LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Kotryna Brezgytė – Šmaižienė
Kalių lytinių takų mikrobiotos įvairovė ir jautrumas antimikrobinėms
medžiagoms
The diversity and antimicrobial susceptibility of microbiota in the
genital tract of bitches
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: prof. dr.Modestas Ružauskas
2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kalių lytinių takų mikrobiotos įvairovė ir jautrumas antimikrobinėms medžiagoms“:
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ
Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.
(data) ( redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) (parašas) vardas, pavardė)
Magistro baigiamojo darbo recenzentas
(vardas, pavardė) (parašas)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1 Kalių reprodukcinių organų anatomija ... 10
1.1.2 Kiaušidės ... 10
1.1.2 Gimda ... 10
1.1.3 Makštis ... 10
1.2 Kalių reprodukcinės sistemos susirgimai ir jų sukėlėjai ... 11
1.2.1 Vaginitas... 11
1.2.2 Piometra ir cistinė kiaušidžių hiperplazija ... 11
1.2.3 Metritas... 13
1.3 Normali kalių lytinių takų mikrobiota ... 13
1.3.1 Normali makšties mikrobiota ... 13
1.3.2 Normali gimdos mikrobiota ... 15
1.4 Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms problematika ... 16
1.5 Bakterijų identifikacija ... 17
1.5.1 Fenotipiniai bakterijų identifikacijos metodai... 17
1.5.2 Mitybinės terpės ir bakterijų kultūrų išskyrimas ... 17
1.5.3 Tepinėlio gaminimas ... 18
1.5.4 Genotipiniai bakterijų identifikacijos metodai ... 18
1.5.5 Polimerazinė grandininė reakcija ... 18
1.5.6 Pirmos ir antros kartos sekoskaita ... 19
2. TYRIMO VIETA IR MEDŽIAGOS... 20
2.1 Tyrimų vieta ir objektai ... 20
2.2 Tiriamųjų bakterijų išskyrimas ... 20
2.3 Išskirtų bakterijų identifikacija ... 21
2.3.1 Bakterijų identifikacija klasikinės mikrobiologijos metodais ... 21
2.3.2 Bakterijų identifikacija molekulinės biologijos metodais ... 22
4
2.5 Statistinė duomenų analizė ... 24
3. TYRIMO REZULTATAI ... 26
3.1 Informacija apie mėginius... 26
3.2 Kalių lytinių takų mikrobiotos įvairovė ... 27
3.3 Iš kalių lytinių takų išskirtų bakterijų padermių jautrumas antimikrobinėms medžiagoms ... 30
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS ... 37
IŠVADOS ... 39
PADĖKA ... 40
5
SANTRAUKA
Kalių lytinių takų mikrobiotos įvairovė ir jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Kotryna Brezgytė – ŠmaižienėMagistro baigiamasis darbas
Kalių lytiniuose takuose yra didelė mikroorganizmų įvairovė, ir bet kuris iš jų tam tikromis sąlygomis gali tapti oportunistiniu patogenu. Kai kurie šių mikroorganizmų siejami su spontaniniais abortais arba poatvediminėmis komplikacijomis (16). Darbo tikslas buvo ištirti kalių lytiniuose takuose vyraujančią mikrobiotą, identifikuoti konkrečias bakterijas ir nustatyti jų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms, taip pat pabrėžti retai pasitaikančių bakterijų, kurios paprastai lieka neidentifikuotos, svarbą. Ištirtos 26 kalės, iš jų išskirtos 57 bakterijų padermės, tyrimams naudoti įprasti mikrobiologiniai metodai bei 16S rRNR sekoskaitos metodas. Mėginiai imti iš sergančių bei sveikų kalių makšties ir gimdos. Tirtų kalių amžiaus intervalas buvo nuo vienerių iki aštuonerių metų, vidutinis amžius - 4,5.±0,4 m.
Atlikto tyrimo metu, be dažnai pasitaikančių ir literatūros šaltiniuose minimų kalių lytinių takuose aptinkamų padermių (Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus spp. Enterococcus spp.), buvo identifikuotos rečiau pasitaikančios bakterijų padermės arba tos padermės, kurių identifikuoti įprastais mikrobiologiniais metodais nepavyko.
Tyrimo metu 33 bakterijų izoliatai tirti įprastais mikrobiologiniais metodais, likę 24 – pasitelkiant 16S rRNR sekoskaitos metodą. Tiriant jautrumą antimikrobinėms medžiagoms tirti pasirinkta
Staphylococcus spp. ir Streptococcus spp. padermės. Stafilokokų grupėje bakterijų padermės buvo
jautriausios enrofloksacinui (80 proc.) ir sulfametoksazoliui - trimetoprimui (70 proc.), atsparios benzilpenicilinui (70 proc.) bei tetraciklinui (60 proc.). Streptokokų padermių grupėje dažniausias jautrumas nustatytas sulfametoksazoliui-trimetoprimui (100 proc.), benzilpenicilinui (100 proc.) bei enrofloksacinui (91,7 proc.), o atspariausios padermės buvo tetraciklinui (50 proc.).
6
SUMMARY
The diversity and antimicrobial susceptibility of microbiota in the genital tract of bitches Kotryna Brezgytė – Šmaižienė
Master’s Thesis
There are various microorganisms in the genital tract of bitches and under certain changed conditions most of them can become pathogenic. Some of these microorganisms are related to spontaneous abortions or postpartum complications. The aim of this work was to identify the bacteria in the genital tract of bitches and explore their antimicrobial susceptibility, also emphasizing the importance of rare bacteria that are usually left unidentified. The samples were taken from 26 bitches and 57 bacteria cultures were isolated and identified using classic microbiological methods and 16S rRNR sequencing. The samples were taken from the vagina and uterus of sick and healthy bitches. The age of bitches varied between one and eight years, average age was 4.5±0,4 years.
During this study in adition to well known and described bacteria of bitches genital tract, such as Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Proteus spp. Enterococcus spp., rare bacteria, or bacteria that failed to be identified by using classic microbiological methods, were identified.
From 57 bacteria isolates 33 were identified by using classical microbiological methods whereas 24 were identified using 16S rRNA sequence method. For antimicrobial susceptibility tests
Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. were chosen. In staphylococcus group bacteria isolates
were the most susceptible to enrofloxacin (80%) and sulfamethoxazole-trimethoprim (70%). The resistance to benzylpencillin (70%) and tetracycline (60%) was detected. In Streptococcus spp. the isolates were most frequently susceptible to sulfamethoxazole-trimethoprim (100%), benzylpencillin (100%) and resistant to tetracycline (50%).
7
SANTRUMPOS
spp. – rūšys
sp. – rūšis proc. – procentai
°C – laipsniai pagal Celsijų
PGR – polimerazinė grandininė reakcija DNR – dioksiribonukleorūgštis
μl – mikrolitras
DNazė – deoksiribonukleazė
rRNR – ribosominė ribonukleorūgštis
EUCAST – Europos jautrumo antimikrobinėms medžiagoms komitetas CLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas
S. epidermis – Staphylococcus epidermis
pH – vandenilio jonų koncentracijos tirpale matas, parodantis tirpalo rūgštingumą ar šarmingumą TE – tetraciklinas SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas P – benzilpenicilinas FOX – cefoksitinas ENR – enrofloksacinas E – eritromicinas s – sekundė min – minutė
8
ĮVADAS
Kliniškai sveikų kalių makšties mikrobiota paprastai yra mišri, tačiau identifikuojant grynas kultūras galima įtarti, jog patogeninės bakterijos neretai nustelbia normalią mikrobiotą. Grynos kultūros dažniausiai išskirtos priešrujo ir ramybės fazėmis, tuo tarpu mišri mikrobiota dažniausiai aptikta rujos ir porujo periodais. Šie rezultatai leidžia daryti prielaidą, jog, išskyrus gryną kultūra, ne visada galima teigti, jog yra pasireiškusi infekcija (1). Makšties mikrobiotos pokyčiai gali būti susiję su lytinio ciklo stadijomis, tačiau pokytis labiau apibūdinamas kaip randamų mikroorganizmų dažnis (kiekis) nei kaip skirtingų mikroorganizmų radimas (2). Teigiama, jog identifikuojant kalių lytinių takų mikrobiotą naudojant tik įprastus mikrobiologinius metodus, yra neidentifikuojama didelė dalis bakterijų tiek sveikų, tiek sergančių kalių lytiniuose takuose (3). Šaltiniai teigia, jog E. coli 80 proc. piometros atvejų yra identifikuojama kaip piometros sukėlėja, tačiau kiti autoriai, tyrę piometros patogenezę, pabrėžia, jog dauguma potencialių patogenų galėjo būti neidentifikuojami dėl riboto laboratorinių tyrimų tikslumo – kai kurios bakterijos laboratorijos sąlygomis negali būti tiksliai identifikuotos, todėl pasirinktas pažangesnis metodas - 16S rRNR sekoskaita.
Kalių lytinių takų mikroorganizmų ištyrimas yra aktualus ir dėl to, kad jauniklių vystymosi periodu problemas sukelia dvejopos priežastys – neinfekcinės ir infekcinės kilmės, pastarosios yra pasitaikančios dažniausiai. Vaisiaus vystymosi progresavimui mikroorganizmai gali pakenkti perėję placentos barjerą arba skleisdami toksinus ir taip sukeldami uždegiminius procesus (4). Norint parinkti tinkamą gydymą konkretaus patogeno sukeltai infekcijai gydyti, rekomenduojama atlikti bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms testą (5).
