1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Tomas Laurusevičius
Indikatorinių mikroorganizmų išskyrimas iš šunų tiesiosios
ţarnos ir atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas
Isolation of intestinal mircoflora of dogs rectum and
antimicrobial resistance determination
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
Magistrinis darbas
Darbo vadovas: prof. dr. Jūratė Šiugţdaitė
2 DARBAS ATLIKTAS UŢKREČIAMŲJŲ LIGŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Indikatorinių mikroorganizmų išskyrimas iš šunų tiesiosios ţarnos ir atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3 1.SANTRAUKA ... 4 2.ĮVADAS ... 6 3.DARBO TIKSLAS ... 8 4.DARBO UŢDAVINIAI ... 8 5.LITERATŪROS APŢVALGA ... 9
6.TYRIMO METODAI IR MEDŢIAGA ... 14
7.REZULTATAI ... 18
7.1 Kambaryje laikomi šunys. ... 21
7.1.1 Amţiaus grupės.. ... 23
7.1.2 Lyties grupės.. ... 23
7.2 Lauke laikomi šunys.. ... 24
7.2.1 Amţiaus grupės. ... 26
7.2.2 Lyties grupės.. ... 26
7.3 Prieglaudoje laikomi šunys.. ... 27
7.3.1 Amţiaus grupės.. ... 29
7.3.2 Lyties grupės.. ... 30
7.4Hospitalizuotų šunų grupė. ... 31
7.4.1 Amţiaus grupės. ... 33
7.4.2 Lyties grupės. ... 33
7.5 Daugybinis atsparumas. ... 35
7.5.1 Lauko sąlygomis laikomų gyvūnų grupė ... 35
7.5.2 Kambaryje laikomų gyvūnų grupė ... 35
7.5.3 Prieglaudos gyvūnų grupė ... 35
7.5.4 Klinikoje laikomų šunų grupė ... 36
7.6 Molekuliniai tyrimai. ... 36 8.REZULTATŲ APTARIMAS ... 38 9.IŠVADOS ... 43 10. LITERATŪROS SĄRAŠAS... ...44 11.PRIEDAI... ...52
TURINYS
4
1. SANTRAUKA
Indikatorinių mikroorganizmų išskyrimas iš šunų tiesiosios ţarnos ir atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymas
Tomas Laurusevičius
SMD publikuotų straipsnių apţvalga
Antimikrobinis atsparumas yra aktuali šių laikų problema veterinarijoje ir medicinoje. Platus antimikrobinių medţiagų naudojimas gyvūnų-augintinių infekcinėms ligoms gydyti sudaro sąlygas aplinkoje plisti atsparumo genams.Atsparumo genai perduodami kryţminiu būdu tarp ţmogaus ir gyvūno, todėl antibiotikai gali pasidaryti neveiksmingi gydant tiek ţmonių, tiek augintinių infekcines ligas. Yra ţinoma, jog uţkrečiamoms ligoms gydyti medicinoje ir veterinarijoje daţnai naudojami tokie patys antibiotikai, todėl atsparumas šioms medţiagoms gali būti perduotas tarp šeimininko ir augintinio. Taip pat yra manoma, jog neracionalus bei netikslus antimikrobinių medţiagų naudojimas turi įtakos rezistentiškumo vystymuisi visuomenėje. Siekiant išsiaiškinti rezistentiškumo genų paplitimą skirtingose aplinkose, tyrime buvo ištirtikliniškai sveiki šunys, kurie buvo laikomi skirtingomis sąlygomis — namuose, lauke, gyvūnų prieglaudoje ir veterinarijos klinikos stacionare. Mikroorganizmų atsparumui nustatyti buvo išskirtos indikatorinės ţarnyno mikrobiotos bakterijos —
Escherichia coli ir enterokokai (Enterococcus faecium ir Enterococcus faecalis). Mėginiai imti
iš tiesiosios ţarnos, kultyvuojami mikrobiologijos laboratorijoje, išskirtos trys minėtos rūšys, įvertintas atsparumas skirtingiems antibiotikams. Remiantis rezultatų analize, didţiausias antimikrobinis atsparumas nustatytas prieglaudoje(p≤0,05) laikomų šunų grupėje, maţiausias — namuose laikomų šunų grupėje (p≤0,01). Rezistentiškumo genams aptikti atlikta polimerazės grandininė reakcija (PGR). Prieglaudoje laikomų šunų grupėje buvo ištirtos antibiotikams atsparios E.coli padermės. Atlikus PGR analizę, rasti šieEscherichia
colirezistentiškumo genai: tetA bei tetB genai (atitinkamai 13,33 proc. ir 6,66 proc.),
koduojantys atsparumą tetraciklinų klasių antimikrobinėms medţiagoms, trimetoprimui/sulfametoksazolui atsparumą koduojantis genas (dfrA1) (6,66 proc.) bei catA1 rezistentiškumo genas, kuris koduoja atsparumą chloramfenikoliui (6,66 proc.).Atsparumo genas (catA1) rastas tame pačiame mėginyje, kuriame aptitkas ir tetB genas.
Isolation of intestinal microflora of dogs rectum and antimicrobial resistance determination
Raktaţodţiai: indikatoriniai mikroorganizmai, Escherichia coli, enterokokai, atsparumas, genai.
5 Tomas Laurusevičius
Students Scientific Association reports review
Antibiotic resistance is a growing problem among humans and animals. The large majority of antibiotics currently used for treating infections and the antibiotic resistance genes acquired by human pathogens each have an environmental origin. Irracional use of antibiotics is a major concern in public health. It is known that resistance genes can spread in different enviroment and cause antimicrobial resistance in both, animals and humans, respectively. The number of companion animals has increased steadily, and this increased contact between humans and animals may promote the trasmission of antimicrobial-resistant bacteria from pets to human owners.
Intestinal commensal bacteria, such as Escherichia coli and enterococci, are part of the normal enteric microflora.These bacteria act as indicators of antimicrobial selection pressure, and they may harbour a reservoir of antimicrobial resistance genes for pathogenic or zoonotic bacteria.In this study samples were collected from healthy dogs rectum. There were four groups: dogs which were living indoors, outdoors, in the animal shelter and which were hospitalized in veterinary clinicnot more than for four hours. Feces samples were collected and sent to laboratory for further research. Three species were isolated — E.coli, E.faecium, E.faecalis and antimicrobial resistance was tested afterwards.
Study results showed that the frequency of resistance tended to be significantly higher in isolates from shelter dogs than isolates from outdoors, indoors and hospitalized population of dogs against most antimicrobials tested (p≤0.05 and p≤ 0.01).PCR amplification was used to detect genes conferring resistance to beta-lactams, tetracycline, aminoglycoside,trimethoprim/sulfamethoxazole, quinolone, sulphonamide and chloramphenicol. PCR results showed, that resistant E.coli strains in shelter dogs isolates had resistant genes: tetA and tetB genes was found in tetracycline resistant E.coli strains (13.33% and 6.66% respectively). (dfrA1) gene, which is responsible for coding resistance to trimethoprim/sulfamethoxazole was found in trimethoprim/sulfamethoxazole resistant E.coli strains (6.66%).catA1 gene was detected in the same E.coli strains, in which tetBgene was detected as well (6.66%).
SUMARRY
6
2. ĮVADAS
Antimikrobinis atsparumas — tai natūralus biologinis fenomenas, kuomet mikroorganizmai prisitaiko prie juos ţudančio vaistų poveikio ir įvairiais būdais geba sumaţinti arba visiškai panaikinti vaistų efektyvumą gydant infekcines ligas (2). Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medţiagoms ţmonių ir gyvūnų populiacijose yra tarpusavyje susijęs veiksnys, o tai kelią didelį susirūpinimą visuomenėje bei veterinarijoje ir medicinoje (3,4). Pastaruoju metu visame pasaulyje gyvūnų-augintinių skaičius ţenkliai auga, todėl manoma, jog augintinių ir ţmonių tarpusavio kontaktas gali lemti antimikrobinio atsparumo daugėjimą visuomenėje(4). Gausus antibiotikų naudojimas medicinoje ir veterinarijoje daro įtaką bakterijų rezistentiškumo genų paplitimui aplinkoje (5). Kadangi bakterijos sugeba prisitaikyti prie besikeičiančių aplinkos sąlygų, antimikrobinis atsparumas gali vystytis įvairiose ekologinėse nišose (6).
Šiame darbe tirtos normalią šunų ţarnyno mikroflorą sudarančios bakterijos —
Escherichia coliir enterokokai (Enterococcus faecium ir Enterococcus faecalis). Šie
komensalai mikrobiologijoje naudojami kaip indikatoriniai mikroorganizmai nustatinėjant rezistentiškumo genus bei antimikrobinį atsparumą (7,8).
Escherichia coli yra Enterobacteriaceae šeimai priklausanti gramneigiama lazdelė. Šis
fakultatyvinis anaerobas daţniausiai aptinkamas ţmonių ir gyvūnų ţarnyne. Nepaisant to, jog
E.coli yra natūralią ţarnyno mikroflorą sudarantis komensalas,šis mikroorganizmas gali būti ir
patogeniškas. Tyrimais įrodyta, jog vykstant mutacijoms bakterijose, chromosomos įgyja patogeniškumo genus, todėlţarnyno infekcijas sukelti gali ir virulentiškosE.colipadermės (9). Mūsų atliktametyrime ištirti kliniškai sveiki šunys, kurie neturėjo virškinamojo trakto susirgimų, todėl Escherichia coli buvo išskirta kaip indikatorinė ţarnyno bakterija ir panaudota nustatant antimikrobinį atsparumą bei ieškant rezistentiškumo genų atspariose padermėse.
