ANTIOKSIDANTINIAI RYKŠTENĖS (SOLIDAGO L.) GENTIES AUGALŲ TYRIMAI, NAUDOJANT GELEŽIES REDUKCIJOS ANTIOKSIDANTINĖS GALIOS REAGENTĄ

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

LAURA STOŠKUTĖ

ANTIOKSIDANTINIAI RYKŠTENĖS (SOLIDAGO L.) GENTIES

AUGALŲ TYRIMAI, NAUDOJANT GELEŽIES REDUKCIJOS

ANTIOKSIDANTINĖS GALIOS REAGENTĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Prof. dr. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data

ANTIOKSIDANTINIAI RYKŠTENĖS (SOLIDAGO L.) GENTIES AUGALŲ TYRIMAI, NAUDOJANT GELEŽIES REDUKCIJOS ANTIOKSIDANTINĖS GALIOS REAGENTĄ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. dr. Liudas Ivanauskas Data

Recenzentas Darbą atliko

Magistrantė Laura Stoškutė Data 2015-05-31

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10

1.1 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas ... 10

1.2 Antioksidantai ... 11

1.3 Oksidacinio streso pažaida ... 13

1.4 Solidago L. genties augalų morfologiniai požymiai, paplitimas ir kokybės reikalavimai ... 14

1.5 Solidago L. biologiškai aktyvios medžiagos ... 15

1.6 Solidago L. farmakologinės savybės ... 15

1.6.1 Solidago L. prostatos adenokarcinomos gydyme ... 16

1.7 Fenoliniai junginiai ir jų savybės ... 17

1.8 Redukcinio aktyvumo nustatymas ... 18

1.9 ESC pokolonėlinis metodas ... 20

1.10 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 20

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 22

2.1 Tyrimo objektas ... 22

2.2 Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 22

2.3 Naudota aparatūra... 22

2.4 Rykštenės ekstraktų paruošimas ... 23

2.5 Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 23

2.6 Efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis FRAP tyrimo metodas ... 24

2.7 Duomenų statistinė analizė. ... 25

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

3.1 Solidago L. genties antioksidantiniai tyrimai spektrofotometriniu metodu ... 26

3.2 Temperatūros įtaka absorbcijai naudojant FRAP reagentą ... 26

3.3 Antioksidantinio aktyvumo rezultatų įvertinimas ... 27

3.3.1 Solidago L. lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas ... 27

3.3.2 Lyginamas S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų aktyvumas ... 29

3.3.3 Solidago L. šaknų ir stiebų antioksidantinio aktyvumo rezultatų vertinimas ... 31

4. IŠVADOS ... 37

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 38

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 39

SANTRAUKA

L. Stoškutės magistrinis baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. L. Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2015. Šis mokslinis darbas finansuotas Lietuvos Mokslo Tarybos (Nr. MIP-50/2013).

Pavadinimas: Antioksidantiniai rykštenės (Solidago L.) genties augalų tyrimai, naudojant geležies redukcijos antioksidantinės galios reagentą.

Raktiniai žodžiai: Solidago L., rykštenė, antioksidantinis aktyvumas, spektrofotometrija, FRAP, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), pokolonėlinė reakcija.

Tyrimo objektas ir metodai: Rykštenės (Solidago L.) lapų, šaknų ir stiebų ekstraktai. Bendras antioksidantinis aktyvumas nustatytas geležies redukcijos antioksidantinės galios (FRAP) spektrofotometriniu metodu bei optimizuotos sąlygos efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC-FRAP) pokolonėliniammetodui atlikti.

Darbo tikslas: Įvertinti rykštenės (Solidago L.) genties augalų antioksidantinę galią, naudojant spektrofotometrinį metodą ir parinkti optimalias sąlygas antioksidantinio aktyvumo nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) – geležies redukcijos antioksidantinės galios (FRAP) pokolonėliniu metodu.

Darbo uždaviniai: Atlikti Solidago L. ekstraktų redukcinių savybių tyrimą FRAP spektrofotometriniu metodu. Optimizuoti temperatūrą spektrofotometrinio FRAP metodo atlikimui. Palyginti skirtingų Solidago L. rūšių lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą skirtingose žaliavos rinkimo vietovėse. Palyginti skirtingų Solidago L. rūšies augalo organų antioksidantinį aktyvumą. Nustatyti optimalias sąlygas Solidago L. ekstraktų antioksidantinių savybių aktyvumo nustatymui ESC-FRAP pokolonėliniu metodu.

Išvados: Nustatytos optimalios sąlygos Solidago L. rūšies lapų, stiebų ir šaknų ekstraktams tirti spektrotofometriniu FRAP metodu. Ekstraktai termostatuojami 80oC temperatūroje 20 min. su FRAP reagentu ir praėjus 1 val. matuojama ekstraktų absorbcija esat 593 nm bangos ilgiui. Didžiausias S. Canadensis ekstraktų antioksidantinis aktyvumas Vilniaus regione nustatytas Riešėje1 (1,26 ± 0,05 mg/g), o Utenos regione – Vyžuonos parke (1,31 ± 0,027 mg/g). S. Gigantea ekstraktų antioksidantinis aktyvumas didžiausias Vilniaus regione – Verkių regioniniame parke (1,53 ±0,107 mg/g), o Utenoje, Pakalnių miškų masyve – (1,88 ± 0,028 mg/g). S. Gigantea lapų ekstraktai pasižymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei S. Canadensis Vilniaus ir Utenos regionuose. Nustatytos optimaliausios sąlygos ESC pokolonėliniam metodui atlikti su FRAP reagentu: kilpos imobilizavimo temperatūra 55oC ir 10 metrų kilpa pagaminta iš polietereterketoninio (PEEK ) vamzdelio (išorinis skersmuo – 1,58 mm, vidinis skersmuo – 0,25 mm).

SUMMARY

Master Thesis by L. Stoskute, Scientific Supervisor L. Ivanauskas, Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2015. This study was financed by Lithuanian Science Council (No. MIP – 50/2013).

Title. Research on antioxidants in goldenrod (Solidago L.) type plants using ferric reducing antioxidant power reagent.

Keywords. Solidago L., goldenrod, antioxidant activity, spectrophotometry, FRAP, high performance liquid chromatography, post-column reaction.

Object and methods of the study. Extracts of goldenrod leaves, roots and stems. Antioxidant activity was identified using FRAP spectrophotometric method. Optimal conditions for high performance liquid chromatography (HPLC) were set while using post-column (ESC-FRAP) method.

Aim of the study. To evaluate the antioxidant potency of goldenrod (Solidago L.) type plants while using spectrophotometric method and to define optimal conditions for determining antioxidant activity by using ESC-FRAP post-column method.

Goals of the study. To research reductive qualities of Solidago L. extracts using FRAP spectrophotometric method. To select proper temperature to apply FRAP spectrophotometric method. To compare antioxidant activity of different Solidago L. type plants leaves in various locations. To compare antioxidant activity of different organs of Solidago L. type plants. To define optimal conditions for analyzing antioxidant qualities of Solidago L. extracts using ESC-FRAP post-column method.

Conclusions. The optimal conditions to analyze leaves, roots and stems of Solidago L. type plants using spectrophotometric FRAP method were defined. Extracts are heated in 80oC temperature for 20 minutes with FRAP reagent, 593 nm wave length. After 1 hour absorption of the extracts is measured. The most significant antioxidant activity of S. Canadensis extracts was noticed at Riese1 (1,26 ± 0,05 mg/g ) in Vilnius region and at Vyzuona park (1,31 ± 0,02 mg/g) at Utena region. S.Gigantea has the largest antioxidants activity at Verkiu reg. park (1,53 ± 0,1 mg/g) in Vilnius region and Pakalniu forest(1,88 ±0,02 mg/g) at Utenos region. In both Vilnius and Utena regions S. Gigantea is noticed to have higher antioxidant activity than S. Canadensis. According to the research, the optimal conditions for ESC post-column method using FRAP reagent are as follows: loop immobilization temperature 55oC and 10 meter loop (PEEK) (where outer diameter is 1,58 mm, inner diameter is 0,25 mm).

SANTRUMPOS

ABTS - 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)

CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (anglų k. - cupric ion reducing antioxidant capacity)

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high performance liquid chromatography) FRAP - geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power) HAT - vandenilio atomo perdavimo reakcija (angl. hydrogen atom transfer)

MDA – malondialdehidas

PDA - fosfodiodų matricos detektorius PEEK – polietereterketoninis vamzdelis RNS - reaktyviosios azoto formos ROS - reaktyviosios deguonies formos R2 - regresijos koeficientas

SET - elektronų perdavimo reakcija (angl. single electron transfer) SN – standartinis nuokrypis

SSN – santykinis standartinis nuokrypis

TEAC - troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity) TE – trolokso ekvivalentai

TPTZ - 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (angl. 2,4,6-tripyridyl-s-triazine) UV/Vis – ultravioletinė ir matomoji šviesa

ĮVADAS

Laisvųjų radikalų formavimasis yra nuolatinis procesas, vykstantis normaliai funkcionuojančiame organizme. Sutrikus pusiausvyrai tarp laisvųjų radikalų ir organizme veikiančių antioksidantinių sistemų, pasireiškia oksidacinis stresas. Oksidacinis stresas atlieka svarbų vaidmenį lėtinių ir degeneracinių ligų, tokių kaip artritas, autoimuniniai sutrikimai, onkologiniai susirgimai, širdies ir kraujagyslių ligos, neurodegeneracinių ligų vystymąsis bei senėjimo procesas [10, 2].

