LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Eglė Lebednikaitė
Bakterijų, išskirtų iš sergančių kalių reprodukcijos
organų, rūšinė sudėtis ir jų jautrumas antimikrobinėms
medžiagoms
Species composition of bacteria, isolated from reproductive
system of diseased bitches, and their antimicrobial
susceptibility
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBASDarbo vadovas: doc. dr. Modestas Ružauskas
2 DARBAS ATLIKTAS ANATOMIJOS IR FIZIOLOGIJOS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Bakterijų, išskirtų iš sergančių kalių reprodukcijos organų, rūšinė sudėtis ir jų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms“.
1. Yra atliktas mano paties (pačios).
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
2017-12-15 Eglė Lebednikaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
2017-12-15 Eglė Lebednikaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
2017-12-19 Modestas Ružauskas
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
2017-12-19 Judita Žymantienė
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1) Aleksandr Novoslavskij
2) Mindaugas Malakauskas
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SUTRUMPINIMAI ... 7 ĮVADAS ... 9 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 111.1. Kalių reprodukcinės sistemos ligos ... 11
1.1.1. Piometra ... 11
1.1.2. Endometritas/metritas... 13
1.1.3. Vaginitas... 14
1.2. Kalių reprodukcinės sistemos ligas sukeliančių bakterijų charakteristika ... 15
1.2.1. Enterobakterijų šeimos charakteristika ... 15
1.2.2. Stafilokokų bakterijų genties charakteristika ... 16
1.2.3. Enterokokų bei streptokokų genčių bakterijų charakteristika ... 18
1.2.4. Gemella rūšis ... 19
1.2.5. Bacillus genties bakterijos ... 20
1.3. Mikroorganizmų identifikavimo metodai ... 20
1.3.1. Dažymas Gramo būdu ... 20
1.3.2. KOH testas ... 21
1.3.3. Katalazės testas ... 21
1.3.4. Biocheminiai testai ... 21
1.3.5. Molekuliniai metodai bakterijoms identifikuoti ... 22
1.3.6. Amino rūgščių padauginimo testas arba polimerazinė grandininė reakcija ... 22
1.3.7. Sekoskaita... 23
1.4. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms ... 23
1.4.1. Antimikrobinio atsparumo tipai ... 23
1.4.2.Antimikrobinio atparumo mechanizmai... 25
1.5. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimo metodai ... 27
1.5.1 Antibiotikų diskų metodas pagal Kirby Bauer ... 27
1.5.2. Kiekybiniai metodai antimikrobinio atsparumo nustatymui ... 28
1.5.3. Molekuliniai metodai antimikrobiniam atsparumui nustatyti ... 29
4
2.1. Medžiaga tyrimams ir bakterijų iš kalių reprodukcinių organų išskyrimas ... 30
2.2. Bakterijų identifikacija ... 30
2.3. Bakterijų DNR išskyrimas molekuliniams tyrimams ... 31
2.4. Bakterijų identifikacija molekuliniais tyrimais ... 31
2.5. 16S rRNR sekosaita ... 31
2.6. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms nustatymas ... 32
3. TYRIMŲ REZULTATAI ... 34
3.1. Kalių lytinių organų mikrobiologinis tyrimas ... 34
3.2. Iš kalių lytinių organų išskirtų bakterijų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms ... 37
4. REZULTATŲ APIBENDRINIMAS ... 43
IŠVADOS ... 47
REKOMENDACIJOS ... 48
PADĖKA ... 49
5
SANTRAUKA
Bakterijų, išskirtų iš sergančių kalių reprodukcijos organų, rūšinė sudėtis ir jų jautrumas antimikrobinėms medžiagoms
Eglė Lebednikaitė Magistro baigiamasis darbas
Kalių lytinėje sistemoje yra bakterijų – oportunistinių mikroorganizmų, kurios reprodukcinėje sistemoje reziduoja visą šuns gyvenimą dažnai nesukeldamos jokių patologijų. Įvairaus pobūdžio traumos ir kiti, kartais nežinomi veiksniai, kurių metu oportunistinės bakterijos tampa patogeninėmis, gali sukelti lytinių organų uždegimines ligas, septicemiją (11). Šio darbo tikslas – išskirti bakterijas iš sergančių kalių reprodukcijos organų, jas identifikuoti ir nustatyti jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
Tyrimo metu buvo išskirtos bakterijos iš 24 lytinių organų ligomis sergančių kalių mėginių, paimtų iš gimdos ir makšties. Išskirta ir toliau tirta 81 bakterijų padermė.
Šio tyrimo metu, be gerai žinomų ir aprašytų mikroorganizmų, sukeliančių patelių lytinių organų uždegimus, tokių kaip stafilokokai, streptokokai, enterokokai ar enterobakterijos, aptiktos ir identifikuotos retai aprašomos bakterijos – Advantella spp., Psychrobacter spp., Weissella confusa, Jeotgalicoccus halophilus ir Brevundimonas bullata. Aptikti ir kiti, biocheminiais testais retai identifikuojami mikroorganizmai, siejami su šunimis, tokie kaip Streptococcus canis, Actinomyces canis bei Haemophilus haemoglobinophilus.
Iš tirtųjų padermių (n=81), 31 bakterijų padermė identifikuota biocheminių testų pagalba, o 50 padermių, dėl nepatikimos identifikacijos biocheminiais testais (ar nesant reikiamų testų rinkoje), identifikuotos genotipiškai, atliekant 16S rRNR sekoskaitą. Atlikus antibiotikogramą, nustatyta, kad tyrimo metu išskirtos bakterijos dažniausiai jautrios buvo gentamicinui (92,3 proc.), enrofloksacinui (86 proc.) bei cefoksitinui (84,6 proc.). Išskirtoms bakterijoms atsparumas dažniausiai pasireiškė trimetoprimo-sulfametoksazolio kombinacijai (30,6 proc.), tetraciklinui (27,2 proc.) ir chloramfenikoliui (24,7 proc.).
Raktažodžiai: šunys, sekoskaita, 16S rRNR, mikroorganizmai, reprodukcijos organai, antimikrobinės medžiagos.
6
SUMMARY
Species composition of bacteria, isolated from reproductive system of diseased bitches, and their antimicrobial susceptibility
Eglė Lebednikaitė Master‘s Thesis
Bitches have bacteria – opportunistic microorganisms which reside in reproductive system entire dog life, often without causing any diseases. Traumatic injuries and other, sometimes unknown causes, when opportunistic mikroorganisms become patogens, can cause inflammation of reproductive system or septicemia (11). The aim of this work was to isolate and identify bacteria associated with reproductive diseases of bitches and to explore their antimicrobial susceptibility.
During this study bacteria have been isolated from 24 samples from vagina and uterus of diseased bitches. 81 bacteria strains were isolated and studied further. In addition to well known and described microorganisms, that cause infections of reproductive system of bitches, such as Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. or Enterobacteriaceae, rare bacteria have been identified and described, such as Advantella spp., Psychrobacter spp., Weissella confusa, Jeotgalicoccus halophilus and Brevundimonas bullata. Other bacteria associated with dogs, such as Streptococcus canis, Actinomyces canis and Haemophilus haemoglobinophilus, and which are rarely detected by biochemical tests, have been identified too. Of the strains tested (n=81), 31 strains of bacteria have been identified by biochemical tests and other 50 have been identified genotypically using 16S rRNA sequence (due to absence of realiable biochemical tests in the market). The antibiogram has shown that isolated bacteria were susceptible to gentamicin (92,3 %), enrofloxacin (86 %) and cefoxytine (84,6 %). Isolated bacteria demonstrated resistance to the combination of trimethoprim-sulfamethoxazole (30,6 %), tetracycline (27,2 %), and chloramphenicol (24,7 %).
Key words: dogs, sequence, 16S rRNA, microorganisms, reproductive system, antimicrobial materials.
7
SUTRUMPINIMAI
16S rRNR – bakterijų šešiolikto subvieneto ribosominė ribonukleorūgštis Acetyl-CoA – acetilo kofermentas A
AMP – ampicilinas
ATP – adenozin 5' trifosfatas C – chloramfenikolis
CEH/P – cistinės endometriumo hiperplazijos-piometros kompleksas COX – ciklooksigenazės
CTX – cefotaksimas
dATP – deoksiadenozino 5'-trifosfatas dCTP – deoksicitidino 5'-trifosfatas dGTP – deoksiguanozino 5'-trifosfatas DNA – deoksiribonukleorūgštis dTTP – deoksitimidino 5'-trifosfatas E. coli – Escherichia coli
EnPEC – endometriumo patogeninė E. coli ENR – enrofloksacinas
ERY – eritromicinas
ESVAC – Europos veterinarijoje sunaudojamų antibiotikų stebėsena F – fimbrijų adhezinai
FOX – cefoksitinas GEN – gentamicinas
KNS – koaguliazei neigiami stafilokokai KSV – kolonijas sudarantys vienetai
MASP – meticilinui atsparus S. pseudintermedius MIB – minimali baktericidinė koncentracija MSK – minimali slopinanti koncentracija NAD+ – nikotinamido adenino dinukleotidas
8 NCBI – nacionalinis JAV biotechnologijos institutas
P – benzilpenicilinas
PGR – polimerazės grandininė reakcija
pH - vandenilio jonų (H+) koncentracijos tirpale matas, parodantis tirpalo rūgštingumą ar šarmingumą proc. – procentai
RNA – ribonukleorūgštis
SEPEC – enteropatogeninė E. coli S. fleurettii – Staphylococcus fleuretti S. lentus – Staphylococcus lentus spp. – rūšys
sp. – rūšis
S. sciuri – Stalphylococcus sciuri
S. stepanovicii – Staphylococcus stepanovicii S. vitulinus – Staphylococcus vitulinus SXT – sulfametoksazolis-trimetoprimas TET – tetraciklinas
TLR – Toll baltymo receptorius
UI – antimikrobinės medžiagos vienetai UPEC – šlapimo sistemos patogeninė E. coli µg – mikrogramai
9
ĮVADAS
Šiuolaikiniame pasaulyje vis aktualesnė problema yra patogeninių, antibiotikams atsparių bakterijų skaičiaus didėjimas bei jų plitimas nuo sergančių gyvūnų – žmonėms. Viena jautriausių grupių – gyvūnų augintinių laikytojai (1,2). Todėl tokių atsparių antibiotikams bakterijų nustatymas ir sekimas yra svarbus tiek žmonių, tiek veterinarinėje medicinoje (3,4,5,6). Bakterijų, pasižyminčių daugybiniu atsparumu, nustatoma vis daugiau – mikroorganizmai tampa atsparūs keliems skirtingiems antibiotikams (7). Antibiotikai, tai mažos molekulės, kurias gamina bakterijos arba mikroskopiniai grybai, tai medžiagos, kurios nužudo bakterijas, nesukeldamos jokios žalos gyvūnui ar žmogui, todėl naudojamos gydymui (8). Nekontroliuojamas antibiotikų vartojimas (žmonės) ir naudojimas (gyvūnai) laikomas svarbiausiu veiksniu, lemiančiu atsparių mikroorganizmų atsiradimą ir plitimą (9).