Enterococcus gentį sudaro daugiau negu 20 rūšių, tačiau tik keletas šių bakterijų
padermių yra patogeninės (10). Enterokokai — tai gramteigiami ţmonių ir gyvūnų patogenai/oportunistai, kurie yra svarbūs sveikatos apsaugai visame pasaulyje. Nepaisant to, jog D grupės streptokokai,kaip ir Escherichia coli, sudaro ţmonių ir gyvūnų ţarnyno normaliąmikroflorą, aplinka daţnai būna uţteršta ţmonių ir gyvūnų išmatomis, kurios yra šių
7 bakterijų rezervuaras aplinkoje. Enterokokai yra hospitaliniai ir visuomenėje įgyti patogenai, sukeliantys didelį atsparumą antimikrobinėms medţiagoms, todėl yra naudojami kaip indikatoriniai mikroorganizmai antimikrobinių medţiagų atsparumui nustatyti (11).
Antimikrobinio atsparumo pasireiškimas gyvūnų-augintinių populiacijoje gali turėti įtakos ir ţmonėms.Tarpusavio kontaktas yra vienas iš rezistentiškumo geno perdavimo veiksnių (12), o gausus antibiotikų naudojimas veterinarijoje bei medicinoje taip pat kelia didelį susirūpinimą visuomenės sveikata. Yra ţinoma,jog kai kurios antibiotikų klasės (pvz.: cefalosporinai ir fluorokvinolonai) plačiai naudojamos gyvūnų gydymo tikslais yra ypač svarbios medicinoje, todėl neracionalus antibiotikų naudojimas veterinarinėse gydyklose bei ligoninėse taip pat turi įtakos antimikrobinio atsparumo vystymuisi (13). 2004 metais atlikti tyrimai parodė, jog šunys ir katės yra potencialūs antimikrobinio atsparumo perdavimo šaltiniai. Tai lėmė platus antibiotikų naudojimas šių gyvūnų gydyme ir glaudus kontaktas su ţmogumi (14).
Yra ţinoma, jog bakterijos tarpusavyje gali keistis atsparumo genais (15). Šie genai gali būti perduodami horizontalios ar vertikalios pernašos mechanizmais, taip pakeisdami bakterijos genomą. Įsiterpus atsparumą koduojantiems genams, bakterija tampa atspari vienai ar net keliomsskirtingoms antimikrobinėms medţiagoms (16). Rezistentiškumo genai gali būti aptinkami atliekant molekulinius-genetinius tyrimus. PGR (polimerazės grandininė reakcija) yra vienas iš būdų aptikti genus bakterijų genome (17).
Daugybinis antimikrobinis atsparumas šunų ir kačių populiacijoje buvo uţregistruotas Europos ir Azijos šalyse (18,19), JAV (20), Brazilijoje (21) ir net Australijoje (22), tačiauLietuvoje tyrimų su sveikų šunų indikatorinės ţarnyno mikrofloros atsparumo antimikrobinėms medţiagoms nustatymudar nėra atlikta.
Mūsų darbo tikslas buvo ištirti kliniškai sveikų šunų, laikomų skirtingomis sąlygomis, tiesiosios ţarnos indikatorinę mikroflorą ir atsparumą antimikrobinėms medţiagoms. Taip pat nustatyti daugybinį antimikrobinį atsparumą skirtingose grupėse bei genetiškai ištirti prieglaudos grupėje laikomų šunų Escherichia coli atsparių antimikrobinėms medţiagoms padermių rezistentiškumo genus.
8
3. DARBO TIKSLAS
Ištirti kliniškai sveikų šunų, laikomų skirtingose aplinkose, tiesiosios ţarnos indikatorinę mikroflorą ir atsparumą antimikrobinėms medţiagoms.
4. DARBO UŢDAVINIAI
Surinkti mėginius iš skirtingomis sąlygomis laikomų kliniškai sveikų šunųtiesiosios ţarnos;
Išskirti ţarnyno indikatorines bakterijas iš šunų tiesiosios ţarnos;
Nustatyti antimikrobinį atsparumą išskirtoms E.coli ir enterokokų padermėms; Nustatyti daugybinio antimikrobinio atsparumo pasireiškimą skirtingose šunų
grupėse;
Nustatyti atsparumą koduojančius genus E.coli padermėse išskirtose iš prieglaudoje laikomų šunų.
9
5. LITERATŪROS APŢVALGA
Atsparumas antibiotikams yra natūralus reiškinys, kurį sukelia bakterijų genų mutacijos(23). Gausus ir netinkamas antibiotikų vartojimas paspartina antibiotikams atsparių bakterijų atsiradimą ir plitimą. Pasaulio Sveikatos Organizacijos (PSO, angl. WHO) duomenimis antimikrobinis atsparumas yra paplitęs visame pasaulyje ir atsirandant naujiems atsparumo mechanizmams šis reiškinys kelia didelį susirūpinimą visuomenės sveikata. Bakterijos tampa atsparios naujos kartos antibiotikams: 2014 metais atlikta pasaulinė apklausa parodė, jog pasaulyje yra paplitęs atsparumas fluorokvinolonų klasės antibiotikams, kurie daţniausiai naudojami gydant ţmonių šlapimo takų infekcijas, sukeltas patogeninių
Escherichia coli padermių (24).
Pastaraisiais metais vis labiau atsiţvelgiama į šią problemą. Antimikrobinis atsparumas didėja ne tik dėl plataus antibiotikų panaudojimo, bet ir dėl netinkamo jų pasirinkimo gydant ţmonių bei gyvūnų infekcines ligas. Šių medţiagų daţnas naudojimas turi didelę reikšmę organizmui, nes antibiotikai veikia ne tik patogenines bakterijas, bet ir komensalinius ţmonių ir gyvūnų virškinimo trakto mikroorganizmus, todėl vyksta atsparumo genų transmisija ar bakterijų mutacijos (25,26).
Atsparumas antibiotikams atsiranda dėl DNR mutacijų, kurios pakeičia bakterijos genomą. Mikroorganizmai įgyja genus ar jų kombinacijas, kurių koduojamų baltymų veikimas lemia atsparumą konkrečiam antibiotikui ar tam tikram jų spektrui (16). Kai kurie tokie genai, būdami pernešamuose genomo elementuose (pvz.: plazmidėse ar transpozonuose), gali būti perduodami iš vienų bakterijų, kitoms (16). Atsparumas atsiranda ir dėl įvykusių mutacijų bakterijos gene, koduojančiame antibiotiko taikinį: tokiu atvejų taikinys tampa nejautrus šios medţiagos poveikiui (16).
Bakterijose genų pernaša vyksta trimis būdais: konjugacijos, transformacijos ir transdukcijos(27,28,29). Konjugacijos metu, rezistentiškumo genai yra perduodami iš vienos bakterijos kitai, veikiant plazmidėms. Transdukcijos mechanizme veikia bakteriofagai, virusai ar kitos bakterijos, kurios integruoja rezistentiškumo geną į bakterijos „ taikinio― genetinę medţiagą (30). Yra įrodyta, jog bakterijos gali keistis genetine informacija per plazmidėse veikiančius transmisijos mechanizmus (31). Transformacijos metu, rezistentiškumo genai, išreikšti negyvos bakterijos ekstrachromosominėse plazmidėse yra pasisavinami kitų
10 bakterijų.Transformacija — tai mechanizmas, kurio metu kai kurios bakterijų rūšys gali pasisavinti egzogeninę DNR ir ją įterpti į savitą genomą (31).
Šie genetinės informacijos perdavimo būdai yra suskirstyti į dvi pernašos sistemas. Horizontalioje pernašoje dalyvauja gramneigiamų bakterijų elementai — integronai. Tai bakterijų genetinės struktūros, kurios koduoja 9 genus, uţtikrinančius sričiai savitąją DNR rekombinaciją(32). Rekombinacijos metu vyksta genų įterpimas, kas ir lemią atsparumą įvairiems antibiotikams(33). Šių genetinių struktūrų judrumą, o taip pat ir rezistentiškumo plitimą, uţtikrina kitos bakterijų struktūros – plazmidės ir transpozonai (34).
Tuo tarpu vertikali genų pernaša vyksta kuomet susikuria rezistentiškumo genas.Tokiu atveju šis genas yra perduodamas bakterijos palikuoniamsvykstant DNR replikacijai.Šis procesas yra paremtas Darvino evoliucijos teorijos natūralios selekcijos principais: bakterijos chromosomose įvykusios spontaninės mutacijos iššaukia rezistentiškumą kitoms bakterijų populiacijoms (35). Šiuo metu gyvūnų-augintinių skaičius sparčiai auga ir kontaktas tarp ţmogaus ir augintinių didėja. Mokslininkai atlieka vis daugiau tyrimų apie rezistentiškumo genų transmisiją tarp gyvūno ir ţmogaus. Siekiama išsiaiškinti, ar daţnas tarpusavio kontaktas bei aplinka yra antimikrobinio atsparumo prieţastis (36). Taip pat yra atlikta keletas tyrimų, kurių rezultatai parodė, jog ţmonių migracija tarp skirtingų šalyse ar kontinentų yra rizikos faktorius platinti rezistentiškumo genus, esančius bakterijų plazmidėse (37,38).
