SMULKIŲJŲ ATRAJOTOJŲ AKIŲ KONJUNKTYVOS IR NOSIES ERTMöS MIKROFLOROS TYRIMAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

VETERINARIJOS FAKULTETAS UŽKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDRA

SANDRA BELICKAITö

SMULKIŲJŲ ATRAJOTOJŲ AKIŲ KONJUNKTYVOS IR NOSIES ERTMöS

MIKROFLOROS TYRIMAS

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: prof. dr. Jūrat÷ Šiugždait÷

2 PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas – Smulkiųjų atrajotojų akių

konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas:

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie n÷ra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavard÷) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DöL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavard÷) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

(aprobacijos data) (katedros ved÷jo/jos vardas, pavard÷) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įd÷tas į ETD IS

(gynimokomisijos sekretor÷s/riaus parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavard÷) ( parašas)

Magistro baugiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sektetor÷s/riaus vardas, pavard÷) (parašas)

3

TURINYS

SUMMARY ... 4

ĮVADAS ... 5

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 7

1.1. Ožkų akių konjunktyvos mikroflora... 7

1.2 Ožkų nosies ertm÷s mikroflora... 8

1.3. Avių akių konjunktyvos mikroflora ... 11

1.4 Avių nosies ertm÷s mikroflora ... 14

1.5 Laukinių atrajotojų akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros įvairov÷... 15

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS ... 166

3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 21

3.1 AVIŲ IR OŽKŲ PRIEAUGLIO AKIŲ KONJUNKTYVOS IR NOSIES ERTMöS MIKROFLOROS TYRIMAS, ATLIKTAS B, C, D ŪKIUOSE ... 21

3.1.1 Avių prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, A ūkyje... 21

3.1.2. Avių prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, A ūkyje... 22

3.1.3 Ožkų prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, B ūkyje ... 23

3.1.4 Ožkų prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, B ūkyje ... 24

3.1.5 Ožkų prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, C ūkyje ... 25

3.1.6 Ožkų prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, C ūkyje ... 26

3.1.7 Ožkų prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, D ūkyje ... 26

3.1.8 Ožkų prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, D ūkyje ... 27

3.2 Akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros palyginamoji analiz÷ skirtinguose ūkiuose 28 3.3 Akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros priklausomyb÷ nuo įvairių faktorių... 29

3.4 Staphylococcus aureus identifikavimas PGR metodu... 30

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31

IŠVADOS... 33

4

SUMMARY

A STUDY OF MICROFLORA OF OCULAR CONJUNCTIVA AND NASAL CAVITY IN SMALL RUMINANTS

The purpose of this investigation was to isolate microbial flora of the normal small ruminants ocular conjunctiva and nasal cavity.

Samples were collected from 28 clinically healthy young sheep’s ocular conjunctiva and nasal cavity and 118 samples were collected from young goat’s ocular conjunctiva and nasal cavity. Microorganisms were isolated from 23 (82.14 perc.) ocular and nasal samples of young sheep’s and 106 (89.83 perc.) ocular and nasal samples of young goat’s without clinical signs.

Among the isolates from the clinically healthy young sheep’s and goat’s ocular and nasal Staphylococcus spp. were the most frequent microorganisms strain. It was isolated in number (21.43 perc.) of the young sheep’s nasal samples, followed by coagulase – positive Staphylococcus aureus (21.43 perc.) and (14.29 perc.) of the ocular samples, followed by coagulase – positive

Staphylococcus aureus (14.29 perc.) and coagulase – negative Staphylococcus epidermidis (7.14 perc.). Other detected strains of the nasal samples: Escherichia coli (21.43 perc.), Streptococcus spp. (14.29 perc.), Pasteurella spp. (14.29 perc.), Bacillus cereus (7.14 perc.); and of the ocular samples: Corynebacterium spp. (21.43 perc.), Enterobacter spp. (14.29 perc.), Bacillus cereus (14.29 perc.), Escherichia coli (7.14 perc.), Streptococcus spp.(7.14 perc.).

The results of dominating Staphylococcus spp. strain of the clinically healthy young goat’s ocular samples were (28.33 perc.) followed by coagulase – positive Staphylococcus aureus (11.67 perc.) and (39.65 perc.) of nasal samples, followed by coagulase – positive Staphylococcus aureus (6.89 perc.). Other frequently isolates microorganisms of the clinically healthy young goat’s ocular samples: Corynebacterium spp. (15 perc.) and Bacillus spp. (10 perc.) and the next dominating microorganisms of nasal samples: Enterobacter spp. (18.96 perc.) and Streptococcus spp. (12.07 perc.)

After research of PCR we detected Staphylococcus aureus strains from ocular and nasal samples by using specific au-F3 and au-nucR primers to Staphylococcus aureus.

According R statistical package (Fisher‚s exact test) was determined that the probability of detecting microorganisms in samples from nasal cavity higher (47.46 perc.) (p<0.05) than ocular conjunctiva.

5

ĮVADAS

Sveikų gyvūnų paviršiniai audiniai, kaip oda bei gleivin÷s, nuolat kontaktuoja su išorine aplinka ir yra lengvai kolonizuojami įvairių mikroorganizmų. Mikroorganizmų įvairov÷, reguliariai randama bet kuriose organizmo anatomin÷se vietose, yra vadinama normalia mikroflora. Dažniausiai normalią mikroflorą sudaro eukariotiniai grybai bei protistai, tačiau didžiausią jos dalį sudaro bakterijos.

Normali gyvūnų mikroflora yra nepaprastai sud÷tinga ir susideda iš daugiau nei 200 bakterijų rūšių. Normalios mikrofloros sud÷čiai įtakos turi įvairūs faktoriai, tarp jų – genetika, amžius, lytis, stresas, mityba. Veikiant stresiniams faktoriams (transportavimas, triukšmas ir kt.) slopinama imunin÷ būkl÷ ir kliniškai sveikų gyvūnų normali bakterin÷ mikroflora gali būti sutrikdyta. Normalios bakterin÷s mikrofloros slopinimas dažniausiai sudaro sąlygas potencialiems patogenams vystytis ir tai nulemia įvairių susirgimų pasireiškimą (Azizollah et al., 2009).

Išorin÷s akies infekcijai plisti neleidžia tinkamas mechaninių, anatominių, imunologinių bei mikrobiologinių veiksnių balansas. Mechaniniams ir anatominiams veiksniams priskiriama sveika akių jungin÷ ir ragenos epitelis bei mirks÷jimo refleksas. Akių konjunktyva nuolat yra dr÷gna ir sveika d÷l nuolat išsiskiriančio sekreto iš ašarų liaukų. Mirkčiojimas kas kelias sekundes valo akių konjunktyvą, taip mechaniškai šalindamas pašalines medžiagas, tarp jų – ir bakterijas. Tod÷l ašarų komponentai (lizocimas, imunoglobulinai, laktoferinas ir betalizinas) yra labai svarbūs sudarant išorinį gynybos barjerą (McClellan et al., 1998).

Normalią viršutinių kv÷pavimo takų (nosiarykl÷) mikroflorą sudaro didelis skaičius įvairių bakterijų rūšių. Šnerv÷s visada yra gausiai kolonizuotos Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium sp. ir Staphylococcus aureus. Tai yra pagrindin÷ patogenų nešiojimo vieta. Sveiki sinusai, priešingai, yra sterilūs.

http://textbookofbacteriology.net/themicrobialworld/NormalFlora.html. Prieiga per internetą 2012-02-24.

Yra labai nedidel÷ tikimyb÷, jog bakterijos kolonizuos akių konjuktyvą be specialių prisitvirtinimo prie epitelinio paviršiaus mechanizmų ir lizocimo pasipriešinimo savybių. Nusilpus organizmo imunitetui išorinis akių gynybos barjeras pažeidžiamas įsivyraujant patogeniniams mikroorganizmams. Manoma, kad patogenai, kurie sukelia konjunktyvos infekcijas (pvz., Chlamydia trachomatis ), gali specifiškai prisijungti prie akių konjuktyvos epitelio (Smith, Sherman, 1994).

6 Tod÷l norint išvengti akių bei viršutinių kv÷pavimo takų mikrofloros pokyčius indukuojančių susirgimų, svarbu užtikrinti tinkamas gyvulių laikymo sąlygas, subalansuotą š÷rimą ir rutininių tyrimų atlikimą.

Darbo objektas: smulkiųjų atrajotojų akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikroflora.

Darbo tikslas: ištirti smulkiųjų atrajotojų akių ir nosies mikroflorą.

Darbo uždaviniai:

1. Išskirti ir identifikuoti mikroorganizmus iš smulkiųjų atrajotojų nosies ertm÷s. 2. Išskirti ir identifikuoti mikroorganizmus iš smulkiųjų atrajotojų akių konjunktyvos.

3. Identifikuoti išskirtas Staphylococcus aureus padermes polimerazine grandinine reakcija. 4. Įvertinti smulkiųjų atrajotųjų mikroflorą įtakojančius faktorius.

7

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Ožkų akių konjunktyvos mikroflora

Ožkos yra daugiafunkciniai gyvūnai, iš kurių gaunama m÷sa, pienas, oda bei plaukai. Šie gyvūnai yra laikomi didel÷mis bandomis ir daugelyje besivystančių šalių, tokių kaip Botsvana Afrikoje, jie yra laikomi natūrinio ūkininkavimo tikslais (Davendra, 1985).

Nagrin÷jant akių problemas buvo atlikti tyrimai Pietų Afrikoje. Botsvanos žem÷s ūkio kolegijoje atlikus tyrimus buvo teigiama, kad akių infekcijos rizika padid÷ja vasaros laikotarpiu ar šiltais m÷nesiais, kada suaktyv÷ja mus÷s. Šie vabzdžiai nuo vieno šeimininko prie kito perneša tam tikrų ligų patogenus. Tod÷l pagrindinis tyrimo objektas buvo susijęs su ožkų akių konjunktyvos mikroflora, siekiant nustatyti akių konjunktyvos, gleivinių ir odos užterštumą pagal išskirtų bakterijų tipizavimą (Tortora et al., 1992).

Iš sveikų ir bakterijomis užkr÷stų akių buvo išskirta viena iš bakterijų – Staphylococcus aureus. Staphylococcus sp. aplinkoje aptinkami kaip komensalai ir gali nulemti žmonių ir labai dažnai gyvūnų oportunistines infekcijas, nors šie mikroorganizmai laikomi nepatogeniškais (Quinn et. al., 2011). Cooper et al. (2001), atliekantis tyrin÷jimus su triušiais, išsiaiškino, jog Staphylococcus sp. yra gausiausiai aptinkama bakterija akyse. Triušių tyrimo metu tarp mikroorganizmų, išskirtų iš sveikų akių, dažniausiai buvo išskiriama Staphylococcus sp.