Infekcinės kilmės nevaisingumas, rimta problema šunų augintojams ir veisėjams. Bakterijų sukeltos reprodukcinės sistemos ligos dažnai ūmios, gali būti perduotos jaunikliams, paveikti jų sveikatą. Veterinarijos gydytojai ir veisėjai jau žino, kad tokios ligos, kaip vaginitas – makšties uždegimas, piometra, išsimetimai bei negyvų naujagimių atvedimas, tai bakterinės kilmės ligos (10).
Kalių lytinėje sistemoje yra bakterijų, oportunistinių mikroorganizmų, kurios reprodukcinėje sistemoje gyvena visą šuns gyvenimą ir ligos nesukelia. Įvairaus pobūdžio traumos, kurių metu oportunistinės bakterijos tampa patogeninėmis, gali sukelti lytinių organų uždegimines ligas, septicemiją (11).
Daugelis bakterijų, išskirtų iš nesergančių kalių lytinės sistemos, aptinkamos ir kalėse, kurioms pasireiškia įvairūs lytinės sistemos susirgimai. Dažniausiai išskiriamos bakterijos iš kalių lytinės sistemos yra šios: E. coli, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Pasteurella spp., Proteus spp., Bacillus spp., Corynebacterium spp., Pseudomonas spp., Micrococcus spp., Neisseria spp., Klebsiella spp. ir Moraxella spp. (12).
Įprastai kalių makšties priekinėje dalyje aerobinių bakterijų yra apie 60 proc., o užpakalinėje 90 proc. (13). Bakterijų kaita priklauso nuo imuninės sistemos, kurios kaitai turi įtakos hormoninė reguliacija lytinio ciklo metu (14). Didesnis skaičius bakterijų išskiriamas rujos metu, lyginant su poruju ir ramybės periodu lytinio ciklo metu (15). Taip pat lyginant sergančias ir nesergančias kales buvo patvirtinta, kad daugiau mikroorganizmų išskiriama iš kalių, kurios serga reprodukcinės sistemos ligomis (14).
„Klinikinės mikrobiologijos laboratorijos svarbiausias uždavinys išskirtom bakterijom nustatyti jautrumą antibiotikams. Išskirti tuos antibiotikus, kuriems bakterijos yra atsparios ir parinkti tinkamus gydymui.“ (16).
10 Darbo tikslas ir uždaviniai:
Šio darbo tikslas – išskirti bakterijas iš sergančių kalių reprodukcijos organų, jas identifikuoti ir nustatyti jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
Darbo uždaviniai:
1. Išskirti bakterijas iš sveikatos sutrikimus turinčių kalių reprodukcijos organų.
2. Nustatyti išskirtų bakterijų rūšinę sudėtį pritaikant optimalius identifikacijos metodus. 3. Nustatyti bakterijų jautrumą antimikrobinėms medžiagoms.
4. Išanalizuoti gautus tyrimo rezultatus, pateikti rekomendacijas veterinarijos gydytojams – praktikams.
11
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Kalių reprodukcinės sistemos ligos
Veisėjai dažnai išreiškia susirūpinimą dėl to, kad kalių nevaisingumas glaudžiai susijęs su makšties ir gimdos mikrobiota. Nepaisant racionalių antibiotikų naudojimo principų, veisėjai neretai prašo prieš kergimą daryti bakterijų kultūrų iš makšties nustatymą, bei atitinkamai paskirti antibiotikus (17). Gimdos ligos tiesiogiai susiję su ruja, ir yra pagrindinė mėsėdžių nevaisingumo priežastis (18). Kalių rujos metu bakterijos kyla lytiniuose takuose link gimdos, vėliau spontaniškai grįžta atgal (17). Hormoniniai pokyčiai atsiradę dėl ilgos proliferacijos fazės, išlikę kiaušidžių folikulai ar susiformavę cistos, taip pat bakterinės infekcijos, veikia gimdą, ir tai sukelia jos degeneraciją (18).
1.1.1. Piometra
Piometra – tai bakterinės infekcijos ir uždegimo sukelta sisteminė liga, kuomet gimdoje kaupiasi pūliai (19). Tai liga, susijusi su porujo faze, ja serga suaugusios lytiškai subrendusios kalės (20). Piometra klasifikuojama į uždaro bei atviro kaklelio piometrą. Uždaro kaklelio piometra yra pavojingesnė, jos metu būtina ankstyva diagnostika bei tinkamas gydymas, kad išvengti mirties atvejų dėl septicemijos ar toksemijos. Nepaisant šiuolaikinio gydymo, piometros atveju mirtingumas siekia 4 proc. (21).
Ši liga yra pavojinga gyvybei (19). Piometra serga vidutiniškai 19 proc. visų sveikų kalių iki 10 metų amžiaus (22). Gydant, mirtingumas dėl piometros yra retas – siekia 5 proc. visų atvejų. Dažniausiai mirties priežastis yra kita, gaištama dėl endotoksemijos ir šoko (23).
Piometra išsivysto ne dėl vienos priežasties, tai gali būti daugybės etiologinių faktorių kompleksas. Ją gali sukelti hormonai, veikiantys gimdą, bakterinė infekcija bei pačio organizmo gebėjimas kovoti su bakterine infekcija ir individualus jautrumas bakterijų toksinams bei uždegimo šalutiniams produktams (24).
Cistinės endometrinės hiperplazijos – piometros kompleksas (CEH/P), anksčiau endometrito – piometros kompleksas (EPC), yra viena svarbiausių ir dažniausiai pasireiškiančių kalių gimdos ligų (18).
Ryšys tarp piometros ir kalių gimdos ligos – cistinės endometriumo hiperplazijos – yra nustatytas kaip rujos pabaigoje galimas komensalinių bakterijų atsiradimas makštyje ir jų plitimas iš makšties į gimdą. Tai progresuojantis degeneracinis procesas gimdoje, kurio metu susidaro CEH ir sukeliama piometra kalėms. Susirgimą sukelia progesteronas ir, galbūt, estrogenai (25).
12 Progestreonas yra svarbus patogenezėje, nes jis sukelia spontanišką ligos pasireiškimą dėl to, kad veikia imunosupresiškai, stimuliuoja endometriumo liaukų sekreciją, kuri suteikia terpę bakterijų augimui, o užsidaręs gimdos kaklelis, esant piometrai ir cistinės endometriumo hiperplazijos kompleksui, slopina gimdos eksudato pasišalinimą (26,27). Nepaisant to, kad kalėms CEH dažniausiai pasireiškia prieš išsivystant piometrai, negalime tvirtinti, kad progresavus CEH tikrai išsivystys piometra (25).
Gimdos uždegimu kalės suserga pirmoje porujo pusėje, kai progesterono koncentracija yra aukščiausia, o estradiolio-17β pati mažiausia (28). Padidėjęs progesterono kiekis kraujyje rujos metu gali sąlygoti mažiau efektyvų nespecifinį imunitetą, taip pat sumažėja TLR gamyba rujos ir ankstyvo porujo metu, o gimdoje sudaromos sąlygos embriono implantacijai ir vystymuisi (29). Šių lytinio ciklo fazių metu padaugėja bakterijų, dažniausiai Escherichia coli (E. coli), ir taip padidėja bakterinės infekcijos tikimybė. Bakterija prilimpa prie endometriumo ir stimuliuoja imuninį atsaką. TLR2 ir TLR4 receptoriai yra sužadinami, jų padaugėja (30), taip stimuliuojama citokinų, ciklooksigenazės-2 (COX-2) ir prostaglandinų E2 ir F2α gamyba (29), sukeliama vietinė imuninė reakcija (31).
Esant piometrai dažniausiai iš gimdos išskiriamos bakterijos yra E. coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Pseudomonas spp. ir Proteus spp. Tokie pat mikroorganizmai išskiriami iš nesergančių kalių makšties (32,33).
Hormonų disbalansas yra pagrindinė CEH/P susidarymo priežastis, antrinė – bakterinė infekcija. 70–80 proc. atvejų esant šiam susirgimui yra išskirima E. coli, kartais stafilokokai, streptokokai ar Pseudomonas aeruginosa. Atsižvelginat į beta hemolizę kaip netiesioginį patogeniškumo rodiklį, beta hemolizinės E.coli padermės iš sergančių kalių buvo išskirtos dažniau lyginant su mėginiais iš sveikų kalių (34).
