LIETUVOS SVE0IKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Rūta Vyšniauskaitė
Koaguliazei teigiamų ir neigiamų stafilokokų, išskirtų iš karvių
mastitinio pieno, atsparumas antibiotikams
Antimicrobial resistance of coagulase – positive and coagulase – negative
staphylococci isolated from milk from a cow's with mastitis
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Lekt.dr. Raimundas Mockeliūnas
2 DARBAS ATLIKTAS UŽKREČIAMŲ LIGŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ Koaguliazei teigiamų ir neigiamų stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, atsparumas antibiotikams“.
1. Yra atliktas mano paties/pačios;
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje;
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.
2020 12 10 Rūta Vyšniauskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. 2020 12 10 Ričardas Burneika
(data) (vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO Darbas yra baigtas ir gali būti ginamas
2020 12 10 Raimundas Mockeliūnas (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE 2020 12 10 protokolo Nr. PR-20-05
(aprobacijos data) Raimundas Mockeliūnas (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentas
Doc. Dr. Aleksandr Novoslavskij
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ...4 SUMMARY ...6 ĮVADAS...8 SANTRUMPOS...10 1. LITERATŪROS APŽVALGA………...11 1.1. Karvių mastitas ...111.2. Stafilokokų genties bakterijų morfologija ir bendrosios savybės………...15
1.3. Mastitų gydymas………...18
1.4. Antibiotikai...19
1.5. Atsparumas antibiotikams……….19
1.6. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimo būdai………..21
1.7. Antibiotikogramos ir minimali inhibicinė koncentracija……….……….22
2. TYRIMO METODAI IR ORGANIZAVIMAS ...25
2.1. Tyrimo vieta ir objektai ...25
2.2. S. aureus ir koaguliazei neigiamų stafilokokų išskyrimas ...26
2.3. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas ...27
2.3.1. Diskų metodas ………...27
2.3.2. Minimalių slopinančių koncentracijų nustatymo metodas...29
2.4. Statistinė duomenų analizė ……….………...31
3. TYRIMO REZULTATAI...32
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS……….………...38
IŠVADOS...41
4 Koaguliazei teigiamų ir neigiamų stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, atsparumas
antibiotikams 2019 – 2020 m. Rūta Vyšniauskaitė Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Darbą sudaro 47 puslapiai, pateiktos 5 lentelės, 14 paveikslėlių, iš jų 6 grafikai, 1 darbo schema ir 44 literatūros šaltiniai.
Darbo tikslas - tirti Staphylococcus aureus ir koaguliazei neigiamų stafilokokų, kurie buvo išskirti iš pieno karvių sergančių mastitu, atsparumą antibiotikams.
Darbas atliktas LSMU Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute
Tirta 187 pieno bandiniai iš karvių, sergančių mastitu. Tyrimo eigoje 91 proc. bandinių nustatyta Staphylococcus genties bakterijos. Penktadalis stafilokokų identifikuota kaip koaguliazei teigiamas stafilokokas S. aureus (19 proc.), o kiti - koaguliazei neigiami stafilokokai (81 proc.). Tyrime dažniausi buvo: S. chromogenes - 29 proc., S. warneri - 19 proc., S. haemolyticus - 14 proc., retesni - S. hominis, S. xylosus, S. capitis ss capitis, S. epidermidis, S. hominis spp. hominis. Atsparumas antibiotikams nustatytas tiriant Diskų metodu bei mažiausią slopinančią antibiotikų koncentraciją. Koaguliazei neigiami stafilokokai tyrime buvo statistiškai patikimai atsparūs (p<0,05) penicilinui (85 proc.), tetraciklinui (22 proc.) bei gentamicinui (20 proc.). S. aureus padermės buvo atsparios penicilinui (100 proc.) (p<0,05), gentamicinui (40 proc), tetraciklinui (34 proc.) bei makrolidų klasės antibiotikui eritromicinui (20 proc.).
Tarpusavyje koreliavo kiekybinio bei kokybinio jautrumo antibiotikams tyrimų rezultatai. Tačiau nustatant minimalias slopinančias bakterijų augimą antimikrobinių medžiagų koncentracijas, identifikuota daugiau atsparių koaguliazei neigiamų stafilokokų padermių ir platesniam spektrui antimikrobinių medžiagų. Tyrimo metu nustatyta didesnis kiekis atsparių meticilinui, tetraciklinui, eritromicinui, sulfametoksazoliui/trimetoprimui koaguliazei neigiamų stafilokokų padermių nei nustatyta standartiniu Diskų metodu. Taip pat minimalių slopinančių koncentracijų tyrime nustatyta
5 didėjantis atsparumas cefalosporinams, fluorchinolonams, aminoglikozidams. Beveik pusė (43,8 proc.) stafilokokų buvo atsparūs plataus veikimo spektro pusiau sintetiniam betalaktamui – ampicilinui. Taip pat tyrime gauti išsamūs duomenys, kurie parodė, kad stafilokokai išskirti iš karvių mastito yra atsparūs svarbiems žmonių gydyme chinolonų, linkozamidų, fluorchinolonų klasė antibiotikams.
6 Antimicrobial resistance of coagulase – positive and coagulase – negative staphylococci isolated from
milk from a cow's with mastitis 2019 – 2020 m.
Rūta Vyšniauskaitė Master’s Thesis
SUMMARY
Work consists of 47 pages, 4 tables, 14 pictures, 6 of which were graphs and 44 reference sources.
Objective of master’s thesis – to investigate resistance to antibiotics of coagulase positive/negative Staphylococcus aureus, which were extracted from milk.
Study was conducted in Microbiology and virology institute of the Veterinary academy, Lithuanian University of Health Science.
Were examined 187 samples of milk (cows with signs of mastitis). Staphylococcus bacteria were detected in 91% of cases. Staphylococci were identified as coagulase-positive staphylococci S. aureus (19%) and others as coagulase-negative staphylococci (81%). The most common were: S. chromogenes - 29%, S. warneri - 19%, S. haemolyticus - 14%, less common - S. hominis, S. xylosus, S. capitis ss capitis, S. epidermidis, S. hominis spp. hominis. Antibiotic resistance was determined by the disc method as well as the lowest inhibitory concentration of antibiotics. Coagulase-negative staphylococci were statistically significantly resistant (p <0.05) to penicillin (85%), tetracycline (22%) and
gentamicin (20%). S. aureus strains were resistant to penicillin (100%) (p <0.05), gentamicin (40%), tetracycline (34%), and the macrolide antibiotic erythromycin (20%).
The results were correlated of quantitative and qualitative sensitivity to antibiotics. However, more strains of staphylococci and a wider range of antimicrobials have been identified by setting minimum inhibitory concentrations of antimicrobials. The study revealed higher levels of coagulase-negative staphylococcal strains resistant to methicillin, tetracycline, erythromycin, sulfamethoxazole / trimethoprim than the standard Disk method. Increasing resistance was also found in the study of
7 minimum inhibitory concentrations to cephalosporins, fluoroquinolones, aminoglycosides. Almost half (43.8%) of staphylococci were resistant to a broad-spectrum semi-synthetic beta-lactam, ampicillin. Isolated staphylococci are resistant to quinolones, lincosamides, fluoroquinolones antibiotics witch is important in the treatment of humans.
8
ĮVADAS
Pieninės gyvulininkystės ūkiuose mastitas išplitęs tarp 30,0 – 40,0 proc. melžiamų karvių. Ligą sukelti gali dirginimas, traumos, tačiau pagrindinė priežastis – bakterijos, jų skaičiuojama daugiau nei 150 rūšių. Bandose, kurių piene nustatomas didelis somatinis ląstelių skaičius (SLS), 79 proc. atvejų ligą sukelia Staphylococcus, Streptococcus genčių bakterijos (1).
Mastitas – pieno liaukos uždegimas. Jam yra būdinga skirtinga etiologija, ligos sunkumas bei baigtis. Karvių mastitas labai aktuali problema tarp pieninių karvių bei viena pagrindinių priežasčių dėl ko pieno pramonė patiria didelius ekonominius nuostoliusi (2). Galvijų mastitas dažnai laikoma infekcine liga, kurią gali sukelti daugybė mikrobų rūšių. Vienas labiausiai paplitusių patogenų mastitiniame piene – S. aureus, kuris gali sukelti ir žmonių, kurie vartoja pieną, sveikatos sutrikimus (2). Jis identifikuojamas gausiausiai ir laikomas patogeniškiausiu žmonėms bei gyvūnams. Sukėlėjas greitai patenka į audinius tešmenyse ir gali suformuoti darinius neturinčius sienelių. Taip pat stafilokokų genties bakterijos išskiria β – laktamazę, ji skaido antibiotikų struktūroje esantį β – laktaminį žiedą. Taip antimikrobinės medžiagos yra inaktyvuojamos ir pačių sukelėjų sienelė lieka nepakitusi (4).
Mastito gydymui dažniausiai yra naudojami antibiotikai. Jie švirkščiami į tešmenį arba į raumenis: beta laktamai, tetraciklinai, makrolidai, cefalosporinai, linkozamidai. Taip pat gydymui yra sukurta ir kompleksinių preparatų, sudėtyje turinčių daugiau kaip du antibiotikus (5). Dažnas ir nepagrįstas antibiotikų naudojimas prisideda prie atsparių mikroorganizmų vystymosi. Bakterijų atsparumas antibiotikams – pasiekęs pavojingai aukštą lygį daugelyje šalių. Yra nustatomi nauji bakterijų antibiotikams atsparumo mechanizmai, keliama grėsmė gebėjimui valdyti infekcijas. Tie patys antibiotikai yra naudojami ir žmonių, ir gyvūnų gydymui. Pasaulyje bakterijų atsparumo problema yra sprendžiama, o ypatingai didelis dėmesys yra kreipiamas į gyvūnams gydyti naudojamus, žmonėms kritiškai svarbius, antibiotikus, siekiant išlaikyti jų efektyvumą kuo ilgesnį laiką (6).
