TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ DARBAS ATLIKTAS FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Pagalbinių medţiagų įtaka kietųjų kapsulių su resveratroliu kokybei“.

1. Yra atliktas mano pačios.

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Agnė Mikolainytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS

TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuviu kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

Agnė Mikolainytė

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas)

vardas, pavardė)

Baigiamojo darbo recenzentas

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

protokolo Nr. FF 17-3

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTAS

AGNĖ MIKOLAINYTĖ

PAGALBINIŲ MEDŢIAGŲ ĮTAKA KIETŲJŲ KAPSULIŲ SU RESVERATROLIU KOKYBEI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Prof. Jurga Bernatonienė

Vertinimo forma patvirtinta Farmacijos s fakulteto Tarybos posėdyje 2014-04-17 protokolo Nr. FF 17-3

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMACINIŲ TECHNOLOGIJŲ INSTITUTAS

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data

PAGALBINIŲ MEDŢIAGŲ ĮTAKA KIETŲJŲ KAPSULIŲ SU RESVERATROLIU KOKYBEI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė Darbą atliko

Prof. Jurga Bernatonienė Magistrantė Agnė Mikolainytė

Data Data

Recenzentas

Prof. Sonata Trumbeckaitė

Data

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12

1.1. Natūralūs polifenoliai, jų svarba ... 12

1.2. Natūralūs resveratrolio šaltiniai, jo išskyrimas ir fizikocheminės savybės ... 12

1.3. Resveratrolio poveikis organizmui ... 13

1.3.1. Priešvėţinis ir priešuţdegimis poveikis ... 13

1.3.2. Resveratrolio nauda širdţies ir kraujagyslių sistemai ... 14

1.3.3. Neuroprotekcinis poveikis ... 15

1.4. Resveratrolio famakokinetika: absorbcija, metabolizmas, biopasisavinimas ... 15

1.5. Optimali resveratrolio farmacinė forma ... 16

1.6. Lietuvos rinkoje esantys resveratrolio maisto papildai ... 20

2. TYRIMO METODIKA ... 23

2.1. Tyrimo objektas ... 23

2.2. Tyrimo medţiagos ir prietaisai ... 23

2.3. Tyrimo metodai ... 24

2.3.1. Miltelių mišinio birumo vertinimas ... 25

2.3.2. Miltelių mišinio suberiamojo tankio, suberiamosios masės nustatymas ... 26

2.3.3. Miltelių Carr’o indekso ir Hausner’io koeficiento nustatymas ... 27

2.3.5. Miltelių drėgmės kiekio nustatymas ... 29

2.3.6. Granuliometrinė sudėtis ... 29

2.3.7. Kapsulių masės vienodumas ... 29

2.3.8. Kapsulių suirimo laikas ... 30

2.3.9. Kietųjų farmacinių formų tirpimo testo in vitro modelis ... 31

2.3.10. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas ... 31

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 32

3.1. Miltelių technologinių savybių vertinimas ... 32

3.1.1. Miltelių ir jų mišinių birumo tyrimas ... 33

3.1.2. Miltelių Carr’o indekso ir Hausner’io koeficiento nustatymas ... 37

3.1.3. Resveratrolio mišinių su Prosolv’u HD 90 ir mikrokristalinės celiulioze Carr’o indeksas ... 38

3.1.4. Resveratrolio mišinių su Prosolv’u HD 90 ir mikrokristaline celiulioze Hausner’io koeficientas ... 40

3.1.5. Mikroskopinė miltelių analizė ir drėgmės kiekio nustatymas ... 41

3.1.6. Granuliometrinė sudėtis ... 42

3.2. Kapsulių kokybės tyrimai ... 43

3.2.1. Kapsulių vidutinės masės nustatymas ... 43

3.2.2. Kapsulių suirimo laikas ... 44

3.2.3. Kapsulių tirpimo testas ... 44

IŠVADOS ... 50

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51

SANTRAUKA

Agnės Mikolainytės magistro baigiamasis darbas: „Pagalbinių medţiagų įtaka kietųjų kapsulių su resveratroliu kokybei“/ mokslinė vadovė prof. Jurga Bernatonienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmacinių technologijų institutas. - Kaunas.

Pastaraisiais metais labai didelis dėmesys skiriamas polifenoliams, ypač resveratroliui. Jam būdingos įvairios biologinės savybės, nuo antibakterinio ir priešgrybelinio poveikio iki kardioprotekcinio, neuroprotekcinio ir priešvėţinio poveikio, taip pat tyrimai parodė jo naudą ilgaamţiškumui ir su amţiumi susijusiams sveikatos pablogėjimui [1]. Tačiau resveratrolio naudojimas yra ribotas, dėl jo prasto tirpumo vandenyje, didelio cheminio nestabilumo ir maţo biologinio pasisavinimo. Taigi, siekiant pagerinti šiuos resveratrolio vartojimo apribojimus, svarbu surasti tinkamas pagalbines medţiagas, kurios padėtų uţtikrinti geresnes resveratrolio savybes ir svarbiausia padidintų jo biopasisavinimą.

Darbo tikslas: įvertinti pagalbinių medţiagų ir resveratrolio įtaką kietųjų kapsulių kokybei. Uţdaviniai: įvertinti resveratrolio fizikochemines (nuodţiūvį, tirpumą) ir technologines savybes

(birumą, dalelių dydį,); nustatyti pagalbinių medţiagų įtaką kapsuliuojamam miltelių mišiniui su resveratroliu; pagaminti kietas kapsules ir įvertinti pagalbinių medţiagų įtaką jų kokybei; nustatyti skirtingų pagalbinių medţiagų įtaką kapsulių su resveratroliu atpalaidavimui ir kokybei.

Tyrimo objektas: Resveratrolis ir su juo pagamintos kietosios ţelatininės kapsulės

Tyrimo metodas: Literatūros analizės metodas taikomas nagrinėjamai temai aprašyti, miltelių

technologinių savybių tyrimai (Carr’o indeksas, Hausner’io koeficientas, kūgio kampas), kapsulių masės vienodumo, suirimo ir tirpimo testai.

Rezultatai: Tyrimo metu buvo pagamintos 4 skirtingų sudėčių kapsulės su resveratroliu ir

skirtingomis pagalbinėmis medţiagomis. Atlikus tirpimo testus, nustatyta, kurių sudėčių kapsulės atitinka Europos Farmakopėjos kokybės reikalavimus ir pasiţymi optimaliomis savybėmis.

Išvados: Tyrimo metu gauti duomenys patvirtina, kad kapsulių kokybei įtakos turi pagalbinių

medţiagų ir resveratrolio kiekio parinkimas. Atlikti kapsulių tirpumo testai parodė, kokios pagalbinės medţiagos suteikia resveratroliui optimalias savybes.

SUMMARY

Master thesis of Agnė Mikolainytė: „Impact of additive substances to quality of hard-shelled resveratrol capsules“/ scientific manager Prof. Jurga Bernatonienė; Lithuanian University of Health Sciences, Academy of medicine, Pharmacy faculty, Institute of pharmaceutical technologies. – Kaunas.

In recent years resveratrol came to attention among the polyphenols due to its diverse biological properties, ranging from antibacterial and antifungal to cardio- and neuroprotective, as well as anti-cancer. Studies have also shown the benfits of resveratrol of improving lifespan and fold-age related problems. The practical use of resveratrol is, however, limited due to its poor water solubility, high chemical instability and low bioavailability. In order to overcome these caveats, it is important to find appropriate additive substances, which would improve the pharmacological effects and bioavailability of resveratrol [1].

The aim of research: to evaluate the impact of additive substances to the quality of resveratrol

capsules.

Objectives of research: evaluate the physico-chemical (shrinkage, solubility) and technological

(brittleness, particle size) properties; determine the effect of additive substances to powdered capsulated compounds with resveratrol; manufacture the hard-shelled capsules and evaluate the effects of additive substances to their quality; determine the properties of different additive substances to release and quality of resveratrol capsules .

Object of the research: resveratrol and manufactured resveratrol-gelatine capsules.

Applied research methods: Analysis of literature for the description of the topic, technological

analysis of the powdered substances (Carr index, Hausner coefficient, cone angle), tests of the capsule mass uniformity, disintegration and solubility.

Results of research: during the course of the study 4 different compositions of

resveratrol-capsules with different additive substances were manufactured. Solubility tests showed, which compositions were in accordance with European Pharmacopoeia and show the optimal properties.

Conclusions: the study data confirms that the additive substances in resveratrol-capsules, as well

as the ratio of resveratrol to additive substances influence the pharmacological qualities. The performed solubility tests showed, which additive substances ensure the optimal pharmaceutical qualities of resveratrol.

PADĖKA

Nuoširdţiai dėkoju Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedrai uţ suteiktą galimybę atlikti mokslinį tiriamąjį – magistrinį darbą, visiems katedros darbuotojams ir darbo vadovei prof. Jurgai Bernatonienei uţ dėmesį, laiką, pastabas ir patarimus. Esu dėkinga Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros asist.lab. Mindaugui Marksai uţ pagalbą tiriant mėginius efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

SANTRUMPOS

BB – kraujo smegenų barjeras BI – birumo indeksas

0

C – laipsniai pagal Celsijų CD – ciklodekstrinai CI – Carr’o indeksas

CNS – centrinė nervų sistema g/s – gramai per sekundę HK – Hausner’io koeficientas

HPMC – hidroksimetilpropilceliuliozė MC – mikrokristalinė celiuliozė MI – miokardo infarktas

PAM – paviršiaus aktyvios medţiagos Ph. Eur. – Europos farmakopėja proc. – procentai

SDS - natrio dokusatas SK – subėrimo kampas SLS - natrio laurilsulfatas UV – ultravioletiniai spinduliai

ĮVADAS

Pastaruoju metu Europoje kovojama su ligomis, būdingomis šiuolaikiniam amţiui, tokiomis kaip širdies ir kraujagyslių ligos, vėţys, nutukimas, diabetas ar įvairios alergijos [2]. Augalai yra vienas iš svarbiausių ţmonių maisto ir vaistų šaltinių, todėl sparčiai daugėja ţinių apie teigiamą fitocheminių junginių vaidmenį kovojant su šiais laikais būdingomis ligomis, kurias daţniausiai sukelia oksidacinis stresas. Dėl šios prieţasties padidėjo mokslininkų ir vartotojų dėmesys antioksidantų turintiems augalams, kurių didelę dalį sudaro polifenoliai [2, 3].