Moraxella ovis buvo išskirta taip pat iš sveikų akių, tačiau šio mikroorganizmo svarba keratokonjunktyvito patogenez÷je yra abejotina (Van Halderen, Henton, 1994). Pagrindinis tyrin÷jimo tikslas buvo susijęs su nepatogeniškų mikroorganizmų aptikimu kliniškai sveikų ožkų akių konjuktyvoje. Tiriamąją gyvūnų bandą sudar÷ 200 ožkų. M÷giniai iš akių konjunktyvos atsitiktinai buvo paimti ketvirtadaliui ožkų iš vienos akies. M÷giniai buvo renkami Botsvanos žem÷s ūkio kolegijoje. M÷giniai buvo paimti iš įvairaus amžiaus ožkų. Ožkos buvo laikomos kartu su avimis pagal pusiau intensyvaus auginimo sistemą. Gyvūnai buvo išgenami iš aptvarų pasiganyti ir ankstyvą popietę buvo pargenami į kaimelį bei papildomai šeriami šienu bei girdomi. M÷giniai buvo renkami anksti ryte, rudens sezono metu. Visoms tirtoms ožkoms nenustatyta oftalmologinių pakitimų. Atskiroms ožkų grupel÷ms buvo paimti m÷giniai iš vienos akies.

Bakterijos buvo išskirtos iš 50 sveikų ožkų akių – 32, tai sudar÷ 60 proc., o iš likusių 18 m÷ginių buvo gauti neigiami rezultatai. Pavien÷s bakterijos buvo išskirtos iš 12 ožkų, tai sudar÷ 24 proc. Moraxella sp. buvo dažniausiai išskiriama bakterija ir sudar÷ 26,3 proc. visų išskirtų bakterijų.

Dažniausiai pasitaikanti bakterija iš sveikų ožkų akių buvo Moraxella sp. bei Staphylococcus sp. Nepakitusioje ožkų konjunktyvos gleivin÷je buvo išskirtos šios bakterijos: Moraxella ovis, Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus sp. ir Bacillus sp. (1 lent.).

8 1 lentel÷. Bakterijos, išskirtos iš ožkų akių konjunktyvos

Bakterijų gentys Bakterijų skaičius Išskirtų bakterijų procentin÷ išraiška Moraxella sp. 15 26,3 Staphylococcus spp. 13 22,8 Corynebacterium spp. 9 15,8 Streptococcus sp. 5 8,8 Micrococcus spp. 4 7,0 Pasteurella spp. 1 1,8 Kitos 10 17,5 Iš viso 57 100,0

Šaltinis: (Mushi E. Z. et al., 2007)

Moraxella sp. taip pat buvo išskirta daugelio ožkų keratokonjuktyvito atvejų. Pastangos užkr÷sti ÷riukus, panaudojant Moraxella ovis bakterijų kultūras, gautas iš klinikinių m÷ginių, nebuvo s÷kmingos. Buvo teigiama, jog pradiniai patogenai infekcijai sukelti yra Chlamydia sp. ir / arba Mycoplasma sp., o Moraxella sp. buvo laikomas kaip antrinis suk÷l÷jas (Van Halderen, Henton, 1994).

1.2 Ožkų nosies ertm÷s mikroflora

Nigerijos gyvulininkyst÷s ekonomikoje ožkos yra itin svarbios d÷l puikaus sugeb÷jimo prisitaikyti prie nepalankių aplinkos sąlygų (Peacock, 2005). Ožkų m÷sa yra naudingas baltymų šaltinis, taip pat ožkininkyst÷ yra svarbus pajamų šaltinis skurdžiai gyvenantiems kaimo gyventojams, ypač vaikams ir moterims (Jaitner et al., 2001). Taigi ožkininkyst÷s produkcijos augimas reikalauja užtikrinti maisto saugumą ir padidinti pajamas (Diallo, 2006).

Nepaisant to, kad ožkas laiko kiekvienas namų ūkis, tačiau šiuo atžvilgiu produkcija n÷ra gerai išvystyta d÷l netinkamos gyvulių mitybos, blogos priežiūros ir vyraujančių ligų. Iš visų šių ligų labiausiai pažeidžiančios respiratorinį traktą yra ožkų kontagin÷ pleuropneumonija ir pasterelioz÷, sukeliančios didelius nuostolius d÷l per didelio sergamumo bei mirtingumo. Prie bakterinių pneumopatijų dažniausiai priskiriama Mannheimia haemolytica, kuri labai pažeidžia plaučius. Be to, bakteriniai agentai kaip Actinomyces pyogenes taip pat sukelia pažeidimus ožkų plaučių audinyje (Akpavies, Emikpe, 2000).

9 Analizuojant kv÷pavimo takų infekcines ligas, mikrobiologiniai tyrimai buvo atlikti su ožkų kv÷pavimo takų mikroflora. Jie buvo orientuoti į plaučių pneumonijas, nosies ertm÷s tyrimus bei išskirtų mikroorganizmų antibiogramos analizę. Tyrimai atlikti 60 sveikų Vakarų Afrikos nykštukinių ožkų. M÷giniai iš ožkų nosies ertm÷s buvo tiriami standartiniais metodais kiekvienai atskirai. Antibiotikais impregnuotų diskų metodas buvo naudojamas mikroorganizmų jautrumui nustatyti. Tyrimo metu iš viso buvo išskirta 328 mikroorganizmai. Dažniausiai išskiriamos bakterijos buvo Streptococcus spp., o Escherichia coli ir Staphylococcus aureus taip pat buvo vienos iš dominuojančių bakterijų. Mannheimia haemolytica ir Pasteurella multocida išskyrimas iš kliniškai sveikų ožkų nosies ertm÷s parod÷ galimą jų įtaką smulkiųjų atrajotojų respiratorinių ligų patogenezei. Išsiaiškinta, kad dauguma bakterijų yra jautrios streptomicinui, enrofloksacinui ir gentamicinui, tačiau atsparios tetraciklinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi ir eritromicinui. Tai parod÷ ryšį tarp netinkamo antibiotikų vartojimo ir atsparumo vaistams išsivystymo. Be to, praktikuojančiuosius veterinarijos gydytojus bei laboratorijos darbuotojus svarbu informuoti apie galimą antibiotikų panaudojimą sergant respiratorin÷mis ligomis ir prevencijos tikslais.

Tyrimas buvo vykdomas 2 metus, tikslingai atrenkant 60 sveikų eksperimentinių ožkų. Buvo perkama po 20 ožkų bandose iš individualių gyvūnų augintojų ar iš kitų namų ūkių aplink arba pačiame Ibadane, Nigerijoje. Veterinarijos patologijos departamento nurodymu, smulkieji atrajotojai buvo laikomi aptvaruose, eksperimentiniams gyvūnams skirtose sekcijose, Ibadano universiteto veterinarin÷s medicinos fakultete. Jie nebuvo leidžiami ganytis. Gyvūnai buvo šeriami koncentratais ir iki soties girdomi vandeniu. Ožkos buvo mažiau nei vienerių metų amžiaus ir pirkimo metu atrod÷ kliniškai sveikos.

Iš viso buvo gauta 328 išskirtų bakterijų. Dažniausiai pasitaikanti bakterijų rūšis buvo Streptococcus pyogenes, o Escherichia coli ir Staphylococcus aureus buvo antrosios iš dominuojančiųjų išskirtų bakterijų. Mannheimia haemolytica ir Pasteurella multocida buvo svarbūs smulkiųjų atrajotojų respiratorinio trakto patogenai (2 lent.).

2 lentel÷. Mikroorganizmų gentys bei rūšys, išskirtos iš kliniškai sveikų Vakarų Afrikos nykštukinių ožkų nosies ertm÷s

Bakterijos 20 ožkų 20 ožkų 20 ožkų Iš viso 60 ožkų

Iš viso išskirtų bakterijų

(proc.)

Streptococcus spp. 17 21 12 50 15.2

Escherichia coli 6 21 16 43 13.1

10 Staphylococcus aureus 15 21 - 36 11.0 Klebsiella spp. 4 12 15 31 9.5 Staphylococcus spp. 4 12 10 26 7.9 Mannheimia haemolytica 5 21 - 26 7.9 Enterococcus spp. 4 5 12 21 6.4 Pasteurella multocida 3 18 - 21 6.4 Pseudomonas spp. 3 1 14 18 5.5 Proteus spp. 2 4 4 10 3.1 Bacillus spp. - 5 - 5 1.5 Micrococcus spp. - - 1 1 0.3 Streptococcus viridians spp. - - 1 1 0.3 Iš viso 80 162 86 328 100

Šaltinis: Empike B. O. et al., 2009.

Tyrimai parod÷, kad sveikų Vakarų Afrikos nykštukinių ožkų nosies ertm÷je kolonizuojasi įvairi bakterin÷ mikroflora. Panašios bakterijos buvo išskirtos iš ožkų ir avių pneumonijos apimtų plaučių, tačiau mažiau duomenų buvo pateikiama apie bakterijas, išskirtas iš sveikų ožkų. Staphylococcus aureus išskyrimas iš nosies ertm÷s sutapo su duomenimis, gautais išskyrus bakterijas iš ožkos (Ugochukwu, 1985) ir avies (Barbour et al., 1997) plaučių. Staphylococcus aureus aptinkamas viršutiniuose kv÷pavimo takuose ir esant nuolatin÷ms stresin÷ms situacijoms sukelia patologinius procesus. Escherichia coli, kuri paprastai sudaro normalią žarnyno mikroflorą, gali sukelti plaučių ir urogenitalinio trakto infekcijas. Tai taip pat gali būti susiję su galimu gyvulio odos užteršimu išmatomis uostantis poravimosi metu. Nors tyrimo metu išskirtas Microccocus spp. buvo laikomas nepatogeniniu, tačiau šis paplitimas gali būti d÷l odos užterštumo. Bacillus spp. išskyrimas iš sveikų gyvūnų prieštarauja kitų autorių nuomonei, kurie nurod÷ bakterijas, išskirtas iš ožkų, sergančių plaučių ir gerkl÷s ligomis (Richards et al., 1986). Nuolatinis Mannheimia haemolytica išskyrimas iš įvairių gyvūnų rūšių sveikų plaučių arba gyvūnų, sergančių respiratorinio trakto ligomis, gali būti labai svarbus infekcinių pneumopatijų patogenez÷je. Mannheimia haemolytica ir Pasteurella multocida išskyrimas iš sveikų Vakarų Afrikos nykštukinių ožkų nosies ertm÷s didesn÷mis proporcijomis (7,9 proc. ir 6,4 proc. atitinkamai) parodo galimą jų įtaką daugumai smulkiųjų atrajotojų respiratorinių ligų (Brogden et al., 2000).

