LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Laura Šakarnytė

Bakterijų, išskirtų iš elninių (Cervidae) šeimos žvėrių, atsparumas antibiotikams Prevalence and Antimicrobial Resistance of Bacteria Isolated from Cervidae

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: lekt. dr. Lina Merkevičienė

2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Bakterijų, išskirtų iš elninių (Cervidae) šeimos žvėrių, atsparumas antibiotikams“:

1. yra atliktas mano paties (pačios).

2. nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Laura Šakarnytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE DARBO LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ Patvirtinu, kad darbo lietuvių kalba taisyklinga.

Asta Tinterytė

(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO Patvirtinu, kad darbas atitinka reikalavimus ir yra parengtas gynimui

(data)

Lekt. dr. Lina Merkevičienė

(darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE) Prof. Rasa Želvyte

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas Lekt. dr. Aušra Gabinaitienė

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1. Elninių (Cervidae) žvėrių šeimos biologija ... 10

1.2. Bakterijų atsparumo antibiotikams mechanizmai ... 12

1.3. Bakterijų atsparumas antibiotikams... 14

1.3.1 Bakterijų atsparumas antibiotikams žmonių medicinoje ... 14

1.3.2. Bakterijų atsparumas antibiotikams veterinarinėje medicinoje ... 16

1.3.3. Bakterijų atsparumas antibiotikams laukiniuose gyvūnuose ... 18

1.3.3.1. Gram neigiamų bakterijų atsparumas antibiotikams laukiniuose gyvūnuose ... 18

1.3.3.2...Escherichia coli atsparumas kolistinui...20

1.3.3.3. Gram teigiamų bakterijų atsparumas antibiotikams laukiniuose gyvūnuose ... 21

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 23

2.1. Tyrimų eiga, vieta ir tyrimo objektai ... 23

2.2. Mėginių identifikavimas, rinkimas ir pristatymas į laboratoriją ... 23

2.3. Tiriamosios medžiagos įsėjimas į mitybines terpes bakterijoms išskirti ... 25

2.3.1. Staphylococcus spp. sėjimas į mitybines terpes ... 25

2.3.2. Escherichia coli sėjimas į mitybines terpes ... 25

2.4. Išskirtų bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas ... 25

2.5. Išskirtų bakterijų padermių paruošimas šaldymui ... 27

2.6. Kolistinui atsparumą koduojančių genų nustatymas ... 27

2.7. Tyrimo duomenų statistinis vertinimas ... 28

4 3.1. Staphylococcus spp. paplitimas elninių šeimos gyvūnų populiacijose ... 29 3.1.1. Laukinių elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 29 3.1.2. Nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 30 3.2. Escherichia coli bakterijų paplitimas elninių šeimos gyvūnų populiacijose ... 33 3.2.1 Laukinių elninių šeimos gyvūnų Escherichia coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms... ... 33 3.2.2 Nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų Escherichia coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms.... ... 34 3.2.3 Escherichia coli bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms palyginimas tarp laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių gyvūnų ... 35 3.2.4 Kolistinui atsparumą koduojančių genų nustatymas tarp Escherichia coli, išskirtų iš elninių šeimos gyvūnų... ... 37 4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 38 LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 41

5

SANTRAUKA

Bakterijų, išskirtų iš elninių (Cervidae) šeimos žvėrių, atsparumas antibiotikams Laura Šakarnytė

Magistro baigiamasis darbas

Darbo apimtis: 49 puslapiai, 6 lentelės, 17 paveikslų, 1 schema.

Darbo tikslas: išskirti E. coli ir Staphylococcus spp. bakterijas iš laisvėje ir nelaisvėje gyvenančių elninių (Cervidae) šeimos atstovų ir nustatyti jų atsparumą antibiotikams.

Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms yra plačiai paplitusi kompleksinė problema, kuri apima ne tik žmonių ir naminių gyvūnų sveikatą, bet ir laukinės gamtos biologinius rezervuarus. Šiam procesui daug įtakos turi išaugusi žmonių bei naminių gyvūnų populiacija, globaliniai pokyčiai, padidėjęs medikamentų poreikis, ekonominės problemos bei kiti politiniai ir socialiniai veiksniai. Įprastomis sąlygomis, laukiniai gyvūnai neturi tiesioginio sąlyčio su antropogenizuotais gyvosios ir negyvosios gamtos elementais, tačiau pastebimi antimikrobinių medžiagų jautrumo pokyčiai bakterijų mėginiuose, išskirtuose iš laukinės gamtos.

Tyrimai atlikti 2019–2020 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Mėginiai (elninių šeimos gyvūnų išmatos) buvo renkami Pasvalio rajono, Joniškėlio apylinkių, Kėdainių rajono miškuose bei privačiuose ūkiuose X (Pakruojo rajonas), Y (Pasvalio rajonas). Darbo metu buvo atliekami klasikiniai mikrobiologiniai bei molekuliniai genetiniai tyrimai. Iš išmatų mėginių išskirtoms E. coli ir Staphylococcus spp. bakterijoms buvo nustatinėjamas atsparumas antibiotikams. E. coli padermės, kurios pasižymėjo atsparumu kolistinui, buvo tiriamos molekuliniais metodais ieškant mcr-1 ir mcr-2 genų.

Iš laukinių elninių gyvūnų E. coli bakterijos buvo išskirtos 58 proc., Staphylococcus spp. bakterijos 15,9 proc. atvejų, iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų E. coli 90,3 proc. atvejų, o iš nelaisvėje laikomų elninių gyvūnų Staphylococcus spp. 16,1 proc. atvejų.

Iš laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių gyvūnų išskirtos E. coli bakterijos daugiausiai buvo atsparios gentamicinui (47,5 proc.; 46,4 proc.), ampicilinui (32,5 proc.; 46,4 proc.). Staphylococcus spp. bakterijos išskirtos iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų pasižymėjo didžiausiu atsparumu ciprofloksacinui (60 proc.) ir gentamicinui (20 proc.). Mcr-1 ir mcr-2 genai, koduojantys atsparumą kolistinui, nebuvo nustatyti.

6

SUMMARY

Prevalence and Antimicrobial Resistance of Bacteria Isolated from Cervidae Laura Šakarnytė

Master‘s Thesis

Scope of the thesis: 49 pages, 6 tables, 17 figures, 1 scheme.

Goal of the thesis: to isolate E. coli and Staphylococcus spp. bacteria from representatives of the family Cervidae living in freedom and capture and to determine their resistance to antibiotics.

Resistance of bacteria to antimicrobial substances is a widely spread complex problem involving not only health of people and domestic animals but also biological reservoirs of the wild nature. This process is significantly affected by increased population of people and domestic animals, global changes, increased need of pharmaceuticals, economic problems, and other political and social factors. Under common conditions, wild animals do not have direct contact with anthropogenic elements of the animate and inanimate nature; however, in the samples of bacteria isolated from the wild nature, changes in sensitivity of antimicrobial substances are visible.

Research was conducted in the Institute of the Microbiology and Virology of the Veterinary Academy of the Lithuanian University of Health Sciences within the period of 2019–2020. Samples (faeces of animals of the family Cervidae) were collected in Pasvalys district, Joniškėlis surroundings, forests of Kėdainiai district, and private farms X (Pasvalys district), Y (Pasvalys district). During preparation of this thesis, classical microbiological and molecular genetic tests were performed. The antimicrobial resistance was being measured to bacteria E. coli and Staphylococcus spp. isolated from the samples of faeces. Through molecular tests of E. coli strains resistant to colistin, mcr-1 and mcr-2 genes were being searched.

E. coli bacteria were isolated from the wild deer animals in 58 % of cases and Staphylococcus spp. bacteria - in 15.9 % of cases; from captive deer family animals E. coli bacteria were isolated in 90.3 % of cases, and Staphylococcus spp. – in 16.1 % of cases.

E. coli bacteria isolated from the wild and captive deer animals were mostly resistant to gentamicin (respectively 47.5 % and 46.4 %), ampicillin (32.5 % and 46.4 %). Staphylococcus spp. bacteria isolated from the captive deer family animals featured the highest resistance to ciprofloxacin (60.0 %) and gentamicin (20.0 %). The colistin resistance genes mcr-1 and mcr-2 gens were not detected.

7

SANTRUMPOS

AMP - ampicilinas

AMR - antimikrobinėms medžiagoms atsparios bakterijos

bp - bazių poros

C - chloramfenikolis

CIP - ciprofloksacinas

CLSI - Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas

CN - gentamicinas

CS - kolistinas

DNR - deoksiribonukleorūgštis

E - eritromicinas

EUCAST - Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komitetas

EURODEER - Europos elninių šeimos gyvūnų elgsenos tyrimo projektas (angl. European Roe DEER)

FOX - cefoksitinas

IPM - imipenemas

LR - Lietuvos Respublika

LSMU - Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

MASA - (angl. MRSA) meticilinui atsparus Staphylococcus aureus MIK - (angl. MIC) mažiausioji slopinančioji antibiotiko koncentracija n - tirtų mėginių skaičius

P - penicilinas

p - patikimumas (statistinis)

PGR - polimerazinė grandininė reakcija PSO - Pasaulio sveikatos organizacija

QRDR - atsparumą chinolonų klasės antibiotikams koduojantys regionai TE - tetraciklinas

8

ĮVADAS

Bakterijų atsparumas antibiotikams yra itin aktuali dabartinės medicinos bei veterinarijos problema, kuriai skiriama vis daugiau dėmesio. Šis reiškinys nėra naujas fenomenas – tai natūraliai išsivysčiusi bakterijų prisitaikymo prie aplinkos mechanizmų visuma. Nauji atsparumo mechanizmai atsiranda kiekvieną dieną ir tai apsunkina infekcinių ligų kontroliavimo ir gydymo galimybes.