Tikslus infekcijos sukėlėjo identifikavimas bei jautrumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas svarbus dėl vis labiau įsivyraujančios rezistentiškumo antimikrobinėms medžiagoms problemos. Teigiama, jog to priežastys gali būti sparčiai gausėjanti žmonių populiacija, migracija, padidėjęs sunaudojamų antibiotikų kiekis smulkių gyvūnų klinikose bei auginant ūkinius gyvūnus. Reikėtų pabrėžti, jog viena iš augančio bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms problemos priežasčių yra nepagrįstas jų vartojimas bei naudojimas gydant gyvūnus. Taip pat kaip šios problemos priežastys įvardijamos perteklinis antibiotikų naudojimas (ūkiniams gyvūnams, gyvūnams augintiniams, akvakultūroms) nelegali prekyba bei prastos sanitarinės sąlygos (6).
9 Darbo tikslas:
Išskirti bakterijas iš sveikų ir sergančių kalių reprodukcijos organų, jas identifikuoti ir nustatyti jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti bakterijas iš sveikų ir sergančių kalių reprodukcijos organų.
2. Nustatyti išskirtų bakterijų rūšinę sudėtį pritaikant optimalius identifikacijos metodus. 3. Nustatyti išskirtų bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1 Kalių reprodukcinių organų anatomija
Kalių lytinius organus sudaro kiaušidės, kiaušintakiai, gimda, makštis, makšties prieangis, vulva ir klitoris (7). Lytinius organus galima skirstyti į vidinius ir išorinius, lytiniai takai prasideda makšties prieangiu, kranialiai jo yra makštis, kuri kalei stovint yra horizontalios padėties. Makštis užsibaigia gimdos kakleliu – organu, kuris skiria gimdą nuo makšties. Gimda sudaryta iš dviejų gimdos ragų, kurių kiekvienas pasibaigia kiaušintakiu, kuris sudaro bursą ir apgaubia kiaušidę, jose vyksta hormonų sintezė bei gaminamos kiaušialąstės (8,9).
1.1.2 Kiaušidės Kiaušides pilvo ertmėje prilaiko suspensorinis raištis. Kiaušintakiai yra siauri, vamzdelio formos, jie jungia kiaušides su gimdos ragais. Jų ilgis yra 5-10 cm, o plotis iki kelių milimetrų (10). Kiaušintakio gale, kuris yra arčiau kiaušidės, yra piltuvėlis, kuriuo į kiaušintakį patenka kiaušialąstė po ovuliacijos (8). Kiaušidės ne tik gamina kiaušialąstes, bet veikia ir kaip endokrininė liauka. Kiaušidė yra suplotos iš abiejų pusių formos. Jos dydis priklauso nuo lytinio ciklo stadijos. Kiaušidę gaubia bursa, kurios sienelė sudaryta iš kiaušidės ir kiaušintakio raiščio. Kiaušidės guli laikomos kiaušidės raiščio, lygiagrečiai inkstų, ties 4-5 juosmens slanksteliu. Išskiriamos žievės ir šerdies zonos. Žievė sudaryta iš folikulų su viduje esančiais oocitais, ir, priklausomai nuo lytinio ciklo stadijos, geltonuoju kūnu. Šerdis sudaryta iš tankaus kraujagyslių bei limfagyslių tinklo bei nervų (10).
1.1.2 Gimda Kalės gimdą sudaro gimdos kaklelis, kūnas bei gimdos ragai. Gimdos funkcijos – praleidžia spermą, kuri apvaisina ovocitus bei apvaisinimo atveju joje vyksta embriono implantacija, maitinimas bei vystymąsis. Vykstant endometriumo hipertrofijai kartu su vaisiaus membranomis yra formuojama placenta, kuri yra embriono ir vaisiaus mitybos šaltinis (7). Gimdos ragai prasideda nuo gimdos kūno ir baigiasi kiaušidėmis. Kai įvyksta apvaisinimas, vaisiai išsidėsto eile abiejuose gimdos raguose. Lytiškai subrendusios, vidutinio dydžio kalės gimdos ragai yra apie 12 centimetrų ilgio (10). Gimdos sienelė sudaryta iš vaskuliarizuoto endometriumo, kuriame išsidėsčiusios liaukos bei raumeninio sluoksnio (miometriumo). Gimdos kaklelis sudarytas iš jungiamojo bei raumeninio audinio, kurie formuoja sfinkterį ir taip gimda apsaugoma nuo infekcijos. Kalei esant vaisingai ar vykstant atvedimui kaklelis atsipalaiduoja ir atsiveria (8).
1.1.3 Makštis Makštis yra išsiplėsti galintis kanalas, kuris tęsiasi nuo makšties prieangio iki gimdos. Makšties ilgis ir diametras didėja gimdoje esant vaisiams bei atvedimo metu (7). Kalės makšties sienelė yra sudaryta iš vidinio sluoksnio – gleivinės, vidurinio raumeninio sluoksnio bei išorinio jungiamojo audinio sluoksnio. Makšties gleivinė sudaro raukšles, kurios padeda jai išsiplėsti ar
11 susitraukti (8). Gleivinė yra neliaukinė, ją sudaro daugiasluoksnis plokščiasis epitelis. Epitelio sandara gali kisti priklausomai nuo lytinio ciklo stadijos. Raumeninis sluoksnis yra sudarytas iš labai plono vidinio išilginio sluoksnio, storesnio žiedinio raumens sluoksnio ir išorinio išilginio raumens (7). Norint susieti makšties mikrobiotą ir citologiją su apvaisintoms kalėms atsirandančiais susirgimais (gimdos infekcijomis, vaisiaus rezorbcija, abortais) priešrujo fazės metu buvo tirtos kalės ir rasti šie mikroorganizmai (nuo rečiausiai iki dažniausiai aptinkamo): Enterococcus faecalis, Streptococcus
β-haemolyticus, Pasteurella multocida, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Escherichia coli haemolyticus, Arcanobacterium pyogenes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. ir Acinetobacter spp., mikoplazmų rasta nebuvo (11).
1.2 Kalių reprodukcinės sistemos susirgimai ir jų sukėlėjai
1.2.1 Vaginitas Vaginitas – medicininis terminas, apibūdinantis makšties arba makšties prieangio uždegimą. Vaginito priežastys gali būti: šlapimo takų infekcijos, traumos, svetimkūniai, vulvos užteršimas šlapimu ar išmatomis, ektopinė šlaplė, augliai, bakterinė ar virusinė infekcija, hematomos ar abscesai, įgimti anatominiai pakitimai. Kiti šaltiniai kaip vaginito priežastis įvardija: užteršimas išmatomis ar šlapimu, šlapimo nelaikymas, bakterinės infekcijos (pavyzdžiui bruceliozė), šunų Herpes virusas, ektopiniai šlapimtakiai (12). Bet kuris vaginito sukėlėjas laikomas antrine uždegimo priežastimi, nes bakterijos dažniausiai išskirtos iš kalių, sergančių vaginitu, yra normali vaginos mikrobiota, kurios taip pat randama ant odos ir tiesiojoje žarnoje ( Escherichia coli, Streptococcus spp.,
Staphylococcus spp., Pasteurela multocida, Proteus mirabilis). Kadangi makštis nėra sterili terpė,
bakteriologinio tyrimo rezultatus reikėtų interpretuoti atidžiai (13). Lėtinio vaginito atveju gali būti stebimas atipinių bakterijų rūšių augimas ( grynos Gram- kultūros, Pseudomonas spp.) arba grynos
Mycoplasma rūšys, taip pat kartais aptinkama mieliagrybių (14). Dažniausi klinikiniai simptomai yra
padažnėjęs šlapinimasis, tarpvietės laižymas, išskyros iš makšties (gleivės, pūliai, retesniu atveju kraujas). Vulva gali būti ištinusi, paraudusi (15). Vaginitu serga įvairaus amžiaus kalės, viena iš vaginitų formų yra jauniklių vaginitas (serga kalės iki vienerių metų amžiaus). Ši vaginito forma gali išgyti savaime po pirmos rujos (16).
1.2.2 Piometra ir cistinė kiaušidžių hiperplazija Piometra dažniausiai yra antrinė infekcija, kuri pasireiškia dėl hormoninių pokyčių kalės reprodukcinėje sistemoje. Rujos metu progesterono kiekis išlieka pakilęs apie du mėnesius ir sukelia gimdos sienelės sustorėjimą taip ruošdamas ją būsimam vaisiui. Jei apvaisinimas neįvyksta kelias rujas iš eilės, gimdos sienelė ir toliau storėja, kai kuriais atvejais formuojasi cistos (būklė vadinama cistinė endometriumo hiperplazija). Sustorėjęs endometriumas kartu su cistomis produkuoja skysčius, kurie yra puiki terpė bakterijoms. Taip pat dėl
12 sustorėjusios gimdos sienelės sutrinka gimdos raumenų susitraukimai, tai reiškia, kad besikaupiantys skysčiai kartu su bakterijomis negali būti pašalinti iš gimdos.
Rujos metu baltieji kraujo kūneliai, kurie paprastai saugo organizmą nuo infekcijos eliminuojant bakterijas nebepatenka į gimdą. Tai yra normalus reiškinys, leidžiantis spermatozoidams saugiai patekti į patelės organizmą ir nebūti sunaikintiems ar pažeistiems šių imuninių ląstelių.