Mannheimia haemolytica buvo išskirta iš sveikų gyvulių nosiarykl÷s ir tonzilių, kur buvo identifikuotas A2 serotipas tiek avims, tiek galvijams (Rowe et al., 2001). Mikroorganizmų išskyrimas iš avių nosiarykl÷s buvo lyginamas su infekcijos atvejais.

11 Atlikti tyrimai parod÷, kad streso faktoriai kartu su virusine infekcija arba be jos slopina mukociliarinio klirenso mechanizmą, kuris respiratoriniame trakte sukelia nepatogeninių bakterijų proliferaciją. Jie taip pat skatina nepatogeninių bakterijų virtimą į patogenines, ypač Mannheimia haemolytica, kada 2 serotipas staiga virsta pirmuoju, kuris laikomas gyvuliams patogeniniu serotipu. Šių serotipų pakitimas yra reikšmingas ožkų pneumonijos patogenez÷je.

Atsižvelgiant į stresinius faktorius, kaip klimatinių sąlygų pasikeitimas, ligos, netinkama priežiūra, patogeninių bakterijų rūšys, ypač svarbi yra Mannheimia haemolytica, kai kolonizuojamas Vakarų Afrikos nykštukinių ožkų viršutinis respiratorinis traktas ir kyla didžiul÷ rizika infekcijų pasireiškimui.

1.3. Avių akių konjunktyvos mikroflora

Nagrin÷jant avių akių problemas, Anglijoje buvo atlikta keletas tyrimų, specifiškai susijusių su sveikų avių atsparios akių konjunktyvos mikroflora. Spradbrow (1968) išskyr÷ tik nedaugelį bakterijų rūšių iš avių akių konjunktyvos, tačiau Egwu (1989) ir jo kolegos m÷ginių ÷mimo metu ištyr÷ įvairią mikroflorą. Vieninteliai mikroorganizmai, kurie yra reikšmingi ir gali būti išskirti iš sveikų avių akių konjunktyvos bei galintys nulemti avių keratokonjunktyvitą, yra Mycoplasma conjunctivae ir Moraxella ovis. Chlamydia psittaci yra susijusi su specifiniu folikuliniu konjunktyvitu (Wilsmore, Dagnall, 1988).

Avių keratokonjuktyvitas charakterizuojamas l÷tine eiga su pūlingomis išskyromis bei keratito ir ragenos drumstumo požymiais. Ragenos drumstumas gali pasireikšti tik sunkiais atvejais. Taip pat yra matomi tokie akių skleros požymiai: išskyros iš nosies, lakrimacija, fotofobija, hiperemija.

Mikrobiologin÷s analiz÷s metu buvo atlikti trys tyrimai. Įvairių veislių avys buvo laikomos Karališkojoje veterinarijos kolegijoje arba buvo atvežtos iš komercinių bandų. M÷giniai buvo imami visais sezonais iš lauke ar patalpose laikomų avių.

Pirmojo tyrimo metu buvo imami m÷giniai iš suaugusių avių, siekiant nustatyti akių konjunktyvos maišelyje vyraujančią mikroorganizmų įvairovę ir jų santykinį skaičių. Antrojo tyrimo metu santykinis mikroorganizmų skaičius ir jų įvairov÷ buvo tiriama ir aptikta dviem sveikų ÷riukų ir ÷riavedžių grup÷ms. Šio tyrimo tikslas buvo įsitikinti, ar išskirti mikroorganizmai sudaro atsparią mikroflorą, ar pasireiškimas yra tik trumpalaikis. Trečiojo tyrimo metu buvo ištirta tokia mikroflora, kuri l÷m÷ avių keratokonjunktyvitą. Visų trijų tyrimų rezultatai pavaizduoti 3 lentel÷je.

12 3 lentel÷. Bakterijos, mikoplazmos ir grybai, išskirti iš akių konjunktyvos 67 avims su keratokonjunktyvito požymiais

Mikroorganizmai Keratokonjunktyvito

klinikiniai požymiai (97 akys)

Nerasta klinikinių požymių (37 akys) Išskirtos bakterijos, mikoplazmos ir grybai 64 11 Mycoplasma conjunctivae 44 2 Moraxella ovis 28 3 Koaguliazei neigiami stafilokokai 17 5 Mycoplasma conjunctivae ir Moraxella ovis 14 0 Bacillus spp. 10 4 α hemolitiniai streptokokai 6 1 Streptomyces spp. 3 1 Mucor spp. 3 1 Mycoplasma conjunctivae ir Chlamydia psittaci 0 1

P.haemolytica, A.laidlawii, S.aureus ir B.cereus buvo išskirtos iš akių su keratokonjunktyvito požymiais. Šaltinis: (Dagnall G. J. R., 1994).

Tyrimai parod÷, jog keletas mikroorganizmų gali būti išskirti iš sveikų avių konjunktyvos maišelio net ir tada, kai m÷giniai buvo imami reguliariai per palyginti ilgą laikotarpį. Iš sveikų avių ir ÷riukų sistemingai buvo išskiriama tik Moraxella ovis ir šis mikroorganizmas turi didel÷s reikšm÷s akių konjunktyvos atspariai mikroflorai, kiti išskirti mikroorganizmai yra laikini arba oportunistiniai kolonizuojantys organizmai.

Mycoplasma conjunctivae sukelia keratokonjunktyvitą, bet šiame tyrime keletui avių jis buvo aptinkamas akių konjunktyvoje nepasireiškus klinikiniams keratokonjunktyvito požymiams. Tikriausiai tokios avys gal÷jo tur÷ti kontaktų su kitomis avimis, turinčiomis klinikinių keratokonjunktyvito požymių. Taip pat Mycoplasma conjunctivae gal÷jo būti kaip atsparios mikrofloros dalis, tačiau buvo per mažas skaičius, kad sukeltų klinikinį atsaką. Be to, gal÷jo būti tam tikrų patogenetinių skirtumų tarp individualių Mycoplasma conjunctivae padermių.

Moraxella ovis ir Mycoplasma conjunctivae buvo išskirtos iš nosies ertm÷s keletui avių; šie mikroorganizmai taip pat buvo aptikti ir konjunktyvos maišelyje. Tai rodo, jog kv÷pavimo takų infekcijų tik÷tinas šaltinis buvo akys ir šie mikroorganizmai per÷jo į nasolakrimalinį kanalą

13 kolonizuodami nosies ertm÷s gleivinę. Bet kokios išskyros iš nosies gali būti potencialus patogenų šaltinis kitoms imlioms avims.

Moraxella ovis buvo išskirta iš sergančių ir kliniškai sveikų avių akių, tačiau žymiai dažniau esant keratokonjunktyvito požymiams. Klinikiniai užkr÷stų akių požymiai dažniausiai buvo neryškūs ir daugiausia apsiribojo uždegiminiais pokyčiais konjunktyvoje. Buvo pateikta keletas įrodymų, kad Moraxella ovis gali būti itin svarbi avių keratokonjunktyvito patogenezei, prisidedant prie būkl÷s sunkumo.

Nors koaguliazei neigiami stafilokokai buvo dažnai išskiriami, tačiau jie niekada nesukeldavo keratokonjunktyvito ir buvo laikomi kaip oportunistiniai mikroorganizmai. Kitų mikroorganizmų vaidmuo tokių kaip Bacillus sp. ir Streptomyces sp. buvo nežymus, kadangi jie buvo išskiriami pakankamai retai. Mycoplasma conjunctivae buvo dažniausiai išskiriamas mikroorganizmams avims su keratokonjunktyvito klinikiniais požymiais. Šis mikroorganizmas taip pat buvo aptiktas ir abiejose akivaizdžiai sveikose akyse kartu su Chlamydia psittaci, bet nebuvo pakankamai įrodymų, kad Chlamydia psittaci buvo reikšminga pirmin÷ keratokonjunktyvito priežastis (Wilsmore, Dagnall, 1988).

Taip pat akių problemos buvo nagrin÷jamos ir kitose pasaulio šalyse. 2009 m. vasarą buvo atliktas tyrimas, kurio tikslas buvo ištirti normalią akių bakterinę mikroflorą avims, laikomoms skerdyklos patalpose Urmijos mieste, Irane. Buvo surinkti 100 m÷ginių iš apatinio konjunktyvos maišelio 50 kliniškai sveikų avių, iš kurių 78 proc. buvo patel÷s, 22 proc. – patin÷liai. Avys buvo skirtingų ekotipų („makui“ ir „ghezel“), tačiau į 3 grupes buvo suskirstytos pagal amžių: vienmet÷s (12 proc.), 2–3 metų (66 proc.) ir daugiau nei 4 metų (22 proc.). Buvo išskirti 156 mikroorganizmai ir jų augimas maksimaliai pasireišk÷ visuose 100 akių m÷ginių. Po vieną bakterijų rūšį išaugo 46 akies m÷giniuose. Po dvi bakterijų rūšis išaugo 52 akies m÷giniuose; 3 bakterijų rūšys nustatytos 2 akies m÷giniuose. Teigiama koreliacija nebuvo nustatyta tarp iš kiekvienos akies išskirtų bakterijų skaičiaus ir amžiaus (p>0,05). Buvo išskirtos šios bakterijų paderm÷s: Bacillus cereus (47,74 proc.), Enterobacter aerogenes (12,9 proc.), Staphylococcus epidermidis (8,91 proc.), Escherichia coli (8,91 proc.), Dermatophilus congolensis (7 proc.), Klebsiella spp. (5,8 proc.), Streptococcus spp. (4,5 proc.), Staphylococcus aureus (4,5 proc.). Reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta, palyginti su išskirtų bakterijų skaičiumi, tarp lyties, amžiaus grupių ir skirtingų ekotipų (p>0,05). Bacillus cereus buvo dažniausiai išskiriama bakterija tarp abiejų lyčių, amžiaus grupių ir ekotipų, Enterobacter aerogenes ir Klebsiella spp. buvo antrosios dažniausiai nustatomos bakterijos taip pat tarp abiejų lyčių ir amžiaus grupių, tačiau dažniau „makui“ ekotipui. Atsižvelgiant į visų išskirtų bakterijų dažnį, nebuvo nustatyta ryškių bakterijų pasireiškimo skirtumų tarp abiejų lyčių, trijų amžiaus grupių ir dviejų ekotipų. Gramteigiamos aerobin÷s bakterijos dažniausiai buvo

14 išauginamos iš kliniškai sveikų avių konjunktyvos maišelio (72,43 proc.) su dominuojančia Bacillus cereus paderme (Sooreh A., Mohammad A., 2010).

