LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Giedrė Partaukienė
Mikroorganizmų išskyrimas iš klinikiniu metritu sergančių karvių
Isolation of Microorganisms from Cows with Clinical Metritis
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr. Jūratė Šiugždaitė
2
DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad iteikiamas magistro baigiamasis darbas „Mikroorganizmų išskyrimas iš klinikiniu metritu sergančių karvių".
1. Yra atliktas mano paĉios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literaturos sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė ) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros vedėjo/jos vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
MIKROORGANIZMŲ IŠSKYRIMAS IŠ KLINIKINIU METRITU SERGANĈIŲ KARVIŲ
Giedrė Partaukienė
Magistro baigiamasis darbas
Santrauka
Klinikinis metritas diagnozuojamas 20-40 proc. pieninio tipo karvių, per pirmąsias 10 – 20 dienų po apsiveršiavimo. Tai reprodukcinės sistemos liga, kurią dažniausiai sukelia oportunistiniai mikroorganizmai. Metritą predisponuoja veršiavimosi sutrikimai - distokijos, vyriškos lyties veršeliai, negyvas vaisius, dvyniai ar užsilaikiusi placenta. Metritas atpažįstamas pagal pūlingas, nemalonaus kvapo, raudonai rudas išskyras iš gimdos, nebevykstanĉios gimdos involiucijos, karĉiavimo (T > 39,5°C) ir prastos bendros gyvulio fizinės būklės.
Darbo tikslas: Išskirti karvių klinikinio metrito sukėlėjus ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Tyrimo metodai ir medţiagos: Tyrimas buvo atliktas 2017 2018 metais. Mėginiai buvo imti steriliais kateteriais iš dvidešimt penkių, metritu serganĉių karvių. Visi paimti mėginiai buvo pristatyti į mikrobiologijos laboratoriją per pirmas 24 valandas nuo paėmimo. Mikroorganizmai buvo identifikuojami, jiems atlikti antimikrobinio atsparumo testai, Kirby-Bauer metodu.
Tyrimo rezultatai: Mikroorganizmai buvo išskirti iš 92 proc. klinikiniu metritu serganĉių karvių, gimdos išskyrų mėginių. Daugiausiai nustatyta Escherichia coli (70 proc.), Trueperella pyogenes ir Streptococcus dysgalactiae(9 proc.) bakterijų.
Didžiausias bendras antimikrobinis atsparumas nustatytas ceftazidimui (91,3 proc.) ir cefaklorui (65,2 proc.).
Daugiausiai metritu sirgo pirmaveršės (36 proc.), ir taip pat duodanĉios daugiau nei 35 litrus pieno per parą (60 proc.) karvės
Atlikus statistinę analizę gautas statistiškai patikimas ryšys tarp karvių pieningumo grupės ir metrito sukėlėjo rūšies (p < 0,05).
4
ISOLATION OF MICROORGANISMS FROM COWS WITH CLINICAL METRITIS
Giedrė Partaukienė
Master„s thesis
Summary
Clinical metritis is a common reproductive tract desease, caused by oportunistic microorganisms. It is present in up to 20 - 40% of dairy cows and occurs within 21 days of parturition. Metritis is characterized by enlarge uterus, pyrexia (T > 39,5°C) and watery red-brown fluid to viscous off-white purulent uterine discharge, which has a fetid odour.
The most important risk factors associates with metritis include dystocia, male offspring, stillbirth, twins and retained placenta.
Aim of research: Isolate microorganisms from the dairy cows, with clinical metritis and determine it resistence to antimicrobial agents
Materials and methods: Research was done during the period of 2017–2018 year. The samples was collected from twenty-five dairy cows with clinical metritis. The samples of uterine discharge were delivered to microbiology laboratory within 24 hours. The bacteriology analysis and antimicrobial susceptibility tests were done at lobaratory.
Results: Microorganisms were obtained from 92% samples. The hightest prevalence had Escherichia coli (70%), Trueperella pyogenes, and Streptococcus dysgalactiae (9%).
Obtained microorganisms were most resistant to ceftazidim (91,3%) and cefaclor (65,2%). The most dairy with clinical metritis was primiparous (36%) and with hight milk yields (over 35 liters/day) - (60%).
Statistical analysis revealed that there is significant prevalence of cows milk yield groups and microorganisms which caused metritis, species (p < 0,05).
5
Santrumpos
A. pyogenes - Arcanobacterium pyogenesB. cereus - Bacillus cereus
E. coli - Escherichia coli
F. necrophorum - Fusobacterium necrophorum
KA - kraujo agaras l. - litrai
m. - metai
MA - maitinamasis agaras mėn. - mėnesis
MYP - manitolio, kiaušinio trynio ir polimiksino agaras ml - mililitrai
mm - milimetrai pav. - paveikslas
P. mirabilis - Proteus mirabilis
pp - post partum - periodas po apsiveršiavimo
proc., (%)- procentai
S. dysgalactiae - Streptococcus dysgalactiae
S. uberis - Streptococcus uberis
spp. - rūšys T - temperatūra temp. - temperatūra
T. pyogenes - Trueperella pyogenes
6
μg - mikrogramai
7
Turinys
Įvadas ... 9
1. Literatūros apžvalga ... 11
1.1 Periodas po karvių apsiveršiavimo ... 11
1.2 Karvių klinikinis metritas ... 11
1.3. Metrito priežastys ... 13
1.4. Kitų veiksnių įtaka metrito pasireiškimui ... 14
1.5. Karvių gimdos infekcijas sukeliantys mikroorganizmai ir jų virulentiškumas ... 14
1.6. Metrito gydymas ... 16
1.7. Mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 16
2. Tyrimo metodai ir medžiaga... 18
2.1. Mikroorganizmų išskyrimas ... 18
2.2. Mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas ... 20
2.3. Mikrobiologinio tyrimo schema ... 21
2.4. Statistinės analizės atlikimas ... 21
3. Tyrimo rezultatai ... 22
3.1 Mikroorganizmų išskyrimas iš karvių, serganĉių klinikiniu metritu gimdos išskyrų ... 22
3.2 Mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas ... 23
3.2.1. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefuroksimui ... 23
3.2.2. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefovecinui ... 23
3.2.3. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefaklorui ... 24
3.2.4. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefoksitinui ... 25
3.2.5. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas ceftazidimui ... 25
3.3 Įvairių veiksnių įtaka metrito susirgimui ... 26
3.3.1 Klinikiniu metritu serganĉių karvių pasiskirstymas pagal laktacijos grupes ... 26
3.3.2. Karvių metrito sukėlėjų pasiskirstymas pagal pieningumo grupes ... 27
8
3.3.4. Metritu serganĉių karvių pasiskirstymas pagal užtrūkinimo trukmę ... 29
4. Rezultatų aptarimas ... 30
Išvados ... 32
Rekomendacijos ... 33
Padėka ... 34
9
Įvadas
Pieninių galvijų ūkiai Lietuvoje kasmet vis labiau auga. Juose vis daugiau laikoma aukšto produktyvumo karvių, kurių genetinės savybės, selekcijos būdu, nuolatos gerinamos importuojant bulių spermą iš užsienio šalių. Šiuo būdu yra pagerinamos visos karvių bandos produktyvumo savybės, taĉiau tuo paĉiu dažnai prarandamas bandos sveikatingumas, nes neretai .Lietuvos ūkiuose
nėra užtikrinamas pakankamai geras. šėrimo racionas bei zoohigieninės sąlygos. Dėl produktyvių
karvių polinkio sirgti įvairiomis ligomis, didelė dalis gali būti išbrokuojama dėl sunkių reprodukcijos sutrikimų bei didelių gydymo kaštų. To pasekoje ūkiai patiria didelius ekonominius nuostolius (1-3).
Literatūros šaltiniuose teigiama, kad pas 80-100 proc. karvių, pirmosiomis dienomis po apsiveršiavimo, gimdos gleivinėje yra aptinkama patogeninių bakterijų, taĉiau daugiau nei 60 proc. atvejų gyvūno imuninė sistema sugeba jas sunaikinti nespėjus pasireikšti infekcijos požymiams (8-10). Tamai et al. 2010 m., Japonijoje atliktame tyrime, nustatyta kad spontaniniu pasveikimu pasižymėjo beveik 75 proc. karvių, o likusioms karvėms nustatyta persistuojanti infekcija (daugiau nei 25 proc. karvių) (11).
Karvių metritas yra bakterijų sukeltas. ūminis gimdos uždegimas apimantis ne tik vidinį gimdos sluoksnį - endometriumą bet ir vidurinijį sluoksnį - miometriumą (21). Klinikinis karvių metritas pasireiškia per pirmąsias 10-21 dieną po apsiveršiavimo (1,4-5). Ši liga dažniausiai sutinkama pieninių karvių ūkiuose. Įvairių autorių duomenimis, metritu suserga 20-40 proc. pieninio tipo karvių (6,7). Šios ligos paplitimą lemia bendras karvių bandos sveikatingumas, galvijų laikymo ir veršiavimosi patalpų zoohigieninės sąlygos, tinkama veterinarinė pagalba karvei veršiuojantis.