Paprastai lytinio ciklo metu gimdos kaklelis būna užsivėręs, tačiau rujos metu jis būna atsivėręs tam, kad pakliūtų spermatozoidai ir įvyktų apvaisinimas. Taigi, esant atviram gimdos kakleliui, bakterijos, normaliai esančios makštyje, gali patekti į gimdą. Paprastai, jei gimda yra sveika ir nepažeista, ji geba sukurti nepalankias sąlygas šioms bakterijoms išlikti, tačiau, jei gimdos sienelė yra sustorėjusi ar su cistomis dėl cistinės endometriumo hiperplazijos, tai gali tapti puikia terpe bakterijoms daugintis (17).
Literatūroje aptariamo tyrimo metu ištyrus 150 kalių piometros atvejų dažniausiai išskirti
Escherichia coli (71,3 proc. ligos atvejų) ir Pseudomonas aeruginosa (8 proc. ligos atvejų)
mikroorganizmai. Taip pat išskirta Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Pasteurella spp. (18).
Dažniausiai piometra pasireiškia vyresnio amžiaus kalėms dėl gimdos sienelės pokyčių, kuomet daug kartų yra pasireiškusi ruja, tačiau neįvyko apvaisinimas. Piometra dažniausiai pasireiškia antrąją - aštuntąją savaitę po paskutinės rujos. Klinikiniai piometros simptomai priklauso nuo to, ar gimdos kaklelis išlieka atsivėręs, jei jis yra atviras, susikaupę pūliai per makštį pasišalins iš gimdos. Pūliai ar nenormalios išskyros paprastai pastebimos po uodega, ant kailio ar odos, vietoje, kurioje gyvūnas miega. Karščiavimas, letargija, anoreksija ir depresija yra galimi simptomai, tačiau pasireiškia ne visada. Jei gimdos kaklelis išlieka uždaras, pūliai ar išskyros nepasišalina ir pradeda kauptis, gali padidėti gyvūno pilvo apimtis. Besiveisiančios bakterijos išskiria toksinus, kurie patenka į kraujotaką. Tokiu atveju vystosi uždaro tipo piometra ir klinikiniai simptomai būna stipriai išreikšti, gali pasireikšti vėmimas ir viduriavimas (17). Kartu su piometra dažnai pasireiškia ir cistinė endometriumo hiperplazija (CEH). Cistinė endometriumo hiperplazija apibūdinama kaip endometriumo liaukų išvešėjimas, endometriumo hiperplazija ir cistų formavimąsis, gali pasireikšti su arba be skirtingos prigimties skysčiais. Piometros ir cistinės endometriumo hiperplazijos patogenezės mechanizmas nėra iki galo paaiškintas, tačiau jos pasireiškimui turi įtakos pasikartojantis progesterono kiekio kitimas lytinio ciklo metu, sukeliamas gimdos uždegimas kartu su skysčių kaupimusi bei oportunistinių bakterijų infekcija (19).
13 1.2.3 Metritas Terminas paprastai vartojamas gimdos uždegimui, išsivysčiusiam po vaisiaus atvedimo, apibūdinti. Metritas išsivysto bakterijoms per makštį ir atvirą gimdos kaklelį patekus į gimdą ir yra įtraukiama visa gimdos sienelė (16) (20). Normali gimda, joje nesivystant vaisiui, yra atspari infekcijoms ir net tokių specifinių ligų atvejais kaip bruceliozė, trichomonozė ar kampilobakteriozė, ligos sukėlėjas yra neįgalus ilgai išlaikyti. Gimdos užsikrėtimas Campylobacter
fetus ar Tritrichomonas foetus neįvykus apvaisinimui trunka iki 2-3 lytinių ciklų. Brucella abortus
sukelia abortą, tačiau nesant vaisiui gimdoje ilgai neišsilaiko (20). Skirtingai nei piometra, metritas išsivysto iškart po vaisiaus atvedimo, kartais po aborto ir yra siejamas su užsilaikiusia placenta ar vaisiaus dalimis. Simptomai dažnai nespecifiniai, kartais galima pastebėti išskyras iš makšties. Diagnozuojama atliekant bendrąjį kraujo tyrimą, stebimas baltųjų kraujo kūnelių padidėjimas. Biocheminio kraujo tyrimo rezultatuose stebimas inkstų ir kepenų funkcijos rodiklių padidėjimas, hipoglikemija ir elektrolitų disbalansas. Gydoma skiriant skysčių terapiją, antibiotikus, tikslinga pašalinti gimdos turinį, jei tai yra metrito priežastis. Tam gali būti naudojamas oksitocinas arba prostaglandinai, kurie sukelia gimdos susitraukimus. Stabilizavus būklę rekomenduojama atlikti ovariohisterektomiją (21).
1.3 Normali kalių lytinių takų mikrobiota
1.3.1 Normali makšties mikrobiota Kalės lytiniai takuose randama įvairių mikroorganizmų, pasikeitus aplinkybėms, kai kurie iš jų gali tapti oportunistiniais patogenais (22). Kliniškai sveikų kalių makšties mikrobiota paprastai yra mišri, tačiau identifikuojant grynas kultūras, galima įtarti, jog patogeninės bakterijos nustelbia normalią mikrobiotą. Atlikto tyrimo metu grynos kultūros dažniausiai išskirtos priešrujo ir ramybės fazėmis, tuo tarpu mišri mikrobiota dažniausiai aptikta rujos ir porujo stadijose. Šie rezultatai leidžia daryti prielaidą – išskyrus gryną kultūrą, ne visada galima teigti, kad yra pasireiškusi infekcija(1). Įrodyta, jog vienintelė bakterija specifiškai sukelianti nevaisingumą yra
Brucella canis. Mėginiai imami iš makšties ar gimdos turėtų būti vertinami itin atidžiai, nes kai kurie
mikroorganizmai reprezentuoja normalią mikrobiotą ir nebūtinai yra susirgimo priežastis arba paaiškina nevaisingumą. Antimikrobinių medžiagų naudojimas kalėms prieš pastojimą bei vaisiaus nešiojimo metu nebūtinai pagerins pastojimo ar išnešiojimo tikimybę, bet didins mikroorganizmų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms (23). Atlikto tyrimo metu buvo tiriama kalių lytinių takų (makšties, gimdos kaklelio bei gimdos) mikrobiota, atsižvelgiant į lytinio ciklo fazę. Buvo tirtos 55 kalės (11 ramybės, 16 priešrujo, 13 rujos, 9 porujo fazių metu bei 6 šuningos kalės). Iš makšties išskirta 61 bakterija, iš jų 45,4 proc. mieliagrybių, 30,9 proc. E.coli, 20 proc. Proteus sp., 12,7 proc.
14
Streptococcus sp. ir 1,8 proc. Enterococcus sp. Didžiausias bakterijų skaičius išskirtas priešrujo bei
15
1 lentelė. Normali kalių makšties mikrobiota
Mikroorganizmas Kiekis (proc.)
Escherichia coli 15,1
Streptococcus spp. 9,1
Staphylococcus spp. 57,6
Pasteurella spp. 15,1
Pseudomonas aeruginosa 3,1
Makšties mikrobiotos pokyčiai gali būti susiję su lytinio ciklo stadijomis, tačiau pokytis labiau apibūdinamas kaip randamų mikroorganizmų dažnis (kiekis) nei kaip skirtingų mikroorganizmų radimas. Kai kurie kalių lytinių organų mikrobiotos pokyčiai sietini su kastracija. Taip pat
Staphylococcus spp. dažniau aptinkama kalėms prieš lytinę brandą ir po atvedimo ir rečiau kalėms po
rujos (2). Tyrimo metu, kuomet buvo tiriamos 46 sveikos kalės skirtingo lytinio ciklo fazių metu, gauti tokie rezultatai: dažniausiai išskirta Staphylococcus spp. (57,6 proc.), taip pat teigiama, jog sveikoms kalėms Staphylococcus aureus yra dažniausiai išskiriama bakterija. Mažiausiai bakterijų išskirta porujo metu, o daugiausia priešrujo ir rujos metu. Taip pat visų lytinio ciklo fazių metu iš makšties buvo išskirta Escherichia coli bei Streptococcus spp. (22) (1 lentelė).
1.3.2 Normali gimdos mikrobiota Normaliai gimdos mikrobiotai identifikuoti buvo atliktas tyrimas - tirta 69 sveikų kalių gimdos mikrobiota, atsižvelgiant į jų lytinio ciklo fazę. Lentelėje pateikti tyrimo rezultatus apibendrinantys duomenys (25) (2 lentelė).
2 lentelė. Kultūrų išskyrimas, atsižvelgiant į lytinio ciklo fazę bei apvaisinimą
Prieš lytinį brendimą
Ruja Porujis Ramybės
periodas
Apvaisintos kalės
Tirtų kalių skaičius 26 1 16 12 4
Išskirtų kultūrų skaičius (proc.) 9 (34,6proc.) 2 (18,2proc.) 6 (37,5proc.) 0 0
Apibendrinant 2 lentelės duomenis galima teigti, jog didžiausiam skaičiui kalių kultūros buvo išskirta esant porujo fazėje (37,5 proc.), o mažiausiai – ramybės periodu bei nešiojant vaisių (0proc.).