Lietuvoje tyrimai dėl bakterijų ir jų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms atliekami jau nuo seno (taip pat ir S. aureus, sukeliančių karvių mastitą). Tačiau mastito sukėlėjų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms būklė yra žinoma tik atskirai tirtuose ūkiuose ir atsparumas nuolatos keičiasi. Koaguliazei neigiami stafilokokai yra spenio odos oportunistai, kurie paprastai gyvena ant tešmens odos ir nesukelia sunkiai gydomo mastito. Tačiau pastaraisiais metais atlikti tyrimai požiūrį pakeitė. Tyrėjai nurodo, kad iki 30 koaguliazei neigiamų stafilokokų rūšių yra galvijų
9 mastito priežastis. Lietuvos tyrėjai Aniulis E., Japertas S. dar 2001 m. nurodė, kad mažėjant S. aureus (40 proc. atvejų) sukelto mastito, koaguliazei neigiamų stafilokokų vaidmuo mastito etiologijoje sparčiai didėja (59,8 proc. atvejų). Tampa vis dažnesni, sunkiai gydomi mastitai, kurių etiologinis faktorius – koaguliazei neigiami stafilokokai. Veterinarijoje mastitams gydyti naudojamiems antibiotikams didėja mikrobų atsparumas šiems vaistams. Pienininkystės ūkiai atliko S. aureus sukeltu mastitu sergančių karvių stebėseną, gydymą, likvidavimą, tačiau kilo nauja problema, tai koaguliazei neigiamų stafilokokų atsparumas antibiotikams. Atsparūs antibiotikams mikroorganizmai plinta gyvūnų bandose, jų sukeliamos ligos yra sunkiai gydomos. Mastitą sukelia įvairios stafilokokų rūšys, todėl reikia stebėti, žinoti labiausiai paplitusius mastito sukėlėjus ir jų atsparumą. Nors pageidaujama, kad esant mastitui būtų nustatyta bakterijų jautrumas antibiotikams kiekvienu atveju, praktika rodo, kad tas atliekama ne visada. Kol taikomas ir empirinis antibiotikų parinkimas gydymui, reikia žinoti atskirų bakterijų rūšių ir populiacijų jautrumą antibiotikams atskirame regione. Tokie duomenys turėtų būti nuolat atnaujinami, nes situacija nuolat kinta. Bakterinio atsparumo nustatymui reikia nuolatos tirti išskirtas padermes ir parinkti tinkamą gydymą (7). Taigi pieno ūkiuose, tyrimai tebeišlieka aktualūs, kadangi Staphylococcus genties bakterijų savybės bei paplitimas kinta.
Darbo aktualumas: Lietuvos ūkiuose bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms nėra nuosekliai tiriamas, todėl šiame darbe norėjome ištirti mastitinio pieno mėginius iš įvairių Lietuvos ūkių ir palyginti Staphylococcus genties bakterijų atsparumus atskiroms antimikrobinėms medžiagoms arba jų grupėms.
Tikslas: tirti Staphylococcus aureus ir koaguliazei neigiamų stafilokokų, kurie buvo išskirti iš pieno karvių sergančių mastitu, atsparumą antibiotikams.
Uždaviniai:
1. Surinkti karvių mastitinio pieno bandinius bakteriologiniams tyrimams 2. Išskirti ir identifikuoti stafilokokų rūšis
3. Nustatyti stafilokokų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
10
SANTRUMPOS
PSO - Pasaulio sveikatos organizacija KNS – koaguliazei neigiami stafilokokai KTS – koaguliazei teigiami stafilokokai MDA – manito druskos agaras
MH – Miulerio-Hintono (Mueller-Hinton) agaras SLS – somatinių ląstelių skaičius
MSK – minimali slopinanti koncentracija MIK – minimali inhibicinė koncentracija
MASA – meticilinui atsparus Staphylococcus aureus P – penicilinas E – eritromicinas SXT – trimetoprimas/sulfametoksazolis CN – gentamicinas CIP – ciprofloksacinas FOX – cefoksitinas TE – tetraciklinas
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Karvių mastitas
Mastitas – pieno liaukos uždegimas (8). Išvystytose pieninės gyvulininkystės šalyse mastitas išplitęs tarp 30,0 – 40,0 proc. melžiamų karvių. Ligą sukelti gali dirginimas, traumos, tačiau pagrindinė priežastis – bakterijos, jų skaičiuojama daugiau nei 150 rūšių. Bandose, kurių piene nustatomas didelis somatinis ląstelių skaičius (SLS), 79 proc. atvejų ligą sukelia Staphylococcus, Streptococcus genčių bakterijos (1).
1 pav. Mastitu sergančios karvės tešmuo (9)
Pienas, gautas iš segančių karvių, turi skirtingą cheminę sudėtį lyginant su pienu, gautu iš sveikų karvių. Pieno cheminė sudėtis darosi panašesnė į kraujo, kuomet stiprėja uždegimas, kadangi sudėtinės dalys yra filtruojamos į pieno liauką iš kraujo apytakos. Sausosiose pieno medžiagose esminių sudedamųjų dalių sumažėja nuo 5 iki 15 proc. Stipriai kinta riebalų sudėtis: daugėja nesočiųjų (didelės molekulinės masės) riebalų rūgščių. Tokie pokyčiai paskatina lipolizę (riebalų skaidymą). Dėl šios priežasties pieno produktų kokybė suprastėja. Piene, kuris yra paveiktas uždegimo, net 11 – 25 proc. mažiau bendrojo kazeino, o išrūginių baltymų daugiau nei įprastai. Tokiame piene suaktyvėja fermentų, skaidančių baltymus, veikla: baltymai skaidomi ne vien tešmenyje bei išmelžtame piene, tačiau ir produktuose pagamintuose iš jų. Sergančių mastitu karvių piene pasikeičia mineralų bei mikroelementų kiekis. Tai nulemia ir pieno perdirbimo savybes bei maistinę vertę. Pieno, kuris turi daug somatinių ląstelių, nesuperka perdirbėjai (1 lentelė), o pagaminti produktai kenkia juos vartotojančių žmonių sveikatai, todėl mastitai yra ir ekonominė, ir socialinė problema (10).
12
1 lentelė. Pieno sudėties ir kokybės rodikliai (10)
Rodiklis Norma
Užterštumas bakterijomis, ne daugiau kaip, tūkst./cm3
100
Somatinių ląstelių skaičius, ne daugiau kaip, tūkst./cm3
400
Inchibitorinės medžiagos Neturi būti
Pieno užšalimo temperatūra, ne aukštesnė kaip, °C
0,5
Mastitu sergančioms karvėms yra iki 1,5 karto didesnė tikimybė anksčiau tapti brokuotoms negu nesirgusioms. Nustatyta, jog mastitai paveikia ir karvių reprodukciją: ilgėja intervalai tarp apsiveršiavimo, apsisėklinimo, mažėja apsisėklinimo rodikliai bei atsiranda didesnė tikimybė embriono praradimui. Mastitai turi neigiamą poveikį karvių gerovei, jų gydymui reikia papildomų lėšų, veterinarinių paslaugų, o dalį produkcijos tenka pašalinti. Netiesioginiai nuostoliai yra siejami su pieno primelžimo sumažėjusiais kiekiais, trumpesniu laktacijos periodu, prastesne pieno kokybe, ankstesniu užtrūkinimo laiku (3).
Mastitą gali sukelti biologiniai, cheminiai, fiziniai bei mechaniniai veiksniai, bet dažniausiai mastito priežastis būna infekcinė (virusai, bakterijos, grybeliai). Pasitaiko ir neinfekcinių mastitų, pavyzdžiui, kilusių dėl mechaninių traumų. Dabar vis daugiau mastito sukelėjų yra nustatoma moderniais molekuliniais metodais (10). Dabar yra žinoma maždaug 150 skirtingų patogenų. Patogeniniai mikroorganizmai patenka į pieno liauką per spenio kanalą, limfą, kraują (11). Pienas yra puiki terpė mikroorganizmų dauginimuisi, tad daugelis mikroorganizmų, patekusių iš aplinkos į tešmenį, išlieka gyvybingi, dauginasi bei esant palankioms sąlygoms turi galimybę sukelti uždegimą. Pagrindinis sukėlėjo patekimo į tešmenį kelias yra galaktogeninis – per melžėjų rankas, melžimo įrangą, pašluostes. Nuo sukėlėjo koncentracijos ir virulentiškumo priklauso uždegimo laipsnis (12).
Mastitas tai daugiafaktorinė liga ir rizikos veiksnius galima skirstyti į ligą lemiančių veiksnių grupes – tai sukėlėjas, šeimininkas ir aplinka. Mastitas gali būti neinfekcinės bei infekcinės kilmės, eiga: žaibinė ūmi, lėtinė slaptoji (latentinė). Mastito sukelėjai yra klasifikuojami į kontaginius (užkrečiamus) ir aplinkos. Kontaginį mastitą gali sukelti Streptococcus agalactiae, Staphylococcus
13 aureus ir Mycoplasmas spp. Sukelėjų pagrindinis ligos šaltinis yra sergantys gyvuliai. Dažniausiai kontaginiu mastitu užsikrečiama per melžimo įrenginius. Norint išvengti šių infekcijų yra mirkomi speniai po melžimo, skiriamas didelis dėmesys užtrūkusioms karvėms ir sergančių karvių pašalinimui iš bandos. Buvo nustatyta, jog viena karvė, užsikrėtusi S. aureus gali perduoti sukelėją dar 6 – 8 karvėms per tą patį melžimo aparatą (13). E. col ir S. uberis bakterijos dažniausiai siejamos su aplinkos mastitais. Pagrindinis E. coli šaltinis aplinkoje – išmatos, dėl to, bet koks tešmens kontaktas su išmatomis, gali būti koliforminio mastito priežastimi. S. uberis taip pat randama išmatose, bet dažniausiai pas karves aptinkama ant odos. Jos ilgai išlieka gyvybingos šiauduose, tad visi organiniai pakratai yra rizikos faktorius mastitams, nes juose gali daugintis įvairios bakterijos. Taip pat melžimo metu yra įmanomas užsikrėtimas E. coli ir S. uberis bakterijomis, ypač S. uberis, tad labai svarbu užtikrinti geras higienos sąlygas melžimo aikštelėse ir fermose aplinkos mastitų profilaktikai. Karvių brokavimas neužkerta kelio infekcijai, nes patogenas nebūna pašalintas iš aplinkos (14).