Gyvūnai iš neantropogenizuotos aplinkos gali būti tarsi mikroorganizmų, atsparių antimikrobinėms medžiagoms, rezervuaras, dėl to yra būtina labiau gilintis į šią temą ir suprasti jų atsiradimo ir plitimo mechanizmus (1). Tačiau mažėjantis antimikrobinių medžiagų jautrumas infekcinių ligų sukėlėjams yra opi problema šiuolaikinėje medicinoje. Atliekant gydymo procedūras ir taikant antimikrobinę terapiją tiek naminiams, tiek žemės ūkio gyvūnams dažnai yra susiduriama su bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms problema. Daug dėmesio susilaukia patogeninės bakterijos, tokios kaip E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp., Camphylobacter spp., Enterococcus spp., ir jų sukeliamos infekcinės ligos, kurių gydymas pirmos eilės pasirinkimo antibiotikais dažnai yra neveiksmingas dėl išsivysčiusio atsparumo antimikrobinėms medžiagoms (2). Atsparūs mikroorganizmai gali lengvai plisti tarp žmonių ir gyvūnų artimo kontakto metu, per maisto grandinę ar aplinką (3).

Lietuvoje laikomų nelaisvėje elninių šeimos gyvūnų skaičius nuolat didėja. 2015 m. duomenimis, Lietuvoje iš viso buvo laikomi 11 343 danieliai ir elniai, o 2020 m. duomenimis, – 19 337. Per penkis pastaruosius metus danielių ir elnių gyvūnų vienetų skaičius Lietuvoje padidėjo 58,66 proc. (4). Šiuo metu Lietuvoje natūraliomis sąlygomis gyvena daugiau nei 260 tūkst. briedžių, tauriųjų elnių, stirnų bei danielių (5). Veterinarinėje medicinoje E. coli, Salmonella spp., Staphylococcus spp. ir kitos atsparios bakterijos daugiausia yra tyrinėjamos produkcijos gyvūnų, kiaulių, galvijų bei paukščių populiacijoje, tačiau pastebėtas bakterijų plitimas į laukinių gyvūnų populiacijas, kurios nėra tiesiogiai paveiktos antibiotikų (6).

Darbo tikslas – išskirti E. coli ir Staphylococcus spp. bakterijas iš laisvėje ir nelaisvėje gyvenančių elninių (Cervidae) šeimos atstovų ir nustatyti jų atsparumą antibiotikams.

Darbo uždaviniai:

1. Išskirti E. coli ir Staphylococcus spp. iš laisvėje ir nelaisvėje gyvenančių elninių (Cervidae) šeimos atstovų.

2. Nustatyti išskirtų bakterijų atsparumą antibiotikams. 3. Nustatyti kolistinui atsparumą koduojančius genus.

9 4. Įvertinti elninių (Cervidae) šeimos atstovų, kaip galimo atsparių antibiotikams bakterijų platintojų,

10

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Elninių (Cervidae) žvėrių šeimos biologija

Elninių (Cervidae) šeimos gyvūnai – tai šiltakraujai žinduoliai, porakanopiai atrajotojai, žolėdžiai. Dauguma elninių turi ragus, kurie yra iš kieto kaulo, be raginės makšties, kasmet metami. Briedis – vienas stambiausių miško žinduolių. Ragus turi tik patinai, poruojasi rugpjūčio–spalio pradžioje, dažniausiai gyvena sumedėjusia augalija apaugusiuose plotuose. Tauriojo elnio kūnas tvirtas, kojos plonos. Suaugę patinai atsiskiria ir žiemą gyvena sudarydami patinų būrelius, dažniausiai maitinasi lapuočių ir mišriuose miškuose. Europinės stirnos kailis vasarą būna raudonai arba gelsvai rudas, o žiemą – rusvai pilkas, kūno apačia šviesesnė, patinai turi ragus; šie gyvūnai gyvena įvairaus tipo miškuose (7).

Elninių šeimą sudaro daug skirtingų rūšių porakanopių gyvūnų – šiuo metu literatūroje yra aprašomos 43 rūšys ir 206 porūšiai, o šios šeimos atstovų eksterjerai labai varijuoja: Aliaskos briedis (Alces alces gigas) yra 700 kg svorio, šiaurinis pudu (Pudu mephistophiles) – 9 kg (8). Elninių šeimos gyvūnai yra natūraliai paplitę Šiaurės, Centrinėje bei Pietų Amerikoje, Eurazijoje, Šiaurės Afrikoje, Naujojoje Zelandijoje, tačiau jų nėra aptinkama Antarktidoje ir Australijoje. Be to, šie gyvūnai dažnai yra laikomi nelaisvėje įvairiems tikslams (8,9). Numanoma, kad stirnų (Capreolus capreolus), kurios yra plačiai paplitusios visoje Europoje, yra maždaug 1,5 karto daugiau, nei nurodoma oficialiuose dokumentuose (10). Tačiau nemažai elninių šeimos atstovų, tokių kaip Dovydo elnias (Elaphurus davidianus), Kalamijos elnias (Hyelaphus calamianensis), pelkinis elnias (Blastocerus dichotomus) yra atsidūrę ties išnykimo riba dėl perteklinės nekontroliuojamos medžioklės, geografinės izoliacijos, buveinių išnykimo, žemės ūkio plėtros ir kitų priežasčių (9).

Stambūs žolėdžiai yra labai svarbūs įvairioms ekosistemoms, be to, moksliniais tyrimais yra įrodyta šių gyvūnų įtaka augalų bei kitų gyvūnų biologinei įvairovei ir augalų vegetacijai. Nors per paskutinius kelis dešimtmečius elninių šeimos atstovai patyrė daug drastiškų pokyčių, daugelyje ekosistemų yra stebimas elninių populiacijos didėjimas (11). Labai svarbus elninių šeimos gyvūnų bruožas – sezoninė migracija. Nustatyta, kad pavasarinė stirnų migracija yra sinchroniška kiekvienais metais, tačiau rudeninės migracijos tipas, trukmė bei atstumai priklauso nuo regiono, individų ir jų lyties. Europos elninių šeimos gyvūnų elgsenos tyrimo projekto (EURODEER, angl. EUropean ROe DEER) duomenimis, taurieji elniai (Cervus elaphus) triskart daugiau migruoja nei stirnos (Capreolus capreolus) (atitinkamai – 56 ir 18 proc.), o tauriųjų elnių patinai migruoja dukart daugiau nei patelės (atitinkamai – 82 ir 38 proc.) (žr. 1 pav.) (12,13).

11 Lietuvos Respublikos aplinkos ministerija nurodo, kad 2019–2020 m. medžioklės sezono metu rinktais duomenimis nustatyta, jog 2019 m. Lietuvos teritorijoje gyvena 18 182 briedžiai (1585 vnt. daugiau nei 2018 m.), 55 254 taurieji elniai (7 874 vnt. daugiau nei 2018 m.), 179 645 stirnos (14 716 vnt. daugiau nei 2018 m.), 7 161 danieliai (1 543 vnt. daugiau nei 2018 m.) (5). Valstybės įmonės žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro 2020 m. rugpjūčio 1 d. duomenimis, Lietuvoje yra 1 registruotas laikytojas, kuris laiko 1 briedį nelaisvėje, 306 laikytojai, kurie yra užregistravę 313 danielių bandų, o iš viso nelaisvėje yra laikoma 9 470 danielių. 167 laikytojas yra įregistravęs 174 nelaisvėje laikomų elnių bandas, iš viso – 8 898 registruotų gyvūnų (15). 2020 m. duomenimis, Lietuvos elnių augintojų asociacijai priklauso 44 nariai.

Laukiniai medžiojami žolėdžiai gyvūnai dažnai padaro nemažai žalos žemdirbystės ūkiams (16). Elniniai minta augalais, kurie yra auginami kaip pasėliai, apdorojami įvairiomis trąšomis, pesticidais, fungicidais, herbicidais ar kitomis medžiagomis, siekiant padidinti užauginamos produkcijos kiekį (17). Herbicidai yra vieni iš dažniausiai naudojamų cheminių medžiagų pasaulyje. Tyrimais įrodyta, kad herbicidai daro poveikį bakterijų mažiausiai slopinančiajai antibiotiko koncentracijai (angl. MIC, minumum inhibitory concentration). E. coli ir S. enterica paveikus plačiai naudojamu herbicidu glifosatu (raundapas), fluorochinolonų klasės antibiotiko ciprofloksacino mažiausioji slopinančioji antibiotiko koncentracija padidėjo. Tačiau E. coli paveikus herbicidu glifosatu, antibiotiko tetraciklino mažiausioji slopinančioji antibiotiko koncentracija sumažėjo. Deja, bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms gali didėti net ir tada, kai antimikrobinių medžiagų naudojimas yra griežtai kontroliuojamas, nes atsparumo susidarymui taip pat įtakos turi kiti veiksniai ir cheminės medžiagos (18,19).

