al controllo e ai restanti materiali), dovuto ad un incremento del collagene I.

0 5000 10000 15000 20000 25000 30000

CTRL 2P1824EV 120MLPUP50 CMCPCL PCL PCL7-2i

C e ll M ax imal In te sni ty ( Pi xe l v al u e *10^ 5 ce lls)

IMMUNOHISTOCHEMISTRY: COLLAGEN TYPE I & III

Type I Type III 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

CTRL 2P1824EV 120MLPUP50 CMCPCL PCL PCL7-2i

Type I/ Type II I R at io

RATIO

71

Figura29. Rapporto del collagene di tipo I /III per 2P1824EV, 120MLPUP50, CMCPCL, PCL, PCL7-2i e controllo (*p<0.05).

4.6. PIRFENIDONE

I test preliminari di vitalità cellulare effettuati su colture trattate con concentrazioni decrescenti di Pirfenidone, farmaco con attività antifibrotiche e antiinfiammatorie, hanno mostrato un effetto bifasico: basse concentrazioni del farmaco portano ad un aumento della vitalità cellulare, mentre, concentrazioni crescenti ne causano una drastica diminuzione (Figura 30). Questo fenomeno è conosciuto come ormesi ed è considerato una funzione adattativa che mettono in atto molti sistemi biologici quando vengono esposti a stimoli potenzialmente tossici.

Figura 30. Vitalità cellulare dopo incubazione di 72h a diverse concentrazioni di Pirfenidone: 0,01 mg/mL, 0,03 mg/mL, 0,05 mg/mL, 0,07 mg/mL e 0,1 mg/mL.

72

4.7. SECRETOMA

I risultati sono stati ottenuti dalle curve di crescita delle cellule di controllo, a cui è stato aggiunto per 24h, ai tempi definiti nel precedente capitolo, terreno privo di siero. I fibroblasti hanno mostrato la secrezione di diverse proteine, tra cui vari componenti della matrice extracellulare come il Collagene di tipo I (Figura 32), tipo II (Figura 33), tipo III (Figura 34) e Fibronectina (Figura 35). Questi risultati indicano, al contempo, che nei campioni sono stati rilevate diverse componenti non legate alla matrice come proteine legate al citoplasma, al nucleo, alla membrana cellulare e ad organelli intracellulari (Figura 31). Ciò ha evidenziato un problema di purificazione dei campioni a cui verrà posto rimedio nelle fasi successive del progetto.

73

Figura 32. Analisi semiquantitativa del Collagene di tipo I al giorno 3, 7, 10, 14 e 17.

Figura 33. Analisi semiquantitativa del Collagene di tipo II al giorno 3, 7, 10, 14 e 17.

Figura 34. Analisi semiquantitativa del Collagene di tipo III al giorno 3, 7, 10, 14 e 17.

74

4.8. METALLOPROTEINASI

I risultati della zimografia per le metalloproteinasi MMP-2 e -9 presenti nel terreno di coltura, ottenuti per il controllo ed il materiale di riferimento, mostrano un andamento non omogeneo (Figura 36). Le MMP sono presenti nei campioni ma la diversa posizione fa pensare ad una parziale complessazione con il loro attivatore EMPRIN (Extracellular

Matrix Metalloproteinase INducer): dove la banda corre in maniera più elevata (i picchi

verso il basso), tale andamento potrebbe indicare la presenza di MMP in forma libera.

STANDARD

CTRL

2P1824EV

MMP-9

MMP-2

Figura 36 Zimografia dei campioni di terreno di coltura di fibroblasti di controllo e su 2P1824EV (14 giorni di coltura). Le bande per lo standard corrispondono a MMP-9 (100KDa) e MMP-2 (75 KDa).