Taip pat reiktų paminėti, jog gimdos mikrobiotai įtakos gali turėti ir kiti veiksniai, pavyzdžiui, gimdoje esantis negyvas vaisius. Vieno tyrimo metu buvo analizuojama penkiasdešimties kalių gimdos mikrobiota. Mėginiai buvo imami iš penkiasdešimties kalių gimdų, kurioms buvo atliekama priverstinė
16 Cezario operacija dėl distokijos. Bakterijų augimas buvo stebimas 68 proc. (34 kalės). Dažniausiai pasitaikiusios bakterijos buvo Staphylococcus epidermidis (n = 12), Staphylococcus intermedius (n = 7), β‐hemolitiniai streptokokai (n = 6), Staphylococcus aureus (n = 4), α‐hemolitiniai streptokokai (n = 4) ir γ‐hemolitiniai streptokokai ( n = 4). Taip pat tyrimo autoriai teigia, jog, lyginant su sveikų kalių gimdos mikrobiota, įvykus vaisiaus žūčiai, išskiriama daugiau skirtingų bakterijų kolonijų bei gausesnis jų kiekis (26). Lyman C.C. ir kt. atliko tyrimą – buvo bandyta paneigti arba patvirtinti hipotezę, jog gimdoje esantys mikroorganizmai paprastai patenka per atvirą gimdos kaklelį iš makšties rujos metu. Buvo ištirtos penkių kalių lytinių takų mikrobiota rujos metu. Tyrimo rezultatai atskleidė, jog endometriumo mikrobiota keičiant lytinio ciklo stadijoms nepakito, tuo tarpu makšties mikrobiota rujos metu smarkiai skyrėsi nuo kitų lytinio ciklo fazių. Taip pat atlikus stastistinę tyrimo duomenų analizę paaiškėjo, jog gimdoje buvo didesnė bakterijų įvairovė (įvairesnė rūšinė sudėtis), o makštyje bakterijų įvairovė yra mažesnė, tačiau didesnis bakterijų skaičius. (3)
1.4 Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms problematika
Antimikrobinis atsparumas – tai mikroorganizmo (bakterijos, viruso ar kai kurių parazitų) savybė būti atspariam antimikrobiniam vaistui (antibiotikams, antivirusiniams vaistams). Tokiu būdu gydymas tampa neefektyvus, infekcija tampa persistuojančia ir gali būti platinama kitiems. Europos sąjunga valstybėms narėms teikia racionalaus antimikrobinių medžiagų naudojimo veterinarijoje gaires, kuriose teigiama, jog antimikrobinių medžiagų poreikį geriausiai galima sumažinti atliekant tinkamą ligų prevenciją (27). Šunų ir žmonių tarpusavio ryšį platinant antimikrobinėms medžiagoms atsparias bakterijas 2012–2014 m. tyrė Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Mikrobiologijos ir virusologijos institute atlikti Gyvūnų kompanionų tyrimai, tirta daugiau nei 750 gyvūnų kompanionų bei išskirta 1500 bakterijų izoliatų. Tyrimų metu nustatyta, jog meticilinui atsparių stafilokokų paplitimas šunų veislynuose yra proporcingas laikomų veislinių kalių skaičiui, o šių bakterijų aptikimas buvo statistiškai patikimas veislynuose, kuriuose laikoma šešios ir daugiau kalių. Buvo nustatyta, jog bendrąja prasme kompanijos gyvūnai nekelia didelio pavojaus žmonėms, kalbant apie bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms, išskyrus didesnius šunų veislynus (šešios ar daugiau kalių). Remiantis šiuo tyrimu buvo teiktos rekomendacijos atlikti bakterijų atsparumo tyrimus veislynuose, kuriuose laikomos šešios ar daugiau kalių, o gyvūnų veisėjams turėti mažesnius veislynus. Tokiu būdu bus mažiau su reprodukcine sistema susijusių ligų, ir todėl mažės poreikis naudoti antimikrobines medžiagas, taip pat ir bakterijų atsparumas. Taip pat rekomenduota gydymą antibiotikais skirti tik atlikus antibiotikogramą (28). Apdairaus antimikrobinių medžiagų naudojimo esmė yra jų skyrimas tik tada, kai tai tikslinga, kuo trumpesniam laikotarpiui, reikalingam ligai išgydyti, optimalus dozavimas
17 pradedant siauriausio spektro antimikrobine medžiaga bei laboratorinių tyrimų atlikimas ligos sukėlėjui nustatyti (29). Teigiama, jog didžiausias atsparumas antimikrobinėms medžiagoms gydant šunis būdingas šioms bakterijoms: Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, Pseudomonas spp. (30).
1.5 Bakterijų identifikacija
1.5.1 Fenotipiniai bakterijų identifikacijos metodai. Bakterijų identifikavimo metodai gali būti skiriami į dvi grupes: fenotipiniai ir genotipiniai. Genotipas – pilna informacija apie organizmo paveldimas savybes, net jei jos neišreikštos. Fenotipas – matomos organizmo savybės, tokios kaip morfologija ar vystymasis. Fenotipas gali keistis arba pasireikšti skirtingai, priklausomai nuo aplinkos sąlygų. Pavyzdžiui, bakterijų kultūra gali augti skirtingomis spalvomis ant skirtingų terpių. Fenotipiniai bakterijų identifikavimo metodai yra plačiai naudojami dėl jų kainos, tačiau verta paminėti, jog fenotipinių požymių, tokių kaip: ląstelės dydis ir forma, sporuliacija, biocheminis aktyvumas ir jautrumas antimikrobinėms medžiagoms pasireiškimas, tiesiogiai priklauso nuo terpės kokybės ir aplinkos veiksnių, tad kartais šie metodai gali būti subjektyvūs (31). Taip pat naudojamas mikroskopinis tyrimas: iš tiriamosios medžiagos daromas tepinėlis, kuris dažomas pasirinktu būdu (dažniausiai Gramo būdu), gautas tepinėlis mikroskopuojamas. Svarbu paminėti, jog mikroskopuojant neidentifikuojama tiksli mikroorganizmo rūšis, o tik apibūdinama jo morfologija. Ypač svarbu nustatyti, kokia yra sienelės sudėtis, taip pat tai lazdelės ar kokai. Į tai atsižvelgiama skiriant antimikrobines medžiagas gydymui. Kitas mikrobiologijos tyrimo metodas yra bakteriologinis tyrimas, kuris yra pagrįstas sukėlėjui tinkamų mitybinių terpių bei sąlygų parinkimu (pavyzdžiui, optimali temperatūra sukėlėjui augti, augimo aplinkos dujų sudėtis). Paprastai tiriamoji medžiaga sėjama į kelias gausinimo terpes ir, išauginus gryną kultūrą bei nustačius jos biologines savybes, galimas tikslus identifikavimas (32).
1.5.2 Mitybinės terpės ir bakterijų kultūrų išskyrimas. Mikrobiologinė mitybinė terpė - tai substancija, skatinanti ir palaikanti mikroorganizmų augimą ir sudaranti palankias sąlygas jiems išgyventi. Gaminant mitybines terpes stengiamasi sukurti sąlygas kuo panašesnes į gamtoje esančias sąlygas, kuriose mikroorganizmai galėtų augti bei daugintis. Mikroorganizmų kultivavimas mitybinėse terpėse priklauso nuo tokių faktorių kaip: optimalus maistingųjų medžiagų, deguonies ar kitų dujų kiekis, tinkama drėgmė, pH bei aplinkos temperatūra. Svarbūs elementai mikroorganizmų augimui yra anglis, azotas, neorganiniai fosforo ir sieros junginiai, taip pat kai kurie metalai, vanduo bei vitaminai. Maistinės medžiagos yra kaip augimo faktoriai, kurie stimuliuoja ląstelių augimą, proliferaciją bei diferenciaciją (31).
18 Tam, kad būtų gautos atskiros kolonijos, mikroorganizmų kultūra yra sėjama į mėsos peptono agarą Petri lėkštelėje. Petri lėkštelė su standžia terpe dalinama į keturis sektorius ir brūkšniais sėjama pradedant nuo pirmo sektoriaus ir baigiant ketvirtuoju. Paprastai pavienės kolonijos pradeda augti paskutiniuose sektoriuose (32).
1.5.3 Tepinėlio gaminimas. Bakterijų kultūra ar konkreti kolonija nuo mitybinės terpės imama kilpele ar pipete ir dedama ant švaraus objektinio stiklelio ir išsklaidoma. Jei kultūra imama nuo standžios mitybinės terpės, ant objektinio stiklelio, prieš paskleidžiant kultūrą, dedamas lašas distiliuoto vandens arba fiziologinio tirpalo, sumaišoma su kultūra ir paskleidžiama norimame plote. Tepinėlis džiovinamas kambario temperatūroje. Tuomet tepinėlį reikia fiksuoti, fiksavimas gali būti: fizikinis (liepsna) arba cheminis (naudojami fiksuojamieji tirpalai). Tepinėlis dažomas pasirinktu būdu, dažnai naudojamas dažymo metodas yra Gramo dažymo būdas, kuomet naudojami genciano violetinis, Liugolio tirpalas, blukintojas (pavyzdžiui 96o etanolis), distiliuotas vanduo bei fuksino ar safranino tirpalas. Tepinėlis sausinamas ir mikroskopuojamas prieš tai uždėjus lašą imersijos. Gramneigiami mikroorganizmai dažosi raudonai, o gramteigiamai – violetine arba mėlyna spalva (32).