Žmogaus organizmas su oksidaciniu stresu kovoja dviem būdais: egzogeniniais ir endogeniniais antioksidantais. Egzogeniniai antioksidantai yra maistas ar maisto papildai [41].

Antioksidantiniu aktyvumu pasižymi daugelis augalų rūšių. Epidemiologiniais tyrimais įrodyta, kad mityba, kurios racioną sudaro gausus vaisių ir daržovių vartojimas, sumažina riziką susirgti širdies ir kraujagyslių ligomis bei mažina įvairių vėžinių formų vystymąsi. Moksliniais tyrimais nustatyta, kad žmogaus paros racione antioksidantų kiekis turėtų būti apie 23 mg [23].

Nuo seno Europos fitoterapijoje Rykštenės (Solidago L.) genties augalai buvo naudojami šlapimo takų infekcijoms gydyti. Šiomis dienomis rykštenė tapo neatskiriama Europos fitofarmacijos dalimi. Solidago L. genties priešuždegiminį, spazmolitinį, diuretinį veikimą lemia saponinai, flavonoidai bei mineralai: fosforas, kalis, magnis, geležis [14]. Antioksidantiniam rykštenės (Solidago L.) genties poveikiui įtaką daro biologiškai aktyvūs junginiai: rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, chlorogeno rūgštis ir kt. Rykštenė naudojama gydant prostatą, esant inkstų akmenligei, šlapimo takų uždegimui, reumatui, artritui, egzemai bei kitiems odos pažeidimams [38].

Su Lietuvos klimato juostoje augančiais Solidago L. genties augalais atlikta labai mažai analitinių tyrimų, todėl svarbu ištirti antioksidantinį aktyvumą, siekiant įvertinti Solidago L. genties augalinių žaliavų galimą naudą kovojant su laisvųjų radikalų poveikiu. Gauti tyrimų duomenys gali būti reikšmingi ateityje, kuriant augalinius vaistinius preparatus ar maisto papildus, kurie padėtų kovoti su oksidacinio streso keliamomis organizmo pažaidomis.

Darbo tikslas yra įvertinti rykštenės (Solidago L.) genties augalų antioksidantinę galią, naudojant spektrofotometrinį metodą ir parinkti optimalias sąlygas antioksidantinio aktyvumo nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) – geležies redukcijos antioksidantinės galios (FRAP) pokolonėliniu metodu.

Magistro darbą sudaro įvadas, turinys, literatūros apžvalga, eksperimentinių tyrimų objektas ir metodai, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, rekomendacijos, literatūros sąrašas. Eksperimentiniai tyrimai atlikti 2014 - 2015 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros laboratorijoje. Šis mokslinis darbas finansuotas Lietuvos Mokslo Tarybos (Nr. MIP-50/2013).

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Įvertinti rykštenės (Solidago L.) genties augalų antioksidantinę galią, naudojant spektrofotometrinį metodą ir parinkti optimalias sąlygas antioksidantinio aktyvumo nustatymui efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC ) – geležies redukcijos antioksidantinės galios (FRAP) pokolonėliniu metodu.

Darbo uždaviniai:

1. Optimizuoti temperatūrą spektrofotometriniam FRAP metodo atlikimui.

2. Atlikti Solidago L. ekstraktų redukcinių savybių tyrimą FRAP spektrofotometriniu metodu.

3. Palyginti skirtingų Solidago L. rūšių lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą skirtingose žaliavos rinkimo vietovėse.

4. Palyginti skirtingų Solidago L. rūšies organų: šaknų, stiebų antioksidantinį aktyvumą. 5. Parinkti optimalias sąlygas Solidago L. ekstraktų antioksidantinių savybių aktyvumo

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Laisvieji radikalai ir oksidacinis stresas

Reaktyvios deguonies formos yra šalutiniai ląstelių metabolizmo produktai. Laisvieji radikalai apibūdinami kaip atomai ar molekulės, galinčios nepriklausomai egzistuoti ir turintys savo išorinėje orbitalėje vieną ar kelis nesuporuotus elektronus [23]. Ląstelėms naudojant deguonį energijai (ATP) gauti, mitochondrijose susidaro šio proceso šalutiniai produktai: reaktyviosios deguonies formos (ROS) ir reaktyviosios azoto formos (RNS). Kai reaktyvių deguonies formų aktyvumas viršija antioksidantų aktyvumą, yra pažeidžiamos ląstelių makromolekulės, tokios kaip lipidai ir baltymai, galimi DNR pažeidimai. Laisvieji radikalai sukelia molekulių transformacijas ir genų mutacijas, jie žmogaus organizme yra gaminami nuolatos. Reaktyvios deguonies formos yra klasifikuojamos į dvi grupes: radikalines ir neradikalines deguonies formas (1 lentelė). Dauguma laisvųjų radikalų egzistuoja tik labai trumpą laiką ir reaguoja greitai su kitomis molekulėmis, pavyzdžiui, OH gali egzistuoti 10-10 sekundės biologinėse sistemose. Radikalinės formos yra mažiau stabilios nei ne radikalinės, tačiau jų reaktyvumas yra stipresnis. Vandenilio peroksidas (H2O2), ozono (O3), hipochlorito rūgštis (HOCl), azoto rūgštis (HNO2), diazoto trioksidas (N2O3) yra ne laisvieji radikalai ir paprastai vadinami oksidantais, tačiau jie gali lengvai sukelti laisvųjų radikalų reakcijas gyvuosiuose organizmuose. Biologiniai laisvieji radikalai yra labai nestabilios molekulės, kurių elektronai gali lengvai reaguoti su įvairiomis organinėmis medžiagomis, pavyzdžiui lipidais, baltymais [32, 43].

Esant didelėms laisvųjų radikalų koncentracijoms, sukeliamas oksidacinis stresas. Kitaip sakant, oksidacinis stresas pasireiškia tuomet, kai atsiranda disbalansas tarp besiformuojančių ir neutralizuojamų reaktyviųjų deguonies ir azoto formų. Oksidacinis stresas yra vienas pagrindinių faktorių, lemiančių lėtinių ir degeneracinių ligų vystymąsi, tokių kaip reumatoidinis artritas, vėžys, plaučių ligos, autoimuniniai sutrikimai, inkstų ligos, širdies ir kraujagyslių ligos bei neurodegeneracinių ligų vystymasis. [2, 3, 10, 20].

1 lentelė. Radikalinės ir neradikalinės deguonies formos [32] Pavadinimas Simbolis Deguonies radikalai Deguonies biradikalas O2•• Superoksido jonas O2 • Hidroksilas OH• Peroksilas ROO• Alkoksilas RO• Azoto oksidas NO•

Deguonies radikalai – ne radikaliniai

Vandenilio peroksidas H2O2

Organiniai peroksidai ROOH

Hipochloro rūgštis HOCL

Ozonas O3

Aldehidai HCOR

Molekulinis deguonis O2

Peroksinitritas ONOOH

1.2 Antioksidantai

Antioksidantai – tai organizmui naudingi junginiai, kurie gali apsaugoti ląsteles ir makromolekules (pvz: riebalų, baltymų, DNR ir k.t) nuo kenksmingo reaktyviųjų deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formų poveikio [16]. Antioksidantų įvairovė yra plati, apimanti fermentus, kuriuos gamina žmogaus organizmas, augalines žaliavas, maistą.

Fermentiniai antioksidantai gali būti intraceliuliniai arba ekstraceliuliniai. Antioksidantai skirstomi į grupes pagal savo kilmę:

 Fermentai antioksidantai: superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT), glutationo peroksidazė (GPx), glutationo reduktazė (GRx). Superoksido dismutazė yra pirmoji gynybos linija prieš laisvuosius radikalus, ji redukuoja superoksido anijono radikalą (O2 • -_{) į} vandenilio peroksidą (H2O2). Oksiduota forma (H2O2) yra transformuojama į vandenį ir deguonį (O2), šiame procese dalyvauja katalazė (CAT) arba glutationo peroksidazė (GPX).

 Nefermentinių antioksidantų, slopinančių laisvuosius radikalus, įvairovė plati. Jiems priklauso metaboliniai antioksidantai ir antioksidantai gauti su maistinėmis medžiagomis. Metaboliniams antioksidantams priklauso lipoinė rūgštis, glutationas, L – argininas, kofermentas Q10, melatoninas, šlapimo rūgštis, bilirubinas. Maistiniams antioksidantams priskiriamas vitaminas A (retinolis), beta – karotenas, , vitaminas C (askorbo rūgštis), vitaminas E (tokoferolis),

fenoliniai junginiai (flavonoidai, antocianai, proantocianidai), tioliai, „karščio šoko“ baltymai (heat shock proteins) . Taip pat mikroelementai (geležis, varis, cinkas, selenas, manganas) [10].

Antioksidantų sistemos efektyvumas priklauso nuo mitybos rėžimo (vartojamų vitaminų ir mikroelementų) ir endogeninių antioksidantinių fermentų gamybos. Antioksidantų sistemos efektyvumui yra svarbus fizinis krūvis, kadangi fizinis aktyvumas didina laisvų radikalų atsiradimą [22].

Kuomet antioksidantai neutralizuoja laisvuosius radikalus, jie virsta oksiduota forma, dėl šios priežasties antioksidantų ištekliai organizme turi būti atnaujinami nuolat. Jeigu vienos konkrečios sistemos antioksidantas yra veiksmingas surišant laisvuosius radikalus, kitose sistemose tas pats antioksidantas gali tapti neveiksmingu. Esat tam tikroms aplinkybėms, antioksidantas gali net veikti kaip prooksidantas. Jis tiesiog gali generuoti toksiškas ROS / RNS formas [37].Gynybos mechanizmų nuo oksidacinio streso klasifikacija pateikta 1 paveikslėlyje [32].