Yra skiriamios dvi pagrindinės mastitų formos: klinikinė, kai ligos požymiai yra gerai matomi, ir subklinikinė, kai stebimas pokytis būna tik padidėjęs somatinių lastelių skaičius piene. Subklinikiniai mastitai nustatomi net iki 15 – 40 kartų dažniau nei klinikiniai ir vyrauja daugelyje ūkių. Klinikinio mastito paplitimas bandose dažniausiai sudaro 2 – 5 procentus. Mastito forma priklauso nuo ligos sukelėjo. Klinikinį mastitą gali sukelti S. uberis, E. coli, Pseudomonas, Klebsiella ir kitos bakterijos, o prie subklinikinių mastitų dažniau yra nustatomi koaguliazei neigiami stafilokokai. S. aureus yra dažniausiai iš pieno izoliuojama bakterija ir gali sukelti tiek klinikinį mastitą, tiek subklinikinį. Rizikos faktorių, galinčių sukelti mastitą yra daugybė. Pradedant anatominėmis (liaukos ketvirčių padėtimis, atstumo tarp grindų ir spenių), baigiant gyvulio veisle, amžiumi, laktacijos periodu, produktyvumu. Ligos pasireiškimui įtakos turi ir šėrimas, laikymo sąlygos, higiena, melžimas (3).
Mastito sukelėjas pirmiausia turi patekti į pieno liauką, kad sukeltų pieno liaukos uždegimą. Patogenai į pieno liauką dažniausiai patenka per spenio kanalą ir retesniais atvejais per limfinę ar kraujatokos sistemas. Karvės spenio kanalas yra kelių milimetrų ilgio, ir toks atstumas skiria liauką nuo patogenų, esančių aplinkoje. Melžimo greitis yra susijęs su šio kanalo diametru, o taip pat jis yra svarbus faktorius karvių selekcijai. iš kitos pusės platesni spenių kanalai yra siejami su didesne rizika spontatiniam pieno tekėjimui, mastitams. Mikroorganizmai patekę į pieno liauką kolonizuoja audinį ir pradeda daugintis. Bakterijų sukeltos infekcijos (tiek gramteigiamų, tiek gramneigiamų) padidina uždegimo mediatorių (interlaukino-1 (IL-1), navikų nekrozės faktoriaus–α (TNF-α), uždegiminių eikozanoidų (biologiškai aktyvūs junginiai, gaminami iš arachidono rūgšties)) koncentracijas. Uždegiminiai mediatoriai skatina leukocitų migraciją į tešmenį.
14 Intramaminė infekcija, sukelta gramneigiamų bakterijų, jų lipopolisacharidų (taip pat žinomų kaip endotoksinų), gali sukelti karščiavimą, ūmų uždegimą. Dėl mikrokraujagyslių, kapiliarų endotelio pralaidumo padidėjimo yra pažeidžiama pieno liaukos barjero funkcija ir atsiranda skausmas, patinimas ir karštis (15). Somatinės ląstelės – tai daugiausia yra į pieną išskirtos epitelio ląstelės, kurios buvo pašalintos iš liaukos gleivinės, bei į pieną patekusios baltosios kraujo ląstelės (leukocitai), liaukai reaguojant į traumą ar infekciją (11).
Somatinės ląstelės yra normaliai piene randamos ląstelės, kurios yra keletos rūšių (2 lentelė ): neutrofilai, makrofagai, limfocitai, eozinofilai ir įvairios pieno liaukos epitelinės ląstelės (16). Sveiko tešmens piene esančios ląstelės daugiausia yra iš pieno liaukos epitelio ir nutekamųjų latakų ląstelių (13). Somatinių ląstelių koncentracija piene yra apibrėžiama kaip somatinių ląstelių skaičius (SLS) ir matuojamas tūkstančiais ląstelių mililitre pieno. Pienas, gautas iš normalaus, sveiko tešmens, dažniausiai turi mažiau nei 100,000 SLS/ml., o karvių , sergančių mastitu SLS smarkiai išauga ≥200,000 SLS/ml (16). SLS paprastai išreiškiamas ląstelių skaičiumi kubiniame centimetre arba mililitre.
15
2 lentelė. Ląstelių rūšys, randamos normaliame galvijų piene. Infekuoto ketvirčio SLS sudarančios
ląstelės (11)
Ląstelių rūšis Ląstelių skaičius proc. Normaliame galvijų piene
Neutrofilai 0–11
Makrofagai 66–88
Limfocitai 10–27
Epitelinėsląstelės 0–7 Infekuoto ketvirčio SLS sudaro:
Baltieji kraujo kūneliai 99
Pieno sekrecijos ląstelės iš pieno liaukos audinių
1
Karvių pieno liaukos atsparumo ir imlumo viduliaukinėms infekcijoms indikatorius yra somatinės ląstelės. Sveikoje pieno liaukoje vyraujančios ląstelės yra epiteliocitai, o leukocitai dominuoja ankstyvo uždegimo procese. Leukocitai atlieka apsauginį vaidmenį prieš pieno liaukos infekcines ligas. Somatinės ląstelės atlieka dvi funkcijas: fagocituoja infekcinius mikroorganizmus ir padeda atkurti infekcijos ar traumos pažeistus pieno sekrecijos audinius. Tad dažniausia SLS padidėjimo priežastis yra tešmens uždegimas – mastitas (11).
1.2 Stafilokokų genties bakterijų morfologija ir bendrosios savybės
Stafilokokai yra laikomi vienomis iš dažniausiai mastitą sukeliančių bakterijų. Auksinis stafilokokas – Staphylococcus aureus subsp. aureus tipas Firmicutes, klasė Bacilli, eilė Bacillales,
16 šeima Staphyllococcaceae, gentis Staphylococcus (2 pav.) Tai gramteigiamos bakterijos, apvalios ląstelės (kokai), 0,6–1,0 μm ilgio (17).
2 Pav. Staphylococcus aureus (18)
Normaliomis sąlygomis jos būna pavienės, sukibusios poromis ar sudaro klasterius. Kolonijos turi aiškius kraštus, pigmentacija yra varijuojanti nuo oranžinės pilkos iki geltonos ar pilkos. Ląstelės membranoje kaupiasi pigmentai triterpenoid-karotinoidai. Kolonijų diametras > 5 mm. Nejudrios, sporų nesudaro. Normaliomis sąlygomis neinkapsuliuota arba iš dalies kapsuliuota. Mažesnes kolonijas sudaro inkapsuliuoti štamai. Kapsulės sudėtyje yra randama N-acetil-D-amino-galaktourono rūgštis, N-acetil-Dfukozaminas bei taurinas. Sienelė ląstelėje yra sudaryta iš peptidoglikano (turinčio L-lizino) bei teichoinės rūgšties (sudėtyje yra ribitolis bei N-acetilgliukozaminas). Peptidoglikano tipas yra L-Lys-Gly5-6. Membraną ląstelėje sudaro glikolipidai, mono- ir digliukozil-digliceridai ir fosfolipidai, lizilfosfadidilglicerolis bei kardiolipinas. Chemoorganotrofai: būdingi kvėpavimo bei fermentacijos metabolizmo keliai. Kaip energijos bei anglies šaltiniai gali būti panaudojamos aminorūgštys bei angliavandeniai. Reiklūs mitybinei terpei: būtinas azotas aminorūgščių pavidale bei B grupės vitaminai. Gerai auga terpėje, kuri turi 10 proc. NaCl, prasčiau toje, kuri turi 15 proc. NaCl. Augimui palanki temperatūra +10 – +45 ºC, optimali – +30 – +37 ºC. Fakultatyviniai anaerobai geriausiai auga aerobinėmis sąlygomis (19). Sintetina katalazę, fermentuoja angliavandenius bei sudaro pieno rūgštį (17).
Šios genties bakterijos yra vertinamos pagal fenotipines ir genotipines savybes. Prie stafilokokų genties priskiriamos 42 rūšys ir 24 porūšiai. Dažniausiai šios bakterijos klasifikuojamos į dvi grupes: sintetinančios fermentą koaguliazę, ir nesintetinančios.