Dažniausiai (62–90 proc.) piometros atveju išskiriama bakterija yra Escherichia coli (35). Vadinasi, ji yra natūrali makšties mikrobiota, priešrujo ar tikrosios rujos metu nesunkiai patenkanti į gimdą (36). Įrodyta, jog Escherichia coli kamienai, išskirti iš kalių, sergančių piometra ir šlapimo takų uždegimu vienu metu, yra visiškai tapatūs (37). E. coli serotipai išskiriami piometros atveju yra 02, 04, 06, 075 ir 032 (35,38,39). Nustatyta, kad gimda yra pažeidžiama bakterijų, atkeliavusių iš makšties. Be to, E. coli, turi adhezinus, kurie proliferuoja ir sukelia infekciją gimdoje (40,41). E. coli adhezinai specifiškai prilimpa prie progesterono veikiamo gimdos endometriumo (25). Galima daryti išvadą, kad infekciją sukelia bakterijos, kurioms palankios sąlygos susidaro dėl per didelio sekrecinio skysčio kiekio, labai didelio kriptų ir cistų kiekio, sumažėjusios vietinio imuniteto reakcijos, dėl vietinės audinių degeneracijos (40,41). Progestreonas mažina šuns vietinį imuninetą, skatina endometriumo
13 liaukų sekreciją, mažina gimdos kaklelio judrumą. Buvo pavirtinta, kad progesteronas didina endometrimo receptorių kiekį ir taip E. coli gali lengviau prie jų prisitvirtinti, vyksta E. coli adhezija (18).
Iš makšties bei gimdos paimtos ir užaugintos kultūros turi būti interpretuojamos atsargiai, nes dauguma bakterijų yra normali mikrobiota lytiniuose takuose ir nesukelia ligos ar nevaisingumo. Kaip pagrindinė taisyklė, prieš paskiriant gydymą turėtų būti išaugusių kolonijų sąsaja su klinikiniais požymiais, tokiais kaip ypatingai dvokiančios nenormalios išskyros iš makšties, makšties gleivinės uždegimo požymiai, leukocitozė ir sisteminių ligų nustatymas (17).
Porujo metu gimda yra glebi, o padidėjęs liaukų sekrecinis aktyvumas yra gera terpė bakterijoms augti. Bakterijos gali pakilti lytiniais takais iš distalinės lytinių organų bei šlapimo organų dalies, arba, bet tai nutika rečiau, atkeliauti kraujotaka. Piometra gali būti su arba be pūlingomis ištakomis, tai priklauso nuo gimdos kaklelio būklės. Uždaro kaklelio piometra yra sunkesnis susirgimas, nes galimas ištakų nuotėkis per falopijaus vamzdį arba pačią gimdą, ir tuomet gali išsivystyti septinis peritonitas (42). Bakterijų augimą ir vystymąsi slopinančiai veikia plataus spektro ir specifiškai veikiančios antimikrobinės medžiagos. Literatūroje teigiama, kad laboratorinių tyrimų metu (in vitro) bei remiantis gydomąja patirtimi, geras pradinis pasirinkimas bakterinėms infekcijoms gydyti yra amoksicilinas, amoksicilinas su klavulano rūgštimi, cefalosporinai, sustiprinto poveikio sulfonamidai. Tačiau antibiotikai vis vien turi būti pasirenkami atsižvelgiant į užaugintą bakterijų kultūrą, jos identifikaciją ir antibiotikogramos rezultatus (25).
1.1.2. Endometritas/metritas
Endometritas, tai endometriumo uždegimas dėl reakcijos į sėklinį skystį (spermą) ar nevaikingoms kalėms dėl bakterinės infekcijos (43). Endometritas yra rimta problema ir kartais pasireiškia dėl distokijų, nesterilios akušerinės pagalbos, užsilaikius vaisiams gimdoje ar dėl nepasišalinusios placentos (17).
Metritas – visų gimdos sluoksnių uždegimas. Tai sunkesnė ir labiau pažengusi endometrito forma (43). Metritas gali tapti lėtine liga ir sukelti nevaisingumą. E. coli yra dažniausiai pasitaikanti bakterija ligos etiologijoje tiek jaunoms, tiek senesnėms kalėms. Bakterijos pakyla lytiniais takais iš išorinės, apatinės lytinės bei šlapimo sistemos, ir tai dažnesnė priežastis nei bakterijų patekimas kraujotaka (17).
Skiriamas gydymas plataus spektro baktericiniais antibiotikais (veiksmingas amoksicilinas – tikarcilinas ar cefazolinas), svarbu žinoti, ar antimikrobinę medžiagą leidžiama naudoti žindančiai patelei ir galimą poveikį naujagimiui. Pagalbinis gydymas, tai intraveniniai skysčiai ir elektrolitai, o norint išvalyti gimdą 3 ar 5 dienoms skiriamas konservatyvus gydymas naudojant sintetinius arba
14 natūralius prostaglandinus. Ovariohisterektomija gali būti pasirinktas kaip tinkamas gydymas, jei šuns būklė leidžia ir konservatyvus gydymas nepadeda. Nesunkiems metrito atvejams, kai šuo ėda, gali būti skiriami antibiotikai, kuriuos galima sušerti, taip pat būtina gera priežiūra namuose (17).
1.1.3. Vaginitas
Vaginitas yra reta suaugusių kalių liga. Kad ir kaip bebūtų, žinios apie šią liga yra svarbios, nes negydomos reprodukcinės sistemos ligos gali sukelti sunkius gimdos susirgimus, kuomet kalė lieka nevaisinga (44). Vaginitas, dažna antrinės kilmės infekcija, kai normali makšties mikrobiota pakinta dėl pagrindinių ligų, tokių kaip herpesvirusas, šlapimo sistemos infekcijos, svetimkūniai, makšties anomalijos, taip pat dėl nuolatinių išskyrų iš makšties ar šlapimo nelaikymo (17). Vaginitas gan dažna liga nesubrendusioms kalėms. Tai juvenilinis vaginitas, pasireiškiantis po gydymo antibiotikais, kuris dažniausiai išnyksta po pirmos rujos (45). Iš nesubrendusių patelių dažniau išskiriami koaguliazei teigiami stafilokokai (46).
Bakterinis vaginitas dažniausiai pasireiškia kaip antrinė infekcija, sukelta hormonų disbalanso kraujyje, taip pat dėl nepakankamos mitybos, netinkamo antibiotikų vartojimo ar nesilaikant higienos. Tai sąlygos, kurios skatina bakterijas plisti. Bakterinis vaginitas, tai infekcija, kurią sukelia enterobakterijų šeima ar tam tikri mikroorganizmai iš žemesnės šlapimo ir lytinės sistemos, tai Staphylococcus spp, Streptococcus spp, Proteus mirabilis ir Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus, Escherichia coli ir Pasteurella haemolytica (47). Klebsiella spp., Shigella spp. ir Citrobacter spp. pasitaiko rečiau (48). Hashimoto ir kt. (2002) išskyrė šias bakterijas esant vaginitui: koaguliazei teigiamus Staphylococcus spp. (27,28 proc.), Proteus spp. (18,18 proc.), Streptococcus spp. (18,18 proc.), koaguliazei neigiamus Staphylococcus spp. (9,09 proc.), E. coli (9,09 proc.) ir koaguliazei teigiamus Staphylococcus spp. kartu su Streptococcus spp. (18,18 proc.). Pasteurella spp., Pseudomonas spp., Mycoplasma spp. ir Chlamydophila spp. taip pat esant šiam susirgimui dažnai aptinkamos bakterijos (49).
Plataus spektro antibiotikai, veikiantys E. coli, tokie kaip sulfametoksazolis/trimetoprimas ar amoksicilino-klavulano rūgšties derinys yra tinkami empiriniam gydymui, kol laukiama antibiotikogramos atsakymo dėl nežinomos kultūros. Sulfametoksazolis/trimetoprimas ir kvinolonų grupės antibiotikai yra efektyvūs prieš E. coli, bet ne tokie efektyvūs gydant infekcijas, sukeltas anaerobinių bakterijų (17).
15 1 lentelė. Dažniausiai išskiriamos bakterijos iš makšties, kai kalė yra kliniškai sveika ir sergant
vaginitu. Bakterijų padermių sąrašai yra pateikti pagal pasireiškimo dažnį (50) Aerobinės bakterijos išskiriamos iš kliniškai
sveikų kalių makšties Aerobinės bakterijos išskiriamos iš makšties sergant vaginitu
E. coli E. coli
Streptococcus canis Streptococcus canis
Pasteurella multocida Streptococcus intermedius Staphylococcus aureus Beta hemoliziniai streptokokai
Streptococcus spp. Staphylococcus aureus
Beta hemoliziniai sterptokokai Pasteurella multocida Alfa hemoliziniai streptokokai Proteus mirabilis Bacillus spp.
Proteus mirabilis
Staphylococcus intermedius Staphylococcus spp.
Šaltinis: Root Kustritz MV. Theriogenology. 2006.
1.2. Kalių reprodukcinės sistemos ligas sukeliančių bakterijų charakteristika
Vienintelis požymis, kuris jungia visus mikroorganizmus, yra jų mikroskopiniai dydžiai. Tačiau jie skiriasi genomo sandara, organizacijos lygiu, savo baltymų sintezės sistemomis ir jų sudėtimi bei ląstelių sienelės struktūra. Tradiciškai laikoma, kad išoriškai visų prokarijotų ląstelės labai panašios. Todėl labai dažnai paprastumo dėlei, ypač medicinos mikrobiologijoje, prokariotiniai mikroorganizmai vadinami bakterijomis – taip vadinama visa Procaryota karalystė (Eubacteria, Archebacteria) (51).1.2.1. Enterobakterijų šeimos charakteristika
Enterobakterijų (Enterobacteriaceae) šeimai priklauso 40 genčių ir daugiau nei 180 žinomų rūšių. Rūšys ir šeimos išsiskiria biocheminėmis savybėmis ir tai patogus būdas atskirti rūšis mikrobiologiškai. Terminai koliforminis – koliforminė bakterija, neturi reikšmės bakterijų taksonomijoje, bet priskirimi toms enterobakterijų šeimos bakterijoms, kurios skaldo laktozę, pvz.: Escherichia coli, Klebsiella ir Enterobacter rūšys (52). Mažiau nei pusė šeimos bakterijų turi veterinarinę reikšmę (53).