12

1.2. Bakterijų atsparumo antibiotikams mechanizmai

Antibiotikai – tai medžiagos, slopinančios arba naikinančios bakterijas; jie gali būti natūralūs arba sintetiniai. Perteklinis antimikrobinių medžiagų naudojimas ir greitas bakterijų atsparumo didėjimas kelia didelę grėsmę žmonių ir gyvūnų sveikatingumui, todėl yra labai svarbu žinoti bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms įgijimo mechanizmus ir priežastis. Atsparios bakterijos geba augti, daugintis, sintetinti įvairias medžiagas bei sukelti infekcijas net tada, kai bakterijos yra veikiamos antimikrobinių medžiagų (20,21). Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms gali būti skiriamas į du tipus: natūralų ir įgytą. Pavyzdžiui, E. coli rodo atsparumą vankomicinui, dėl šios medžiagos negalėjimo fiziškai prasiskverbti pro bakterijos membraną. Įgyto atsparumo priežastimi gali būti genų įgavimas horizontaliu keliu, genų mutacijos arba abi šios priežastys (22).

Gram neigiamų bakterijų atsparumo didėjimas dažnai yra siejamas su atsparumą koduojančių genų lokacija bakterijoje, kadangi jos gali lengvai plisti dėl intergronų, transpozonų, plazmidžių, bakteriofagų (23). Judrieji genomo elementai – tai DNR segmentai, koduojantys enzimus ir kitus baltymus, kurie reguliuoja DNR plitimą tarp genomų ir bakterijų. Prokariotuose interląstelinis DNR plitimas gali pasireikšti šiomis formomis: transformacija, konjugacija ir transdukcija (žr. 2 pav.) (24).

2 pav. Genetinės medžiagos plitimo būdai prokariotuose judriaisiais genomo elementais (25) Bakterijos įgauna atsparumą antimikrobinėms medžiagoms dėl spontaninių genetinės medžiagos mutacijų, genų įgavimo iš kitų bakterijų, dėl biocidų ir kitų medžiagų tiesioginio ar netiesioginio poveikio. Biocidai turi įtakos antimikrobiniam atsparumui, kadangi jie dažnai veikia panašiu būdu kaip antibiotikai. Intensyvus biocidų naudojimas sukelia bakterijų atsparumą šiems produktams ir kryžminį atsparumą kitoms antimikrobinėms medžiagoms. Naudojama per maža biocido koncentracija, nepaisant aplikavimo metodo, nenužudo bakterijos, tačiau sukelia streso atsaką, kurio metu aktyvuojami įvairūs ląstelės mechanizmai, padedantys mikroorganizmui išgyventi. Kartu yra inicijuojamas bei aktyvinamas

13 atsparumo įgavimas įvairioms antimikrobinėms medžiagoms (26,27). Kitos cheminės medžiagos (pvz., herbicidai) taip pat turi įtakos bakterijų jautrumui – atsparumui antimikrobinėms medžiagoms (18).

E. coli pasižymi tiek donoro, tiek recipiento elgsena, todėl gali gauti ir skleisi atsparumą koduojančią genetinę medžiagą (28). Yra keletas bendrų antimikrobinėms medžiagoms atsparių bakterijų (AMR) atsparumo atsiradimo mechanizmų: enzimų, kurie pakeičia molekulinę antimikrobinių medžiagų struktūrą sekretavimas, antimikrobinio vaisto taikinio funkcijos pakeitimas, išorinės membranos struktūrų modifikacija, efliukso siurblių sistemos pokyčiai (29). Bakterijos įgauna atsparumą antimikrobinėms medžiagoms koduojančius genus per mobilius elementus, tokius kaip plazmidės, transpozonai bei integronai, bei chromosominių genų spontaninių mutacijų metu. Atsparumą koduojanti genetinė medžiaga, esanti šiuose elementuose, gali būti perduodama kitoms bakterijoms (30,31).

Atsparumas tetraciklinui yra sukeltas plazmidėse esančios genetinės informacijos, su plačiu spektru genetinių determinantų, dėl kurių kiekio jautrioms bakterijoms padidėja tikimybė įgyti atsparumą. Savo ruožtu, atsparumas daugeliui cefosporinų grupės antibiotikų paprastai yra pastovių mutacijų pasekmė (31). 2013 m. Ispanijoje atlikto mokslinio tyrimo metu nustatyta, kad visi tetraciklinui atsparūs štamai turi tet(A) ir tet(B) genus, kurie koduoja aktyvią efliukso sistemą ląstelėje (32). Taip pat tetraciklinui atsparių E. coli bakterijų genetinėje medžiagoje yra randami tet(C), tet(D), tet(E) genai. Atsparumas noliksidimo rūgščiai ir ciprofloksacinui yra siejamas su aminorūgščių pokyčiais dėl GyrAir ParC baltymų pokyčių ląstelėje (33). Pastebima, kad viena iš dažniausių bakterijų atsparumo chinolonams priežasčių yra mutacijos QRDR (atsparumą kvinolonų klasės antibiotikams koduojančiuose regionuose) (32). Chinolonams ir fluorochinolonams taip pat būdingas atsparumo antimikrobinėms medžiagoms atsiradimas dėl pokyčių vaisto prisijungimo vietose, sumažėjusio išorinės ląstelės membranos pralaidumo, pakitimų efliukso sistemoje (28).

Atsparumas β-laktaminiams antibiotikams atsiranda dėl bakterijų β-laktamazių fermento gamybos. Airijoje 2012 metais atlikto mokslinio tyrimo metu nustatyta, kad 23,5 proc. laukinių hibridinių elnių E. coli mėginių yra teigiami nitrocefino testui, kurio rezultatas yra teigiamas, kai bakterija gamina β-laktamazę (34). Dažniausiai šį fermentą koduojantys genai yra blaTEM-1, blaCTX-M-14, blaTEM-52 (28,33).

Tačiau Lenkijoje atlikto mokslinio tyrimo su laukiniais elniais metu blaTEM geno nebuvo aptikta, bet net

54,9 proc. iš laukinių gyvūnų išskirtų E. coli mėginių buvo aptiktas blaCMY-2 genas (iš išskirtų mėginių

46,2 proc. yra jautrūs β-laktamams) (1). 2016 m. Bangladeše su laukiniais elniniais atlikto tyrimo metu aptikti šie atsparumo tetraciklinui genai E. coli bakterijoje: tetA, tetB, tetC. Nustatyta, kad 58,62 proc. ampicilinui atsparių E. coli ir 34,48 proc. sulfametoksazolui atsparių E. coli bakterijų turi blaTEM ir sul2

14

1.3. Bakterijų atsparumas antibiotikams

Antimikrobiniai preparatai ilgą laiką nuo jų išradimo buvo veiksmingi prieš įvairaus tipo patogenines bakterijas, tačiau, praėjus kiek daugiau nei keliems dešimtmečiams, mikroorganizmai prisitaikė įveikti antibiotikų sukeliamas žalas (36). Bakterijų atsparumui antimikrobinėms medžiagoms daug įtakos turi išaugęs žmonių, naminių gyvūnų skaičius, globalinė migracija, padidėjęs antibiotikų naudojimas gydymo įstaigose, veterinarijos klinikose, gyvūnų produkcijoje, laukinių gyvūnų išplitimas, netinkama vaistų pasiekiamumo bei patekimo vartotojams reguliacija, kokybės neatitinkantys medikamentai bei kiti politiniai ir socialiniai veiksniai (37,38). Prognozuojama, kad jei artimiausiu metu nebus imtasi efektyvių priemonių stabdyti antimikrobinėms medžiagoms atsparių mikroorganizmų plitimą, iki 2050 m. kasmet gali mirti apie 10 milijonų žmonių ir numatomas bendro vidaus produkto sumažėjimas apie 100,2 trilijonų JAV dolerių (38).

1.3.1 Bakterijų atsparumas antibiotikams žmonių medicinoje

Antimikrobinės medžiagos – labai svarbi infekcinių ligų gydymo priemonė, jų atsiradimas padarė didelę pažangą ne tik žmonių, bet ir veterinarinėje medicinoje. Pirmieji antibiotikų naudojimo žmonių medicinoje pėdsakai aptinkami 350–550 m. prieš mūsų erą, tačiau tikrasis medicinos perversmas fiksuojamas 1943 m., kai žmonių infekcinėms ligoms gydyti pradėtas naudoti penicilinas. Nuo antibiotikų naudojimo medicinoje pradžios, nuolat išsaugomos milijonų žmonių gyvybės, taip pat žmonių gyvenimo trukmė vidutiniškai pailgėjo 23 metais (39–41).

Atsparių bakterijų sukeltas infekcines ligas gydyti dvigubai sunkiau nei neatsparių bakterijų sukeltas infekcines ligas, nes įprastai veiksmingi antibiotikai nedaro norimo poveikio. Dėl šios priežasties gydymas gali būti pradedamas per vėlai, ligai pažengus ar kilus antrinei infekcijai, dėl ko ligos prognozė gali tapti blogesnė ar net kritinė. Tokiose situacijose padidėja pacientų sergamumas ir mirtingumas, didesnės gydymo išlaidos, galimi šalutiniai poveikiai (39). Daugelis moderniosios medicinos procedūrų, kaip organų transplantacija, vėžio gydymo terapija, nepakankamai išsivysčiusių naujagimių terapija bei kitos procedūros, būtų neįmanomos be efektyvaus antimikrobinių medžiagų poveikio patogeniniams mikroorganizmams. Pastaraisiais metais vis didėjantis priešgrybelinių ir antibakterinių preparatų naudojimas žmonių ir veterinarinėje medicinose sukelia padidėjusį bakterijų atsparumą šioms medžiagoms. Per didelis suvartojamų antibiotikų kiekis dažnai įvardijamas kaip viena iš pagrindinių atsparumą antimikrobinėms medžiagoms lemiančių priežasčių (37).