1.5.4 Genotipiniai bakterijų identifikacijos metodai. Genetiniam bakterijų identifikavimui yra naudojamas genetinis tyrimas: vykdoma DNR hibridizacija tam, kad būtų nustatyta sukėlėjo DNR arba RNR ir lyginant su jau žinoma DNR duomenų bazėje identifikuojamas sukėlėjas (32). Greitas patogeno identifikavimas yra labai svarbus veiksnys norint skirti tinkamą ir adekvatų gydymą antimikrobinėmis medžiagomis. Nors įprasti bakterijų identifikavimo metodai dar vis dažnai naudojai mikroorganizmų aptikimui, jie trunka ilgai ir yra netinkami identifikuojant nekultivuojamas bakterijas (33). Naudojantis įprastais mikrobiologiniais metodais liga turi būti pažengusi tam, kad patogenas būtų aptiktas. Jei gyvūno imuninė sistema sureagavo į antigeną ir prasidėjo imuninis atsakas, kartais testai pagrįsti antigeno ir antikūnio sąveika gali neaptikti ligos. Tokie testai paprastai naudingi tik ligai jau pažengus (34). PGR gali būti naudojama analizuojant ypač mažus mėginių kiekius, šis metodas tinkamas naujų ir senų mėginių analizavimui (35).
1.5.5 Polimerazinė grandininė reakcija. Polimerazinė grandininė reakcija (PGR) yra dvigrandės dioksiribonukleorūgšties (DNR) replikacija, kuomet yra dauginamas (amplifikuojamas) tam tikras DNR fragmentas veikiant DNR polimerazėms. Keičiant temperatūrą yra atliekami reakcijos ciklai ir taip vyksta DNR sekų – kopijų sintezė. Tam kad įvyktų reakcija, yra reikalingi pagrindiniai komponentai: DNR matrica, kurią norima amplifikuoti, fermentas DNR polimerazė (veikia kaip reakcijos katalizatorius sintetinant DNR matricos kopiją), oligonukleotidiniai pradmenys, deoksiribonukleotidų 5 trifosfatai, reakcijos buferinis tirpalas su pakankamu magnio jonų kiekiu bei
19 termocikleris. Labai svarbus veiksnys reakcijai įvykti yra DNR matricos grynumas, nes per mažas kiekis mažina PGR reakcijos efektyvumą, o per didelis kiekis didina klaidų dažnį (pavyzdžiui, amplifikuojami nespecifiniai DNR segmentai) (36). Pagrindiniai PGR etapai apima DNR denatūraciją, pradmenų prijungimą (anilinimą) ir DNR grandinės sintezę. Denatūracijos etapo metu veikiant 92-96oC
temperatūrai suardomos vandenilinės jungtys tarp DNR grandinių ir suardoma natūrali dviveja molekulės sudėtis, prijungiami pradmenys ir pradedama sintezė dalyvaujant DNR polimerazei. Anilinimo etapo metu, sumažinus temperatūra iki 37-68oC komplementarumo principu prijungiami
pradmenys. Paskutinio reakcijos etapo metu veikiant DNR polimerazei 70-75oC temperatūroje sintetinama nauja grandinė (pradmens pratęsimas). Šie trys reakcijos etapai sudaro vieną ciklą, kiekvieno ciklo metu (paprastai vykdoma 25-40 ciklų) DNR kopijų skaičius padidėja dvigubai (37).
1.5.6 Pirmos ir antros kartos sekoskaita. DNR sekoskaita tai DNR analizės metodas, kai analizuojama bazių, kurios sudaro DNR molekulę, išsidėstymo tvarka (seka). Analizuojant šias sekas ir jų išsidėstymą, išaiškinama, kokią genetinę informaciją neša konkretus DNR fragmentas. Taip pat atskleidžiami pasikeitę DNR fragmentai, kurie sukelia genetines ligas (38).
Pagrindinis skirtumas lyginant pirmosios ir antrosios kartos sekoskaitos metodus yra tyrimo apimtis. Pirmosios kartos sekoskaita (kitaip vadinamas Sandžerio sekoskaita, (anglų k. - Sanger
sequencing) vienu metu gali sekvenuoti tik vieną DNR fragmentą, tuo tarpu naujos kartos sekoskaitos
metodas leidžia sekvenuoti daug DNR fragmentų vienu metu. Pirmos kartos sekoskaita yra tinkamesnis pasirinkimas esant mažesniam mėginių skaičiui. Antros kartos sekoskaita yra pranašesnis, nes leidžia aptikti rečiau aptinkamus DNR sekų derinius, suteikiama detalesnės analizės galimybė, greitesnė tyrimo eiga (39).
20
2. TYRIMO VIETA IR MEDŽIAGOS
2.1 Tyrimų vieta ir objektai
Eksperimentiniai tyrimai atlikti LSMU VA Mikrobiologijos ir virusologijos institute 2018-2019 metais. Tyrimams medžiaga pristatyta iš įvairių veterinarijos gydyklų – Vilniaus, Kauno, Klaipėdos ir kitų rajonų, tačiau didžiausias mėginių kiekis buvo gautas iš dr. Leono Kriaučeliūno smulkiųjų gyvūnų klinikos. Tyrimams medžiagą pristatė veterinarijos specialistai transportinėse terpėse su lydraščiais. Tyrimams naudoti mėginiai iš šunų klinikinės medžiagos, esant įvairioms lytinų takų infekcijoms, taip pat kai kurie mėginiai buvo siunčiami profilaktiškai prieš kergimą. Surinkus mėginius ir duomenis apie gyvūnus, jie buvo sugrupuoti pagal šuns veislę, amžių, lytį, mėginio ėmimo vietą bei išskirtų padermių identifikavimui naudotą metodą.
1pav. Tyrimų vieta
2.2 Tiriamųjų bakterijų išskyrimas
Gauti mėginiai buvo įsėti į standžias mitybines terpes iškart po pristatymo. Tamponėliu buvo išvedžiojama tiesiai ant mitybinių terpių paviršiaus trečdalyje lėkštelės ploto. Tuomet sterilia bakteriologine kilpele atlikti sėjimai išvedžiojant štrichais, kad būtų gautos atskiros mikroorganizmų kolonijos ir įvertintas kultūrų vienalytiškumas ir augimo gausumas.
Tyrimams buvo naudojama universali mitybinė terpė – Columbia agaras su 5 proc. avino krauju (Biolife, Italija), bei keletas selektyvių terpių – Mannitol Salt Agar (Liofilchem, Italija), Cetrimide
21 Agar (Liofilchem, Italija), Endo Agar (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė) bei Slanetz-Bartley Agar (Liofilchem, Italija).
Bakterijos buvo kultivuotos termostate +35 ºC temperatūroje, kasdien peržiūrint augimą ant terpių. Vertinant išaugusias bakterijų kolonijas, vertintas jų kiekis universalios terpės paviršiuje (įvertinti, ar mėginyje yra pakankamas kiekis bakterijų ar tai tik kontaminacija imant mėginį), jų vienalytiškumas ir atrinktos atskiros bakterijų kolonijos tolimesniam pagausinimui ir identifikavimui.
2 pav. Kultūros vertinimas universalios terpės paviršiuje
2.3 Išskirtų bakterijų identifikacija
2.3.1 Bakterijų identifikacija klasikinės mikrobiologijos metodais Bakterijų identifikacija atlikta nustatant biochemines jų savybes standartiniuose stikliniuose mėgintuvėliuose su angliavandeniais arba naudojant komercines identifikacijos sistemas „Microbact” (Thermo Fisher, JAV). Naudojant šias sistemas, rezultatai interpretuoti naudojant kompiuterinę programą Microbact 2000. Identifikacijai atlikti grynos kultūros buvo įsėjamos į mėgintuvėlius arba į komercines sistemas, prieš tai paruošus 0,5 McFarland vieneto drumstumo bakterijų suspensiją.
22 Vertinant rezultatus komercinėse sistemose, laikyta, kad rūšis identifikuota, jei identifikavimo tikslumas buvo ne mažiau kaip 90 proc. Esant mažesniam identifikavimo patikimumo procentui arba esant bakterijų gentims, kurioms nėra skirtų biocheminių testų, taip pat padermėms, kurios yra biochemiškai neaktyvios, identifikacija atlikta naudojant molekulinius metodus.
4 pav. Komercinė identifikacijos sistema biocheminėms mikroorganizmų savybėms įvertinti ir juos
identifikuoti
2.3.2 Bakterijų identifikacija molekulinės biologijos metodais Atliekant bakterijų identifikaciją molekulinės mikrobiologijos metodais prieš tai buvo išskirta bakterijų DNR. Tuo tikslu keletas bakterijų kolonijų, augančių standžioje terpėje, buvo suspenduojama 200 μl vandens, be DNAzių. Suspensija virinama 5 min. kratyklėje su kaitinimo funkcija (BioSan, Latvija), po to greitai atšaldoma ir centrifuguojama 10 000 g greičiu. Supernatantas su DNR nusiurbiamas ir laikomas šaldiklyje iki tyrimų. Identifikacijai panaudota 16S rRNR sekoskaita. Tam, kad būtų galima ją atlikti, pirmiausiai atlikta polimerazinė grandininė reakcija panaudojant universalų bakterijoms pradmenį 515R. Reakcijai atlikti buvo panaudotas Draem Taq Green PCR Master Mix (Thermo Fisher, JAV) su polimeraze, pradmuo ir tiriamųjų bakterijų DNR. Reakcija vykdyta termocikleryje (BOECO, Vokietija). DNR sintezė buvo vykdoma 30-čia ciklų, kuriuos sudaro:
• DNR denatūracija (94°C, 30s) • pradmenų prilipinimas (55°C, 1 min) • DNR sintezė (72°C, 30s).
