LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Aistė Darata Brazdilytė
ESBL/AmpC produkuojančių Escherichia coli
paplitimas mėsos produktuose Lietuvos rinkoje ir šių
bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
The prevalence and antimicrobial resistance of
ESBL/AmpC producing Escherichia coli in meat products
Veterinarinės maisto saugos ištęstinių studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: lektorius, Dr. Aleksandr Novoslavskij Maisto saugos ir kokybės katedra
2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „ESBL/AmpC produkuojančių
Escherichia coli paplitimas mėsos produktuose Lietuvos rinkoje ir šių bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms“.
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE
(aprobacijos data) (katedros (instito) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)
2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
Santrauka...4 Summary...6 Santrumpos...8 ĮVADAS...10 1. LITERATŪROS APŽVALGA...121.1. Šviežios ir atšaldytos mėsos mikroflora...12
1.2. Escherichia coli bakterijų charakteriska ir poveikis vartotojų sveikatai...13
1.3. Antibiotikų grupės, bei veikimo mechanizmai...14
1.4. Antibiotikų naudojimas gyvūnams...15
1.5. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms...17
1.5.1. E. coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms...18
1.6. E. coli bakterijų gaminami fermentai...21
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGOS...24
2.1. ESBL ir AmpC produkuojančių E. coli aptikimas šviežioje ir atšaldytoje mėsoje...25
2.2. E. coli bakterijų antimikrobinio atsparumo nustatymas...25
2.3. Statistinė analizė...28
3. TYRIMO REZULTATAI...29
3.1. ESBL/AmpC paplitimas skirtingose mėsos rūšyse...29
3.2. Išskirtų E. coli bakterijų fenotipinis charakterizavimas...30
3.3. Išskirtų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms...30
3.3.1. E. coli išskirtų iš kiaulienos atsparumas antimikrobinėms medžiagoms...33
3.3.2. E. coli išskirtų iš jautienos atsparumas antimikrobinėms medžiagoms...33
3.3.3. E. coli išskirtų iš vištienos atsparumas antimikrobinėms medžiagoms...34
4. REZULTATŲ APTARIMAS...36
5. IŠVADOS...38
4 SANTRAUKA
ESBL/AmpC produkuojančių Escherichia coli paplitimas mėsos produktuose Lietuvos rinkoje ir šių bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Aistė Darata Brazdilytė Magistro baigiamasis darbas
Esherichia coli bakterijos produkuojančios išplėstinio spektro beta laktamazes (ESBL, angl. extended-spectrum β-lactamase) ir plazmidiniai beta laktamazių fermentai, kurių rezistentiškumo genas užkoduotas plazmidėse (AmpC, angl. AmpC β -lactamases) šiuo metu plačiai paplitusios pasaulyje ir taip pat dažnai aptinkamos žalioje mėsoje. E. coli yra vienos iš dažniausiai mutuojančių bakterijų ir nuolat pastebimas šių bakterijų didėjantis atsparumas antimikrobinėms medžiagoms.
Šio darbo tikslas yra įvertinti ESBL/AmpC produkuojančių E. coli bakterijų paplitimą įvairių rūšių mėsoje parduodamoje Lietuvoje (kiaulienoje, jautienoje ir vištienoje), bei nustatyti šių bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Tiriamasis darbas atliktas 2015 – 2018 m. Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Bakteriologinių tyrimų skyriuje. Tyrimo metu buvo vertinami šviežios ar atšaldytos mėsos mėginiai, surinkti iš įvairių mažmeninės prekybos vietų (parduotuvių, turgų) įvairiuose Lietuvos miestuose.
E. coli bakterijų išskyrimas buvo atliktas pagal standartinę darbo procedūrą (SDP) 5.4.4.B.61 – „ESBL ir AmpC produkuojančių E. coli išskyrimas patologinėje, klinikinėje medžiagoje ir maisto produktuose“ naudojama Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Bakteriologinių tyrimų skyriuje. Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms buvo atliktas naudojant komerciškai pagamintas sensititro (ang. Sensititre) plokšteles – EUVSEC ir EUVSEC 2 (Thermo fisher scientific) nustatant minimalias bakterijų augimą slopinančias koncentracijas MIK (MIC - ang. – Minimum inhibitory concentration). Darbo metu įvertintas E. coli bakterijų atsparumas šiems antibiotikams: sulfametoksazolui (SMX), trimetoprimui (TMP), ciprofloksacinui (CIP), tetraciklinui (TET), meropenemui (MEM), azitromicinui (AZI), nalidikso rūgščiai (NAL), cefotoksimui (FOT), chloramfenikoliui (CHL), tigeciklinui (TGC), ceftazidimui (TAZ), kolistinui (COL), ampicilinui (AMP), gentamicinui (GEN), cefoksitinui (FOX), ertapenemui (ETP), imipenemui (IMI), cefepimui (FEP), temocilinui (TRM). Tyrimų rezultatai pateikti atlikus statistinę duomenų analizę. Rezultatai laikomi statistiškai reikšmingais, jei P<0,05. Išskirtų E. coli bakterijų fenotipinas buvo nustatomas, pagal Europos Sąjungos maisto saugos tarnybos rekomendacijas įvertinant sinerginį poveikį beta laktamazių inhibitoriams (cefotaksimui
5 su klavulano rūgštimi – F/C ir ceftazidimui su klavulano rūgštimi – T/C) bei bakterijų atsparumą cefoksitinui (FOX).
Atlikus tyrimo rezultatų analizę pastebėta, kad didžiausias ESBL/AmpC gaminančių bakterijų kiekis aptiktas vištienos mėginiuose: 2016 m. ištirtuose 150 vnt. vištienos mėginių fermentus produkuojančios E. coli bakterijos aptiktos 94 mėginiuose (62,6 proc.), o 2018 m. ištyrus 150 vnt. vištienos mėginių ESBL produkuojančių bakterijų aptikta 93 mėginiuose (62 proc.) (P>0,05). Mažiausiai fermentus produkuojančių E. coli bakterijų aptikta jautienoje – 2015 m. 12 mėginių (8 proc.) ir 2017 m. dvejuose mėginiuose (1,3 proc.), (P>0,05). Kiaulienoje 2015 m. šių bakterijų aptikta 16 mėginių (10,7 proc.), o 2017 m. trijuose mėginiuose (2 proc.), (P>0,05).
Analizuojant išskirtas ESBL/AmpC fermentus produkuojančias E. coli bakterijas, pagal jų fenotipą nustatėme, kad dažniausiai Lietuvoje išskirtos bakterijos turi ESBL fenotipą (54,1 proc.), AmpC fenotipą (45 proc.), ESBL+AmpC fenotipą – 0,9 proc.
Visos išskirtos bakterijos pasižymėjo dauginiu atsparumu. Vertinant išskirtų bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms bendras atsparumas statistiškai reikšmingai skyrėsi priklausomai nuo mėsos rūšies (P<0,05). Didžiausias iš jų atsparumas buvo nustatytas vištienai (53,4 proc.). Tyrimo metu nustatyta, kad visos išskirtos ESBL/AmpC produkuojančios E. coli buvo atsparios ampicilinui ir cefotaksimui, bei jautrios temocilinui, tigeciklinui, meropenemui ir imipenemui.
6 SUMMARY
The prevalence and antimicrobial resistance of ESBL/AmpC producing Escherichia coli in meat products
Aistė Darata Brazdilytė Master‘s Thesis
Esherichia coli bacteria producing ESBL‘s (extended-spectrum beta-lactamases) and AmpC β-lactamases encoded in the plasmids is currently widespread in the world and frequently found in raw meat. E. coli is one of the most mutating bacteria and the antimicrobial resistance in these bacteria is increasing.
The aim of this work is to evaluate the prevalence of ESBL/AmpC-producing E. coli bacteria in various types of meat sold in Lithuania (pork, beef and chicken) and to determine the antimicrobial resistance of these bacteria.
The research work was carried out in 2015 - 2018. In National Food and veterinary risk assessment institute of Lithuania, Bacteriological Unit. During the research, samples of fresh or chilled meat from various retail outlets (shops, markets) in various Lithuanian cities were evaluated.
Isolation of E. coli bacteria was performed according to standard operating procedure (SOP) 5.4.4.B.61 - "Isolation of ESBL/AmpC producing E. coli in pathological, clinical material and food samples" used in the National Food and Veterinary Risk Assessment institute of Lithuania, Bacteriological Unit. Antimicrobial resistance was performed in commercially produced Sensititre plates - EUVSEC and EUVSEC 2 (Thermo fisher scientific) to determine minimum growth inhibitory concentrations of bacteria (MIC). We tested E. coli bacterial resistance to this antibiotics: sulfamethoxazole (SMX), trimethoprim (TMP), ciprofloxacin (CIP), tetracycline (TET), meropenem (MERO), azithromycin (AZI), nalidic acid (NAL), cefotoxime (FOT), chloramphenicol (CHL), tigecycline (TGC), ceftazidime (TAZ), colistin (COL), ampicillin (AMP), gentamicin (GEN), cefoxitin (FOX), ertapenem (ETP), imipenem (IMI), cefepime (FEP ), temocilin (TRM). The results of the studies were provided by statistical data analysis. The results are considered statistically significant if p <0.05.
The isolated E. coli bacteria phenotype was determined by evaluating the synergistic effects of beta-lactamase inhibitors (cefotaxime with clavulanic acid - F/C and ceftazidime with clavulanic acid - T/C) and the resistance of bacteria to cefoxitin (FOX) as recommended by European Food Safety Authority.
7 The results of the study has shown that the highest levels of ESBL / AmpC producing bacteria were found in chicken meat samples: in 2016 - 94 (62.6%) samples out of 150 was positive for ESBL/AmpC producing E. coli bacteria, and in 2018 they were found to be present in 93 samples (62%) out of 150 tested samples, (p>0.05). The least ESBL/AmpC producing E. coli bacteria were detected in beef samples: in 2015 - 12 samples (8%) were positive and 2017 two samples were positive (1.3%), (p< 0.05). In 2015, 16 out of 150 pork samples were positive with ESBL/AmpC producing E. coli (10.7%), while in 2017 the number of positive samples were three (2%), (p< 0.05).