15 Atsparios bakterijos gali lengvai plisti tarp gyvūnų ir žmonių dėl tiesioginio kontakto, per mitybos grandinę ar aplinką (žr. 3 pav.). Taip pat teigiama, kad didžioji dauguma žmonėms pavojingų infekcinių ligų turi laukinės gamtos rezervuarą. Escherichia coli, Salmonella spp., Campylobacter spp. dažnai aptinkamos žmonių naudojamuose rekreaciniuose vandenyse, kuriuose bakterijos neretai būna paplitusios dėl laukinių gyvūnų, išskirtinai paukščių, daromos įtakos (42–44).

Žmonės dažnai užsikrečia bakterijomis, kurios yra atsparios antimikrobinėms medžiagoms, tiesiogiai nuo žemės ūkio gyvūnų, per infekuotą vandenį ar maisto produktus. Bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms genai neretai patenka į žmonių organizmus horizontalios genų pernašos būdu. Dažniausiai iš gyvūnų išskiriamos bakterijos, sukeliančios infekcijas žmonėms, yra Campylobacter spp., Salmonella spp., meticilinui atspari Staphyloccocus aureus (MASA), Escherichia coli. PSO (pasaulio sveikatos organizacijos) 2019 m. pateiktais duomenimis, didžiausią susirūpinimą žmonių sveikatingumu kelia: karbapenemams atspari Acinetobacter spp., Clostridioides difficile, karbapenemams atsparios Enterobacteriaceae spp., Neisseria gonorrhoeae, Campylobacter spp., Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp. (45-52).

Labai panašios arba tos pačios struktūros antibiotikai naudojami ne tik žmonių medicinoje, bet ir veterinarijoje. Žmonėms ir gyvūnams naudojami antibiotikai pagal PSO standartus skirstomi į tris klases: kritiškai svarbūs, labai svarbūs ir svarbūs. Kritiškai svarbūs antibiotikai su pavyzdžiais yra pateikti 1 lentelėje (53).

16 1 lentelė. Kritiškai svarbios antimikrobinės medžiagos ir pavyzdžiai, kurie yra naudojami žmonių medicinoje (54)

Antimikrobinės medžiagos klasė Antimikrobinės medžiagos pavyzdys kritiškai svarbios antimikrobinės medžiagos

aminoglikozidai gentamicinas

ansamicinai rifampicinas

karbapinemai ceftriaksonas, cefepimas ir kt.

glikopeptidai vankomicinas

glicilciklinas tigeciklinas

lipopeptidai daptomicinas

makrolidai, ketolidai azitromicinas, eritromicinas, telitromicinas

monobaktamai aztreonamas

oksazolidonai linezolidas

penicilinai ampicilinai, amoksicilinas su klavulano rūgštimi

fosfoninės rūgšties derivatai fosfomicinas

polimiksinai kolistinas

cefalosporinai (3, 4, 5 kartos) cefozidimas, ceftiofuras antituberkulioziniai vaistai bedakvilinas

chinolonai ciprofloksacinas

1.3.2. Bakterijų atsparumas antibiotikams veterinarinėje medicinoje

Atsparūs mikroorganizmai plinta tarp žmonių, gyvūnų ir aplinkos, suformuodami tam tikrus, ne visada iššifruojamus, plitimo kelius. Pastaruoju metu daugelis veterinarijos gydytojų susiduria su bakterijų atsparumo problema veterinarinėje medicinoje. Vienos iš dažniausiai problemas keliančių bakterijų yra atsparios E. coli, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., meticilinui atsparia Staphylococcus pseudintermedius. Meticilinui atspari Staphylococcus aureus labiau paplitusi žmonių, tačiau kelia didelį susirūpinimą ir veterinarinėje medicinoje. Atsparių bakterijų sukeltos infekcinės ligos dažnai asocijuojasi su sunkesne ligos gydimo eiga, išaugusiais gydymo kaštais, galimais šalutiniais padariniais, prastesne ligos prognoze ir baigtimi. Daugelis mikroorganizmų randami tiek žmonėse, tiek gyvūnuose, todėl tai kelia didelį susirūpinimą dėl galimų zoonotinių bakterijų plitimo (55).

2010 m. gyvūnams pasaulyje buvo sunaudota 63,151 (±1,560) tonų antibiotikų. Numanoma, kad iki 2030 m. šis kiekis padidės 67 proc. iki 105,596 (±3,605) tonų per metus dėl išaugusios produkcijos gyvūnų paklausos (56). Dažnai gyvūnų gydymui, profilaktikai ar dėl kitų priežasčių, naudojami antibiotikai yra panašios arba tokios pat cheminės struktūros kaip ir antibiotikai, naudojami žmonių medicinoje (57) (žr. 2 lent.). Antimikrobinės medžiagos, naudojamos produkcijos gyvūnų sveikatingumui bei produktyvumui gerinti, kelia didelį susirūpinimą dėl pavojaus gyvūnams ir žmonėms (36,57). Antibiotikai ir yra labai svarbi industrinės agrokultūros dalis, kuriai alternatyvų nėra daug, tačiau mažinti jų panaudą yra būtina, pasirenkant mažiau žalingas medžiagas (58). 2017 m. duomenimis, 31

17 Europos Sąjungos šalis iš viso sunaudojo 6 703,0 tonų antibiotikų, tuo tarpu Lietuvoje tais metais buvo sunaudota viso 11,7 tonų (59). Europoje naudoti antimikrobines medžiagas žemės ūkyje ar kaip augimo stimuliatorius yra uždrausta, tačiau išlieka daug šalių, kuriose antimikrobinių medžiagų panaudos tikslingumas yra abejotinas. 2017 m. Jungtinėse Amerikos Valstijose uždrausta naudoti antimikrobines medžiagas kaip augimo stimuliatorius produkcijos gyvūnams. Verta pastebėti, kad antibiotikai vis dar naudojami užkrečiamų ligų prevencijai, kai taikomos subterapinės vaistinės medžiagos koncentracijos (37,43,60,61).

2 lentelė. PSO (Pasaulinės sveikatos organizacijos) antimikrobinių vaistų kategorijos, jų svarbumas medicinoje ir keletas vaistų pavyzdžių, naudojamų veterinarinėje medicinoje (53)

Antibiotikų klasė Svarbumas žmonių medicinoje Naudojimo veterinarinėje medicinoje pavyzdys

aminoglikozidai kritiškai svarbūs gentamicinas, neomicinas

makrolidai ir linkozamidai kritiškai svarbūs eritromicinas, tilmikozinasa_,

linkomicinasa, tulatromicinasa, tilozinasa

β-lactamai kritiškai svarbūs penicilinas, ceftiofurasa,

amoksicilinas

fluorochinolonai kritiškai svarbūs ciprofloksacinas,

danofloksacinasa, enrofloksacinasa

tetraciklinai labai svarbūs chlortetraciklinas,

oksitetraciklinas, tetraciklinas

streptogramins labai svarbūs virginiamicinasa

fenikoliai labai svarbūs florfenikolisa

sulfonamidai labai svarbūs daugelis sulfonamidų

polimiksinai svarbūs kolistinas

a _{– naudojami išskirtinai tik veterinarinėje medicinoje.}

Elninių šeimos gyvūnams mikroorganizmų sukeltos infekcinės ligos taip pat būdingos ir pastebimos tiek laisvėje, tiek nelaisvėje gyvenančių gyvūnų populiacijose. Dažniausiai nustatomos šios infekcinės ligos: galvijų tuberkuliozė (Mycobacterium bovis, Mycobacterium caprae), paratuberkuliozė (Mycobacterium avium), nekrobaciliozė (Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium necrophorum funduliforme), bruceliozė (Brucella abortus), klostridiozė (Clostridium spp.), dermatofilozė (Dermatophilus congolensis), hipertrofinė osteopatija (Streptococcus, Staphylococcus, Fusobacterium spp.). Taip pat dažnos koinfekcijos, sukeltos Trueperella pyogenes, Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Esant galimybėms, elninių šeimos gyvūnai, užsikrėtę bakterinėmis infekcinėmis ligomis, gydomi antibiotikais (9).