Enterobakterijų šeima – gram-neigiamos, lazdelės formos (53), vidutinio dydžio (0,4–0,6 x 2–3 µm) bakterijos (52). Kai kurios gali atrodyti kaip kokobacilų struktūros ar būti kiek ilgesnės formos. Kvėpavimo tipas – fakultatyvūs anaerobai. Enterobakterijos negamina oksidazės fermento. Tai svarbi savybė, pagal kurią galima atskirti šios šeimos bakterijas, nuo kitų gram-neigiamų, oksidazei-teigiamų bakterijų (52). Fermentuoja gliukozę ir daugybę kitų angliavandenių, yra oksidazei neigiamos,
16 katalazei teigiamos bakterijos. Redukuoja nitratus į nitritus, kai kurios rūšys, ypač E. coli fermentuoja laktozę. Judrios šeimos bakterijos turi peritrichinius žiuželius (53).
Enterobakterijos gali būti grupuojamos į tris kategorijas: patogeninės, oportunistiniai patogenai ir nepatogeninės bakterijos. Oportunistiniai patogenai sukelia ligas kitose organizmo vietose nei virškinamasis traktas. E. coli patogeninė bakterija gali sukelti ir lokalizuotą – enteritinę arba sisteminę organizmo ne virškinamojo trakto infekciją (53). Ne virškinamojo trakto infekcija, tai tokios E. coli padermės, kurios sukelia septicemiją (SEPEC), šlapimo sistemos infekcijas E. coli (UPEC). EnPEC – E. coli padermė pažeidžianti gimdą. Tai endometriumo patogenas (54).
Visos gram-neigiamos bakterijos, taip pat ir Enterobacteriaceae šeima, turi lipopolisacharidus išorinėje bakterijos sienelės membranoje. Lipopolisacharidai yra stiprūs endotoksinai, pagrindinis lipidas A. Bakterija žūsta, suyra ir tuomet endotoksinas yra paleidžiamas. Kitos, pavojingesnės šios šeimos bakterijos, turi adhezinus, kurie tvirtinasi prie šeimininko ląstelių; kapsules, kurios turi antifagocitinių savybių; sideroforus, kurie dar labiau sutvirtina ląstelę su bakterija, o tada egzotoksinai, kuriems priskiriami enterotoksinai ir citotoksinai, gali veikti (52).
Dažniausiai sutinkama bakterija šunims, kalėms yra E. coli (55). Dauguma padermių yra šlapimo sistemos patogenai ir pasižymi tam tikrais virulentiškumo faktoriais. Įskaitant P fimbrijas, α hemolizinus ir citotoksinį nekrozės faktorių 1, kuris didina bakterijos patogeniškumą kalių reprodukcinei sistemai, sukeldamas progesterono įtakoje susiformavusį endometriumą (56).
Fimbrijų adhezinai, kuriuos turi dauguma E. coli padermių, tvirtinasi prie mukozinio sluoksnio. Dauguma adhezinų jau yra identifikuoti. Svarbiausi ir stipriausiai veikantys yra K88 (F4), K99 (F5), 987P (F6), F18 ir F41. Anksčiau buvo naudojama K raidė. Kartais dar naudojama P raidė, nes fimbijos gali būti žinomos kaip pili-žiuželis (53).
Atsparios antibiotikams enterobakterijų rūšys – zoonoziniai mikroorganizmai – per maisto grandinę gali būti pernešami į žmonių organizmą ir sukelti sunkiai gydomas infekcijas (57).
1.2.2. Stafilokokų bakterijų genties charakteristika
Taksonomiškai Staphylococcus gentis priklauso Staphylococcaceae bakterijų šeimai, kuriai priklauso ir 5 žemesnės giminės bakterijos: Gemella spp., Jeotgalicoccus spp., Nosocomiicoccus spp. ir Salinicoccus spp. (58). Šiuo metu yra išskiriamos 47 stafilokokų rūšys ir 23 porūšiai, iš kurių daugelis yra randami tik žemesniuosiuose žinduoliuose (59).
Stafilokokai, tai gram-teigiami kokai, kurių diametras yra 0,8 iki 1 µm. Randami sukibę poromis, tetradomis, tačiau dažniausiai grupėmis arba vynuogių kekėmis (52). Kolonijos matinės, gali būti baltos arba kreminės, retkarčiais geltonos ar oranžinės spalvos (58). Nejudrios, negamina sporų.
17 Kvėpavimo tipas - fakultatyvūs anaerobai. Katalazei teigiami, oksidazei neigiami. Auga ant maitinamųjų ir kraujo agarų. Neauga ant McConkey agaro. Kapsulės negamina arba ji labai neryški (52). Optimali stafilokokų augimo temperatūra yra 30–37 °C. Kai kurios šių bakterijų rūšys taip pat gali vykdyti fermentaciją (9).
Jų sienelė sudaryta iš itin storo peptidoglikanų sluoksnio, sienelės teicho ir lipoteicho rūgščių bei baltymų esančių plazminėje membranoje. Šie baltymai gali būti išsidėstę ne tik plazminėje membranoje, bet ir peptidoglikano sluoksnyje ar prisijungę prie teicho rūgščių (60).
Klinikiniuose mėginiuose Staphylococcus rūšys turi būti diferencijuojamos nuo Streptococcus ir Micrococcus rūšių (53). Stafilokokai yra katalazei teigiami, oksidazei neigiami (52). Stafilokokai dažniausiai gamina katalazę, bet negamina citochromoksidazės fermento, išskyrus S. sciuri bakterijų grupę, į kurią įeina S. sciuri, S. lentus, S. vitulinus. Šia savybe stafilokokai skiriasi nuo katalazės negaminanačių streptokokų (58). Taip pat šios genties bakterijos skirstomos į koaguliazę išskiriančias ir jos neiškiriančias rūšis ar porūšius (53).
Koaguliazei neigiami stafilokokai yra mažo virulentiškumo, kurie tik retkarčiais sukelia ligas gyvūnams ar žmonėms (53). Šiuo metu žinomos 38 KNS rūšys, iš kurių dauguma yra neigiamos termostabiliai nukleazei (58). Ilgai buvo manoma, kad pastarosios bakterijos nėra patogeniškos, tačiau, pradėjus dažniau naudoti intravenines priemones bei padažnėjus su imuninės sistemos sutrikimais susijusių ligų atvejams, paaiškėjo, kad KNS yra vieni dažniausių ligoninėje kilusių kraujotakos infekcijų sukelėjų (58).
Nors dauguma koaguliazei teigimų stafilokokų yra pripažinti kaip vieni rimčiausių patogenų sukeliančių infekcijas, nereikėtų pamiršti ir koaguliazei neigiamų stafilokokų (KNS) keliamo pavojaus. Be to, visos stafilokokų rūšys, nepaisant koaguliazės reakcijos skirstymo gali būti atsparūs daugybei antibiotikų klasių. Antibiotikų, kurie naudojamų tiek gyvūnų, tiek žmonių medicinoje (61).
Apie 80–90 % koaguliazei neigiamų stafilokokų kultūrų, siejamų su ligas sukeliančiais patogenais, žmonių medicinoje yra meticilinui atsparūs, koaguliazei neigiami stafilokokai (62). Stafilokokai, atsparūs meticilinui ir kitiems antibiotikams, dažnai sukelia infekcijas ir gyvūnams augintiniams (63). KNS yra žinomi kaip normali gyvūnų augintinių gleivinių ir odos mikrobiota, galinti tapti atspari daugybei įvairių antibiotikų (64). Visgi, jų patogeniškumas ir galimybė perduoti atsparumo genus koaguliazei teigiamiems stafilokokams nėra nuodugniai ištirta (65).
Staphylococcus sciuri yra priskiriama koaguliazei neigiamoms ir novobiocinui atsparioms bakterijoms. Šią grupę sudaro S. sciuri (su trimis porūšiais), S. lentus, S. vitulinus, S. fleurettii ir S.
18 stepanovicii, kurios visuotinai pripažintos kaip komensalai. S. sciuri gali sukelti infekcijas tiek gyvūnams. tiek žmonėms (66).
S. pseudintermedius kolonijos yra dažniausiai hemolizinės. Koaguliazei ir oksidazei teigiamos. Katalazės ir oksidazės testai gali būti vertinami teigiamai, kai koaguliuja po keturių valandų inkubacijos 35ºC temperatūroje. β-galaktozidazės testas, trehalozės, ksilozės fermentacija gali būti naudojama siekiant atsikirti gentį nuo streptokokų. Jei pigmentacija nepastebima, tai hemoliziniai stafilokokai. Jie gamina α ir β hemolizinus, todėl išryškėja dviguba hemolizė. Alfa hemolizinas sudaro ryškią hemolizę, o β – ne tokia ryški platesnė hemolizės zona. Hemolizės sudarymas tarp koaguliazei neigiamų stafilokokų yra skirtingas, kartais gali būti sunkiai pastebimas (52).
Atsparumas β laktaminiams antibiotikams pastebimas dėl plazmidės koduotos penicilazės. Tolerancija yra retesnė penicilino atsparumo forma ir yra manoma, kad tai dėl susilpnėjusių autolizinių ląstelės sienelės fermentų. Atsparumas kitiems antibiotikams dažnas tarp Staphylococcus genties (52).
Prieš maždaug dešimtmetį visame pasaulyje pasirodė pranešimai apie smulkiuose gyvūnuose pradėtą aptikti meticilinui atsparų S. pseudintermedius (MASP), kuris, dėl savo daugybinio atsparumo vaistams, kelia didelę grėsmę gyvūnų sveikatai. Europoje esanti epideminė šio mikroorganizmo atmaina iš esmės yra atspari visiems antimikrobiniams vaistams, naudojamiems smulkių gyvūnų veterinarinėje praktikoje (67).