Gyvūnų natūralią ţarnyno mikroflorą sudaro daugiau nei 500 skirtingų rūšių komensalinių bakterijų, kurios yra svarbios organizmo mitybai bei imunitetui (39). Komensalai, tokie kaip Escherichia coli bei enterokokai, yra antimikrobinio atsparumo genų šaltinis (40). Antimikrobinio rezistentiškumo tyrimai, visų pirma, buvo pradėti su sveikais ţemės ūkio gyvuliais: galvijais, kiaulėmis, paukščiais, ţirgais, kadangi yra ţinoma, jog antimikrobinėms medţiagoms atsparios Escherichia coli bakterijos gali perduoti rezistentiškumo genus ţmogui ar gyvūnui per uţkrėstą mėsą (12). Tik vėliau pradėti tyrinėti gyvūnai-augintiniai, nes pasaulyje šių gyvūnų skaičius sparčiai auga ir kontaktas tarp ţmogaus ir augintinio didėja. 2004 metais atliktas tyrimas Portugalijoje parodė, jog iš kliniškai sveikų šunų ir kačių tiesiosios ţarnos išskirta ţarnyno lazdelė E.coli buvo atspari daugiau nei 5 skirtingoms antimikrobinėms medţiagoms (41). 2015 metais Italijoje atliktas identiškas tyrimas su kliniškai sveikų kačių ir šunų ţarnyno enterokokais. Tyrimo rezultatai parodė, jog iš 115 ištirtų gyvūnų, atsparumas antimikrobinėms medţiagoms nustatytas visuose išskirtose
11
Escherichia coli padermėse ir tik 27,8 proc. (n=32) išskirtų enterokokų padermių buvo
atsparios 2-4 skirtingoms antimikrobinės medţiagoms— likusios padermės atsparios buvo daugiau negu keturiems skirtingų rūšių medţiagoms, kurių tyrime buvo panaudota viso 17 (11).
Escherichia coli yra Enterobacteriaceae šeimai priklausanti gramneigiama lazdelė. Šis
fakultatyvus anaerobas daţniausiai aptinkamas ţmogaus ir gyvūnų storajame ţarnyne ir sudaro normalią ţarnyno mikroflorą, tačiau patogeniškos padermės į organizmą patenka iš aplinkos alimentiniu būdu ir gali sukelti toksikoinfekcijas (42). E.coli daţnai aptinkama dirvoje, vandenyje, išmatose, todėl šis komensalas mikrobiologijoje yra naudojamas kaip indikatorinis mikroorganizmas (43,44). 2005 metais Japonijoje atliktas tyrimas su produkcijos gyvūnais (kiaulėmis, galvijais, broileriais ir vištomis dedeklėmis) parodė, jog 306 Escherichia coli padermėse didţiausias atsparumas nustatytas tetraciklinų, aminoglikozidų bei fluorokvinolnų klasės antibiotikams (45).
Tuo tarpu enterokokai (E.feacium, E.feacalis) yra fakultatyviniai anaerobai, kurie sudaro normalią ţmogaus ir gyvūno ţarnyno mikroflorą (46). Šios bakterijos į aplinką gali patekti su ţmonių ir gyvūnų išmatomis (47). Didelė dalis enterokokų turi rezistentiškumą įvairiems antibiotikams — celfalosporinams, penicilinams, aminoglikozidams, linkozaminams bei glikopeptidams (48). Dauguma enterokokų nėra patogeniški mikroorganizmai ir nesukelia didelio pavojaus ţmonių bei gyvūnų sveikatai. Nepaisant to, atlikti tyrimai parodė, jog
Enterococcus faecium turi didesnį atsparumą antimikrobinėms medţiagoms neiEnterococcus faecalis (39).Taip pat, yra ţinoma, jog gyvūnų enterokokų rezistentiškumo genai gali būti
perduodami ţmonių enterokokams (49).
Siekiant išaiškinti atsparumo antibiotikams atsiradimo prieţastis ir plitimą, yra svarbūs tyrimai molekuliniu lygiu, kuriais nustatomi atsparumą lemiantys genetiniai elementai.
Šiuo metu vis daugiau mikrobiologų sutinka, jog gramneigiamos bakterijos sukelia didesnę daugybinio atsparumo plitimo visuomenėje riziką. Rezistentiškumo paplitimas gramneigiamų bakterijų populiacijose yra dėl plazmidėse ar transpozonuose esančių mobilių atsparumo genų pasireiškimo (50). Būtent gramneigiamų bakterijų tarpe rezistentišumo genai yra DNR elementuose — integronuose , ir yra perduodami horizontalios pernašos mechanizmu kitoms bakterijoms (51).
12 Vienas iš metodų nustatyti atsparumo genus yra polimerazės grandininė reakcija (PGR). Polimerazės grandininė reakcija — tai molekulinės biologijos metodas, leidţiantis in vitro amplifikuoti DNR ir gauti didelį kiekį specifinių jos fragmentų. Šios reakcijos principas paremtas DNR polimerazės panaudojimu, kuomet yra vykdoma tam tikro DNR sekos fragmento replikacija in vitro. DNR (deoksiribonukleorūgštis) — tai polimeras, sudarytas iš struktūrinių vienetų, vadinamų nukleotidais (mononukleotidais) (52). DNR yra daugumos gyvybinių formų genetinė informacija, todėl tiriant bakterijų genotipą polimerazės grandininės reakcijos metodu, galima rasti rezistentiškumo genų ar jų kombinacijų. Šiuo metu pasaulyje itin daţnai atliekami tokio pobūdţio genetiniai-molekuliniai tyrimai siekiant aptikti rezistentiškumo genus. Pasaulyje atlikta nemaţai tyrimų su ţmonių ir gyvūnų ţarnyno indikatoriniais mikroorganizmais, kurių rezultatai parodė, jog antimikrobinėms medţiagoms atsparių bakterijų genome buvo rasti rezistentiškumo genai (53,54,55). Yra ţinoma, jog rezistentiškumo genai koduoja atsparumą skirtingoms antibiotikų klasėms. JAV atliktas tyrimas su iš produkcijos gyvūnų išskirtomis bakterijomis (Escherichia coli, Enterococcus
spp., Salmonella enterica) parodė, jog atlikus PGR analizę, rasti rezistentiškumo genai,
koduojantys atsparumą skirtingoms antibiotikų klasėms. Buvo nustatyta, jog aminoglikozidų klasės antibiotikams atsparumą kodavo aac, ant, ir aph genai, makrolidų klasių antibiotikams — rm(A), erm(B), ir msr(C) genai, ir tetraciklinams atsparumą koduojantys genai buvo rasti šie: tet(K), (L), (M), (O), (S)(56). Identiškas tyrimas atliktas ir 2014 metais: išskyrus kliniškai sveikų šunų ir kačių indikatorinę E.coli ţarnyno lazdelę, nustatytas atsparumas skirtingiems antibiotikams, todėl atlikus PGR analizę, buvo identifikuoti skirtingi rezistentiškumo genai, koduojantys atitinkamų antibiotikų klasių atsparumą šioms medţiagoms (57). Taigi, identifikuojant atsparumo genus PGR analizės metodu, būtina naudoti atitinkamų antibiotikų klasių atsparumą koduojančių genų DNR sekas.
Atsparios antimikrobinėms medţiagoms bakterijos yra paplitusios aplinkoje: ore, vandenyje, maiste ir t.t. (15). Aplinkos sąlygos turi įtakos atsparumo genų transmisijai ir bakterijų paplitimui (31). Skirtingomis sąlygomis gyvenantys gyvūnai-augintiniai gali perduoti atsparumo genus šeimininkams ar kitiems gyvūnams, su kuriais pastarieji turi kontaktą (38). Rezistentiškumas antimikrobinėms medţiagoms ypač plinta veterinarijos gydyklose, medicinos įstaigose bei šunų prieglaudose ar veislynuose. Glaudus tarpusavio kontaktas yra veiksnys perduoti rezistentiškumo genus kitam organizmui (58,14). Siekiant įvertinti aplinkos
13 poveikį atsparumo genų paplitimui, mūsų atliktame tyrime buvo pasirinktos skirtingos šunų laikymo vietos: namų sąlygomis laikomi šunys, lauke gyvenantys šunys, prieglaudoje laikomi šunys bei vienos veterinarinės klinikos stacionare laikinai hospitalizuoti šunys. Pasak uţsienio šaltinių, aplinka daro įtaką rezistentiškumo genų paplitimui: Portugalijoje ištirtos kačių indikatorinės ţarnyno bakterijos parodė skirtingą atsparumą antimikrobinėms medţiagoms — iškelta hipotezė, jog aplinkos sąlygos turi įtakos rezistentiškumo genų paplitimui, kadangi namų sąlygomis laikomų kačių grupei nustatytas maţesnis atsparumas nei veislyne veisiamų kačių grupėje (39). Identiškas tyrimas atliktas JAV, kurio rezultatai parodė, jog veterinarinės gydyklos stacionaro aplinkoje vyrauja tokius pačius rezistentiškumo genus turinčios enterokokų padermės, kaip ir tame pačiame stacionare laikytų kačių išmatų enterokokų padermės (59).
Atsparumas antimikrobinėms medţiagoms yra paplitęs įvairiose aplinkose ir gyvūnai atsparumo genus turinčias bakterijas taip pat išskiria į aplinką, o tai lemia rezistentiškumo antimikrobinėms medţiagoms augimą visuomenėje. Kadangi veterinarijoje ir medicinoje naudojami tokių pačių klasių antibiotikai, atsparumas šioms medţiagoms yra didelis visuomeninis susirūpinimas, todėl yra būtina išsiaiškinti ar aplinkos sąlygos turi įtakos rezistentiškumo genų paplitimui aplinkoje ir kaip tai daro įtaką ţmonių ir gyvūnų sveikatai.
14
6. TYRIMO METODAI IR MEDŢIAGA
Tyrimai buvo atliekami 2013-2015 metais. Viso ištirti 75 skirtingų veislių, amţiaus ir lyties kliniškai sveiki šunys – 45 patelės ir 30 patinų. Gyvūnų amţius varijavo nuo 8 mėnesių iki 18 metų. Visi augintiniai buvo laikomi skirtingomis sąlygomis: namuose (kambaryje), lauke (kieme ar voljere), gyvūnų prieglaudoje bei klinikos stacionare (hospitalizuoti gyvūnai — klinikos stacionare praleidę ne daugiau nei keturias valandas). Priklausomai nuo prieš tai minėtų laikymo sąlygų, sudarytos keturios grupės: kambario, lauko, prieglaudos ir hospitalizuotų gyvūnų grupės.
Visose grupėse ištirta po20 gyvūnų-augintinių, išskyrus „prieglaudos‖ grupę – šioje grupėje ištirta 15 šunų.