18 1.3.3. Bakterijų atsparumas antibiotikams laukiniuose gyvūnuose

Pastaruosius keletą dešimtmečių didėja susirūpinimas antimikrobiniu komensialinių bakterijų atsparumu laukinių gyvūnų populiacijose. Šios bakterijos vyrauja žmonių, žemės ūkio gyvūnų, naminių gyvūnų bei laukinių gyvūnų natūralioje mikrofloroje. Biologiniai ypatumai ar žmonių veiklos, kurios didina žmonių sąlytį su laukiniais gyvūnais (ūkininkavimas, veterinarijos klinikos, sąvartynai, atviri vandens valymo įrenginiai, medžioklė ir kt.), padeda plisti laukinių gyvūnų natūralios mikrofloros bakterijoms ir patekti į žmonių populiaciją. Manoma, kad laukiniai gyvūnai gali būti antimikrobinėms medžiagoms atsparių bakterijų bei jų genetinės medžiagos rezervuaru. Nors laukiniai gyvūnai paprastai neturi tiesioginio kontakto su antimikrobinėmis medžiagomis, dėl savo fiziologinių ypatumų neretai jie gali patekti į gyvulininkystės ūkių teritorijas, misti agrokultūriniuose pasėliuose, kurie yra apdoroti trąšomis, herbicidais, pesticidais bei kitomis medžiagomis. Agrokultūriniai pasėliai neretai tręšiami organinėmis trąšomis (paukščių, galvijų, kiaulių mėšlu), kartu su šiomis trąšomis ant pasėlių ir į dirvą gali patekti įvairių preparatų (įskaitant antimikrobines medžiagas) likučių bei mikroorganizmų. Daug susirūpinimo kelia medžioklės proceso metu gauta gyvūnų mėsa, ji apdorojimo metu potencialiai gali turėti tiesioginį ar netiesioginį kontaktą su kitais maisto produktais, jei yra nesilaikoma bendrosios higienos reikalavimų (62-65).

1.3.3.1. Gram neigiamų bakterijų atsparumas antibiotikams laukiniuose gyvūnuose

Gram neigiamos bakterijos dėl savo savitos struktūros pasižymi didesniu atsparumu antimikrobinėms medžiagoms, sukeliamų infekcinių ligų sergamumu bei mirtingumu nei gram teigiamos bakterijos. Dėl šios priežasties jų atsparumo mechanizmai, plitimo keliai bei genetinių determinantų nustatymas yra ypač svarbu tiek veterinarinėje, tiek žmonių medicinoje (66).

Escherichia coli – tai gram neigiama bakterija, kuri natūraliai aptinkama šiltakraujų gyvūnų virškinimo trakte, kartu su natūraliais gyvūnų ekskrementais patenka į aplinką ir dažnai šių bakterijų kiekis vertinamas kaip aplinkos užterštumo rodiklis (67). E. coli dažniausiai jautri daugeliui antimikrobinių medžiagų, geba gerai akumuliuoti genus, koduojančius atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, perduodamus daugiausiai horizontaliu keliu (28). Laukinių gyvūnų virškinimo traktas yra rezervuaras antibiotikams atsparių genų (ypač ampicilinui, tetraciklinui, streptomicinui ir trimetoprimui - sulfametoksazolui) (33). Viena iš laukinių gyvūnų gram neigiamų bakterijų atsparumo priežasčių yra paukščių pernešamos ir su išmatomis skleidžiamos atsparios antimikrobinėms medžiagoms bakterijos. Taip užteršiami natūralūs vandens telkiniai, prie kurių prieigą turi ir kiti laukiniai gyvūnai (35).

19 2003–2004 m. Portugalijoje (duomenys rinkti skirtinguose nacionaliniuose parkuose) atlikto tyrimo metu nustatyta, kad iš 112 E. coli mėginių, išskirtų iš laukinių gyvūnų, didžiausias bakterijų atsparumas yra tetraciklinui, streptomicinui, ampicilinui (33). Tuo tarpu 2017 m. su Italijoje iš laukinių gyvūnų išskirtomis E. coli bakterijomis atlikto tyrimo metu nustatyta, kad E. coli labiausiai atspari pirmos kartos cefalosporinams ir ampicilinui. Didžioji dauguma mėginių paimti iš plėšrūnų, kurie dėl savo biologinių ypatumų maitinasi skirtingose aplinkose (1). 2005–2007 m. Čekijoje ir Slovakijoje atlikto tyrimo metu iš 42 elninių šeimos gyvūnų paimtų išmatų, 12 proc. mėginių buvo atsparūs antimikrobinėms medžiagoms (6). C. A. Alonso ir kt. 2013 m. atlikto tyrimo metu nustatytas iš smulkių laukinių gyvūnų išskirtų E. coli bakterijų 8,3 proc. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms, o iš laukinių tauriųjų elnių išskirtų E. coli mėginių 6,5 proc. atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (32). Lenkijoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, kad dauguma elninių šeimos gyvūnų bei šernų mėginių, iš kurių buvo išskirta E. coli, nebuvo atsparūs antimikrobinėms medžiagoms. Dviejuose mėginiuose užfiksuotas atsparumas kolistinui, tačiau genetiniais tyrimais nebuvo identifikuota genetinė medžiaga (30) (žr. 3 lent.).

Didėjanti naminių, laukinių gyvūnų ir žmonių sąveika didina tikimybę antibiotikams atspariems mikroorganizmams plisti tarp žmonių ir gyvūnų. Gram neigiamų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms yra didelis iššūkis šiuolaikinei medicinai ir veterinarijai, kadangi šios bakterijos geba greitai įgyti atsparumą įvairiems antimikrobiniams preparatams (66).

20 3 lentelė. Laukinių gyvūnų E. coli atsparumas antimikrobinėms medžiagoms skirtingose pasaulio šalyse proc. (1, 28, 29, 30, 32, 33, 34, 70)

1.3.3.2. Escherichia coli atsparumas kolistinui

Kolistinas – kritiškai svarbus, paskutinio pasirinkimo antibiotikas, naudojamas žmonių medicinoje ir veterinarijoje. Tai polimiksinų klasės antimikrobinė medžiaga, skirta gydyti gram neigiamų bakterijų sukeltas ligas. Kolistinas veterinarinėje medicinoje dažniausiai naudojamas gydyti Enterobacteriaceae spp. sukeliamas infekcijas. Ilgą laiką buvo manoma, kad šiam antibiotikui bakterijos neįgauna atsparumo, tačiau 2015 m. Kinijoje, iš kiaulių išskirtose E. coli bakterijose, nustatytas mcr-1 genas, kuris koduoja atsparumą kolistinui ir yra lokalizuotas plazmidėje, o kai kuriuose štamuose mcr genai yra lokalizuoti chromosomose. Toliau atliktų tyrimų metu buvo nustatyti 2, 3, 4, 5, mcr-6, mcr-7, mcr-8, mcr-9 genai, kurie lemia atsparumą šiai antimikrobinei medžiagai. Genetinė medžiaga buvo išskirta iš E. coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Salmonella spp., Citrobacter spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Kluyvera spp., Aeromonas spp., Providencia spp. ir Raulotella spp. bakterijų mėginių. Kadangi mcr genai aptinkami bakterijų plazmidėse, tai palengvina judriųjų genomo elementų plitimą horizontaliu keliu (65,68-71).

a _{- 24 skirtingos gyvūnų rūšys,} b _{– laukiniai elnių hibridai,} c _{– 9 skirtingos gyvūnų rūšys,} d _{– laukiniai taurieji elniai, stirnos, danieliai, stumbrai,} e _{– laukiniai taurieji}

21 E. coli bakterijose esantis mcr-1 genas išskirtas kiaulėse, galvijuose, paukščiuose ir iš jų gaunamuose produktuose, taip pat naminiuose bei laukiniuose gyvūnuose (69). Laukiniai paukščiai ir žinduoliai gyvūnai, ypač tie, kurie pasižymi migracija dideliu atstumu, yra potencialūs E. coli mcr-1 ir mcr-2 genų rezervuarai, nešiotojai ir platintojai (72).

Polimiksinų klasės antibiotikai naudojami kaip paskutinio pasirinkimo, kritiškai svarbios reikšmės medžiagos kovoje prieš dauginiu atsparumu pasižyminčias bakterijas žmonių medicinoje. Tačiau didėjantis bakterijų atsparumas šios klasės antibiotikui kolistinui bei mcr genų atradimas bakterijų plazmidėse kelia didelį susirūpinimą dėl galimo kolistino poveikio sumažėjimo gydant infekcines ligas (73).

1.3.3.3. Gram teigiamų bakterijų atsparumas antibiotikams laukiniuose gyvūnuose

Gram teigiamos bakterijos pasižymi dideliu atsparumu plačiai naudojamoms antimikrobinėms medžiagoms infekcinių ligų gydymui. Didžiausią susirūpinimą kelia meticilinui atspari Staphylococcus aureus (MASA), vankomicinui atspari Enterococcus faecium (VRE) ir antimikrobinėms medžiagoms atspari Streptococcus pneumoniae (74)

Staphylococcus – tai gram teigiama bakterija (kokas) 0,5–1,0 μm dydžio. Šios bakterijos skirstomos pagal gebėjimą koaguliuoti kraujo plazmą (koaguliazės reakcija). Koaguliazės reakcijai teigiamiems stafilokokams priklauso S. aureus, koaguliazės reakcijai neigiamiems stafilokokams priklauso virš 30 kitų tipų bakterijų. Tai komensialinė bakterija, kuri aptinkama kaip natūrali mikroflora gleivinėse, gerklėje, odos paviršiuje ne tik žmonėms, bet ir gyvūnams. Daugelis bakterijų štamų turi zoonotinį potencialą plisti tarp žmonių ir gyvūnų, įskaitant produkcijos gyvūnus, gyvūnus augintinius bei laukinius gyvūnus. Viena iš sunkiausiai kontroliuojamų zoonozinių bakterijų yra meticilinui atspari S. aureus (MASA) (75,76).