Karvių metrito gydymo metu labai svarbu parinkti efektyvų ir individualų gydymo būdą antimikrobinėmis medžiagomis. Siekiant parinkti tikslingiausią ir ekonomiškiausią gydymą, reikalinga nustatyti metrito sukėlėją ir jo atsparumą antimikrobinėms medžiagoms (12).
Karvių klinikinį metritą dažniausiai sukelia Escherichia coli, Arcanobacterium pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Streptococcus spp. Prevotella spp. bakterijos (13), todėl šiai ligai gydyti įprastai pasirenkami plataus spektro antibiotikai, pvz. cefalosporinai, kurie veikia Gram-neigiamas ir Gram-teigiamas bakterijas.
Karvių metritas yra labai aktuali problema .pieninių galvijų ūkiuose, nes sukelia daug
ekonominių nuostolių, dėl brangaus gydymo, dažno gyvūlių išbrokavimo, mažesnės pieno produkcijos, servis periodo pailgėjimo, didesnio sėklinimo indekso, mažesnio apsivaisinimo indekso. (9, 11,13-16).
10
Darbo tikslas: Išskirti karvių klinikinio metrito sukėlėjus ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Darbo uţdaviniai:
1. Išskirti karvių metrito sukėlėjus iš karvių gimdos išskyrų mėginių.
2. Nustatyti karvių metrito sukėlėjų atsparumą antros ir treĉios kartos cefalosporinams. 3. Nustatyti pieningumo, laktacijos ir užtrūkinimo laikotarpio įtaką metrito atsiradimui.
11
1. Literatūros apţvalga
1.1 Periodas po karvių apsiveršiavimo
Post partum periodas (pp), arba kitaip periodas po apsiveršiavimo trunka apie šešias savaites. Šiuo laikotarpiu atsistato karvės reprodukcinė. sistema,. vyksta gimdos involiucija, kuri paprastai trunka apie 40 50 dienų. Prieš apsiveršiuojant, karvių gimdoje mikroorganizmų neaptinkama, nes bakterijoms. trukdo patekti fizinis barjeras - uždaras gimdos kaklelis. Prasidėjus gimdymui, atsivėręs gimdos kaklelis suardo natūralų apsauginį barjerą ir patogeniniai mikroorganizmai gali laisvai patekti į gimdą, kurioje dėl šilumos ir drėgmės yra ypaĉ palankios sąlygos mikroorganizmų dauginimuisi (8 - 10, 17).
Laikotarpiu po apsiveršiavimo, beveik visų karvių gimdoje aptinkama patogeninių mikroorganizmų, taĉiau jei karvės imuninė sistema stipri, ji pati sugeba sunaikinti patogenines bakterijas iki infekcijos požymių pasireiškimo pradžios. Šis procesas. vadinamas spontaniniu pasveikimu, kuris užsienio autorių. duomenimis būdingas iki 75 proc. karvių (8-11). Šiuo.
laikotarpiu karvės organizme vyksta daug fiziologinių procesų, kurių metu karvė grįžta į normalią reprodukcinę būseną ir pasirengia apvaisinimui (4, 5, 8, 10).
Pagrindiniai procesai vysktantys post partum periodu karvės organizme yra gimdos involiucija, endometriumo regeneracija, bei kiaušidėse prasidedantis lytinis ciklas. Susitraukinėjant gimdos raumeniniam sluoksniui iš gimdos yra šalinamos lochijos (kraujas, placenta, vaisiaus dangalų likuĉiai, irstanĉių karunkulų dalys), ir taip mažinama palanki terpė mikroorganizmams daugintis. Šis procesas paprastai trunka apie 10 dienų (18, 19).
Jei karvės imuninė sistema yra per silpna, arba patogeninių. bakterijų invazija yra itin didelė, pasireiškia gimdos infekcinės ligos. Šių ligų atsiradimui taip pat turi didelę įtaką placentos užsilaikymas, prastos karvių laikymo ir veršiavimosi patalpų zoohigieninės sąlygos, nesubalansuotas šėrimo racionas, šliužo dislokacija, distokijos, dvyniai, buliukai, mėsinio tipo veršeliai, bei metaboliniai sutrikimai, tokie kaip ketozė, kepenų lipidozė, hipokalcemija (16, 20-22). Gimdos infekcinės ligos yra skirstomos į metritą, klinikinį endometritą, slaptą endometritą ir piometrą. Jas dažniausiai sukelia Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Prevotella spp., Bacillus spp. ir Streptococcus spp. bakterijos (5, 13, 20, 23).
Pieninių galvijų ūkiuose, Lietuvoje, atliktas tyrimas nustatė kad ūkiuose vyrauja Escherichia coli, Streptococcus spp. bei Enterococcus faecalisbakterijos (24).
1.2 Karvių klinikinis metritas
Karvių klinikinis metritas yra ūminė galvijų reprodukcinės sistemos liga, kurios metu pažeidžiama gimdos gleivinė - endometriumas ir gimdos vidurinysis sluoksnis - miometriumas.. Ši liga pasireiškia per pirmąsias 21 d. po apsiveršiavimo (21).
12
Klinikinis metritas yra atpažįstamas pagal pūlingas (1 pav.), nemalonaus kvapo, raudonai rudas (2 pav.) išskyras iš gimdos (25), karšĉiavimo (T > 39,5°C), prastos bendros gyvulio fizinės būklės, nebevykstanĉios gimdos involiucijos (gimda išlieka padidėjusi) (10). Serganĉios karvės tampa apatiškomis, nebeėda, sumažėja pieno primilžis, padažnėja širdies darbas, gyvulį gali ištikti dehidratacija. Laiku negydant karvės liga gali baigtis letaliai arba pereiti į endometritą. (20, 21, 26).
1 pav. Pūlingos išskyros iš metritu sergančių karvių (25)
2 pav. Raudonai rudos išskyros iš metritu sergančių karvių (25)
Metritui diagnozuoti taip pat taikomas rektinis tyrimas, kurio metu palpuojama gimda arba ultragarsinis tyrimas. Rektinės gimdos palpacijos metu jauĉiama padidėjusi gimda, galima išmasažuoti gimdoje susikaupusių pūlingų išskyrų (27). Ultragarsinis tyrimas yra brangesnis diagnostinis tyrimas, kurio negalima atlikti be specialios įrangos - echoskopo. Jo metu, gimda echoskopuojama per rectum. Metritu serganĉių karvių gimdos sonogramoje galima matyti išsiplėtusią gimdą, pilną skysĉio, su jame plaukiojanĉiais echogeniškais gabalėliais - pūliais (3 pav.). (28)
13 3 pav. Metritu sergančios karvės, gimdos sonogramos vaizdas (28)
Karvių klinikinis metritas, pagal Sheldon„ą (29) gali būti skirstomas į tris laipsnius: I - ojo laipsnio metritas diagnozuojamas pagal pūlingas, nemalonaus kvapo išskyras iš makšties ir padidėjusią karvės gimdą. II - ojo laipsnio metritui be padidėjusios gimdos ir gausių išskyrų iš makšties, būdinga aukšta temperatūra (39,5 °C ir daugiau). III - ojo laipsnio metritui būdinga prasta karvės fiziologinė būklė, jai pasireiškia toksemijos požymiai, ko pasekoje gyvūnai gaišta.
Pieniniuose ūkiuose sergamumas šia liga siekia apie 20 - 40 procentų karvių (6, 7). Metritu dažniausiai serga aukšto produktyvumo (duodanĉios daugiau nei 35 kg pieno per dieną), pieninio tipo karvės, ypaĉ. laikomos prastesnėse zoohigieninėse sąlygose, gaunanĉios mažai. mociono (30). Dėl didelių gydymo kaštų, pailgėjusio servis periodo, prasto apsivaisinimo daugelis karvių yra brokuojamos, o tai ūkiams atneša didelius ekonominius nuostolius (9, 11, 13, 14).
1.3. Metrito prieţastys
Pagrindiniams karvių klinikinį metritą sukeliantiems veiksniams priskiriami įvairūs patogeniniai mikroorganizmai. Vieni iš jų sutinkami kaip įprasta organizmo mikroflora - oportunistinės bakterijos, kurios gavusios palankias sąlygas tampa patogenėmis, o kitos - patenka iš aplinkos. Neretai ligos eigoje vieni mikroorganizmai gali sudaryti palankias sąlygas kitiems mikroorganizmams augti ir daugintis, todėl ligos eigoje iš gimdos išskyrų išskirtos bakterijų kultūros gali šiek tiek skirtis (2, 3, 9, 21, 26).