1.4 Avių nosies ertm÷s mikroflora

Analizuojant mikrofloros įvairovę avių viršutiniuose kv÷pavimo takuose tyrimai buvo atliekami Amerikoje bei šiaur÷s rytų Afrikoje. Amerikoje buvo atliekami tyrimai su snieginių ir naminių avių m÷giniais iš nosies ertm÷s ir tonzilių. Nosies bei tonzilių m÷giniai buvo renkami iš 14 laisvai laikomų kliniškai sveikų snieginių avių (Ovis canadensis) ir 10 naminių avių (Ovis aries). Buvo identifikuotos 194 bakterijos, iš jų –101 iš snieginių avių ir 93 iš naminių avių. Iš šių išskirtų bakterijų 115 buvo gramteigiamos ir 79 gramneigiamos. Daugiausia buvo išskirta Staphylococcus sp. bakterijų. Šios bakterijos dažniau buvo aptinkamos pas namines avis nei pas sniegines avis. Tačiau didesnis Streptococcus sp. bakterijų skaičius buvo išskirtas iš snieginių avių. Pasteurella haemolytica yra labiausiai paplitusi gramneigiama bakterija, kuri buvo išskirta iš 5 tonzilių m÷ginių, tačiau šių bakterijų nebuvo rasta nosies m÷giniuose namin÷ms avims. Pastaroji bakterija buvo išskirta iš 7 tonzilių ir iš 3 nosies m÷ginių sniegin÷ms avims. Dauguma išskirtų bakterijų buvo oportunistiniai patogenai. Tačiau Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida ir Actinomyces pyogenes bakterijos yra dažniausiai susijusios su kv÷pavimo takų ligomis (Carijean et al., 1994).

Taip pat buvo atlikti kliniškai sveikų bei sergančių avių nosiarykl÷s mikrofloros tyrimai Gondaro veterinarijos klinikoje, Etiopijoje. Buvo surinkti 142 m÷giniai, iš kurių 74 m÷giniai buvo paimti iš kliniškai sveikų ir 68 m÷giniai iš sergančių avių nosiarykl÷s. Iš kliniškai sveikų bei sergančių avių m÷ginių išaugo 70 proc. bakterijų. Dažniausiai išskirtos bakterijos iš kliniškai sveikų avių nosiarykl÷s m÷ginių buvo Staphylococcus epidermidis (15,6 proc.), Escherichia coli (14,3 proc.), Corynebacterium pseudotuberculosis (11,7 proc.), Staphylococcus aureus ir Micrococcus luteus (9,1 proc.). Mažiausiai išskirta buvo Pseudomonas aeruginosa (2,6 proc.) ir Pasteurella multocida (1,3 proc.). Iš sergančių avių nosiarykl÷s buvo išskirtos šios bakterijos: Staphylococcus aureus (17,3 proc.), Staphylococcus epidermidis (13,3 proc.), Mannheimia haemolytica ir Micrococcus luteus (10,7 proc.), Pasteurella multocida (2,7 proc.). Gramteigiamos bakterijos buvo dominuojančios sveikų bei sergančių avių nosiarykl÷s m÷giniuose. Tyrimas parod÷, kad kliniškai sveikų bei sergančių avių nosiarykl÷s m÷giniuose yra aptinkama įvairi bakterin÷ mikroflora (Omer et. al., 2012).

15 1.5 Laukinių atrajotojų akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros įvairov÷

Akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s tyrimai buvo atliekami su kupranugariais ir azijiniais buivolais, Irane. Tyrimo tikslas buvo įvertinti akių konjunktyvoje ir kv÷pavimo takuose vyraujančią mikroflorą. 2008 m. buvo atliktas tyrimas su kupranugariais centriniame Irane. Buvo atsitiktinai atrinkta 30 kupranugarių, kurie buvo laikomi skerdykloje. Tepin÷liai iš nosies buvo renkami priešskerdimin÷s ekspertiz÷s metu iš kliniškai sveikų suaugusių kupranugarių. Iš 120 m÷ginių vyraujanti bakterijų gentis buvo Staphylococcus spp. (52,7 proc.). Taip pat buvo nustatytos Neisseria spp. (20,4 proc.), Bacillus spp. (16,61 proc.) bei Streptococcus spp. (4,5 proc.) gentys. Klebsiella spp. (1,3 proc.), Nocardia spp. (0,003 proc.), Serratia spp. (0,006 proc.) sudar÷ mažiausią procentinę dalį. Keletas kitų mokslininkų tyrin÷jo aerobinių bakterijų išskyrimą iš kliniškai sveikų gyvūnų, pavyzdžiui, ožkų kv÷pavimo takų (Mergra et al., 2006), šunų viršutinių kv÷pavimo takų (Ajuwape et al., 2006), jūrų liūto nosies ertm÷s (Hernandez Casto et al., 2005), tačiau tik pastarasis tyrimas su kupranugariais atskleid÷ Neisseria spp. išskyrimą iš kv÷pavimo takų. Kituose tyrimuose teigiama, jog ši bakterija yra dalis burnos mikrofloros tam tikrų gyvūnų, tačiau pranešimai apie jos išskyrimą iš kv÷pavimo takų yra labai reti.

http://www.isocard.org/e_Library/Journal_of_Camelid_Science/JCS_2009_Volume_02/04_Camel %20flora.pdf. Prieiga per internetą 2012-02-12.

2009 m. buvo atliktas tyrimas su azijiniais buivolais šiaur÷s vakarų Irane. Buvo tirimama 50 kliniškai sveikų azijinių buivolų, iš jų 33 patel÷s ir 17 patinai, akių konjunktyvos mikroflora. Prieš m÷ginių ÷mimą, akys buvo patikrintos oftalmoskopu, siekiant įsitikti, kad jos yra nepažeistos. M÷giniai buvo renkami iš kliniškai sveikų buivolų abiejų akių apatinio konjunktyvos maišelio, naudojant sterilius tampon÷lius kiekvienai akiai, siekiant išvengti galimo užteršimo nuo blakstienų ar vokų odos. Tyrimo metu nustatyta, kad gramteigiamos bakterijos sudar÷ didžiausią dalį – 59 proc. Vyraujanti bakterijų gentis buvo Staphylococcus spp. (29,20 proc.). Dermatophilus spp. (7,18 proc.) ir Streptococcus spp. (0,51 proc.) buvo rečiau išskiriami gramteigiami mikroorganizmai. Gramneigiamos bakterijos sudar÷ 41 proc. ir dažniausiai pasitaikanti bakterijų rūšis buvo Escherichia coli (26,67 proc.). Edwardsiella spp. (7,18 proc.), Klebsiella spp. (4,61 proc.) ir Proteus spp. (2,55 proc.) buvo retai pasitaikančios bakterijų gentys. Dermatophilus congolensis ir Edwardsiella tarda bakterijos pirmą kartą buvo išskirtos iš akių konjunktyvos šio tyrimo metu. D.congolensis pirmiausia yra žinomas kaip buivolų ir kitų gyvūnų odos patogenas, tačiau jis gali lemti įvairių gyvūnų (buivolų ir galvijų) kitų audinių ligas, burnos gleivin÷s uždegimus, ožkų limfinių mazgų bei kačių poodinio audinio pažeidimus. Irane yra paskelbta keletas pranešimų apie galvijų (Shoorijeh et al., 2008) ir avių (Hashemi et al., 2004) odos ligų formas.

16

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

Tyrimai atlikti 2011 m. balandžio – 2012 spalio m÷n. Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Užkrečiamųjų ligų katedroje, mikrobiologijos laboratorijoje. Moksliniai tyrimai atlikti laikantis 1997 11 06 Lietuvos respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. 8 - 500 („Valstyb÷s žinios“, 1997 11 28, Nr. 108) bei poįstatyminių aktų – LR valstybin÷s veterinarin÷s tarnybos įsakymų „D÷l laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ (1998 12 31, Nr. 4 - 361) ir „D÷l laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ (1999 01 18, Nr. 4 - 16). Taip pat, atitinka ES Direktyvą 86/609/EEC ir EK rekomendacijas 2007/526 EC „Gyvūnų naudojimas ir laikymas eksperimentiniais ir kitais tikslais“. M÷giniai tyrimui buvo paimti iš avių bei ožkų prieauglio akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s. Per šį laikotarpį buvo surinkti 146 m÷giniai, iš jų 28 avių prieauglio ir 118 ožkų prieauglio. A ūkyje buvo paimti 28 m÷giniai iš Lietuvos juodgalvių vietinių avių 1 m÷n. amžiaus, skirtingos lyties jauniklių. Kiti m÷giniai buvo surinkti iš ožkų jauniklių, kurie buvo skirtingos lyties, 4 - 6 m÷n. amžiaus. B ūkyje buvo paimta 50 m÷ginių iš Čekų baltųjų veisl÷s ožkų prieauglio, iš jų 32 m÷giniai iš ožkyčių ir 18 m÷ginių iš ožkiukų; C ūkyje - 28 m÷giniai iš Zaneno veisl÷s ožkyčių; D ūkyje buvo surinkta 40 m÷ginių iš Čekų baltųjų veisl÷s ožkų prieauglio, iš jų 24 m÷giniai iš ožkyčių ir 16 m÷ginių iš ožkiukų. M÷giniai buvo renkami pavasario, vasaros bei rudens sezono metu.

A ūkyje tyrimo laikotarpiu buvo auginama 200 avių, I – VI laktacijų. öriukai buvo laikomi prie ÷riavedžių nedideliuose gardeliuose, gausiai pakreiktais šiaudais. Kiekviename gardelyje stovi geriamojo vandens kibirai. öriavedžių racionas priklausomai nuo metų laiko šiek tiek skiriasi, tačiau pagrindinę jo bazę pavasarį, vasarą ir rudenį sudaro žol÷, šaltuoju metų laiku papildomai duodama šienainio, siloso, šakniavaisių, koncentruotųjų pašarų priklausomai nuo avių poreikio. B, C, D ūkiuose ožkos auginamos panašiomis sąlygomis. Ožkos laikomos uždarai ištisus metus, kai kurios turi galimybę išeiti į pasivaikščiojimo aikšteles. B ūkyje tyrimo metu buvo laikoma 110 melžiamų ožkų, 3 ožiai ir apie 90 jauniklių. Ožkos buvo I – V laktacijos. Ožkų racionas atitinkamai kiekvienam sezonui šiek tiek varijuoja ir susideda iš miltų mišinio, šieno, šienainio, siloso, morkų, burok÷lių, runkelių. Tyrimo metu ūkiuose infekcinių ar invazinių ligų nebuvo užregistruota.