Porrero ir kt. 2014 m. Ispanijoje atlikto tyrimo metu išskirta MASA iš upės vandens mėginių, laukinių šernų ir danielių. Tyrimo metu identifikuoti šie MASA (iš laukinių gyvūnų ir upės vandens mėginių) genai, koduojantys atsparumą antimikrobinėms medžiagoms: mecC, blaZLGA251 (77). 2011 m.

Italijos Alpėse nušauta stirna, kurios eisena buvo apsunkinta, sutrikusi orientacija. Atlikti mikrobiologiniai, patomorfologiniai bei histologiniai tyrimai. Mikrobiologinio tyrimo metu išskirta Staphylococcus aureus bakterija, pasižyminti dauginiu atsparumu (atsparumas penicilinui, ampicilinui, amoksicilinui su klavulano rūgštimi, cefoksitinui, ceftiofurui, cefriaksonui, ciprofloksacinui, enrofloksacinui ir fluorochinolonams) (78). Ispanijoje (2009–2011 m.) atlikto tyrimo metu imti

22 mikrobiologiniai mėginiai iš sumedžiotų arba gyvagaudžiais spąstais sugautų gyvūnų šnervių arba odos mėginių. Iš tauriųjų elnių išskirtų S. aureus bakterijų nustatytas 19,29 proc. atsparumas benzilpenicilinui, 1,88 proc. atsparumas sulfametoksazolui ir 8,9 proc. streptomicinui (79). T. Hauschild ir kt. tyrimo metu iš smulkių laukinių žinduolių (graužikų) odos, kailio ir virškinamojo trakto mėginių išskirti penki Staphylococcus štamai, kurie demonstruoja atsparumą novobiocinui (80).

23

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1. Tyrimų eiga, vieta ir tyrimo objektai

Tyrimai buvo atlikti 2019–2020 m., Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Mėginiai (elninių šeimos gyvūnų išmatos) buvo surinkti Pasvalio rajono Joniškėlio apylinkių sen., Jurgėniškiuose, Levaniškio (koord. 56.036890, 24.267081) miške, Pasvalio apylinkių sen. Ustukiuose (koord. 56.084461, 24.379743), Pasvalio rajono, Pasvalio sen., Žadeikių (koord. 56.0086, 24.4543), Kėdainių rajono Krakių sen., Krakių (koord. 55.374327, 23.758556) miškuose, Pasvalio rajone, Kirdonių miške (koord. 56.182712, 24.585951). Privačiuose ūkiuose X (Pakruojo rajonas), Y (Pasvalio rajonas) (žr. 4 pav. ). Tyrimų planas ir eiga pateikti 5 paveiksle.

4 pav. Mėginių rinkimo žemėlapis (raudona spalva pažymėtos laukinių elninių šeimos gyvūnų mėginių rinkimo vietos, mėlyna spalva pažymėtos nelaisvėje laikomų laukinių elninių šeimos gyvūnų

mėginių rinkimo vietos)

2.2. Mėginių identifikavimas, rinkimas ir pristatymas į laboratoriją

Elninių šeimos gyvūnų išmatos – apvalūs, cilindro formos rutuliukai, kurių vienas galas yra įdubęs, o kitas galas nežymiai nusmailėjęs. Išmatų dydis ir kiekis priklauso nuo gyvūno dydžio: briedžio (Alces alces) išmatos yra 2–3,4 cm ilgio ir 1,5–1,8 cm pločio, tauriojo elnio (Cervus elaphus) 2–2,5 cm ilgio ir 1,3–1,8 cm pločio, danielių (Dama dama) 1–1,5 cm ilgio ir 0,8–1,2 cm pločio, europinės stirnos (Capreolus capreolus) 1–1,4 cm ilgio ir 0,7–1 cm pločio rutuliukai (81). Medžiaga rinkta vienkartinėmis pirštinėmis, mėginiai sudėti į skirtingus sterilius maišelius, taip pat rinkta vienkartiniais tamponėliais, kurie iš karto po medžiagos paėmimo patalpinti į transportinę terpę (TranswabR medium Amies MW170,

24 Jungtinė Karalystė), sunumeruoti ir pažymėta radimo vieta. Medžiaga pristatyta į laboratoriją tą pačią ar kitą dieną.

25

2.3. Tiriamosios medžiagos įsėjimas į mitybines terpes bakterijoms išskirti

Antroji tyrimo dalis yra Staphylococcus spp. ir E.coli padermių iš elninių šeimos žinduolių išmatų išskyrimas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Veterinarijos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Į laboratoriją pristatyta medžiaga tą pačią arba kitą dieną (praėjus ne daugiau nei 24 valandoms nuo mėginių paėmimo) buvo įsėjama į mitybines terpes.

2.3.1. Staphylococcus spp. sėjimas į mitybines terpes

Stafilokokams išskirti naudotas manitolio druskos agaras (Mannitol Salt Agar (Liofilchem, Italija)). Užsėtos Petri lėkštelės kultivuotos aerobinėmis sąlygomis, +37 °C temperatūros termostate 24-48 val. Praėjus numatytam kultivavimo laikui, užaugusios bakterijų kolonijos buvo įvertintos vizualiai (koaguliazei teigiami stafilokokai – S. aureus formuoja geltonas kolonijas, koaguliazei neigiami stafilokokai – S. epidermidis formuoja mažas raudonai violetinės spalvos kolonijas) (82). Taip pat tiriama išaugusių kultūrų morfologija mikroskopuojant Olympus BX53 mikroskopu, prieš tai pasiruošus tepinėlius, kurie nudažyti ir įvertinti Gramo dažymo būdu. Užaugus tipinėms bakterijų kultūroms, jos buvo gryninamos – bakterijos dar kartą sėjamos į manitolio druskos agarą ir kultivuotos aerobinėmis sąlygomis, +37 °C temperatūros termostate 24–48 val.

2.3.2. Escherichia coli sėjimas į mitybines terpes

E. coli išskirti naudotas MacConkey Agaras (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė). Užsėtos Petri lėkštelės kultivuotos aerobinėmis sąlygomis, +37 °C temperatūros termostate 24 val. Praėjus numatytam kultivavimo laikui, užaugusios bakterijų kolonijos buvo įvertintos vizualiai – E. coli vertinamos kaip raudonai rausvos spalvos kolonijos. Tipinės kolonijos gryninimo tikslais buvo persėtos į Tryptone Bile X-Gluc (TBX) (Liofilchem, Italija) agarą, kultivuotos aerobinėmis sąlygomis, +37 °C temperatūros termostate 24 val. E. coli vertinamos kaip mėlynai žalios spalvos kolonijos (83). Taip pat tipinės E. coli kolonijos sėjamos į SIM Medium terpę (Sulfide Indole Motility Medium, Oxoid, Jungtinė Karalystė). E. coli bakterijos SIM Medium terpėje yra judrios, į Kovačo reagentą reaguoja teigiamai – produkuoja indolą, neprodukuoja hidrogeno sulfido (84). Visos tipinės E. coli bakterijos SIM Medium terpėje produkavo indolą, neprodukavo hidrogeno sulfido ir buvo judrios.

2.4. Išskirtų bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas

Remiantis EUCAST (European Commitee in Antimicrobial Susceptibility Testing) ir CLSI (Clinical and Laboratory Standarts Institute) bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymo standartais,

26 buvo atlikti išskirtų bakterijų antimikrobinio jautrumo nustatymo tyrimai. Išgrynintos morfologiškai panašios bakterijos buvo paimamos sterilia kilpele ir įlašinamos į 0,9 proc. sterilaus fiziologinio tirpalo mėgintuvėlį, kai drumsto standartas lygus Mac Farland 0,5 standartui (nustatant makfarlandometru). Suspensija tamponu sėjama į Mueller Hinton agarą (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė) braukiant, tada švelniai spaudžiant, su skirstytuvu ir dezinfekuotu pincetu sudedami antibiotikų diskai. Paruoštos Petri lėkštelės kultivuotos aerobinėmis sąlygomis, +37 °C temperatūros termostate 24 val. (85). Praėjus reikiamam laikui, Petri lėkštelėse esančių antimikrobinių medžiagų diskų poveikis išskirtoms bakterijoms buvo vizualiai įvertinamas, nustatant jautrumo ribas, naudojant liniuotę, kai bakterijų neaugimo zona matuojama skersai.

Jautrumo duomenų interpretacija atlikta vertinant klinikinių lūžio taškų reikšmes pagal CLSI (JAV) ir EUCAST (ES) rekomendacijas. Antibiotikų atsparumui nustatyti naudoti antibiotikai, parinkti pagal jų svarbą ir panaudą veterinarinėje medicinoje bei žmonių medicinoje. E. coli naudotos antimikrobinės medžiagos: AMP10 (ampicilinas), CN10 (gentamicinas), CIP5 (ciprofloksacinas), FOX30 (cefoksitinas), TE30 (tetraciklinas), C30 (chloramfenikolis), IPM10 (imipenemas), CS10 (kolistinas). Stafilokokams naudotos antimikrobinės medžiagos: P10 (penicilinas), CIP5 (ciprofloksacinas), CN10 (gentamicinas), E15 (ertitromicinas), FOX30 (cefoksitinas), TE30 (tetraciklinas), C30 (chloramfenikolis) (žr. 4 ir 5 lent.). Gautų rezultatų interpretacija atlikta naudojantis EUCAST ir CLSI standartais, taip pat prancūzų mikrobiologų draugijos išleistomis rekomendacijomis ir vertinant kaip „jautri padermė“, „vidutiniškai jautri padermė“ ir „atspari padermė“ (86-88).