By analyzing isolated E. coli bacteria producing ESBL/AmpC, according to their phenotype, it was found that most bacteria isolated in Lithuania have ESBL phenotype (54.1%), AmpC phenotype (45%), ESBL + AmpC phenotype - 0.9%.
All isolated bacteria were characterized by multiple resistance. The overall resistance of the isolated bacteria to antimicrobial resistance was statistically significantly different depending on the type of meat (p <0.05). The highest resistance was found in chicken (53.4%).
The study has found that all isolated ESBL / AmpC-producing E. coli were resistant to ampicillin and cefotaxime, and susceptible to temocillin, tigecycline, meropenem and imipenem.
8
SANTRUMPOS
AAM – atsparumas antimikrobinei medžiagai. AM – antimikrobinė medžiaga.
AMP – ampicilinas. AZI – azitromicinas.
BPV – buferinis peptono vanduo. C – klavulano rūgštis.
°C – celsijaus laipsniai. CIP – ciprofloksacinas. COL – kolistinas.
CLV – klavulano rūgštis.
DANMAP - Danish Integrated Antimicrobial Resistance Monitoring and Research Programme. DNR – deoksiribonukleorūgštis.
ECDC – Europos ligų kontrolės ir prevencijos centras.
EFSA – European Food Safety Authority (Europos maisto saugos tarnyba) ESVAC - European Surveillance of Veterinary Antimicrobial Consumption. EMA - European Medicines Agency.
EUCAST – The European Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing (Europos antimikrobinio rezistentiškumo komitetas).
EURL – AR – Antimikrobinio rezistentiškumo Europos Sąjungos referentinė laboratorija (ang. - European Union Reference Laboratory for antimicrobial resistance).
ECOFF – Epidemiological cut-off values (epidemiologines lūžio taško reikšmės). ETP – ertapenemas.
F/C – cefotaksimas su klavulano rūgštimi. FEP – cefepimas. FOT – cefotaksimas. FOX – cefoksitinas. GEN – gentamicinas. H2S – sieros vandenilis. IPM – imipenemas. MERO – meropenemas.
MR – metilo raudonasis (angl. Methyl Red). RNR – ribonukleino rūgštis.
9 KSV – kolonijas sudarantys vienetai
MIK – Minimali inhibicinė koncentracija. SMX – sulfametoksazolas.
ŠTEC – šigatoksinus gaminanti Escherichia coli. TAZ – ceftazidimas.
T/C – ceftazidimas su klavulano rūgštimi. TET – tetraciklinas.
TGC – tigeciklinas. TMP – trimetoprimas. TRM – temocilinas. VP - Vogue proskauer.
10
ĮVADAS
Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms kelia vis didesnį susirūpinimą. Šiuo metu tai labai aktuali tema, kuria rašomi ir skelbiami įvairūs straipsniai, atliekama daug tyrimų. Šiuolaikinių antibiotikų era prasidėjo nuo 1928 m. kai A. Flemingas atrado peniciliną. Nuo tada penicilinas tapo plačiai vartojamas ir išgelbėjo milijonus gyvybių, tačiau netrukus bakterijų atsparumas penicilinui tapo didžiule problema. Nors ir po penicilino buvo sukurta naujų antibiotikų (tetraciklinas, vankomicinas, eritromicinas ir kt.) bakterijų greitas atsparumo išsivystymas lėmė tai, kad naujų vaistų kūrimas tapo sudėtingu procesu ir bakterinės infekcijos vėl tapo didžiule grėsme [1].
Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms atsirado dėl per didelio antibiotikų vartojimo, taip pat dėl bakterijų gebėjimo perduoti informaciją genetiniame lygyje. Atsparumas antibiotikams bakterijose taip pat gali atsirasti dėl įvairių mutacijų [1].
Dėl didelės žmonių populiacijos, didėja maistui auginamų gyvūnų pramonė. Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio duomenimis Europoje 2017 m. suvartota virš 10,5 milijonų tonų jautienos, 18,1 milijonų vištienos ir 29,1 milijonai kiaulienos [2]. Lietuvoje 2017 m. paskersta virš 147 tūkstančių galvijų, virš 768 tūkstančių kiaulių ir virš 5,4 milijonų viščiukų broilerių [3].
Kasmet pasaulyje suvartojami dideli kiekiai antibiotikų gyvūnų gydymui ir ligų prevencijai. Spėjama, kad antimikrobinių medžiagų suvartojimas iki 2030 m. padidės 67 proc., šį augimą lems padidėjusi gyvulinių produktų paklausa vidutinių pajamų šalyse ir didelių ūkių skaičiaus padidėjimas, kuriuose įprastai naudojamos antimikrobinės medžiagos [4].
Maistiniai gyvūnai turi didelę reikšmę atsparių bakterijų plitimui. Netinkamas arba per didelis antimikrobinių medžiagų naudojimas maistiniams gyvūnams paskatino atsparių bakterijų padermių vystymąsi [5]. Gyvūnai atsparias antimikrobinėms medžiagoms bakterijas gali perduoti tiesioginiu būdu (kontakto), taip pat netiesioginiais būdais – užteršiant aplinką ar per gyvulinės kilmės maistą.
Vienos iš dažniausių aptinkamų bakterijų mėsos žaliavose - E. coli. Įvairiais tyrimais nustatyta, kad žaliavos užterštumas E. coli bakterijomis gali siekti nuo 11,9 iki 38,7 proc., priklausomai nuo įvairių veiksnių [6]. E. coli bakterijos yra vienos iš labiausiai evoliucionuojančių bakterijų rūšių. Šios dažnai per užterštą maistą plintančios bakterijos sėkmingai dalijasi tarpusavyje genetine informacija dėl atsparumo antimikrobinėms medžiagoms bei perduoda šią informaciją kitoms bakterijų rūšims tokių būdu sukeliant papildomą riziką vartotojams [7].
Nuo 1983 metų aptiktos E. coli bakterijos produkuojančios išplėstinio spektro beta laktamazes (angl. extended-spectrum β-lactamase) ir cefolosporinazes (AmpC) šiuo metu plačiai paplitusios pasaulyje. Nuo 2000 m. Europos antimikrobinio atsparumo stebėjimo tinklo
11 duomenimis nustatyta, kad nuolat didėja E. coli izoliatų atsparių trečios ir ketvirtos kartos cefalosporinams. Bakterijos gaminančios ESBL yra atsparios oksiimino cefalosporinams ir pasižymi dauginiu atsparumu (atsparios 3 antimikrobinių medžiagų grupėm ir daugiau), paliekant ribotas gydymo galimybes [8].
Todėl nuolatinė bakterijų atsparumo antibiotikams stebėsena yra būtina prevencinė ir kontrolės priemonė, siekiant pastebėti atsirandančius pokyčius bakterijų atsparume, kuri leistų laiku ir atitinkamai imtis problemos sprendimo.
Šio darbo tikslas – įvertinti ESBL/AmpC produkuojančių Escherichia coli bakterijų paplitimą įvairių rūšių mėsoje parduodamoje Lietuvoje (kiaulienoje, jautienoje ir vištienoje), bei nustatyti šių bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms.
Darbo uždaviniai:
1. Išanalizuoti fermentus gaminančių Escherichia coli bakterijų paplitimą Lietuvos rinkoje parduodamoje mėsoje.
2. Palyginti šių bakterijų paplitimą skirtingose mėsos rūšyse.
3. Išanalizuoti išskirtų E. coli bakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, palyginti atsparumą tarp skirtingų mėsos rūsių ir įvertinti atsparumo antimikrobinėms medžiagoms kitimą dviejų metų laikotarpyje.
12
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Šviežios ir atšaldytos mėsos mikroflora
Mėsos produktų gamyba apima kelis aspektus: gyvūno auginimą ūkyje ir jo pakrovimą į transporto priemonę, transportavimą, gyvūnų iškrovimą ir laikymą, gyvūnų skerdimą. Sąlygos, kuriomis gyvūnai auginami ir skerdžiami lemia mėsos mikrobiologinį užteršimo lygį. Labiausiai tikėtini užteršimo šaltiniai yra aplinka, kurioje auginami gyvūnai (oras, aplinka, vanduo, pašarai), pats gyvūnas (oda, žarnynas, išmatos) ir skerdyklos aplinka (įranga, indai, žmonės) [9].
Po skerdimo ant skerdenos likęs bakterijų kiekis gali svyruoti nuo 10 iki 10000 kolonijas sudarančių vienetų (KSV) 1 cm2. Dažniausiai pasitaikančios bakterijos mėsoje: Microccoccus
spp., Staphylococcus spp., Bacillus spp., Cornobacterium spp., Enterobacteriaceae genties bakterijos (Salmonella spp., Eschericia coli ir kt.), Flavobacteria spp., Pseudomonas spp., pienarūgštės bakterijos ir Brochothrix thermosphacta [10]. Nors dauguma maisto produktų gali sukelti apsinuodijimus mėsa ir mėsos produktai yra svarbus patogeninių bakterijų šaltinis. Mėsa dažnai gali būti užteršta salmonelių, kampilobakterijų, toksinus gaminančių E. coli, Yersinia enterocolitica, Listeria monocytogenes rūšių bakterijomis. Visų šių bakterijų gali būti gyvūnų virškinamajame trakte, net sveiki gyvūnai gali būti šių bakterijų nešiotojais. Vėliau šios bakterijos patenka į mėsa, skerdimo ar maisto tvarkymo metu [10].