Karvių metritą sukeliantys veiksniai gali būti skirstomi į predisponuojanĉius ir pagrindinius ligą sukelianĉius veiksnius. Predisponuojantiems veiksniams paprastai priskiriami: veršiavimosi sutrikimai - distokijos; gimdos vidinio sluoksnio (endometriumo) pažeidimai, pasitaikantys dėl grubių akušerinių procedūrų; didelis vaisius - buliukai ar mėsinių veislių veršeliai; dvyniai; negyvas vaisius ar užsilaikiusi placenta (5, 33-35).
14
Infekcijos riziką taip pat didina metaboliniai sutrikimai gyvulio organizme - esant pernelyg nupenėtoms, šeriamoms nesubalansuotu racionu ar turinĉioms nusilpusį imunitetą, mažai mociono gaunanĉioms karvėms.
1.4. Kitų veiksnių įtaka metrito pasireiškimui
Sheldon„o ir kt. atliktas tyrimas rodo, kad pirmos laktacijos karvės (pirmaveršės), turi didesnę riziką susirgiti metritu, nei vyresnės, dviejų ir daugiau laktacijų turėjusios karvės. Manoma kad tai gali būti apsunkinto. pirmojo veršiavimosi pasekmė, nes pirmaveršėms karvėms dažniau tenka suteikti pagalbą veršiavimosi metu (29).
Literatūros šaltiniuose teigiama, kad labai pieningos karvės (duodanĉios 35 litrus ir daugiau pieno per dieną) yra labiau linkusios sirgti reprodukcinės sistemos infekcinėmis ligomis, tarp jų ir metritais. Didelės produkcijos karvėms pirmosiomis savaitėmis po apsiveršiavimo yra didesnė tikimybė. susidaryti neigiamam energijos balansui (NEB), todėl dažniausiai nukenĉia karvių imuninė sistema, ko pasekoje patogeniniams organizmams lengviau kolonizuotis gimdoje (34).
1.5. Karvių gimdos infekcijas sukeliantys mikroorganizmai ir jų
virulentiškumas
Karvių reprodukcinės sistemos ligos pasireiškia tuomet, kai patogeniniai mikroorganizmai patenka į karvių gimdą ir įsiskverbia į endometriumo epitelio ląsteles bei pradeda gaminti toksinus, lemianĉius ligos pasireiškimą. Viena pirmųjų gimdoje gausias kolonijas sudaranĉių bakterijų - Escherichia coli, kuri palengvina tokių bakterijų kaip Trueperella pyogenes ir Fusobacterium necrophorum kolonizaciją gimdoje (2, 36, 38, 39).
E.coli yra Gram - neigiama, lazdelės formos bakterija, fakultatyvinis anaerobas. Ši bakterija aptinkama tiek sveikų, tiek serganĉių metritu karvių gimdoje (38, 40). Literatūros šaltiniuose išskiriami šeši E. coli virulentiškumo veiksniai, kurie buvo įvardinti labiausiai susiję su metritu ir endometritu. Tai fimH, astA, cdt, kpsMII, ibeA ir hlyA genai. Užsienyje atlikti tyrimai parodė, kad karvės, kurių organizme buvo aptikta bent viena fimH geną turinti E. coli, turėjo 4,6 karto didesnę riziką susirgti metritu, nei karvės iš kurių nebuvo išskirtos E. coli. (9, 41, 43). E. coli patogeniškos padermės pasižymi fermentu beta-laktamaze, kuri sumažina beta-laktaminių antibiotikų veikimą. Ši E. coli savybė didina rezistentiškumą beta-laktaminiams antibiotikams, tokiems kaip penicilinams, 1-3 kartos cefalosporinams, monobaktamams ir beta laktaminiams inhibitoriams, todėl šios bakterijos sukeltos infekcijos yra sunkiai išgydomos (42, 44).
Naujausių tyrimų duomenimis įrodyta, kad patogeninės E. coli padermės rezistentiškumą gali perduoti komensalinėms, galvijų laikymo vietose aptinkamoms E. coli padermėms (45, 47). Europoje atlikti tyrimai parodė, kad iš galvijų išskirtos E. coli padermės turėjo nuo 1 iki 5 proc. atsparumą amoksacilinui su klovulano r., bei pirmos kartos cefalosporinams, išskyrus cefapiriną
15
(23,2 proc. atsparūs), neomicinui atsparios buvo 7 proc. padermių, o tetraciklinams apie 14,5 proc. E. coli padermių (46).
Proteus mirabilis yra oportunistinė, fakultatyvi anaerobinė, Gram- neigiama, lazdelės formos bakterija, pasižyminti „šliaužianĉiu“ augimu ant mitybinių terpių ir priklausanti Enterobacteriaceae šeimai. Šios bakterijos išskiria fermentą. hemoliziną, kuris formuoja poras ląstelių sienelėse, ko pasekoje natrio jonai yra pašalinami iš ląstelės ir taip sutrikdoma ląstelės veikla. Taip pat Proteus genties mikroorganizmai pasižymi. savybe skaidyti β-laktamo žiedą, esantį antimikrobinių medžiagų penicilinų grupėje. Šią savybę turintys mikroorganizmai kelia pasaulinio masto problemą dėl didelio rezistentiškumo plaĉiai naudojamiems antibiotikams.
Neturintys β-laktamazių Proteus spp. mikroorganizmai pasižymi jautrumu cefalosporinams, chloramfenikoliui, ampicilinui, fluorochinolonams ir aminoglikozidams (48).
Fusobacterium necrophorum - Gram-neigiama, lazdelės formos bakterija - obligatinis anaerobas, dažniausiai siejamas su pūlingomis ir nekrozinėmis infekcijomis žmonių ir gyvūnų tarpe (49). Pagrindinis F. necrophorum virulentiškumo veiksnys - leukotoksinas, kuris ardo imunines ląsteles - leukocitus (26). Galvijų organizme F. necrophorum dažniausiai formuoja kepenų abscesus, taĉiau taip pat gali būti sutinkamas ir kaip vienas svarbiausių karvių metrito sukėlėjų. Ši bakterija yra skirstoma į porūšius - subsp. funduliforme ir subsp. necrophorum, kuris yra virulentiškesnis (50).
Trueperella pyogenes - oportunistinė, Gram-teigiama, sporų negaminanti, lazdeles primenanĉios formos, bakterija, dažniausiai sukelianti infekcijas galvijų urogenitaliniame, respiratoriniame ir gastrointestinaliniame trakte. Ši bakterija žinoma, kaip pagrindinė karvių abortų, metrito, mastito ir nevaisingumo priežastis, ir dažniausiai sukelia infekcijas kartu su E. coli, F. necrophorum ir S. intermedius (51, 52). T. pyogenes yra patogeniška, nes geba išskirti citotoksiną pioliziną, kuris sukelia šeimininko ląstelių citolizę (52) ir kolageną surišantį baltymą (cbpA), padedantį prisitvirtinti prie kolageno turinĉių audinių (26, 53). Ši bakterija gali sukelti uždegiminį procesą gimdoje, neutrofilų migraciją į gimdą ir pūlingos masės išsiskyrimą (51). Kadangi T. pyogenes yra priskiriama oportunistiniams patogenams, ji neretai yra aptinkama ir sveikų karvių gimdos mikrofloroje (13).
Streptococcus spp. - tai Gram-teigiami kokai, paprastai išsidėstę pavieniui ar grandinėlėmis. Jie yra fakultatyviniai anaerobai, plaĉiai paplitę gamtoje ir daugelis aptinkami, kaip komensalinės bakterijos žmonių ir gyvūnų viršutinių kvėpavimo takų ar urogenitalinio trakto gleivinėse.
Europoje atliktas tyrimas parodė kad S. uberis jautrus penicilinui G ir ceftiofurui. Maždaug 20 proc. padermių buvo atsparios eritromicinui ir 36,7 proc. tetraciklinui (46). S. dysgalactiae - eritromicinui atsparumas siekė 13,7 proc., o tetraciklinui 56,8 proc. (46).
16
Bacillus spp. - tai Gram-teigiamos lazdelės formos bakterijos, gaminanĉios endosporas. Tai katalazei teigiamos, aerobinės bakterijos, dauguma judrios. Bacillus cereus yra judri, penicilinui atspari ir hemolizinėmis savybėmis pasižyminti bakterija, žinoma, kaip karvių mastito sukėlėja arba yra siejama su maisto intoksikacijomis.