17 Stafilokokų virulentiškumas pasireiškia įvairiomis infekcijomis žmonių ir gyvūnų organizmuose (20, 21). Žmogaus ir gyvūnų organizme stafilokokai gyvena kaip komensalai, bet susilpnėjus imuninei šeimininko sistemai, gali tapti patogeniškos. Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, Staphylococcus pseudintermedius yra koaguliazės teigiamosios padermės, aktualūs patogenai medicinoje ir veterinarijoje. Staphyloccus epidermis ir Staphylococcus saprophyticus – koaguliazės neigiami stafilokokai, jos sukelia žmonėms šlapimo takų ir kvėpavimo infekcijas (22). Visame pasaulyje stafilokokų sukeltos infekcijos yra aprašytos bei ištirtos daugelio šalių mokslininkų. Apie 30 proc. žmonių savo organizmuose turi Staphylococcus aureus bakterijų (23). Susiduriama su problemomis, kaip suvaldyti šių bakterijų plitimą gydymo įstaigose, tam tikruose regionuose (24). Pastarąjį dešimtmetį greitai tobulėjantys tyrimo metodai ir technologijos mokslininkams leido išanalizuoti stafilokokų genomus ir duomenų bazėse sukaupti duomenis. Juos vartojant galime palyginti tam tikras rūšis, išskirtas iš skirtingų regionų įvairių šaltinių ir taip vykdyti jų stebėseną (25). Stafilokokai išskiria, sintetina egzotoksinus. Visos S. aureus padermės gali sintetinti keletą pirogeninių egzotoksinų bei taip sukelti imuninį atsaką. Šie bakterijų baltymai yra patogeniški ir susiję su tam tikromis žmonių ligomis. Stafilokokų enterotoksinai yra skirtingų stafilokokų rūšių išskiriami toksinai. Šiuos toksinus išskiria S.aureus, nors juos išskiria ir kitos šios genties bakterijos (26). Enterotoksinai yra termostabilūs ir neutralizuoja virškinimo fermentus. Jie skirstomi į kelis tipus, daugelis susiję su maisto produktų sukeltais apsinuodijimais (27). S. aureus – pagrindinis maisto nuodytojas, patogenas, kuris sukelia furunkuliozę, pneumoniją, toksinę epiderminę nekrozę, osteomielitą, miokarditą, ūmų endokarditą, perikarditą, mastitą, enterokolitą, cistitą, cervititą, prostatitą, meningitą, cerebritą, toksinio šoko sindromą (dėl sintetinamų enterotoksinų), abscesus bei hospitalinę infekciją. Tam tikri štamai turi galimybę sintetinti epidermolitinius toksinus. Šiuo metu yra žinomi 5 bakterijų sintetinami enterotoksinai A, B, C, D bei E. Egzistuoja 3 enterotoksino C formos. Jautrūs lizuojančiam lizostafino poveikiui bei atsparūs lizocimo poveikiui. Jautrūs furazolidonui, novobiocinui bei nitrofuranui, fenoliams bei jų dariniams, salicilanilidams, karbanilidams bei jų dariniams. Atsparus nedidelėms eritromicino bei bacitracino koncentracijoms. Atsparus penicilinui G bei neretai atsparus meticilinui. S. aureus štamai, kurie yra atsparūs meticilinui yra žymimi MRSA (angl. methicillin-resistant S. aureus). Pastaraisiais metais plinta S. aureus štamai, kurie yra atsparūs vankomicinui (19).
18
3 Pav. S. aureus rezistentiškumas (19)
Stafilokokai sukelia 27 – 69 proc. karvių mastito atvejų valstybėse, kurios plėtoja gyvulininkystę. Tai plazmokoaguliaziškai teigiami (KTS) bei plazmokoaguliaziškai neigiami (KNS) stafilokokai – S. chromogenes, S. simulans, S. epidermidis, S. intermedius, S. haemolyticus, S. warneri, S. sciuri, S. delphini, S. xylosus, S. schleiferi subs. coagulans bei koaguliaziškai kintamas S. hyicus (1).
Lietuvoje pagrindiniai mastito sukėlėjai yra Staphylococcus genties bakterijos, jomis karvės užkrečiamos melžiant. Didžiojoje dalyje atvejų mastitiniame piene yra nustatomos šios stafilokokų rūšys: S. aureus, S. epidermidis bei S. hyicus. Patogenas yra labai virulentiškas, nes vos dešimties bakterijų užtenka, jog patekus į tešmenį karvė galėtų susirgti tešmens uždegimu. Sukėlėjas įsiskverbia į tešmens audinius, po šešių valandų jis jau gali būti randamas tešmens parenchimoje. Patekę į parenchimą sukėlėjai sudaro mikropūlinukus. Iš šių inkapsuliuotų pūlinukų, nusilpus organizmui, bakterijos iš naujo patenka į alveoles ir uždegimas atsinaujina. Sukėlėjas gali formuoti bakterijų L formas, sienelių neturinčius darinius. Dėl to auksiniai stafilokokai tampa atsparūs antibiotikams, kurie būtent ir veikia ląstelių sieneles. Dėl šių savybių S. aureus yra patogeniškas gyvūnams ir žmonėms, dėl to laikomas reikšmingiausiu KTS (19). S. aureus – koagulazei teigiamas stafilokokas, galintis augti 7 – 48°C temperatūroje, atsparus kaitinimui 70°C temperatūroje 30 min., o 80°C –10 min. Stafilokokai dauginasi ir gamina toksinus įvairiose medžiagose (1).
19 Mastitais sergančios karvės yra gydomos antimikrobiniais preparatais. Jie švirkščiami į tešmenį ar į raumenis. Jei mastitas yra sukeltas streptokokų, gydoma dažniausiai naudojant siauro veikimo spektro antibiotikus – natūralius ir pusiau sintetinius penicilinus, eritromiciną, linkomiciną. Esant mišriai infekcijai, taikomi ir plataus veikimo spektro antibiotikai – tetraciklinai, ampicilinas, gentamicinas, ar cefalosporinai. Dažniausiai mastitu sergančioms karvėms gydyti skiriamas ne vienas, o keli antibiotikai, kurie veikia kompleksiškai. Norint sustiprinti antimikrobinį poveikį, sustabdyti atspariųjų mikroorganizmų plitimą, bei sumažinti toksiškojo antibiotiko dozę – taikomas kombinuotas gydymas, panaudojant keletą antimikrobinių medžiagų iš skirtingų klasių. Taigi joms vystosi mikroorganizmų atsparumas (28).
1.4 Antibiotikai
Antibiotikai – tai medžiagos, vartojamos ligoms gydyti, kurios slopina mikroorganizmų dauginimąsi (23). Atsparios bakterijos aplinkoje buvo jau daug metų, o ne atsirado tada, kai buvo pradėti naudoti pirmi antibiotikai. Kaip ir genai, lemiantys atsparumą naujausiems sintetiniams antibiotikams. Prototipai - jų genomuose (29).
Antibiotikais skatinamas gyvūnų augimas, gydomos infekcijos. Pasaulio medicinoje naudojama daugiau nei 4000 junginių su antimikrobinėmis savybėmis. Vieni antibiotikai slopinantys bakterijų augimą, kiti – slopinantys baltymų sintezę (pvz., aminoglikozidai, makrolidai ir tetraciklinai), ribonukleorūgščių sintezę (pvz., rifampinai), DNR replikaciją bakterijose (pvz., chinolonai), jų sienelės susidarymą (pvz.: cefalosporinai,iipenicilinai, glikopeptidai). Infekcinėms ligoms gydyti plačiausiai vartojami natūralūs arba pusiau sintetiniai antibiotikai. Greta mikrobiologinės kilmės antibakterinių junginių (antibiotikų), infekcijoms gydyti taip pat yra vartojami sintetiniai antibakteriniai prieparatai: oksazolidinonai, slopinantys baltymų sintezę, fluorochinolonai, stabdantys bakterijų DNR replikaciją arba sulfonamidai, kurie slopina folio rūgšties sintezę. Antibiotikų klasė ir koncentracija lemia jų veiksmingumą (30, 31).
1.5 Atsparumas antibiotikams
Bakterijos, ir jų augantis atsparumas antibiotikams, kelia neramumą ir veterinarijoje bei medicinoje. Padidėjęs antibakterinių ir priešgrybelinių preparatų vartojimas pastaraisiais metais
20 sukėlė ir padidėjusį bakterijų atsparumą šiems vaistams (32). Atsparumo mechanizmai aiškinami genų transmija: atsparumą gali lemti genai, kurie galbūt yra perduodami tarp pačių bakterijų (33). Pasaulyje kiekvienais metais, dėl atsparių antibiotikams bakterijų sukeltų infekcijų, miršta 700000 žmonių (34).
Bakterijos labai greitai įgyja atsparumą antibiotikams, nepriklausomai nuo to, jog mokslininkai sukuria vis naujus vaistus. Ir jeigu nebus imamasi griežto ir atsakingo antibiotikų vartojimo, pasaulis grįš į laikotarpį, kada antibiotikai dar nebuvo atrasti, ir nuo smulkiausių sužalojimų žmonės bei gyvūnai mirs (35).
Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, į pavojingiausių bakterijų sąrašą šiuo metu įtrauktos šios rūšys: Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes/cloacae, Enterococcus faecalis/faecium, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhi/Paratyph (35, 36).
Gyvūnams ir žmonėms gydyti naudojami antibiotikai yra skirstomi į kritiškai svarbius, labai svarbius ir svarbius. 2016 metais PSO paskelbė, jog didžiausias dėmesys ir bakterijų atsparumo situacija turėtų būti stebima šiems antibiotikams (3 lentelė) (36).
3 Lentelė: Kritiškai svarbių antibiotikų sąrašas (36)
Žmonėms kritiškai svarbūs antibiotikai (pagal PSO)
Gyvūnams kritiškai svarbūs antibiotikai (pagal PGSO (OIE))
3 ir 4 kartų cefalosporinai Aminoglikozidai
Fluorochinolonai Cefalosporinai Aminoglikozidai Makrolidai Makrolidai Penicilinai Karbapenemai Chinolonai Glikopeptidai Fenikoliai Glicilciklinai Sulfonamidai Oksazolidinonai Tetraciklinai Penicilinai Spektinomicinas Polimiksinai Antituberkulioziniai vaistai
21 Pastarąjį dešimtmetį Europoje skiriamas didelis dėmesys didėjančiam bakterijų atsparumui. Keliamos grėsmės yra aktualios ir Lietuvai. Čia nuolat atliekami atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimai. Bakterijų genų mutacijos ir atsparumas antibiotikams tampa natūraliu reiškiniu. Gyvūnai gali užsikrėsti bakterijomis, kurios yra atsparios žmonių infekcijoms gydyti vartojamiems antibiotikams. O kai kurios atsparios bakterijos gali būti perduodamos iš gyvūnų žmonėms per maisto grandinę (37).