Remiantis įvairiais moksliniais tyrimais patogeninių bakterijų paplitimas žalioje mėsoje priklausomai nuo mėsos rūšies bei patogeno gali būti labai įvairus. Pvz., Pakistane atlikto tyrimo metu, nustatyta, kad 250- yje atrinktų mėsos mėginių aptiktos net 342 skirtingos patogeninės bakterijos. Iš jų 35 proc. – E. coli, o 15 proc. iš šių bakterijų buvo 0157:H7 serotipo. Kitos potencialiai patogeniškos bakterijos aptiktos tirtuose mėginiuose buvo: Listeria spp. 4 proc., Klebsiella spp. 8 proc., kitos enterobakterijų rūšys 15 proc., Staphylococcus aureus 7 proc. [11]. Etiopijoje atlikto tyrimo metu, apie E. coli O157:H7 paplitimą žalioje mėsoje, nustatyta, 4,2 proc. iš tirtų 738 mėginių buvo teigiami [12]. Vokietijoje atlikto tyrimo metu, apie Salmonella spp. paplitimą šviežioje mėsoje, nustatyta, kad iš 4170 žaliavinių mėsos mėginių ir šalutinių produktų iš jautienos ir kiaulienos, Salmonella spp. bakterijų aptikta 1,8 proc. kiaulienos mėginių, 0,6 proc. jautienos mėginių [13]. Irake atlikto tyrimo duomenimis nustatyta, kad iš 100 tirtų broilerių mėsos mėginių Salmonella spp. bakterijų aptikta – 45,8 proc., E. coli bakterijų - 34,1 proc. [14]. Irane atlikto tyrimo duomenimis apie E. coli O157: H7 paplitimą įvairių rūšių mėsoje nustatyta, kad iš 85-ių jautienos mėginių šių bakterijų aptikta 8,2 proc. [15]. Italijoje atlikto tyrimo metu dėl verotoksinus gaminančių E. coli bakterijų paplitimo mėsos produktuose, nustatyta, kad iš tirtų 250 jautienos mėginių buvo 8,4 proc. teigiamų [16].
13
1.2. Escherichia coli bakterijų charakteristika ir poveikis vartotojų sveikatai
E. coli arba žarninės lazdelės priklauso Enterobacteriaceae šeimai. Tai gram neigiamos lazdelių formos bakterijos, kurios yra fakultatyvūs anaerobai. Šios bakterijos yra judrios – turi peritrichinius žiuželius išsidėsčiusius visame ląstelės paviršiuje. E. coli nesudaro nei kapsulių nei sporų, todėl nėra atsparios aplinkos sąlygoms. Optimaliausia augimo temperatūra šioms bakterijoms - 37°C. Natūraliai jų randama visų šiltakraujų gyvūnų, o taip pat ir žmonių virškinamajame trakte (pvz. aklosiose žarnose) [17,18].
E. coli negaminančios toksinų bakterijos nėra patogeniškos žmonėms ir gyvūnams. Jos sudaro apie 0,1 proc. visos žarnyno mikrofloros, tačiau padermės gaminančios toksinus turi įtakos žmogaus sveikatai. Šių bakterijų įvairiomis padermėmis galima užsikrėsti per maistą, dažniausiai gyvūninės kilmės, nes skerdimo metu žarnų turiniu užteršiama skerdena, taip pat geriant užterštą vandenį, kontakto metu su kitu žmogumi arba gyvūnu [19]. E. coli bakterijų padermės gaminančios toksinus yra vadinamos verotoksiną arba šigatoksiną gaminančios, nes gamina ir šigatoksinus ir verotiksinus. Šios bakterijos turi įvairias sero grupes, kurios nustatomos atliekant serotipavimą. Tokios bakterijų padermės sukelia viduriavimą, kartais viduriavimą su krauju, pykinimą, vėmimą. Paprastai inkubacinis periodas yra 3-4 dienos, nepasireiškia karščiavimu. Stiprus apsinuodijimas gali sukelti anemiją arba inkstų nepakankamumą, kuris baigiasi mirtimi. Įvairios E. coli bakterijų padermės taip pat gali sukelti šlapimo takų infekcines ligas. Apie aštuoniems proc. pacientų (jaunesni kaip penkerių metų ir vyresnio amžiaus žmonės yra jautriausi) gali išsivystyti hemolizinis uremijos sindromas, kurio gydymui nėra naudingi antimikrobiniai preparatai. Žmonių mirtingumas nuo hemolizinio uremijos sindromo yra apie 3 – 5 proc. [20]. Dažniausiai ligos protrūkius sukelia E. coli O 157 H:7 serovariantas, tačiau vis dažniau skelbiama apie kitų sero grupių VTEC protrūkius pvz. O104:H4 bakterijos sukeltas protrūkis Vokietijoje 2011 m. [21,22]. Manoma, kad net 50 proc. visų kitų serotipų taip pat sukelia infekcines ligas [18]. Sergamumas E. coli žarnyno infekcijomis Europos Sąjungoje kito nuo 2946 atvejų 2007 metais iki 6457 atvejų 2017 metais (1 pav.).
1 pav. Žmonių sergamumas VTEC infekcijomis 2007 m. - 2017 m. Europoje (Europos ligų prevencijos ir kontrolės centras) [23].
2946 3197 3706 3711
9563
5756 6148 6054 5575 6631 6457
2007 m. 2008 m. 2009 m. 2010 m. 2011 m. 2012 m. 2013 m. 2014 m. 2015 m. 2016 m. 2017 m. Patvirtintų atvejų skaičius (n)
14 Duomenys rodo, kad VTEC žarnyno infekcijos vis dar sukelia nemažai protrūkių. Tačiau taip pat svarbus šių bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. Kuo bakterijos atsparesnės antimikrobinėms medžiagoms, tuo ilgesnė gydymo trukmė, o taip pat atsiranda labai atsparių padermių, kurių nebeveikia antimikrobinės medžiagos, kas nulemia paciento mirtį [21].
1.3. Antibiotikų grupės, bei veikimo mechanizmai
Antibiotikai – tai antimikrobinės medžiagos naudojamos gydant bakterijų sukeltas infekcines ligas. Antibiotikai skirstomi į šias grupes: betalaktaminius, aminoglikozidus, tetraciklinus, amfenikolius, makrolidus, linkozamidus, polimiksinus, chinolonus ir fluorochinolonus, glikopeptidus, rifamicinus, sulfanomidus ir įvairius antibiotikus [24].
Betalaktaminius antibiotikus sudaro penicilinai, cefolosporinai, beta laktamazių inhibitoriai, monobaktamai ir karbapenemai. Visos šios grupės savo cheminėje formulėje turi beta laktaminį žiedą ir yra panašios savo veikimo principu, bakterijų atsparumu, toksiškumu [24]. Šie antibiotikai plačiai naudojami gydymui, nes yra mažiau toksiški nei kiti, todėl bakterijų atsparumas šiems antibiotikams yra labai reikšmingas.
Penicilinai – tai organinės rūgštys jų cheminės struktūros pagrindą sudaro 6-aminopenicilano rūgštis, kuri susideda iš beta laktamo ir tiazolino tarpusavyje sujungtų žiedų, su atvira grandine šone prijungta prie beta laktamo žiedo. Penicilinų grupės antibiotikai skirstomi į: natūralius ir pusiau sintetinius (pagal gavimo būdą), plataus spektro ir atsparius betalaktamazei (pagal veikimo spektrą). Visi penicilinai slopina bakterijų apvalkalėlio (murino) sintezę ir veikia baktericidiškai [24].
Cefolosporinai – tai antibiotikų grupė, kurią sudaro I-os, II-os, III-ios ir IV-os kartos antimikrobinės medžiagos. Šios kartos skiriasi platesniu antibakteriniu veikimo spektru. Šios grupės antibiotikų pagrindą sudaro 7-aminocefalosporano rūgštis, kurią sudaro beta laktaminis ir dihidrotiazono susijungę žiedai. Cefolosporinai, kaip ir penicilinai veikia baktericidiškai, jie bakterijų ląstelių apvalkalėliuose slopina mukopeptidų (reikalingi sudaryti peptidogliukano sluoksniui) sintezę [24].
Beta laktamazių inhibitoriai – tai medžiagos slopinančios beta laktamazių veikla. Beta laktamazės inhibitoriai aktyviausiai veikia ląstelių plazmidėse koduojamas beta laktamazes, silpniau veikia chromosomų gaminamas beta laktamazes. Beta laktamazių inhibitoriai derinami su kitomis antimikrobinėmis medžiagomis norint sustiprinti jų veikimą pvz., klavulano rūgštis derinama su amoksacilinu [24].
15 Monobaktamai – antimikrobinės medžiagos, kurias sudaro tik vienas beta laktaminis žiedas. Veikia baktericidiškai slopindami murino sintezę. Monobaktamai yra atsparūs fermentams beta laktamazėms [24].
Karbapenemai – šie antibiotikai sandarą panašūs į peniciliną. Jų veikimo spektras labai platus, veikia slopindami bakterijų sienelių sintezę. Šios grupės antibiotikai vartojami retai, šiuo metu gydyti gyvūnus jais uždrausta [24]. Karbapenemai turi didžiausią aktyvumo spektrą ir didžiausią veikimą prieš gram teigiamų ir gram neigiamų bakterijų sukeltas infekcijas [25].
Tetraciklinai – sudaryti iš keturių žiedų, gali reaguoti tiek su rūgštimis tiek su bazėmis, žiedų skirtingose vietose prijungiant skirtingus darinius gaunama skirtingų junginių. Tetraciklinai pasižymi plačiu veikimo spektru, veikia mikroorganizmus bakteriostatiškai tiek ląstelės viduje, tiek išorėje [24].
Amfenikolių grupei priklauso chloramfenikolis, florfenikolis ir tiamfenikolis. Visi šie antibiotikai veikia bakterijas bakteriostatiškai, slopindami mikroorganizmų ląstelių baltymų sintezę. Tai plataus veikimo spektro antibiotikai [24].
Chinolonai ir fluorchinolonai. Šių antimikrobinių medžiagų grupei priklauso senesnieji chinolonai ir naujesni chinolonai (fluorchinolonai). Chinolonus sudaro nalidikso, oksolino, pipemido rūgštys ir cinoksacinas. Tai plataus veikimo spektro sintetiniai antibiotikai. Šie antibiotikai pažeidžia girazės veiklą, kuri iš ilgos mikroorganizmo DNR grandinės padaro mažytę spiralę. Taip veikiantys antibiotikai vadinami senaisiais chinolonais [24]. Fluorchinolonai arba naujieji chinolonai savo cheminėje molekulėje turi fluoro. Fluorchinolonai veikia baktericidiškai, slopindami mikroorganizmų DNR replikaciją ir transkripcija [24].