1.6. Metrito gydymas
Norint parinkti efektyvų ir ekonomišką gydymą reikia turėti žinių apie infekcijos sukėlėją, jo atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, ligos patofiziologiją, vaistų, naudojamų ligos gydymui, savybes, jų šalutinius poveikius, įtaką gyvūno sveikatingumui. Visos šios problemos apsunkina gyvūno gydymą, nes reikia atlikti tyrimus, norint įvertinti tinkamą antimikrobinių preparatų rūšį, koncentraciją ir gydymo trukmę individualiai kiekvienam gyvūnui (54). Dauguma veterinarijos gydytojų karvių gimdos infekcijų gydymui naudoja antimikrobines medžiagas neatlikdami bakteriologinių tyrimų dėl laiko ir finansų stokos. Manoma, kad tai yra pagrindinė priežastis, dėl ko kiekvienais metais didėja patogeninių mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (48). Mokslininkai pabrėžia, kad ypaĉ svarbu infekcijas gydyti ligos sukelėją veikianĉiomis medžiagomis, ir tęsiant gydymą tiek, kiek yra nurodoma vaisto gamintojo, siekiant nepadidinti mikroorganizmų rezistentiškumo turimiems medikamentams. Šiam tikslui dažniausiai naudojami įvairūs jautrumo tyrimai, atliekami su iš tiriamosios medžiagos išskirta mikroorganizmų kultūra (55).
1.7. Mikroorganizmų atsparumas antimikrobinėms medţiagoms
Kasmet vis didėjantis bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms yra pasaulinė problema, kuri palieĉia ne tik žmonių, bet ir veterinarinę mediciną. Neseniai Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) atkreipė visuomenės dėmesį į plaĉiai paplitusį antimikrobinį atsparumą ypaĉ svarbiems, plataus spektro antibiotikams, kaip cefalosporinai ir fluorochinolonai, kurie naudojami žmonių medicinoje stiprioms bakterinėms infekcijoms gydyti (57). Taip pat didelį susirūpinimą kelia kritiškai svarbiems antibiotikams (CIA) atsparūs zoonoziniai patogenai, tokie kaip E. coli ir Salmonella spp, išskiriami iš serganĉių produkcijos gyvūnų (56, 58). Per pastaruosius 30 metų visame pasaulyje labai išplito E. coli padermės, kurioms būdingas blaCTX-M genas, suteikiantis rezistentiškumą plataus spektro beta laktaminėms antimikrobinėms medžiagoms (ESBL) (60). Šiai pasaulinei grėsmei riboti ir mažinti, pasaulio sveikatos organizacija (PSO/WHO) siūlo įvesti griežtą antimikrobinių preparatų naudojimo kontrolę ir vykdyti aktyvią stebėseną antimikrobinėms medžiagoms atsparių bakterijų atžvilgiu (61).
Šiuo metu, daugybė produkcijos gyvūnų ir žmonių yra gydomi pirmosios ar antrosios kartos cefalosporinais, tokiais kaip cefazolinas, cefaleksinas, cefuroksimas bei ceftiofuras (59). Santos ir kt. (62) nustatyta, kad daugiau kaip 50 proc. izoliuotų T. pyogenes bakterijų buvo atsparios
17
amoksicilinui, ampicilinui, chloramfenikolui, florfenikoliui, oksitetraciklinui ir penicilinui. Be to, 35 proc. izoliuotų E. coli pasireiškė atsparumas daugeliui vaistinių preparatų (ampicilinui, chloramfenikoliui, florfenikoliui) (46). Neseniai atliktas tyrimas apibūdino galimą atsparumą cefapirinui, kuris yra dažnai naudojamas antibiotikas karvių, serganĉių infekcinėmis gimdos ligomis gydymui daugelyje šalių (20). Taĉiau, cefalosporinų naudojimas produkcijos gyvūnams yra ginĉytinas klausimas, nes jie yra atsarginiai antibiotikai žmonėms gydyti. Europos sąjungos šalyse buvo priimta direktyva (Direktyva 2003/99 / EB) ribojanti cefalosporinų naudojimą ūkio gyvūnams, dėl didelės padidėjusio rezistentiškumo rizikos (18, 19, 63).
Pirmos kartos cefalosporinai labiausiai veikia Gram - teigimas bakterijas, o Gram - neigiamas bakterijas visiškai neveikia arba veikia silpnai, todėl jie mažai svarbūs žmonių ir veterinarinėje medicinoje (59).
Antros ir treĉios kartos cefalosporinai veikia tiek Gram-teigiamus tiek Gram-neigiamus mikroorganizmus, todėl yra ypaĉ veiksmingi esant mišriai bakterinei infekcijai. Ceftiofuras - treĉios kartos cefalasporinas yra plaĉiai naudojamas pieninių galvijų infekcinėms ligoms gydyti (64).
18
2. Tyrimo metodai ir medţiaga
Tyrimas buvo atliekamas 2017–2018 metais. Mėginiai buvo imami steriliai iš 25 karvių, kurioms buvo diagnozuotas klinikinis metritas, gimdos lochijų, naudojant vienkartinius sterilius kateterius. Masažuojant gimdą per rectum, iš gimdos kaklelio kateteriu paimti pūlingų išskyrų mėginiai, kurie pristatyti į mikrobiologijos laboratoriją per 24 valandas.
Serganĉios karvės imant mėginius nebuvo gydytos antimikrobinėmis medžiagomis.
Tyrimo metu, klinikiniu metritu sirgusios karvės pagal pieningumą 30 - 90 laktacijos dienomis buvo suskirstytos į keturias grupes: 1 grupė - karvės davusios 30-35 l. pieno per parą, 2 grupė - karvės, davusios 35-40 l. pieno per parą, 3 grupė - karvės davusios 40-45 l. pieno per parą, 4 grupė - karvės davusios 45-50 l. pieno per parą.
2.1. Mikroorganizmų išskyrimas
Tiriamoji medžiaga buvo užsėjama į Petri lėkšteles su kraujo agaru (KA), maitinamuoju agaru (MA) ir ant Drigalskio agaro. Užsėtos Petri lėkštelės kultivuotos termostate esant +37 °C temperatūroje, 24-48 val. aerobinėmis sąlygomis.
Bakterijų morfologinėms savybėms nustatyti naudotas Gramo metodas („Diagnostica Merck“, Vokietija). Gram-teigiamos bakterijos nusidažė mėlyna spalva, o Gram-neigiamos bakterijos – raudona spalva. Mikroskopavimo metu įvertinama mikroorganizmų morfologija (kokai, lazdelės, sporinės lazdelės ir kt.).
Į KA pasėjus tiriamąjį meginį, po kultyvavimo stebimos hemolizinės mikroorganizmų savybės. Jei bakterijų kultūra pasižymi hemolizinėmis savybėmis, matoma aiški hemolizės zona aplink bakterijų kolonijas, kuri paprastai skirstoma į dvi grupes - α (dalinę) ir β (visišką) hemolizę.
Enterobakterijoms išskirti mėginiai sėti ant Drigalskio agaro („Oxoid“, Anglija). Užsėtos Petri lėkštelės kultivuotos termostate +37 °C temperatūroje 24–48 val. Po kultivavimo vertintos išaugusių kolonijų biocheminės savybės - laktozės skaidymas. E. coli bakterijos skaido laktozę, todėl jų kolonijos būna gelsvos, o terpės spalva keitėsi į geltoną. Laktozės neskaidanĉios bakterijų kolonijos būna melsvos arba žalsvai melsvos spalvos, o terpės spalva nesikeiĉia, būna melsva. Laktozės neskaido Proteus spp.
Staphylococcus aureus kultūrai identifikuoti buvo stebimas mikroorganizmų augimas ant Manito druskos („Oxoid“, Anglija) ir Baird-Parker („Liofilchem“, Italija) agaro, kultivuojamų termostate +37 °C temperatūroje 24–48 valandas.
Manito druskos agare S. aureus skaido manitą, todėl dėl pH pasikeitimo agaras tampa geltonos spalvos. S. pseudintermedius neskaido manito, todėl terpės spalva nesikeiĉia - išlieka rožinė.
19
Baird-Parker agare stebimas kalio telūrito skaidymo ir lecitinazės išskyrimo savybės. S. aureus skaido kalio telūritą, todėl kolonijos būna juodos spalvos, o aplink jas matoma skaidri zona dėl lecitinazės aktyvumo, kuri skaido kiaušinio trynio emulsiją. S. pseudintermedius taip pat skaido kalio telūritą, todėl bakterijų kolonijos būna juodos spalvos, taĉiau neišskiria lecitinazės.
Patogeninių stafilokokų nustatymui naudojami koaguliazės („Liofilchem“, Italija) ir „Staphytest Plus“ testai („Oxoid“, Anglija).
Stafilokokų nuo streptokokų atskyrimui naudojamas katalazės testas (streptokokai katalazei neigiami, o stafilokokai teigiami).
Streptococcus spp. identifikuojami naudojant Edward„o terpę („Oxoid“, Anglija). Joje nustatomos streptokokų eskulino hidrolizės savybės. S. uberis pasižymi α hemolize ir teigiama eskulino hidrolizės reakcija. S. dysgalactiae pasižymi β hemolize ir neigiama eskulino hidrolizės reakcija.