M÷giniai mikrobiologiniam tyrimui imti iš nosies ertm÷s ir akių konjunktyvos į transportines terpes TRANSWAB®(Amies, Liofilchem, Italija). M÷giniai buvo imami iš vienos akies bei vienos nosies landos atskirais steriliais vatos tampon÷liais, nes pa÷mus m÷ginius iš abiejų akių ir nosies landų išaugdavo ta pati mikroorganizmų rūšis. Akių tyrimui buvo naudojami specialūs, sausi ir sterilūs mikrobiologiniai tampon÷liai, kuriais buvo braukiama palei vidinį akies ir trečiąjį akies voką. Tyrimas buvo atliekamas kruopščiai, siekiant išvengti m÷ginių užterštumo d÷l galimai

17 užterštos akių vokų odos. M÷giniai iš akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s buvo imami įsitikinus, jog gyvuliams nebuvo taikoma antibiotikų terapija ar naudojami vietiniai anestetikai d÷l toksinio poveikio bakterijoms bei iškreiptų rezultatų parodymų.

M÷giniai buvo s÷jami į Petri l÷kšteles su kraujo agaru (KA) (Oxoid, Anglija) ir selektyvin÷mis mitybin÷mis terp÷mis. Užs÷tos Petri l÷kštel÷s buvo kultivuojamos 24 – 48 val. aerobin÷mis sąlygomis, esant +37ºC temperatūrai. Po to buvo vertinamos mikroorganizmų kultūrin÷s, morfologin÷s ir biochemin÷s savyb÷s. Mikroorganizmų morfologijai nustatyti buvo paruošti tepin÷liai iš mikroorganizmų kultūrų bei dažyti Gramo metodu („Diagnostica Merck“, Vokietija) ir vertinta mikroskopu.

Stafilokokų identifikavimui m÷giniai buvo užs÷ti ant 5 proc. KA, Manitolio druskos (Oxoid, Anglija) bei Baird – Parker agarų (Liofilchem, Italija). Kraujo agare buvo stebima visiška arba dalin÷ hemoliz÷, kurią sukelia hemolizin÷mis savyb÷mis pasižymintys mikroorganizmai. Virulentiški kamienai augdami kraujo agare aplink savo spindį sudar÷ skaidrią zoną d÷l eritrocitų lizavimo.

Staphylococcus aureus (S.aureus) identifikavimui buvo stebimas mikroorganizmų kultūrų augimas ant Manitolio druskos (Oxoid, Anglija) ir Baird – Parker agarų (Liofilchem, Italija). Petri l÷kštel÷s su užs÷ta kultūra kultivuotos termostate +37ºC temperatūroje. Rezultatai vertinti po 24 – 48 val. S.aureus augdamas ant Manitolio druskos agaro fermentuoja manitą d÷l to keičiasi terp÷s pH ir terp÷s rožin÷ spalva augimo zonoje pakinta į gelsvą. Baird – Parker agare (Liofilchem, Italija) augdamas S.aureus d÷l telurito skaidymo sudaro juodas kolonijas su opalescencin÷mis zonomis.

Patogeniniams stafilokokams identifikuoti buvo naudotas „Staphytest Plius“ testas (Oxoid, Anglija), kuriuo nustatomas A baltymas, esantis jų ląstel÷s sienel÷je. „Staphytest Plius“ testas – tai lateksagliutinacijos reakcija, kuriai atlikti gaminamos specialios standartin÷s sistemos iš latekso dalelių. Latekso dalel÷s savo paviršiuje turi absorbuotus specifiškus polikloninius antikūnus, kiaulių fibrinogeną ir triušio IgG. Ant „Staphytest Plus“ juostel÷s užlašinus šio specialaus reagento ir prid÷jus tiriamąją stafilokokų kultūrą, kurioje yra mikroorganizmo antigenų, matoma latekso dalelių agliutinacija – įvyksta reakcija tarp: fibrinogeno ir rišamojo faktoriaus, IgG Fc fragmento ir Proteino A, kuris yra specifiškas IgG (Oxoid kompanijos instrukcija).

Patogeninio S.aureus patvirtinimui buvo atrinkti koaguliazei teigiami m÷giniai, panaudojus triušių plazmą, susidarant paviršinei koaguliazei. Šie koaguliazei teigiami m÷giniai su galima S.aureus paderme buvo užs÷ti kaip etalonin÷ kultūra į nuožulniuosius maitinamuosius agarus ir buvo laikoma + 4 °C temperatūroje, kol buvo atliktas PGR tyrimas.

Koaguliazei teigiamų stafilokokų DNR išskyrimui buvo naudotas 5 proc. „Chelex-100“ tirpalas (Sigma, USA). Į ependorfinius m÷gintuv÷lius su 500 µl „Chelex-100“ tirpalu buvo perkeltos 3–5 stafilokokų kultūros kolonijos. V÷liau m÷gintuv÷liai inkubuoti 56°C temperatūroje 30

18 min. ir 95°C temperatūroje 10 min. Pakaitintas tirpalas centrifuguotas 2,5 min. 10000 aps./min. greičiu. Po centrifugavimo 300 µl viršutinio tirpalo sluoksnio, buvo perkeltas į naujus m÷gintuv÷lius ir dar kartą centrifuguota 2,5 min. 10 000 aps./min. greičiu. Viršutinis tirpalo sluoksnis (su stafilokokų DNR) perkeltas į naujus m÷gintuv÷lius. DNR buvo naudojama PGR produkto gamybai.

Išskirtoms koaguliazei teigiamoms stafilokokų paderm÷ms identifikuoti iki rūšies panaudota polimerazin÷ grandinin÷ reakcija (PGR). Tyrimui pasirinkti au-F3 (pirmyn 5‘ – TCGCTTGCTATGATTGTGG – 3‘) ir au-nucR (atgal 5‘ – GCCAATGTTCTACCATAGC – 3‘) oligonukleotidų pradmenys, specifiški S. aureus paderm÷ms. Šių pradmenų bazių porų skaičius genome yra 359 (bp). Su išskirta stafilokokų DNR buvo ruošiamas PGR mišinys. Jo gamybai buvo naudojamas bidistiliuotas vanduo, MgCl2 (MBI, Fermentas), 10 x PGR buferis (MBI, Fermentas),

dNTP (MBI, Fermentas), Taq DNR polimeraz÷ (MBI, Fermentas) ir oligonukleotidų pradmenys. Atlikta PGR 30 ciklų amplifikacija, laikantis tokių parametrų: denatūracija – 2 min. 95ºC temperatūroje ir 95ºC temperatūroje 30 sek., hibridinimas su specifiniais pradmenimis – 35 sek. 56ºC temperatūroje, galutinis produktų ilginimas ir amplifikavimo užbaigimas 1 min. – 72ºC temperatūroje ir 2 min. – 72ºC temperatūroje.

PGR produktų elektroforez÷ buvo atliekama TAE buferyje (40 mM Tris, 20 mM acto rūgštis 1mM EDTA), naudojant 11 µl PGR produkto, leidžiant 100 V elektros srovę 60 min. PGR amplifikacijos produktai buvo analizuojami 1,2 proc. „Top Vision LE GQ“ agaroz÷s gelyje (MBI, Fermentas) su 1,3 proc. etidžio bromidu UV lempos spinduliuose. Tyrimo metu buvo naudojamas „GeneRuler TM 1000 bp DNA Ladder“ (MBI, Fermentas) žymeklis.

Streptococcus spp. identifikavimui buvo vertinamos morfologin÷s savyb÷s ir hemoliz÷ kraujo agare. D grup÷s streptokokų (enterokokų) nustatymui kultūra buvo auginta ant Kanamicino azido agaro (Oxoid, Anglija), kuriame augantys D grup÷s streptokokai skaidydami eskuliną sudar÷ juodas kolonijas. Staphylococcus spp. diferencijacijai nuo Streptococcus spp. bei siekiant nustatyti gramteigiamų padermių katalaz÷s fermento produkavimą buvo atliktas greitasis katalaz÷s testas, su 3% vandenilio peroksidu (H2O2). Teigiama reakcija laikoma tada, kai išsiskiria oro burbuliukai.

Enterobakterijų identifikavimui kultūros buvo s÷jamo ant diferencinių diagnostinių Drigalskio ir Levino terpių (Oxoid, Anglija), siekiant įvertinti laktoz÷s skaidymą. Buvo užs÷tos vienkartin÷s Petri l÷kštel÷s ir kultivuotos +37ºC temperatūroje, 24 – 48 val. aerobin÷mis sąlygomis. Po kultivavimo buvo vertinamos išaugusių kolonijų kultūrin÷s ir biochemin÷s savyb÷s. Biochemin÷ms savyb÷ms įvertinti buvo naudotas angliavandenių skaidymo tyrimas („Margoji eil÷“). Enterobakterijos buvo s÷jamos į S.I.M. MEDIUM (Liofilchen, Italy) ir UREA AGAR BASE (Liofilchen, Italy) agarus ir pagal atitinkamų angliavandenių skaidymą identifikuotos iki rūšies.

19 Escherichia coli (E.coli) diferencijavimui nuo kitų enterobakterijų buvo s÷jama ant Levino agaro (Oxoid, Anglija). Šios terp÷s sud÷tyje esantys indikatoriai metileno m÷lynasis ir eozinas, kurie slopina gramteigiamų mikroorganizmų pasireiškimą bei laktoz÷s fermentavimas leidžia atskirti mikroorganizmus pagal terp÷s spalvos pakitimus. E.coli augdama šioje terp÷je sudaro metalinį atspalvį d÷l laktoz÷s skaidymo. Žalios spalvos Drigalskio terp÷je augdama E.coli d÷l laktoz÷s skaidymo sudaro geltonas augimo zonas.

Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. genties bakterijos buvo identifikuotos nuo Drigalskio agaro pers÷jus į „Margąją eilę“ ir pagal biocheminių reakcijų rezultatus, naudojantis enterobakterijų šeimos biocheminių savybių charakteristikomis (4 lent.) identifikuotos iki genties.

4 lentel÷. Enterobakterinių šeimos biocheminių savybių tyrimas

Tribas Gentis L ak to z÷ In d o la s H2 S Ju d ru m a s D u lc it as C it ra ta s V P R U r÷ ja Salmonella - +/- +/- +/- +/- +/- - - Citrobacter +/(+) +/- +/- + +/- + - +/- Escherichia + + - +/- +/- - - - Escherichieae Shigella -/(+) +/- - - +/- - - - Edwardsiella Edwardsiella tarda - + + + - - - - Klebsiella +/- - - + +/- + + +/- Klebsiella Enterobacter + - - - +/- +/- +/- +/- P.vulgaris - + + + - +/- - + P.mirablis - - + + - +/- +/- + Morganella - + - + - - - + Proteae Providencia - + - + - + - +/- Yersiniaeae Yersinia enterocolica - - - + - - - +/(+)

Paaiškinimas: + reakcija teigiama; - reakcija neigiama; +/- savyb÷ nepastovi

Šaltinis: http://umanitoba.ca/science/micro300400labs/pdffiles/manuals/3470man13.pdf. Prieiga per internetą 2012 02 28.