Sulfonamidų grupės antibiotikai skirstomi į trumpai ir greitai veikiančius, vidutinės veikimo trukmės, ilgai veikiančius ir beveik nesirezorbuojančius iš virškinimo trakto. Šiuo metu žinoma apie 150 skirtingų sulfonamidų junginių. Šios grupės antibiotikai dažnai derinami su kitomis vaistinėmis medžiagomis pvz. diamino pirimidinu, nes tokie junginiai veikia sinergetiškai. Sulfonamidai trukdo RNR gamyba, baltymų sinteze ir mikroorganizmų replikacija. Jie veikia plačiu spektru, kai kurias bakterijas baktericidiškai, o kai kurias bakteriostatiškai [24].
1.4. Antibiotikų naudojimas gyvūnams
Antimikrobinės medžiagos yra naudojamos gyvulininkystėje, siekiant išlaikyti gyvulių sveikatingumą ir produktyvumą. Tačiau tai prisideda prie atsparių antimikrobinėms medžiagoms patogeninių ir simbiotinių, pvz. E. coli bakterijų plitimo tiek gyvūnams tiek žmonėms. Gyvūnams, kurie laikomi bandose (kiaulės, broileriai) taikomas bendras antimikrobinių medžiagų skyrimas,
16 todėl antimikrobinių medžiagų sunaudojimas geriamųjų miltelių pavidalų yra daug didesnis, nei skiriamų pavieniams gyvūnams gydyti – tablečių [4].
Danijoje 1999 – 2000 m. siekiant išsaugoti antimikrobinių medžiagų veiksmingumą žmonėms buvo iš pagrindų pakeistas gyvulių auginimas. Jau 1995 m. šalis smarkiai apribojo, kiek veterinarijos gydytojai galėjo parduoti antibiotikų ir tais pačiais metais tapo pirmąja Europos Sąjungos šalimi, kuri sukūrė sistemingą ir nuolatinę antimikrobinių vaistų vartojimo ir atsparumo antimikrobinėms medžiagoms gyvūnų, maisto produktų ir žmonių stebėsenos programą - DANMAP. Bakterijų atsparių antimikrobinėms vaistinėms medžiagoms stebėsena ir įvairios su DANMAP susijusios mokslinių tyrimų veiklos prisidėjo prie kelių antimikrobinių medžiagų naudojimo maisto produktuose apribojimų ar draudimų tiek Danijoje tiek ir kitose Europos Sąjungos šalyse [26].
Atlikus 2010 m. monitoringą apie antimikrobinių medžiagų naudojimo maistiniams gyvūnams nustatyta, kad bendras antimikrobinių medžiagų suvartojimas pasaulyje – 63,151 tonos. Manoma, kad šis kiekis iki 2030 m. padidės 67 proc., šį augimą lems padidėjusi gyvulinių produktų paklausa vidutinių pajamų šalyse ir didelių ūkių skaičiaus padidėjimas, kuriuose įprastai naudojamos antimikrobinės medžiagos [4].
Remiantis duomenimis, apie 80 proc. visų sunaudojamų antibiotikų Jungtinėse Amerikos Valstijose naudojama ne žmonių gydymui. Antibiotikai naudojami maistui skirtiems gyvūnams, tam tikrų ligų gydymui ir prevencijai. Šie vaistai gali sukelti bakterijų, kurių negalima gydyti antibiotikais atsiradimą, ir situacija tik blogėja. Manoma, kad visuotinis antimikrobinių medžiagų naudojimas gyvūnams yra dvigubai didesnis negu žmonėms. Tačiau pagrindiniai veterinarijos sektoriaus duomenys, patvirtinantys šiuos teiginius, yra silpni ir trūksta standartizacijos. Be patikimų įrodymų, kad būtų galima įvertinti pasaulinį antimikrobinių medžiagų vartojimą gyvuliams, ryšys tarp antimikrobinių medžiagų vartojimo ir atsparumo modelių yra menkai įvertintas [4].
Penkios šalys 2010 m., turinčios didžiausią pasauliniu mastu antimikrobinių medžiagų suvartojimą maisto produktų gamyboje, buvo Kinija (23 proc.), Jungtinės Amerikos Valstijos (13 proc.), Brazilija (9 proc.), Indija (3 proc.) ir Vokietija (3 proc.). Tyrime pateikti pasauliniai antimikrobinio vartojimo skaičiavimai yra pagrįsti specifiniais antimikrobinio vartojimo koeficientais, taikomais vienam populiacijos korekcijos vienetui (angl. - PCU). Šio tyrimo duomenimis vidutinė antimikrobinių medžiagų suvartojimo dalis galvijams 45 mg/PCU, broileriams 148 mg/PCU, kiaulėms 172 mg/PCU [4].
Europoje, taip pat matomi dideli kiekiai parduodamų antimikrobinių medžiagų skirtų gyvūnų gydymui. Daugiausiai antimikrobinių medžiagų gyvūnams parduota Ispanijoje (2 pav.)
17 2 pav. Europos vaistų agentūra (angl. - EMA), Europos veterinarinių antimikrobinių medžiagų
vartojimo stebėsena (angl. - ESVAC), [27].
1.5. Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (AAM) – tai procesas, kurio metu bakterijos keičiasi taip, kad sumažintų ar visai panaikintų antibiotikų efektyvumą [1]. Atsparumas antimikrobinėms medžiagoms gali būti natūralus arba įgytas. Bakterijų rūšys, tokios kaip Pseudomonas aeruginosa, turi didelį natūralų atsparumą daugeliui antibiotikų, o kiti paprastai yra labai jautrūs antibiotikams, pvz., A grupės streptokokai [28]. Įgytas atsparumas išsivysto dėl genetiškai modifikuotų mikrobų genomo ar horizontalaus rezistentiškumo genų pernešimo į įvairius mobiliuosius deoksiribonukleorūgšties (DNR) elementus. Atsparumo pasikartojimo dažniai gali labai skirtis priklausomai nuo atsparumo mechanizmo, ir ar organizmas turi mutavusį (vieno geno funkcijos praradimo) fenotipą [28]. Atsparumas paprastai turi biologinę „kaina“ mikroorganizmui, tačiau vyksta greitos mutacijos, kad mikroorganizmas atsistatytų, tai paaiškina kodėl daugumos bakterijų atsparumas populiacijose išlieka. AAM dažnai pasireiškia laipsniškai, todėl svarbu identifikuoti mažo atsparumo organizmus, kurie galėtų būti genetine platforma aukštesnių atsparumo lygių vystymuisi [28].
Savaime replikuojančios mikroorganizmų plazmidės, profagai, transpozonai, integronai - tai DNR elementai, kurie dažnai perneša rezistentiškus genus į jautrius mikroorganizmus. Šie elementai bakterijai prideda DNR ir jų integracijai į genomą naudoja būdingas rekombinacijas. Tačiau atsparumas taip pat gali atsirasti dėl homologinių rekombinacijų, kurios sudaro
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 2015 m. 2016 m.
18 mozaikinius genus, kur kiekviena geno dalis atsiranda iš skirtingo mikroorganizmo. Antimikrobinių medžiagų naudojimas leido sužinoti apie įvairius genetinius mechanizmus, kurie yra atsakingi už mikroorganizmų vystymąsi [28].
Įgytas atsparumas antibiotikams atsiranda arba dėl mutacijų arba horizontalaus genų pernešimo. Kiekvienai antibiotikų klasei paprastai yra keletas mechanizmų, kurie gali sukelti atsparumą. Šie mechanizmai taip pat gali skirtis priklausomai nuo bakterijų rūšių ir jų genetinės sudėties. Pagrindiniai atsparumo mechanizmai yra: sumažėjęs vaisto įsisavinimas, padidėjęs vaistinės medžiagos eksportavimas iš ląstelės vidaus, vaisto paskirties inaktyvacija arba modifikavimas, naujo vaistinio preparato atsparumo atsiradimas arba kiti šalutiniai mechanizmai, antibiotiko hidrolizė veikiant fermentams, antibiotiko modifikavimas veikiant fermentams [28].
Mutacijų dažnumas, dėl kurių atsiranda rezistentiškumas yra labai skirtingas. Tai priklauso nuo mechanizmo, kuris sukelia atsparumą. Jei vieno geno inaktyvavimas gali sukelti atsparumą, atsparumo išsivystymo dažnumas yra daug didesnis nei tuo atveju, kai genas turi būti konkrečiai modifikuotas, kad būtų išsaugotas atsparių baltymų kodas, kurio aktyvumas normalus [28].
1.5.1. E. coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Remiantis moksline literatūra, E. coli bakterijos turi natūralų atsparumą vankomicinui [29]. Iš sergančių žmonių išskirtos E. coli bakterijos dažniausiai būna atsparios ampicilinui, amoksiklavui, ciprofloksacinui, o rečiau atsparios nitrofurantoinui [30]. Analizuojant E. coli bakterijas išskirtas iš įvairių maisto produktų, matoma, kad šios dažnai atsparios ampicilinui, amoksacilinui, tetraciklinui, trimoksazolui, streptomicinui, ciprofloksacinui, rečiau cefotaksimui ir gentamicinui, chloramfenikoliui ir amoksiklavui. E. coli bakterijų atsparių imipenemui, tigeciklinui ir kolistinui šių tyrimų metu nenustatyta [31].