Mėginiai buvo imami iš šunų tiesiosios ţarnos ir talpinami į transportines TRANSWAB® (Amies, Lioflchem, Italija). Surinkti mėginiai tą pačią dieną nuveţti į mikrobiologijos laboratoriją ir pasėti į Petri lėkšteles su mitybinėmis terpėmis. Escherichia
coliišskyrimui naudotas TBX chromogeninis (angl. Tryptone Bile X Gluconoride) ir
diferencinis diagnostinis Mac Conkey agarai (Liofilchem, Italija). Enterokokams išskirti mėginiai pasėti ant kanamicino eskulino azido (angl. Kanamycin Aesculin Azide agar) (Liofilchem, Italija) agaro. Uţsėtos Petri lėkštelės kultivuotos 24-48 valandas fakultatyvinėmis sąlygomis, esant +37o C temperatūrai. Išaugusių kultūrų morfologinės savybės tirtos tepinėlį
nudaţius Gramo daţymo metodu („Diagnostica Merck―, Vokietija). D grupės streptokokų serologinės grupės nustatymui naudotas „Streptococcal Grouping Kit― (Liofilchem, Italija). Enterokokų biocheminėms savybėms nustatyti naudotas sorbitolio testas.
Antimikrobinių medţiagų atsparumas atliktas sudarant antibiogramą. Pasirinktas Kirby-Bauer modifikuotas metodas (indikatorinių antibiotikų diskų metodas) – išskirtos bakterijų kultūros pasėtos į specialų „Mueller Hinton II Agar― agarą (Oxoid, Anglija). Enterokokų antimikrobiniam atsparumui nustatyti naudotas kanamicino eskulino azido agaras. Visi mikroorganizmai suspenduoti fiziologiniame tirpale iki 0,5 Mac Farland vieneto optinio tankio. Tiriamos mikroorganizmų kultūros pasėtos į Petri lėkštelę ir ant paviršiaus sudėti indikatoriniai antimikrobinių medţiagų diskai. Antimikrobiniam rezistentiškumui nustatyti, tyrime buvo pasirinkta 19 skirtingų antimikrobinių medţiagų. 11 antibiotikų diskų buvo naudojami Escherichia coli jautrumui ir atsparumui nustatyti: sulfonamidas (STX, 30µg),
15 tetraciklinas (TE 30 µg), florfenikolis (FFC, 30µg), polimiksinas B (PB, 300 IU), trimetoprimas/sulfametoksazolas (STA, 25 µg), ampicilinas (AMP,10 µg), neomicinas (N, 30 µg), enrofloksacinas (ENR, 5 µg), nitrofurantoinas (F, 300 µg), gentamicinas (CN, 10 µg), amoksicilinas su klavulanine rūgštimi (AMC, 20 µg + 10 µg).
Enterokokų jautrumui bei atsparumui nustatyti pasirinkti šie antimikrobinių medţiagų diskai: ampicilinas (AMP,10 µg),enrofloksacinas (ENR, 5 µg), penicilinas (P, 10 IU), linkomicinas (MY, 2 µg),tilozinas (TY, 5 µg), gentamicinas (CN, 10 µg), tetraciklinas (TE, 30 µg), eritromicinas (E, 15 µg).
Uţsėtos lėkštelės kultivuotos 24-48 valandas fakultatyvinėmis sąlygomis +37o
C temperatūroje. Atsparumas antimikrobinėms medţiagoms buvo įvertintas pagal galiojančius standartus — išmatuotos bakterijų augimo slopinimo zonos ir pagal išmatavimus įvertintas medţiagos poveikis (Clinical and Labaratory Standarts Institute, Antimicrobial Susceptibility Testing Standarts, 2013).
Tyrime atlikti ir genetiniai-molekuliniai tyrimai. Iš prieglaudoje laikomų šunų išskirtų antimikrobinėms medţiagoms atsparių Escherichia coli padermių atlikta polimerazės grandininė reakcija (PGR). Remiantis šios reakcijos rezultatais, nustatyti rezistentiškumo genai, koduojantys atsparumą skirtingoms antimikrobinėms medţiagoms.
Tirti šių E. coli padermių atsparumo genai: streptomicinui (aadA1), tetraciklinui [tet(A),
tet(B)], trimetoprimui (dfrA1), chinolonams (qnrA), gentamicinui [(aac(3)-IV], sulfonamidams
(sul1), beta-laktamams (blaSHV, blaCMY), eritromicinui [ere(A)], chloramfenikoliui (catA1, cmlA).
Reakcijoje naudoti oligonukleotidų pradmenys, specifiški tiriamiems atsparumo genams, nurodyti ţemiau pateiktoje 1 lentelėje.
16 1 lentelė.Escherichia coli antimikrobinio rezistentiškumo genai ir pradmenų sekos. Antimikrobinė medţiaga Atsparumo genas Pradmenų sekos PGR produkto ilgis (bp)
Streptomicinas aadA1 TATCCAGCTAAGCGCGAACT
ATTTGCCGACTACCTTGGTC 447 Tetraciklinas tet(A) GGTTCACTCGAACGACGTCA CTGTCCGACAAGTTGCATGA 577 tet(B) CCTCAGCTTCTCAACGCGTG GCACCTTGCTGATGACTCTT 634
Trimetoprimui dfrA1 GGAGTGCCAAAGGTGAACAGC
GAGGCGAAGTCTTGGGTAAAAAC
367
Chinolonai qnrA GGGTATGGATATTATTGATAAAG
CTAATCCGGCAGCACTATTTA
670 Gentamicinas aac(3)-IV CTTCAGGATGGCAAGTTGGT
TCATCTCGTTCTCCGCTCAT
286
Sulfonamidai sul1 TTCGGCATTCTGAATCTCAC
ATGATCTAACCCTCGGTCTC 822 Beta-laktamai blaSHV TCGCCTGTGTATTATCTCCC CGCAGATAAATCACCACAATG 768
blaCMY TGGCCAGAACTGACAGGCAAA
TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC
462
Eritromicinas ere(A) GCCGGTGCTCATGAACTTGAG
CGACTCTATTCGATCAGAGGC 419 Chloramfenikolis catA1 AGTTGCTCAATGTACCTATAACC TTGTAATTCATTAAGCATTCTGCC 547 cmlA CCGCCACGGTGTTGTTGTTATC CACCTTGCCTGCCCATCATTAG 698
E. coliDNR išskyrimui naudotas 5 proc. „Chelex-100― tirpalas (Sigma, USA).
DNR amplifikacija atlikta termocikleryje (G-STORM GS1, UK), laikantis šių parametrų — 5 min. 94ºC temperatūroje, 30 ciklų 94ºC temperatūroje 30 sek., 50ºC temperatūroje 30 sek.,
1,5 min. 72ºC temperatūroje. Amplifikacija uţbaigta 2 min. 72ºC temperatūroje.
PGR produktų elektroforezė atlikta TAE buferyje (40 mM Tris, 20 mM acto rūgštis 1mM EDTA), leidţiant 100 V elektros srovę 50 min. Naudotas 1,2 proc. „Top Vision LE GQ― agarozės gelis (MBI, Fermentas) su 1,3 proc. etidţio bromidu. Į gelio šulinėlius įvesta po 11 μl PGR produkto, nudaţyto „DNA loading dye― daţais (MBI, Fermentas). Tyrimo metu naudotas „GeneRuler TM 1000 bp DNA Ladder― (MBI, Fermentas) ţymeklis.PGR amplifikacijos produktai buvo analizuojami UV lempos spinduliuose.
17 Statistinė analizė apskaičiuota naudojantis SPSS 13.0 Windows statistical package (2004). Kuskal-Wallis testas buvo atliktas siekiant išanalizuoti skirtumus tarp antimikrobinių medţiagų jautrumo procento ir rezistentiškumo geno aptikimo Escherichia coli padermėse skaičiaus. Lyties, amţiaus ir veislės apskaičiavimai skirtingose grupėse atlikti pasinaudojant Microsoft Exell programa. Statistinis patikimumas skaičiuotas pagal Pirsono kvadrato (χ2) testo standartus. Grupėms palyginti panaudotas tikslusis Fišerio kriterijus.Rezultatai yra statistiškai reikšmingi, kuomet p≤ 0,05, p≤ 0,01 arba p≤ 0,001.
18
7. REZULTATAI
Iš viso tyrime ištirti 75 kliniškai sveiki šunys. Buvo sudarytos keturios grupės: kambario sąlygomis laikomų augintinių grupė (n=20), lauke (voljere ar kieme) laikomų šunų grupė (n=20), prieglaudoje gyvenantys šunys (n=15) bei veterinarijos klinikos stacionare laikytų šunų grupė (n=20).
Iš visų ištirtų šunų išmatų mėginių, Escherichia coli išaugo 67 mėginiuose (89,3 proc). D grupės streptokokai išaugo iš 41 mėginio (54,66 proc). TyrimeE.coli pasireiškė daţniau nei enterokokai (p≤0,001).
Šunų amţius varijavo nuo 8 mėnesių iki 18 metų. Buvo sudarytos keturios amţiaus grupės: iki metų amţiaus (n=8), (1-5] metai (n=44), (5-10] metų (n=16), daugiau negu 10 metų (n=7).
Iki metų amţiaus grupėje, Escherichia coli išskirta iš6mėginių (75 proc.), o 1-5 metų grupėje E.coli pasireiškė 39 mėginiuose (88,63 proc.). 5-10metų bei vyresnių negu 10 metų šunų grupėse ši bakterija išskirta iš visų mėginių — 100 proc. Atlikta statistinė analizė parodė, jog E.coli išskyrimasnepriklausė nuo amţiaus (p>0,05).