Visose srityse – medicinoje, veterinarijoje, žemės ūkyje bei maisto pramonėje – turi būti vykdoma antibiotikų stebėjimo kontrolė, nes antibiotikų suvartojimo kiekiai vis dažniau įvardijami kaip pagrindinė bakterijų atsparumo antibiotikams priežastis (38).
Bakterijų atsparumas antibiotikams vystosi dviem būdais: dėl savaiminės mutacijos arba dėl horizontalių genų perdavimo. Bet kuriuo atsparumo keliu bakterijos yra apsaugomos nuo antimikrobinių medžiagų grėsmių, vienu ar keliais iš šių mechanizmų: antibiotikų skaidymas ar modifikacija, aktyvus antibiotikų ištekėjimas iš bakterijų, sumažėjęs membranos pralaidumas antibiotikui arba alternatyvaus metabolizmo įgijimas (39).
1.6. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimo būdai
Bakterijų jautrumui/atsparumui vertinti naudojami keletas standartizuotų tyrimų metodų: Kirby-Bauer metodas; Stokes metodas; Agaro skiedimo metodas; Terpės skiedimo metodas; Epsilometrinis testas (E-test) (19, 21).
Antibiogramos yra bakterijų atsparumo antibiotikams/kitoms antimikrobinėms medžiagoms nustatymas laboratorijoje. Dažniausiai naudojamas Kirby-Bauer metodas dėl nesudėtingo atlikimo ir ekonominio pagrįstumo. Šie tyrimai privalo būti atliekami ypač tiksliai, nes tai turi įtakos interpretuojant slopinimo zonų skersmens skirtumus. Mikroorganizmai, atsparūs in vitro, gali būti laikomi atspariais antibiotikams. Šiuo metodu yra paimamos 3 – 5 panašios kolonijos iš šviežios kultūros, išmaišomos 2 – 4 ml triptikazės buljone ir inkubuojama 4 – 6 val. Tuomet, steriliu tamponu, kultūra užsėjamas visus MH (Mueller Hinton) agaro lėkštelės paviršius, leidžiama nudžiūti kelias minutes. Uždedami antibiotikų diskai ant užsėto agaro paviršiaus ir lėkštelės (apverstos) inkubuojamos 35 – 37 °C temperatūroje 18 – 24 val. Zonų skersmuo išmatuojamas milimetrais ir remiantis EUCAST ar CLSI standartuose pateiktais duomenimis įvertinamos kaip jautrios, mažiau jautrios ir atsparios (12).
Stokes metodas yra diskų difuzijos metodo atmaina ir naudojamas įprastiniam bakterijų jautrumo tyrimui. Šiame metode naudojamas rinkinys standartinių štamų, priklausomai nuo tyrimo tikslo: kontrolinis štamas E. coli NCTC 10414, skirtas koliforminių bacilų, išskirtų iš šlapimo takų,
22 tyrimui; kontrolinis štamas P. aeruginosa NCTC 10662 – tiriant bakterijų jautrumą aminoglikozidams. Šiame tyrime diskai su antibiotikais yra taikomi standartiniam ir tiriamam inokuliatui. Inhibicijos zonos susidaro aplink kiekvieną diską. Suspensijos drumstumas sureguliuojamas, kad atitiktų 0,5 McFarland standartą. Sterilia kilpele kontrolinė kultūra yra užnešama dviem juostomis iš abiejų pusių, paliekant centrinę juostą neinokuliuotą. Tiriamasis mėginys sėjamas lėkštelės centrinėje dalyje nepaliečiant abiejų pusių. Diskai su antibiotikais uždedami ant linijos tarp tiriamų ir kontrolinių bakterijų ir švelniai prispaudžiami. Turi būti išlaikomas minimalus atstumas 20 mm tarp dviejų diskų; 85 mm diametro lėkštelėje gali būti patalpinti keturi diskai. Zonų dydis matuojamas nuo diskų krašto iki zonos krašto. Inhibicijos zonų palyginimas tarp standartinio ir tiriamojo štamo rodo tiriamųjų bakterijų jautrumą. Bakterijos vertinamos kaip jautrios, kai zonos diametras lygus arba didesnis, arba ne daugiau kaip 3 mm mažesnis už kontrolę; vidutinio jautrumo, kai zonos dydis didesnis nei 2 mm, bet mažesnis už kontrolę daugiau kaip 3 mm; atsparios – zonos dydis mažiau kaip 2 mm (40).
1.7 Antibiotikogramos ir minimali inhibicinė koncentracija
Minimali inhibicinė koncentracija (MIK) – mažiausia antibiotiko koncentracija, dar slopinanti bakterinės kultūros augimą. Antibiotikogramos tikslas yra nustatyti ar mikroorganizmai, išaugę iš specifinio organizmo židinio, yra jautrūs ar rezistentiški konkrečiam antibiotikui ar jų grupei. Šio tyrimo atsakymo galima tikėtis maždaug kitą dieną, kai išauga kolonijos. Kai nustatoma MIK (minimali inhibitinė koncentracija, slopinanti bakterijų kolonijos augimą), tuomet galima tinkamai pasirinkti antimikrobinės terapijos dozę. Ji turi viršyti MIK koncentraciją infekcinio židinio vietoje 2 – 4 kartus. Tinkamo antibiotiko parinkimas yra labai svarbus norint mažinti bakterijų atsparumo antibiotikams vystymąsi (40).
Agaro skiedimo metodas. Agaro skiedimo metodas yra kiekybinis metodas, kurio metu nustatoma tiriamo bakterijų štamo minimali inhibitorinė (slopinamoji) antibiotikų koncentracija (MIK). Šis metodas yra veiksmingas tiriant infekcinių bakterijų izoliatus. Agaro terpėje yra paruošiami kelių praskiedimų antibiotikų tirpalai supilami į Petri lėkšteles. Skiedžiama nedideliu kiekiu vandens pridedant į agarą, agaras tirpinamas iki 60 °C temperatūros ir atvėsinamas. Kai lėkštelės išpilstytos, jos gerai išdžiovinamos inkubatoriuje 37 °C temperatūroje 30–60 min. Lėkštelės paviršius turi būti sausos prieš atliekant tyrimą. Agaro skiedimo metodika patogi, nes galima tirti keletas štamų kiekvienoje lėkštelėje. Lėkštelių apačioje nubraižomas tinklelis skirtas
23 testuoti 20 – 25 štamų, įskaitant kontrolę. Bakterijų suspensijos paruošimui imama maždaug 4 – 5 gerai išreikštos kolonijos, suspenduojama, kad atitiktų 0,5 McFarland standartą. Bakterijų kultūra užnešama ant terpės paviršiaus pažymint užsėjimo tašką. Lėkštelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje 16 – 18 valandų. Stebima, ar vyksta augimas ir lygiagrečiai palyginama kontrolė. Antibiotiko koncentracija, kurioje augimas yra visiškai slopinamas, yra laikoma minimalia inhibitorine koncentracija (MIK).
Terpės skiedimo metodas. Terpės skiedimo metodas yra kitas kiekybinis metodas, nustatantis minimalią inhibitorinę koncentraciją (MIK). Šiame tyrime naudojama serija skiedimų inokuliuojama standartizuota bakterijų suspensija. Po inkubavimo per naktį, antibiotiko MIK yra nustatoma pagal mažiausią antibiotikų koncentraciją, kuri inhibuoja bakterijų augimą. Bakterijų suspensijos paruošimui imama maždaug 4 – 5 gerai išreikštos kolonijos, suspenduojama terpėje, drumstumas sureguliuojamas taip, kad atitiktų 0,5 McFarland standartą. Suspensija toliau skiedžiama iki galutinės rekomenduojamos bakterijų koncentracijos šulinėlyje 5 x 105 KSV/ml. Kaip augimo kontrolė naudojama terpė be antibiotiko. Pradinis antibiotiko tirpalas skiedžiamas keletą kartų ir gaunama serija mėginių su skirtingomis antibiotiko koncentracijomis. Mėginiai dedami į terpę, inkubuojami 35 – 37 °C temperatūroje 18 val. Po inkubavimo periodo įvertinamas terpės drumstumas. Drumstumo padidėjimas apibūdina bakterijų augimą, kurio neinhibavo antibiotiko koncentracija, esanti terpėje.
Epsilometrinis testas (E-testas). Epsilometrinis testas yra automatizuota sistema bakterijų izoliatų MIK nustatymui. Testas paremtas diskų difuzijos principu, antibiotikai difunduoja į terpę kai juostelės padedamos ant agaro paviršiaus. Juostelėje (5 x 50 mm, antibiotiko nešiklis) yra imobilizuojamas žinomo antibiotiko gradientas. Bakterijų suspensijos paruošimui imama maždaug 4 – 5 gerai išreikštos kolonijos, suspenduojama terpėje. Terpės drumstumas turi būti 0,5 McFarland vieneto. Po inkubacijos periodo stebimos elipsoidinės augimo inhibitorinės zonos. MIK nustatoma pagal zonos ir skalės susikirtimo vietą. Rezultatai patikimi, jeigu zonos aiškiai matomos.