Enterococcus faecalis identifikavimui naudojamas „Streptococcal grouping kit“ testas („Oxoid“, Anglija), stabimas augimas kanamicino eskulino azido agare („Oxoid“, Anglija), tiriamos biocheminės savybės.
Escherichia coli hemolizinėms savybėms nustatyti naudotas kraujo agaras. Enterobakterijų biocheminėms savybėms tirti taikytas „Entero pluri Test“ testas („Liofilchem“, Italija). Išskirtos mikroorganizmų padermės sėtos į SIM terpę (Sulfide Indole Motility Medium, „Oxoid“, Anglija).
Bacillus cereus bakterijos identifikuotos įvertinus ant selektyvinės mitybinės terpės (MYP agaras, „Oxoid“, Anglija) ir KA išaugusias kolonijas ir morfologines savybes. Ant MYP agaro B. cereus bakterijos atpažįstamos, kaip ryškiai rožinės kolonijos su aplink esanĉio trynio precipitacijos zona. Kraujo agare B. cereus kolonijos būna išplitusios ir grublėtos, pilkšvos spalvos, o aplink matoma hemolizė.
Trueperella pyogenes nustatyta įvertinus ant KA („Oxoid“, Anglija) išaugusių kolonijų požymius ir bakterijų morfologines savybes. Užsėtos Petri lėkštelės 24–48 val. kultivuotos +37 °C temperatūroje. Šios bakterijos auga labai smulkiomis baltomis kolonijomis, su aplink jas esanĉia β hemolizės zona.
Proteus mirabilis nustatomas pagal „šliaužiantį“ augimą ant KA. Išgrynintą kultūrą pasėjus į SIM terpę („Oxoid“, Anglija), matoma pajuodavusi terpės spalva dėl sieros vandenilio gamybos.
Siekiant atskirti P. mirabilis nuo P. vulgaris daromas indolo gamybos testas su Kovaĉo reagentu. Jo užlašinus ant terpės su P. mirabilis reakcija neigiama - raudonas žiedas nesusidaro (P. mirabilis neišskiria indolo). Jei reakcija teigiama, ir susidaro raudonas indolo žiedas - terpėje yra P. vulgaris produkuoja indolą).
20
2.2. Mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimas
Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms buvo tiriamas naudojant modifikuotą Kirby - Bauer metodą (indikatorinių diskų metodą - 1966 m.). Tiriamos mikroorganizmų kultūros buvo pasėtos į specialų „Mueller Hinton II Agar“ agarą („Oxoid“, Anglija). Indikatoriniai antimikrobinių medžiagų diskai buvo dedami ant agaro paviršiaus 30 mm atstumu vienas nuo kito. Petri lėkštelės buvo kultivuojamos aerobinėmis sąlygomis termostate +37 ºC temperatūroje 24-48 valandas. Matuojant bakterijų augimo slopinimo zoną buvo vertintas atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Rezultatai vertinami pagal galiojanĉius EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility) standartus.Šio tyrimo metu tirtas antimikrobinis jautrumas E. coli, T. pyogenes, P. mirabilis, S. dysgalactiae, S. uberis ir B. cereus mikroorganizmams.
Iš viso buvo ištirta 25 mėginiuose rastų patogeninių bakterijų atsparumas penkioms antimkrobinėms medžiagoms - cefoksitinui, ceftiofurui, ceftazidimui, cefovecinui ir cefaklorui.
Naudojamų antimikrobinių medžiagų koncentracija ir indikatoriniai dydžiai atitiko EUCAST standartus. Ceftiofuras - 30 μg (Oxoid/A), cefaleksinas - 30 μg (Oxoid/A), ceftazidimas - 30 μg (Oxoid/A), cefoksitinas - 30 μg (Oxoid/A), cefovecinas - 30 μg (Oxoid/A). Visų pasirinktų medžiagų bakterijų slopinimo zonų indikatoriniai dydžiai buvo vienodi: 19 mm ≤ jautru, 19 mm > atsparu.
21
2.3. Mikrobiologinio tyrimo schema
4 pav. Tyrimo schemos grafinis vaizdavimas
2.4. Statistinės analizės atlikimas
Atliekant tyrimo statistinę analizę buvo siekiama nustatyti laktacijos, pieningumo ir užtrūkinimo periodo trukmės įtaka metritą sukėlusių mikroorganizmų rūšiai ir jų atsparumui antimikrobinėms medžiagoms.
Statistinė analizė buvo suskaiĉiuota naudojantis „Microsoft Excel 2010” ir SPSS programomis. Statistinis patikimumas buvo suskaiĉiuotas naudojantis Chi kvadrato testu. Tyrimo rezultatai buvo statistiškai patikimi, kai p ≤ 0,05, p ≤ 0,01 arba p ≤ 0,001.
22
3. Tyrimo rezultatai
3.1 Mikroorganizmų išskyrimas iš karvių, sergančių klinikiniu metritu
gimdos išskyrų
Iš 25 mėginių, paimtų iš klinikiniu metritu serganĉių karvių gimdos išskyrų, mikroorganizmai buvo išskirti iš 23 mėginių (92 proc.), o iš 2 mėginių (8 proc.) mikroorganizmai neišaugo.
5 pav. Karvių metrito sukėlėjų pasiskirstymas, procentais
Atlikus karvių, serganĉių metritu, gimdos išskyrų mikrobiologinį tyrimą, daugiausiai buvo nustatyta E. coli, T. pyogenes ir S. dysgalactiae, o mažiausiai išskirta B. cereus, P. mirabilisir S. uberis bakterijų. 70 9 9 4 4 4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 E. coli T. pyogenes S. dysgalactiae
B. cereus P. mirabilis S. uberis
A tvejų skai či u s, p ro c.
23
3.2 Mikroorganizmų atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimas
3.2.1. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefuroksimui
6 pav. Bendras patogeninių mikroorganizmų atsparumas cefuroksimui, proc. 3 iš 6 mikroorganizmų rūšių buvo visiškai atsparios cefuroksimui (P. mirabilis, S.
dysgalactiae ir S. uberis). E. coli atsparumas siekė 31,25 proc., T. pyogenes buvo atsparios 50 proc., o B. cereus bakterijos buvo neatsparios cefuroksimui.
Bendras visų bakterijų, išskirtų iš metritu serganĉių karvių, jautrumas cefuroksimui siekė 56,5 proc.
Atlikus statistinę analizę, nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp karvių metrito sukelėjų ir jų atsparumo cefuroksimui (p<0,01).
3.2.2. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefovecinui
7 pav. Patogeninių mikroorganizmų atsparumas cefovecinui, proc.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% A n tim ikr o b in is jau tr u m as/ atsp ar u m as, p ro c. Patogeniniai mikroorganizmai Jautru Atsparu 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% A n tim ikr o b in is jau tr u m as/ atsp ar u m as, p ro c. Patogeniniai mikroorganizmai Jautru Atsparu
24
Atlikus antimikrobinio atsparumo tyrimą, nustatyta, kad cefovecinui buvo atspariausios trys bakterijų rūšys - P. mirabilis, S. dysgalactiae, S. uberis, kiek mažiau atsparios buvo E. coli (37,5 proc.) ir T. pyogenes (50 proc.) bakterijos. B. cereus mikroorganizmai buvo neatsparūs antimikrobinei medžiagai.
Bendras visų bakterijų, išskirtų iš metritu serganĉių karvių, jautrumas cefovecinui siekė 52,2 proc.
Atlikus statistinę analizę, buvo nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp patogeninių mikroorganizmų ir jų atsparumo cefovecinui (p < 0,05).
3.2.3. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefaklorui
8 pav. Patogeninių mikroorganizmų atsparumas cefaklorui, proc.
Atsparumas cefaklorui buvo būdingas T. pyogenes, P. mirabils, S. dysgalactiae, S. uberis ir 56,25 proc. E. coli bakterijų padermių. B. cereus bakterijos buvo jautrios cefaklorui.
Bendras visų bakterijų, išskirtų iš metritu serganĉių karvių, jautrumas cefaklorui siekė 34,8 proc.
Atlikus statistinę analizę, pastebėtas patikimas ryšys tarp karvių metrito sukelėjų ir jų atsparumo cefaklorui (p < 0,01). 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% A n tim ikr o b in is jau tr u m as/ atsp ar u m as, p ro c. Patogeniniai mikroorganizmai Jautru Atsparu
25
3.2.4. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas cefoksitinui
9 pav. Patogeninių mikroorganizmų atsparumas cefoksitinui, proc.
Cefoksitinui atspariausios buvo P. mirabilis ir S. uberis bakterijos, kiek mažiau atsparios buvo E. coli ir T. pyogenes (50 proc.) bakterijos. S. dysgalactiae ir B. cereus bakterijos buvo neatsparios cefoksitinui.
Bendras visų bakterijų, išskirtų iš metritu serganĉių karvių, jautrumas cefoksitinui siekė 52,2 proc.