Didelis dėmesys skiriamas polifenoliams, ypač natūraliam vynuogių ir raudonojo vyno produktui – resveratroliui (3,5,4’trihidroksi-transstilbenas). Jam būdingos įvairios biologinės savybės, nuo antibakterinio ir priešgrybelinio poveikio iki kardioprotekcinio, neuroprotekcinio ir priešvėţinio poveikio, taip pat tyrimai parodė jo naudą ilgaamţiškumui ir su amţiumi susijusiams sveikatos pablogėjimui [1].

Svarbiausi natūralūs resveratrolio šaltiniai yra vynuogės ir jų dariniai (vynas, sultys), juose yra ţymiai daugiau resveratrolio nei kituose šaltiniuose, pavyzdţiui, ţemės riešutuose ar uogose. Be to, vynuogės, kaip natūralus resveratrolio šaltinis, tapo labai svarbios maisto produktų pramonėje, nes jos naudingos ţmonių sveikatai, todėl kaip ir riešutai, yra ţmogaus raciono dalis [4, 5].

Tačiau resveratrolio, kaip maisto produkto, naudojimas maisto pramonėje šiuo metu yra ribotas dėl jo prasto tirpumo vandenyje, didelio cheminio nestabilumo ir maţo biologinio pasisavinimo. Siekiant pagerinti šiuos resveratrolio vartojimo apribojimus, gali būti naudojamas kapsuliavimas. Kapsuliavimas, tai toks būdas kai vienas ar keli ingredientai patalpinami tam tikroje matricos formoje. Viduje patalpinta medţiaga vadinama aktyvia arba šerdies medţiaga, o medţiaga, kuri sudaro matricą – apvalkalu ar nešikliu. Taigi, norint sukurti sėkmingą komercinį pritaikymą, reikėtų pasirinkti tinkamą kapsuliavimo technologiją, nešiklio medţiagą, sienelės medţiagą ar kapsulės savybes. Kapsuliavimas resveratroliui reikalingas, norint jį apsaugoti nuo aplinkos veiksnių (UV, deguonies), skatinančių jo cheminį skaidymą laikymo metu. Taip pat kapsulė reikalinga tam, kad pagerinti jo biopasisavinimą, padidinant jo tirpumą virškinamojo trakto skysčiuose, skatinant jo absorbciją enterocitų ląstelėse ir sumaţinant jo metabolizmą prieš absorbciją. Pagalbinių medţiagų pasirinkimo kriterijai daugiausiai grindţiami jų fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis, tokiomis kaip tirpumas, molekulinė masė, difuziškumas, geometrinis suderinamumas, struktūra. Keli iš galimų kapsuliavimui naudojamų kompleksų bioaktyviųjų junginių pranašumų yra šie: tirpumo vandenyje pagerinimas, stabilizavimas nuo oksidacijos ar ultravioletinių spindulių poveikio ir kontroliuojamas atpalaidavimas [6].

Apibendrinus mokslinę literatūrą, bei patentų kiekius, nustatyta, kad tokiems kompleksams sudaryti daţniausiai naudojami ciklodekstrinai. Įrodyta, kad ciklodekstrinai pagerina resveratrolio tirpumą, kartu ir atpalaidavimą iš farmacinės formos [6].

Šio tyrimo tikslas yra pritaikyti pagalbines medţiagas, kurios padėtų pagerinti kapsuliuoto resveratrolio tirpumą, cheminį nestabilumą, bei maţą biopasisavinimą [6].

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Tyrimo tikslas: įvertinti pagalbinių medţiagų ir resveratrolio įtaką kietųjų kapsulių kokybei. Uţdaviniai:

1. Įvertinti resveratrolio fizikochemines (nuodţiūvį, tirpumą) ir technologines savybes (birumą, dalelių dydį).

2. Nustatyti pagalbinių medţiagų įtaką kapsuliuojamam miltelių mišiniui su resveratroliu. 3. Pagaminti kietas kapsules ir įvertinti pagalbinių medţiagų įtaką jų kokybei.

4. Nustatyti skirtingų pagalbinių medţiagų įtaką kapsulių su resveratroliu atpalaidavimui ir kokybei.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Natūralūs polifenoliai, jų svarba

Natūralūs polifenoliai yra antriniai augalų metabolitai, apsaugantys nuo įvairių rūšių streso, taip pat svarbūs augalų adaptacijai, išgyvenimui, ūminėms, bei lėtinėms problemoms. Pagal klasifikaciją natūralūs polifenoliai paprastai skirstomi į skirtingas klases, atsiţvelgiant į jų pagrindinę cheminę struktūrą, ir yra aiškiai atskirtos fenolio rūgštys, flavonoidai, stilbenai ir lignanai. Stilbenai yra natūralūs fenolio gynybiniai junginiai, kurie atsiranda daugelyje skirtingų augalų rūšių, ir pasiţymi antimikrobiniu, antioksidaciniu poveikiu prieš fitopatogenus ar UV stresą. Stilbeno junginiai pastaruoju metu tapo daugelio medicinos ir augalų fiziologijos tyrimų objektu, taip pat atsirado kaip perspektyvios molekulės, galinčios paveikti ţmonių sveikatą, o svarbiausias jų vaidmuo yra kaip fitoeleksinų. Stilbeno fitoeleksinai, daugiausia gaunami iš resveratrolio. Resveratrolis (3,5,4′-trihidroksitrans-stilbenas) yra gerai ţinomas fitoeleksinas polifenolio, kurio daugiausia yra vynuogių odoje; dėl galimo naudos sveikatai ji sulaukė didelio mokslinio dėmesio [7, 8, 9, 10].

1.2. Natūralūs resveratrolio šaltiniai, jo išskyrimas ir fizikocheminės savybės

Pirmą kartą resveratrolis buvo išskirtas 1940 m. iš Baltųjų gelsvių (Veratrum grandiflorum) šaknų. Šiuo metu jis paplitęs tokiuose augaluose kaip raudonosios vynuogės (Vitis spp.), ţemės riešutai (Arachis spp.), juka (Yucca shidigera), ciberţolė (Curcuma longa), dracena (Dracaena loureiri), kasija (Cassia spp), gnetai (Gnetum cleistostachyum). Taip pat jo randama avietėse, šilkmedţiuose, braškėse ir tam tikruose vaistiniuose augaluose, kaip Japoninis pelėvirkštis (Polygonum cuspidatum), iš kurio daugiausiai išskiriama ir išgryninama komercinių resveratrolio produktų [10, 11, 12].

Tačiau resveratrolio biologinis pasisavinimas iš natūralių šaltinių daţnai yra palyginti ţemas, nes jis yra junginiuose su kitomis biologinėmis struktūromis. Taip pat, resveratrolio kiekis natūraliame šaltinyje gali labai skirtis, atsiţvelgiant į rūšį, klimatą, vietą ar metų laiką. Daţnai nepraktiška vartoti tokį natūralių šaltinių kiekį, kurio reikia, kad būtų pastebimas biologinis poveikis, bei resveratrolis pirmiausia gali būti vaisių dalyse, kurios paprastai nėra vartojamos, pavyzdţiui, odoje ar sėklose. Dėl šių prieţasčių daţnai pageidautina resveratrolį išgauti ir sukurti tam tikrą farmacinę formą [6].

Resveratrolį galima išskirti iš natūralių šaltinių atliekant paprastas perdirbimo operacijas, tokias kaip smulkinimas, malimas, ekstrahavimas tirpikliu (daţniausiai vandeniniai alkoholiniai mišiniai) ir atskyrimo bei gryninimo metodai. Ekstrahavimo ir gryninimo metu paprastai gaunamas miltelių pavidalo resveratrolis, susidedantis iš baltų kristalų [6].

Resveratrolis yra kieti balkšvi milteliai, kurių molekulinė formulė C14H12O3, molekulinė masė

228,25 g/mol, o lydymosi temperatūra 253–255 °C. Resveratrolis yra labai lipofilinių ir hidrofilinių savybių junginys – jis tirpus riebaluose, taip pat tirpsta etanolyje, tačiau, atsiţvelgiant į tirpumą vandenyje jis praktiškai jame netirpsta. Resveratrolis egzistuoja kaip du struktūriniai izomerai: cis- (Z) ir trans- (E). Trans formos miltelių pavidalo resveratrolis yra aktyvesnis ir stabilus esant dideliam oro drėgnumui (iki 75 % ir temperatūrai apie 40 °C). Cis-resveratrolio forma, veikiama ultravioletiniu spinduliavimu, sukelia daugiau fotocheminių reakcijų, sukuria fluorescencinę molekulę, vadinamą resveratronu, taigi dėl nestabilumo cis-resveratrolio negalima įsigyti [5, 12].