1 pav. Gynybos mechanizmo nuo oksidacinio streso klasifikacija [32] Atkūrimo mechanizmai

(DNR atkūrinantys fermentai)

Fizikiniai mechanizmai (Biologinių sričių stabilizavimas) Prevenciniai

mechanizmai (Metalų chelatų susidarymas su ROS)

Gynybos mechanizmas nuo oksidacinio streso

Junginiai gaunami su maistu (pvz: tokoferolis, karotenai) Fermentai antioksidantai: tiesiogiai veikiantys (SOD, katalazė, peroksidazė); pagalbiniai (G6PD, ksantino oksidazė) Mažos molekulinės masės antioksidantai (neutralizatoriai) Netiesiogiai veikiantys mažos molekulinės masėsantioksidantai (chelatoriai) Sintetitiniai ląstelių junginiai (histidino dipeptidai) Antioksidantinė apsauga Atliekos (pvz: šlapimo rūgštis)

1.3 Oksidacinio streso pažaida

Neurologinės ligos. Per pastarąjį dešimtmetį atlikta daug mokslinių ir eksperimentinių tyrimų, siekiant įrodyti oksidacinio streso svarbą ligų patogenezėje. Tyrimų duomenys parodė, kad oksidaciniai pažeidimai yra priežastis, skatinanti neuronų žuvimą ir demencijos progresavimą. Alzheimeriu sergančių žmonių smegenyse rasti β – amiloidai, toksiški baltymai, yra oksidacinio streso padariniai ir dalyvauja tolimesniuose neurodegeneraciniuose procesuose [10,40].

Reumatoidinis artritas. Reumatoidinis artritas – autoimuninės kilmės liga, charakterizuojama kaip lėtinis sąnarių uždegimas, dažnai pažeidžiantis aplink esančius audinius bei kitus organus – plaučius, širdį, odą. Ligos patogenezėje svarbų vaidmenį atlieka reaktyvios deguonies ir azoto formos, esančios uždegimo vietoje. Reumatinės ligos atveju oksidacinę pažaidą ir uždegimą įrodo padidėjęs prostaglandinų ir isoprostano (oksidacinio streso markerio) kiekis sąnarių skystyje [10].

Nefropatija. Oksidacinis stresas turi įtakos inkstų ligoms: glomerulonefritui, lėtiniam inkstų nepakankamumui, proteinurijai, uremijai. Nefrotoksinis ciklosporino, takrolimo, gentamicino, bleomicino, vinblastino poveikis pasireiškia daugiausia dėl oksidacinio streso vykdomos lipidų peroksidacijos. Sunkieji (Cd, Hg, Pb, As) ir pereinamieji (Fe, Cu, Co, Cr) metalai yra stiprūs laisvųjų radikalų induktoriai, organizme nulemiantys įvairių formų nefropatijų vystymąsi [10].

Pažaida vaisiui. Oksidacinis stresas yra preeklapsijos ir sulėtėjusio vaisiaus vystymosi priežastis. Tyrimai rodo, kad esant preeklapsiniam nėštumui motinos kraujyje padaugėja lipidų peroksidacijos produktų (isoprostano, MDA). Įvertinus tyrimų duomenis nustatyta, kad ROS / RNS yra vieni iš pagrindinių ligos priežasčių. Nėštumo komplikacijų metu padidėja NADPH oksidazės 1 ir 5 izoformų kiekis, kurie yra pagrindiniai superoksido fermentavimo šaltiniai placentoje [10]. 2 pav. pateikiama schema, kurioje nurodoma, kurioms organizmo sistemoms oksidacinis stresas kelią žalą ir kokių ligų priežastimi tampa.

2 pav. Ligos, kurių atsiradimui įtaką daro oksidacinis stresas [10]

1.4 Solidago L. genties augalų morfologiniai požymiai, paplitimas ir kokybės

reikalavimai

Rykštenės rūšies augalai priklauso Solidago L. genčiai, (graižažiedžių šeimai (Compositea) arba kitaip vadinamai astrinių šeima (Asteraceae)). Jai priskiriamos 120 rūšių pasaulyje: 103 rūšys kilusios iš Kanados ir Jungtinių valstijų, 8 – 9 rūšių gimtinė yra Meksika, likusios 10 – 12 rūšys kilusios iš Pietų Amerikos, Europos bei Azijos. Tai daugiamečiai žoliniai augalai [9]. Tyrimams naudotos S. Canadensis ir S. Gigantea rūšių augalinės žaliavos 3 ir 4 pav.

3 pav. Kanadinė rykštenė 4 pav. Vėlyvoji rykštenė (Solidago canadensis L.) (Solidago gigantea L.)

Inkstai: glomerulonefritas; lėtinis inkstų nepakankamumas Sąnariai: artritas; reumatas Akys: katarakta; tinklainės ligos Oksidacinis stresas Įvairūs organai: vėžys, senėjimas; diabetas; uždegimas; infekcija Plaučiai: astma; lėtinis bronchitas Vaisius: preeklapsija; vystymosi sutrikimas Širdis - kraujagyslės: aterosklerozė; hipertenzija; išemija; kardiomiopatija; širdies

nepakankamumas

Smegenys: Alzheimeris; parkinsonas, depresija;

insultas; atminties praradimas

Rykštenės genties augalų stiebai žalsvai geltoni ar žalsvai rudi, su didesniais ar mažesniais grioveliais. Viršutinė stiebo dalis šiek tiek arba tankiai apaugusi plaukeliais, o apatinė lygi. Lapai žali, lancetiški su dantytu kraštu, 8 – 12 cm ilgio ir 1 – 3 cm pločio. Viršutinis lapo paviršius yra daugiau ar mažiau lygus, tačiau apatinis pilkšvai žalsvas ir plaukuotas, ypač lapų gyslose. Žiedus sudaro geltoni graižai, susitelkę šakų viršūnėse [9]. Žiedynai pailgos piramidės formos, pasvirę į vieną pusę. Žiedyno stiebai 2,0 – 3,5 mm ilgio, žiedkotis būna apie 2,6 – 5,8 mm aukščio [21]. Rykštenės žydi nuo liepos iki rugsėjo mėnesio. Auga kirtavietėse, pamiškėse, šlaituose, taip pat sausose pievose bei senuose dirvonuose. Rykštenės genties augalai aptinkami visoje Lietuvoje [1].

Pagal Europos farmakopėją kaip augalinė žaliava farmacinių preparatų gamybai naudojama džiovinta antžeminė augalo dalis. Kokybiškoje žaliavoje turi būti ne mažiau 2,5 % flavonoidų, išreikštų hiperozidu, drėgmės kiekis žaliavoje negali viršyti 10 %, žaliavos džiovinimas atliekamas 100 – 105 0_{C temperatūroje [21].}

1.5 Solidago L. biologiškai aktyvios medžiagos

Susisteminus literatūros ir mokslinių tyrimų duomenis, įvertinta Solidago L. fitocheminė sudėtis. Nustatyta, kad rykštenės augalai kaupia šias veikliąsias medžiagas: eterinius aliejus (kadinenas, kamferolis, limonenas, sabibenas), flavonoidus (rutinas, kvercetinas, astragalinas, izokvercetinas, hiperozidas, kamferolis), diterpeninius saponinus, seksviterpenus, polisacharidus, fenolines rūgštis (chlorogeninė rūgštis, kavos rūgštis, vanilino rūgštis), saponinus, kurie yra būdingi tik rykštenei: gigantea saponinus, canadensis saponinus, virgaurea saponinus. Tyrimų duomenimis įrodyta, kad rykštenės cheminėje sudėtyje dominuoja flavonoidai, taninai ir fenoliniai junginiai, sudarantys 12,5 procentų visų Solidago L. augaluose besikaupiančių veikliųjų medžiagų [4, 12, 39].

1.6 Solidago L. farmakologinės savybės

Jau viduramžiais buvo pastebėtas rykštenės genties augalų fitoterapinis poveikis. Augalinė žaliava buvo naudojama šlapimo takų, inkstų akmenligei gydyti, taip pat reumatui kaip priešuždegiminė priemonė, podagrai, prostatai bei egzemai ir kitiems odos sutrikimams gydyti. Liaudies medicinoje rykštenės augalų preparatai buvo naudojami kraujavimui stabdyti. Žiedai naudojami skausmui malšinti ir kaip sutraukianti priemonė. Iš šaknų daromi kompresai, manoma, kad jie traukdavo karštį [1, 36, 42]. Taip pat rykštenės rūšys pasižymi spazmolitiniu, sedatyviniu ir hipotenziniu veikimu (Demir et al. 2009) [33]. Starks ir kiti pranešė apie rykštenės genties

antibakterinį, skausmą malšinantį, antimikozinį poveikį. Rykštenės etanoliniai ir metanoliniai ekstraktai pasižymi vidutiniu bakteriocidiniu poveikiu [29, 33].

Remiantis eksperimentiniais tyrimais ir klinikiniais testais buvo pastebėta, kad rykštenės augalinė žaliava gali būti naudojama kaip perspektyvus vaistas kovojant su išemija, anemijomis, artritu – ligomis, kurias sukėlė laisvieji radikalai. Rykštenė savo sudėtyje turi flavonoidų ir kofeino rūgšties, dėl šių augalinių antioksidantų nustatytas rykštenės antioksidantinis ir chelatinių savybių turintis veikimas [39].