Atlikus statistinę analizę, nustatytas statistiškai patikimas ryšys tarp bakterijų rūšies ir atsparumo cefoksitinui (p < 0,01).
3.2.5. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas ceftazidimui
10 pav. Karvių metrito sukėlėjų atsparumas ceftazidimui, proc.
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% An tim ikr o b in is jau tr u m as / at sp ar u m as , p ro c. Patogeniniai mikroorganizmai Jautru Atsparu 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% A n tim ikr o b in is jau tr u m as/ atsp ar u m as, p ro c. Patogeniniai mikroorganizmai Jautru Atsparu
26
Atspariausios ceftazidimui buvo B. cereus, P. mirabilis, S. dysgalactiae ir S. uberis bakterijos. Kiek mažesniu atsparumu pasižymėjo E. coli (93,75 proc.) ir T. pyogenes (50 proc.) bakterijos.
Bendras visų bakterijų, išskirtų iš metritu serganĉių karvių, jautrumas ceftazidimui buvo 8,7 proc.
Atlikus statistinę analizę, nustatytas patikimas ryšys tarp karvių metrito sukėlėjo rūšies ir atsparumo ceftazidimui (p < 0,01).
3.3 Įvairių veiksnių įtaka metrito susirgimui
3.3.1 Klinikiniu metritu sergančių karvių pasiskirstymas pagal laktacijos grupes
Mėginiai buvo imami iš 25 kliniškai serganĉių karvių. Tiriamos karvės buvo skirstomos į tris grupes pagal laktaciją. 1 grupė - 1 laktacijos karvės, 2 grupė - antros laktacijos karvės, 3 grupė - treĉios ir ketvirtos laktacijos karvės.
11 pav. Metritu sergančių karvių pasiskirstymas pagal laktacijos grupes
Daugiausiai klinikiniu metritu sirgo pirmos laktacijos grupės karvės, o kiek mažiau sirgo antros ir treĉios laktacijos grupių karvės.
36 32 32 0 5 10 15 20 25 30 35 40 1 2 3 K ar vi ų skai či u s, p ro c.
27
3.3.2. Karvių metrito sukėlėjų pasiskirstymas pagal pieningumo grupes
12 pav. Bakterijos išskirtos iš skirtingo pieningumo karvių, sergančių metritu, proc. 1 grupės karvių mėginiuose daugiausiai išskirta E. coli, ir šiek tiek mažiau - T. pyogenes bakterijų. Kitų rūšių bakterijų nebuvo išskirta.
2 grupės karvių mėginiuose didžiausią dalį sudarė E.coli ir S. dysgalactiae bakterijos, daug mažiau išskirta S. uberis ir T. pyogenes bakterijų.
3 grupės metritu serganĉių karvių meginiuose daugiausiai išskirta E. coli bakterijų, ir šiek tiek mažiau B. cereus ir P. mirabilis bakterijų.
4 grupės karvių mėginiuose rasta tik E. coli bakterijų.
Atlikus statistinę analizę, gauta statistiškai patikima priklausomybė tarp karvių pieningumo grupės ir metrito sukelėjo rūšies (p<0,05).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 B akt e ri jų d al is, p ro c. Bakterijų rūšis 1gr. (30-35l) 2gr. (35-40l) 3gr. (40-45l) 4gr. (45-50l)
28
3.3.3. Metrito sukėlėjų pasiskirstymas pagal laktacijos grupes
13 pav. Skirtingų laktacijos karvių, metrito sukėlėjų pasiskirstymas, proc.
Pirmoje laktacijos grupėje daugiausiai išskirta E. coli bakterijų, šiek tiek mažiau išskirta S. dysgalactiae ir P. mirabilis bakterijų. Visai neišskirta T. pyogenes, S. uberis ir B. cereus bakterijų.
Antroje karvių laktacijos grupėje daugiausiai išskirta E. coli bakterijų. Mažiau išskirta T. pyogenes ir B. cereus bakterijų. Visai neišskirta S. dysgalactiae, S. uberis ir P. mirabilis bakterijų.
Treĉioje karvių laktacijos grupėje daugiausiai išskirta E. coli bakterijų, o mažiausiai išskirta S. uberis bakterijų. Visai neišskirta S. dysgalactiae, P. mirabilis, T. pyogenes ir B. cereus bakterijų.
Remiantis atlikto tyrimo rezultatais, statistiškai reikšmingo ryšio tarp laktacijos grupės ir metritą sukėlusių bakterijų rūšies bei jų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nenustatyta (p > 0,05). 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Su kė lė jų sk ai či u s, p ro c. Metrito sukėlėjas 1 laktacijos gr. 2 laktacijos gr. 3 laktacijos gr.
29
3.3.4. Metritu sergančių karvių pasiskirstymas pagal uţtrūkinimo trukmę
14 pav. Karvių pasiskirstymas pagal užtrūkinimo trukmę, proc.
Daugiausiai metritu serganĉių karvių buvo pirmaveršės. Daugiaveršės karvės, turėjusios 40-60 dienų ir daugiau nei 40-60 dienų trukmės užtrūkinimo periodą sirgo šiek tiek mažiau, nei
pirmaveršės, o mažiausiai metritu sirgo karvės, turėjusios mažesnį nei 40 dienų užtrūkinimo periodą.
Remiantis atlikto tyrimo rezultatais, statistiškai reikšmingo ryšio tarp užtrūkinimo trukmės ir metritą sukėlusių bakterijų rūšies bei jų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nenustatyta (p > 0,05). 36.00% 4.00% 4.00% 32.00% 24.00% 0.00% 5.00% 10.00% 15.00% 20.00% 25.00% 30.00% 35.00% 40.00% 0 <20 20-40 40-60 >60 K ar vi ų skai či u s, p ro c. Užtrūkinimo trukmė, d.
30
4. Rezultatų aptarimas
Ištyrus visus metritu serganĉių karvių išskyrų iš gimdos mėginius, mikroorganizmai buvo išskirti iš 92 proc. mėginių. Panašūs bakterijų išskyrimo iš karvių gimdos išskyrų rezultatai buvo gauti užsienio autorių atliktame tyrime Vokietijoje, 2013 - 2014 metais. Jų atlikto tyrimo metu bakterijų kultūros buvo išskirtos iš daugiau nei 82,5 proc. mėginių (13).
Šio tyrimo metu pagrindiniai karvių metrito sukėlėjai buvo Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Streptococcus dysgalactiae, Proteus mirabilis, Streptococcus uberis ir Bacillus cereus bakterijos. Šie duomenys sutapo su daugumos užsienio autorių duomenimis, kurie teigia, kad karvių metritus dažniausiai sukelia Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Prevotella spp., Bacillus spp. ir Streptococcus spp. bakterijos (5, 13, 20, 23).
Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyta, kad daugiausiai metritu sirgo pirmaveršės, ir taip pat karvės, davusios daugiau nei 35 litrus pieno per parą. Šie duomenys sutampa su užsienio autorių atliktais tyrimais. 2010 metais JAV atlikto Bicalho et al. tyrimo metu pastebėta, kad metritu daugiausiai serga pirmaveršės karvės, kiek mažiau antros laktacijos, o mažiausiai treĉios ir ketvirtos laktacijos karvės (26). Taip pat Sheldon„as ir kt. teigė, kad pirmaveršės karvės turi didesnę riziką sirgti metritu (29), o Dubuc J. (34) teigė, kad produktyvesnės karvės (duodanĉios 35 litrus pieno ir daugiau) yra taip pat dažniau serga metritais bei endometritais.
Mūsų atlikto tyrimo metu, nustatyta, kad daugiausia Escherichia coli bakterijų atsparios ceftazidimui ir cefaklorui, o mažiausias atsparumas nustatytas cefuroksimui ir cefovecinui. Cefoksitinui nustatytas 50 proc. atsparumas. Moges et al. (65) atliktame tyrime buvo nustatytas 100 proc. E.coli atsparumas cefoksitinui.
Atlikus antibiogramą, nustatėme, kad visos išskirtos T. pyogenes bakterijos buvo atsparios cefaklorui, o kitoms antimikrobinėms medžiagoms - cefuroksimui, cefovecinui, cefoksitinui ir ceftazidimui buvo nustatytas 50 proc. atsparumas. Moges et al. (65) atliktame tyrime nustatytas 16,66 proc. T. pyogenes atsparumas cefoksitinui.
Tyrimo metu Streptococcus dysgalactiae kultūra buvo jautri tik cefoksitinui, o kitoms antimikrobinėms medžiagoms - cefuroksimui, cefovecinui, cefaklorui ir ceftazidimui bakterijos buvo atsparios.
Iš tyrime išskirtų Bacillus cereus bakterijų, atsparumas nustatytas tik ceftazidimui. Kitoms antimikrobinėms medžiagoms - cefuroksimui, cefovecinui, cefaklorui ir cefoksitinui bakterijos buvo jautrios.