1.3. Resveratrolio poveikis organizmui

Polifenoliai kaupiasi augaluose reaguodami į egzogeninius streso veiksnius, tokius kaip suţalojimas, grybelinės infekcijos ar UV spinduliavimas. Taigi resveratrolis turi platų pageidaujamų biologinių veiksmų spektrą, įskaitant antioksidacinį, priešuţdegiminį aktyvumą, kardioprotekcinį, anti-aterogenišką, anti-trombocitinį poveikį, taip pat slopina kraujagyslių ląstelių molekulių adhezijos ekspresiją, pasiţymi chemoprevencinėmis, priešvėţinėmis savybėmis, ypač prieš gaubtinės ir tiesiosios ţarnos vėţio ląsteles; gali būti kaip viena iš medţiagų naudojamų Alzheimerio ligos progreso sumaţinimui. Įrodyta, kad resveratrolis imituoja kalorijų apribojimą ir padidina daugelio rūšių gyvenimo trukmę, todėl tinka diabeto profilaktikai bei gyvenimo kokybės gerinimui, geras imunomoduliatorius [5, 12, 13].

1.3.1. Priešvėţinis ir priešuţdegimis poveikis

Resveratrolis vartojamas vėţio prevencijai ir gydymui, ir iki šiol vykdomi įvairūs in vivo ir in

vėţiui gydyti. Yra išskiriami trys pagindiniai su vėţio vystymusi susiję mechanizmai, leidţiantys sukelti chemoprotekcinį poveikį: ląstelių apoptozė, antiproliferacija ir priešuţdegiminis poveikis. Taigi nustatyta, kad resveratrolis slopina tam tikras vėţio rūšis, kurios priskirtos jo gebėjimui sukelti apoptozę, suaktyvinti kaspazę, modifikuoti signalizacijos kelius, maţinti ląstelių proliferaciją, sulaikyti ląstelių ciklus ir maţinti metastazes [14, 15].

Daugelis tyrimų parodė ryšį tarp vėţio ir uţdegimo, kuris vaidina svarbų vaidmenį ankstyvose vėţio vystymosi stadijose. Nustatyta, kad resveratrolis sukelia COX fermentų ekspresijos ir aktyvumo pasikeitimus – slopina uţdegimą per COX-2 kelią. Taigi resveratrolio slopinamas COX-2 fermentas slopina uţdegimą, dėl kurio sumaţėja vėţinės ląstelės [16].

1.3.2. Resveratrolio nauda širdţies ir kraujagyslių sistemai

Vienas labiausiai ţinomų resveratrolio privalumų yra poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai. Resveratrolis gali padėti kovoti su koronarinėmis širdies ligomis slopindamas miokardo infarktą, aritmijas, hipertenziją, hipertrofiją, fibrozę, aterosklerozę ir trombozę. Pasiūlyta daugybė biocheminių mechanizmų, galinčių atsiţvelgti į šį sugebėjimą, įskaitant antioksidantinį aktyvumą, azoto oksido biosintezės ir aktyvumo moduliavimą, ląstelių tarpusavio sąveikos pokyčius ir trombocitų COX-1 slopinimą [18, 19, 20].

Dėl didelio oksidacinio aktyvumo resveratrolis padidina endotelio azoto oksido sintazės, fermento, atsakingo uţ galingo vazodilatatoriaus azoto oksido sintezę, ekspresiją ţmogaus kraujagyslių endotelio ląstelėse, bei sumaţina galingo vazokonstriktoriaus endotelino ekspresiją. Kitas būdas, kuriuo resveratrolis gali paveikti kardioprotekcinį poveikį, yra trombocitų agregacijos slopinimas, veikiantis panašiai kaip aspirinas, ir jo antioksidacinis poveikis cholesterolio metabolizmui. Resveratrolis apsaugo širdį padidindamas katalazės aktyvumą miokarde. Keletas tyrimų sėkmingai įrodė, kad ţiurkių miokardo infarkto (MI) modelyje resveratrolis reikšmingai padidina kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ir jo tirozinkinazės receptoriaus Flk-1 baltymų ekspresijos profilius, kurie savo ruoţtu palengvina miokardo paţeidimus. Taip pat tyrimai parodė, kad resveratrolis apsaugo ţinduolių širdis nuo išemijos / reperfuzijos sukeltų paţeidimų, bei nuo nutukimo sukelto širdies paţeidimo [18, 19, 20].

1.3.3. Neuroprotekcinis poveikis

Daugelis tyrimų patvirtina, kad centrinė nervų sistema (CNS) yra vienas iš resveratrolio tikslų. Resveratrolis gali praeiti pro kraujo smegenų barjerą (BBB) ir sukelti apsauginį poveikį neurodegeneracinėms ligoms, tokioms kaip smegenų išemija, Parkinsono liga, Alzheimeris ar dėmesio sutrikimai [21, 22].

Resveratrolio neuroprotekcinė nauda buvo ţinoma nuo tada kai buvo įrodyta, kad jis pagerina kainato sukeltą eksitotoksiškumą. Vėliau įrodyta, kad resveratrolis pagerina histopatologinius ir elgesio rezultatus po įvairių tipų ūminių CNS suţalojimų, įskaitant insultą, trauminį smegenų paţeidimą, subarachnoidinė hemoragiją ir nugaros smegenų paţeidimus. Antrinis smegenų paţeidimas ir neuronų mirtis po ūmaus CNS paţeidimo, pavyzdţiui, insulto, sąveikauja dėl daugelio patofiziologinių mechanizmų, įskaitant oksidacinį stresą, uţdegimą, jonų pusiausvyros sutrikimą ir apoptozę. Įrodyta, kad gydymas resveratroliu uţkerta kelią ar sulėtina daugelį šių patologinių pokyčių, todėl atrodo, kad jo neuroprotekcinius veiksmus įtakoja daugelis numanomų efektorių ir taikinių [22].

Taigi resveratrolis parodė, kad neuromokslų srityje yra perspektyvus neuroprotekcinis junginys dėl savo antioksidacinių savybių ir gebėjimo padidinti SIRT1 junginių aktyvumą, kurie buvo aptikti kaip teigiami Saccharomyces cerevisiae gyvenimo trukmės moduliatoriai, bei yra laikomi pagrindu kuriant perspektyvius terapinius įrankius sergant šiomis ligomis [23].

1.4. Resveratrolio

famakokinetika:

absorbcija,

metabolizmas,

biopasisavinimas

Resveratrolio absorbcijai didelę įtaką daro jo maţas tirpumas vandenyje, todėl norint ją pagerinti, reikėtų padidinti resveratrolio tirpumą. Tam galima naudoti organinius tirpiklius, etanolį ar tam tikrų molekulinių kompleksų sudarymą. Taip pat, nustatyta, kad maistas įtakos neturi, bet resveratrolio vartojimas valgio metu ţymiai sulėtina jo rezorbciją, ypač vartojant su maistu kuriame daug riebalų. Ţarnyne resveratrolis absorbuojamas pasyvios difuzijos būdu arba formuojant kompleksus su membranų pernešėjais [10, 13, 28].

II fazės resveratrolio ar jo metabolitų metabolizmas vyksta kepenyse. Tulţyje vyksta enterohepatinis pernešimas, dėl kurio kai kurie ciklai gali grįţti į plonąją ţarną. Be to, resveratrolis gali

sukelti savo metabolizmą, padidindamas II fazės kepenų detoksikuojančių fermentų aktyvumą. Kadangi resveratrolio metabolizmas yra didelis, susidaro konjuguoti sulfatai, gliukuronidai, kurie išlaiko tam tikrą biologinį aktyvumą. Taip pat ţinoma, kad kiti dietiniai flavonoidai, tokie kaip kvercetinas, gali slopinti resveratrolio sulfataciją ir gliukuronidaciją kepenyse ir dvylikapirštės ţarnos audiniuose, padidindami jo biologinį pasisavinimą [24].

Resveratrolis geriau pasisavina iš maisto papildų nei valgant ar geriant produktus kuriuose jo yra. Išgėrus vaisto resveratrolis ir jo metabolitai pirmiau patenka į kepenis, o tik tada pasiekia likusį organizmą. Vartojant maţas resveratrolio dozes, didţiausia koncentracija plazmoje pasiekiama per pirmąsias 30 minučių. Jeigu vartojamos didesnės dozės, piceido forma arba resveratrolis vartojamas nevalgius, didţiausia koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama per 1,5-2 val. Laisvas resveratrolis absorbuojamas greitai, po 5-6 valandų pastebimas lengvas atoveiksmis, kuris patvirtina enterohepatinio ciklo buvimą, tačiau vartjant resveratrolį intraveniniu būdu antras pikas nėra pasiekiamas [10, 13].

1.5. Optimali resveratrolio farmacinė forma

Resveratrolio, kaip natūralaus šaltinio panaudojimas ribotas dėl jo prasto tirpumo vandenyje, maţo biologinio pasisavinimo ir cheminio nestabilumo. Dėmesys turėtų būti telkiamas į resveratrolio farmacinę formą, kuri padėtų išlaikyti stabilumą, padidintų jo tirpumą vandenyje, siekiant pagerinti jo biologinį pasisavinimą, pasiekti ilgalaikį išsiskyrimą ir galiausiai resveratrolį nukreipti į konkrečias vietas. Norint resveratrolio kapsules sėkmingai pritaikyti, būtina pasirinkti tinkamą kapsuliavimo technologiją, nešiklio medţiagą, apvalkalo medţiagą ir kapsulės savybes. Nešiklio ir apvalkalo pasirinkimo kriterijai daugiausia grindţiami jų fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis, tokiomis kaip tirpumas, molekulinė masė, difuziškumas, padengimo plevele pajėgumas ir emulsiklio savybės. Be to, reikia atsiţvelgti į bendras vartojimo sąnaudas ir maisto saugą [25].