Rykštenės preparatų farmakologinį poveikį didžiąja dalimi lemia fenoliniai junginiai. Flavonoidai ir fenolinis glikozidas - leiokarpozidas. Flavonoidai ir ypač flavonoliai randami Solidago L. genties augaluose yra svarbūs, kadangi pasižymi antioksidantinėmis savybėmis ir suriša laisvuosius radikalus [12, 45].

Mokslininkai N. Deepa and V. Ravichandiran atliko tyrimą, kurio metu buvo nustatytas Kanadinės rykštenės antibakterinis veikimas. Tyrimui atlikti buvo naudojami keturi kanadinės rykštenės žolės ekstraktai: chloroformo, heksano, etilo acetato ir 50% vandeninio etanolio. Ekstraktai buvo tiriami diskų difuzijos metodu, naudojant Muller Hinton agaro terpę. Ekstraktų inhibicijos zona buvo lyginama su standartu ciprofloksacinu (5μg/diske). Antibakteriniam poveikiui nustatyti buvo naudojamos šios bakterijos: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Candida albicans Salmonella para typhi A, Salmonella para typhi B, Pseudomonas aeruginosa Enterobacter aerogenes, Actinobacter baumanni Shigella dysenteriae, , Seratia liquefaciens and Proteus vulgaris, coagulase-negative staphylococci. Gavus rezultatus pastebėta, kad visi ekstraktai pasižymėjo antibakteriniu poveikiu, kuris panašus į standarto. MSK heksano ir chloroformo buvo 300 μg/ml, etilo acetato ir 50% vandeninio etanolio ekstrakto – 200 μg/ml [19].

1.6.1 Solidago L. prostatos adenokarcinomos gydyme

Prostatos adenokarcinoma yra viena labiausiai paplitusių vėžio formų tarp vyrų. Jungtinėse Amerikos valstijose prostatos vėžys sudaro 36% visų vėžio formų vyrų tarpe. Manoma, kad pacientai gali būti išgydyti radikalia prostatektomija ar radioterapija, tačiau daugiau nei 90% mirčių įvyksta vėžiui metastazavus. Pacientams, kurie buvo sėkmingai gydomi operacijos būdu, dažnai liga pasikartoja po daugelio metų. Nėra atrastas mediciniškai patikimas būdas, leidžiantis išgydyti prostatos vėžį. Ieškant alternatyvių gydymo metodų atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, kad Solidago L. ekstraktas turi stiprų citotoksinį poveikį įvairioms vėžinių ląstelių linijoms. Žaliava ekstrahuojama vandeniu, etanoliu ir chloroformu 90oC temperatūroje. Ekstraktas buvo išskirstytas Sephadex G-100 kolonėle, aktyvios frakcijos molekulinė masė nustatyta 40,000. Mėginiai buvo analizuoti ir nustatomas

citotoksinis poveikis žmogaus prostatos naviko ląstelėms (PC3). Vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai parodė stiprų citotoksinį poveikį į PC3 ląsteles. Ekstraktai buvo ruošiami iš skirtingų augalo dalių: lapų, žiedų, stiebų; gautų rezultatų duomenimis didesnis aktyvumas nustatytas lapuose ir žieduose. Citotoksinis aktyvumas yra veiksmingas įvairių navikų ląstelių linijoms: prostatos (PC3), krūties (MDA435), melanomos (C8161) bei smulkiųjų plaučių ląstelių karcinomos (H520) [24].

Taip pat atliktas tyrimas, kurio metu siekiama ištirti priešvėžinį S. Virgaurea poveikį pelių navikų augimui. Tyrimui panaudotas žiurkės prostatos ląstelių linijų modelis (AT6.1) ir SCID pelės modelis. AT6.1 modelio ląstelės buvo injekuotos į SCID pelių modelį ir suleista S. Virgaurea G – 100 frakcija (5 mg/kg) į pilvaplėvę ir po oda kas tris dienas, tyrimo trukmė 25 dienos. Naviko dydis buvo matuojamas kas antrą dieną. Auglio augimas buvo prislopintas, leidžiant S. Virgaurea frakciją į pilvaplėvę ir po oda. Tyrimų metu nustatyta, kad injekcijos į pilvo ertmę labiau slopino naviko augimą nei injekcijos po oda, tačiau tai nebuvo statistiškai reikšmingas skirtumas. Atliktų tyrimų rezultatai su gyvūnais sutapo su tyrimais, darytais in vitro, todėl Solidago L. genties augalai laikomi perspektyviais prostatos gydyme [24, 48].

1.7 Fenoliniai junginiai ir jų savybės

Fenoliniai junginiai yra antriniai augalų metabolizmo produktai. Jie gali veikti kaip antioksidantai, padedantys išvengti širdies ligų, mažinti uždegimą bei sumažinti vėžio ir diabeto dažnį [30]. Šiai grupei yra priskiriama daugiau nei 8000 junginių. Jų struktūroje yra vienas ar daugiau aromatinių žiedų, turinčių bent vieną hidroksilo grupę [46]. Augalų fenoliniai junginiai yra klasifikuojami pagal hidroksilų grupių skaičių bei jų išsidėstymą. Fenoliniai junginiai skirstomi į grupes: flavonoidai (flavonoliai, flavonai, flavanonai, flavanoliai, izoflavonoidai, antocianidinai), fenolinės rūgštys (hidroksicinamono ir hidroksibenzenkarboksi rūgštys), taninai, kumarinai, lignanai, stilbenai. Pateikiama bendroji fenolinių rūgščių ir flavonoidų struktūra 5 pav. [31].

5 pav. Bendra fenolinių rūgščių ir flavonoidų struktūra [31] COOH COOH

A

C

O +

B

Hidroksibenzenkarboksi rūgštys Hidroksicinamono rūgštys Flavonoidai

Flavonoidai yra plačiausiai paplitusi fenolinių junginių grupė. Visi flavonoidai yra kilę iš aromatinių amino rūgščių, fenilalanino ir tirozino darinių, ir turi charakteringą C6 – C3 – C6 konfiguraciją. Pagrindą sudaro du aromatiniai žiedai, sujungti trijų anglies atomų tilteliu ir kartu su deguonies atomu formuojantys heterociklą [46]. Flavonoidų struktūros yra labai skirtingos, kadangi vyksta pagrindinės struktūros pokyčiai jas hidroksilinant, alkilinant, glikozilinant. Pavyzdžiui, glikozilinant prie pagrindinės flavonoido struktūros būna prijungtas cukrus – dažniausiai gliukozė (rečiau pasitaiko – galaktozė ar ksilozė). Dažniausiai flavonoidai randami O – glikozidų forma. Flavonoidų glikozilinimas lemia mažesnį jų aktyvumą ir didesnį tirpimą vandenyje. Taip pat glikozilinimas gali būti kaip esminė apsaugos forma augalams, užkertanti kelią ląstelių citoplazmos ir vakuolių pažeidimams [35, 46].

Išskiriamos dvi fenolinių rūgščių klasės: benzoinės rūgšties ir cinamono rūgšties dariniai. Hidroksibenzoinės rūgšties augaluose kiekis yra labai mažas. Jų galima rasti raudonuosiuose vaisiuose, ridikuose, svogūnuose. Galo rūgšties šaltinis yra arbatmedžio lapai. Augaluose hidroksicinamono rūgštis yra plačiau paplitusi nei hidroksibenzoinė rūgštis. Plačiausiai paplitusios hidroksicinamono rūgštys: p-kumarino, kofeino, ferulinė ir sinapso rūgštys. Chlorogeno rūgštis dažniausiai randama daugelyje rūšių vaisių. Didžiausia koncentracija randama mėlynėse, kiviuose, obuoliuose bei vyšniose. Dideliu chlorogeno rūgšties kiekiu pasižymi kava. Viename puodelyje gali būti nuo 70 mg iki 350 mg chlorogeno rūgšties [46].

Yra šimtai polifenolinių junginių, kurie pasižymi antioksidantiniu poveikiu. Šių junginių savybės gali leisti išvengti širdies ligų, sumažinti uždegimą, mutagenezę ląstelėse ar netgi vėžio ir diabeto dažnį. Manoma, kad fenoliniai junginiai pasižymi stipresnėmis antioksidantinėmis savybėmis nei vitaminas C, E ir karotinoidai [31, 46].

1.8 Redukcinio aktyvumo nustatymas

Šiuo metu taikomi įvairūs antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai, pagrįsti skirtingais veikimo mechanizmais. Šiais metodais tiriami augaliniai antioksidantai konkuruojančios ar nekonkuruojančios reakcijos principu [6]. Antioksidantai įvairiais veikimo mechanizmais geba neutralizuoti žalingas ROS ir RNS formas. Antioksidantai ROS/RNS radikalus ir neradikalus inaktyvuoja dviem pagrindiniais mechanizmais: elektronų perdavimo (SET, angl. single electron transfer) ir vandenilio atomo perdavimo (HAT, angl. hydrogen atom transfer) reakcijomis. Galutinis rezultatas visada vienodas (neutralizuotas prooksidantas), tačiau skiriasi reakcijos kinetika ir potencialios šalutinės reakcijos [6, 30].