1.2.3. Enterokokų bei streptokokų genčių bakterijų charakteristika
1903 metais Enterococcus genties pavadinimas pasiūlytas tik Streptococcus faecalis ir Streptococcus faecium bakterijoms. 1984 metais buvau priskirta daugiau bakterijų į šią gentį (68, 69). Šiuo metu enterokokų gentčiai priklauso 48 bakterijos (70).
Streptokokai ir enterokokai yra gram-teigiami kokai. Randami pavieniai, poromis, arba skirtingų ilgių grandinėlėmis. Kiekvienas kokas yra mažesnis nei 2 µm diametro ir gali būti sferinis arba kiaušinio formos. Tai fakultatyvūs anaerobai, katalazei ir oksidazei neigiami. Nejudrūs, bet yra išmitis, kai kurioms enterokokų pademėms (52). Streptokokai lepūs, reikalingas kraujas arba serumas, tam, kad jie augtų terpėje. Enterokokai toleruoja druskas, esančias McConkey agare, ir atrodo kaip mažų taškelių kolonijos. Griežti anaerobiniai streptokokai priskirti Peptoniphilus genčiai (52).
Fermentuoja angliavandenius, pagrindinis metabolitas – pieno rūgštis. Streptokokai gamina fermentą leucino aminopeptidazę (LAP), anksčiau – leucino arilamidas (70).
Ant kraujo agaro streptokokai hemolizuoja. Hemolizė gali būti įvairaus stiprumo. Hemolizė gali būti kaip ankstyvas rodiklis atpažįstant kultūrą. Hemolizė ir Lancefield klasifikacija svarbūs streptokokų identifikacijoje (70).
19 Hemoliziniai streptokokai gali sukurti įvairią hemolizę. Pagrindiniai hemolizės tipai: (52)
α-hemolizė – dalinė eritrocitų žūtis aplink koloniją dėl kurios raudona spalva kinta;
β-hemolizė – visiška eritrocitų žūtis, tai pilna hemolizė aplink koloniją, dėl kurios išnyksta, praskaidrėja raudona kraujo agaro spalva;
Nehemolizuojantys (ankčiau vadinama γ-hemolizė) – spalva nekinta (70).
α-svarbiausioji (α) arba “plačios zonos” α-hemolizė - nedidelė nepažeistų eritrocitų zona yra kartu su kolonija, kuri turi visiškos hemolizės zoną ir ši supa nepažeistus eritrocitus. Ši hemolizė gali būti supainiota su β-hemolize (70).
β-hemoliziniai streptokokai toliau yra skirstomi į Lancefield serogrupes, pagal tai koks angliavandenis sudaro bakterijos sienelę (71). Yra 20 Lancefield serotipų, žymimų nuo A iki V raidės, (įskaitant I ir J raides) (70).
Streptococcus canis (Lancefield grupė G ) (72). Mikroskopiškai ši rūšis yra gram-teigiami kokai, išsidėstę grandinėlėmis. Didelės kolonijos Lancefield grupių C ir G (≥0,5mm) sudaro panašias kolonijas kaip A grupės streptokokai (73).
C ir G grupių streptokokai neauga ant terpių, kurių sudėtyje yra tulžies rūgšties (70).
Enterococcus gentis turi Lancfield grupės D antigeną (70), nors nors kai kurios padermės gali reaguoti su Lancefield grupės D ir G antiserumais. Enterococcus cassiflavus ir Enterococcus gallinarum rūšys yra judrios. Dauguma enterokokų rūšių katalazei neigiamos bakterijos, bet kai kurios padermės gamina pseudokatalazę (74).
Streptokokų atsparumas antibiotikams labai priklauso nuo rūšies ir geografinės vietos (52). E. faecalis labai retai atsparios ampicilinui (75). Visgi, atsparūs vankomicinui ar glikopeptidams enterokokai tampa vis dažniau sutinkami, ir yra manoma, kad šis plitimas atsiranda dėl transpozonų bei plazmidžių, keliaujančių tarp bakterijų rūšių (76).
Yra du glikopeptidams atsparių enterokokų tipai, tai tokie enterokokai, kuriems atsparumas yra įgimtas, o kitiems jis įgytas. Įgytu atsparumu pasižymi Enterococcus faecium ir Enterococcus faecalis. (70) Tiek Enterococcus faecium, tiek Enterococcus faecalis abu pasižymi dideliu atsparumu (30–50 proc.) prieš aminoglikozidus – gentamiciną ir streptomiciną (77). Enterococcus faecium labai dažnai pasižymi atsparumu β laktaminiams antibiotikams, tačiau gydyti dar sunkiau, kuomet bakterija tampa atpari vankomicinui. Tai daugiau būdinga Enterococcus faecium nei Enterococcus faecalis (78).
1.2.4. Gemella rūšis
Gemella rūšis yra katalazei neigiami kokai. Pagal Gramą dažosi įvairiai. Kvėpavimo tipas – fakultatyvus anaerobas. Kokai gali būti matomi poromis, tetradomis, grupėmis ar kekėmis, kartais
20 trumpomis grandinėlėmis. Kai kurios rūšys pripažintos kaip gram-neigiamos (70). Reikėtų nepamiršti, kad kai kurios padermės pirminiam išskyrimui reikalauja augimui griežtų anaerobinių sąlygų, ir tampa aerotolerantiškos po perkėlimo į laboratorinę terpę (79). Ši rūšis, auginama ant kraujo agaro, gali sudaryti α-hemolizę arba nehemolizuoti bei priminti „viridans“ streptokokų kolonijas. Kolonijos mažos, spalva įvairi, nuo pilkos iki bespalvės (70). Kartais, identifikuojant komerciniais identifikavimo testais, „viridans“ streptokokai gali būti sumaišyti su Gemella rūšimi. Galima atskirti tik pagal ląstelių išsidėstymą bei „viridans“ streptokokų augimui reiklingą piridoksiną (79).
1.2.5. Bacillus genties bakterijos
Bacillus genties bakterijos yra didelės, gram-teigiamos (senosios kultūros nusidažo lengvai), gaminančios sporas lazdelės. Kvėpavimo tipas – aerobai. Katalazei teigiamos, dauguma fermentuoja angliavandenius, yra judrios. Nustatyta daugiau nei 40 šios genties rūšių. Žinoma, kad šios bakterijos gali sukelti oportunistines infekcijas, ypač pavojingas silpnesniems individams. Tai gali būti ir zoonozinės bakterijos (80).
1.3. Mikroorganizmų identifikavimo metodai
Infekcinių ligų mikrobiologinė diagnostika yra labai svarbi tinkamam ligonių gydymui, epidemiologinei kontrolei bei užkrečiamųjų ligų valdymui. Mikrobiologinei infekcinių ligų diagnostikai taikomi tyrimo metodai: mikroskopinis, bakteriologinis, biologinis. Be to, naudojami netiesioginiai metodai: serologinis, alergologinis ir kt. (51).
1.3.1. Dažymas Gramo būdu
Pats pavadinimas „Gram“ yra kilęs iš šio metodo sukūrėjo Hanso Kristijano Gramo (angl. Hans Christian Gram) vardo. Dažymas yra labai vertinga technika naudojama mikroskopijoje, siekiant padidinti kontrastą mikroskopiniame vaizde. Procedūra apima mėginio paruošimą ant stiklelio, fiksaciją (kurios dėka išlaikoma ląstelės forma), dažymą ir stebėjimą pro mikroskopą (81).
Gramo dažymo būdas yra sudėtinė ir diferencinė dažymo procedūra, kuri iki šių dienų išlieka labiausiai naudojamu ir dažniausiai atliekamu tyrimu mikrobiologijos laboratorijoje. Šis dažymo metodas atskiria bakterijas pagal jų sienelės struktūrą, ir organizmai būna klasifikuojami pagal jų reakciją su Gramo dažais – į gram-teigiamus ir gram-neigiamus. Gram-teigiamos bakterijos sienelę sudaro storesnis ir tankesnis peptidoglikano sluoksnis. Šiose bakterijose jodas įsiskverbia į sienelę ir neleidžia mėlynam dažui difunduoti pro ląstelės sienelę blukinimo metu. Kad reakcija įvyktų, sienelė turi būti nepažeista. Gram-neigiamos bakterijos, kurios neišlaiko kristalinio violetinio, yra dažomos kontrastiniu dažu: neutraliu raudonuoju, safraninu arba fuksinu. Jei po dažymo procedūros matome
21 tamsiai mėlyna ar violetine spalva nusidažiusią bakteriją – turime gram-teigiamą organizmą, o jei rožine ar raudona – gram-neigiamą (81).
Nors Gramo dažymo būdas ir yra naudinga priemonė bakterijų identifikacijos procese, tačiau ne visos bakterijos gali būti identifikuotos šiuo metodu. Kai kurios (ypač senos kultūros) gali dažytis ir gram-teigiamai, ir gram-neigiamai arba visai nereaguoti į dažą, t.y. nesidažyti Gramo būdu (81).
1.3.2. KOH testas
Šis testas taip pat skirtas nustatyti ar bakterijos yra gram-teigiamos, ar gram-neigiamos. Tyrimo metu nedidelis kiekis bakterijų yra paimamas nuo neselektyvios terpės (kraujo agaro) ir sumaišoma su panašiu kiekiu 3 proc. kalio hidroksido. Maišoma ant mikroskopinio stiklelio, tuomet kilpelė lėtai keliama ir stebima ar atsiranda tįstančios gleivės. Tįstančios bakterijos yra gram-neigiamos (52).
1.3.3. Katalazės testas
Katalazės testas yra svarbus atskiriant katalazės neišskiriančius (neigiamus) streptokokus nuo katalazei teigiamų stafilokokų, bei naudojamas kitoms bakterijoms identifikuoti (82). Šis testas aptinka katalazės fermentą visuose citochromą turinčiuose aerobinėse ir fakultatyvinėse anaerobinėse bakterijose. Testo metu vyksta vandenilio peroksido skaidymas ir susidaro deguonis bei vanduo, kaip parodyta šioje reakcijoje: 2 H2O2 ——>2 H2O + O2. Vandenilio peroksidas susidaro kai kuriose bakterijose kaip šalutinis oksidacinis produktas aerobinio cukraus skaidymo metu. Didelės jo sankaupos yra toksiškos bakterijoms, o katalazė skaido vandenilio peroksidą taip apsaugodama ląstelę nuo žūties (83).