Analizuojant E. coli bakterijų atsparumą antibiotikams, išskirtų iš infekuotų žmonių, matoma, kad atsparumas antimikrobinėms medžiagoms pastaraisiais metais keitėsi labai įvairiai. Didžiausias E. coli bakterijų atsparumas nustatytas aminopenicilinams. Išskirtų bakterijų atsparių aminopenicilinams 2014 m., 2016 m., ir 2017 m. buvo vienodai – po 57,8 proc, o 2015 m. – 59,6 proc. Minėtu laikotarpiu atsparumas fluorchinolonams kiekvienais metais didėjo. Palyginus 2014 m. su 2017 m. atsparių bakterijų kiekis šiam antibiotikui padidėjo – 12,4 proc. Taip pat matomas didelis atsparių bakterijų skaičiaus padidėjimas 3-ios kartos cefolosporinams, palyginus 2014 m. ir 2017 m. bakterijų atsparumas šiems antibiotikams nustatytas – 8,7 proc. dažniau. Tyrimo metų laikotarpyje matomas atsparumo sumažėjimas aminoglikozidų grupės antibiotikams, nuo 2014 m. iki 2017 m. atsparių bakterijų sumažėjo – 2,3 proc. E. coli bakterijų pasižyminčiu dauginiu atsparumu (atsparios 3-ios kartos cefalosporinams, fluorchinolonams, aminoglikozidams)
19 atsparumas kito pamečiui, 2014 m. ir 2016 m. jų nustatyta – po 2,6 proc., 2015 m. – 4,3 proc., 2017 m. – 4,4 proc.
3 pav. E. coli bakterijų išskirtų iš žmonių atsparumas procentais įvairiems antibiotikams Lietuvoje 2015 m. – 2017 m. laikotarpyje (ECDC),[32].
Analizuojant Europos maisto saugos tarnybos (EFSA) surinktus duomenis 2017 m., apie E. coli bakterijų išskirtų iš kiaulių atsparumą antimikrobinėms medžiagoms matoma, kad Lietuva viršija Europos Sąjungos vidurkį dėl atsparumo kolistinui (COL) - 0,7 proc. ir gentamicinui (GEN) - 1,3 proc. Didžiausias atsparumas išskirtų E. coli iš kiaulių bakterijų Lietuvoje: tetraciklinui (TET) – 45,5 proc., ampicilinui (AMP) – 28,3 proc., ir sulfametoksazolui (SMX) - 26,3 proc. Lietuvoje atsparių E. coli bakterijų azitromicinui (AZI), cefotaksimui (FOT) ir ceftazidimui (TAZ) nenustatyta.
4 pav. E. coli bakterijų išskirtų iš penimų kiaulių atsparumas antimikrobinėms medžiagoms (EFSA), [33].
0 10 20 30 40 50 60 70
Aminopenicilinai Fluorchinolonai 3-ios kartos cefalosporinai Aminogliukozidai Dauginis atsparumas 2017 m. 2016 m. 2015 m. 2014 m. 28% 0% 0% 0% 8% 0% 1% 4% 4% 26% 46% 21% 39% 2% 0% 1% 18% 11% 0% 3% 6% 42% 52% 32% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP FOT CHL COL NAL TET Lietuva ES
20 E. coli bakterijos 2016 m. išskirtos iš viščiukų broilerių Lietuvoje atspariausios ampicilinui (AMP) – 100 proc., ciprofloksacinui (CIP) – 92 proc., sulfametoksazolui (SMX) – 91 proc., nalidikso rūgščiai (NAL) – 80 proc., trimetoprimui (TMP) – 73 proc., tetraciklinui (TET) – 68 proc. Lietuvoje aptikta nemažai E. coli bakterijų išskirtų iš broilerių atsparių cefotaksimui (FOT) ir ceftazidimui (TAZ) - po 52 proc. E. coli išskirtų iš viščiukų broilerių atsparių kolistinui (COL) nenustatyta.
5 pav. E. coli bakterijų išskirtų iš viščiukų broilerių atsparumas įvairioms antimikrobinėms medžiagoms, 2016 m. (EFSA), [34].
Palyginus E. coli bakterijų išskirtų iš kiaulių 2017 m. ir viščiukų broilerių 2016 m. atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, matoma, kad E. coli bakterijos išskirtos iš broilerių pasižymi didesniu atsparumu daugumai antimikrobinių medžiagų, nei išskirtos iš kiaulių. Tačiau, iš kiaulių išskirtos E. coli turėjo atsparumą kolistinui (COL) – 1 proc.
6 pav. E. coli bakterijų išskirtų iš kiaulių ir broilerių Lietuvoje atsparumo antimikrobinėms medžiagoms palyginimas (Europos Sąjungos maisto saugos tarnyba (EFSA), [33,34].
100% 3% 52% 52% 47% 92% 0% 35% 80% 91% 68% 73% 58% 4% 4% 4% 17% 64% 2% 9% 60% 50% 47% 41% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP AZI FOT TAZ CHL CIP COL GEN NAL SMX TET TMP Lietuva ES 28% 0% 0% 0% 8% 10% 1% 4% 4% 26% 46% 21% 100% 3% 52% 52% 47% 92% 0% 35% 80% 91% 68% 73% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% AMP FOT CHL COL NAL TET Kiaulės Broileriai
21
1.6. E. coli bakterijų gaminami fermentai
Gram neigiamos bakterijos gali gaminti fermentus, kurie padeda bakterijoms išlikti net gydant antibiotikais. Dažniausiai tai - beta laktamazės (β-laktamazės), kurios yra pagrindinė atsparumo beta laktaminiams antibiotikams priežastis. Išplėstinio spektro beta laktamazės (ESBL) Europoje aptinkamos vis dažniau nuo pat jų pirmojo apibūdinimo 1983 m. Šiuo metu dažniausiai ESBL aptinkamos E. coli bakterijose, kurios sukelia įvairias infekcijas žmonėms [35].
Pastaraisiais metais padažnėjo ir plačiai paplito beta laktamazės fermentų, kurie hidrolizuoja ir sukelia atsparumą cefalosporinams ir aztreonamui. Dauguma ESBL yra kilusios iš plačiai paplitusių plataus spektro beta laktamazių - TEM-1 ir SHV-1. Taip pat yra naujų ESBL įskaitant CTX-M ir OXA tipo fermentus. ESBL yra plačiai paplitusios visame pasaulyje, o dabar kai kuriose šalyse pastebima didelė E. coli ir K. pneumoniae produkuojančių ESBL padermių dalis. Šios beta laktamazės dabar aptinkamos kitose Enterobacteriaceae genties bakterijose, o taip pat P. aeruginosa bakterijose. Šias beta laktamazes produkuojančios padermės sukurs daugybę gydomųjų uždavinių 21-ajame amžiuje [36].
Bakterijose dėl atsparių genų pernešimo plazmidėse kyla genetiniai pokyčiai atsiradę dėl mutacijų ir dėl genų rekombinacijos. Vienas iš pavyzdžių yra labai dažna TEM beta - laktamazė, kuri yra užkoduota bla geno. TEM beta- laktamazė veiksmingai hidrolizuoja beta laktaminius antibiotikus, tokius kaip benzilpenicilinas ir ampicilinas, tačiau jis gali sugebėti hidrolizuoti ir trečios kartos cefalosporinus, Išplėstinio spektro beta - laktamazės atsirado ne tik iš TEM, bet ir iš SHV tipo beta laktamazių [8].
Žmonių medicinoje, karbapenemai yra viena iš paskutinių gydymo būdų sunkioms infekcijoms, kurias sukelia daugeliui antibiotikų atsparios gram neigiamos bakterijos [35]. Todėl vis daugiau pranešimų, kuriuose aprašoma karbapenemazes gaminančios Enterobacteriaceae genties bakterijos kelia nerimą. Per pastaruosius šešerius metus tapo akivaizdu, kad karbapenemazes produkuojančių bakterijų atsiradimas nebėra apribotas klinikiniais rodikliais. Visame pasaulyje iš aplinkos, laukinių paukščių ir gyvūnų kompanionų bei maistinių gyvūnų buvo išskirta daugiau karbapenemazes produkuojančių bakterijų [35].
Nuo 2009 m. rugpjūčio 17–30 d. buvo atliktas perspektyvus stebėjimo tyrimas 4 ligoninėse pietinėje Nyderlandų dalyje. Tyrimui buvo naudojamos atsitiktinai parinktos mėsos pakuotės iš pagrindinių parduotuvių. Tyrime buvo vertinamos bakterijų paplitimas ir atliekamas fenotipinis ESBL patvirtinimas. Tyrimo rezultatai atskleidė, kad E. coli bakterijos turinčios ESBL geną dažnai aptinkamos vištienoje [37]. Tyrimo rezultatai pateikti 7- oje lentelėje.
22 7 lentelė. Nyderlanduose atlikto tyrimo duomenys
Mėginio tipas Skaičius, vnt.
Aptiktas
ESBL genas ESBL E. coli
ESBL Klebsiella spp. Kitos ESBL produkuojančios bakterijos Vištiena 89 71 68 6 4 Jautiena 85 4 4 Kiauliena 57 2 2
Mišri / malta mėsa 22 1 1
Kita 9 1 1
Iš tyrimo duomenų, matome, kad E. coli bakterijos turinčios ESBL genus dažnai aptinkamos mėsoje. Panašių tyrimų atlikta ir kitose Europos šalyse. Doi et al. pranešė, kad 67 proc. mažmeninės mėsos mėginių Sevilijoje, Ispanijoje, turėjo ESBL tipo atsparumo genus [38]. Jungtinėje Karalystėje atliktas importuotų žaliavinių viščiukų tyrimo metu nustatyta, kad 10-yje iš 27-ių tirtų mėginių buvo aptikta bakterijų turinčių ESBL genus [39]. Autoriai padarė išvadą, kad bakterijos turinčios ESBL genus, mėsoje kelia potencialų pavojų vartotojų sveikatai.
Bakterijų gaminamos AmpC beta laktamazės yra kliniškai svarbios cefalosporinazės, koduotos daugelio Enterobacteriaceae genties bakterijų ir kai kurių kitų organizmų chromosomose, kur jos skatina atsparumą cefalotinui, cefazolinui, cefoksitinui, daugumai penicilinų ir beta laktamazės inhibitorių. Gram-neigiamų bakterijų atsparumas antibiotikams yra puikus pavyzdys, kaip bakterijos gali įsigyti, palaikyti ir išreikšti naują genetinę informaciją, kuri gali suteikti atsparumą vienam ar keliems antibiotikams [40].