FRAP metodu yra vertinamas antioksidantų gebėjimas redukuoti geležies 2,4,6 – tripyridyl – s – triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ kompleksą į intensyviai mėlynos spalvos [Fe(II] )-(TPTZ)2]2+ kompleksą, procesas vyksta rūgštinėje aplinkoje (Benzie, Strain, 1996,1999) (6 pav.). Pirmiausiai FRAP metodas buvo panaudotas kraujo plazmos antioksidantiniam aktyvumui nustatyti, vėliau pradėtas taikyti maistui ir antioksidantams iš vaistinių augalinių žaliavų tirti [28]. Atliekant tyrimus FRAP metodu yra būtinos rūgštinės (pH 3,6) sąlygos tam, kad būtų išlaikomas geležies tirpumas, išvengiant [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ komplekso nuosėdų susidarymo. Tirpalo absorbcijos padidėjimas yra išmatuojamas esant 593 nm bangos ilgiui. Gauti duomenys lyginami su standartinių antioksidantų trolokso ar askorbo rūgšties tirpalais, apskaičiuojamos TEAC reikšmės [44]. FRAP metodas nėra tinkamas tirti visus antioksidantus, kadangi metodui reikalingos ypatingos sąlygos – pH 3,6, kurios itin skiriasi nuo fiziologinių sąlygų – pH 7,4, dėl šios priežasties tokių junginių kaip tioliai (-SH ) pvz: glutationas ar karotinoidai nustatyti FRAP metodu neįmanoma. Junginių antioksidantinis aktyvumas yra priklausomas nuo laiko. Pulido ir kiti (2000) pastebėjo, kad ferulo rūgštis, kvercetinas, kavos rūgštis ir tanino rūgštis nepasiekė reakcijos pusiausvyros būsenos po 4 min., absorbcija toliau lėtai didėja ir po kelių valandų, todėl atsiranda problema norint taikyti fiksuotą reakcijos laiką [8, 11, 27]. Tačiau lyginant FRAP metodą su kitais, skirtais antioksidantiniam aktyvumui nustatyti (ABTS, CUPRAC, DPPH) privalumai būtų tai, kad jis nebrangus, paprastai paruošiami metodui atlikti reikalingi reagentai, nereikalauja ypatingos įrangos ir tyrimas neužima daug laiko [44].

1.9 ESC pokolonėlinis metodas

Šiuo metu vienas iš plačiausiai naudojamų metodų – efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas, kurio metu yra apjungiamas biologiškai aktyvių junginių skirstymas ir pokolonėlinės reakcijos su skirtingais (DPPH, FRAP, CUPRAC, ABTS) reagentais detekcija [7]. Efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis metodas leidžia efektyviai ir nesudėtingai nustatyti atskirų fenolinių junginių bei kitų biologiškai aktyvių medžiagų antioksidantinį aktyvumą [17]. Pagrindiniai veiksniai darantys įtaką ESC pokolonėlinei reakcijai yra derivatizacijos reagentų koncentracija, temperatūra, kolonėlės ilgis, reagento tėkmės greitis. Temperatūra yra svarbi reakcijos atlikimui, nes jos svyravimai gali pakeisti antioksidantų veikimo mechanizmą ar juos paveikti kitu būdu. Reakcijai naudojamos kilpos parametrai turi įtakos smailių aukščiui ir bazinės linijos triukšmui. Pokolonėlinės reakcijos greitis yra mažesnis tuomet, kai temperatūra yra nepakankama. Mažesnė temperatūra lemia lėtesnes chemines reakcijas, dėl šios priežasties turėtų būti pratęstas reakcijos laikas. [5].

Koleva ir kt. pirmieji charakterizavo ESC pokolonėlinį metodą ir panaudojo metanolinį DPPH tirpalą laisvųjų radikalų surišimui. Junginiai, lemiantys antioksidantinį aktyvumą buvo fiksuoti absorbciniu detektoriumi ir užrašomos neigiamos smailės ties 517 nm bangos ilgiu. Tyrimo metu buvo optimizuota DPPH koncentracija, reakcijos trukmė, judančiosios fazės sudėtis ir pH įtaka [34].

Naudojant ESC – FRAP pokolonėlinį metodą absorbcijos pokyčiai yra fiksuojami kaip teigiamos smailės ties 593 nm bangos ilgiu, priešingai ESC reakcijai su DPPH reagentu. Optimizuota FRAP tirpalo koncentracija 123 µM TPTZ ir 246 µM, optimali reakcijos trukmė apie 40 sekundžių. FRAP reagento koncentracija ir tėkmės greitis neturi ryškios įtakos bazinės linijos triukšmui pokolonėlinėje chromatogramoje, dėl šios priežasties ESC – FRAP metodas yra pranašesnis už ESC – DPPH bei ESC – ABTS pokolonėlinius metodus [7].

1.10

Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Laisvieji radikalai - toksinės molekulės, kurios gali sukelti pavojingas ligas, jungiamojo bei kitų audinių pažeidimus bei pagreitinti organizmo senėjimo procesą. Antioksidantai, kurių gausu augaliniuose maisto šaltiniuose, geba neutralizuoti laisvuosius radikalus ir tokiu būdu apsaugo mūsų organizmą nuo žalingo jų poveikio.

Apibendrinant mokslinėje literatūroje rastą informaciją galime teigti, kad rykštenės žaliavoje esančios biologiškai aktyvios medžiagos pasižymi stipriu antioksidantiniu poveikiu ir gali būti taikomos medicinoje. Biologiškai aktyvūs junginiai: rutinas, izokvercitrinas, chlorogeno rūgštis,

hiperozidas, saponinai ir kiti, lemia rykštenės (Solidago L.) genties panaudojimą, esant šlapimo takų infekcijoms, inkstų uždegimui, taip pat reumatui, artritui. Flavonoidai, taninai ir fenoliniai junginiai dominuoja Solidago L. genties žaliavoje.

Norint įvertinti biologiškai aktyvių junginių antioksidantinį aktyvumą dažnai yra naudojamas FRAP redukcinės galios nustatymo metodas, kuris pranašesnis už kitus metodus savo paprastumu – lengvai paruošiami metodui atlikti reikalingi reagentai, jis nėra brangus, tyrimas neužima daug laiko. Dažniausiai tyrimams naudojamas FRAP spektrofotometrinis bei ESC – FRAP pokolonėlinis metodai.

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

2.1 Tyrimo objektas

Solidago L. genties augalai – 2 rykštenės rūšys: S. Canadensis, S. Gigantea. Tyrimai atlikti su išdžiovintais rykštenės lapais, stiebais bei šaknimis. Žaliava surinktaUtenos ir Vilniaus rajonuose.

2.2 Naudoti reagentai ir tirpikliai

Metanolis 99% įsigytas iš Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija). FRAP reagento gamybai: geležies chlorido heksahidratas (FeCl3 X 6H2O), natrio acetatas (NaCH3COO) įsigyti iš Sigma – Aldrich Chemie (Steinheim, Vokietija), ledinė acto rūgštis (99,8%) – iš Standart (Lenkija), koncentruota druskos rūgštis (konc. HCl) – iš Fluka – Chemie (Buch, Šveicarija), 2,4,6 – tripiridil – s – triazinas (TPTZ) – iš Alfa Aesar (Vokietija). Naudoti standarto trolokso ≥98% paruošti tirpalai iš Fluka (Buch, Šveicarija). Acetonitrilas įsigytas iš Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija), trifluoracto rūgštis (99,8%) – iš Fluka – Chemie (Buchs, Vokietija). ESC analizei naudoti standartai: rutinas ir chlorogeno rūgštis įsigyti iš Extrasynthese (Genay, Prancūzija), izokvercitrinas gautas iš Chromadex (Santa Ana, JAV).

2.3

Naudota aparatūra

1. Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedford, MA) 2. Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mavajai, JAV);

3. Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija) 4. Termostatinė vonelė – Heidolf (Vokietija)

5. Waters 2695 chromatografas (Waters Corporation, Milford, JAV);

6. Fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Waters Corporation, Milford, JAV); 7. 150×4,6 mm, 3 μm YMC kolonėlė (YMC Europe GmbH, Vokietija);

2.4 Rykštenės ekstraktų paruošimas

Išdžiovinta augalinė žaliava mechaniškai susmulkinama elektriniu malūnėliu. Tiriamieji mėginiai ruošiami ultragarsinės ekstrakcijos būdu. Ekstraktų ruošimui naudotas 70% metanolio ir vandens mišinys. Gaminta 10 ml metanolinio ekstrakto, sverta rykštenės lapų, šaknų, stiebų ėminio 0,01g (tikslus svėrinys), gaminat santykiu 1:1000 (v/v). Paruošti ekstraktai buvo laikomi ultragarso vonelėje 50 min. palaikant pastovią 25o

C temperatūrą.

2.5 Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu

Tyriamųjų bandymų redukcinis aktyvumas tirtas spektrofotometriniu FRAP metodu. Darbinis FRAP reagento tirpalas ruošiamas sumaišant pasigamintus tirpalus: a) 300 mM acetatinis buferis ( 3,1g natrio acetatas tirpinamas ledinėje acto rūgštyje (16ml), 1000ml kolba, vėliau praskiedžiant distiliuotu vandeniu iki 1000 ml (pH=3,6)); b) TPTZ milteliai tirpinami 40 mM druskos rūgšties tirpale, gaunamas 10 mM TPTZ tirpalas; (50ml distiliuoto vandens sumaišoma su 0,1695 ml konc chloro rūgšties. Gautame 40mM vandenilio rūgšties tirpale tirpinama 0,1562g TPTZ miltelių); c) geležies (III) chlorido heksahidratas tirpinamas distiliuotame vandenyje ir gaunamas jo 20 mM tirpalas.(0,2703g geležies ir ištirpinama 50ml distiliuoto vandens), santykiu 10:1:1. Paimama 3 ml darbinio tirpalo ir pridedama 20 µl tiriamojo ekstrakto, sumaišoma, mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje [15]. Po 1 val. spektrofotometru (Dinamika) matuojama mišinio absorbcija esant 593 nm bangos ilgiui. Gauti duomenys išreikšti trolokso ekvivalentais (TE) gramui žaliavos, sudarius trolokso tiesinės regresijos kalibracinę kreivę: y =235,43x + 0,233; R2 = 0,9953; (7 pav.) čia: x – Trolokso standartinių tirpalų koncentracija, mg/ml; y – absorbcijos dydis.