Tyrimo metu bakterijų izoliatas sumaišomas su 3 proc. vandenilio peroksido tirpalu. Jei tiriama bakterija gamina katalazės fermentą, iš karto skirsis dujų burbuliukai. Jei burbuliukai nesiskiria – katalazės fermento bakterija negamina. Būtina šalia atlikti tiek neigiamą, tiek teigiamą kontrolę (83).
1.3.4. Biocheminiai testai
Biocheminiai testai susiję su kataboliniu bakterijos aktyvumu. Indikatorių sistema naudojama tam, kad parodyti kaip skirtingai bakterija veikia substratus. Angliavandeniai panaudojami ne visi, tai priklauso nuo bakterijų rūšies – skirtingas angliavandenių skaidymas naudojamas bakterijų identifikacijai. Biocheminiam testui atlikti naudojama juostelė su nedideliais įdubimais, juose yra būtini reagentai, į kuriuos dedamos bakterijų kultūros jų identifikacijai. Reakcija vertinama pagal spalvos pokytį. Testai yra skirtingi – enterobakterijoms, kitoms gram-neigiamoms bakterijoms, anaerobams, stafilokokams ir streptokokams (53).
Reakcijoje dalyvauja angliavandeniai arba alkoholiai: monosacharidai, tokie kaip arabinozė, fruktozė, galaktozė, gliukozė, manozė, ribozė, ribuliozė, ksilozė. Disacharidai, tai cukrozė (gliukozės ir
22 fruktozės molekulės), maltozė (dvi gliukozės molekulės), laktozė (gliukozė ir galaktozė). Trisacharidai – rafinozė (gliukozė, fruktozė, galaktozė), polisacharidas – inulinas, alkoholiai – adonitolis, dulcitolis, manitolis bei sorbitolis (52).
1.3.5. Molekuliniai metodai bakterijoms identifikuoti
Tobulėjant tyrimo metodams, labai padidėjo skaičius fenotipinių požymių, kurie gali būti naudojami mikroorganizmams klasifikuoti. Pastaruoju metu filogenetinį mikroorganizmų klasifikacijos principą papildo ir keičia genosistematika. Ji grindžiama mikroorganizmų DNR nukleotidų sudėties ir kitų jų genomo ypatybių pvz., (matmenų, apimties, molekulinės masės ir kitų) nustatymu (51). Tiksliam bakterijos rūšies nustatymui gali būti reikalingi genetiniai tyrimai (84).
1.3.6. Amino rūgščių padauginimo testas arba polimerazinė grandininė reakcija
PGR metodas yra geras ir tinkamas būdas bakterijoms tirti, nes yra paprastas, jautrus ir specifiškas. Polimerazinė grandininė reakcija labai plačiai naudojamas metodas. PGR metu tam tikro DNR segmento amino rūgštys yra padauginamos daug kartų vos per kelias valandas. PGR reakcijai reikia labai nedidelio kiekio mikroorganizmų, kad būtų nustatytas mikroorganizmas.
PGR, tai cikliškas procesas, šaldymas ir kaitinimas, kurio metu kopijuojama DNR. Kiekvienas ciklas turi tris žingsnius. Pirmasis žingsnis, tai DNR grandinės denatūracija. PGR metu atskiriama dvigrandė spiralinė DNR. Palaikoma temperatūra 93–94°C. Vandenilinės jungtys suardomos ir padidinamos DNR gijos atskirai.
Antruoju etapu labai svarbi temperatūra. Ji palaikoma žemesnė tam, kad naudoti sinteniniai oligonukleotidų prademenys galėtų sąveikauti, susijungti su DNR. Oligonukleotidų pradmenys turi nuo 20 iki 25 bazių. Jie parenkami taip, kad atitiktų pagal komplementarumą tam tikrą DNR bazių zoną. Šio etapo metu temperatūra priklauso nuo oligonukleotidų pradmenų, bet dažniausiai palaikoma nuo 50–60°C intervale. Tam, kad pradmenys susijungtų pagal komplementarumą su DNR, reikalingas fermentas DNR polimerazė.
Trečiu etapu kaitinama tam, kad pradmenys pailgėtų. Nuo pradmenų dvigubos susijungimo vietos su DNR inicijuojama sintezė, kurios metu prisijungę oligonukleotidai ilgėja pagal komplementarumo dėsnį. DNR polimerazė katalizuoja reakciją. Svarbu, kad polimerazė būtų termostabili, žymėta Taq ženklu tam, kad atlaikytų nuolat kintančią temperatūrą, pasikartojančius didelės temperatūros ciklus. Temperatūra palaikoma 72°C, o polimerazė išgaunama iš bakterijos Thermus aquaticus, kuri aptinkama karštose vermėse ir yra aktyviausia tokioje temperatūroje. Pailgėjimui svarbūs keturi deoksinukleotidai (dATP, dGTP, dCTP ir dTTP) ir specialus buferis su magniu, kuris reikalingas Taq polimerazės veiklai. Trys etapai – denatūracija, pradmenų prijungimas
23 bei DNR ilgėjimas yra kartojami. Įvyksta 30 ar 40 ciklų, kol pagaminamas reikiamas PGR produkto kiekis – pakankamas DNR kiekis (52).
1.3.7. Sekoskaita
Vienas pagrindinių metodų, leidžiančių nustatyti genomo variantus bei jų įvairovę, yra DNR sekoskaita (85). Sekoskaita remiasi nukleotidų eilės nustatymu DNR fragmente. Dabar sekoskaita yra automatizuotas metodas ir gali nustatyti visą genomą. Viso genomo sekoskaita nėra metodas, kuris atliekamas laboratorijose nuolat, tačiau klinikinės laboratorijos daro mažesnio pobūdžio tyrimus tam, kad identifikuotų mikroorganizmus. Dauguma klinikinių mikrobiologijos laboratorijų dabar atlieka 16S rRNR subvieneto sekvenavimą tam, kad identifikuotų sunkiai nustatomas bakterijų padermes. Po sekvenavimo, kompiuteryje įdiegta programa yra naudojama tam, kad palyginti gautą nukleotidų seką su jau nustatytomis ir identifikuotomis, žinomomis programai nukleotidų sekomis. Nors šis metodas nėra labai tikslus, tai sudaro galimybę atpažinti bei palyginti genetiškai artimas bakterijas (86).
1.4. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Antibiotikai tapo būtini dėl infekcinių ligų sukelto didėjančio sergamumo ir mirtingumo. Kai tik jie buvo pradėti naudoti veterinarinėje medicinoje, gyvūnų sveikata ir produktyvumas žymiai pagerėjo. Tačiau sumažėjęs vaistų efektyvumas, dėl atsparių antibiotikams bakterijų atsiradimo, plitimo ir išsilaikymo (apibrėžiamas kaip mikroorganizmo sugebėjimas atlaikti normalią veiksmingą antimikrobinio vaisto koncentraciją) tapo pagrindine problema ir rimta grėsme gydymo efektyvumui, gydant infekcines ligas tiek žmonių, tiek gyvūnų medicinoje (87).
Antimikrobino atsparumo mechanizmai yra žinomi visiems šiuo metu naudojamiems antibiotikams veterinarinėje ir žmonių medicinoje. Todėl tvarus valdymas dabartinių antibiotikų, tęstinis vystymas naujų bei antimikrobinių vaistų alternatyvos yra esminiai būdai, leisiantys apsaugoti gyvūnų ir žmonių sveikatą nuo infekcijas sukeliančių patogenų (87).
1.4.1. Antimikrobinio atsparumo tipai
Bakterijų atsparumas yra skirstomas į tris pagrindinius fenotipus: jautrios, įgimto ir įgyto atsparumo (87). Jautrumas antibakterinei medžiagai yra genetiškai determinuota mikroorganizmų rūšies savybė, pasireiškianti tuo, kad tos rūšies mikroorganizmai natūraliai sintetina tuos „taikinius“, kuriuos veikdamas tam tikras antimikrobinis vaistas sustabdo tos mikroorganizmų rūšies ląstelių augimą ir dauginimąsi (mikrobostatiškas poveikis) ar/ir juos užmuša (mikrobocidiškas poveikis) (51).
24
1.4.1.1. Įgimtas antimikrobinis bakterijų atsparumas
Įgimtas atsparumas yra būdingas visiems tam tikros taksonominės grupės bakterijoms (genčiai, rūšiai ar porūšiui). Tai tam tikri struktūriniai ir biocheminiai mikroorganizmo pakitimai. Pavyzdžiui, dauguma gram-neigiamų bakterijų yra atsparios makrolidams. Jų molekulės yra per didelės tam, kad praeitų ląstelės sienelę ir pasiektų taikinį. Aminoglikozidų sumažėjęs aktyvumas prieš anaerobines bakterijas, aminoglikozidai negali įsiskverbti į bakteriją dėl anaerobinių sąlygų; polimiksinas, kuris neveikia gram-teigiamų bakterijų dėl fosfatidiletanolamino, esančio jų citoplazminėje membranoje (87).
1.4.1.2. Įgytas antimikrobinis bakterijų atsparumas
Įgytas atsparumas vienam (atsparumas) ar keliems (daugiaatsparumas) antibakteriniams vaistams yra savybė būdinga tam tikrai padermei pasikeitus jos genomui (51).