20 Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) identifikuoti naudotas selektyvinis „Pseudomonas citramide agar Base“ („Oxoid“,Anglija) agaras. P.aeruginosa bakterijos augdamos terp÷je išskiria pigmentus piocianiną ir pioverdiną ir sudaro žalią spalvą bei d÷l trimetilamino gamybos išskiria saldų kvapą.

Corynebacterium ir Bacillus genčių bakterijos buvo nustatytos įvertinus, ant kraujo agaro išaugusių kolonijų požymius ir mikroorganizmų morfologines savyb÷s. Bacillus spp. bakterijos, tepin÷liuose nudažytuose Gramo būdu, matomos ilgos gramteigiamos lazdel÷s, gaminančios endosporas. Corynebacterium spp. bakterijos tiriant mikroskopu matomos tipiškos gramteigiamos lazdel÷s.

Atliekant statistinę analizę buvo vertinama smulkiųjų atrajotojų lyties, rūšies, veisl÷s bei sezoniškumo įtaka akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikroflorai. Gautus duomenis apdorojome naudojantis R statistiniu paketu paskaičiavus tikslųjį Fišerio kriterijų. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.

21

3. TYRIMŲ REZULTATAI

3.1 AVIŲ IR OŽKŲ PRIEAUGLIO AKIŲ KONJUNKTYVOS IR NOSIES ERTMöS MIKROFLOROS TYRIMAS, ATLIKTAS B, C, D ŪKIUOSE

3.1.1 Avių prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, A ūkyje

A ūkyje, pavasario sezono metu buvo surinkta 28 m÷giniai iš Lietuvos juodgalvių avių prieauglio, iš kurių 15 (53,57 proc.) buvo patin÷liai, o patelių - 13 (46,43 proc.).

A ūkyje buvo paimta 14 m÷ginių iš akių konjunktyvos. Mikroorganizmai išskiri iš 12 m÷ginių (1 pav.). Po vieną mikroorganizmų rūšį nustatyta 3 (21,43 proc.) m÷giniuose. Nustatyta, kad m÷giniuose iš akių konjunktyvos daugiausiai dominavo gramteigiama Staphylococcus gentis, išskirta iš 5 (35,72 proc.) m÷ginių. Iš kurių Staphylococcus aureus bakterijos išskirtos iš 2 dviejų m÷ginių, o Staphylococcus epidermidis iš 1 akių konjuktyvos m÷ginio. M÷giniuose iš akių konjunktyvos taip pat išskirtos enterobakterijos: Enterobacter spp., išaugusi 2 m÷giniuose ir E.coli, išaugusi 1 akių konjunktyvos m÷ginyje. Kiti išskirti mikroorganizmai: Corynebacterium spp., Bacillus cereus, Streptococcus spp. (2 pav.).

22 2 pav. Mikroorganizmai išskirti iš kliniškai sveikų avių prieauglio akių konjunktyvos, A ūkyje

3.1.2. Avių prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, A ūkyje

A ūkyje taip pat buvo paimta 14 m÷ginių iš nosies ertm÷s. Mikroorganizmai išskirti iš 11 m÷ginių (3 pav.). Viena mikroorganizmų rūšis nustatyta 1 (7,14 proc.) nosies m÷ginyje. Iš gramteigiamų bakterijų padermių nustatyta dominuojanti Staphylococcus gentis, išskirta iš 6 nosies ertm÷s m÷ginių. Iš kurių Staphylococcus aureus bakterijos išskirtos iš 3 avių prieauglio nosies ertm÷s m÷ginių. Nustatyta, kad vyraujanti gramneigiama bakterija m÷giniuose iš nosies ertm÷s buvo Escherichia coli, kuri buvo išskirta iš 3 m÷ginių. Kiti išskirti mikroorganizmai: Streptococcus spp., Pasteurella spp., Bacillus cereus (4 pav.).

23 4 pav. Mikroorganizmai išskirti iš kliniškai sveikų avių prieauglio nosies ertm÷s, A ūkyje

3.1.3 Ožkų prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, B ūkyje

B ūkyje, vasaros sezono metu iš viso buvo surinkta 50 m÷ginių iš Čekų baltųjų ožkų prieauglio, iš kurių buvo 32 patel÷s (64 proc.), o patin÷lių – 18 (36 proc.).

B ūkyje buvo surinkti 26 m÷giniai paimti iš ožkų prieauglio akių konjunktyvos. Mikroorganizmai buvo išskirti iš 22 m÷ginių (5 pav.). Gramteigiamos bakterijos išskirtos iš 76,92 proc., gramneigiamos iš 23,08 proc. m÷ginių. Dažniausiai m÷giniuose buvo išskirta Staphylococcus spp. Ši gentis buvo nustatoma 11 m÷ginių, iš kurių Staphylococcus aureus išaugo 3 m÷giniuose. Taip pat iš gramteigiamų bakterijų išskirtų iš akių konjunktyvos dominuojanti buvo Bacillus cereus. M÷giniuose iš akų konjunktyvos nustatytos enterobakterijos, iš kurių Enterobacter spp. išskirta iš 4 m÷ginių, o E.coli iš 2 m÷ginių. Kitos išskirtos bakterijos: Corynebacterium spp., Streptococcus spp. (6 pav.).

24 5 pav. M÷giniai iš kurių išskirti mikroorganizmai

6 pav. Mikroorganizmai išskirti iš kliniškai sveikų ožkų prieauglio akių konjunktyvos, B ūkyje

3.1.4 Ožkų prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, B ūkyje

B ūkyje buvo paimti 24 m÷giniai iš ožkų prieauglio nosies ertm÷s ir mikroorganizmai buvo išskirti iš 23 m÷ginių (7 pav.). Gramteigiamos bakterijos buvo išskirtos iš 66,67 proc., gramneigiamos iš 33,33 proc. m÷ginių. Iš 12 m÷ginių dažniausiai buvo išskirta Staphylococcus spp. Iš kurių Staphylococcus aureus buvo nustatyta 3 m÷giniuose iš nosies ertm÷s. Po vieną mikroorganizmų rūšį išskirta iš 3 m÷ginių. Iš enterobakterijų nosies ertm÷s m÷giniuose nustatytos Enterobacter spp., išskirta iš 3 m÷ginių ir E.coli, išskirta iš 2 m÷ginių, o Proteus spp. bei Klebsiella

25 spp. išskirtos po vieną kartą. Kitos išskirtos bakterijos: Streptococcus spp., Pseudomonas aeruginosa (8 pav.).

7 pav. M÷giniai iš kurių išskirti mikroorganizmai

8 pav. Mikroorganizmai išskirti iš kliniškai sveikų ožkų prieauglio nosies ertm÷s, B ūkyje

3.1.5 Ožkų prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, C ūkyje

C ūkyje, rudens sezono metu iš viso buvo surinkti 28 m÷giniai iš kliniškai sveikų Zaneno veisl÷s ožkų prieauglio patelių.

C ūkyje buvo surinkta 14 m÷ginių iš ožkų prieauglio akių konjunktyvos. Mikroorganizmai buvo išskirti iš 11 (78,57 proc.) m÷ginių. Gramteigiamos bakterijos išskirtos iš 92,86 proc.,

26 gramneigiamos iš 7,14 proc. m÷ginių. Viena gramneigiama Pseudomonas aeruginosa bakterijų rūšis nustatyta 1 ( 7,14 proc.) m÷ginyje. Nustatyta, kad m÷giniuose paimtuose iš akių konjunktyvos daugiausiai dominavo gramteigiamos bakterijos. Dažniausiai buvo išskiriama Staphylococcus spp., kuri akių m÷giniuose iš viso sudar÷ 35,72 proc., iš kurių koaguliazei teigiamas S.aureus sudar÷ 14,29 proc. Iš gramteigiamų bakterijų taip pat išskirta Corynebacterium spp. (21,43 proc.). Kiti išskirti mikroorganizmai: Bacillus spp. (21,43 proc.), Bacillus cereus (14,29 proc.).

3.1.6 Ožkų prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, C ūkyje

C ūkyje taip pat buvo surinkta 14 m÷ginių iš ožkų prieauglio nosies ertm÷s ir mikroorganizmai buvo išskirti iš 13 (92,86 proc.) m÷ginių. Gramteigiamos bakterijos išskirtos iš 64,29 proc., gramneigiamos iš 35,71 proc. m÷ginių. Streptococcus spp., (7,14 proc.) bei Escherichia coli (7,14 proc.) buvo išskirtos vieną kartą iš nosies ertm÷s m÷ginių. Staphylococcus spp. (42,86 proc.) buvo dominuojanti m÷giniuose iš nosies ertm÷s. Kiti mikroorganizmai išskirti iš nosies ertm÷s m÷ginių buvo: Enterobacter spp. (28,57 proc.), Bacillus cereus (14,29 proc.).

3.1.7 Ožkų prieauglio akių konjunktyvos mikrofloros tyrimas, D ūkyje

D ūkyje, rudens sezono metu iš viso buvo surinkta 40 m÷ginių iš kliniškai sveikų Čekų baltųjų veisl÷s ožkų prieauglio, iš jų 24 (60 proc.) m÷giniai paimti iš patelių, 16 (40 proc.) – iš patin÷lių.

D ūkyje buvo paimta 20 m÷ginių iš ožkų prieauglio akių konjunktyvos. Mikroorganizmai buvo išskirti iš 18 m÷ginių (9 pav.). Gramteigiamos bakterijos buvo išskirtos iš 70 proc. m÷ginių, gramneigiamos iš 30 proc. m÷ginių. Po vieną mikroorganizmų gentį bei rūšį išaugo 2 m÷giniuose. Dažniausiai išskiriama buvo Staphylococcus spp. Iš enterobakterijų E.coli išaugo 3 m÷giniuose, o Proteus spp. išaugo 2 akių konjunktyvos m÷giniuose. Kiti išskirti mikroorganizmai: Corynebacterium spp., Bacillus spp., Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa (10 pav.).