Trolokso koncentracijos ribos (0,000078 – 0,025 mg/ml). TEAC reikšmė (mg/g) apskaičiuojama naudojant formulę: Cc = A1*ABS+ A0

7 Pav. Trolokso kalibracinė kreivė FRAP redukcinės galios vertinimo metodu

2.6 Efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis FRAP tyrimo metodas

Principinė efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline FRAP radikalų surišimo reakcija schema pateikta 8 pav.

8 pav. ESC pokolonėlinio metodo aparatūros sistema augalinių antioksidantų tyrimams:1. Eliuentai; 2. ESC binarinis siurblys; 3. Injektorius; 4. Reagento tirpalas; 5. Prieškolonė; 6.

Detektorius; 7. Maišymo trišakis; 8.Šiukšlės; 9. Reakcijos kilpa; 10. PC; [18]

y = 235,43x + 0,233 R² = 0,9953 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 0,0005 0,001 0,0015 0,002 0,0025 0,003 Op tinis t an ki s, A

Antioksidantiniai ESC tyrimai atlikti sujungus pokolonėlinę sistemą sudarytą iš: Waters 2695 chromatografo (Waters, Milford, MA) sujungto su Waters 996 PDA ir Water 2487 UV/Vis detektoriais. Veiklieji junginiai buvo išskirstyti sudarius gradientinę sistemą: tirpalas A - 0,05% trifluoracto rūgštis vandenyje, tirpalas B – acetonitrilas; 0 min – 95% A ir 5% B, 5 min – 88% A ir 12% B, 50 min – 70% A ir 30% B, 51 min – 10% A ir 90% B, 56 min – 10% A ir 90% B, 57 min – 95% A ir 5% B. Veikliųjų junginių atskyrimui naudota 4,6×150 mm, 3 µm YMC kolonėlė, analizės metu injekuota 10 µl tiriamo tirpalo, tekmės greitis 1 ml/min. Veiklieji junginiai buvo tirti su fotodiodų matricos detektoriumi Water 996 (PDA), esant tokiam bangos ilgiui, prie kurio jų absorbcija yra didžiausia. Iš PDA detektoriaus judri fazė su išskirstytais junginiais per maišymo trišakį patenka į reakcijos kilpą, į kurią ESC skysčių siurblys Gilson pump 305 tiekia reagento tirpalą (FRAP) – 0,5 ml/min, antioksidantinio aktyvumo nustatymui. Pokolonėlinės reakcijos atlikimui panaudota kilpa sujungta su Water 2487 (Milford, MA) detektoriumi, kuriuo matuojama pratekančio tirpalo absorbcija esant 593 nm šviesos bangos ilgiui.

2.7 Duomenų statistinė analizė.

Tyrimų duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft, JAV), Empower® v.2.0 be „SPSS 20“ (IBM, JAV) programomis. Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis (SN). Apskaičiuotas tyrimo duomenų standartinis santykinis nuokrypis (SSN). Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Solidago L. genties antioksidantiniai tyrimai spektrofotometriniu metodu

Skyriuje aprašomi Solidago L. genties augalų spektrofotometrinio tyrimo rezultatai, siekiant įvertinti atskirų rykštenės rūšių skirtumus. Dėl to nustatytas antioksidantinis aktyvumas, panaudojant FRAP reagentą. Mokslinėje literatūroje nerasta informacijos kaip parenkama optimaliausia temperatūra tyrimų atlikimui, dažniausiai buvo naudojama 37o

C temperatūra, dėl šios priežasties buvo atliekamas tyrimas, siekiant nustatyti optimalią temperatūrą spektrofotometrinei analizei [15, 26]. Nagrinėjant mokslinę literatūrą pastebėta, kad dažniau tiriami rykštenės lapai, o šio tyrimo metu įvertintas šaknų ir stiebų antioksidantinis aktyvumas.

3.2 Temperatūros įtaka absorbcijai naudojant FRAP reagentą

Remiantis literatūros šaltiniais buvo padaryta išvada, kad ekstraktus pašildžius su FRAP reagentu absorbcija padidėja [15]. Mūsų tyrimų metu buvo optimizuota reakcijos temperatūra, kurioje antioksidantinis aktyvumas yra didžiausias. Buvo matuojamas Solidago L. lapų, stiebų, šaknų bendras antioksidantinis aktyvumas ties 539 nm bangos ilgiu, ekstraktus su FRAP reagentu termostatuojant skirtingose temperatūrose 20 min. Esant skirtingai temperatūrai (30°C, 40°C, 50°C, 60°C, 70°C, 80°C ir 90oC) buvo vertinama temperatūros įtaka absorbcijai. Rezultatai pateikti 9 pav. Didžiausia absorbcija (2,739 ± 0,011 AV) nustatyta mėginius šildant 800_{C temperatūroje.}

9 Pav. Absorbcijos įvairavimas matuojant mėginių absorbciją esant skirtingai temperatūrai (SSN ≤ 1,4%, n=3 ) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 30 40 50 60 70 80 90 A bsorbci ja , A V Temperatūra 0_C

Didinant temperatūrą, ties 90o

C nustatytas absorbcijos mažėjimas (1,667±0,01 AV) (9 pav.), todėl tolimesni bandymai atlikti mėginius šildant 80°C temperatūroje.

3.3 Antioksidantinio aktyvumo rezultatų įvertinimas

Tyrimo metu buvo lyginamas antioksidantinis aktyvumas tarp S. Gigantea ir S. Canadensis rūšies lapų metanolinių ekstraktų, taip pat tarp S. Canadensis skirtingų augalo organų ekstaktų: šaknų, stiebų bei lapų. Lyginama Solidago L. genties antioksidantinio aktyvumo priklausomybė nuo augimo vietos. Rykštenės genties augalai buvo rinkti Vilniaus ir Utenos regionuose.

3.3.1 Solidago L. lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas

Pirmiausia atliktas S. Gigantea lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimas. Įvertintos reikšmės svyravo nuo (0,92 ± 0,027 mg/g) iki (1,88 ± 0,028 mg/g). Didžiausia TEAC reikšmė buvo nustatyta Utenoje, Pakalnių miško masyvo ekstrakto pavyzdžiui (1,88 ± 0,028 mg/g). Taip pat didelė redukcinė geba nustatyta Vilniuje, Verkių regioninio parko ekstrakto pavyzdžiui (1,53 ± 0,107 mg/g) bei Utenos rajono, Tauragnų pavyzdžiui (1,34 ± 0,058 mg/g). O mažiausia redukcine geba pasižymėjo Utena, Stašionys (0,92 ± 0,027 mg/g). Vilniaus apylinkėse antioksidantinio aktyvumo svyravimai nebuvo statistiškai reikšmingi (p=0.102), pavyzdžiui, Vilnius, Riešė1 ir Vilniaus r. Nemenčinė2 skyrėsi per 0,002 mg/g (1,158 ± 0,068 ir 1,156 ± 0,041 mg/g).

Tarpusavyje buvo palyginti Vilniaus bei Utenos apylinkių rezultatai. Išvedus vidurkį iš visų rezultatų nustatyta, kad Utenos apylinkėse antioksidantinis aktyvumas buvo didesnis nei Vilniaus apylinkėse (atitinkamai 1,28 ± 0,199 mg/g ir 1,19 ± 0,367 mg/g), tai sudaro 1,07 karto. FRAP tyrimo rezultatai pateikti 10 pav.

10 pav. Skirtingose augavietėse rinktų S. Gigantea žaliavos (lapų) ekstraktų antioksidantiniai aktyvumai (SSN ≤ 6.9%, n=3)

Taip pat tirtas ir įvertintas S. Canadensis lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas. Žaliava buvo surinkta Utenos ir Vilniaus apylinkėse. Iš 11 pav. pateiktų tyrimo duomenų matyti, kad gauti rezultatai svyravo diapazone nuo (0,39 ± 0,017 mg/g) iki (1,31 ± 0,024 mg/g). Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas Utenoje, Vyžuonos parke surinktos žaliavos ekstrakte (1,31 ± 0,017 mg/g). Mažiausia redukcine geba pasižymėjo Utenos apylinkės, Padbuožė (0,39 ± 0,017 mg/g), gauti rezultatai buvo statistiškai reikšmingi (p<0,05). Taigi Utenos vietovėse antioksidantinio aktyvumo svyravimai buvo labai ryškūs, skirtumas tarp didžiausios ir mažiausios reikšmės siekė 3,3 karto. Priešinga situacija buvo Vilniaus apylinkėse. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas S. Gigantea lapų ekstrakto nustatytas Vilniuje, Kalvarijų g. (0,83 ± 0,039 mg/g) ir tai yra 2,1 karto didesnė reikšmė už mažiausią Utenos apylinkėse (0,39 ± 0,017 mg/g) nustatytą reikšmę. Didžiausiu aktyvumu pasižymėjo Vilniaus r. Riešė1

surinktos žaliavos ekstraktas (1,26 ± 0,051 mg/g). Tačiau antioksidantinio aktyvumo skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (p=0.427) tarp Vilniaus r. Riešės1 ir Riešės2 bei Žemųjų Karačiūnų (atitinkamai 1,26 ± 0,05, 1,18 ± 0,05 ir 1,21 ± 0,06 mg/g). Gautų rezultatų svyravimai buvo žymiai mažesni lyginant su Utenos apylinkėmis, čia skirtumas tarp mažiausios ir didžiausios reikšmės siekė 1,5 karto.