4 lentelė. E. coli tyrimams naudoti antibiotikai, jų koncentracijos diskuose ir atsparumo interpretacija (86-88)

Antibiotikas

Koncentracija

diske, μg Klinikinė vertė (EUCAST), sterili zona jautri, mm vidut. jautri, mm atspari, mm

ampicilinas 10 ≥14 - <14 gentamicinas 10 ≥17 16-14 <14 ciprofloksacinas 5 ≥25 24-22 <22 cefoksitinas 30 ≥19 - <19 tetraciklinas1 30 ≥15 14-12 ≤11 chloramfenikolis 30 ≥17 - <17 imipinemas 10 ≥22 - <17 kolistinas2 _{10 ≥2 - <2} kolistinas3 50 ≥18 18-17 <14

1 _{– CLSI standarto duomenimis,} 2 _{– vertinant pagal MIC koncentraciją mg/L,} 3 _{– Prancūzijos mikrobiologų asociacijos}

27 5 lentelė. Staphylococcus spp. tyrimams naudotos antimikrobinės medžiagos, jų koncentracijos diskuose ir atsparumo interpretacija (86)

Antibiotikai

Koncentracija diske, μg

Klinikinė vertė (EUCAST), sterili zona jautri, mm vidut. jautri, mm atspari, mm penicilinas 10 ≥26 - <26 ciprofloksacinas (S. aureus) 5 ≥50 - <21 ciprofloksacinas (koaguliazei neigiami Staphylococcus spp.) 5 ≥50 - <24 gentamicinas (S. aureus) 10 ≥18 - <18 gentamicinas (koaguliazei neigiami Staphylococcus spp.) 10 ≥22 - <22 eritromicinas 15 ≥21 - <18 cefoksitinas 30 ≥22 - <22 tetraciklinas 30 ≥22 - <19 chloramfenikolis 30 ≥18 - <18

2.5. Išskirtų bakterijų padermių paruošimas šaldymui

Atrinktos bakterijų padermės buvo ruošiamos molekuliniams tyrimams, keletas bakterijų kolonijų, augančių mitybinėje terpėje, buvo resuspenduojamos 400 μl dejonizuotu vandeniu. Gauta suspensija 5 minutes virinama vandens vonioje, tada atvėsinama kelias minutes laikant ant ledo. Atvėsinta suspensija centrifuguojama 10 000 rpm greičiu 10 minučių. 200 μl supernatanto nutraukiama ir laikomas šaldiklyje -18 ºC. Kitame etape keletas bakterijų kolonijų buvo patalpinamos į šaldymui skirtą mėgintuvėlį su Mueller Hinton Broth terpe (Thermo Fisher, Jungtinė Karalystė) ir užpilama gliceroliu, dedama į giliojo šaldymo šaldiklį (-80 °C).

2.6. Kolistinui atsparumą koduojančių genų nustatymas

Molekuliniai tyrimai buvo atliekami PGR (polimerazinė grandininė reakcija) metodu, norint nustatyti E. coli genus, koduojančius atsparumą kolistinui. Buvo ieškoma mcr-1 ir mcr-2 genų. Bakterijų DNR sintezė vykdoma 25-iais ciklais, kuriuos sudaro: DNR denatūracija (94 °C, 15 min), pradmenų prilipinimas (25X (94 °C 30 sek., + 58 °C 90 sek., + 72 °C 60 sek.), DNR sintezė (72 °C, 10 min)). Procesas vykdytas termocikleryje (BOECO, Vokietija) (89). DNR fragmentams gelyje frakcionuoti panaudotas elektroforezės aparatas, o jiems išryškinti naudojama gelių dokumentavimo sistema GelDoc. Oligonukleotidiniai pradmenys parinkti pagal mokslo publikacijose pateiktas pradmenų sekas mcr-1 ir mcr-2 genams tirti (žr. 6 lent.) DNR fragmentams gelyje frakcionuoti panaudotas elektroforezės

28 aparatas (Cleaver, Jungtinė Karalystė), kuriame, vykstant elektroforezės procesui, analizuojami PGR produktai 1,5 proc. agarozės gelyje. Atlikus elektroforezę, gauti PGR rezultatai vertinami analizuojant nuotraukas, padarytas ultravioletinės spinduliuotės aparatu ,,GelDoc” (Ultraviolet Products, Vokietija) (89,90).

6 lentelė. Tyrime naudotos E. coli mcr-1 ir mcr-2 specifinių pradmenų nukleotidų sekos, pradmens molekulinė masė (bp), lydymosi temperatūra (°C) ir literatūros šaltinis.

Pradmuo Seka (5’-3’) Pradmens ilgis (bp) ir t (°C) Genai Literatūra mcr-1-F CGGTCAGTCCGTTTGTTC 309, 58 mcr-1 (89) mcr-1-R CTTGGTCGGTCTGTAGGG mcr-2-F TGTTGCTTGTGCCGATTGGA 567, 58 mcr-2 mcr-2-R AGATGGTATTGTTGGTTGCTG

2.7. Tyrimo duomenų statistinis vertinimas

Gauti rezultatai apdorojami ir analizuojami Microsoft Excel programiniu paketu. Duomenys aprašyti naudojant Microsoft Word ir RefWorks programomis. Analizuojami duomenys pateikiami procentinėmis išraiškomis bei sveikaisiais skaičiais. Skirtumai įvertinti kaip reikšmingi (laikyti statistiškai patikimais arba priklausomais), jei p < 0,05, skaičiuojant t-testą ir Chi kvadrato suderinamumo kriterijų su Jeitso tolydumo pataisa.

29

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1. Staphylococcus spp. paplitimas elninių šeimos gyvūnų populiacijose

Tyrimo metu surinkta ir ištirta 100 laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų išmatų mėginių. Bandymo metu iš viso išskirta 16 Staphylococcus spp. padermių 16,0 proc., (p > 0,05), 84 mėginiuose Staphylococcus spp. bakterijos nebuvo išskirtos. Iš natūralioje aplinkoje gyvenančių elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. bakterijos buvo išskirtos 11-oje mėginių iš 69, 15,9 proc. (p < 0,05). Iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos žinduolių mėginių buvo išskirtos 5 Staphylococcus spp. padermės iš 31, 16,1 proc. (p > 0,05).

6 pav. Staphylococcus spp. paplitimas laukinių ir nelaisvėje auginamų elninių gyvūnų populiacijose (vnt.)

3.1.1. Laukinių elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Išskirtos iš laukinių elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. padermės 15,9 proc. (n = 11, p < 0,05) buvo tiriamos, norint nustatyti bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, duomenys pateikti 7 pav. Tirti mėginiai daugiausiai buvo atsparūs cefoksitinui, gentamicinui, penicilinui – 36,4 proc., eritromicinui ir ciprofloksacinui – 27,3 proc., o bakterijos buvo mažiausiai atsparios tetraciklinui – 18,2 proc. ir chloramfenikoliui – 9,1 proc.

30 7 pav. Staphylococcus spp. išskirtų iš laukinių elninių šeimos gyvūnų atsparumas

antimikrobinėms medžiagoms (proc.) (n = 11)

3.1.2. Nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Išskirtos iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. padermės 16,1 proc. (n = 5, p > 0,05) buvo tiriamos, norint nustatyti bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, duomenys pateikti 8 pav. Tirti mėginiai buvo atsparūs ciprofloksacinui – 60,0 proc. (n = 3) ir gentamicinui – 20,0 proc. (n = 1). 1 bakterijų štamas pasižymėjo atsparumu ciprofloksacinui ir gentamicinui. 2 bakterijų štamai buvo jautrūs visoms antimikrobinėms medžiagoms.

8 pav. Staphylococcus spp. išskirtų iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (proc.) (n = 5)

31 3.1.3. Staphylococcus spp. bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms

palyginimas tarp laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių gyvūnų

Vertinant bendrus, iš laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių šeimos žvėrių, Staphylococcus spp bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms rezultatus, buvo nustatyta, kad iš viso 9 mėginiai pasižymėjo atsparumu bent vienam ir daugiau tirtų antibiotikų, o 4-ios padermės pasižymėjo dauginiu atsparumu – buvo atsparios trims ir daugiau antimikrobinių medžiagų.

Iš natūralioje aplinkoje gyvenančių elninių šeimos gyvūnų Staphylococcus spp. bakterijos buvo išskirtos iš 11 mėginių 15,9 proc. (p < 0,05). Padermių, kurios buvo atsparios bent vienam ar daugiau tirtų antibiotikų, išskirta 6–8,7 proc. (p < 0,05), dauginiu atsparumu pasižymėjo 4-ios padermės 5,8 proc. (p < 0,05). 5-ios iš laukinių gyvūnų mėginių išskirtos Staphylococcus spp. padermės buvo jautrios visoms antimikrobinėms medžiagoms (žr. 9 pav.).

Iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos žinduolių mėginių išskirtos 5-ios Staphylococcus spp. padermės 16,1 proc. (p > 0,05). Bakterijų, kurios buvo atsparios bent vienam ar daugiau tirtų antibiotikų, buvo išskirta 3–9,7 proc. (p > 0,05), dauginiu atsparumu bakterijos nepasižymėjo. Iš 2-jų mėginių išskirti Staphylococcus spp. štamai buvo jautrūs visoms antimikrobinėms medžiagoms (žr. 9 pav.).