Kitas metodas – masių spektrometrija (MS). Atliekant masių spektrometriją, matricos pagalba atliekama lazerio desorbcija / jonizacija. Tai jonizacijos technika, kurios metu lazerio energiją sugerianti matrica sukuria jonus iš didelių molekulių, kurių fragmentacija yra minimali. MS galima nustatyti antimikrobinį atsparumą, kurį sąlygoja horizontalūs genų pernešimai arba mutacijos, turinčios įtakos geno produkto kiekiui, tuo tarpu antimikrobinį atsparumą, kurį sąlygoja tikslinės mutacijos, vis dar sunku nustatyti. Tai patikimas mikroorganizmų identifikavimas klinikinėse mikrobiologijos
24 laboratorijose ir dabar pakeičia fenotipinį mikrobų identifikavimą. Ši technika yra bendras, tikslus, greitas ir ekonomiškai efektyvus augimu pagrįstas metodas (40).
25
2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS
2.1. Tyrimo vieta ir objektai
Tyrimui naudojami pieno mėginiai surinkti iš įvairių šalies rajonų, skirtingais metų laikais, iš skirtingo dydžio pieninių karvių fermų ir ūkių.Visi mėginiai buvo imti iš įtariamų mastitu segančių karvių. Pieno mėginiai buvo imami po melžimo į sterilius indus iš pažeitų tešmens ketvirčių, laikantis aseptikos.
4 Pav. Pieno mėginiai (27)
Tolimesni tyrimai buvo atlikti LSMU Veterinarijos akademijos, Mikrobiologijjos ir virusologijos institute, Mikrobiologinių tyrimų laboratorijoje: pirminiai bakteriologiniai tyrimai – nustatytas stafilokokų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms, biocheminiai indentifikavimo iki rūšies tyrimai bei kiekybinai atsparumo antibiotikams tyrimai. Darbas atliktas pagal schemą:
26 Buvo tirti 187 pieno bandiniai, paimti iš įvairių fermų, skirtingų rajonų.
2.2. S. aureus ir koaguliazei neigiamų stafilokokų išskyrimas
Pieno mėginiai mikrobiologiniams tyrimams buvo sėti į Petri lėkšteles su selektyviu manitolio druskos agaru (Liofilchem, Italija). Užsėjus lėkšteles jos 1-2 paras buvo kultivuojamos termostate +37OC temperatūroje. Iš kultūrų paruošti tepinėliai buvo nudažomi Gramo metodu bei stebimi pro mikroskopą, mikroorganizmų morfologijai. Toliau naudojant 3 proc. vandenilio peroksido tirpalą buvo vertintos išaugusios stafilokokų kultūros, nustatyta katalazės gamyba, ir panaudojus 3 proc. KOH tirpalą – priklausymas gram teigiamiems mikroorganizmams. Stafilokokų grupės nustatytos naudojant plazmos koaguliazės testus. Latekso agliutinacijos reakcija naudota auksinių stafilokokų identifikacijai, panaudojant agliutinacinius latekso serumus (Microgen, Jungtinė Karalystė). Rūšiai identifikuoti naudotos RapiID STAPHYLUS System (Microgen, Jungtinė Karalystė) arba MicrobactTM 125 (Oxoid, Jungtinė Karalystė) greitosios identifikavimo sistemos (5 pav). Pagal gamintojo instrukcijas paruošiama tiriamojo stafilokoko suspensija, inokuliuojama į plokštelių šulinėlius. Inkubuojama termostate pagal aprašą, vertinama šulinėliuose pakitusi angliavandenių spalva, identifikuojama kompiuterine programa.
Karvių mastitinio pieno bandinių surinkimas (n = 187)
Bakteriologiniai tyrimai (n = 187)
Stafilokokų rūšių identifikavimas (n = 170)
Stafilokokų atsparumo antbiotikams tyrimas (n = 170)
Rezultatų, gautų skirtingais atsparumo antibiotikams nustatymo metodais, analizė
27
5 Pav. Greitoji stafilokokų identifikavimo programa (autoriaus nuotrauka)
2.3. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas
2.3.1. Diskų metodas
Diskų difuzijos arba Kirby-Bauer metodas buvo panaudotas kokybiniam bakterijų jautrumui antibiotikams nustatyti. Naudota Mueller Hinton Agar (Liofilchem, Italija) kieta terpė. Kilpele 3 – 5 išaugusios stafilokokų kolonijos sumaišytos su fiziologiniu tirpalu, iki tol kol pasiekia 0,5 Mac Farland vieneto optinį tankį. Agaro lėkštelių užsėjimas buvo atliktas steriliu medvilnės tamponėliu. Inokuliatas tolygiai paskirstytas agaro paviršiuje braukiant trimis kryptimis. Ant užsėtos bei nudžiovintos terpės paviršiaus diskų dispensoriumi (Oxoid, JK) buvo tvirtai uždėti diskai. Diskų skaičius lėkštelėje parinktas taip, jog nesusisiektų inhibicijos zonos. Po užsėjimo diskai buvo uždėti per 15 min. Lėkštelių inkubavimas atliktas sudėjus į termostatą apverstas lėkšteles. Inkubuojama 35 ± 1 °C, 16–20 val. Lėkštelės vertintos po inkubavimo, zonos matuotos ir jautrumas vertintas tose zonose, kur visiškai nėra augimo, jos yra matomos žiūrint plika akimi apie 30 cm atstumu. Inhibicijos zonos matuotos liniuote, apvalinant iki artimiausio milimetro (6 pav).
28
6 Pav. Antibiotikų atsparumo nustatymas diskų difuzijos metodu (autoriaus nuotrauka)
Zonų skersmuo vertintas pagal zonų ribinių reikšmių lenteles, pateiktas interneto svetainėje http://www.eucast.org. Darbui buvo parinktos tokios antbiotikų rūšys, kurios dažniausiai naudojamos klinikinėje praktikoje prieš ligų sukėlėjus bei turi lūžio tašką (angl. clinical break-point). Rezultatai buvo vertinti kaip „jautri padermė”, „vidutiniškai jautri padermė” arba „atspari padermė” (4 lentelė).
29 4 lentelė. Tyrimams naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir stafilokokų
atsparumo interpretacijai naudotos vertinimo reikšmės (sterilių zonų skersmuo, mm) Antibiotikų
klasė Antibiotikai
Koncentracija diske, μg arba
IU
Klinikinė reikšmė (EUCAST), sterili zona Jautri, ≥ mm Vidut.jau tri, mm Atspari, mm Penicilinai Penicilinas G 1 IU 26 netaikoma 26 Amoksacilinoklavulan atas 30 (20+10) 20 netaikoma 19 Fluorchinolo
nai Enrofloksacinas 5 20 netaikoma 20
Aminoglikozi
dai Gentamicinas 10 18 netaikoma 18
Tetraciklinai Tetraciklinas 30 22 19-21 19 Cefalosporin ai Cefoksitinas 30 25 netaik oma 25 Folio rūgšties inhibitoriai Trimetoprimas / sulfametoksazolas 25 (1,25+23,75) 17 netaik oma 14
Makrolidai Eritromicinas 15 21 netaik
oma 18
2.3.2. Minimalių slopinančių koncentracijų nustatymo metodas
Minimalių slopinančių koncentracijų nustatymas atliktas automatizuotu būdu, naudojant „Sensititre” plokšteles aparatu ARIS 2X (Thermo Scientific, Jungtinė Karalystė) (7, 8 pav). Tyrimai buvo atlikti besivadovaujant metodikomis, kurios buvo aprašytos gamintojo bei besivadovaujant CLSI standartu.
30
7 Pav. Diagnostic System plokštelės - „Sensititre” (autoriaus nuotrauka)
8 Pav. Aparatas ARIS 2X (41)
Tyrimas atliktas tokia veiksmų seka: identifikuotos tyrime stafilokokų padermės parą auginamos termostate 35 ± 1 °C temperatūroje ant Mueller Hinton agaro (Liofilchem, Italija). Po paros į mėgintuvėlį su fiziologiniu tirpalu įdedama tiek tiriamosios kultūros, kad tankis būtų 0,5 McFarland vienetų. Matuojama bakterijų suspensija optiniu matuokliu „Liap 2” (Latvija). 10 mikrolitrų šios suspensijos inokuliuojama į mėsos peptono buljoną, inkubuojama 15 min. kambario temperatūroje. Stafilokokų suspensija švelniai perpilama į sterilią plastiko formą. Daugiakanale pipete, daugkartiniais paspaudimais, suspensija sulašinama į „Sensititre” plokšteles, kuriose gamintojo patalpinta skirtingų
31 koncentracijų reikalingų antimikrobinių medžiagų. Plokštelės inkubuojamas 24 val. 35 ± 1 °C temperatūroje aparate ARIS 2X. Rezultatų vertinimą atlieka kompiuterinė programa esanti aparate.
2.4. Statistinė duomenų analizė
Tyrimo rezultatai statistiškai apskaičiuoti kompiuterine programa SPPS. Statistinio patikimumo paskaičiavimui buvo taikomas Chi – kvadrato testas. Skirtumas laikytas statistiškai patikimu, jei p<0,05.
32
3. TYRIMO REZULTATAI
Buvo tirti 187 bandiniai pieno (karvių, turinčių mastito požymių). Iš 170 bandinių buvo išskirti stafilokokai, o iš likusių 17 – neišskirti. (9 pav)
9 Pav. Tirtų mėginių (n = 187) išskirtų ir neišskirtų sukelėjų (stafilokokų) dalis, proc.
Iš visų 170 išskirtų sukėlėjų 33 vnt. (19 proc.) buvo koaguliazei teigiamas S. aureus ir 137 vnt. (81 proc.) koaguliazei neigiami stafilikokai. Tyrime dažniausi buvo koaguliazei neigiami stafilokokai (10 pav.).
91% 9%
išskirta
neišskirta Išskirtų ir neišskirtų sukėlėjų dalis, proc.
33
10 Pav. Iš mėginių (n = 170) išskirtų S. aureus ir koaguliazei neigiamų stafilokokų palyginimas,
proc.