Enterokokai iki metų amţiaus šunų grupėje išaugo 5 mėginiuose, tai sudarė 62,5 proc. visų grupėje surinktų mėginių. 1-5 metų grupėje enterokokai išskirti iš 25 mėginių (59 proc.), o 5-10 metų amţiaus grupėje D grupės streptokokai išaugo 8 mėginiuose (50 proc.). Tačiau,vyresnių negu 10 metų šunų grupėje šie mikroorganizmai išaugo tik 3 mėginiuose (42,85 proc.). Statistinė analizė parodė, jog šunų amţius neturėjo įtakos enterokokų išskyrimui (p>0,05).
Išskirtų indikatorinių mikroorganizmų skirtingose maţiaus grupėse skaičius pateiktas 2 lentelėje.
2 lentelė. Išskirtų indikatorinių mikroorganizmų skaičius skirtingose amţiaus grupėse
Amţius Iki 1 metų (1-5] metai (5-10] metų virš 10 metų Viso
Escherichia coli padermių skaičius 6 38 16 7 67
19 Tyrime dalyvavo 45 patelės ir 30 patinų. Escherichia coli buvo išskirta iš 41 patelės (91,1 proc.) ir 26 patinų (86,7 proc.). Enterokokai išaugo 25 patelių mėginiuose (55,6 proc.), o patinų grupėje D grupės streptokokai išskirti iš 16 mėginių (53,3 proc.). Statistiškai išanalizavus šias grupės, rezultatai parodė, kad E.coli patelių grupėje pasitaikė daţniau negu enterokokai (p≤0,01) , o patinų grupėje skirtumas reikšmingas nebuvo (p>0,05). Išanalizavus priklausomybę nuo lyties, statistinės analizės rezultatai parodė, jog Escherichia coli ir D grupės streptokokų pasireiškimas nuo lyties nepriklausė (p>0,05).
Atlikus atsparumo antimikrobinėms medţiagoms tyrimus, buvo nustatyta, jog
Escherichia coli labiausiai atspari buvo neomicinui (85,4 proc., (n=57)), ampicilinui (77,1
proc., (n=51)), sulfonamidui (70,8 proc., (n=47)), tetraciklinui (64,6 proc., (n=43)), 1 pav. Enterokokai atspariausi buvo gentamicinui (87,1 proc., (n=35)), eritromicinui (83,9 proc., (n=34)), linkomicinui (80,6 proc., (n=33)) ir tilozinui-tetraciklinui-enroflokacinui (74,2 proc., (n=30)), 1 pav.
Apačioje pateiktuose paveiksluose vaizduojama kaip tyrime panaudotos antimikrobinės medţiagos veikė E.coli ir enterokokus.
1 pav.Antimikrobinių medţiagų poveikis išskirtoms Escherichia colipadermėms. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% N A MP STA TE F PB CN A MC STX ENR FFC
20 2 pav.Antimikrobinių medţiagų poveikis išskirtoms enterokokų padermėms.
Kai kurios antimikrobinės medţiagos buvo naudotos abiejų bakterijų rezistentiškumui nustatyti. Ampicilino, tetraciklino, gentamicino, enrofloksacino bei amokscilino su klavulanine rūgštimi antibiotikų diskai buvo naudojami vertinant enterokokų bei E.coli antimikrobinį atsparumą. Ţemiau pateiktame paveiksle (3 pav.) vaizduojama kaip šios antimikrobinės medţiagos skirtingai veikė enterokokus ir E.coli. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% CN E MY TY TE EN R A MP CL P A MC
21 3 pav.Antimikrobinių medţiagųpoveikis indikatorinių bakterijų padermėse.
7. 1
Kambaryje laikomi šunys
. Šioje grupėje dalyvavo 16 kliniškai sveikų gyvūnų-augintinių. Keturi šunys buvo gydyti simptomiškai, tačiau sirgo ne virškinamojo trakto ligomis. Grupę sudarė daugiausiai nedideli grynaveisliai šunys (Jorkšyro terjerai, mopsai, Vakarų Škotijos baltieji terjerai ir kt.). E.coli išskirta iš 18 mėginių (90 proc.), tuo tarpu enterokokai — iš 9 (55 proc.). Escherichia coli šioje grupėje pasitaikė daţniau (p≤0,05).Įvertinus Escherichia coli atsparumą antimikrobinėms medţiagoms, gauti tokie rezultatai: didţiausias atsparumas nustatytas neomicinui (83,33 proc., (n=15)), ampicilinui ir sulfonamidui (72,22 proc., (n=13)) bei tetraciklinui (61,11 proc., (n=8)). Jautrumas nustatytas florfenikoliui 100 proc. mėginių (n=18), amoksicilinui su klavulanine rūgštimi bei polimiksinui B — 61,11 proc. mėginių (n=11). Rezultatai grafiškai vaizduojami 5 paveiksle.
Enterokokai labiausiai atsparūs buvo eritromicinui ir gentamicinui (81,81 proc., (n=9)), tetraciklinui ir linkomicinui (63,63 proc., (n=7)) bei tilozinui ir enrofloksacinui (54,54 proc., (n=6)). D grupės streptokokų antimikrobinių medţiagų poveikio rezultatai vaizduojami 4 paveiksle. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% E .co li E n ter o k o k ai E .co li E n ter o k o k ai E .co li E n ter o k o k ai E .co li E n ter o k o k ai E .co li E n ter o k o k ai
AMP TE CN (p<0,001) AMC (p<0,001) ENR (p<0,001) Atsparu Vidutiniškai jautru Jautru
22 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% E CN MY TE TY EN R P A MC
Atsparu Vidutiniškai jautru Jautru p<0,001
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% N ST A A M P TE ST X F EN R A MC CN PB FFC
Atsparu Vidutiniškai jautru Jautru p<0,001
.
4 pav. Antimikrobinių medţiagų poveikis enterokokų išskirtoms padermėms.
5 pav. Antimikrobinių medţiagų poveikis Escherichia coli išskirtoms padermėms.
23 7. 1.1Amţiaus grupės. Iki metų amţiaus grupėje tirti 4 šunys — E.coli išskirta iš 3 mėginių (75 proc.), enterokokai taip pat iš 3 mėginių (75 proc.) .
1-5 metų amţiaus grupėje mėginiai imti iš 10 šunų (50 proc.). Šioje amţiaus grupėje
E.coliišskirta iš 9 mėginių (90 proc.), o enterokokai iš 4 (40 proc.)
5-10 metų amţiaus grupėje buvo 4 šunys ir iš visų augintinių išmatų mėginių išaugo
Escherichia coli (100proc.). Tuo tarpu enterokokai išskirti iš 3 mėginių (75 proc.).
Vyresnių nei 10 metų šunų grupę sudarė 2 šunys — E.coli išskirta iš abiejų gyvūnų (100 proc.), enterokokai — išaugo viename mėginyje (50 proc.).
Statistinė analizė parodė, jog Escherichia coli ir enterokokų pasireiškimas nepriklausė nuo šunų amţiaus (p≤0,05).
Įvertinus antimikrobinį atsparumą E.coli padermėse, nustatyta, jog iki metų amţiaus šunų mėginiai atspariausi buvo neomicinui (100 proc. (n=3)), 1-5 metų amţiaus grupėje didţiausias atsparumas nustatytas sulfonamidui ir amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (88,88 proc., (n=8)). 5-10 metų grupėje ir vyresnių negu 10 metų amţiaus grupėje, Escherichia coli labiausiai atspari buvo neomicinui (atitinkamai 100 proc., (n=4) ir 80 proc, (n=3)).
Enterokokai iki 1 metų amţiaus atspariausi buvo gentamicinui (75 proc., (n=3)). 1-5 metų amţiaus grupėje didţiausias atsparumas nustatytas penicilinui (100 proc., (n=4)). O 5-10 metų ir vyresnių šunų amţiaus grupėse enterokokai atspariausi buvo eritromicinui (100 proc., n=4 ir 100 proc., (n=2)).
7. 1.2Lyties grupės. Kambario sąlygomis laikomų šunų grupėje patelės ir patinai pasiskirstė tolygiai — 10 patelių (50 proc.) ir 10 patinų (50 proc.).
Patelių grupėje E.coli išskirta iš 9 mėginių (90 proc.), o enterokokai iš 7 (70 proc.). Iš patelių išmatų išskirta ţarninė lazdelė atspariausia buvo sulfonamidui 88,88 proc. (n=8), tetraciklinui ir ampicilinui 77,77 proc. (n=7) ir neomicinui 66,66 proc. (n=6). E.coli patelių grupėje jautriausia buvo florfenikoliui (100 proc., (n=9)).
Tuo tarpu D grupės streptokokai labiausiai atsparūs buvo eritromicinui ir gentamicinui (71,42 proc., (n=5)), tetraciklinui, likomicinui ir tilozinui (57,14 proc., (n=4)) bei penicilinui (28,57 proc., (n=2)). Enterokokai jautriausi buvo amoksicilinui su klavulanine rūgštimi— 85,71 proc. (n=6).
Patinų grupėje Escherichia coli išskirta iš 9 mėginių (90 proc.), o enterokokai iš 4 (40 proc.). Šioje grupėje didţiausias atsparumas E.coli padermėms nustatytas neomicinui — visi
24 mėginiai buvo atsparūs šiam antibiotikui (100 proc., (n=9)). Ampicilinui atsparumas nustatytas 6 mėginiuose (66,66 proc.), o 5 padermės atsparios buvo furantoinui (55,55 proc.). E.coli patinų grupėje jautriausia buvo florfenikoliui (100 proc., (n=9)).
D grupės streptokokai labiausiai atsparūs buvo gentamicinui ir eritromicinui — šiems antibiotikams atsparumas nustatytas visuose mėginiuose (100 proc., (n=9)). Tetraciklinui ir linkomicinui atsparios buvo 3 padermės (75 proc.), o tilozinui, penicilinui ir enrofloksacinui atsparumas nustatytas dviejose padermėse (50 proc.). Labiausiai jautrūs enterokokai buvo amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (75 proc., (n=3)).