9 pav. Staphylococcus spp. bakterijų paplitimas elninių šeimos gyvūnų populiacijose (proc.)

Palyginus Staphylococcus spp. atsparumo duomenis tarp laisvėje ir nelaisvėje laikomų elninių žinduolių, atsparumas nustatytas atitinkamai gentamicinui (36,4 proc. ir 20 proc.) ir ciprofloksacinui (27,3 proc. ir 60 proc.). Kitoms antimikrobinėms medžiagoms nelaisvėje laikomiems elniniams

32 gyvūnams, atsparumas nenustatytas. Gauti duomenys buvo palyginti ir pateikiami 10 pav. Atlikus statistinę duomenų analizę, nustatyta, kad p > 0,05 – duomenys nėra statistiškai reikšmingi.

10 pav. Staphylococcus spp. bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukinių ir nelaisvėje auginamų elninių gyvūnų populiacijose

Atlikus mikrobiologinius Staphylococcus spp. bakterijų atsparumo tyrimus tam tikroms antimikrobinėms medžiagoms, laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų mėginiuose buvo nustatytas atsparumas skirtingam antibiotikų skaičiui. Duomenys pavaizduoti 11 pav. Nelaisvėje auginamų elninių šeimos žinduolių Staphylococcus spp. padermės dažniausiai buvo atsparios vienam antibiotikui – 66,7 proc., o dviem antibiotikų rūšims – 33,3 proc. Iš laukinių elninių šeimos gyvūnų išskirtos Staphylococcus spp. bakterijos dažniausiai buvo atsparios dviem ir trims antibiotikų rūšims – 33,3 proc. Penkioms ir šešioms antimikrobinėms medžiagoms buvo atsparios po 16,7 proc. bakterijų.

33

3.2. Escherichia coli bakterijų paplitimas elninių šeimos gyvūnų populiacijose

Ištyrus 100 iš elninių šeimos žinduolių surinktų išmatų mėginių, E. coli buvo viso išskirta 68 kartus (68,0 proc., p < 0,05). 32-uose mėginiuose E. coli bakterijos nebuvo išskirtos. Iš natūralioje aplinkoje gyvenančių elninių šeimos gyvūnų E. coli bakterijos buvo išskirtos 40-yje mėginių iš 69 (58 proc., p < 0,05). Iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos žinduolių mėginių buvo išskirtos 28-ios iš 31 (90,3 proc., p < 0,05) E. coli padermės.

12 av. E. coli. paplitimas laukinių ir nelaisvėje auginamų elninių gyvūnų populiacijose (vnt.)

3.2.1 Laukinių elninių šeimos gyvūnų Escherichia coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Iš laukinių elninių šeimos gyvūnų išskirtos E. coli padermės 58 proc. (n = 40, p < 0,05), tiriamos norint nustatyti bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms. Buvo išskirta 43,5 proc. (n = 30, p < 0,05) bakterijų štamų, kurie pasižymi atsparumu antimikrobinėms medžiagoms. Duomenys pavaizduoti 13 pav. E. coli didžiausiu atsparumu pasižymėjo gentamicinui – 47,5 proc., cefoksitinui ir ampicilinui – 32,5, ciprofloksacinui – 30,0 proc., chloramfenikoliui – 29,6 proc., tetraciklinui – 22,5 proc., imipenemui – 13,3 proc., o mažiausias atsparumas nustatytas kolistinui (CS) – 2,6 proc. (p > 0,05).

40 28

69 31

0 20 40 60 80

Laukiniai elniniai gyvūnai Nelaisvėje laikomi elniniai

gyvūnai

Vnt.

34 13 pav. E. coli bakterijų, išskirtų iš laukinių elninių šeimos gyvūnų, atsparumas antimikrobinėms

medžiagoms (proc.) (n = 30)

3.2.2 Nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų Escherichia coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms

Ištyrus 31 (p < 0,05) nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų mėginį, buvo išskirti 64,5 proc. (n = 20, p < 0,05) bakterijų štamų, kurie yra atsparūs antimikrobinėms medžiagoms. Duomenys pavaizduoti 14 pav. E. coli didžiausiu atsparumu pasižymėjo gentamicinui ir ampicilinui – 46,4 proc., ciprofloksacinui – 25,0 proc., cefoksitinui ir kolistinui – 17,9 proc., imipenemui – 14,3 proc., tetraciklinui ir chloramfenikoliui – 10,7 proc. (p > 0,05).

14 pav. E. coli bakterijų, išskirtų iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos gyvūnų, atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (proc.) (n = 20)

35 3.2.3 Escherichia coli bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms

palyginimas tarp laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių gyvūnų

Vertinant bendrus, tiek iš laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių šeimos žvėrių, E. coli bakterijų atsparumo antimikrobinėms medžiagoms rezultatus buvo nustatyta, kad 50 E. coli bakterijų iš 58 išskirtų mėginių buvo atsparios bent vienam ir daugiau tirtų antibiotikų, o 21 išskirta bakterija dauginiu atsparumu – buvo atsparios trims ir daugiau antimikrobinėms medžiagoms (p < 0,05).

Iš natūralioje aplinkoje gyvenančių elninių šeimos gyvūnų E. coli bakterijos buvo išskirtos 40 iš tirtų 69 mėginių (58 proc., p < 0,05). Padermių, kurios buvo atsparios bent vienam ar daugiau tirtų antibiotikų, buvo išskirta 30 (43,5 proc., p < 0,05), dauginiu atsparumu pasižymėjo 14 padermių (20,3 proc., p < 0,05). 10 iš laukinių gyvūnų mėginių, išskirtų E. coli bakterijų, buvo jautrios visoms antimikrobinėms medžiagoms (žr. 15 pav.).

Iš nelaisvėje laikomų elninių šeimos žinduolių mėginių buvo išskirtos 28 (90,3 proc., p < 0,05) E. coli padermės. Bakterijų, kurios buvo atsparios bent vienam ar daugiau tirtų antibiotikų, buvo išskirta 20 (64,5 proc., p < 0,05), dauginiu atsparumu pasižymėjo 7 (22,6 proc., p < 0,05) bakterijų štamai. Iš 8 mėginių išskirtos E. coli padermės buvo jautrios visoms antimikrobinėms medžiagoms (žr. 15 pav.).

15 pav. E. coli bakterijų paplitimas elninių šeimos gyvūnų populiacijose (proc.)

Tyrimo metu iš laukinių elninių šeimos gyvūnų išskirta 30 (43,5 proc.) E. coli mėginių, kurie pasižymėjo antimikrobiniu atsparumu ir 20 (64,5 proc.) E. coli bakterijų štamų iš nelaisvėje laikomų

36 elninių šeimos gyvūnų mėginių. Palyginus atsparumo duomenis tarp laisvėje ir nelaisvėje laikomų elninių žinduolių, atsparumas nustatytas atitinkamai gentamicinui (47,5 proc. ir 46,4 proc.), ampicilinui (32,5 proc. ir 46,4 proc.), ciprofloksacinui (30 proc. ir 25 proc.), cefoksitinui (32,5 proc. ir 17,9 proc.), tetraciklinui (22,5 proc. ir 10,7 proc.). chloramfenikoliui (29,6 proc. ir 10,7 proc.), imipenemui (13,3 proc. ir 14,3 proc.) ir kolistinui (2,6 proc. ir 17,9 proc.) (žr. 16 pav.).

Atlikus statistinę duomenų analizę nustatyta, kad p > 0,05 – duomenys statistiškai nėra reikšmingi.

16 pav. E. coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms laukinių ir nelaisvėje auginamų elninių gyvūnų populiacijose (proc.)

Atlikus mikrobiologinius E. coli bakterijų atsparumo tyrimus tam tikroms antimikrobinėms medžiagoms, laukinių ir nelaisvėje laikomų elninių gyvūnų mėginiuose buvo nustatytas atsparumas skirtingam antibiotikų skaičiui. Duomenys pavaizduoti 17 pav. Nelaisvėje auginamų elninių šeimos žinduolių E. coli padermės dažniausiai buvo atsparios dviem antibiotikams – 35 proc., vienam antibiotikui – 30 proc., keturiems antibiotikams – 15 proc., penkiems antibiotikams – 10 proc., o mažiausiai šešiems ir septyniems antibiotikams – 5 proc. Laukinių elninių šeimos gyvūnų E. coli padermės dažniausiai pasižymėjo atsparumu vienam antibiotikui – 33,3 proc., dviem ir trims antibiotikų rūšims – 20 proc., penkioms antibiotikų rūšims – 13,3 proc., keturioms ir šešioms antibiotikų rūšims – 6,7 proc.

37 17 pav. E. coli bakterijų atsparumas tam tikram antibiotikų skaičiui (proc.)

3.2.4 Kolistinui atsparumą koduojančių genų nustatymas tar p Escherichia coli, išskirtų iš elninių šeimos gyvūnų

E. coli štamai, kurie pasižymėjo atsparumu kolistinui ir išskirti iš laukinių (2,6 proc.), ir nelaisvėje laikomų (17,9 proc.) elninių šeimos gyvūnų, buvo tiriami molekuliniais metodais, norint nustatyti atsparumą kolistinui koduojančius mcr-1 ir mcr-2 genus. Tirtose E. coli padermėse mcr-1 ir mcr-2 genų nebuvo nustatyta.