Taigi vienas iš geriausių būdų pagerinti resveratrolio savybes yra kapsuliavimas, panaudojant koloidų pagrindu pagamintas tiekimo sistemas. Svarbus bet kurio bioaktyviojo agento išleidimo sistemos aspektas yra tai, kad jis gali jį išleisti tinkamoje vietoje virškinimo trakte. Skirtingi koloidinių tiekimo sistemų tipai turi skirtingą gebą apsaugoti ir išleisti resveratrolį virškinamajame trakte, kurie gali būti naudojami šio junginio biologiniam pasisavinimui padidinti, pavyzdţiui, maţinant metabolizmą, didinant biologinį pasisavinimą ar padidinant absorbciją. Įrodyta, kad kompleksai, paruošti iš ciklodekstrinų,

padidina hidrofobinių junginių pernešimą per plonosios ţarnos ląstelių gleivinį sluoksnį, taip padidindami oralinį biologinį pasisavinimą. Tikėtina, kad paviršinio aktyvumo ir liposomų pagrindu veikiančios tiekimo sistemos greitai suskaidomos virškinimo trakte dėl jų sąveikos su tulţies druskomis, fosfolipidais ir kitais paviršinio aktyvumo komponentais. Taigi resveratrolis gali patekti į ţarnyno skysčius, kur jis gali būti metabolizuojamas ar absorbuojamas [5, 29].

1.5.1. Ciklodekstrinai

Ciklodekstrinai (CD) yra cikliniai α-1,4-gliukanai, sudaryti nuo šešių iki daugiau nei 100 gliukozės vienetų. Tai yra natūralūs produktai, susidarantys dėl vidinės molekulinės transglikozilinimo reakcijos, kurios metu krakmolas skaidomas fermento ciklodekstrino gliukotransferazės. Fermentinis produktas paprastai yra CD mišinys, apimantis α-, β- ir γ-CD, sudarytus iš atitinkamai šešių, septynių arba aštuonių gliukozės vienetų [26].

Šie CD daţniausiai pasitaikantys natūralūs CD ir vieninteliai naudojami farmacijos produktuose. α-, β- ir γ-ciklodekstrinai yra spurgos formos molekulės, turinčios hidrofilinį išorinį paviršių ir šiek tiek lipofilinę centrinę ertmę. Vandeniniuose tirpaluose jie gali sudaryti vandenyje tirpius lipofilinių silpnai tirpstančių vaistų kompleksus, paimdami kai kuriuos lipofilinius vaistų fragmentus į centrinę ertmę [27].

Ciklodekstrinai daugiausia naudojami formuoti kompleksams, nes pasiţymi šiomis savybėmis:

a) Tirpumo pagerinimas: ciklodekstrinai padidina daugelio blogai tirpstančių vaistų tirpumą vandenyje, sudarydami kompleksus su jų nepolinėmis molekulėmis ar funkcinėmis grupėmis. Gautas kompleksas slepia didţiąją dalį hidrofobinio funkcionalumo CD vidinėje ertmėje, o išorinio paviršiaus hidrofilinės hidroksilo grupės lieka veikiamos aplinkos. Bendras poveikis yra tas, kad susidaro vandenyje tirpus CD-vaisto kompleksas [31, 33].

b) Biologinio pasisavinimo didinimas: CD yra ypač vertingi jei maţas biologinis pasisavinimas yra dėl maţo vaisto tirpumo. Kad per burną pavartotas vaistas atsipalaiduotų, pirmiausia turi ištirpti farmacinė forma. Todėl jei vaistas sudaro kompleksą su CD, padidėja tirpimo greitis ir atitinkamai padidėja ir absorbcija. CD ne tik pagerina tirpumą, bet ir apsaugo nuo aktyvių ingredientų kristalizacijos, sudarydamas atskiras vaisto molekules taip, kad jos nebegalėtų savarankiškai susiburti į kristalinę gardelę [31, 33].

c) Stabilumo gerinimas: CD kompleksų sudarymas naudingas gerinant vaistų cheminį, fizinį ir šiluminį stabilumą. Kad veiklioji molekulė suirtų veikiant deguoniui, vandeniui, radiacijai ar šilumai, turi vykti cheminės reakcijos (fotodegradacija, dehidracija, hidrolizė, sublimacija, oksidacija, terminis irimas, stereocheminės transformacijos ar izomerizacija). Kai molekulė yra patalpinta CD ertmėje, reaktantams sunku difuzuoti į ertmę ir reaguoti su saugoma medţiaga [30, 31].

d) Dirginimo sumaţinimas: skrandį, odą ar akis dirginančios vaistinės medţiagos gali būti įterptos į CD ertmę, kad sumaţintų jų dirglumą. Kompleksas su CD sumaţina vietinio laisvojo vaisto koncentraciją, ţemiau dirginimo slenksčio. Kai kompleksas palaipsniui disocijuojasi ir laisvasis vaistas išsiskiria, jis absorbuojamas kūne, o jo vietinė laisvoji koncentracija visuomet išlieka maţesnė uţ tas, kurios gali dirginti gleivinę [31, 33].

e) Nesuderinamumo prevencija: vaistai daţnai nesuderinami tarpusavyje arba su kitomis neaktyviomis medţiagomis, esančiomis kompozicijoje. Nesuderinamų ingredientų kapsulė CD molekulėje stabilizuoja kompoziciją fiziškai atskirdama komponentus, kad būtų išvengta betkokios sąveikos [26].

f) Kvapo ir skonio maskavimas: nemalonų kvapą ir kartų vaistų skonį galima uţmaskuoti sudarant CD kompleksus. Molekulės ar funkcinės grupės, sukeliančios nemalonų skonį ar kvapą, gali būti paslėptos nuo jutimo receptorių, įterpiant jas į CD ertmę. Gauti kompleksai neturi jokio skonio ar kvapo arba turi silpnesnį, ir yra daug priimtinesni pacientui [29].

g) Medţiagos formavimo pranašumai: medţiagas, kurios yra aliejai arba skysčiai kambario temperatūroje, gali būti sunku formuoti ir sudaryti stabilias kietas dozavimo formas. Kompleksavimas su CD gali tokias medţiagas paversti mikrokristaliniais arba amorfiniais milteliais, kuriuos įprastais gamybos procesais ir įranga galima patogiai apdoroti ir paruošti į kietas dozavimo formas [26].

Taigi būtent dėl šių savybių ciklodekstrinai yra tinkami formuoti kompleksus su resveratroliu. Įrodyta, kad visi kompleksai, sudaryti naudojant α-, β- ir γ-ciklodekstrinus, padidina resveratrolio tirpumą vandenyje efektyviau nei įvairios paviršiaus aktyvios medţiagos [6].

1.5.2. α-, β- ir γ-ciklodekstrinų kompleksai su resveratroliu

Paprastai resveratrolis ir ciklodekstrinai kompleksus sudaro santykiu 1:1. Tai reiškia, kad viena resveratrolio molekulė yra įtraukta į vieną ciklodekstrino molekulę. Tarp patvirtinų kaip saugių vartoti ciklodekstrinų, ciklodekstrinas yra efektyviausias, norint sudaryti kompleksus su resveratroliu. β-ciklodekstrinas taip pat yra daţniausiai maisto pramonėje naudojamas β-ciklodekstrinas dėl jo plataus prieinamumo ir palyginti ţemos kainos [6].

Įrodyta, kad visi kompleksai, sudaryti naudojant α-, β- ir γ-ciklodekstrinus, padidina resveratrolio tirpumą vandenyje efektyviau nei įvairios paviršiaus aktyvios medţiagos. Naudojant β-ciklodekstriną, resveratrolio tirpumas vandenyje gali padidėti nuo maţdaug 2 kartų iki maţdaug 100 kartų. α-ciklodekstrino tirpumas vandenyje yra beveik aštuonis kartus didesnis nei β-α-ciklodekstrino, bet maţdaug 1,6 karto maţesnis nei γciklodekstrino 25 °C temperatūroje. Palyginti su β ir γciklodekstrinais, α -ciklodekstrinas yra ţymiai atsparesnis rūgščių tirpalų hidrolizei. Jo negalima akivaizdţiai hidrolizuoti ţmogaus seilių ir kasos amilazėmis. β-ciklodekstrinas pasiţymi panašiu atsparumu fermentinei hidrolizei, kurią sukelia ţmogaus seilių ir kasos amilazės. Palyginimui, γ-ciklodekstrinas yra gana lankstus ir gali būti greitai ir iš esmės visiškai virškinamas ţmogaus seilių ar kasos amilazių [6].

Taip pat svarbu tai, kad ciklodekstrinai gali būti naudojami kaip stimuliatoriai ekstrahuojant resveratrolį iš natūralių šaltinių. Toks CD panaudojimas galėtų būti ekonomiškas ir ekologiškas būdas atskirti bioaktyvius fenolio junginius nuo augalinės matricos. Pavyzdţiui, resveratrolio ekstrahavimas iš vynuogių išspaudų naudojant β-ciklodekstrinus padidėjo, palyginti su ekstrakcija, naudojant tik vandenį, ar ekstrakciją metanoliu. Naudojant β-ciklodekstrinus, gaunama daugiau grynų ekstraktų, turinčių tą patį antioksidantinį aktyvumą [6].

1.5.3. Kiti kompleksai su resveratroliu

Resveratrolis taip pat gali būti patalpintas ir kitų formų kompleksuose. Pavyzdţiui, resveratrolio kapsuliavimui gali būti naudojamos mielių ląstelės. Tokiu atveju reikalingas aukštas slėgis (25 MPa 4 h) tam, kad paskatinti resveratrolio įterpimą į tuščias mielių ląsteles. Šis kapsuliavimo būdas pagerina resveratrolio šiluminį ir UV stabilumą normaliomis ir pagreitintomis laikymo sąlygomis. Šiuo atveju nustatyta, kad imitacinėje skrandţio terpėje per 90 min. išsiskiria 90 % resveratrolio [6].