DNR fragmentai gelyje išfrakcionuoti elektroforezės aparatu (Cleaver, Jungtinė Karalystė), o jiems išryškinti panaudota gelių dokumentavimo sistema GelDoc (Ultraviolet Products, Vokietija).
23 Gavus PGR produktą, buvo atliktas jo valymas ir koncentravimas. Tam buvo naudojamas Zymo Research (USA) komercinis rinkinys Clean & Concentrator. Išgrynintas produktas buvo siunčiama į BaseClear kompanijos laboratoriją (Nyderlandai) sekoskaitai atlikti. Gautos sekos buvo išanalizuotos naudojant kompiuterinę programą “Molecular Evolutionary Genetic Analysis software (MEGA, version 6)”. Bazinių lokalių išsidėstymų įrankio (BLAST) pagalba sekos buvo palygintos su sekomis, esančiomis nacionalinio biotechnologijos informacijos centro (NCBI, JAV) duomenų bazėse registruotomis DNR sekomis. Išanalizavus gautus duomenis buvo sudarytas nustatytų bakterijų rūšių filogenetinis medis.
5 pav. Termocikleris
6 pav. Polimerazinės grandininės reakcijos vertinimas elektroforezės gelyje
2.4 Bakterijų jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimas
Tyrimai atlikti sėjant grynas kultūras ant Mueller Hinton Agar (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė). Gaminant terpę buvo nustatomas ir jei reikia koreguojamas jos pH naudojant natrio šarmo tirpalą. Pagaminus terpes, jų pH svyravo tarp 7,2 iki 7,6, o terpė buvo išpilstoma laminarinėje traukos spintoje į Petri lėkšteles 4 milimetrų storiu. Atliekant jautrumo tyrimą buvo pagaminama 0,5
24 McFarland standarto tankio bakterijų suspensija steriliame fiziologiniame tirpale, kuria buvo suvilgomas sterilus vatos tamponėlis ir juo išvedžiojamas visas terpės paviršius. Vienalytei suspensijai gauti naudota purtyklė, o bakterijų tankis matuotas optiniu tankio matuokliu (BioSan, Latvija ). Pradžiovinus terpes keletą minučių, ant jų specialiu dispenseriu (Oxoid, Jungtinė Karalystė) buvo uždedami antibiotikų diskai. Šiuose diskuose esančios antimikrobinių medžiagų koncentracijos parinktos pagal EUCAST standartą.
Tyrimų rezultatai vertinti matuojant milimetrine liniuote sterilios zonos diametrą. Zona, kurioje bakterijų padermė neaugo, buvo laikoma sterilia zona.
Rezultatai interpretuoti remiantis EUCAST klinikiniais lūžio taškais. t.y. įvertinta atskirai kiekvienos medžiagos efektyvumas kiekvienai tirtąjai bakterijų rūšiai, kuriai šiuo metu yra sukurti galiojantys standartai (3 ir 4 lentelės). Jei EUCAST standarte nebuvo interpretacijos atskiriems antibiotikams, jie vertinti remiantis CLSI standartu.
2.5 Statistinė duomenų analizė
Duomenų analizė buvo vykdyta naudojant „Microsoft Excel'2010“ skaičiuoklę bei programiniu statistinių duomenų paketą “IBM SPSS Statistics”. Apskaičiuotų rezultatui patikimumui pagrįsti naudotas Chi kvadrato kriterijus, tyrimo duomenys buvo patikimi, kai p<0,05,p<0,01 ir p<0,001. Taip pat duomenų susisteminimui bei grafiniam pavaizdavimui naudota aprašomoji statistika (skaičiuota kokybinių kintamųjų procentinė išraiška bei sudaryti tai atvaizduojantys grafikai). Aprašomoji statistika naudota skaičiuojant procentinę amžiaus bei veislės dydžio išraišką.
3 lentelė. Naudoti klinikiniai lūžio taškai stafilokokams
Antimikrobinė medžiaga ir jos
koncentracija, µg Interpretacija
Padermė jautri, ≥ Vidutiniškai
jautri Padermė atspari, ≤
Penicilinas (10) 26 - 25 Cefoksitinas (30) 22 (25S.epidermidis) - 21 (24S.epidermidis) Enrofloksacinas (5) 23 17-22 16 Trimeto-sulfa (25) 17 14-16 13 Eritromicinas (15) 21 18-20 17
25
Tetraciklinas (30) 22 19-21 18
4 lentelė. Naudoti klinikiniai lūžio taškai streptokokams
Antimikrobinė medžiaga ir jos
koncentracija, µg Interpretacija Padermė jautri, ≥ Vidutiniškai jautri Padermė atspari, ≤ Penicilinas (10) 18 - 17 Eritromicinas (15) 21 18-20 17 Tetraciklinas (30) 23 20-22 19 Trimeto-sulfa (25) 18 15-17 14 Entrofloksacinas (5) 20 - 19
Bakterijų padermės, kurios buvo atsparios ne mažiau kaip trims skirtingų antibiotikų klasių antimikrobinėms medžiagoms, naudojamoms gydymui, buvo laikytos daugiaatspariomis.
26
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1 Informacija apie mėginius
Tyrimo metu buvo ištirtos 26 kalės ir jų lytinių takų mikrobiota, iš viso išskirta 57 bakterijų padermės. Gyvūnai pagal veislę suskirstyti į tris grupes: mažų veislių atstovai priskirti pirmai grupei, vidutinių – antrai, o didelių veislių kalės priskirtos trečiajai grupei. Pagal amžių taip pat skirstyta į tris grupes: pirmajai amžiaus grupei priskirtos kalės nuo vienerių iki trejų metų amžiaus, antrajai – nuo ketverių iki šešerių metų ir trečiajai – septynerių metų ir vyresnės kalės. Mėginiai imti iš dvejų vietų – iš gimdos arba makšties (5 lentelė). Identifikacijai naudoti įprasti mikrobiologiniai metodai: naudojant universalias ir selektyvias mitybines terpes bei greituosius testus (Staphylococcus spp. tiksliai rūšiai nustatyti). Neidentifikavus bakterijų šiais metodais, jie buvo identifikuoti 16S rRNR sekoskaitos metodu.
Išskirtų bakterijų įvairovė pateikta 7 paveiksle.
5 lentelė. Duomenys apie mėginius
Tirtų kalių skaičius 26
Išskirta bakterijų padermių 57 (41 iš makšties ir 16 iš gimdos)
Skirstymas pagal veislę 1 grupė – mažos veislės
2 grupė – vidutinės veislės 3 grupė – didelės veislės
Skirstymas pagal amžių 1 grupė – 1 - 3 m.
2 grupė – 4 - 6m. 3 grupė – 7m. ir >
Tyrimo metodas ir mėginių skaičius 33 mėginiai tirti įprastais mikrobiologiniais metodais
27
3.2 Kalių lytinių takų mikrobiotos įvairovė
7 pav. Išskirtų bakterijų įvairovė ( n = 57)
Iš pateikto 7 pav. matyti, jog dominavo Staphylococcus spp. (n = 20) (iki tikslios rūšies identifikuota Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus xylosus) ir Streptococcus spp. (n = 10) (iki tikslios rūšies identifikuota Streptococcus canis (dvi padermės), Streptococcus minor, Streptococcus fryi (dvi padermės)), Proteus
spp. (n = 4) (iki tikslios rūšies identifikuota Proteus mirabilis (dvi padermės)).
Staphylococcus spp. ir Streptococcus spp. viso sudarė 52,6 proc. visų tirtų bakterijų.
Likusios padermės buvo rečiau pasitaikančios, jų dažnumas varijavo nuo vieno iki trijų (Pasteurellaceae (n = 3), Frederiksenia canicola (n = 3), Bacillus spp. (n = 2)). Dviem atvejais bakterijų neišskirta (n = 2). 2 1 2 2 1 1 3 1 1 1 3 2 5 1 1 10 20 0 5 10 15 20 25 T irt ų ba kt er ij ų sk aičius , v nt.
28
8 pav. Bakerijų, tirtų sekoskaitos metodu, filogenetinis medis (n = 24)
Bakterijas tiriant 16S rRNR sekoskaitos metodu gauti atsakymai interpretuoti pateikiant juos filogenetiniame medyje (8 pav). Kai kurias bakterijas pavyko identifikuoti iki šeimos (n = 5), likusios padermės buvo identifikuotos iki rūšies (n = 19). Daugiausia buvo Streptococcus rūšių (n = 7), taip pat
29 Devintame paveiksle pateikiamas išskirtų padermių pasiskirstymas skirtingose amžiaus grupėse (n = 26).
9 pav. Tirtų bakterijų kiekio pasiskirstymas skirtingose amžiaus grupėse (n = 26)
Devinto paveikslo duomenys parodo, kad tarp tiriamųjų dominavo kalės nuo ketverių iki šešerių metų amžiaus (n = 14), tuo tarpu pirmojoje amžiaus grupėje (1-3m.) tirtos aštuonios kalės, o trečiojoje (≥ 7m.) – keturios kalės. Vidutinis kalių amžius buvo 4,5m.±0,4m.