27 9 pav. M÷giniai iš kurių išskirti mikroorganizmai

10 pav. Mikroorganizmai išskirti iš kliniškai sveikų ožkų prieauglio akių konjunktyvos, D ūkyje

3.1.8 Ožkų prieauglio nosies ertm÷s mikrofloros tyrimas, D ūkyje

D ūkyje taip pat buvo paimta 20 m÷ginių iš nosies ertm÷s ir mikroorganizmai buvo išskirti iš 19 m÷ginių (11 pav.). Gramteigiamos bakterijos buvo išskirtos iš 70 proc., gramneigiamos iš 30 proc. nosies ertm÷s m÷ginių. Dažniausiai išskiriama buvo Staphylococcus spp. mikroorganizmai. Koaguliazei teigiamas S.aureus buvo išskirtas vieną kartą iš ožkų prieauglio nosies ertm÷s m÷ginių. Iš enterobakterijų Enterobacter spp. išaugo 4 m÷giniuose, o E.coli 2 m÷giniuose. Kiti išskirti mikroorganizmai: Bacillus spp., Streptococcus spp. (12 pav.).

28 11 pav. M÷giniai iš kurių išskirti mikroorganizmai

12 pav. Mikroorganizmai išskirti iš kliniškai sveikų ožkų prieauglio nosies ertm÷s, D ūkyje

3.2 Akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros palyginamoji analiz÷ skirtinguose ūkiuose

Daugiausiai bakterijų išaugo D ūkyje 92,5 proc., mažiausias bakterijų augimas nustatytas A ūkyje 82,14 proc. Didžiausias dominuojančių gramteigiamų Staphylococcus genties (56 proc.) bakterijų pasireiškimas nustatytas B ūkyje, m÷giniuose iš ožkų prieauglio nosies ertm÷s. Mažiausiai Staphylococcus genties (21,43 proc.) bakterijų buvo išskirta iš avių prieauglio akių konjunktyvos m÷ginių. A ūkyje, pavasario sezono metu iš avių prieauglio nosies ertm÷s daugiausiai buvo išskirta Escherichia coli (21,43 proc.) bakterijų, tačiau šios rūšies bakterijos m÷giniuose iš akių

29 konjunktyvos sudar÷ mažiausią gramneigiamų bakterijų procentinę dalį (7,14 proc.). Avių prieauglio tyrimo metu, be bakterijų pasikartojančių kiekviename ūkyje papildomai buvo išskirtos šios bakterijos: Staphylococcus epidermidis, Pasteurella spp. B ūkyje vasaros sezono metu atliktu tyrimu nustatyta, kad Enterobacter spp. buvo dažniausiai išskiriama gramneigiama tos pačios genties bakterija iš akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s m÷ginių. Taip pat šiame ūkyje buvo nustatytas didžiausias gramneigiamų bakterijų pasireiškimas. D ūkyje buvo išskirta Proteus spp., kuri nebuvo nustatyta kituose ūkiuose pa÷mus m÷ginius iš akių konjunktyvos. B ūkyje buvo išskirta Klebsiella spp., kuri nebuvo nustatyta kituose ūkiuose pa÷mus m÷ginius iš nosies ertm÷s. D ūkyje, iš gramneigiamų mikroorganizmų nosies m÷giniuose daugiausiai išaugo Enterobacter spp. paderm÷s bakterijų, o iš akių konjunktyvos daugiausiai išaugo Escherichia coli bakterijų. C ūkyje mikrofloros sud÷tis gramneigiamų bakterijų atžvilgiu išsiskyr÷ tuo, kad akyje vieną kartą buvo išskirta Pseudomonas aeruginosa, kuri nebuvo išskirta iš ožkų prieauglio nosies ertm÷s m÷ginų, o pastaruosiuose dominavo Enterobacter spp., kuri neaptikta m÷giniuose iš akių konjunktyvos. Visuose ūkiuose iš m÷ginių paimtų iš akių konjunktyvos buvo išskirta Bacillus spp.

3.3 Akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikrofloros priklausomyb÷ nuo įvairių faktorių

Analizuojant tyrimo duomenis nustatyta, kad iš avių prieauglio patinų mikroorganizmai išskirti iš 35,72 proc. m÷ginių,o iš patelių - 48,86 proc. m÷ginių (p>0,05); mikroorganizmai iš ožkų prieauglio patinų išskirti iš 30,77 proc. m÷ginių, o iš patelių – 60,85 proc. m÷ginių (p>0,05). Atsižvelgiant į gautus rezultatus atlikus statistinę analizę, galima teigti, kad lyties bei gyvūnų rūšies įtaka akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikroflorai nebuvo reikšminga (p>0,05). Siekiant įvertinti gyvūnų veisl÷s įtaką akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s mikroflorai, buvo vertinamos Zaneno ir Čekų baltųjų ožkų veisl÷s. Rezultatai parod÷, kad veisl÷s įtaka m÷ginių mikroflorai taip pat nebuvo reikšminga (p>0,05). Atsižvelgiant į pavasario, vasaros bei rudens sezonų vaidmenį mikroorganizmų išskyrimui, buvo gauti statistiškai nepatikimi rezultatai (p>0,05), reiškiantys, kad m÷ginių mikroflorai sezoniškumas įtakos netur÷jo.

Taigi, bakterijų pasireiškimui reikšmingų skirtumų nebuvo nustatyta, atsižvelgiant į sezoniškumą, gyvūnų rūšį, veislę bei lytį. Kadangi m÷giniai buvo paimti iš panašaus amžiaus, 2-5 m÷n. gyvūnų prieauglio, tai palyginamoji analiz÷ tarp amžiaus grupių nebuvo atlikta.

Analizuojant mikroorganizmus išskirtus iš smulkiųjų atrajotojų akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s, galima teigti, kad tikimyb÷ mikroorganizmus aptikti m÷giniuose iš nosies ertm÷s didesn÷ (47,46 proc.) (p<0,05 proc.) nei iš akių konjunktyvos. Tai paaiškina nosies aplinkos užterštumo įvairiomis organin÷mis dalel÷mis (išmatų, šlapimo, pakratų ir kt.) prielaidą.

30 3.4 Staphylococcus aureus identifikavimas PGR metodu

PGR metodas buvo naudojamas siekiant identifikuoti smulkiųjų atrajotojų akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s m÷giniuose vyraujančias koaguliazei teigiamas Staphylococcus aureus padermes remiantis būdingu bazių porų skaičiumi.

Tyrimas buvo atliktas PGR metodu, panaudojant au-F3 ir au-nucR oligonukleotidų pradmenis, specifiškus S. aureus paderm÷ms. Viso buvo atrinkti 8 m÷giniai, iš kurių 3 koaguliazei teigiami m÷giniai paimti iš smulkiųjų atrajotojų akių konjunktyvos ir 5 koaguliazei teigiami m÷giniai paimti iš nosies ertm÷s su galima S.aureus paderme. Pagal gautas bazių poras, remiantis Sasaki (2010) duomenimis, PGR metodu buvo identifikuotos 4 (50 proc.) koaguliazei teigiamos S. aureus paderm÷s, turinčios 359 bazių poras (bp) (11 pav.).

Taigi PGR metodu patvirtintos S. aureus paderm÷s aptiktos A, B ir D ūkiuose paimtuose m÷giniuose. 1 (33,33 proc.) padermių sudar÷ m÷giniai paimti iš avių prieauglio akių konjunktyvos, 3 (60 proc.) S. aureus padermių sudar÷ m÷giniai paimti iš ožkų prieauglio nosies ertm÷s. Kitos ankščiau rezultatuose min÷tos Staphylococcus spp. paderm÷s buvo identifikuotas remiantis biochemin÷mis savyb÷mis ir komerciniu „Staphytest Plius“ (Oxoid, Anglija) testu.

11 pav. DNR elektroforez÷ 1 proc. agaroz÷s gelyje, naudojant PGR, S. aureus identifikavimui. 1 ir 10 – „GeneRuler TM“ 1000 bp DNR žymeklis (MBI, Fermentas). Neigiama kontrol÷: 2 – E. coli (ATCC 8739). 3 ir 4 – neigiami m÷giniai. 5;6;7 ir 8 – Staphylococcus aureus; Teigiama kontrol÷: 9 – Staphylococcus aureus (ATCC 9144)

31

4. REZULTATŲ APTARIMAS

2001 metais Pietų Afrikoje, Botsvanoje atlikti tyrimai su ožkomis parod÷, kad dažniausiai iš akių konjunktyvos buvo išskiriamos Moraxella sp. (26,3 proc.) bei Staphylococcus sp. (22,8 proc.) bakterijos. Šie tyrimo rezultatai sutapo su kitų autorių duomenimis, tiriant avių akių konjunktyvos m÷ginius. Pagal Van Halderen ir Henton (1994), pateiktus duomenis, Moraxella sp. buvo išskirta tiek iš sveikų, tiek iš sergančių ožkų konjunktyvos, tačiau pastangos užkr÷sti ÷riukus Moraxella ovis bakterijų kultūromis, gautomis iš klinikinių m÷ginių nebuvo s÷kmingos. Atlikti tyrimai parod÷, kad ši bakterijų rūšis tiriamuoju laikotarpiu nebuvo išskiriama iš akių konjunktyvos m÷ginių, tačiau viena dažniausiai išskiriamų bakterijų padermių buvo Staphylococcus sp. Cooper et. al. (2001) duomenimis ši bakterijų paderm÷ dažniausiai yra išskiriama iš sveikų avių, ožkų bei triušių akių konjunktyvos.

Sooreh (2010) duomenimis, atlikus tyrimą su m÷giniais iš avių konjunktyvos, buvo nustatytas maksimalus bakterijų išaugimas visuose m÷giniuose. Gramteigiamos aerobin÷s bakterijos buvo dažniausiai išauginamos iš kliniškai sveikų avių akių konjunktyvos (72,43 proc.) su dominuojančia Bacillus cereus paderme. Atlikto tyrimo metu su m÷giniais paimtais iš kliniškai sveikų avių konjunktyvos, bakterijos buvo išskirtos ne iš visų m÷ginių. Spradbrow (1968) išskyr÷ tik nedaugelį bakterijų rūšių iš avių konjunktyvos maišelio, tačiau Egwu ir kiti autoriai (1989) m÷ginių ÷mimo metu ištyr÷ įvairią mikroflorą. Didžiausią mikrofloros įvairovę sudar÷ m÷giniai paimti iš avių su keratokonjuktyvito požymiais (72 proc.), o m÷giniai paimti iš kliniškai sveikų akių konjunktyvos sudar÷ (28 proc.). Tyrimas atliktas su m÷giniais paimtais iš kliniškai sveikų ožkų konjunktyvos parod÷, kad bakterijos taip pat buvo išskirtos ne iš visų m÷ginių (60 proc.).