7. 2
Lauke laikomi šunys
. Šioje grupėje ištirti 20 įvairaus amţiaus, lyties ir veislės gyvūnai. 45 proc. ištirtų gyvūnų-augintinių buvo didelių veislių šunys — vokiečių aviganiai (n=6, 30 proc.) ir belgų aviganiai (n=3, 15 proc.). Maţų veislių lauke laikomų augintinių nebuvo, o likusią lauke laikomų šunų grupės dalį sudarė mišrių veislių šunys (55 proc.,(n=11)).Escherichia coli šioje grupėje išskirta iš visų 20 surinktų mėginių (100 proc.). D grupės
streptokokai išskirti iš 14 šunų išmatų mėginių (70 proc.). Statistiškai išanalizavus indikatorinių bakterijų pasireiškimą šioje grupėje, buvo nustatyta, jog E.coli pasireiškė daţniau nei enterokokai (p≤0,05).
Iš 20 grupėje ištirtų mėginių, net 16 Escherichia coli padermių nustatytas atsparumas neomicinui (80 proc.). 70 proc. mėginių atsparūs buvo ampicilinui(n=14), 65 proc. — sulfonamidui (n=13). Didţiausias jautrumas nustatytas enrofloksacinui (95 proc., (n=19)). Atlikus Pirsono kvadrato testą, buvo nustatyta, jog visų 11 antimikrobinių medţiagų veikimas
Escherichia coli atţvilgiu skiriasi reikšmingai (p≤0,001). 6 paveiksle grafiškai vaizduojamas
antimikrobinių medţiagų poveikis E.coli išskirtose padermėse.
D grupės streptokokams atsparumas nustatytas gentamicinui (92,86 proc., (n=13)_ n=34)), tilozinui ir linkomicinui (85,71 proc., (n=12)), enrofloksacinui ir eritromicinui (78,57 proc.,(n=11)). Jautriausi enterokokai buvo amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (57,15 proc., (n=8)). 7 paveiksle pavaizduota kaip skirtingos antimikrobinės medţiagos veikė išskirtus enterokokus.
25 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% CN TY MY E E NR TE A MP P A MC
Atsparu Vidutiniškai jautru Jautru p<0,001 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% N A MP STA TE F A MC PB STX CN FFC ENR
Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu p<0,001
6 pav. Antimikrobinių medţiagų poveikis Escherichia coli išskirtoms padermėms.
26 7. 2.1 Amţiaus grupės. Amţius lauke laikomų šunų grupėje buvo įvairus: daugiausiai grupėje šunų buvo vidutinio amţiaus — 1-5 metų amţiaus šunų buvo 12 (60 proc.), iki metų amţiaus ir vyresnių negu 10 metų šunų šioje grupėje buvo po vieną. 30 proc. grupėje dalyvavusių augintinių sudarė 5-10 metų amţiaus šunys (n=6).
Tiek iš jauniausio, tiek iš seniausio šuns išmatų mėginių buvo išskirta E.coli ir enterokokai (100 proc). 9 mėnesių šuns išmatų mėginyje išaugusi E.coli atspariausia buvo neomiciniui ir ampicilinui, kitoms antimikrobinėms medţiagomsbakterija buvo jautri. Tačiau, vyresnio nei 10 metų šuns mėginyje išskirta E.coli labiausiai atspari buvo neomicinui, tetraciklinui, sulfonamidui, ampicilinui, polimiksinui B ir amoksicilinui su klavulanine rūgštimi.Jauniausio šuns išskirtas enterokokų mėginys buvo atsparus visoms antimikrobinėms medţiagoms, išskyrus peniciliną ir amoksiciliną su klavulanine rūgštimi. Vyresnio nei 10 metų amţiaus šuns išskirtii enterokokai atsparūs visiems antibiotikams, išskyrus enrofloksaciną ir amoksiciliną su klavulanine rūgštimi — šioms antimikrobinėms medţiagoms enterokokai buvo jautrūs.
1-5 metų amţiaus grupėje Escherichia coli išskirta iš 12 mėginių (100 proc.), o D grupės streptokokai — iš 9 (75 proc.). Šioje grupėje E.coli atspariausia buvo neomicinui ir ampicilinui (75 proc., (n=9)), o enterokokai — eritromicinui, tilozinui ir tetraciklinui (66,66 proc., (n=6)).
5-10 metų grupėje, Escherichia coli išaugo 6 mėginiuose (100 proc.), enterokokai — 3 (50 proc.). Šioje amţiaus grupėje ţarninė lazdelė atspariausia buvo sulfonamidui (100 proc., (n=6)), o enterokokai šioje grupėje jautrūs buvo tik penicilinui — likusioms antimikrobinėms medţiagoms enterokokai buvo atsparūs.
Statistiškai palyginus visas amţiaus grupes nustatyta, jog amţius indikatorinių bakterijų pasireiškimui reikšmės neturėjo (p>0,05), visų antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,01).
7. 2.2 Lyties grupės. Lauke laikomų šunų grupėje tirta 12 patelių (60 proc.) ir 8 patinai (40 proc.).
Patelių grupėje Escherichia coli išskirta iš 12 mėginių (100 proc.), o enterokokai — iš 8 (66,66 proc.).
27 Nustačius antimikrobinį atsparumą, rezultatai parodė, jog iš patelių išskirtos E.coli padermės atspariausios neomicinui (83,33 proc., (n=10)), ampicilinui ir sulfonamidui (66,66 proc., n=8) bei tetraciklinui (41,66 proc., (n=5)). 11 mėginių nustatytas jautrumas enrofloksacinui (91,66 proc.) — šiam antibiotikui E.coli buvo jautriausia. Statistiškai apskaičiuota, jog enrofloksacino ir neomicino veikimas skyrėsi statistiškai reikšmingai (p≤0,001).
Patelių grupėje D grupės streptokokaibuvo atsparūs eritromicinui ir gentamicinui (75 proc., (n=6)), enrofloksacinui, tetraciklinui ir linkomicinui (62,5 proc., (n=5)) bei penicilinui (37.5 proc., (n=5)). Jautriausi enterokokai buvo penicilinui ir amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (n=3, 37,5 proc.). Eritromicino ir gentamicino poveikis nesiskyrė statistiškai reiškmingai nuo penicilino ir amoksicilino su klavulanine rūgštimi poveikio. (p>0,05).
Patinų išmatų mėginiuose Escherichia coli išaugo visuose mėginiuose (100 proc.). D grupės streptokokai išskirti iš 7 šunų (87,5 proc.).
Didţiausią atsparumą patinų grupėje E.coli parodė ampicilinui, neomicinui ir nitrofurantoinui (75 proc., (n=6)). Visi ištirti mėginiai jautriausi buvo enrofloksacinui (100 proc.). Ampicilino, neomicino ir nitrofurantoino poveikis lyginant su enrofloksacinu skyrėsi reikšmingai (p≤0,01).
Patinų tarpe išskirtiems enterokokams nustatytas 100 proc. atsparumas šioms antimikrobinėms medţiagoms — gentamicinui, linkomicinui, tilozinui (n=7). Enterokokai jautrūs buvo tik vienai antimikrobinei medţiagai — ampicilinui (71,42 proc., (n=5)). Įvardintų antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,001).
7. 3
Prieglaudoje laikomi šunys
. Šioje grupėje ištirta15 gyvūnų, kurie buvo laikomi gyvūnų prieglaudoje. 70 proc. šunų buvo mišrios veislės, 30 proc. — grynaveisliai. Didţioji dalis šunų prieglaudoje laikomi lauko sąlygomis (voljeruose, pririšti prie būdos), tačiau mėginiai buvo renkami ir iš patalpose („boksuose―, garduose) laikomų šunų. Tuo metu prieglaudoje iš viso buvo laikomi 48 šunys ir 6 katės. Gyvūnai lauke laikomi labai glaudţiai, neturėjo daug vietos, kai kurie šunys galėjo prieiti vienas prie kito. Voljeruose šunys gyveno po 2-3, tik agresyvūs gyvūnai buvo laikomi atskirai po vieną.Escherichia coli išskirta iš 10 šunų mėginių (66,66 proc.). Grupėje E.coli atspariausia
buvo trims antimikrobinėms medţiagoms: ampicilinui, polimiksinui B ir neomicinui(100 proc., (n=10)). Gentamicinui ir tetraciklinui atsparumas nustatytas 90 proc. padermių (n=9), o
28 sulfonamiduiatsparios buvo 80 proc. išskirtų padermių (n=8). Jautrumas nustatytas trimetoprimui/sulfametoksazolui ir enrofloksacinui (50 proc., (n=5)). Grupėje skirtingų antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,01). 8 paveiksle vaizduojama kaip skirtingos antimikrobinės medţiagos veikė Escherichia coli išskirtas padermes.
Enterokokų atţvilgiu didţiausias atsparumas nustatytas enrofloksacinui, tetraciklinui, linkomicinui, penicilinui ir eritromicinui (100 proc., (n=6)). 81,81 proc. mėginių buvo atsparūs tilozinui ir gentamicinui (n=5). Jautrūs enterokokai buvo amokcilinui su klavulanine rūgštimi (83,33 proc., (n=5)) bei tilozinui (16,7 proc., (n=1)). Visų antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,01). 9 paveiksle vaizduojamas antimikrobinų medţiagų poveikis išskirtose enterokokų padermėse.
8 pav. Antimikrobinių medţiagų poveikis Escherichia coliišskirtoms padermėms. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% N PB A M P T E CN ST A F A MC STX ENR FFC
29 9 pav.Antimikrobinių medţiagų poveikis enterokokų išskirtoms padermėms.
7. 3.1Amţiaus grupės. Amţiaus grupėje iki vienerių metų ištirti 2 šunys (13,33 proc.). Tik iš vieno šuns išmatų mėginio išaugo D grupės streptokokai ir E.coli (50 proc.). Vyresni nei 10 metų amţiaus šunys tirti nebuvo.