Tyrimo metu išskirtos Proteus mirabilis ir Streptococcus uberis bakterijos buvo astparios visoms tirtoms antimikrobinėms medžiagoms - cefovecinui, cefovecinui, cefaklorui, cefoksitinui ir ceftazidimui.
31
Atlikus tyrimą, galima teigti, kad kiekviena mikroorganizmų rūšis turi skirtingą rezistentiškumą antimikrobinėms medžiagoms, kuris gali skirtis individualiai net tos paĉios rūšies bakterijoms. To pasekoje, gydymas antimikrobinėmis medžiagomis turi būti skiriamas individualiai, siekiant sumažinti gydymo laiką, bei padidinti jo efektyvumą.
32
Išvados
1. Iš metritu serganĉių karvių išskyrų mėginių, daugiausiai buvo išskirta Escherichia coli, Trueperella pyogenes, Streptococcus dysgalactiae, kiek mažiau - Proteus mirabilis, Streptococcus uberis ir Bacillus cereus bakterijų.
2. Tyrimo metu didžiausiu antimikrobiniu atsparumu pasižymėjo Proteus mirabilis ir Streptococcus uberis bakterijos - jos buvo atsparios visoms naudotoms antimikrobinėms medžiagoms. Mažiausiu atsparumu pasižymėjo Bacillus cereus bakterijos, jos buvo atsparios tik vienai antimikrobinei medžiagai - ceftazidimui. Likusios bakterijos pasižymėjo mišriu atsparumu antimikrobinėms medžiagoms.
3. Tyrimo metu nustatyta, kad karvių laktacija ir pieningumas turi įtaką karvių metrito susirgimui. Didelio produktyvumo ir pirmos laktacijos karvės metritu serga dažniau. Užtrūkinimo periodo ilgis reikšmingos įtakos metrito susirgimui neturėjo.
33
Rekomendacijos
1. Siekiant parinkti tinkamą antimikrobinę medžiagą gyvūnų gydymui, reikia išskirti karvių metrito sukėlėjus ir nustatyti jų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
2. Naudoti tik tas antimikrobines medžiagas, kurioms yra jautrūs ligos sukėlėjai.
3. Siekiant išvengti didėjanĉio mikroorganizmų rezistentiškumo antimikrobinėms
34
Padėka
Nuoširdžiai dėkoju savo darbo vadovei prof. dr. Jūratei Šiugždaitei už kantrybę, pastabas, suteiktas žinias ir pagalbą rašant baigiamąjį darbą. Taip pat dėkoju Vilmantui Juodženĉiui už
geranoriškai suteiktą informaciją bei žinias ir dr. Sigitai Kerzienei už pagalbą apdorojant statistinius duomenis.
Nuoširdžiai dėkoju savo vyrui ir visai šeimai už kantrybę, pagalbą ir visapusišką palaikymą studijų metu.
35
Literatūros sąrašas
1. Szenci Ottó.. Diagnosis and treatment of. post partum uterine abnormalities. in the cow. 2014. Lucrări Ştiinţifice - vol. 53, Seria Zootehnie;
2. LeBlanc SJ. Interactions. of metabolism, inflammation, and reproductive tract healt in the postpratum period in dairy cattle. Reproduction in Domestic Animals. 2012; 47: 18-30;
3. McDougall, S., H. Hussein, D. Aberdein, K. Buckle, J. Roche,. C. Burke, M. Mitchell, and S. Meier.. Relationships between cytology, bacteriology and. vaginal discharge scores and reproductive performance in dairy cattle. Theriogenology 2011.76:229–240;
4. LeBlanc SL, Osawa T, Dubuc J.. Reproductive tract defense and disease in postpartum dairy cows. Theriogenology 2011; 76: 1610-1618;
5. Sheldon IM., Williams EJ., Miller ANA., Nash DM., Herath S. Uterine diseases in cattle after parturition. The Veterinary Journal. 2008; 176: 115-121;
6. Gautam G., Nakao T., Yusuf M., Koike K. Prevalence of endometritis during the postpartum period and its impact on subsequent reproductive performance in two Japanese dairy herds. Animal Reproduction Science 2009. 116. 175–187;
7. Gilbert R.O., Shin S.T., Guard C.L., Erb H.N., Frajblat M. Prevalence of endometritis and its effects on reproductive performance of dairy cows. Theriogenology. 2005;64:1879–1888; 8. Noakes DE., Parkinson TJ., England GC.. Veterinary reproduction and obstetrics. 9th ed.
Edinburgh: Mosby; 2009, p. 309.
9. Azawi OI. Postpartum uterine infection in cattle. Anim Reprod Sci 2008;105:187–208;
10. Bicalho, R.C., Machado, V.S., Bicalho, M.L., Gilbert, R.O., Teixeira, A.G., Caixeta, L.S., Pereira, R.V., Molecular and epidemiological characterization of bovine intrauterine Escherichia coli. J. Dairy Sci. 2010. 93. 5818–5830;
11. Gautam G., Nakao T., Koike K., Long ST, Yusuf M., Ranasinghe RM, et al. Spontaneous recovery or persistence of postpartum endometritis and risk factors for its persistence in Holstein cows. Theriogenology 2010 Jan 15;73(2):168-179;
12. Tamai I.A., Mohammadzadeh A., Salehi T.Z., Mahmoodi P. Genomic characterisation, detection of genes encoding virulence factors and evaluation of antibiotic resistance of Trueperella pyogenes isolated from cattle with clinical metritis. Antonie van Leeuwenhoek 2018. 111:2441–2453;
36
13. Wagener K., Grunert T, Prunner I., Ehling-Schulz M., Drillich M. Dynamics of uterine infections with Escherichia coli, Streptococcus uberis and Trueperella pyogenes in post-partum dairy cows and their association with clinical endometritis. The Veterinary Journal 2014. 202 527–532;
14. Gautam G., Nakao T., Yusuf M., Koike K. Prevalence of endometritis during the postpartum period and its impact on subsequent reproductive performance in two Japanese dairy herds. Anim Reprod Sci 2009;
15. Barlund CS., Carruthers TD., Waldner CL., Palmer CW. A comparison of diagnostic techniques for postpartum endometritis in dairy cattle. Theriogenology 2008. 69:714–23; 16. Runciman DJ., Anderson GA., Malmo J., Davis GM. Use of postpartum vaginoscopic (visual
vaginal) examination of dairy cows for the diagnosis of endometritis and the association of endometritis with reduced reproductive performance. Aust Vet J 2008;86:205–13.;
17. Ĉengić B., Varatanović N., Mutevelić T., Katica A., Mlaĉo N., Ćutuk A. Normal and abnormal uterine involiution in cows monitored by ultrasound. Biotechnology in Animal Husbandry. 2012; 28(2): 205-217;
18. Kasimanickam VR., Owen K., Kasimanickam RK. Detection of genes encoding multidrug resistance and biofilm virulence factor in uterine pathogenic bacteria in postpartum dairy cows. Theriogenology. 2016;85:173–9;
19. Trevisi E., Zecconi A., Cogrossi S., Razzuoli E., Grossi P., Amadori M. Strategies for reduced antibiotic usage in dairy cattle farms. Res Vet Sci. 2014;96:229–33;
20. de Boer M., Heuer C., Hussein H., McDougall S. Minimum inhibitory concentrations of selected antimicrobials against Escherichia coli and Trueperella pyogenes of bovine uterine origin. J Dairy Sci. 2015;98:4427–38;
21. Prunner I., Wagener K., Pothmann H., Ehling-Schulz M., Drillich M. Risk factors for uterine diseases on small- and medium-sized dairy farms determined by clinical, bacteriological, and cytological examinations. Theriogenology. 2014;82:857–65;
22. McDougall S., Husseina H., Aberdeinb D., Buckleb K., Rochec J., Burkec C., Mitchelld M., Meierc S. Relationships between cytology, bacteriology and vaginal discharge scores and reproductive performance in dairy cattle. Theriogenology 2011. 76 229–240;
23. LeBlanc SJ. Interactions of metabolism, inflammation, and reproductive tract healt in the postpratum period in dairy cattle. Reproduction in Domestic Animals. 2012; 47: 18-30
37
24. Šiugždaitė J., Juodžentis V., Petkeviĉius S. Skirtingų laktacijų karvių, serganĉių endometritu, gimdos bakterinis užterštumas. Veterinarija ir zootechnika 2013;61(83):75-80;
25. Blowey RW., Weaver AD: Color atlas of diseases and disorders of cattle, 2nd ed. London, Mosby, 2003;
26. Bicalho ML., Machado VS., Oikonomou G., Gilbert RO., Bicalho RC. Association between virulence factors of Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum, and Arcanobacterium pyogenes and uterine diseases of dairy cows. Vet Microbiol 2012 May 25;157(1-2):125-131 27. Sheldon IM., Lewis GS., LeBlanc S., Gilbert RO. Defining postpartum uterine disease in cattle.