Gali būti užkoduotas atsparumas ir kelioms klasėms. Pavyzdžiui, neseniai atrasta Cfr rRNA metiltransferazė ar aminoglikozido acetiltransferazė Aac(6’)-lb-cr – tai atsparumas daugybei vaistų, kuris reguliuojamas siurblio principu, viena iš jų atparumą lemianti AcrAB-Tolc siurblio sistema. Vienu metu vykstantis įgytas kelių genetiškai nesusijusių veiksnių atsparumas ant vieno mobilaus genetinio elemento yra dažniausiai naudojamas aiškinant daugybinį atsparumą (87). Tam tikros rūšies mikroorganizmų atsparumas tam tikram antibiotikui taip pat yra genetiškai apspręstas. Konkreti jautrių antibiotikui mikroorganizmų padermės savybė, turi ne tik kokybinę (atsparūs ar neatsparūs), bet ir kiekybinę išraišką: antibiotiko koncentraciją, kuriai esant antibiotikas pajėgus sukelti mikrobostatinį ar mikrobocidinį poveikį. Tai rodo minimalioji slopinanti koncentracija (MSK) (51).
Bakterijų atsparumas antibiotikams, tai savybė įgyjama dėl genų mutacijos, dėl ląstelės struktūros pokyčių, kaip normalaus fiziologinio proceso dalies, dėl įgyjamų svetimų atsparumo genų arba yra visų šių trijų procesų pasekmė. Mutacijos atsiranda nuolat, bet palyginus pakankamai retai pačioje bakterijoje, todėl kartais atsparumas irgi atsiranda atsitiktinai. Atsparumas atsiranda dėl streso (kai susiduriama su patogenu ar antimikrobinėmis medžiagomis), taip pat kai susiduria bakterijų populiacijos, iš kurių viena yra su padidėjusiu mutacijų skaičiumi (87). Svarbios yra dvi reikšmingos aplinkybės: tam tikram antibiotikui atsparios padermės ir jautrių tam antibiotikui mikroorganizmų rūšies viduje atsiradimas; atsparių tam tikram antibiotikui padermių įsitvirtinimas ir jų vyravimas mikroorganizmų populiacijoje, vartojant antibiotiką infekcinėms ligoms gydyti, t.y. antibiotikas veikia kaip atrankos (selekcijos) veiksnys (51).
25 Bakterijų atsparumas antibiotikams yra įvairus, jis gali pasireikšti kaip pačios bakterijos pasikeitimas, taip pat bakterija gali pakeisti antibiotiką, jį detoksiksikuoti arba blokuoti, tokiu būdu neleisdama jam veikti. Bakterijos tai daro keisdamos savo genetinę medžiagą (87).
1.4.2.Antimikrobinio atparumo mechanizmai
Antimikrobinio atsparumo mechanizmai gali būti suskirstyti į keturias dideles grupes:
1) paveikiamas antimikrobinio agento sugebėjimas pasiekti taikinį sumažinant jo galimybę įsiskverbti į bakterijos ląstelės sienelę;
2) antimikrobinis agentas gali būti pašalinamas iš ląstelės nespecializuotais ar specialiais siurbliais; 3) antimikrobinis agentas pakeičiamas arba nuslopinamas ir taip inaktyvuojamas prieš ar po įsiskverbimo į bakterijos ląstelę;
4) antimikrobinis agentas gali būti pakeistas ar apsaugotas kitos molekulės, kuri neleidžia jam pasiekti taikinio, tuomet antibiotikas negali veikti. Mikroorganizmas nurodo kitą alternatyvų taikinį, kad nukreiptų antimikrobinį agentą (87).
Antimikrobinio agento pašalinimas siurblio principu yra pagrindinis mechanizmas leidžiantis susidaryti daugybiniam atsparumui (88).
1.4.2.1. Antimikrobinės medžiagos pakeitimas arba nuslopinimas
Yra trys pagrindiniai fermentai, kurie nuslopina antimikrobines medžiagas: β-lakatamazės, aminoglikozidų veikimą keičiantys fermentai ir chloramfenikolio acetiltransferazės (89). β- lakatamazės labai paplitę fermentai ir yra klasifikuojami naudojant dvi sistemas: Ambler ir Bush-Jacoby-Medeiros (88). Svarbiausios β-laktamazės yra gaminamos gram-neigiamų bakterijų (90) ir yra koduojamos chromosomose ir plazmidėse. Genai, lemiantys šį atsparumą perduodami transpozonų, bet taip pat gali būti randami ir integronuose. Antibiotiko suardymą sukelia kiti fermentai (estrazės) (91).
1.4.2.1.1. Antimikrobinės medžiagos nuslopinimas grupinio perdavimo būdu
Fermentų grupė nuslopinanti aminoglikozidus, chloramfenikolį, streptograminą, makrolidus ar rifamiciną yra vadinama transferazėmis. Inaktyvacijos metus surišamos adenilo, fosforilo ir acetilo grupės į antibiotiko molekulės periferiją. Šios modifikacijos atliekamos transportavimo metu per citoplazminę membraną (ko-substratas, ATP, acetyl-CoA, NAD+, UDP-gliukozė ar glutationas) (92, 93).
1.4.2.1.2. Antimikrobinės medžiagos nuslopinimas redokso proceso metu
Oksidacijos ir redukcijos reakcijos yra naudojamos bakterijų kaip atsparumo mechanizmai prieš antimikrobinę medžiagą (92,94).
26
1.4.2.3. Antimikrobinio agento pakeitimas
Antimikrobinio agento ir taikinio susijungimas yra labai specifiška reakcija ir net maži taikinio molekulės pokyčiai gali paveikti reakciją (92,95).
1.4.2.4. Peptidoglikano sienelės struktūros pakeitimai
Ląstelės sienelės sintezę slopina β laktaminiai antibiotikai: penicilinai, cefalosporinai, karbapenemai, monobaktamai ir glikopeptidai. Peptidoglikano sienelės struktūros pokyčiai lemia sumažėjusį β laktaminių antibiotikų veikimą (92).
1.4.2.5. Baltymų sintezės sutrikdymas
Antibiotikai (aminoglikozidai, tetraciklinai, makrolidai, chloramfenikolis, fucidino rūgštis, mupirocinas, streptograminas, oksazolidinonai) gali trukdyti baltymų sintezei įvairiose jos stadijose; pavyzdžiui RNR polimerazės transkripcijos metu specifinis taikinys pakeičia rifamiciną. Aminoglikozidai (gentamicinas, tobramicinas, amikacinas) prilimpa prie 30S ribosominio subvieneto (96), o chloramfenikolis prie 50S subvieneto, taip supresiškai veikiama baltymų sintezė (97).
1.4.2.6. Antimikrobinio agento pašalinimas siurblio metodu
Membranoje esantys integraliniai baltymai, kurie transportuoja antimikrobines medžiagas iš ląstelės ir lemia sumažėjusią koncentraciją lastelėje, vadinami siurbliais. Sumažėjęs ląstelės sienelės pralaidumas lemia mažesnį antibiotiko įsisavinimą (92). Daugiakomponenčiai siurbliai būdingi gram-neigiamoms bakterijoms. Jie kartu su periplastinės membranos sintezės proteinų komponentais bei išorinės membranos baltymu perneša substratus per patį ląstelės apvalkalą. Siurblio sistemos yra specifiškos antimikrobinėms medžiagoms (88,92,94,98).
27 Šaltinis: Levy SB. The challenge of antibiotic resistance. Scientific American. 1998.
1 pav. Antimikrobinio agento pašalinamas iš bakterijos siurbliais
Kairėje: antibiotikas iš ląstelės pašalinamas; Dešinėje: antibiotikas jungiasi su ribosomomis, vykdoma baltymų sintezė (99)
1.4.2.7. Išorinės membranos pralaidumas
Gram-neigiamų bakterijų išorinė membrana susidaro iš vidinio fosfolipidų sluoksnio ir išorinio, kurį sudaro lipidas A. Dėl tokios išorinės membranos struktūros sumažinamas antimikrobinių medžiagų patekimas į ląstelę per šią membraną. Molekulės antimikrobinės medžiagos gali patekti skirtingais būdais: 1) difuzijos metu per poras; 2) difuzijos metu per dvisluoksnį; 3) antimikrobinės medžiagos skatinamas būti įsisavintai. Patekimo tipas priklauso nuo pačios antimikrobinės medžiagos (92).
1.4.2.8. Antimikrobinės medžiagos išvengimas
Bakterija gamina alternatyvų taikinį (dažniausiai fermentą), kuris yra atsparus antibiotiko slopinamajam poveikiui. Tuo pat metu bakterija gamina taikinį, kuris yra jautrus antimikrobinei medžiagai. Tai leidžia bakterijai išgyventi ir gaminti antimikrobinei medžiagai jautrius taikinius (100,101).
1.5. Atsparumo antimikrobinėms medžiagoms tyrimo metodai
1.5.1. Antibiotikų diskų metodas pagal Kirby BauerŠis Kirby-Bauer diskų metodas yra nesunkiai atliekamas, palyginti nebrangus ir dažniausiai laboratorijoje naudojamas diagnostikos tikslais (53).
28 McFarland 0,5 vieneto tiriamųjų bakterijų standartinė koncentracija yra pasėjama ant Mueller-Hinton agaro, tuomet ant lėkštelės uždedami skirtingomis antimikrobinėmis medžiagomis impregnuoti diskai (86). Antimikrobinės medžiagos difunduoja į agarą, sukurdamos tam tikrą antimikrobinės medžiagos prisotintą zoną, kurioje tai medžiagai jautrus mikroorganizmas neaugs (52). Kiekvienos zonos, kurioje slopinamas mikroorganizmų augimas, diametras yra matuojamas milimetrais (trimis skirtingomis kryptimis pasirenkant trijų matavimų vidurkį), ir rezultatai yra palyginami su standartais, nustatytais pagal zonos skersmenį (CLSI, 2008) (53).
Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms nustatomas/interpretuojamas pagal priimtus standartus, tokius kaip CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute, JAV), ar EUCAST (The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Jei tyrimai siejami su antibiotikų parinkimu gydymui, interpretacija atliekama pagal klinikinius lūžio taškus (clinical breakpoints). Vertinant bakterijų jautrumą pagal šiuos standartus jos skirstomos į jautrias, vidutiniškai jautrias ir atsparias. Teigiama, kad šis metodas yra greitesnis, nei naudojant minimalios slopinančios koncentracijos testą (16).