Tyrime buvo identifikuota iki rūšies koaguliazei neigiami stafilokokai. Nustatyta: S. chromogenes (6x), S. warneri (4x), S. haemolyticus (3x), S. hominis (2x), S. xylosus (2x), S. capitis ss capitis (2x), S. epidermidis (1x), S. hominis spp. hominis (1x) (11 pav.). Kitas rūšis identifikuoti biocheminiais tyrimais yra sudėtinga, reikalingi molekuliniai tyrimai.
11 Pav. Išskirtų koaguliazei neigiamų stafilokokų (n = 21) pasiskirstymas pagal rūšis, proc.
KNS 81 proc. KTS (S.aureus) 19 proc.
KTS ir KNS palyginimas
S.chromogenes 29% S. warneri 19% S. haemolyticus 14% S. hominis 9% S. xylosus 9% S. capitis ss capitis 10% S. epidermidis 5% S. hominis spp. Hominis 5%34 Atlikus identifikuotų stafilokokų rūšių pasiskirstymą palyginimą (12 pav.), galima teigti, kad molekulinės biologijos metodų reikšmė būtų didelė, išsiaiškinant kitas koaguliazei neigiamų stafilokokų rūšis ir valdant pilną informaciją. Tyrimas parodė, kad S. aureus identifikavimo dažnumas lyginant su kitais nustatytais sukelėjais yra didelis. Taigi literatūroje vienas iš dažniausiai minimų mastitų sukelėjų S. aureus buvo lengvai ir dažnai identifikuotas tarp visų stafilokokų.
12 Pav. Koaguliazei teigiamų ir koaguliazei neigiamų stafilokokų pasiskirstymas tyrime, proc.
Analizuojant išskirtų stafilokokų jautrumą antibiotikams, daugiausia atsparių suklėjų buvo beta laktamų klasė antibiotikui penicilinui (13 ir 14 pav.). Išskirtų Staphylococcus spp. izoliatų dauguma buvo jautrūs cefoksitinui (97 proc.) bei fluorchinolonų klasės antibiotikui ciprofloksacinui (90 proc.) (p<0,05). Patikimi statistiniai skirtumai tarp stafilokokų rūšių nebuvo nustatyti (p>0,05). Koaguliazei neigiami stafilokokai tyrime buvo statistiškai patikimai atsparūs (p<0,05) beta laktamų klasės antibiotikui penicilinui (85 proc.), tetraciklinui (22 proc.) bei aminoglikozidų klasės antibiotikui gentamicinui (20 proc.).
S. warneri S. haemolyticus S. hominis S. xylosus S. capitis ss capitis S. epidermidis S. hominis spp. Hominis Neidentifikuoti KNS KTS (S. aureus)
KTS
S. aureus 19%
35
13 Pav. KNS (n = 137) jautrumas/atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
14 pav. S. aureus (n = 33) atsparumas/jautrumas antibiotikams procentais
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% P E SXT CN CIP FOX TE Atsparumas Jautrumas KNS atsparumas/jautrumas antibiotikams 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 P E SXT CN CIP FOX TE Atsparumas Jautrumas KTS atsparumas/ jautrumas antibiotikams, proc.
36 S. aureus padermės buvo atsparios penicilinui (100 proc.) (p<0,05), gentamicinui (40 proc), tetraciklinui (34 proc.) bei makrolidų klasės antibiotikui eritromicinui (20 proc.) (14 pav).
Pagal gautus tyrimo duomenis (13 ir 14 pav.) tarp stafilokokų dominavo padermės atsparios penicilinui ir tetraciklinui. Makrolidų klasės antibiotikui eritromicinui penktadalis padermių taip pat buvo atsparios.
Kiekybinio atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimo metu gauti duomenys buvo išsamesni (5 lentelė). Buvo gauti atsakymai apie jautrumą / atsparumą septyniolikai skirtingų antibiotikų, kurie svarbūs medicinoje. Tirtieji stafilokokai betalaktamų klasės antibiotikams parodė skirtingus atsparumo duomenis. Ampicilinui buvo atsparios beveik pusė padermių (43,8 proc.), oksacilinui kas ketvirta padermė, o penicilinui net 87,5 proc. tirtųjų. Trečios kartos cefalosporinui ceftriaksonui vidutiniškai jautrių buvo 18,7 proc. padermių. Eritromicinui jautrios buvo tik kas antra stafilokokų padermė, o tetraciklinui – 25 proc. buvo vidutiniškai jautrios ir 75 proc. – atsparios. Vidutinį jautrumą gentamicinui nustatyta 6,2 proc. tirtųjų padermių. Klindamicinui atsparios buvo 37,5 proc. stafilokokų, o chinolonų klasės antibiotikams 12,5 – 18,7 proc. tirtų stafilokokų.
5 lentelė. Iš pieno išskirtų Staphylococcus spp. kiekybinis atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (%), n=16
Antibiotikai
Padermių atsparumas antibiotikams, MSK mg/ml
0,06 0,12 0,25 0,5 1 2 4 8 16 32 6 4 12 8 Ampicilinas¹ 12,5* 43,7 18,7 12,5 6,3 6,3 Ceftriaksonas¹ 81,2* 18,8 Ciprofloksacinas 75* 6,2 18,8* * Klindamicinas 56,3* 6,2 12,5 6,2 18,8* * Daptomicinas 93,7* 6,3 Eritromicinas 37,5* 12,5 50** Gatifloksacinas¹ 81,3 * 12, 5 6,3 Gentamicinas¹ 75* 18,7 6,2 Levofloksacinas 68,7* 12,5 12,5 6,3** Linezolidas 62,5* 25 12, 5 Oxacilinas+2%NaCl 50* 12,5 12,5 6,3 18,7* * Penicilinas 12,5* 25 25 12,5 6,3 18,7* * Kvinupristinas/dalfopristinas 18,7* 50 25 6,3 Rifampinas 100* Tetraciklinas 25* 12,5 6,3 6,3 50* * Trimetoprimas/sulfametoksazolis 87,5* 12,5* * Vankomicinas 100*
Paaiškinimai: žalias langelis-jautru; mėlynas langelis-vidutiniškai jautru; rausvas langelis-atsparu.
1-CLSI standartas,
*-mažiau arba lygu nurodytai koncentracijai, **-daugiau arba lygu nei nurodyta
koncentracija
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS
Iš karvių pieno mėginių neretai išskiriami koaguliazei neigiami stafilokokai, bet anksčiau patogenais jie nebuvo laikomi, nes šie mikroorganizmai yra dalis normalios karvių tešmens mikrofloros. Koaguliazei neigiami stafilokokai šiuo metu dažnai siejami su karvių mastitu, tačiau trūksta žinių apie konkrečių rūšių svarbą įvairių tipų mastitui ir apie antimikrobinio atsparumo skirtumus.
Šio tyrimo duomenimis nustatyta, jog iš sergančių mastitu karvių pieno dažniausiai išskiriamos stafilokokų genties bakterijos (91 proc.). Tyrime nustatėme dažniausiai koaguliazei neigiamus stafilokokus (81 proc.), nors kai kurios šių atstovų rūšys (S. epidermidis, S. xylosus) sudarė tik labai nedidelę dalį. Tyrimo duomenys rodo, kad svarbiu mastito sukėlėju išlieka S. aureus (tyrimo metu – 19 proc.), ir tai sutampa su ankstesnių Lietuvos mokslininkų tyrimų duomenis (1, 12). Šiame tyrime nustatyta, kad karvių mastito priežastimi yra kiti, anksčiau tik pavieniais atvejais nustatomi stafilokokai – S. chromogenes (29 proc.), S. warneri (19 proc.), S. haemolyticus (14 proc.). Mastito etiologijos klausimus kitose šalyse sprendę mokslininkai, paskelbė skirtingus duomenis. Jų teigimu, vyraujantis tarp mastito patogenų išlieka S. aureus, tačiau dažnai mastito etiologinis faktorius yra ir kitos stafilokokų rūšys. Suomijoje koaguliazei neigiami stafilokokai buvo izoliuoti iš 50 proc., Norvegijoje – iš 14 proc., Vokietijoje – iš 35 proc., JAV – iš 24 proc. mastitinio pieno mėginių (7, 17). Remiantis Brazilijoje atliktais tyrimais S. chromogenes ir S. epidermidis labiausiai paplitusios koaguliazei neigiami stafilokokai. S. epidermidis žymiai labiau paplitęs subklinikinio nei klinikinio mastito atvejais (35).
Mūsų analizė rodo, kad Staphylococcus spp. paplitimo tyrimas ir rūšies identifikavimas yra būtini, nes ši bakterijų grupė kaip tešmens patogenas yra labiausiai paplitusi mūsų šalyje. Taip pat ir mokslininėje literatūroje aprašyta, jog kai kuriose pienininkystės šalyse svarbiausiu mastito etiologiniu veiksniu tampa būtent kitos stafilokokų rūšys, o ne S. aureus. Tyrime išaiškėjo koaguliazei neigiamų stafilokokų identifikavimo iki rūšies problemos, nes įprasti klasikiniai metodai, pasitelkiant biocheminius testus, daugumoje atvejų būna netikslūs arba negalimi. Tai ir lėmė, kad iki rūšies neidentifikavome didelio kiekio stafilokokų. Koaguliazei neigiamus stafilokokus identifikuoti yra sudėtinga dėl šios bakterijų grupės įvairiarūšiškumo. Todėl koaguliazei neigiamus stafilokokus identifikuoti tikslinga ne tik fenotipiniais bet ir genotipiniais metodais (1). Šiame tyrime nustatyta stafilokokų rūšių įvairovė mastito etiologijoje patvirtina būtinybę periodiškai atlikti diagnostinius tyrimus, nes žinoma rūšinė mikroorganizmų sudėtis ir jų
39 atsparumas antimikrobiniams vaistams padeda lengviau išgydyti mastitu sergančias karves, tinkamiau parinkti vaistus.