AmpC beta laktamazių klinikinė reikšmė yra ta, kad suteikia atsparumą tiek siauro, tiek plataus spektro veikimo cefalosporinams, beta laktamazės inhibitoriams ir aztreonamui. AmpC beta laktamazės gali būti chromosomose arba plazmidėse. Plazmidėse esančios AmpC beta laktamazės hidrolizuoja visus beta laktaminius antibiotikus, išskyrus cefepimą ir karbapenemus. Plazmidėmis perduodami AmpC genai yra gauti iš indukuojamų chromosomų genų, kurie buvo perduodami tarp įvairių organizmų. Šie judantys plazmidiniai fermentai suteikia rezistencinį modelį, panašų į chromosomų AmpC beta laktamazių perprodukciją [40].
Analizuojant Europos Sąjungos maisto saugos tarnybos (EFSA) surinktus duomenis apie ESBL ir AmpC fermentus gaminančių E. coli bakterijų paplitimą, matome, kad Europos Sąjungoje (ES) jos dažnai aptinkamos maistui auginamuose gyvūnuose. 2016 m. duomenimis ESBL gaminančių E. coli bakterijų Lietuvoje aptikta – 30 proc. tirtuose broilerių aklųjų žarnų mėginiuose, o AmpC produkuojančių E. coli bakterijų – 67,3 proc. Kiaulių aklųjų žarnų mėginiuose aptikta – 11,5 proc. ESBL produkuojančių E. coli bakterijų, o AmpC produkuojančių
23 E. coli bakterijų – 37,9 proc. Iš šių duomenų matoma, kad Lietuvoje ESBL ir AmpC produkuojančių E. coli bakterijų dažniau aptinkama broileriuose, nei kiaulėse, o dažniausiai aptinkamas bakterijų fenotipas – AmpC.
8 pav. ESBL ir AmpC bakterijų paplitimas procentais kiaulėse 2017 m. ir broileriuose 2016 m. (EFSA), [32,33]. 35% 30% 24% 67% 34% 12% 11% 38% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% ES Lietuva ESBL (broileriai) AmpC (broileriai) ESBL (kiaulės) AmpC (kiaulės)
24
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
Tiriamasis darbas atliktas 2015 – 2018 m. Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Bakteriologinių tyrimų skyriuje. Tyrimo metu šviežios ar atšaldytos mėsos mėginiai, surinkti iš įvairių mažmeninės prekybos vietų (parduotuvių, turgų) įvairiuose Lietuvos miestuose. Mėginiai į laboratoriją buvo pristatomi periodiškai:
2015 m. 150 vnt. jautienos ir 150 vnt. kiaulienos mėsos mėginių 2016 m. 150 vnt. vištienos mėginių
2017 m. 150 vnt. jautienos ir kiaulienos mėsos mėginių 2018 m. 150 vnt. vištienos mėginių
Šiuose mėginiuose kryptingai buvo ieškomos E. coli bakterijos produkuojančios ESBL ir AmpC fermentus, pagal Europos Sąjungos bakterijų atsparumo antibiotikams referentinės laboratorijos gaires (EURL-AR, Danija). Aptikus mėginiuose šias bakterijas, ir jas identifikavus, pagal biocheminius testus, buvo atliekamas antimikrobinių medžiagų jautrumo testas minimalios inhibicinės koncentracijos nustatymo būdų - MIK (MIC - ang. – Minimum inhibitory concentration), naudojant komerciškai pagamintas sensititro (ang. Sensititre) plokšteles – EUVSEC ir EUVSEC 2 (Thermo fisher scientific). Darbo metų įvetintas E. coli bakterijų atsparumas šiems antibiotikams EUVSEC plokštelėje: sulfametoksazolui (SMX), trimetoprimui (TMP), ciprofloksacinui (CIP), tetraciklinui (TET), meropenemui (MEM), azitromicinui (AZI), nalidikso rūgščiai (NAL), cefotoksimui (FOT), chloramfenikoliui (CHL), tigeciklinui (TGC), ceftazidimui (TAZ), kolistinui (COL), ampicilinui (AMP), gentamicinui (GEN).
Antroje naudotoje plokštelėje (EUVSEC 2) buvo vertinamas bakterijų fenotipas, pagal bakterijų atsparumą cefoksitinui (FOX), ertapenemui (ETP), imipenemui (IMI), meropenemui (MERO), ceftazidimui (TAZ), cefepimui (FEP), cefotaksimui (FOT) ir temocilinui (TRM). Nustatant bakterijų fenotipą buvo įvertinama sinergistinis veikimas - cefotoksimo su klavulano rūgštimi (F/C) ir ceftazidimo su klavulano rūgštimi (T/C), Tyrimų duomenys analizuoti Microsoft Excel ir SPSS programomis. Tyrimo metodo schema pavaizduota 9 pav.
9 pav. Tyrimo metodo schema. 1. Pirminis mėginio pasėlis 2. Selektyvus mėginio pasėlis 3. Gautų bakterijų kultūrų identifikavimas 4. Bakterijų jautrumo antibiotikams testo atlikimas 5. Rezultatų vertinimas
25
2.1. ESBL ir AmpC produkuojančių E. coli aptikimas šviežioje ir atšaldytoje
mėsoje
Tyrimas atliktas pagal standartinę darbo procedūrą (SDP) 5.4.4.B.61 – „ESBL ir AmpC produkuojančių E. coli išskyrimas patologinėje, klinikinėje medžiagoje ir maisto produktuose“ naudojama Nacionalinio maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute, Bakteriologinių tyrimų skyriuje. Ši procedūra paruošta, pagal Europos Sąjungos antimikrobinio atsparumo referentinės laboratorijos gaires.
Nuo gauto mėginio paviršiaus steriliu skalpeliu ar žirklėmis atsveriama 25±0,5 g mėsos mėginio į sterilų homogenizavimo maišelį ir užpilama 225 ml buferinio peptono vandens (BPV), (XOID). Mėginiai inkubuojami +37±1°C temperatūroje, 18–22 val, neselektyviam pagausinimui. Po inkubavimo, atsargiai sumaišius bakterijų suspensiją, 10 µl kilpele inokuliuojamas MacConkey agaras (OXOID) su cefotaksimu (OXOID), gryninimo būdu. Užsėtos Petri lėkštelės inkubuojamos 18–22 val., +44±1°C temperatūroje. Po inkubavimo bakterijų identifikavimas pagrįstas išaugusių kolonijų morfologija. Įtariamos ESBL/AmpC produkuojančios E. coli MacConkey agare su FOT auga purpurinės/raudonos spalvos kolonijomis. Vienkartine kilpele imamos trys atskiros būdingos kolonijos ir sėjamos gryninimo būdu ar sektoriais MacConkey agare su FOT. Petri lėkštelės inkubuojamos +37±1°C temperatūroje, 18–22 val. Po inkubavimo E. coli bakterijos identifikuojamos morfologiniais ir biocheminiais tyrimo metodais (10 lentelė), nes purpurinės/raudonos spalvos MacConkey agare su FOT gali augti ir kitos bakterijų rūšys.
10 lentelė. E. coli bakterijų identifikavimas remiantis biocheminių savybių įvertinimu
B akt er ij ų r ūši s Judr u m as G li uko zė s fe rm ent ac ij a Sacha rozė s fer m en tac ij a Lakt oz ės f er m ent aci ja Ma ni to li o fe rm ent ac ij a C it rat o fe rm ent ac ij a Indol o ga m yb a Šla pa lo s kai dym as A ce ta to įsi sa vi ni m as H2 S gam yb a V P te st as MR te st as E. col i įv. dr įv. r dr – + – + – – +
Paaiškinimai: „d“ – dujų susidarymas, „r“ – rūgščių susidarymas, „+“ – teigiama reakcija daugiau kaip 90 proc., „–“ – neigiama reakcija, „įv.“ – rezultatas gali būti įvairus.
2.1. E. coli bakterijų antimikrobinio atsparumo nustatymas
Iš atgaivintų bakterijų kultūrų t. y. - nuo kraujo agaro (Liofilchem), po inkubavimo termostate (18–24 val.), kilpele paimamos kelios atskiros bakterijų kolonijos ir steriliai
26 perkeliamos į mėgintuvėlį su fiziologiniu tirpalu (2 ml, Biomerieux). Mėgintuvėlis uždaromas ir supurtomas purtyklėje. Densitometru matuojamas bakterijų drumstumas, kuris turi atitikti 0,5 McFarland drumstumo standartą. Iš viso 50 µl paruoštos 0,5 McFarland drumstumo bakterijų suspensijos vienkanale pipete su ilgu antgaliu, steriliai perkeliama į 11 ml Mueller–Hinton buljoną su TES buferiu (2- [Tris (hidroksimetil) -metilamino] -etansulfonrūgšties fiziologinis buferis, (Thermo fisher scientific). Mėgintuvėlis užsukamas ir lengvai pavartomas 8–10 kartų, kad inokuliatas gerai susimaišytų. Sekančiame etape, į sterilų lovelį supilama paruošta bakterijų suspensija. Nukerpamas vienas sterilios plokštelės („EUVSEC“, „EUVSEC2“, Thermo Fisher Scientific) pakuotės kraštas ir išimta plokštelė inokuliuojama aštuonkanale pipete. Svarbu, kad darbo metu pipetės antgaliai nepaliestų duobučių dugne esančių antimikrobinių medžiagų (AM) paviršiaus. Po procedūros plokštelės paviršius uždengiamas lipnia plėvele. Vengiama plėvelės raukšlių, nes tai gali įtakoti reakcijas bei galutinį testo rezultatą. Paruoštos plokštelės inkubuojamos termostate, +35±1°C temperatūroje, (16–20) val., Plokštelės viena ant kitos gali būti sudėtos daugiausia po 3 vnt. Norint išvengti bakterijų augimo skystoje terpėje, laikas nuo bakterijų suspensijos paruošimo iki plokštelių inkubavimo neturi viršyti daugiau nei 30 min.
Po inkubavimo, ant specialaus stovo, dedama plokštelė (su plėvele) taip, kad plokštelės šone esančios raidės (A–H) būtų kairėje pusėje, o skaičiai (1–12) – viršuje. Bakterijų augimas stebimas, pasikeitus drumstumui duobutėse ar atsiradus nuosėdoms duobučių dugne. MIK vertinimas – mažiausia AM koncentracija, stabdanti bakterijų augimą (vertinama konkrečios AM mažiausia koncentracija, kurioje nėra bakterijų augimo).