1.5.2. Kiekybiniai metodai antimikrobinio atsparumo nustatymui
1.5.2.1. Daugybinio praskiedimo metodas (Broth dilution test)
Tai vienas iš istoriškai anksčiausiai naudojamų atsparumo antibiotikams tyrimo metodų (102). Laboratorijoje atliekamos tam tikros procedūros, kurių metu nustatoma minimali slopinanti antibiotiko koncentracija (53). Tai atliekama mėgintuvėliuose su maitinamuoju sultiniu, kurie sustatomi eile ir į juos supilstomi antibiotikai su du-kartiniu praskiedimu. Kiekvienas mėgintuvėlis pripildomas skysčiu su įsėta bakterijų kultūra, kuriame yr 104 ir 105 KSV/ml. Mėgintuvėliai laikomi 35-37°C 24 val. Mėgintuvėlis, kuriame yra mažiausia antibiotiko koncentracija ir matomas augimo slopinimas (mėgintuvėlyje nematome drumstumo), nurodo MSK koncentraciją. Testas gali būti atliekamas mėgintuvėliuose pripildytuose mažiausiai 2 ml suspencijos, tai makropraskiedimas arba, dabar dažniau naudojamas būdas, su mikrotitravimo plokštelėmis – mikropraskiedimas. Mikrotitravimo plokštelių su iš anksto paskirstytais skiediniais su antimikrobine medžiaga galime įsigyti su sausu skiediniu arba užšaldytose plokštelėse. Minimali baktericidinė koncentracija taip pat gali būti nustatoma šiuo metodu (52). Minimali baktericidinė koncentracija (MBC) yra didžiausias praskiedimas pačios antimikrobinės medžiagos, kuri gali nužudyti tam tikrą bakteriją (53). Tai atliekama, kai nustatoma MSK. Standartinis kiekis sultinio yra paimamas iš mėgintuvėlių, kuriuose po 24 val. nematome bakterijų augimo, ir užsėjama ant terpės. MBC yra apibrėžiama kaip mažiausia antibiotiko koncentracija, kuri nužudo 99,9
29 proc. pradinio įsėto bakterijų kiekio terpėse arba ten, kur 1000 kartų sumažinamas bakterijų skaičius (52).
1.5.2.2. E-testas
MSK galima nustatyti naudojant E-testą (53). Šį testą sudaro plona plastikinė juostelė, kurios skirtingose dalyse antibiotiko kiekis proporcingai didėja (52). Šiuo metodu MSK yra nustatoma žiūrint į tą juostelės vietą, kurioje prasideda elipsės zona. Toje vietoje yra slopinamų bakterijų augimo pradžia, kuri atitinka MSK (53).
1.5.2.3. Skiedimo agarizuotoje terpėje testas
Šis testas yra panašus į daugybinio praskiedimo metodą, bet skirtumas tas, kad antibiotiko tam tikri praskiedimai yra atliekami ant Petri lėkštelėse su agaru (52). Tam tikri kiekiai antibiotiko su du-kartiniais praskiedimais yra išpilstomi ant iš anksto nustatyto išlydyto ir sušaldyto agaro kiekio, supilstyto į standartines Petri lėkšteles. Tokiam paruoštam agarui leidžiama sustingti, ir tada standartinis kiekis tiriamųjų bakterijų (104
KSV) pasėjamas ant terpės paviršiaus. Daugiau nei 32 bakterijų kultūros gali būti tuo pačiu metu pasėtos ant 100 mm Petri lėkštelės; 100 mm lėkštelėje gali tipti 36 kultūros. Po 12 val. auginimo MSK yra nustatoma kaip mažiausia koncentracija, kuri slopina matomą tiriamųjų bakterijų augimą (viena ar dvi neišaugusios kolonijos gali neturėti įtakos rezultatų vertinimui) (86).
1.5.3. Molekuliniai metodai antimikrobiniam atsparumui nustatyti
Nors antimikrobinio atsparumo nustatymas pagal tam tikrus fenotipinius požymius dažnai naudojamas laboratorijose, molekuliniai metodai suteikiantys galimybę nustatyti atsparumą lemiančius genus vis dažniau naudojami mokslinėse laboratorijose (52). Šie metodai remiasi tradicinės ar realaus laiko PGR rezultatais ir gali būti naudojami nustatant atspatumą lemiančius genus tokiame mikroorganizme, kuris yra išskirtas iš klinikinio mėginio arba esančius pačiame klinikiniame mėginyje/atvejyje. Didžiausiais tyrimo privalumas – atsakymo greitis, tai aktualu tuomet, kai sunku laboratorijoje užauginti bakterijų kultūrą (53). Šio metodo minusas – pačių genų nustatymas nebūtinai reiškia jo pasireiškimą ir bakterijų padermė, tiriant pagal fenotipinius požymius, kuri turi tą geną, nebūtinai yra atspari (52).
30
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Medžiaga tyrimams ir bakterijų iš kalių reprodukcinių organų išskyrimas
Tiriamieji mikroorganizmai buvo išskirti Mikrobiologijos ir virusologijos institute. Kalių mėginiai iš lytinių organų, gimdos ir makšties, pristatyti į Mikrobiologinių tyrimų laboratoriją buvo sėjami į mitybines terpes. Naudotos diferencinės-diagnostinės terpės – McConkey agaras bei selektyvios – Manitolio-druskos agaras (Liofilchem, Italija), TBX, Slanetz-Bartley agaras ir bendrojo naudojimo terpė – avino kraujo agaras (E&O Laboratories, Jungtinė Karalystė). Inkubacija atlikta termostate, 35˚C temperatūroje, 24–48 val. Kultūra sėjama ant avino kraujo agaro štricho būdu, o paskui atliekamas gryninimas siekiant gauti grynas kultūras.2.2. Bakterijų identifikacija
Pradinei bakterijų identifikacijai buvo atliekamas KOH testas. Tokiu būdu atskirtos gram-teigiamos ir gram-neigiamos bakterijos. Jei bakterijos gram-neigiamos, auga ant McConkey agaro, negamina oksidazės fermento, jos prskiriamos Enterobacteriaceae šeimai, ir tęsiamas tyrimas, tolimesnei identifikacijai. Jei bakterijos gram-teigiamos tęsiamas identifikavimas. Daromas tepinėlis, dažomas ir mikroskopuojamas, jei nustatoma bakterijų forma yra kokai, tuomet atliekama katalazės reakcija. Jei katalazė teigiama, bakterijos priskiriamos stafilokokams (Staphylococcus spp.). Jei katalazės reakcija neigiama, tuomet sėjama ant Slantez-Bartley selektyvios terpės ir stebimas augimas. Jei stebimas augimas, bakterijos laikomos kaip Enterococcus genties bakterijos, jei augimo nėra, o ant kraujo agaro jos auga smulkiomis kolonijomis su hemolize, bakterijos identifikuojamos kaip Streptococcus genties bakterijos.
Kai kurios stafilokokų genčiai priklausančios padermės, identifikuotos iki rūšies lygmens naudojant The Microbact™ Staph 12S (Oxoid) (Thermo Fisher, JAV) identifikavimo sistemas su atitinkamai gamintojų pateiktomis kompiuterinėmis programomis. Taip pat kai kurios gram-neigimos bakterijos identifikuotos naudojant The Microbact™ GNB 12A/B/E, 24E (Thermo Fisher, JAV) identifikavimo sistemas su gamintojo pateikta kompiuterine programa.
Sunkiai identifikuojamos bakterijos identifikuotos atliekant 16S rRNR sekoskaitą, prieš tai išskyrus bakterijų DNR.
31
2.3. Bakterijų DNR išskyrimas molekuliniams tyrimams
Bakterijų kolonija auganti standžioje terpėje resuspenduojama dejonizuoto vandens 200 μl. Suspensija virinama 100°C 5 min. vandens vonioje, o po to greitai atšaldoma ir centrifuguojama 10XG greičiu 10 min. Supernatantas su DNR nusiurbiamas (200 ml) ir laikomas šaldiklyje iki tyrimų.
2.4. Bakterijų identifikacija molekuliniais tyrimais
Molekuliniai tyrimai (polimerazės grandininė reakcija, toliau PGR) panaudoti tam, kad padvigubti DNR, kuri toliau bus naudojama sekvenavimui, atliekant 16 rRNR subvieneto sekoskaitą. PGR atlikti naudoti šiai reakcijos komponentai:
dejonizuotas vanduo Green Master Mix pradmenys: 27F ir 515R
tiriamųjų bakterijų genominė DNR
Reakcija atlikta termocikleryje (BOECO, Vokietija). Atliekamas PGR. DNR sintezė vykdoma 30-čia ciklų, kuriuos sudaro:
DNR denatūracija (94°C, 30s) pradmenų prijungimas (55°C) DNR elongacija (72 °C).
2.5. 16S rRNR sekosaita
Atlikus PGR, vykdėme gauto DNR produkto valymą. Tuo tikslu naudojome Zymo Research (PAR) komercinį rinkinį Clean & Concentrator. Išgrynintas produktas buvo siunčiamas į komercinę laboratoriją sekoskaitai atlikti. Gautos sekos buvo išanalizuotos naudojant kompiuterinę programą “Molecular Evolutionary Genetic Analysis software (MEGA, version 6)”. Bazinių lokalių išsidėstymų įrankio (BLAST) pagalba sekos buvo palygintos su sekomis, esančiomis nacionalinio biotechnologijos informacijos centro (NCBI, JAV) duomenų bazėse. Bakterijų identifikacija atlikta esant panašiausiam tirtosios bakterijos DNR sekos sutapimui su žinomomis, referentinėmis DNR sekomis. Papildomai buvo sudaromas išskirtų bakterijų filogenetinis medis, bakterijų genetiniam artumui nustatyti.