Daugiausiai prieglaudoje buvo vidutinio amţiaus šunų — 1-5 metų amţiaus (n=11, 73,33 proc.). Šioje amţiaus grupėje Escherichia coli buvo išskirta iš 7 mėginių (63,63 proc.). Enterokokai išaugo 6 mėginiuose (54,54 proc.).
Šioje amţiaus grupėje E.coli išskirtose padermėse nustatytas daugybinis antimikrobinis atsparumas šiomsmedţiagoms: tetraciklinui, neomicinui, polimiksinui B, gentamicinui, ampicilinui (100 proc., (n=7)). Sulfonamidui atsparūs buvo 6 mėginiai (85,71 proc.), o enrofloksacinui 5 mėginiai — 71,42 proc. Šių antimikrobinių medţiagų poveikis reikšmingai nesiskyrė (p>0,05).
Enterokokai atsparūs visoms antimikrobinėms medţiagoms, išskyrus amoksiciliną su klavulanine rūgštimi. Šiam antibiotikui buvo nustatytas jautrumas 4 iš 5 mėginių (80 proc.). Šių antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,01).
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% E MY P TE EN R TY CN CL A MC
30 Vyresnių šunų grupėje (5-10 metų) tirti buvo 2 šunys (13,33 proc.). Abiejų gyvūnų išmatų mėginiuose išskirta E.coli ţarninė lazdelė (100 proc.). Tuo tarpu enterokokai neišskirti nei iš vieno mėginio (0 proc.).Escherichia coliištirtos padermės atsparios buvo 5 skirtingoms antimikrobinėms medţiagoms: florfenikoliui, polimiksinui B, neomicinui, nitrofurantionui, ampicilinui (100 proc., (n=2)). Antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,01).Statistinė analizė parodė, jog E.coli bei enterokokų padermių išskyrimas nuo amţiaus nepriklausė (p>0,05).
7. 3.2 Lyties grupės. Prieglaudoje tirtų šunų grupę sudarė 9 patelės ir 6 patinai.
Patelių grupėje Escherichia coli išskirta iš 7 mėginių (77,77 proc.), o D grupės streptokokai iš 3 (33,33 proc.). E.coli atspariausia buvo šioms antimikrobinėms medţiagoms: neomicinui, ampicilinui ir polimiksinui B (100 proc., (n=7)), gentamicinui ir tetraciklinui (85,71 proc., (n=6)) bei sulfonamidui ir amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (71,42 proc., (n=5)). Jautrumas nustatytas trimetoprimui/sulfametoksazolui (57,14 proc., (n=4)). Šių antimikrobinių medţiagų poveikis nesiskyrė reikšmingai (p>0,05).
Enterokokai iš patelių išskirti trijuose mėginiuose. Visoms padermėms nustatytas atsparumas šioms antimikrobinėms medţiagoms: enrofloksacinui, gentamicinui, penicilinui, likomicinui, tilozinui, ampicilinui, tetraciklinui, eritromicinui (100 proc., (n=3)). Jautrumas nustatytas tik amoksicilinui su klavulanine rūgštimi(66, 66 proc., (n=2)).
Patinų tarpe D grupės streptokokai ir Escherichia coli išaugo 3 mėginiuose iš 6 (50 proc.). Patinų indikatorinė E.coli parodė daugybinį atsparumą šioms antimikrobinėms medţiagoms: sulfonamidui, tetraciklinui, gentamicinui, ampicilinui, nitrofurantoinui, polimiksinui B (100 proc., (n=3)). Tuo tarpu didţiausias jautrumas nustatytas enrofloksacinui (66,66 proc., (n=2)). Šių antimikrobinių medţiagų veikimas reikšmingai nesiskyrė (p>0,05).
Enterokokai atspariausi buvo eritromicinui, penicilinui, enrofloksacinui, linkomicinui (100 proc., (n=3)). Jautrumas nustatytas amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (100 proc., (n=3)). Šių antimikrobinių medţiagų veikimas reikšmingai nesiskyrė (p>0,05).
31 7. 4
Hospitalizuotų šunų grupė
.
Šioje grupėje surinkta 20 mėginių iš skirtingų veislių, amţiaus bei lyties gyvūnų. Hospitalizuoti šunys buvo laikomi tokie, kurie klinikos stacionare praleido ne daugiau nei 4 valandas. Šie gyvūnai stacionare buvo laikomi dėl įvairių prieţasčių. Vieni šunys buvo palikti šeiminikų laikinai prieţiūrai, kiti narvuose laikyti po operacijų arba gydymo tikslais ir bendrai prieţiūrai.Paėmus mėginius iš tiesiosios ţarnos gauti tokie rezultatai: Escherichia coli išskirta iš 19 mėginių (95 proc.), o enterokokai (E.faecalis, E.faecium) — iš 9 mėginių (45 proc.).
Hospitalizuotų šunų grupėje išskirta E.coli atspariausia buvo šioms antimikrobinėms medţiagoms: ampicilinui (85 proc., (n=14)), neomicinui (70,66 proc., (n=9)), sulfonamidui (72,22 proc., (n=10)) ir tetraciklinui (40 proc., (n=4)). Jautriausia E.coli buvo florfenikoliui (100 proc., (n=15)). Antimikrobinių medţiagų poveikis skyrėsi reikšmingai (p≤0,001).
10 paveiksle vaizduojamas antimikrobinių medţiagų poveikis išskirtose E.coli padermėse.
Enterokokai atspariausi buvo linkomicinui ir tetraciklinui (81,88 proc., (n=9)), gentamicinui (73,63 proc., (n=8)) bei eritromicinui (71,14 proc., (n=7)). Jautrumas enterokokams buvo nustatytas 9 mėginiuose amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (100 proc.).10 paveiksle vaizduojama kaip antimikrobinės medţiagos veikė išskirtas enterokokų padermes.Šių medţiagų poveikis skyrėsi reikšmingai (p≤0,001).
32 10 pav.Antimikrobinių medţiagų poveikis Escherichia coli išskirtoms padermėms.
11 pav.Antimikrobinių medţiagų poveikis enterokokų išskirtoms padermėms. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% N S T A AMP TE S TX F EN R AMC CN PB FFC
Atsparu Vidutiniškai jautru Jautru p<0,001
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% E CN MY TE TY EN R P AMC
33 7. 4.1 Amţiaus grupės. Iki metų amţiaus grupėje ištirtas vienas šuo. Išskirta tik
Escherichia coli(100 proc.). Tuo tarpu enterokokai iš šio gyvūno išmatų mėginio išskirti
nebuvo (0 proc.). Antimikrobinis atsparumas nustatytas tik ampicilinui (100 proc.). Visoms kitoms antimikrobinėms medţiagoms E.coli buvo jautri.
1-5 metų amţiaus grupėje buvo 12 šunų (60 proc.). Escherichia coli išskirta iš 12 mėginių (100 proc.), o enterokokai išaugo 7 mėginiuose (63,63 proc.). Atsparumas nustatytas ampicilinui (83,33 proc., (n=10)). Šių antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,001).
Šioje grupėje D grupės streptokokai atsparumą parodė eritromicinui — visuose mėginiuose atsparumas nustatytas šiam antibiotikui (100 proc.). Antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,05).
5-10 metų grupėje tirti5 šunys (33,33 proc.). Escherichia coli išaugo iš 4 mėginių (80 proc.), o D grupės streptokokų padermės išskirtos iš 2 mėginių (40 proc.). E.coli išskirtoms padermėms didţiausias atsparumas nustatytas ampicilinui (100 proc.). Enterokokai atspariausi buvo amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (100 proc., (n=9)). Antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,05).
10 ir daugiau metų turinčių šunų šioje grupėje buvo 5 augintiniai (33,33 proc.) Šioje grupėje E.coli išskirta iš visų mėginių (100 proc.), tačiau enterokokai išaugo tik viename mėginyje (20 proc.). Didţiausias atsparumas išskirtoms E.coli padermėms nustatytas ampicilinui (100 proc.), sulfonamidui (66,66 proc.). D grupės streptokokai šioje amţiaus grupėje atspariausi buvo penicilinui (66,66 proc., (n=2)). Antimikrobinių medţiagų veikimas statistiškai skyrėsi reikšmingai (p≤0,05).
7. 4.2 Lyties grupės.Tyrime ištirta 14 kalių ir 6 patinai.
Iš 13 patelių tiesiosios ţarnos mėginių E.coli išskirta 13 mėginių (92.85 proc.). Enterokokai išaugo 7 mėginiuose (42,85 proc.). Atspariausios Escherichia coli padermės buvo ampicilinui (92,85 proc.) ir sulfonamidui (74,44 proc.). Didţiausias jautrumas nustatytas florfenikoliui (92,85 proc.). Šių antimikrobinių medţiagų poveikis skyrėsi reikšmingai (p≤0,05).
Enterokokai didţiausią atsparumą parodė tetraciklinui, gentamicinui ir linkomicinui (100 proc.). Jautrumas išskirtoms padermėms nustatytas amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (57,14 proc.).
34 Patinų grupėje Escherichia coli išskirta iš visų surinktų mėginių (100 proc., n=6)). Tuo tarpu enterokokai išaugo 2 mėginiuose (33,33 proc.).
E.coli padermės atspariausios buvo ampicilinui (83,33 proc.), tetraciklinui (43,33 proc.).
Jautrumas nustatytas florfenikoliui (100 proc.). Šių antimikrobinių medţiagų poveikis skyrėsi reikšmingai (p≤0,05).
Iš patinų išmatų surinktų mėginių išskirtos enterokokų padermės buvo atsparios 4 antimikrobinėms medţiagoms: linkomicinui, gentamicinui, tetraciklinui ir eritromicinui (100 proc.). Jautrumas nustatytas amoksicilinui su klavulanine rūgštimi (100 proc.). Antimikrobinių medţiagų veikimas skyrėsi reikšmingai (p≤0,05).