Dešimtame paveiksle pateikiamas tirtų bakterijų pasiskirstymas skirtingose veislių grupėse.
10 pav. Tirtų bakterijų skaičiaus pasiskirstymas skirtingose veislių grupėse (n = 26)
Dešimtame paveiksle pateikti duomenys rodo, kad daugiausia tirta vidutinių veislių atstovų (n = 10), tuo tarpu mažųjų – septynios, didžiųjų šunų veislių – devynios kalės.
8 14 4 0 2 4 6 8 10 12 14 16 1-3m. 4 - 6 m. ≥ 7m. K al ių skai čius, v n t. 7 10 9 0 2 4 6 8 10 12
Mažosios veislės Vidutinės veislės Didžiosios veislės
K al ių skai či u s, v n t.
30
3.3 Iš kalių lytinių takų išskirtų bakterijų padermių jautrumas antimikrobinėms
medžiagoms
Tiriant bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms, kad būtų gauta pakankama imtis, buvo pasirinktos dvi grupės bakterijų, kurių išskirta daugiausiai – Staphylococcus spp. ir Streptococcus spp. Jautrumas antimikrobinėms medžiagoms tirtas naudojant diskų difuzijos metodą, antimikrobinės medžiagos ir jų koncentracijos parinktos remiantis EUCAST standartais.
Vienuoliktame paveiksle pateiktas stafilokokų rūšių jautrumas antimikrobinėms medžiagoms.
TE – tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas, P – benzilpenicilinas, FOX – cefoksitinas, ENR – enrofloksacinas, E – eritromicinas
11 pav. Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Vienuoliktame paveiksle pateikti duomenys rodo, jog tiriant Staphylococcus spp. padermių jautrumą antimikrobinėms medžiagoms jautriausios buvo enrofloksacinui (80 proc.), ir sulfametoksazoliui-trimetoprimui (70 proc.), pusė tirtų bakterijų buvo jautrios cefoksitinui. Tiriant cefoksitino efektyvumą veikiant Staphylococcus spp. padermes – pusė tirtų padermių buvo vidutiniškai jautrios, pusė jautrios, taip pat tiriant cefoksitino veiksmingumą nebuvo atsparių padermių. Didžiausią atsparumą Staphylococcus spp. padermės yra įgijusios benzilpenicilinui (70 proc.) bei tetraciklinui (60 proc.). Skaičiuojant šiuos statistinius rodiklius duomenys buvo patikimi (p = 0,002).
30 10 70 10 60 30 10 50 30 20 20 40 80 50 70 20 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% E (15) ENR (5) FOX (22) P (10) SXT (25) TE (30)
Staphylococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms, proc.
Ant im ik ro bin ė m edžia ga ir jo s k o ncent ra cij a , (µg )
31 Dvyliktame paveiksle pateiktas streptokokų rūšių jautrumas antimikrobinėms medžiagoms.
TE – tetraciklinas, SXT - sulfametoksazolis-trimetoprimas, P – benzilpenicilinas, ENR – enrofloksacinas, E – eritromicinas
12 pav. Streptococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Dvylikto paveikslo duomenys rodo, kad prieš Streptococcus spp. padermes labai efektyvus buvo sulfametoksazolis-trimetoprimas (100 proc.), benzilpenicilinas (100 proc.) bei enrofloksacinas (91,7 proc.). Vidutiniškai jautrios padermės buvo tik tetraciklinui (16,7 proc.) bei eritromicinui (16,7 proc.). Mažiausiai jautrios tirtos Streptococcus spp. padermės buvo tetraciklinui (50 proc.). Skaičiuojant šiuos statistinius rodiklius, duomenys buvo patikimi (p = 0,002).
Lyginant penicilino vekimo efektyvumą tarp Staphylococcus spp. ir Streptococcus spp. bakterijų padermių benzilpenicilinas geriau veikė Streptococcus spp. nei Staphylococcus spp.(p = 0,0).
Kadangi labai trūksta informacijos apie morfologines-kultūrines retai identifikuojamų bakterijų savybes, molekuliniais metodais identifikuotų bakterijų augimas terpėse pateiktas 6 lentelėje.
16.7 8.3 50 16.7 16.7 66.7 91.7 100 100 33.3 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% E (15) ENR (5) P (10) SXT (25) TE (30)
Streptococcus spp. jautrumas antimikrobinėms medžiagoms, proc.
Ant im ik ro bin ė m edžia ga ir jo s k o ncent ra cij a , (µg )
32
6 lentelė. Bakterijų, identifikuotų 16S rRNR sekoskaitos metodu, augimo mitybinėje terpėje
charakteristika (pateikta dokumentiškai, nuotraukos autorės)
Mėginio numeris ir identifikuotos padermės pavadinimas
Augimas mitybinėje terpėje
Nr.1 Gemella palaticanis Nr.2 Chryseobacterium taklimakanense Nr.3 Actinomyces canis
33 Nr.5 Streptococcus canis Nr.6 Streptococcus sp. Nr.7 Frederiksenia canicola Nr.8 Streptococcus minor
34 Nr.14 Pasteurellaceae Nr.15 Streptococcus sp. Nr.17 Neisseria dumasiana
35 Nr.18 Schaalia hyovaginalis Nr.19 Haemophilus haemoglobinophilus Nr.20 Gemella palaticanis Nr.29 Streptococcus fryi
36 Nr.30
Pasteurellaceae
Nr.31
37
4. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS
Atlikto tyrimo metu ištirtos 26 kalės bei išskirti 57 bakterijų izoliatai, mėginiai imti iš gimdos ir makšties. Identifikuojant išskirtas bakterijas pasirinkti laboratoriniai tyrimai, biocheminiai testai bei 16S rRNR sekoskaitos metodas. Dažniausiai išskirtos bakterijos buvo Staphylococcus spp.(17,5 proc.) ir Streptococcus spp. (35 proc.), taip pat išskirta Proteus spp.(7 proc.), identifikuojant bakterijas 16S rRNR sekoskaitos metodu dominavo Pasteurellaceae (5,3 proc.) šeimos bakterijos, taip pat
Frederiksenia canicola bakterijos (5,3 proc.).
Literatūros šaltiniuose kaip dažnai išskiriami mikroorganizmai iš kalių makšties minimi stafilokokai, streptokokai, enterokokai, Proteus spp., mieliagrybiai, taip pat Pasteurella spp.,
Pseudomonas aeroginosa.
Atlikto tyrimo metu nustatant, kokie mikroorganizmai sudaro makšties mikrobiotą, buvo išskirti šie mikroorganizmai: Staphylococcuss spp., Streptococcus spp., Pasteurellaceae, Proteus spp., Bacillus spp., Enterococcus faecalis. Taip pat šios rečiau literatūros šaltiniuose aprašomos bakterijų padermės:
Chryseobacterium taklimakanense, Actinomyces canis, Neisseria dumasiana,Micrococcus luteus, Schaalia hyovaginalis, Haemophilus haemoglobinophilus, Rothia nasimurium ir Frederiksenia canicola, Gemella palaticanis,
Gemella genties mikroorganizmai apibūdinami kaip gramteigiami kokai, katalazei neigiami,
fakultatyvūs anaerobai, augantys vientisomis kolonijomis (pateikta 6 lentelėje, mėginiai Nr.1 ir Nr.20).
Gemella palaticanis buvo išskirta iš šunų gerklų (40), kituose šaltiniuose minima, jog ši bakterija
aptinkama imant mėginius nuo šunų dantenų (41). Remiantis šiais literatūros duomenimis galima daryti prielaidą, jog į lytinius kalių takus ši bakterija galėjo patekti laižant tarpvietės sritį.
Kaip dažniausiai pasitaikančias normalios makšties ir mikrobiotos bakterijas literatūros šaltiniai įvardija E. coli., šios bakterijos tyrimų metu identifikuotos nebuvo, galimai dėl to, kad buvo tirta sąlyginai mažas kalių skaičius ir jų aptikti nepavyko, taip pat renkant mėginius nebuvo pateikta informacijos apie tai, kada paskutinį kartą ir kokiomis medžiagomis gydyta. Neaptikta literatūroje minimo Staphylococcus aureus. Pagal biocheminio testo rezultatą stafilokokai identifikuoti iki rūšies, tad galima to priežastis – subjektyvumas vertintant biocheminių testų rezultatus, kurie pagrįsti spalvos pokyčiu.
Literatūros šaltiniuose aprašomuose kalių gimdos mikrobiotos tyrimuose dažnai minimi šie mikroorganizmai: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., taip pat minima, jog dažnu atveju iš gimdos bakterijų kultūros neišskiriamos, tačiau teigiama, jog tai yra senesnių studijų išvados ir naujesniais
38 tyrimais identifikuojama didelė gimdos mikrobiotos įvairovė. Tiesa, taip pat autoriai teigia, jog kalių makšties mikrobiota pasižymi didesniu bakterijų kiekiu, o gimda – didesne bakterijų įvairove. Atlikto tyrimo metu iš gimdos bakterijų neišskirta dviem atvejais, kitais atvejais išskirti šie mikroorganizmai:
Proteus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Pasteurellaceae spp. bei Frederiksenia canicola.