Resveratrolis taip pat gali jungtis su tam tikros rūšies baltymais fizinės sąveikos, tokios kaip hidrofobinė sąveika, vandenilinės jungtys ir van der Waals’o jėgos, metu. Tyrimai parodė, kad resveratrolis sudaro 1:1 kompleksą su baltymais, o tai reikšmingai nekeičia antrinės baltymų struktūros. Resveratrolio ir baltymų kompleksai išlieka stabilūs esant rūgščiam pH, o resveratrolio geba jungtis padidėja virš terminės denatūracijos temperatūros. Taip yra greičiausiai dėl padidėjusio paviršiaus hidrofobiškumo [6].

Resveratrolio-β-laktoglobulinų surišimas parodė teigiamą poveikį resveratrolio tirpumui vandenyje ir šiek tiek padidino jo foto stabilumą. Mokslininkai įvertindami jungimosi tarp resveratrolio ir baltymų potencialą, ištyrė galimybę naudoti pasukas (šalutinį pieno pramonės produktą) kaip galimą resveratrolio nešiklį. Nustatyta, kad didţioji dalis pridėto resveratrolio prisijungė prie kazeino nuosėdų frakcijos. Pasukos ar kiti pieno produktai, tokie kaip išrūgų baltymų suspensija, galėtų būti naudojami kaip resveratrolio nešėjai. Šių šalutinių produktų, kaip resveratrolio nešiklių, naudojimas galėtų suteikti jiems papildomos naudos ir pagerinti resveratrolio savybes [6].

1.6. Lietuvos rinkoje esantys resveratrolio maisto papildai

Išanalizuoti Lietuvos vaistinėse parduodami maisto papildai, kurių sudėtyje yra resveratrolis. Preparatų cheminė sudėtis pateikta 1 lentelėje:

1 lentelė. Maisto papildai, kurių sudėtyje yra resveratrolis

Pavadinimas

Sudėtis

Veiklioji medţiaga Pagalbinės medţiagos

Maisto papildas – 1 (kapsulės 100mg)

Tikrojo vynmedţio (Vitis

vinifera L.) uogų odelių

ekstraktas

Ţelatina, mikrokristalinė celiuliozė, riebalų rūgščių druskos, titano dioksidas, geltonasis geleţies oksidas

Maisto papildas-2 (kapsulės 50 mg)

Plačialapių rūgčių

(Polygonum cuspidatum) šaknų sausasis ekstraktas

Ţelatina, laktozė, sojų pupelių milteliai, kukurūzų krakmolas, magnio stearatas, silicio dioksidas, titano dioksidas, briliantinis mėlynasis FCF, ponso 4R, indigokarminas Maisto papildas-3 (kapsulės 200 mg) Plačialapių rūgčių (Polygonum cuspidatum) šaknų sausasis ekstraktas

Laktozės monohidratas, skersinio ryšio natrio karboksimetilceliuliozė, mikrokristalinė celiuliozė, hidroksimetilpropilceliuliozė, polivinilo alkoholis, titano dioksidas, riebalų rūgščių magnio druskos, talkas, polietilenglikolis, raudonasis geleţies oksidas, sojų lecitinas

Maisto papildas-4

(kapsulės 100 mg ir 250 mg)

Plačialapių rūgčių

(Polygonum cuspidatum) šaknies sausasis ekstraktas

Ţelatina, tirštiklis

mikrokristalinė celiuliozė, magnio stearatas, lipnumą reguliuojanti medţiaga silicio dioksidas.

Remiantis Lietuvos vaistinėse parduodamų resveratrolio maisto papildų sudėtimi, matoma, kad daţniausiai resveratrolis išgaunamas iš plačialapių rūgčių šaknų, tik vienas gamintojas resveratrolį išgauna iš kito šaltinio – tikrojo vynmedţio uogų odelių. Resveratrolio farmacinė forma – kapsulės, o

koncentracija nuo 50 mg iki 250 mg.

Daţniausiai kietos kapsulės apvalkalas yra formuojamas iš ţelatinos arba hidroksimetilpropilceliuliozės (HPMC), kas atsispindi ir rinkoje esančių kapsulių sudėtyje. Be tirpinamųjų polimerų, ţelatinos ar HPMC, tirpale gali būti ir kitų priedų, tokių kaip daţikliai (titano dioksidas, geltonasis geleţies oksidas, briliantinis mėlynasis FCF, ponso 4R, indigokarminas, raudonasis geleţies oksidas) [30]. Du svarbūs vaistų pateikimo kietose ţelatinos kapsulėse reikalavimai yra tai, kad kapsulės apvalkalo tūryje turi būti reikiama vaistinės medţiagos dozė ir ji turi būti atpalaiduojama reikiamu greičiu. Dėl to su vaistine medţiaga dedamos ir kitos pagalbinės medţiagos, tokios kaip skiedikliai – visiškam apvalkalo uţpildymui, lubrikantai – uţtikrinti pakartojamą uţpildymą, drėkinantys agentai - siekiant skatinti skysčio prasiskverbimą į hidrofobinį miltelių pavidalo vaistą arba preparatą, kuriame yra hidrofobinio lubrikanto [31].

Taigi norint uţpildyti kapsules resveratrolis maišomas su kitomis pagalbinėmis medţiagomis. Daţniausiai naudojami uţpildų rišamųjų medţiagų tipai yra laktozė, krakmolas, dvibazis kalcio fosfatas ir celiuliozė, tokia kaip mikrokristalinė celiuliozė (MC). Renkantis blogo tirpumo vaisto uţpildo rišiklį, geriau pasirinkti vandenyje tirpius rišiklius, tokius kaip laktozė. Šiuo atveju gamintojai naudojo laktozę, krakmolą, bei MC. Krakmolas taip pat gali būti naudojamas kaip medţiaga suirimui pagerinti. Magnio stearatas yra vienas efektyviausių ir populiariausių drėkiklių, slidiklių. Vaistams, kurie pasiţymi prastu biologiniu pasisavinimu, gali būti naudojamos paviršinio aktyvumo medţiagos (PAM), kurios padidina miltelių masę ir tokiu būdų pagerina drėkinimą, tirpimą, bei biologinį pasisavinimą. Dvi daţniausiai naudojamos paviršiaus aktyviosios medţiagos yra natrio dokusatas (SDS) ir natrio laurilsulfatas (SLS). Lietuvos visuomeninėse vaistinėse esančiose resveratrolio kapsulėse naudojamas SLS. Taip pat kapsulių sudėtyje buvo naudotos lipnumą reguliuojančios medţiagos (riebalų rūgščių druskos), stabilizatoriai-plastifikatoriai (poliatilenglikolis). Talkas – išoriškai naudojamuose vaistiniuose preparatuose, atlieka indiferentinės medţiagos vaidmenį, polivinilo alkoholis – kaip drėgmės šalintojas [30]

2. TYRIMO METODIKA

Modeliuoti įvairūs resveratrolio miltelių mišiniai ir atlikti miltelių technologinių savybių tyrimai. Tuomet buvo gaminamos keturių skirtingų sudėčių kietos ţelatininės kapsulės. Kapsulių kokybei vertinti buvo atliekamas turinio masės vienodumo testas, suirimo ir tirpimo testai. Rezultatai apdoroti statistiškai, naudojant kompiuterinę programą „MS Excel 2010“ (Microsoft Corporation, JAV).

2.1. Tyrimo objektas

Keturių skirtingų sudėčių kietosios ţelatininės kapsulės su resveratroliu.

2.2. Tyrimo medţiagos ir prietaisai

Darbe naudoti prietaisai:

 Analitinės svarstyklės GX-200, A&D Company (Japonija);

 Drėgnomatis KERN MLS (Vokietija);

 Optinis mikroskopas Motic Instruments, Inc. (Vokietija);

 Aparatas birumo nustatymui ERWEKA AG (Vokietija);

 Kūgio kampo nustatymo prietaisas Erweka AG (Vokietija);

 Suberiamosios masės nustatymo prietaisas SVM 102, Erweka (Vokietija);

 Sietai ir sietų purtyklės. Tinklelių rinkinys AS 200 basic Retsch (Vokietija);

 Kapsuliavimo mašinėlė Capsuline – 15 (JAV);

 Suirimo laiko nustatymo prietaisas Erweka (Vokietija);

 Prietaisas kapsulių tirpumo tyrimams SOTAX DT-2 (Vokietija);

 Chromatografinė sistema ,,Waters Alliance 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi ,,Waters 996‘‘;

 Ekstrakcijos kasetės ,,Oasis HLB 1cc “ (30 mg, Waters Corporation, Milford, JAV).

Darbe naudotos medţiagos:

 Kietos ţelatininės kapsulės 1 dydis, spalvotos, Capsuline (JAV);

 Standartizuotas trans-resveratrolis (≥98 %, Alfa Aesar, JAV);

 Prosolv HD 90, sudaryta iš 98 proc. MKC ir 2 proc. koloidinio SDO (JRS Pharma LP, Paterson, Vokietija);

 Mikrokristalinė celiuliozė (Alfa Aesar, A Johnson Matthey Company, Vokietija);

 α-ciklodekstrinas;

 β-ciklodekstrinas;

 γ-ciklodekstrinas;

 Metanolis (≥99,9 %, Sigma-Aldrich, Vokietija);

 Acetonitrilas (99,8 %, Sigma-Aldrich, Vokietija);

 Acto rūgštis (≥99 %, Sigma Aldrich, Vokietija);

 Dejonizuotas vanduo paruoštas išgryninto vandens paruošimo sistema ,,Millipore“ (JAV);

 Koncentruota vandenilio chlorido rūgštis (Fluka Chemie, Vokietija);

 Natrio chloridas (Natrii chloridum Eur. Ph. 6; 01/2008:0193) (Merck, Vokietija);

 Pepsinas.