Pirmiausia įvertinamos bakterijų augimo kontrolės duobutės (teigiama/neigiama kontrolė). Jei „neigiama“ kontrolės duobutė nestabdo augimo, ar „teigiamoje“ kontrolės duobutėje nėra bakterijų augimo, tyrimų rezultatai nevertinami. Taip pat rezultatai nevertinami, jei visoje plokštelėje ar konkrečioje plokštelės duobutėje, jeigu:
•Labai silpnas bakterijų augimas plokštelėje ar teigiamos kontrolės duobutėje.
•Skirtingo dydžio bakterijų nuosėdų debesėliai duobučių eilėje (išskyrus beta laktaminius antibiotikus).
•Susidariusios nuosėdos išsitaškę (visoje plokštelėje ar tik galutinėje duobutėje, tačiau tai yra būdinga beta laktaminiams antibiotikams).
•Nėra nuosėdų, o matomas difuzinis bakterijų augimas galutinėje duobutėje (debesėlis). •Daugiau nei vienas „šuolis“ duobutėse (tarša).
•Tamsūs apskritimai duobutėje (per mažas suspensijos kiekis).
•Galutinėje plokštelės duobutėje nuosėdų yra tik mažas taškelis (ignoruoti tik E. coli – būdinga chloramfenikoliui ar florfenikoliui).
27 •Bakterijų augimas duobutėje < 20 proc. (būdingas augimas trimetoprimui, sulfonamidams
ir jų junginiams), lyginant su teigiama kontrole.
Pastaba: Leistinas nuokrypis MIK vertinimui yra +/– vienas AM koncentracijos laipsnis / praskiedimas (+/– viena plokštelės duobutė).
Patvirtinamuosiuose ESBL ir/ar AmpC fermentų produkavimo testuose vertinamas cefotaksimo (FOT) ir ceftazidimo (TAZ) antimikrobinis rezistentiškumas atskirai ir junginyje su beta laktamazės inhibitoriumi – klavulano rūgštimi (C). Sinerginis poveikis nustatomas, kai sumažėja AM MIK koncentracija junginyje su klavulano rūgštimi, lyginanti su AM MIK koncentracija atskirai be klavulano rūgšties. Skirtumas turi būti ne mažesnis nei 3 skiedimai. Cefotaksimas/cefotaksimas + klavulano rūgštis ir/ar ceftazidimas/ceftazidimas + klavulano rūgštis santykis turi būti ne mažesnis nei 8 AM koncentracijos laipsniai. Sinergija rodo ESBL produkavimą. AmpC-tipo beta laktamazių nustatymas gali būti atliekamas, tiriant bakterijų atsparumą cefoksitinui (FOX). Atsparumas cefoksitinui rodo AmpC-tipo beta laktamazių produkavimą. Fenotipinių rezultatų klasifikavimas atliekamas pagal EFSA rekomendacijas. Galimi E. coli bakterijų fenotipai pateikti 11-oje lentelėje.
11 lentelė. E. coli bakterijų fenotipai
Fenotipas Būdingas atsparumas
ESBL
FOT ir TAZ > 1 mg/L MERO ≤ 0,12 mg/L FOX ≤ 8 mg/L
Teigiama sinergija (F/C ir/ar T/C)
AmpC
FOT ir TAZ > 1 mg/L MERO ≤ 0,12 mg/L FOX > 8 mg/L
Neigiama sinergija (F/C ir T/C)
(Neatmetama ESBL produkavimo galimybė) ESBL+AmpC
FOT ir TAZ > 1 mg/L MERO ≤ 0,12 mg/L FOX > 8 mg/L
Teigiama sinergija (F/C ir/ar T/C)
E. coli bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms vertinamas, pagal Europos antimikrobinio rezistentiškumo komiteto – EUCAST (angl. The European Committe on Antimicrobial Susceptibility Testing) nustatytas epidemiologines lūžio taško reikšmes – ECOFF (angl. Epidemiological cut-off values), (12 ir 13 lentelės).
28 12 lentelė. Skirtingų antimikrobinių medžiagų epidemiologinės lūžio taško reikšmės E. coli bakterijoms EUVSEC plokštelėje.
Antimikrobinė medžiaga ECOFF vertė Koncentracija (mg/L) plokštelėje Sulfametoksazolas (SMX) >64 8-1024 Trimetoprimas (TMP) >2 0,25-32 Ciprofloksacinas (CIP) >0,064 0,015-8 Tetraciklinas (TET) >8 2-64 Meropenemas (MERO) >0,125 0,03-16 Azitromicinas (AZI) >16 2-64
Nalidikso rūgštis (NAL) >16 4-128
Cefotaksimas (FOT) >0,25 0,25-4 Chloramfenikolis (CHL) >16 8-128 Tigeciklinas (TGC) >1 0,25-8 Ceftazidimas (TAZ) >0,5 0,5-8 Kolistinas (COL) >2 1-16 Ampicilinas (AMP) >8 1-64 Gentamicinas (GEN) >2 0,5-32
13 lentelė. Skirtingų antimikrobinių medžiagų epidemiologines lūžio taško reikšmės E. coli bakterijoms EUVSEC2 plokštelėje.
Antimikrobinė medžiaga ECOFF vertė Koncentracija (mg/L) plokštelėje
Cefoksitinas (FOX) >8 0,5-64 Ertapenemas (ETP) >0,06 0,015-2 Imipenemas (IMI) >0,5 0,12-16 Meropenemas (MERO) >0,125 0,03-16 Ceftazidimas (TAZ) >0,5 0,25-128 Cefepimas (FEP) >0,125 0,06-32 Cefotaksimas su klavulano rūgštimi (C/T) >0,25 0,06-64 Ceftazidimas su klavulano rūgštimi (F/C) >0,5 0,12-128 Cefotaksimas (FOT) >0,25 0,25-64 Temocilinas (TRM) >32 0,5-128
2.3. Statistinė analizė
Tiriamojo darbo rezultatai apskaičiuoti ir pateikti naudojant Microsoft Excel programą bei standartinį duomenų analizės programinį paketą SPSS. Atlikta suderinamumo kriterijaus statistinė analizė (Chi kvadratas). Apskaičiuotas diskretusis kintamasis, iš pradžių apskaičiuojant imties reikšmių (kategorijų dažnius). Norint įsitikinti, kad dažniai lyginamose grupėse skiriasi statistiškai reikšmingai, apskaičiuota kriterijaus P reikšmė. Nustatyti skirtumai laikomi statistiškai reikšmingais, jei P< (mažesnė) už pasirinktą reikšmingumo lygmenį 0,05.
29
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1. ESBL/AmpC paplitimas skirtingose mėsos rūšyse
Atlikus tyrimą nustatėme, kad 2015 m. ištirtuose 150 vnt. kiaulienos ir 150 vnt. jautienos mėginiuose fermentus produkuojančios E. coli buvo nustatytos 28 mėginiuose (9,3 proc.). Fermentus produkuojančių E. coli bakterijų aptikta – 12 jautienos mėginių (8 proc.), 16 kiaulienos mėginių (10,7 proc.). Atitinkamai 2017 m. ištirtuose 150 vnt. kiaulienos ir 150 vnt. jautienos mėginiuose fermentus produkuojančių E. coli bakterijų nustatyta 5 mėginiuose (1,6 proc.), jautienos - dvejuose mėginiuose (1,3 proc.) ir trijuose kiaulienos mėginiuose (2 proc.).
Įvertinus fermentus produkuojančių E. coli bakterijų paplitimą vištienoje nustatėme, kad 2016 m. ištirtuose 150 vnt. vištienos mėginių fermentus produkuojančios E. coli bakterijos buvo aptiktos net 94 mėginiuose (62,6 proc.). Analogiški rezultatai buvo patvirtinti įvertinus ir 2018 m. ištirtus 150 vnt. vištienos mėginius ESBL/AmpC fermentus produkuojančių E. coli bakterijų aptikta 93 mėginiuose (62 proc.).
2015 m. teigiamų fermentus produkuojančių E. coli bakterijų kiaulienoje buvo aptiktos beveik 5 kartus dažniau negu 2017 m. (P>0,05). Panašūs rezultatai buvo patvirtinti ir dėl E. coli bakterijų paplitimo jautienoje kuomet bakterijos buvo aptiktos beveik 6 kartus dažniau negu 2017 metais (P>0,05). 2016 metais ir 2018 metais vištienoje teigiamų fermentus gaminančių E. coli bakterijų paplitimas statistiškai reikšmingai nesiskyrė (P<0,05) (14 pav.).
14 pav. ESBL/AmpC fermentus produkuojančios E. coli paplitimas įvairių rūšių mėsos mėginiuose. 9% 8% 63% 2% 1% 62% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70%
Kiauliena Jautiena Vištiena
2015 m. 2016 m. 2017 m. 2018 m.
30
3.2. Išskirtų E. coli bakterijų fenotipinis charakterizavimas
Analizuojant išskirtas iš mėginių fementus produkuojančias E. coli, pagal jų fenotipą matoma, kad dažniausiai (priklausomai nuo tyrimo laikotarpio) Lietuvoje išskirtos bakterijos yra ESBL fenotipo, bei AmpC fenotipo, rečiausiai aptinkamas E. coli ESBL+AmpC fenotipas (15 pav.)
15 pav. E. coli išskirtų iš kiaulienos, jautienos bei vištienos fenotipinis charakterizavimas.
3.3. Išskirtų bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Išskirtų E. coli bakterijų antimikrobinio atsparumo testo rezultatai pateikti 16-oje lentelėje.
16 lentelė. Išskirtų ESBL E. coli bakterijų atsparumas skirtingoms medžiagoms, EUVSEC plokštelė.