0 0,5 1 1,5 2 2,5 K on ce n tr aci ja m g/ g Vietovės

11 pav. Skirtingose augavietėse surinktų S. Canadensis žaliavos (lapų) ekstraktų antioksidantiniai aktyvumai (SSN ≤5,5%, n=3)

3.3.2 Lyginamas S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų aktyvumas

Statistinės analizės metu apskaičiuota S. Gigantea suminė redukcinė geba buvo (6,89 ± 0,352 mg/g), o S. Canadensis (3,35 ± 0,161 mg/g), tai sudaro 2,05 karto, todėl galime teigti, kad S. Gigantea pasižymi kur kas stipresniu antioksidantiniu aktyvumu nei S. Canadensis. Tyrimų rezultatai gauti susumavus visus tirtus S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų duomenis iš Utenos apylinkių (12 pav.). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 K o n ce n tr ac ija m g/ g Vietovės

12 pav. Suminis S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas Utenos apylinkėse (SNN≤4,8%, n=3)

Taip pat buvo palyginti S. Gigantea ir S. Canadensis ekstraktai Vilniaus apylinkėse (13 pav). Vertinant junginių gebą redukuoti trivalentį geležies kompleksą, didžiausia redukcinė geba buvo nustatyta Vilniaus apylinkėse surinktų ir tirtų S. Gigantea lapų metanolinių ekstraktų. S. Gigantea (5,94 ± 0,212 mg/g ) lapų ekstraktas pasižymi 1,06 karto didesne redukcine geba nei S. Canadensis (5,57 ± 0,253 mg/g) lapų ekstraktas.

13 pav. Suminis S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas Vilniaus apylinkėse (SSN≤6,9%, n=3) 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Solidago Gigantea Solidago Canadensis

K on ce n tr ac ija m g/g Utenos apylinkės 4,8 5 5,2 5,4 5,6 5,8 6 6,2 6,4

Solidago Gigantea Solidago Canadensis

K on ce n tr ac ija m g/g Vilniaus apylinkės

Išanalizavus ir susumavus visus tyrimų duomenis, galime daryti išvadą, kad S. Gigantea ekstraktai pasižymi didesniu antiradikaliniu aktyvumu Vilniaus ir Utenos regionuose (14 pav.). Tačiau skirtumas tarp Vilniuje rinktos S. Canadensis ir S. Gigantea žaliavos (lapų) ekstraktų nėra statistiškai reikšmingas (p>0,05). S. Gigantea antioksidantinis aktyvumas Vilniuje (5,94 ± 0,216 mg/g), o S. Canadensis (5,57 ± 0,259 mg/g), skirtumas 0,37 mg/g. Priešinga situacija stebima Utenos regione. Čia skirtumas tarp tirtų ekstraktų redukcinės gebos didesnis, S. Gigantea antioksidantinis aktyvumas (6,89 ± 0,352 mg/g), o S. Canadensis (3,35 ± 0,165 mg/g), gauti rezultatai skiriasi 2,05 karto (3,54 mg/g). Taigi Utenos apylinkėse pastebimas didesnis skirtumas tarp S. Gigantea ir S. Canadensis rezultatų nei Vilniaus apylinkėse.

14 pav. S. Canadensis ir S. Gigantea suminių koncentracijų palyginimas Vilniaus ir Utenos regionuose.

3.3.3 Solidago L. šaknų ir stiebų antioksidantinio aktyvumo rezultatų vertinimas

Tirti bei palyginti S. Canadensis rūšies šaknų bei stiebų metanoliniai ekstraktai. Tyrimai atlikti su Vilniaus apylinkėse rinkta žaliava. Rezultatai pateikti kaip suminis S. Canadensis šaknų ir lapų kiekis. Iš 15 pav. matyti, kad stiebuose nustatytas didesnis antioksidantinis aktyvumas, kadangi TEAC reikšmė stiebuose (3,69 ± 0,205 mg/g), o šaknyse – (1,16 ± 0,04 mg/g). Gauti rezultatai leidžia manyti, kad šaknyse kaupiama mažiau biologiškai aktyvių medžiagų nei lapuose, kurios lemia

0 1 2 3 4 5 6 7 S. Canadensis S. Gigantea Utena Utena K once ntr ac ija m g/g Vilnius Vilnius

antioksidantinį aktyvumą. Hipotezę patvirtina mokslinės literatūros šaltinių duomenys, kuriuose nustatyta, kad Solidago L. genties augalai daugiausia biologinį aktyvumą lemiančių medžiagų kaupia stiebuose, lapuose bei žieduose, o šaknyse medžiagų kiekis būna mažiausias [24].

15 pav. S. Canadensis šaknų ir stiebų ekstraktų antioksidantiniai aktyvumai Vilniaus regione (SNN≤7,1%, n=3)

Vertinant kanadinės rykštenės (S. Canadensis L.) antioksidantines savybes buvo palyginta trijų skirtingų žaliavų: šaknų, stiebų bei lapų, redukcinė geba, 16 pav. Mažiausias antioksidantinis aktyvumas buvo nustatytas šaknyse (1,16 ± 0,04 mg/g), o didžiausias - lapų metanoliniuose ekstraktuose (5,57 ± 0,259 mg/g). Stiebų antioksidantinis aktyvumas buvo (3,69 ± 0,205 mg/g). Skirtumas tarp didžiausios aktyvių junginių koncentracijos lapuose ir mažiausios šaknyse sudaro 4,8 karto. Skirtumas tarp šaknų ir stiebų – 3,18 karto, o tarp stiebų ir lapų buvo kur kas mažesnis – 1,5 karto. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

S. Canadensis šaknys S. Canadensis stiebai

K on ce n tr ac ija m g/g Vilniaus apylinkės

16 pav. S. Canadensis šaknų, stiebų, lapų suminių koncentracijų palyginimas (SSN≤7,2%, n=3)

Atlikus tyrimus, tarpusavyje palyginus Solidago L. genties šaknų, stiebų, lapų aktyvumą, galima daryti išvadą, kad didžiausia laisvųjų radikalų surišimo geba pasižymi kanadinės rykštenės (S. Canadensis L.) lapų metanoliniai ekstraktai, tai lemia didžiausias biologiškai aktyvių junginių kiekis lapuose.

Lyginant S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų tyrimus bei gautus rezultatus, didesnis antioksidantinis aktyvumas nustatytas S. Gigantea lapų ekstraktuose.

3.4. Kilpos ir temperatūros įtaka ESC – FRAP pokolonėlinei reakcijai

Tyrimo metu buvo siekiama parinkti optimaliausią kilpos ilgį bei kilpos imobilizavimo temperatūrą. Rezultatai pateikti naudojant temperatūrinius režimus intervale 45o

C – 55oC. Esant 25oC ir 35oC laipsnių temperatūrai nebuvo atliktas tyrimas, kadangi remiantis atliktos spektrofotometrinės analizės duomenimis nustatytas absorbcijos didėjimas šiame temperatūrų intervale nebuvo statistiškai reikšmingas (p<0,05). 60o

C temperatūra nebuvo naudojama, kadangi aukšta temperatūra termolabilioms medžiagoms yra žalinga, nes lemia aktyvių junginių skilimą bei antioksidantinio aktyvumo mažėjimą [5, 47].

Kaip pagrindinis tinkamumo vertinimo kriterijus pasirinktas smailės aukštis. Buvo tirti trijų medžiagų standartai: chlorogeno rūgštis, rutinas ir izokvercitrinas. Gauti rezultatai pateikti 17, 18 ir 19 pav. 0 1 2 3 4 5 6 S. Canadensis šaknys S. Canadensis stiebai S. Canadensis lapai 1,16 3,69 5,57 K on ce n tr ac ija m g/g Vilniaus apylinkės

17 pav. Chlorogeno rūgšties smailės aukščio priklausomybė nuo temperatūros ir kilpos ilgio (SSN≤3,3%, n=3)

18 pav. Rutino smailių aukščio priklausomybė nuo temperatūros ir kilpos ilgio (SSN≤3,59%, n=3)

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 45 50 55 Sm ai lė s au kštis Temperatūra o_C 3 metrų kilpa 10 metrų kilpa 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000 45 50 55 Sm ai lė s au kštis Temperatūra o_C 3 metrų kilpa 10 metrų kilpa

19 pav. Izokvercitrino smailės aukščio priklausomybė nuo temperatūros ir kilpos ilgio (SSN≤2,8%, n=3)

Iš 17, 18 ir 19 pav. matyti, kad geriausi rezultatai gaunami naudojant 10 metrų kilpą (išorinis skersmuo – 1,58 mm, vidinis skersmuo – 0,25 mm). Chlorogeno rūgšties smailės aukštis ties 55oC temperatūra, naudojant 3 ir 10 metrų ilgio kilpas, atitinkamai buvo 36607,67 ir 79313,33, tai yra 2,1 karto didesnis panaudojus 10 metrų ilgio kilpą. Toks pats principas pastebėtas su rutinu ir izokvercitrinu. Rutinas – 9629 (3m) ir 17813,33 (10m), tai yra 1,8 karto daugiau, izokvercitrinas – 30890 (3m) ir 55985 (10m), rezultatas, naudojant 10 metrų kilpą, taip pat 1,8 karto didesnis. Visais atvejais naudojant 10 metrų ilgio kilpą rezultatai buvo didesni nei su 3 metrų kilpa.