35 7. 5
Daugybinis atsparumas.
Daugybinis atsparumas nustatytas kiekvienoje tirtoje grupėje (100 proc.). Atsparumas tyrime buvo nustatytas tokiu atveju, jei tirtų bakterijų padermės parodė rezistentiškumą 4 ir daugiau skirtingoms antimikrobinėms medţiagoms.Iš viso tyrime ištirtos 67 Escherichia coli padermės, tarp kurių, daugybinis atsparumas nustatytas 39 padermėms (43,28 proc.).
Enterokokai išskirti iš 40 mėginių — daugybinis atsparumas nustatytas 35 padermėse (87,5 proc.).
7. 5.1 Lauko sąlygomis laikomų gyvūnų grupėje, Escherichia coli padermėms daugybinis atsparumas nustatytas 9 padermėse (20,45 proc.) — 4 patelėms ir 5 patinams (atitinkamai 44,44 proc. ir 55,55 proc.).Atsiţvelgiant į amţiaus grupes, daugybinis atsparumas daţniausiai pasitaikė 1-5 metų amţiaus grupėje (20 proc., (n=5)).
Enterokokų atţvilgiu daugybinis antimikrobinis rezistentiškumas šioje grupėje nustatytas 13 mėginių iš 14 ištirtų (92,85 proc.) — 8 patelių ir 5 patinų mėginai buvo atsparūs daugiau nei 4 antimikrobinėms medţiagoms (atitinkamai 61,53 proc.ir 38,4. proc.) 1-5 metų amţiaus grupėje toks atsparumas nustatytas 9 mėginiuose (13,5 proc).
7. 5.2 Kambaryje laikomų gyvūnų Escherichia coli padermėms daugybinis atsparumas nustatytas 13 mėginių iš 18 ištirtų (72,22 proc.). Patelių grupėje daugybinis rezistentiškumas nustatytas 7 (53,84 proc.), o patinų — 6 mėginiuose (41,15 proc.). Amţiaus grupėse atsparumas daţniausiai pasitaikė 1-5 metų grupėje (53,84 proc., (n=7)).
Enterokokai atsparūs daugiau nei 4 antimikrobinėms medţiagoms buvo 7 iš 11 ištirtų mėginių (63.63 proc.). Daugybinį atsparumą parodė 4 patelių ir 3 patinų mėginiai (atitinkamai 57,14 proc. ir 42,85 proc.). Amţiaus grupėse daugybinis rezistentiškumas daţniausiai nustatytas iki metų amţiaus grupėje (42,85 proc., (n=3)).
7. 5.3 Prieglaudos gyvūnų grupėje daugybinis E.coli rezistentiškumas nustatytas visuose mėginiuosee (n=10, 100 proc.). 7 patelių ir 3 patinų išskirta indikatorinė Escherichia
coli parodė atsparumą daugiau nei 4 skirtingoms antimikrobinėms medţiagoms (atitinkamai
70 proc. ir 30 proc.). Amţiaus grupėse daugybinis atsparumas daţniausiai pasitaikė 1-5 metų amţiaus šunų E.coli išskirtų padermių mėginiuose (70 proc., (n=7)).
Enterokokai šioje grupėje išskirti iš 6 mėginių (3 patinai (50 proc.) ir 3 patelės (50 proc.)) — visoms padermėms nustatytas 100 proc. atsparumas 8 antimikrobinėms medţiagoms, išskyrus tiloziną (jautrus vienas mėginys), ir amoksiciliną su klavulanine
36 rūgštimi — šiam antibiotikui jautrumas nustatytas 5 mėginiuose. 1-5 metų amţiaus grupėje daugybinis atsparumas nustatytas daţniausiai, lyginant su kitomis amţiaus grupėmis. Šioje grupėje daugybinis atsparumas nustatytas 5 mėginiuose (83,33 proc.)
5.4 Klinikoje laikomų šunų grupėje E.coli išskirta iš 19 mėginių — 7 iš jų parodė daugybinį antimikrobinį atsparumą (36,84 proc.). 2 patinų ir 5 patelių indikatorinė ţarnyno lazdelė buvo atspari daugiau nei 4 antimikrobinėms medţiagoms (atitinkamai 28,57 proc. ir 71,42 proc.). Amţiaus grupėse daugybinis antimikrobinis atsparumas daţniausiai nustatytas 1-5 metų amţiaus grupėje (1-57,14 proc, (n=4)).
Enterokokų daugybinis atsparumas nustatytas 9 mėginiuose (100 proc. visų išskirtų mėginių). 2 patinų ir 7 patelių mėginiuose (atitinkamai 22,22 proc. ir 77,77 proc.). 1-5 metų amţiaus grupėje daugybinis atsparumas pasitaikė daţniau lyginant su kitomis grupėmis (p≤0,05). Šioje grupėje 7 mėginiuose nustatytas daugybinis atsparumas (77,77 proc).
7. 6
Molekuliniai tyrimai
.
Genetiškai buvo tirtos Escherichia coli padermės, kurios buvo išskirtos iš prieglaudoje laikomų šunų grupės, kadangi būtent šioje grupėje buvo nustatytas didţiausias rezistentiškumas antimikrobinėms medţiagoms lyginant su kitomis grupėmis (p≤0,05).Rezistentiškumo genai, koduojantys beta-laktamų klasės antibiotikus (blaSHV ir blaCMY), tyrimo metu aptikti nebuvo. Nerasti ir atsparumo genai (aac(3)-IV), kurie koduoja rezistentiškumą aminoglikozidų klasės antimikrobinėms medţiagoms.
Iš tetraciklinui atsparių E.coli padermių,buvo aptikti dutet atsparumo genai: tetA (13,3 proc.)bei tetB (6,66 proc.). Be tetraciklinui atsparumą koduojančių genų, dar rastastrimetoprimui/sulfametoksazolui atsparumą koduojantis genas (dfrA1), (6,66 proc).
catA1 rezistentiškumo genas, kuris koduoja rezistentiškumą chloramfenikoliui, rastas
vienoje tetB teigiamoje E.coli padermėje, kuri buvo atspari florfenikoliui (6,66 proc.).
Nei vienas iš qnrA, sul1 ir cmlA genų nebuvo aptikti visuose enrofloksacinui, sulfonamidui ir trimetoprimui/sulfametoksazolui bei florfenikoliui atsparių E.coli padermių mėginiuose. Ţemiau pateiktuose paveiksluose (12 pav. ir 13 pav.) pavaizduoti PGR rezultatai.
37 12 pav.Escherichia coli padermė, atspari chloramfenikoliui. (dfrA1rezistentiškumo genas).
13 pav. Escherichia coli padermė, kurioje aptikti tetA ir
38
8. REZULTATŲ APTARIMAS
Tyrimo metu ištirtas kliniškai sveikų šunų normalios ţarnyno mikrofloros antimikrobinis atsparumas. Iš surinktų mėginių buvo išskirtos dvi pagrindinės ir daţniausiai išskiriamos ţarnyno normalios mikrobiotos bakterijos: Escherichia coli ir enterokokai (Enetrococcus
faecalis ir Enterococcus faecium). Būtent šios dvi D grupės streptokokų nepatogeninės
padermės yra daţniausiai išskiriamos iš šunų ir kačių išmatų mėginių (60). Tuo tarpu nevirulentiška E.coli yra priskiriama prie indikatorinių ţarnyno bakterijų antimikrobiniam rezistentiškumui nustatyti (61).
Iš 75 mėginių išskirtos Escherichia coli ir enterokokų (Enetrococcus faecalis ir
Enterococcus faecium) padermės buvo atsparios bent vienai antimikrobinei medţiagai. Tai
parodo, jog kliniškai sveiki augintiniai gali būti atsparūs antimikrobinėms medţiagoms dėl rezistentiškumo geno paplitimo aplinkoje. Veikiant horizontalios ir vertikalios pernašos mechanizmams, šie genai plinta tarp ţmonių ir gyvūnų. Komensalinės bakterijos, tokios kaip, D grupės streptokokai bei E.coli, rezistentiškumo genus gali perduoti būtent dėl šių pernašų mechanizmo, todėl indikatorinės ţarnyno bakterijos yra natūralūs atsparumo genų šeimininkai ir platintojai (60).
Europoje atlikti tyrimai parodė, jog iš sveikų šunų išskirtai indikatorinei Escherichia coli bei enterokokams (Enetrococcus faecalis ir Enterococcus faecium) buvo nustatytas daugybinis antimikrobinis atsparumas skirtingų klasių antimikrobinėms medţiagoms: tetraciklinui, eritromicinui, ampicilinui, enrofloksacinui ir kt. (62). Mūsų atlikti tyrimai parodė, jog ištirtos bakterijos buvo atsparios būtent šioms antimikrobinėms medţiagoms: enterokokai didţiausią atsparumą parodė gentamicinui (87,1 proc.), eritromicinui (83,9 proc.), linkomicinui (80,6 proc.), tilozinui-tetraciklinui-enrofloksacinui (74,2 proc.). Escherichia coli atspariausia buvo neomicinui (85,4 proc.), ampicilinui (77,1 proc.), sulfonamidui (70,8 proc.), tetraciklinui (64,6 proc.).
Daugybinis atsparumas nustatytas 39 Escherichia colipadermėse iš 67 ištirtų ir 35 enterokokų (Enetrococcus faecalis ir Enterococcus faecium) mėginiuose iš 41 ištirtų (atitinkamai 58,20 proc. ir 85, 36 proc.).Šiose padermėse rezistentiškumas nustatytas 4 ir daugiau skirtingoms antimikrobinėms medţiagoms. Brazilijoje atlikto tyrimo, su sveikų (n=21) ir sergančių (viduriuojančių, (n=19)) kačių intestinaline ţarnyno mikroflora,rezultatai parodė, jog daugybinis atsparumas trims ir daugiau skirtingoms antimikrobinėms