AM a
Kiauliena b Jautiena b Vištiena b
2015 2017 2015 2017 2016 2018 R c S c R S R S R S R S R S SMX 11/68,8 5/31,2 2/66,7 1/33,3 12/100 0/0 2/100 0/0 82/87,2 12/12,8 78/83,9 15/16,1 TMP 10/62,5 6/37,5 2/66,7 33,3 7/58,3 5/41,7 1/50 1/50 64/68,1 30/31,9 65/69,9 28/30,1 CIP 7/43,8 9/56,2 1/33,3 2/66,7 4/33,3 8/66,7 0/0 2/100 85/90,4 9/9,6 80/86 13/14 TET 14/87,5 2/12,5 3/100 0/0 8/66,7 4/33,3 2/100 0/0 74/78,7 20/21,3 65/69,9 28/30,1 MERO 0/0 16/100 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 0/0 94/100 0/0 93/100 AZI 1/6,2 15/93, 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 4/4,3 90/95,7 6/6,5 87/93,5 NAL 5/31,2 11/68,8 0/0 3/100 2/16,7 10/83,3 0/0 2/100 67/71,3 27/28,7 61/65,6 32/34,4 TGC 0/0 16/100 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 0/0 94/100 0/0 93/100 CHL 7/43,8 9/56,2 2/66,7 1/33,3 5/41,7 7/58,3 1/50 1/50 38/40,4 56/59,6 33/35,5 60/64,5 COL 1/6,2 15/93,8 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 0/0 94/100 0/0 93/100 FOT 16/100 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 0/0 94/100 0/0 93/100 0/0 TAZ 16/100 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 0/0 93/93,8 1/1,1 91/97,8 2/2,2 AMP 16/100 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/100 0/0 94/100 0/0 93/100 0/0 GEN 4/25 12/75 0/0 3/100 4/33,3 8/66,7 0/0 2/100 24/25,5 70/74,5 13/14 80/86 Paaiškinimai: a
– antimikrobinė medžiaga; b - E. coli padermių skaičius/procentai; SMX – sulfametoksazolas; TMP – trimetoprimas, CIP – ciprofloksacinas, TET – tetraciklinas, MERO – meropenemas, AZI – azitromicinas, NAL – nalidikso rūgštis, CHL – chloramfenilolis, TGC – tigeciklinas, COL – kolistinas, FOT – cefotaksimas, TAZ – ceftazidimas, AMP – ampicilinas, GEN – gentamicinas; c-R (atsparios), S (jautrios).
86% 14% 0% 40% 59% 1% 60% 40% 0% 58% 41% 1% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
ESBL AmpC ESBL+AmpC
2015 m. 2016 m. 2017 m. 2018 m.
31 17 lentelė. Išskirtų ESBL E. coli bakterijų atsparumas skirtingoms medžiagoms, EUVSEC2 plokštelė.
AM a
Kiauliena b Jautiena b Vištiena b 2015 2017 2015 2017 2016 2018 Rc Sc Rc Sc Rc Sc Rc Sc Rc Sc Rc Sc FOX 3/18,7 13/ 81,3 0/0 3/100. 1/8,3 11 / 91,7 2/100 0/0 56 / 59,6 38 / 40,4 39 / 41,9 54 / 58,1 ETP 1 / 6,2 15 / 93,8 0 / 0 3/100 0/0 12 / 100 0/0 2/ 100 6/6,4 88/ 93,6 4/4,3 89/ 95,7 IMI 0/0. 16/ 100 0/ 0 3 /100 0/0 12/ 100. 0/0 2/ 100 94/ 100 p. 0/0 93/ 100. 0/0 MERO 0/0 16/ 100 0/ 0 3 /100 0/0 12/ 100 0/0 2/ 100 94/100 0/0 93/ 100 0/0 FEP 16/ 100 0/0 3/100 0/0 11/ 91,7 1/8,3 1/ 50 1/ 50 80/ 85,1 14/ 14,9 80/86 13/14 FOT 16/ 100 0/0 3/100 0/0 12/ 100 0/0 2/ 100 0/0 94/100 0/0 93/ 100 0/0 TAZ 16/100 0/0 3/100 0/0 12/100 0/0 2/ 100 0/0 93/ 93,8 1/1,1 91/ 97,8 2/2,2 TRM 0/0 16/100 0/ 0 3 /100 0/0 12/ 100 0/0 2/ 100 94/ 100 0/0 93/ 100 0/0
Paaiškinimai:a – antimikrobinė medžiaga; b - E. coli padermių skaičius/procentai; FOX – cefoksitinas; ETP – ertapenemas, IMI – imipenemas, MERO – meropenemas, FEP – cefepimas, FOT – cefotaksimas, TAZ – ceftazidimas, TRM – temocilinas; c-R (atsparios), S (jautrios).
Analizuojant šiuos duomenis, pagal mėsos rūšis, matoma, kad skirtingiems antibiotikams skirtingose mėsos rūšyse atsparumas labai įvairus. Visos išskirtos bakterijos buvo atsparios ampicilinui (AMP) ir cefotaksimui (FOT), bei jautrios meropenemui, ertapenemui, temocilinui ir imipenemui. Statistiškai šie duomenys nėra patikimi. Didžiausi atsparumo skirtumai mėsos rūšyse yra ciprofloksacinui (CIP), nalidikso rūgščiai, kolistinui (COL) ir cefotaksimui (FOX), (18 pav).
18 pav. E. coli bakterijų atsparumas skirtingose mėsos rūšyse.
Visos išskirtos E. coli bakterijos pasižymėjo dauginiu atsparumu (t. y. bakterijos buvo atsparios trims skirtingų klasių antibiotikams). Bendrai vertinant išskirtų bakterijų atsparumą EUVSEC plokštelėje šioms antimikrobinėms medžiagoms: sulfametoksazolui (SMX), trimetoprimui (TMP), ciprofloksacinui (CIP), tetraciklinui (TET), azitromicinui (AZI), nalidikso
68% 63% 42% 90% 26% 47% 21% 16% 100% 57% 29% 71% 14% 43% 29% 21% 86% 68% 88% 74% 68% 38% 20% 51% 0% 20% 40% 60% 80% 100% SMX TMP CIP TET NAL CHL GEN FOX Kiauliena Jautiena Vištiena
32 rūgščiai (NAL), cefotoksimui (FOT), chloramfenikoliui (CHL), tigeciklinui (TGC), ceftazidimui (TAZ), kolistinui (COL), ampicilinui (AMP) ir gentamicinui (GEN), jis statistiškai reikšmingai skyrėsi priklausomai nuo mėsos rūšies (P<0,05). E coli bakterijų išskirtų iš vištienos pirmoje plokštelėje tirtiems antibiotikams atsparumas siekė net - 53,4 proc., (19 pav.). Vertinant išskirtų bakterijų atsparumą – EUVSEC 2 plokštelėje, kurioje nustatoms ESBL bakterijų atsparumas šioms antimikrobinėms medžiagoms: cefoksitinui (FOX), ertapenemui (ETP), imipenemui (IMI), meropenemui (MERO), ceftazidimui (TAZ), cefepimui (FEP), cefotaksimui (FOT) ir temocilinui (TRM), vištienoje taip pat buvo didžiausias, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (P>0,05), (20 pav.).
19 pav. Bakterijų atsparumo palyginimas skirtingose mėsos rūšyse (EUVSEC plokštelė).
20 pav. Bakterijų atsparumo palyginimas skirtingose mėsos rūšyse (EUVSEC 2 plokštelė)
46% 48% 53% 54% 52% 47% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautiena Kiauliena Vištiena Atsparu Jautru 38% 40% 43% 62% 60% 58% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Jautiena Kiauliena Vištiena Atsparu Jautru
33 3.3.1 E. coli išskirtų iš kiaulienos atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Analizuojant išskirtų E. coli bakterijų iš kiaulienos mėsos atsparumą antimikrobinėms medžiagoms nustatėme, kad tiek 2015 metais tiek 2017 metais visos bakterijos buvo atsparios ampicilinui, cefotaksimui, ceftazidimui, bei jautrios meropenemui, imipenemui, cefepimui, tigeciklinui, ir temocilinui. Lyginant bakterijų atsparumo kitimą 2015 – 2017 metų laikotarpyje nustatėme, kad ciprofloksacinui atsparių bakterijų skaičius 2017 m. sumažėjo – 10,5 proc., atitinkamai azitromicinui – 6,3 proc., nalidikso rūgščiai – 31,3 proc., kolistinui – 6,3 proc., gentamicinui – 25 proc., cefoksitinui – 18,8 proc., ertapenemui – 6,3 proc. Tačiau 2017 m. padidėjo bakterijų skaičius atsparių tetraciklinui – 12 proc., atitinkamai trimetoprimui – 4,2 proc., chloramfenikoliui – 23proc. (21 pav.). Statistiškai šie pokyčiai nebuvo reikšmingi (P>0,05).
21 pav. ESBL/AmpC produkuojančių E. coli išskirtų iš kiaulienos atsparumo kitimas 2015 - 2017 m.
3.3.2. E. coli išskirtų iš jautienos atsparumas antimikrobinėms medžiagoms
Analizuojant išskirtų E. coli bakterijų iš jautienos mėsos atsparumą antimikrobinėms medžiagoms nustatėme, kad tiek 2015 metais tiek 2017 metais visos bakterijos buvo atsparios ampicilinui, sulfametoksazolui, cefotaksimui ir ceftazidimui, bei jautrios meropenemui, azitromicinui, tigeciklinui, kolistinui, ertapenemui, imipenemui, temocilinui. Lyginant bakterijų atsparumo kitimą 2015 – 2017 m. laikotarpyje nustatėme, kad trimetoprimui atsparių bakterijų skaičius 2017 m. sumažėjo - 8,3 proc., atitinkamai ciprofloksacinui - 33,3 proc., nalidikso rūgščiai - 16,7 proc., gentamicinui - 33,3 proc., cefepimui - 41,7 proc. Tačiau 2017 m. padidėjo atsparių
66,8 62,5 44% 88% 6% 31% 44% 6% 25% 19% 6% 66,7 66,7 33% 100% 0% 0% 67% 0% 0% 0% 0% 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% SMX TMP CIP TET AZI NAL CHL COL GEN FOX ETP 2015 m. 2017 m.