Optimaliausia tyrimo atlikimui nustatyta temperatūra – 55oC. Tirtų trijų standartų chlorogeno rūgšties, rutino ir izokvercitrino rezultatai keliant temperatūrą nuo 45o

C iki 50oC palaipsniui didėjo. Pavyzdžiui, izokvercitrino smailės aukščio rezultatai su 10 metrų kilpa buvo nuo 31672,33 iki 34301,67 – skirtumas 1,08 karto. Keliant temperatūrą nuo 50oC iki 55oC skirtumas buvo 1,6 karto. Nustatyta, kad reakcijai su FRAP reagentu optimaliausia kilpos temperatūra yra 55 OC, o kilpa – 10 metrų (išorinis skersmuo – 1,58 mm, vidinis skersmuo – 0,25 mm). Gauti tyrimo rezultatai buvo pristatyti tarptautinėje konferencijoje „Young Scientists Meeting“, Čekijoje, 2014 metais (1 priedas).

Apskaičiavus gautų duomenų reikšmingumą pagal Tukey kriterijų buvo nustatyta, kad smailių aukščiai esant 10 metrų kilpai (PEEK) ties 55o_{C yra statistiškai reikšmingi (p<0,05) visiems tirtiems} junginiams: chlorogeno rūgštis, rutinas ir izokvercitrinas. Naudojant 3 metrų kilpą ir skirtingas temperatūras (45o

C, 50oC, 55oC) nėra statistiškai reikšmingo skirtumo: chlorogeno rūgštis p=0.238; rutinas p=0.968; izokvercitrinas p= 0.305. 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 45 50 55 Sm ai lė s au kštis Temperatūra o_C 3 metrų kilpa 10 metrų kilpa

3.5 Tyrimų rezultatų apibendrinimas

Rykštenės lapų metanolinių ekstraktų bendras antioksidantinis aktyvumas buvo nustatytas spektrofotometriniu FRAP metodu in vitro. Antioksidantinio aktyvumo nustatymui spektrofotometriniu FRAP metodu nustatyta optimali reakcijos mišinio temperatūra – 80oC. Didžiausia redukcinė geba nustatyta S. Gigantea lapų ekstraktų žaliavoje, surinktoje Utenoje, Pakalnių miško masyve (1,88 ± 0,028 mg/g). Mažiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo S. Gigantea lapų ekstrakto žaliava, surinkta Utenos regione, Stačionyse (0,92 ± 0,027 mg/g). Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas S. Canadensis lapų ekstrakto žaliavoje, surinktoje Utenoje, Vyžuonos parke (1,31 ± 0,024 mg/g), o mažiausias – Utenos r,. Padbuožėje (0,39 ± 0,017 mg/g). Lyginant suminius S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų antioksidantinio tyrimo duomenis nustatyta, kad S. Gigantea aktyvumas didesnis Utenos ir Vilniaus vietovėse.

Atlikus tyrimus su S. Canadensis Vilniaus regione rinktų šaknų, stiebų bei lapų metanoliniais ekstraktais nustatyta, kad didžiausias antioksidantinis aktyvumas yra lapų ekstraktuose (5,57 ± 0,259 mg/g), stiebų ekstraktuose (3,69 ± 0,205 mg/g), mažiausia TEACFRAP reikšmė nustatyta šaknyse (1,16 ± 0,04 mg/g). Mokslininkų atliktų analitinių tyrimų metu nustatyta, kad didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu taip pat pasižymi Solidago L. genties lapų žaliavos ekstraktai, mažesniu stiebai, o pats mažiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas Solidago L. genties šaknų žaliavos ekstraktuose [14].

Optimizuojant ESC sąlygas pokolonėliniam metodui atlikti, nustatyta optimali reakcijos kilpos imobilizavimo temperatūra 55o_{C, o kilpos ilgis 10 metrų (PEEK) (išorinis skersmuo – 1,58} mm, vidinis skersmuo – 0,25 mm).

4. IŠVADOS

1. Optimizuotos Solidago L. genties bendro antioksidantinio aktyvumo įvertinimo sąlygos FRAP spektrofotometriniam metodui. Didžiausia absorbcija buvo nustatyta metanolinius ekstraktus su FRAP reagentu termostatuojant 80oC temperatūroje 20 minučių.

2. FRAP spektrofotometriniu metodu įvertintas Solidago L. genties augalų lapų ekstraktų redukcinis aktyvumas. Didžiausios TEACFRAP, mg/g reikšmės nustatytos S. Canadensis - Utenoje, Vyžuonos parke (1,31 ± 0,024 mg/g), S. Gigantea – Utenoje, Utenos girininkijoje (1,88 ± 0,02 mg/g ), lapų metanoliniams ekstraktams.

3. Įvertintas suminis S. Gigantea ir S. Canadensis lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas. S. Gigantea rūšiai nustatytas didesnis antioksidantinis aktyvumas Utenos ir Vilniaus vietovėse (6,89 ± 0,35 ir 5,94 ± 0,21 mg/g) lyginant su S. Canadensis – Utenoje (3,35 ± 0,16 mg/g), Vilniuje (5,57 ± 0,25 mg/g). Tačiau nėra didelio skirtumo tarp Vilniaus regione rinktos S. Gigantea ir S. Canadensis lapų žaliavos, gautų rezultatų duomenys skiriasi 0,37 mg/g, šis skirtumas nėra statistiškai reikšmingas (p<0,05).

4. Didesnis antiradikalinis aktyvumas pagal troloksą nustatytas S. Canadensis stiebų metanoliniuose ekstraktuose (3,69 ± 0,205 mg/g) nei šaknyse (1,16 ± 0,04 ).

5. Optimizuotos sąlygos Solidago L. antioksidantinio aktyvumo nustatymui ESC – FRAP pokolonėliniu metodu. Nustatyta optimaliausia reakcijos kilpos imobilizavimo temperatūra – 55oC bei kilpos ilgis – 10 metrų (išorinis skersmuo – 1,58 mm, vidinis skersmuo – 0,25 mm), (p<0.05).

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS

Remiantis atliktais antioksidantinio aktyvumo tyrimais ir gautais rezultatais, galima daryti išvadą, kad racionalu būtų auginti S. Gigantea rūšies atstovus Utenos rajone.

Optimizavus ESC – FRAP pokolonėlinio metodo sąlygas galima būtų įvertinti veikliuosius junginius, pasižyminčius antioksidantinėmis savybėmis bei atlikus metodikos išsamesnius validacinius tyrimus pritaikyti ją kiekybiniam įvertinimui.

ESC – FRAP pokolonėlinį metodą antioksidantiniam aktyvumui nustatyti būtų galima taikyti ne tik Solidago Canadensis bei Solidago Gigantea žaliavos ekstraktų analizei, bet ir visiems Solidago L. genties atstovams bei kitoms, antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčioms, augalų rūšims.

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Gudžinskas Z, Balvočiūtė J. Lietuvos vaistiniai augalai. Kaunas: Šviesa; 2007.

2. Jarašūnienė D, Šimaitis A. Oksidacinis stresas ir endotelio disfunkcija. Medicina, 2003, 39 (12): 1151-1157.

3. Kasparavičienė G, Briedis V. Kai kurie antioksidantų veikimo aspektai mažinant neigiamą laisvųjų radikalų poveikį. Medicina 2002; 2(2): 187-189.

4. Marksa M, Rudušienė J, Marksienė R, Kiliuvienė G. Rykštenės (Solidago L.) rūšies augalų ir rykštenėje besikaupiančių veikliųjų medžiagų svarba gydant šlapimo organų ligas. Medicinos teorija ir praktika, 2012, 158 – 160.

5. Marksa M, Radušienė J, Jakštas V, Ivanauskas L, Marksienė R. Development of an HPLC post – column antioxidant assay for Solidago canadensis radical scavengers. Natural Product Research: Formerly Natural Product Letters, 2015.

6. Raudonis R, Raudonė L, Janulis V, Viškelis P. Antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo nustatymo metodai (apžvalga). Sodininkystė ir daržininkystė. Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės institutas. 2012, 31(3-4): 15-35.

7. Raudonis R. Efektyviosio skysčių chromatografijos – pokolonėlinės reakcijos metodo vystymas antioksidantinio aktyvumo nustatymui. Magistro darbas [Internet], 2008.

8. Raudonis R. Skysčių chromatografijos pokolonėlinių metodų optimizavimas augalinių antioksidantų tyrimams. Daktaro disertacija [Internet], 2012.

9. Šiukšta R. Augalų gentys – Rykštenė. Prieiga per Internetą. [Žiūrėta 2014 08 23] <http://www.botanikos-sodas.vu.lt/lt/zalieji-puslapiai/augalu-gentys/rykstene>

10. Ai Pham-Huy L, He H, Pham-Huy C. Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health. International journal of Biomedical science, 2008; 4 (2): 89-96.

11. Apak R, Güçlü K, Demirata B, Özyürek M, Çelik S.E, Bektaşoğlu B, Berker I.K, Özyurt D. Comparative Evaluation of Various Total Antioxidant Capacity Assays Applied to Phenolic Compounds with the CUPRAC Assay. Molecules, 2007. 12(7), 1469 – 1547.

12. Apati P, Szentmihalyi K, Balázs A, Baumann D, Hamburger M, Kristó T.Sz, Szöke É, Kéry Á. HLPC Analysis of the Flavonoids in Pharmaceutical preparations from Canadian Goldenrod (Solidago canadensis). Chromatographia supplement, 2002, Vol. 56

13. Apáti P. G, Antioxidant constituents in Solidago canadensis L. and its traditional phytopharmaceuticals. Doctoral school pharmaceutical and pharmacological sciences, Ph.D. thesis, 2003, Budapest.