2.3. Tyrimo metodai

Miltelių technologinėms savybėms įvertinti nustatytas miltelių mišinių Carr’o indeksas, Hausner’io koeficientas, laisvai beriamų miltelių kūgio kampas ir birumo greitis. Pagamintų kietųjų ţelatininių kapsulių kokybės rodiklių vertinimui nustatytas masės vienodumas ir kapsulių suirimo, bei tirpimo laikas.

2.3.1. Miltelių mišinio birumo vertinimas

Pasveriama 50,0 g miltelių mišinio 0,01 g tikslumu, ir atsargiai, nepurtant, suberiama į prietaiso piltuvėlį. Prietaisas ir chronometras įjungiami vienu metu. Po 20 sek. purtymo, atidaroma piltuvėlio uţsklanda. Stebima, per kiek laiko milteliai išbyra iš piltuvėlio į surinkimo indą. Bandymas pakartojamas 5 kartus. Birumas turi būti ne maţesnis kaip 4 – 5 g/sek.

Birumas apskaičiuojamas naudojant formulę:

– birumas (g/sek.)

m – pasvertų miltelių masė (g) t – bandymo laikas (sek.) 20 – purtymo laikas (sek.)

Bandymų duomenys apskaičiuojami naudojant formulę: ∑

– birumo vidurkis n – 5 (bandymų skaičius)

– birumas (g/sek.)

Tuo pačiu prietaisu yra nustatomas laisvai išbyrėjusių miltelių kūgio kampas, t.y. kampas tarp išbyrėjusių miltelių kūgio ir horizontalaus paviršiaus (2 lentelė).

2 lentelė. Miltelių birumo įvertinimas pagal kūgio kampą (Eur.Ph. 2.9.36)

BIRUMAS KŪGIO KAMPAS

Puikus 25° – 30° Geras 31° – 35° Vidutinis 36° – 40° Priimtinas 41° – 45° Blogas 46° – 55° Labai blogas ≥ 56°

Remiantis Eur.Ph. 01/2008:20916 straipsniu, jei išbyrėjusių miltelių kūgio kampas yra 25° – 30°, tai jų birumas yra puikus, jeigu 31° – 35° - birumas laikomas geru, o 36° – 40° parodo vidutinį birumą. Jei miltelių kūgio kampas 41° – 45° birumas laikomas priimtinu, o nuo 46° iki 55° - blogu. Jeigu išbyrėjusių miltelių kūgio kampas yra lygus 56° arba daugiau, milteliai laikomi labai blogai biriais.

2.3.2. Miltelių mišinio suberiamojo tankio, suberiamosios masės nustatymas

Suberiamasis tankis – tai laisvai subertos medţiagos masės ir tūrio santykis. Kietos medţiagos suberiamasis tankis priklauso nuo dalelių dydţio, jų poringumo, formos, o miltelių mišinio suberiamasis tankis - nuo miltelių paruošimo ir laikymo.

Pagal Ph.Eur.2.9.34 straipsnį, miltelių mišinių suberiamasis tankis matuojamas į matavimo cilindrą beriant tiksliai pasvertą miltelių kiekį.

Apskaičiuojama naudojant formulę:

- suberiamasis tankis (g/ml) M – medţiagos masė (g) V° – medţiagos tūris (ml)

Miltelių mišinių didţiausiam suberiamajam tankiui apskaičiuoti naudojamas tankinimo prietaisas, sudarytas iš 250 ml talpos graduoto matavimo cilindro, įtvirtinto ant platformos (pakilimo aukštis – 3 mm). Į cilindrą beriamas tiksliai pasvertas miltelių mišinio kiekis. Tiriamoji medţiaga turi sudaryti du trečdalius cilindro tūrio. Parenkamas prietaiso veikimo reţimas, nustomi bandymo parametrai. Tankinimas vykdomas judesiu aukštyn ir ţemyn. Tyrimas tęsiamas atliekant tankinimus maţesniais intervalais iki 2500 sutankinimų, kol skirtumas tarp didţiausių suberiamųjų tankių bus maţesnis nei 2 proc. Tuomet uţrašomas galutinis miltelių tūris cilindre.

–didţiausias suberiamasis medţiagos tankis (g/ml)

M – medţiagos masė (g)

– medţiagos tūris po sutankinimo (g/ml)

2.3.3. Miltelių Carr’o indekso ir Hausner’io koeficiento nustatymas

Carr’o indeksas (CI) arba suspaudţiamumo indeksas ir Hausner’io koeficientas (HR) yra nustatomi miltelių birumui apibūdinti. Atlikus miltelių tankio matavimus, po 2500 sutankinimų, apskaičiuojamas CI ir HR pasinaudojant formulėmis:

CI – Carr’o indeksas (%)

– medţiagos suberiamasis tankis (g/ml)

– medţiagos didţiausias suberiamasis tankis (g/ml)

HR – Hausner’io koeficientas

– medţiagos suberiamasis tankis (g/ml)

– medţiagos didţiausias suberiamasis tankis (g/ml)

3 lentelė. Miltelių birumo vertinimas pagal Carr’o indeksą ir Hausner’io koeficientą

BIRUMAS CARR’O INDEKSAS

(%) HAUSNER’IO KOEFICIENTAS Puikus < 10 1,00 – 1,11 Geras 11 – 15 1,12 – 1,18 Vidutinis 16 – 20 1,19 – 1,25 Priimtinas 21 – 25 1,26 – 1,34 Blogas 26 – 31 1,35 – 1,45 Labai blogas 32 – 37 1,46 – 1,59

Labai, labai blogas >38 >1,60

Remiantis literatūra, ţinoma, kad maţesnis Carr’o indeksas parodo geresnes miltelių birumo savybes. Miltelių, kurių Hausner’io koeficientas maţesnis arba lygus 1,34 pasiţymi „priimtinu“ birumu, o jei koeficientas didesnis uţ 1,34 – miltelių birumas laikomas „blogu“. Kapsulės uţpildymas reikiamu miltelių kiekiu lemia kapsulių masės vienodumą, tačiau jis priklauso ne tik nuo miltelių birumo, bet ir nuo suspaudţiamumo. Būtent dėl to kapsulės uţpildo tūris gali būti nuspėjamas pagal CI.

2.3.4. Mikroskopinė miltelių mišinio analizė

Miltelių mišiniai analizuoti optiniu mikroskopu Motic Instruments, Inc. (Vokietija), siekiant įvertinti dalelių dydį ir formą. Tam, kad matavimai būtų tikslesni, nedideli preparatų kiekiai imami iš skirtingų miltelių mišinio vietų. Tuomet preparatai stebimi praeinančioje šviesoje esant 40x didinimui. Mikroskopas sujungtas su kamera ir kompiuteriu. Kompiuterinė programa automatiškai išmatuoja ilgį - atstumą tarp dviejų toliausiai nutolusių taškų dalelėje. Vaizdas stebimas kompiuterio ekrane.

2.3.5. Miltelių drėgmės kiekio nustatymas

Miltelių drėgmės kiekiui įvertinti naudotas drėgnomatis KERN MLS (Vokietija). Pasirinktas „standartinis šildymo“ metodas. 1 g (0,001 g tikslumu) tiriamojo miltelių mėginio dţiovinama 120 °C temperatūroje iki pastovios masės. Gautas rezultatas yra masės netektis dţiovinant procentais.

Nuodţiūvis (proc.) apskaičiuojamas remiantis formule:

m1- ţaliavos masė gramais prieš dţiovinimą;

m2 - ţaliavos masė gramais po dţiovinimo.

2.3.6.

Granuliometrinė sudėtis

Dalelių suskirstymas pagal stambumą, frakcinė sudėtis daro įtaką birumui, vaistinių medţiagų dozavimo tikslumui, tablečių ar kapsulių kokybei. Greičiausias ir patogiausias dispersiškumo nustatymas yra sietų analizė. Milteliai suberiami ant stambiausio sieto. Visi sietai purtomi 10 min. Sietų angelių diametrai yra 450 µm, 224 µm, 125 µm. Sijojimas atliktas taisyklingai, jei papildomai purtant sietą 1 minutę ant popieriaus lapo išbyra maţiau kaip 1 % miltelių, likusių ant sieto. Išbyrėję milteliai uţpilami ant ţemiau esančio sieto, o likę ant sieto milteliai pasveriami. Tuomet atsiţvelgiant į sijoti atsvertą miltelių kiekį, apskaičiuojamas kiekvienos frakcijos procentinis kiekis.

2.3.7.

Kapsulių masės vienodumas

Pagal Eur. Ph. 6; 01/2008:20905 tyrimui atlikti imama 20 atsitiktinai parinktų kapsulių, sveriama ir apskaičiuojama vidutinė kapsulės masė. Visų pirma pasveriama nepaţeista kapsulė, o tuomet ji atidaroma, išberiamas visas turinys ir pasveriamas apvalkalas. Turinio masė yra skirtumas tarp nepaţeistos kapsulės masės ir jos apvalkalo masės: turinio masė = kapsulės masė – apvalkalo masė. Svėrimai

pakartojami su kitomis 19 kapsulių. Apskaičiuojama vidutinė vienos kapsulės masė. Europos farmakopėjoje kietosioms kapsulėms keliami masės reikalavimai nurodyti 4 lentelėje.

4 lentelė. Leistini kapsulių vidutinės masės nuokrypiai

Farmacinė forma Vidutinė masė (mg)

Leistinas nuokrypis (%) (maţiausiai 18 kapsulių) Leistinas nuokrypis (%) (daugiausiai 2 kapsulėms) Kapsulė < 300 10 20 ≥ 300 7,5 15

Remiantis Eur.Ph.2.9.6 straipsniu, kai vidutinė kapsulės masė yra maţesnė nei 300 mg, leistinas masės nuokrypis yra 10 proc., iš kurių ne daugiau kaip dviems kapsulėms iš dvidešimties galimas 20 proc. leistinas nuokrypis. O kai vidutinė kapsulės masė yra didesnė arba lygi 300 mg, leistinas masės nuokrypis - 7,5 proc., iš kurių ne daugiau kaip dviems kapsulėms iš dvidešimties galimas 15 proc. leistinas nuokrypis. Jei vidutinė kapsulės masė yra lygi arba maţesnė kaip 40 mg, privaloma atlikti ir vienadozių preparatų turinio vienodumo nustatymą.