Empike (2009) duomenimis, dažniausiai pasitaikanti bakterijų rūšis m÷giniuose iš ožkų nosies ertm÷s buvo Streptococcus pyogenes (11,9 proc.) tuo tarpu Staphylococcus aureus (11,0 proc.) buvo antroji iš dominuojančių išskirtų bakterijų. Šie tyrimo duomenys atvirkščiai koreliuoja su mūsų tyrimo duomenimis gautais B ūkyje, kadangi Staphylococcus spp. (37,5 proc.) sudar÷ dominuojančia visų išskirtų bakterijų dalį, o Streptococcus spp. (16,66 proc.) buvo antroji dominuojanti mikroorganizmų paderm÷. S. aureus išskyrimas iš nosies ertm÷s sutapo su duomenimis, gautais išskyrus bakterijas iš ožkos (Ugochukwu, 1985) ir avies (Barbour et al., 1997) plaučių. Bacillus spp. išskyrimas iš sveikų gyvulių prieštarauja kitų autorių nuomonei, kurie nurod÷ bakterijas išskirtas iš ožkų sergančių plaučių ir gerkl÷s ligomis (Richards et al., 1986), bet manoma tai netur÷tų būti pas sveikus gyvulius. Savi tyrimai įrod÷, kad daugiausiai Bacillus spp. bakterijų buvo išskirta iš akių konjunktyvos.

Omer (2012) nustat÷, kad gramteigiamos bakterijos buvo dominuojančios sveikų bei sergančių avių nosiarykl÷s m÷giniuose. Atlikus mikrobiologinius tyrimus nustat÷me, kad

32 m÷giniuose daugiausiai dominuojančios buvo taip pat gramteigiamos bakterijos. Kitų autorių duomenimis m÷giniuose iš avių nosies ertm÷s labiausiai paplitusi buvo gramneigiama Pasteurella haemolytica bakterijų paderm÷. Šie duomenys sutapo su gautais duomenimis A ūkyje, tačiau Pasteurella spp. bakterijos yra dažniausiai susijusios su kv÷pavimo takų ligomis (Carijean et al., 1994).

Palyginus iš abiejų gyvūnų rūšių nosies ertm÷s ir akių konjunktyvos išskirtus mikroorganizmus, vyraujanti mikroflora buvo gramteigiamos bakterijų paderm÷s, o rečiau išskirtos gramneigiamos. Tai atitinka daugelio kitų autorių tyrimo rezultatus (Cooper ir kt., 2001; Sooreh, 2010; Empike, 2009 ir kt.).

33

IŠVADOS

1. Ištyrus avių prieauglio akių konjunktyvos mikroflorą nustatyta, kad vyravo šios mikroorganizmų gentys ir rūšys: Corynebacterium spp. (21,43 proc.), Staphylococcus spp. (14,29 proc.), Staphylococcus aureus (14,29 proc.), Bacillus cereus (14,29 proc.), Enterobacter spp. (14,29 proc.).

2. Ištirtoje ožkų prieauglio akių konjunktyvoje vyravo šie mikroorganizmai: Staphylococcus spp. (28,33 proc.), Corynebacterium spp. (15 proc.), Staphylococcus aureus (11,67 proc.), Bacillus spp. (10 proc.), Escherichia coli (8,33 proc.).

3. Ištyrus avių prieauglio nosies ertm÷s mikroflorą nustatyta, kad vyravo šios bakterijų gentys ir rūšys: Staphylococcus spp. (21,43 proc.), Staphylococcus aureus (21,43 proc.), Escherichia coli (21,43 proc.), Streptococcus spp. (14,29 proc.), Pasteurella spp. (14,29 proc.).

4. Ištirtoje ožkų prieauglio nosies ertm÷je vyravo šie mikroorganizmai: Staphylococcus spp. (39,65 proc.), Enterobacter spp. (18,96 proc.), Streptococcus spp. (12,07 proc.), Escherichia coli (8,62 proc.).

5. Polimerazin÷s grandinin÷s reakcijos metodu iš smulkiųjų atrajotojų akių konjunktyvos ir nosies ertm÷s m÷ginių buvo identifikuotos Staphylococcus aureus paderm÷s, turinčios 359 bazių poras (bp).

6. Nustatyta, kad bakterijų augimui netur÷jo įtakos smulkiųjų atrajotojų lytis, rūšis, veisl÷ bei sezoniškumas (p>0,05). Tačiau nustatyta tikimyb÷, kad mikroorganizmus aptikti m÷giniuose iš nosies ertm÷s didesn÷ (47,46 proc.) (p<0,05 proc.) nei iš akių konjunktyvos.

34

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. AKPAVIES S.O., EMIKPE B.O. Observation on an Actinomyces pyogenes infection in a goat. Revue Elev. Med. vet. Pays trop. 2000. 53: 331-332.

2. Ajuwape, A.T.P., Oyebanji, M.O., Adetosoye, A.I.,. Bacteriological examination of normal upper respiratory tract of puppies with particular reference to staphylococci. Vet. Arhiv. 2006. 76,

179-184.

3. Barbour E.K., Nabbut N.H., Hamadehe S.K., Al-Nakhli H.M.,. Bacterial identity and characteristics in healthy and disease respiratory tracts of sheep and calves. Am. Vet. Res. 1997. 21: 401 – 430.

4. Brogden K.A., Lehmkuhi H.D., Cutlip R.C. Pasteurella haemolytica complicated respiratory infections in sheep and goats. Vet. Res. 2000. 29: 233 – 254.

5. Cooper S.C., G.J. McLellan and A.N. Rycroft. Conjunctival flora observed of 70 healthy domestic rabbits (Oryctolagus cuniculus). Vet.Rec. 2001. 149: 232-235.

6. Dagnall G.J.R. Epidemiol. Infect., Copyright © , Cambridge University Press. 1994. P. 561 – 567.

7. Davendra C., Williamson G. and W.J.A. Payne. Goats. In: An Introduction to Animal Husbandry in the Tropics. 3rd edn. Longman, London. 1985. P. 260.

8. Diallo A. Control of peste des petits ruminants and poverty alleviation J. Vet. Med. 2006. 53: 11-13.

9. Egwu O., Faull WB., Bradbury JM., Clarkson MJ. Ovine infectious keratoconjunctivitis: a microbiological study of clinically unaffected and affected sheep‘s eyes with special reference to Mycoplasma conjunctivae. Vet Rec. 1989. 125: 253-6.

10. Empike B.O., Oyero O.G., Akpavie S.O. Revue Elev. Med. vet. Pays trop., 2009. 62 (1) : 17 - 21

11. Hashemi, T.G.R.,M. Rad and M. Chavoshi, A survey on dermatophilosis in sheep in the north of Iran. Iran J.Vet. Res. 2004. 5(2): 97-101.

12. Hernandez-Castro, R., Martınez-Chavarria, L., Dıaz-Avelar, A., Romero-Osorio, A., Godınez-Reyes, C., Zavala-Gonzalez A., Verdugo-Rodrıguez, A. Aerobic bacterial flora of the nasal cavity in Gulf of California sea lion (Zalophus californianus) pups. Vet. J. 2005. 170, 359–363.

13. Jafari S., Badiee K.H., Behzadi M.A. and Tamadon A. First report of dermatophilus congolensis dermatitis in dairy cows in Shiraz, Southern Iran J.Vet Res. 2008. 9(3): 281 – 283.

14. Jaitner J., Sowe J., Secka-Njie E., Dempfle L. Ownership pattern and management practices of small ruminants in the Gambia – Implications for a breeding programme. Small Ruminant Res. 2001. 40: 101-108.

35 15. Megra, T., Sisay, T., Asseged, B., The Aerobic Bacterial flora of the Respiratory passageways of healthy goats in Dire Dawa Abattoir, Eastern Ethiopia.Revue Med. Vet. 2006. 157,

84-87.

16. Mushi E.Z., Binta M.G., Chabo R.G. and Dintwe K. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2007. 6 (12): 1388 – 1389.

17. Omer A., Berhanu A., Chanie M., Fentahun T. Isolation and identification of aerobic bacterial flora in nasopharyngeal passageways of apparently healthy and clinically sick sheep at Gondar university veterinary clinic. American – Eurasian journal of scientific reasearch. 2012. 7(6): 232 – 237.

18. Peacock C. Goats – a pathway out of poverty. Small Ruminant Res. 2005. 60: 179-186.

19.Quinn P.J., Markey B.K., Leonard F.C., Hartigan P., Fanning S., FitzPatrick E.S., Veterinary Microbiology and Microbial Disease. 2011.

20. Richards Y.J., Menour N.J., Coiguen F.J., Avier C.J., Borges E., Fontain M.J., Audra J., Brunet J., Pailhae C. Bacteriological study on sheep lungs from the abattoir. Revue Med. Vet.1986. 37: 671 – 680.

21. Rowe H.A., Poxton I. R., Donachiew. Survival of Mannheimia haemolytica in tracheobronchial washings of sheep and cattle. Vet.Microbiol. 2001. 81: 305-314.

22. Sasaki T., Tsubakishita S., Tanaka Y., Sakusabe A., Ohtsuka M., Hirotaki S., Kawakami T., Fukata T., Hiramatsu K. Multiplex-PCR Method for Species Identification of Coagulase-Positive Staphylococci. Journal of clinical microbiology. 2010. 48(3): 765–769.

23. Smith M.C. and M.D. Sherman, Williams and Wilkins. Goats medicine. USA. 1994. P. 182 – 184.

24. Spradbrow PB. The bacterial flora of the ovine conjunctival sac. Aust Vet J. 1968. 44: 117-18. 25.Tortora M.C., B.R. Funkie and C.L.Case. Introduction to microbiology. The Benjamin/Cumming publishing Company. New York 1992. P. 392.

26. Ugochukwu E. Isolation and identification of aerobic pathogenic bacteria from pneumonic lungs of goats suffering from pneumonia – enteritis complex. Bull. Anim. Health Prod. Afr., 1985. 33: 303 – 308.

27.Van Halderen A., Henton M.M., Coetzer J.A.W., Thomson G.R. and Tustin R.C. Moraxella sp. infections. In: infections diseases of livestock. Oxford university. 1994.

28. Woodland RM., Wilsmore AJ., Dagnall GJR.,. Sheep conjunctivitis caused by Chlamydia psittaci ir Moraxella ovis. Proc. Eur. Soc. Chlamydia, Res. 1988. 1: 134.

29. Abdullah Araghi-Sooreh and Khosrow Hatami-Lorzini (2012). Aerobic Bacterial Flora of Conjunctival Sac in the Healthy Iranian Water Buffalo (Bubalus bubalis). http://www.maxwellsci.com/print/crjbs/v4-608-612.pdf. Prieiga per internetą 2012 03 07.