Mūsų gauti stafilokokų atsparumo antibiotikams duomenys rodo sumažėjusį jautrumą ir augantį atsparumą veterinarijoje naudojamiems antibiotikams. Kokybinio bei kiekybinio atsparumo antibiotikams tyrimo metu stafilokokai pasižymėjo padidėjusiu atsparumu penicilinui (p<0,05) t.y. visos S. aureus padermės bei 85 proc. koaguliazei neigiamų stafilokokų. Be to, beveik pusė stafilokokų buvo atsparūs plataus veikimo spektro pusiau sintetiniam betalaktamui – ampicilinui. Ampicilinas neveikia betalaktamazę produkuojančių stafilokokų, matomai, šiame tyrime jų buvo daug, vos ne pusė (43,8 proc.). Minimalių slopinančių koncentracijų tyrimas parodė, kad kas ketvirta stafilokokų padermė atspari oksacilinui. Todėl galima manyti, kad šios padermės turi atparumą betalaktamams genetiniame lygmenyje. Mūsų tyrime minimalių slopinančių koncentracijų nustatymas buvo informatyvus, parodė daugiau atsparių padermių oksacilinui, kuomet galima įtarti atsparumą visiems betalaktamams dėl stafilokokų sugebėjimo gaminti betalaktamazes. Tuo tarpu, diskų metodu nustatėme tik dešimt padermių (dauguma S. aureus) atsparių cefoksitinui, kurios irgi matomai produkavo betalaktamazes. Šį faktą patvirtinti gali tik molekuliniai tyrimai. Užsienio tyrėjų duomenimis beta laktamazę gaminančių izoliatų paplitimas skirtingose koaguliazei neigiamų stafilokokų rūšyse labai skiriasi ir yra žymiai didesnis S. epidermidis ir S. haemolyticus (~ 40 proc.), nei S. simulans ir S. chromogenes. Tyrėjai tvirtina, jog naudojimas antibiotikų mastito gydymui arba prevencijai ir buvo esminė priežastis, kad šiems antibiotikams išsivystė mikroorganizmų atsparumas (42). Antibiotikų, tokių kaip penicilinas ir meticilinas, atsiradimas ir vartojimas XX a. viduryje iš pradžių pasirodė veiksmingas prieš S. aureus. Tačiau S. aureus greitai įgijo atsparumą šiems antibiotikams (43). Meticilinas, pusiau sintetinis beta laktaminis antibiotikas, buvo įvestas 1950-ųjų metų pabaigoje kaip infekcijos terapija. Nepaisant meticilino veiksmingumo gydant infekcijas, per dvejus metus nuo klinikinio vartojimo buvo pranešta apie pirmąsias meticilinui atsparias S. aureus padermes. Mūsų tyrime diskų metodu radome labiau išreikštą atsparumą meticilinui S. aureus padermėse, tačiau minimalių slopinančių koncentracijų metodas buvo išsamesnis ir parodė, kad net 25 proc. koaguliazei neigiamų stafilokokų gali būti atsparūs meticilinui.
Tyrime diskų metodu ir nustatant minimalias slopinančias koncentracijas, galima teigti, jog iš mastitinio pieno jau išskiriamos labai atsparios stafilokokų padermės. Būtent automatizuotu antimikrobinio atsparumo (minimalių slopinančių koncentracijų) nustatymo metu, buvo nustatyta besivystantis atsparumas trečios kartos cefalosporinui ceftriaksonui. Tyrime nustatėme iš mastitinio pieno labai atsparias stafilokokų padermes kitiems betalaktamams bei augantį atsparumą tetraciklinui,
40 eritromicinui, sulfametoksazoliui/trimetoprimui, ciprofloksacinui. Galima daryti prielaidą, jog, mėginiai buvo surinkti iš bandų, kuriose ilgą laiką naudota penicilinai bei kiti antibiotikai gydymui ar prevencijai nuo mastitų.
Šiuo metu tyrėjai tvirtina, jog karvių mastito patogenai išlieka jautrūs cefalosporinams, betalaktamazių inhibitorių deriniams, karbapenemams (44). Tačiau mūsų atliktas minimalių slopinančių koncentracijų tyrimas rodo, kad yra jau išskiriamos cefalosporinams tik vidutiniškai jautrios koaguliazei neigiamų stafilokokų padermės. Taip pat tyrime gauti išsamūs duomenys, kurie parodė, kad stafilokokai išskirti iš karvių mastito yra atsparūs svarbiems žmonių gydyme chinolonų, linkozamidų, fluorchinolonų klasė antibiotikams. LSMU anksčiau atliktų tyrimų duomenimis – stafilokokų sukeltą mastitą griežtai nerekomenduojama gydyti beta laktamų klasės antibiotikais, ypatingai, jei vyraujantis sukelėjas yra S. aureus (1, 17). Šiame tyrime gavome rezultatus, kurie rodo, kad ir koaguliazei neigiamų stafilokokų tarpe yra dažnas atsparumas betalaktamams. Nuolatinis šių antibiotikų naudojimas didino bakterijų atsparumą šioms mežiagoms ir mažina jų efektyvumą. Remiantis Veterinarinių vaistų registro duomenis (VMVT), betalaktamai mūsų šalyje yra vieni iš dažniausiai naudojamų antimikrobinių medžiagų gyvūnams gydyti. Tai kelia pavojų ne tik gyvūnamas, bet ir žmonėms. Antibiotikų naudojimas gyvūnų gydymui turi būti pagrįstas, prieš tai nustatant vyraujančius sukelėjus ir parenkant jiems jautrias antimikrobines medžiagas. Pieno ūkiuose reikalingas nuolatinis bandų stebėjimas, kontrolė bei tinkamas situacijų valdymas. Įvairūs tyrimai leidžia stebėti antimikrobinių medžiagų atsparumo kitimus, bei parinkti tinkamą gydymą antibiotikais.
41
IŠVADOS
1. Nustatyta, jog karvių mastito etiologinis faktorius dažniausiai yra Staphylococcus genties bakterijos – 91 proc. tirtų mastitinio pieno bandinių. Staphylococcus spp. išlieka aktualiausia pieno ūkių problema.
2. Tyrime 81 proc. iš mastitiniame pieno išskirtų stafilokokų buvo koaguliazei neigiami stafilokokai. Iš jų dažniausi buvo S. chromogenes (29 proc.) ir S. warneri (19 proc.) S. haemolyticus (14 proc.). Kiti, kaip S. hominis, S. xylosus, S. capitis ss capitis, S. epidermidis, S. hominis spp. hominis nustatyta mažiau. Dažnai mastitiniame piene nustatyta koaguliazei teigiamų stafilokokų atstovas yra S. aureus (19 proc.). Nepaisant šalyje taikytų stebėsenos ir likvidavimo priemonių, S. aureus išlieka dažnu mastito patogenu.
3. Koaguliazei neigiami stafilokokai buvo statistiškai patikimai atsparūs (p<0,05) penicilinui (85 proc.), tetraciklinui (22 proc.) bei gentamicinui (20 proc.). S. aureus padermės pasižymėjo ženkliai (p<0,05) didesniu atsparumu šiems antibiotikams ir dar 20 proc. S. aureus padermių buvo atsparios makrolidų klasė antibiotikui eritromicinui.
4. S. aureus padermėse Diskų metodu nustatyta didesnis atsparumas analizuojamiems antibiotikams nei kitų stafilokokų. Minimalių slopinančių koncentracijų tyrimas buvo išsamus, parodė didesnį kiekį meticilinui, tetraciklinui, eritromicinui, sulfametoksazoliui/trimetoprimui atsparių koaguliazei neigiamų stafilokokų padermių, bei augantį atsparumą cefalosporinams, fluorchinolonams, aminoglikozidams.
42
LITERATŪROS ŠALTINIAI
1. Klimienė I, Ružauskas M, Mockeliūnas R, Šiugždinienė R, Špakauskas V, Matusevičius A, et al. Stafilokokų, išskirtų iš karvių mastitinio pieno, įvairovė ir atsparumas antimikrobinėms medžiagoms [Internet]. Lsmuni.lt. 2012 [cited 2020 Nov 24]. Available from: https://vetzoo.lsmuni.lt/data/vols/2012/57/pdf/klimiene.pdf
2. Khachlouf K, Hamed H, Gdoura R, Gargouri A. Effects of dietary Zeolite supplementation on milk yield and composition and blood minerals status in lactating dairy cows. J Appl Anim Res. 2019;47(1):54–62.
3. Benić M, Department for Bacteriology and Parasitology, Croatian Veterinary Institute, Zagreb, Croatia, Maćešić N, Cvetnić L, Habrun B, Cvetnić Ž, et al. Bovine mastitis: a persistent and evolving problem requiring novel approaches for its control - a review. Vet Arh. 2018;88(4):535–57.
4. Uzunović S, Bedenić B, Budimir A, Ibrahimagić A, Kamberović F, Fiolić Z, et al. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA), extended-spectrum (ESBL)- and plasmid-mediated AmpC ß-lactamase -producing Gram-negative bacteria associated with skin and soft tissue infections in hospital and community settings. Med Glas (Zenica). 2015;12(2):157–68.
5. Mavrogianni VS, Menzies PI, Fragkou IA, Fthenakis GC. Principles of mastitis treatment in sheep and goats. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2011;27(1):115–20.
6. Merkevičienė L, Klimienė I, Šiugždinienė R, Virgailis M, Juknienė I, Ružauskas M. Žmonėms kritiškiems svarbiems antibiotikams atsparios bakterijos naminiuose ir laukiniuose paukščiuose. 2017.