2.3.8. Kapsulių suirimo laikas

Kapsulių suirimo laikas nustatytas pagal Eur. Ph. 5; 01/2005:20901, tablečių ir kapsulių suirimo testą. Naudotas prietaisas Erweka (Vokietija), suirimo laikui nustatyti. Prietaisą sudaro stiklinis cilindras iš šešių stiklinių kiaurų vamzdelių. Apatinė vamzdelių dalis atitverta tinkleliu, vamzdeliai pritvirtinti prie plastikinio korpuso. Iš kiekvienos serijos parenkamos šešios kapsulės. Kapsulės panardinamos atskirai į kiekvieną vamzdelį. Korpusas panardinamas į 900 ml išgryninto vandens terpę, kurioje palaikoma pastovi 37±0,5 °C temperatūra, vertikalių judesių greitis 80 k/min. Kapsulės turi suirti ne ilgiau kaip per 15 min. Bandymas kartojamas 3 kartus.

2.3.9. Kietųjų farmacinių formų tirpimo testo in vitro modelis

Tirpimo testas buvo atliekamas, norint įvertinti resveratrolio atpalaidavimą iš kapsulių. Kapsulių tirpimo in vitro tyrimui naudotas SOTAX DT-2 (Vokietija) mentinis prietaisas. Prietaisą sudaro nustatytu greičiu besisukančios mentės, įmerktos į vandens vonią. Į prietaiso cilindrinius pusrutuliniu dugnu indus yra supilta 500 ml tiriamosios terpės (pH 1,5, pH 1,2 ir pH 7). Terpė, kurios pH 1,5 sudaryta iš 2 g natrio chlorido, 3,2 g pepsino miltelų, 80 ml 1M vandenilio chlorido rūgšties ir praskiesta išgrynintu vandeniu iki 1 l ţymos. Terpė, kurios pH 1,2 sudaryta iš 2 g natrio chlorido, 7 ml 1M vandenilio chlorido rūgšties ir išgryninto vandens iki 1 l. Terpė pH 7 – išgrynintas vanduo, paruoštas naudojant Millipore (JAV) vandens valymo sistemą. Prietaise palaikoma pastovi 37±0,5 °C temperatūra. Atsitiktinai parinktos kapsulės yra įdedamos į indą ir prietaisas paleidţiamas suktis. Prietaiso mentės sukasi 100 aps/min. Tyrimo trukmė 3 valandos. Mėginiai iš pradţių imami kas 15 min. pradedant nuo 30 min. (30 min., 45 min., 60 min.), po to kas 30 min. (90 min., 120 min., 150 min. ir 180 min.) automatinėmis pipetėmis po 2 ml ir tuoj pat įpilama atgal 2 ml tirpimo terpės, kad būtų pastovus tirpimo terpės tūris. Paimtiems mėginiams atliekama išsiskyrusio resveratrolio analizė naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą.

2.3.10.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas

Iš šių tirpiklių buvo sudarytas binarinis gradientas: A: acetonitrilas - acto rūgštis - vanduo (20:2:78 v/v) ir B: acetonitrilas - acto rūgštis - vanduo (90:2:8 v/v).

Kolonėlė termostatuojama 25 °C temperatūra. Mobilios fazės tekėjimo greitis: 1,0 ml/min. Injekcijos tūris: 10 µl. Detekcija: trans-resveratrolio aptikimui naudojamas 305,0 nm šviesos bangos ilgis. Sulaikymo laikas: apie 13 min. Duomenų rinkimui ir analizei buvo naudojama Empower Chromatography Data Software (Waters Corporation, Milford, JAV) programinė įranga.

Ruošiamas etaloninis tirpalas: atsveriamas tikslus kiekis – 20 mg standartizuoto trans-resveratrolio (≥98 %). Milteliai suberti į 10 ml matavimo kolbą, bei tirpinami 5 ml metanolio ir skiedţiami išgrynintu vandeniu iki 10 ml ţymos. Paruoštas etaloninis tirpalas supilamas į tamsaus stiklo buteliuką ir laikomas šaldytuve.

Tuomet ruošiami mėginiai: vienos kapsulės turinys suberiamas į 100 ml tūrio matavimo kolbutę. Tirpinamas 30 ml metanolio ir skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml ţymos. Tirpalas filtruojamas per membraninius 0.45 µm porų skersmens filtrus. Imamas 1 ml šio paruoštos tirpalo ir skiedţiamas

išgrynintu vandeniu iki 10 ml ţymos. Paruoštas tirpalas tiesiogiai analizuojamas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Miltelių technologinių savybių vertinimas

Šio darbo tikslas buvo pagaminti kietas kapsules su resveratroliu, panaudojant tinkamas pagalbines medţiagas. Pasirinkti ir tirti dviejų skirtingų rūšių miltelių mišiniai. Iš pradţių buvo tiriamos atskirų miltelių, tuomet jų mišinių technologinės savybės, kurios yra svarbios gaminant tokias vaistų formas kaip kapsulės. Resveratrolio birumas yra vienas svarbiausių veiksnių. Jis buvo vertinamas pagal Carr’o indeksą (CI), Hausner’io koeficientą (HK), birumo indeksą (BI), suberiamąją masę ir subėrimo kampą (SK). Birumo parametrai – CI, HK ir SK nustatomi skaitmenine išraiška ir tyrimo duomenys, patenkantys į nustatyto dydţio ribas, vertinami atitinkamais apibrėţimais. Birumas gali būti vertinamas nuo puikaus iki labai blogo. Birumo savybių tyrimai atlikti su resveratroliu parodė, kad resveratrolio milteliai yra visiškai nebirūs, dulka, lengvai įsielektrina ir kimba prie indų paviršiaus. Atliekant birumo testą milteliai visai neišbyrėjo, prietaisas uţsikišo, todėl nepavyko nustatyti nei birumo, nei kūgio kampo. Taigi, galima daryti išvadą, kad resveratrolis netinka kapsuliavimui, o norint pagaminti kokybiškas kapsules reikia pridėti pagalbinių medţiagų, kurios pagerintų resveratrolio birumą. Tuomet buvo dedamos ir tiriamos pagalbinės medţiagos gerinančios resveratrolio birumą, bei tiriami jų mišiniai su resveratroliu. Pagalbinėmis medţiagomis buvo pasirinkta mikrokristalinė celiuliozė (MC) ir pagalbinių medţiagų mišinys Prosolv’as HD 90, kuris sudarytas iš 98 proc. MC ir 2 proc. koloidinio SDO. Nustatoma kuri medţiaga geriausiai tinka ir kokia didţiausia galima resveratrolio koncentracija esant puikiam birumui.

Remiantis tyrimų duomenimis geresnėmis savybėmis pasiţymėjo prosolv’as, o didţiausia galima resveratrolio koncentracija esant puikiom mišinio technologinėm savybėm nustatyta 10 proc. Šio mišinio savybės buvo tinkamos berti į kapsules.

3.1.1.

Miltelių ir jų mišinių birumo tyrimas

Birumas nustatomas pasvėrus 50 g kiekvienų miltelių atskirai 0,01 g tikslumu. Tada atsargiai ir nepurtant milteliai suberiami į prietaiso piltuvėlį. Prietaisas ir chronometras įjungiami vienu metu. Po 20 sek. purtymo atidaroma piltuvėlio uţsklanda ir stebima, per kiek laiko milteliai išbyra iš piltuvėlio į surinkimo indą. Bandymas pakartotas 5 kartus. Rezultatai pateikti 5 lentelėje.

5 lentelė. Miltelių birumas

Medţiagos/ mišiniai

Birumas (g/sek.) Kūgio kampas (laipsniais)

Įvertinimas pagal Eu.ph.

Resveretrolis 0 0 Labai blogas

Mikrokristalinė

celiuliozė 4,2±0,09 35±1,9 Geras

Prosolv HD 90 6,3±0,3 15±2,2 Puikus

Tyrimas kartotas 5 kartus (n=5)

Atlikus eksperimentą nustatyta, kad geriausiu birumu pasiţymi prosolv’as HD 90. Jo birumas 6,3 g/s, o kūgio kampas yra 15°, kas taip pat parodo puikų birumą. Mikrokristalinės celiuliozės birumas yra 4,2 g/s, o kūgio kampas 35°, taigi birumas yra geras, tačiau milteliai šiek tiek maţiau birūs nei prosolv’o HD 90. Tuo tarpu pats resveratrolis yra visiškai nebirus, todėl jo kūgio kampo ir birumo greičio nustatyti nebuvo įmanoma.

3.1.1.1. Resveratrolio įtaka miltelių mišinio su prosolv’u HD 90

birumui

Kadangi prosolv’as HD 90 pasiţymėjo geriausiu birumu, o resveratrolis buvo visai nebirus, norint pagerinti resveratrolio birumą, buvo gaminami mišiniai su prosolv’u HD 90. Mišiniai gaminami į prosolv’ą HD 90 įdedant resveratrolio. Resveratrolio koncentracija didinama ir stebima, kaip jo koncentracija mišinyje daro įtaką mišinio birumui. Rezultatai pateikti 1 paveiksle.