Frederiksenia canicola yra Pasteurellacea šeimai priklausanti bakterija, kultivuojama 37oC , 24-48 val. Columbia agare bei širdies – smegenų agare. Bożena M. Korczak ir kt.(reikia metus įrašyti) savo tyrimo metu šią bakteriją iškyrė iš žaizdų, likusių nuo šunų įkandimų, taigi taip pat galima daryti prielaidą, jog ši bakterija dažnu atveju aptinkama šunų burnos ertmėje. (42,43)
Jautrumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimu buvo pasirinktos Staphylococcus spp. ir
Streptococcus spp. bakterijos. Šios grupės buvo pasirinktos motyvuojant tuo, kad kitų išskirtų bakterijų
grupes sudaro per mažas skaičius, tad statistiniai duomenys galimai būtų nereikšmingi. Gauti tokie rezultatai: stafilokokų padermės buvo jautriausios enrofloksacinui (80 proc.). Didžiausią atsparumą
Staphylococcus spp. padermės yra įgijusios benzilpenicilinui (70 proc.). Literatūroje aprašomo tyrimo
atveju Staphylococcus intermedius buvo atspari penicilinui (91,9 proc.), tirti 74 bakterijų izoliatai. (44) Steptokokų padermes geriausiai veikė sulfametoksazolis-trimetoprimas (100 proc.) bei benzilpenicilinas (100 proc.) Mažiausiai jautrios tirtos Streptococcus spp. padermės buvo tetraciklinui (50 proc.). Literatūroje minima, jog benzilpenicilinas gerai veikia Streptococcus canis, tad gydymui rekomenduojama minimali slopinanti koncentracija yra 3 µg /ml. (45)
39
IŠVADOS
1. Nustatyta, kad iš kalių makšties dažniausiai išskiriamos šios kultivuojamos bakterijos:
Staphylococcuss spp., Streptococcus spp., Pasteurellaceae, Proteus spp., Bacillus spp. ir Enterococcus spp. Gimdoje dažniausiai reziduoja Staphylococcus spp. ir Streptococcus spp.
bakterijų padermės.
2. Tyrimais įrodyta, kad 16S rRNR sekoskaitos metodas yra naudingas identifikuojant bakterijas, kurioms nėra skirtų biocheminių testų, taip pat padermes, kurios yra biochemiškai neaktyvios. Taikant šį tyrimo metodą, kalių lyties organuose nustatytos retai identifikuojamos bakterijų rūšys, tokios kaip Chryseobacterium taklimakanense, Actinomyces canis, Neisseria dumasiana,
Schaalia hyovaginalis, Haemophilus haemoglobinophilus, Rothia nasimurium Frederiksenia canicola, Gemella palaticanis ir kt.
3. Ištyrus išskirtų bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms nustatyta, jog stafilokokų padermės dažniausiai buvo jautrios enrofloksacinui (80 proc.), o dažniausią atsparumą įgijusios benzilpenicilinui (70 proc.). Steptokokų padermes geriausiai veikė sulfametoksazolis- trimetoprimas (100 proc.) bei benzilpenicilinas (100 proc.). Streptococcus spp. padermės dažniausiai atsparios tetraciklinui (50 proc.).
40 PADĖKA
Dėkoju prof. Modestui Ružauskui už naujai įgytus praktinius įgūdžius laboratorijoje bei geranorišką ir profesionalią pagalbą rašant baigiamąjį magistrinį darbą.
41
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Maksimovic A., Maksimovic Z., Filipovic, S., Beširovic H., Rifatbegovic M. Vaginal and uterine bacteria of healthy bitches during different stages of their reproductive cycle. The Veterinary record 2012;171:1-2.
2. Greene, E.C. Infectious diseases of the dog and cat. 3rd edition 2005. p. 935-962.
3. Lyman C.C., Holyoak G. R., Meinkoth K., Wieneke X., Chillei K. A., Silva U. Canine endometrial and vaginal microbiomes reveal distinct and complex ecosystems;Plos one;2019;1-2 .
4. Paula Antunes J. M. A., Carvalho Freire D. A., Oliveira I. V., Moura G. H. F., Demoner L. C., Ferreira H.I.P. Infectious causes of abortion, stillbirth and neonatal death in bitches; 2016. p.55-56.
5. Jorgensen J.H., Ferraro M.J. Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General. Medical microbiolgy;2009.p.1749–1755.
6. Aslam B., Wang W., Arshad M.I., Khurshid M., Muzammil S., Rasool M.H. ir kt. Antibiotic resistance: a rundown of a global crisis.Infection and Drug Resistance;2018;11:1645–1658.
7. Evans H., de Lahunta A. Miller's Anatomy of the Dog. 4th edition;2012. p. 386-397.
8. R., Kidd. The Female Dog’s Reproductive System. [Internet]. 2019 Apr 22 [cited 2019 Sept 02] Available from: https://www.whole-dog-journal.com/health/the-female-dogs-reproductive-system/.
9. Hirsh C.D., MacLachlan J.N., Walker L.R. Veterinary microbiology. 2nd edition; 2014. p. 765-773. 10. Budras, K. D., McCarthy H. P., Fricke W., Richter R. Anatomy of the Dog. 5th edition; 2007. p. 68 .
11. Groppetti D., Pecile A., Barbero C., Martino PA. Vaginal bacterial flora and cytology in proestrous bitches: role on fertility.2012;77(8):1549-1556.
12. Anonymous. How to deal with your dog/puppy’s vaginitis. [Internet]. 2019 Aug 7 [cited 2019 Sep 4] Available on: https://animalso.com/vaginitis-in-dogs/.
13. Baker, T. CVC highlight: How to handle chronic vaginitis in veterinary patients. [Internet]. 2013 Dec 01 [cited 2019 Sept 05] Available on: http://veterinarymedicine.dvm360.com/cvc-highlight-how-handle-chronic-vaginitis-veterinary-patients.
14. Kustritz, R. V. M. Vaginitis in dogs: A simple approach to a complex condition. [Internet]. 2008 Oct 01 [cited 2019 Aug 05] Available on: http://veterinarymedicine.dvm360.com/vaginitis-dogs-simple-approach-complex-condition.
15. Llera, R. Vaginitis in Dogs. [Internet]. 2018 [cited 2019 Aug 05] Available on: https://vcahospitals.com/tiara-rado/know-your-pet/vaginitis-in-dogs.
42 16. Wells, V. Structure and function of the female canine reproductive tract. [Internet]. 2015 Aug 03 [cited:2019 Aug 01] Available from: https://www.petplace.com/article/dogs/pet-health/structure-and-function-of-the-female-canine-reproductive-tract/. 2015.
17. Ward, E. Pyometra in Dogs. [Internet]. 2018 [cited 2019 Sept 02] Available from: https://vcahospitals.com/know-your-pet/pyometra-in-dogs.
18. Laurusevičius A.S., Šiugždaitė J., Žilinskas H. Mikroorganizmų ir kitų veiksnių įtaka kalių piometros etiologijai. Veterinarija ir zootechnika; 2009;46:37-42.
19. Hagman R. Molecular aspects of uterine diseases in dogs. Reproduction in Domestic Animals. 2017; 52:37-42.
20. Jubb, Kennedy, Palmer's. Pathology of domestic animals. Sixth edition; Volume 3; 2015. p. 387.
21. Spielman, B. Overview of canine metritis. [Internet]. 2015 Aug 27 [cited: 2019 Oct 05] Available from: https://www.petplace.com/article/dogs/pet-health/metritis-in-dogs/.
22. Laurusevičius S.A., Šiugždaitė J., Žilinskas H. Correlation between different sexual cycle stages and vaginal bacterial flora in bitches of different breeds. Veterinarija ir zootechnika. 2008;41:76-79.
23. Nelson R., Couto G. C. Small animal internal medicine. 5th edition; 2013. p. 951-952 .
24. Gunay U., Onat K.,Gunay A.,Ulgen M. Vaginal, Cervical and Uterine Bacterial Flora at the Different Stages of the Reproductive Cycle in Ovariohysterectomized Bitches. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2010;9(3):478-481.
25. Schultheiss P.C., Jones L.R., Kesel L.M., Olson N.P. Normal bacterial flora in canine and feline uteri. Journal of veterinary diagnostic investigation 1999;11(6):560-562.
26. Goericke‐Pesch S., Fux V., Prenger‐Berninghoff E., Wehrend A. Bacteriological findings in the canine uterus during Caesarean section performed due to dystocia and their correlation to puppy mortality at the time of parturition. Reproduction in domestic animals. 2018;53(4):889-894.
27. Europos Sąjungos oficialusis leidinys. Komisijos pranešimas:Racionalaus antimikrobinių medžiagų naudojimo veterinarijoje gairės. 2015-09-14 p. 24-26.
28. Ružauskas M. Moksliniai tyrimai bakterijų atsparumo antibiotikams srityje. 2016-10-27.
29. Prescott F. J., Brad Hanna J. W., Reid-Smith R., Drost K. Antimicrobial resistance patterns of bacteria isolated from dogs with otitis. Epideiology and infection. 2018;147:1-10.
30. Evason M., Stull J. Antimicrobial (Antibiotic) Resistance in Dogs; AKC Canine Health Foundation. 2019;1-6.
31. Sandle, T. Pharmaceutical Microbiology.Essentials for Quality Assurance and Quality Control. 2016; p.103-113.