Theriogenology 2006;65:1516–30.;
28. Kumar V., Purohit GN. Ultrasonographic Diagnosis of the Bovine Genital Tract Disorders. Online veterinary journa; 2009;
29. Sheldon IM., Cronin J., Goetze L., Donofrio G., Schuberth HJ. Defining postpartum uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle. Biol Reprod 2009;81:1025e32.
30. Williams, E.J. Drivers of post-partum uterine disease in dairy cattle. Reprod Domest Anim. 2013. 48:53-58.
31. Drillich M., Iwersen M. Retained fetal membranes in dairy cows. Livestock Vol. 20, No3. 2015.
32. Drillich, M., Klever, N. and Heuwieser, W. Comparison of two management strategies for retained fetal membranes on small dairy farms in Germany. J. Dairy Sci. 2007. 90: 4275- 4281 33. Goshen T, Shpigel NY. Evaluation of intrauterine antibiotic treatment of clinical metritis and
retained fetal membrane in dairy cows. Theriogenology 2006. 66: 2210-2218.;
34. Dubuc J. Postpartum uterine diseases: prevalence, impacts, and treatments. WCDS Adv Dairy Technol 2011;23:255–67;
35. Wathes DC., Cheng Z., Fenwick MA., Fitzpatrick R., Patton J. Influence of energy balance on the somatotrophic axis and matrix metalloproteinase expression in the endometrium of the postpartum dairy cow. Reproduction 2011 Feb;141(2):269-281;
36. Potter T., Guitian J., Fishwick J., Gordon PJ., Sheldon IM. Risk factors for clinical endometritis in postpartum dairy cattle. Theriogenology, 2010. 74:127-134;
38
37. Westermann S., Drillich M., Kaufmann TB., Madoz LV., Heuwieser W. A clinical approach to determine false positive findings of clinical endometritis by vaginoscopy by the use of uterine bacteriology and cytology in dairy cows. Theriogenology 2010; 74:1248-1255.;
38. Silva E., Leitão S., Tenreiro T., Pomba C., Nunes Lopes da Costa T.L., Mateus L. Genomic and phenotypic characterization of Escherichia coli isolates recovered from the uterus of puerperal dairy cows, J. Dairy Sci. 2009. 92 6000–6010;
39. Yavari M., Haghkhah M., Ahmadi MR. Bacterial study of clinical postpartum endometritis in Holstein dairy cows. Online J Vet Res 2007; 11: 14-23;
40. Bicalho RC., Santos TM., Gilbert RO., Caixeta LS., Teixeira LM., Bicalho ML., et al. Susceptibility of Escherichia coli isolated from uteri of postpartum dairy cows to antibiotic and environmental bacteriophages. Part I: Isolation and lytic activity estimation of bacteriophages. J Dairy Sci 2010; 93: 93-104;
41. Sheldon I.M., Rycroft A.N., Dogan B., Craven M., Bromfield J.J., Roberts M.H., Price S.B., Gilbert R.O., Simpson K.W. Specific strains of Escherichia coli are pathogenic for the endometrium of cattle and cause pelvic inflammatory disease in cattle and mice, PLoS One 2010. 5. e9192;
42. Michael G.B., Kaspar H., A.K.E. Siqueira de Freitas Costa, Corbellini L.G., Kadlec K., Schwarz S. Extended-spectrum β-lactamase (ESBL)-producing Escherichia coli isolates collected from diseased food-producing animals in the GERM-Vet monitoring program 2008– 2014, Vet. Microbiol. 2017. 200 142–150;
43. Galvão KN. Postpartum uterine diseases in dairy cow. Animal Reproduction, 2012; 9(3): 290-296.
44. Bush, K. and Jacoby, G.A. Updated functional classification of β-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother., 2010. 54(3): 969-976;
45. Kaesbohrer A., Schroeter A., Tenhagen B.A., Alt K., Guerra B., Appel B., Emerging antimicrobial resistance in commensal Escherichia coli with public health relevance, Zoonoses Public Health 2012. 59 158–165.
46. Jonga A., Garcha F., Simjeea S., Moyaerta H., Rosea M., Youalaa M., Siegwarth E. Monitoring of antimicrobial susceptibility of udder pathogens recovered from cases of clinical mastitis in dairy cows across Europe: VetPath results. Veterinary microbiology 2018. (213). 73-81;
39
47. Aarestrup F.M., The livestock reservoir for antimicrobial resistance: a personal view on changing patterns of risks, effects of interventions and the way forward, Philos.Trans. R. Soc. 2015. B 370 1617;
48. Wang JT., Chen P., Chang S., Shiau Y., Wang H., Lai JF., Huang IV., Tan M., Lauderdale TY. Antimicrobial susceptibilities of Proteus mirabilis: a longitudinal nationwide study from the Taiwan surveillance of antimicrobial resistance (TSAR) program. BioMed Central Infectious Diseases. 2014; 14:486;
49. Kumar A., Gart E., Nagaraja T.G., Narayanan S. Adhesion of Fusobacterium necrophorum to bovine endothelial cells is mediated by outer membrane proteins.Veterinary Microbiology 2013. 162 813–818;
50. Kumar A., Menon S., Nagaraja T.G., Narayanan S. Identification of an outer membrane protein of Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum that binds with high affinity to bovine endothelial cells Veterinary Microbiology 2015. 176 96–201;
51. Lima, F. S., Greco, L. F., Bisinotto, R. S., Ribeiro, E. S., Martinez, N. M., Thatcher, W. W., et al. Effects of intrauterine infusion of Trueperella pyogenes on endometrial mRNA expression of proinflammatory cytokines and luteolytic cascade genes and their association with luteal life span in dairy cows. Theriogenology 2015. 84, 1263–1272;
52. Amos, M. R., Healey, G. D., Goldstone, R. J., Mahan, S. M., Düvel, A., Schuberth, H. J., et al. Differential endometrial cell sensitivity to a cholesterol-dependent cytolysin links Trueperella pyogenes to uterine disease in cattle. Bio Reprod 2014, 54, 1-13;
53. Pietrocola G., Valtulina V., Rindi S., Jost BH., Speziale P. Functional and structural properties of cbpA, a collagen binding protein from Arcanobacterium pyogenes. Microbiology 2007. 153:3380–3389;
54. Ghai S., Sachdera A., Mahajan R., Dogra S., Soodan S., et al. Bacteriology and antibiotic susceptibility profile of aerobic burn wound isolate at a tertiary care institute. J Appl Environ Microbiol 2015. 3: 95-100;
55. Marshall BM., Levy SB. Food animals and antimicrobials: impacts on human health. Clin Microbiol Rev. 2011;24:718–33;
56. Mukerji S., O‟Dea M., Barton M., Kirkwood R., Lee T., Abraham S. Development and transmission of antimicrobial resistance among Gram-negative bacteria in animals and their public health impact. Essays Biochem. 2017;61:23–25;
40
57. Collignon P., Powers JH., Chiller TM., Aidara-Kane A, Aarestrup FM. World Health Organization ranking of antimicrobials according to their importance in human medicine: A critical step for developing risk management strategies for the use of antimicrobials in food production animals. Clin Infect Dis 2009. 49: 132–141;
58. WHO. Critically important antimicrobials for human medicine. 5th revision. Geneva: World Health Organization; 2017;
59. Pfeifer Y., Cullik A., and Witte W., “Resistance tocephalosporins and carbapenems in Gram- negative bacterial pathogens,” International Journal of Medical Microbiology, 2010. vol. 300, no. 6, pp. 371–379;
60. D‟Andrea MM., Arena F., Pallecchi L., Rossolini GM. CTX-M-type beta-lactamases: a successful story of antibiotic resistance. Int J Med Microbiol 2013. 303:305–317;
61. Verma P., Chandrakar V., Chitra. Antibiotic sensitivity treatment from Gram-negative bacteria isolated from Pus sample. Inter J Pharm Biol Sci. 2012. ISSN: 2230-7605;
62. Santos TM., Caixeta LS., Machado VS., Rauf AK., Gilbert RO., Bicalho RC. Antimicrobial resistance and presence of virulence factor genes in Arcanobacterium pyogenes isolated from the uterus of postpartum dairy cows. Vet Microbiol. 2010;145:84–9;
63. Kuipers A., Koops WJ., Wemmenhove H. Antibiotic use in dairy herds in the Netherlands from 2005 to 2012. J Dairy Sci. 2016; 99:1632–48;
64. Raymond MJ., Wohrle RD., Call DR. Assessment and promotion of judicious antibiotic use on dairy farms in Washington State. J Dairy Sci 2006. 89:3228–3240.
65. Moges N., Regassa F., Yilma T. Isoliation and antimicrobial susceptibility of bacteria from dairy cows with clinical endometritis. Journal of Reproduction and Infertility 2013. 4 (1): 04-08.