1 pav. Resveratrolio įtaka miltelių su prosolv’u HD 90 birumui

*p<0,05 vs 11 % - 20 % resverarolio koncentracijomis

Atlikus eksperimentą, nustatyta didţiausia galima resveratrolio koncentracija, kai mišinio birumas puikus. Iš grafiko matoma, kad didėjant resveratrolio koncentracijai mišinyje, miltelių birumas maţėja. Didţiausia resveratrolio koncentracija, dar esant puikiam birumui yra 10 % (birumas 5,23 g/s), taip pat geras birumas kai resveratrolio yra 11 % ir 12 % (birumas 3,9 g/s ). Nuo 13 % iki 17 % resveratrolio koncentracijų, birumas maţėja iki labai blogo. Esant 18 % resveratrolio mišinio birumas jau labai blogas, o pasiekus 20 % miltelių mišinys visiškai nebyra.

Atitinkamai kinta ir mišinio kūgio kampas (2 pav.):

2 pav. Resveratrolio įtaka miltelių su prosolv’u HD 90 kūgio kampui

0 1 2 3 4 5 6 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 B ir u m as g/ s Resveratrolio koncentracija %

Resveratrolio įtaka birumui

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 K ū gi o kam p as ( °) Resveratrolio koncentracija % Resveratrolio įtaka kūgio kampui * * *

*p<0,05 vs 13 % - 18 % resveratrolio koncentracijomis

Atlikto bandymo rezultatai parodė, jog didėjant resveratrolio koncentracijai mišinyje, jo kūgio kampas taip pat didėja, kol milteliai tampa nebirūs ir kūgio kampo nustatyti neįmanoma. Kūgio kampas kaip ir birumo greitis įrodo, kad geriausios mišinio technologinės savybės yra kai resveratrolio koncentracija 10 %, kūgio kampas 30°. Nuo 10 % resveratrolio koncentracijos iki 13 % resveratrolio kūgio kampo reikšmė didėjo, tačiau atsiţvelgiant į kūgio kampą birumas buvo geras, nuo 14 % iki 16 % - birumas vidutinis, o nuo 17 % pakito iki priimtino. Pasiekus 19 % resveratrolio koncentraciją, milteliai visai nebiro, ir kūgio kampo nustatyti nebuvo įmanoma.

3.1.1.2. Resveratrolio įtaka miltelių su MC birumui

Gerinant resveratrolio technologines savybes, buvo gaminami mišiniai ir su mikrokristaline celiulioze. Į mikrokristalinę celiuliozę dedamas resveratrolis. Resveratrolio koncentracija didinama ir stebima, kaip jo koncentracija mišinyje daro įtaką mišinio birumui.

3 pav. Resveratrolio įtaka miltelių su MC birumui

*p<0,05 vs 3 % - 14 % resveratrolio koncentracijomis

Atlikus tyrimą, nustatyta didţiausia galima resveratrolio koncentracija esant geram birumui. Matome, kad kaip ir su prosolv’u HD 90, didėjant resveratrolio koncentracijai mišinyje, miltelių birumas atitinkamai maţėja. Didţiausia resveratrolio koncentracija, dar esant geram birumui yra 2 % (birumas 2,32

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 B ir u m as g/ s Resveratrolio koncentracija % Resveratrolio įtaka birumui

*

*

g/s), tačiau lyginant su prosolv’o HD 90 mišiniais, šiame mišinyje su 2 % MC birumas yra tik geras, o prosolv’o HD 90 su 10 % resveratrolio birumas buvo vertinamas kaip puikus. Jei mišinyje yra 3 % arba 4 % resveratrolio, mišinio birumas reikšmingai sumaţėja iki 1,4 g/s, lyginant su 2 %. Tuomet birumas vis maţėja, kol galiausiai įdėjus 12 % resveratrolio birumas stipriai blogėja, o padidinus iki 14 % miltelių mišinys visai nebyra.

Nustatyta ir resveratrolio koncentracijos įtaka mišinio kūgio kampui:

4 pav. Resveratrolio įtaka milelių su MC kūgio kampui

*p<0.05 vs 4 % - 13 % resveratrolio koncentracijomis

Mišinio su MC birumas, vertinant pagal kūgio kampą kinta panašiai kaip ir su prosolv’u. Didėjant resveratrolio koncentracijai kūgio kampas didėja, kol milteliai tampa nebirūs ir nustatymas neįmanomas. Matoma, kad MC mišinys su resveratroliu pasiţymi prastomis savybėmis, esant tik 2 % resveratrolio mišinio kūgio kampas yra 45°, kuris reiškia, kad birumas yra tik priimtinas. Įdėjus 3 % resveratrolio, kūgio kampas 47° ir vis didėja iki 63°, todėl didėjant koncentracijai, technologinės savybės tik blogėja, o gauti kūgio kampo rezultatai rodo labai blogą birumą. Pasiekus 14 % resveratrolio koncentraciją, milteliai visiškai nebyra ir kūgio kampo nustatyti neįmanoma.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 K ū gi o kam p as ( °) Resveratrolio koncentracja % Resveratrolio įtaka kūgio kampui * *

3.1.2. Miltelių Carr’o indekso ir Hausner’io koeficiento nustatymas

Carr’o indeksas ir Hausner’io koeficientas taip pat parodo miltelių mišinio technologines savybes. Remiantis šiais parametrais galima įvertinti ar miltelių mišinys yra pakankamai birus.

Suberiamasis tankis priklauso nuo miltelių dalelių dydţio, formos, dalelių tankio ir drėgmės. Pasveriama 5,0 g tiriamųjų miltelių 0,001 g tikslumu ir suberiama į prietaiso matavimo cilindrą. Nustatoma purtymo amplitudė 150 - 200 svyravimų/min. ir įjungiamas prietaisas. Stebimas miltelių lygio kitimas cilindre. Kai miltelių lygis cilindre nebekinta, prietaisas išjungiamas. Purtymas trunka 5 – 10 min. Remiantis gautais rezultatais apskaičiuojamas Carr’o indeksas ir Hausner’io koeficientas. Rezultatai pateikti 5 paveiksle.

5 pav. Resveratrolio ir pagalbinių medžigų birumo vertinimas pagal Carr’o indeksą

*p< 0.05

6 pav. Resveratrolio ir pagalbinių medžigų birumo vertinimas pagal Hausner’io koeficientą

21.43 0.5 20 0 5 10 15 20 25

Resveratrolis Prosolv'as HD 90 Mikrokristalinė celiuliozė

Car 'o in d e kso r e ikšm ė

Carr' o indeksas

*

Resveratrolis Prosolv'as HD 90 Mikrokristalinė celiuliozė

H au sn e r' io k o e fi ci e n to r e ikšm ė s

Hausner'io koeficientas

*

*p<0.05

Kuo maţesnis Carr’o indeksas, tuo geresnės miltelių birumo savybės bei didesnis miltelių suspaudţiamumas, kuris turi įtakos siekiant geresnio kapsulių uţpildymo ir lemia kapsulių vienodumo masę. Optimalios Carr’o indekso charakteristikos yra ≤ 21 – 25 %, todėl matoma, kad geriausiu birumu pasiţymi prosolv’as HD 90, o labai blogu – resveratrolis. Pagal Hausner’io koeficiento reikšmes geru birumu pasiţymi taip pat tik prosolv’as HD 90, nes jo Hausner’io koeficientas maţesnis nei 1,11., kadangi optimalios Hausner’io koeficiento charakteristikos yra ≤ 1,26 – 1,34. Taigi pagal Carr’o indekso bei Hausner’io koeficiento vertinimo rezultatus, buvo nustatyta, kad geriausiu birumu pasiţymėjo prosolv’as HD 90.

3.1.3. Resveratrolio mišinių su Prosolv’u HD 90 ir mikrokristalinės celiulioze

Carr’o indeksas

Buvo analizuojami prosolv’o HD 90 ir MC su skirtingos koncentracijos resveratroliu mišiniai, remiantis Carr’o indeksu. Tiek mišinyje, kurį sudaro prosolv’as HD 90 ir resveratrolis, tiek MC ir resveratrolio mišinyje, buvo didinama resveratrolio koncentracija ir stebima kaip tai keičia miltelių mišinio Carr’o indekso reikšmes. Rezultatai pateikti 7 paveiksle.

7 pav. Mišinių CI priklausomybė nuo resveratrolio koncentracijos

*p<0,05 vs 12 % - 20 % resveratrolio koncentracijomis **p<0.05 vs 9 % - 14 % resveratrolio koncentracijomis

Nustatyta, kad mišinio su prosolv’u HD 90 didţiausia resveratrolio koncentracija, esant puikiam birumui yra 11 %. Mišinio su MC resveratrolio koncentracija esant geriausiam birumui gauta tik 2 %. Abiem atvejais didėjant resveratrolio koncentracijai, Carr’o indeksas taip pat didėjo. Miltelių mišinio iš resveratrolio ir prosolv’o HD 90, kai resveratrolio koncentracija 10 % ir 11 % CI gautas 20, ir jis reikšmingai skyrėsi nuo mišinių, kurių resveratrolio koncentracija nuo 12 % iki 20 % (CI=25). Miltelių mišinio iš resveratrolio ir MC, kai resveratrolio koncentracija 1 % ir 2 % CI gautas 23,8. Tuomet CI didėja iki 26,67 esant 3 % - 7 % resveratrolio koncentracijoms, o nuo 8 % iki 14 % CI= 28,57.

Taigi, kuo maţesnis mišinių Carr’o indeksas, tuo geresnės miltelių mišinių birumo savybės bei didesnis miltelių suspaudţiamumas. Nustatyta, kad geriausiu birumu pasiţymi 11 % resveratrolio ir prosolv’o HD 90 mišinys, nes CI reikšmė gauta maţiausia (CI=20).

0 5 10 15 20 25 30 35 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Car r' o in d e kso r e ikšm ė s Resveratrolio koncentracija (%) Prosolv'as HD 90 + Resveratrolis MC + Resveratrolis

*

* *

*

*

*