LIETUVOJE AUGANČIOS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO L.) ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI SPEKTROFOTOMETRINIU ABTS METODU

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

VIKTORIJA BUTKIENĖ

LIETUVOJE AUGANČIOS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO L.)

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

SPEKTROFOTOMETRINIU ABTS METODU

Darbo vadovas Doc. dr. Rūta Marksienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data

LIETUVOJE AUGANČIOS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO L.)

ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

SPEKTROFOTOMETRINIU ABTS METODU

Darbo vadovas

Doc. dr. Rūta Marksienė Data

Recenzentas Darbą atliko

Vardas Pavardė parašas Magistrantė

Viktorija Butkienė

Data Data

TURINYS SANTRAUKA

SAMMARY

SANTRUMPOS ... 8

ĮVADAS ... 9

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

LITERATŪROS APŽVALGA………...12

1.1 Rykštenės (Solidago L.) paplitimas ... 12

1.2 Lietuvoje augančių Solidago L. klasifikacija, morfologija ... 13

1.3 Solidago L. farmakologinės savybės ... 15

1.4 Solidago L. panaudojimas liaudies medicinoje ... 16

1.5 Solidago L. preparatai šlapimo sistemos gydyme ... 16

1.6 Solidago L. cheminė sudėtis ... 17

1.7 Laisvieji radikalai ... 19

1.8 Antioksidantai ... 20

1.9 Fenoliniai junginiai ... 20

1.10 Fenolinių junginių išskyrimas ir analizės metodai ... 23

1.11 Spektrofotometrinis metodas ... 23

1.12 Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 24

1.13 Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 26

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 27

2.1 Tyrimo objektas ... 27

2.2 Naudoti reagentai ir tirpikliai ... 28

2.3 Naudota aparatūra ... 28

2.4 Rykštenės augalinės žaliavos ir metanolinių ekstraktų paruošimas analitiniams tyrimams ... 28

2.5 Radikalo-katijono surišimas ABTS metodu ... 29

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31

3.1 Solidago L. augalų antioksidantiniai tyrimai spektrofotometriniu metodu ... 31

3.2 Antioksidantinio aktyvumo rezultatų įvertinimas ... 31

3.2.1 Solidago virgaurea lapų ir žiedų antioksidantinis įvertinimas ... 31

3.2.2 Solidago canadensis lapų ir žiedų antioksidantinis įvertinimas ... 32

3.2.3 Solidago virgaurea lapų ir žiedų suminiai antioksidantinių kiekių vidurkiai skirtingose Lietuvos vietovėse ... 33

3.2.4 Solidago canadensis lapų ir žiedų suminiai antioksidantinių kiekių vidurkiai skirtingose Lietuvos vietovėse ... 34

3.2.5 Suminis lyginamasis Solidago L. lapų ir žiedų įvertinimas ... 35

3.3.Tyrimų rezultatų apibendrinimas ... 36

IŠVADOS ... 38

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39

SANTRAUKA

V. Butkienės magistrinis baigiamasis darbas/mokslinė vadovė doc. dr. R. Marksienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. Kaunas, 2016. Šis mokslinis darbas finansuotas Lietuvos Mokslo Tarybos (Nr. MIP-50/2013).

Pavadinimas: Lietuvoje augančios rykštenės (Solidago L.) antioksidantinio aktyvumo tyrimai spektrofotomertiniu ABTS metodu.

Raktiniai žodžiai: Solidago L., rykštenė, antioksidantinis aktyvumas, spektrofotometrija, ABTS.

Tyrimo objektas ir metodai: Skirtingų Lietuvoje augančios rykštenės (Solidago L.) rūšių lapų ir žiedų ekstraktai. Bendras antioksidantinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu ABTS radikalo-katijono surišimo metodu.

Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančios rykštenės (Solidago L.) genties augalų antioksidantinę galią, naudojant spektrofotometrinį ABTS metodą.

Darbo uždaviniai: Atlikti skirtingų Lietuvoje augančios Solidago L. rūšių lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo įvertinimą. Atlikti skirtingų Solidago L. rūšių žiedų ekstraktų antioksidantinį aktyvumo tyrimą. Palyginti S. virgaurea ir S. canadensis lapų ir žiedų ekstraktų surinktų skirtingose Lietuvos regionuose antioksidantinę galią. Palyginti skirtingų Solidago L. augalų rūšių suminius antioksidantinius aktyvumus.

Išvados: Įvertinus ABTS spektrofotometriniu metodu atliktą skirtingą Solidago L. rūšių lapų ir žiedų ekstraktų antioksidantinį aktyvumo tyrimą buvo nustatyta, kad didžiausia antioksidantine galia pasižymi S. virgaurea lapų (914,27±0,97µg/g) ir žiedų (899,32±2,88µg/g) ekstraktai. Rokiškio ir Kauno rajonuose surinkti S. virgaurea ir S. canadensis lapai išsiskyrė didesne antioksidantų koncentracija nei žiedai, tačiau S. canadensis žiedai (876,23±7,69µg/g) surinkti Vilniaus rajone turėjo didesnį antioksidantinį aktyvumą nei lapai (868,77±1,92µg/g). Atlikus Solidago L. augalų suminį, statistinį duomenų apdorojimą statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas tarp lapų ekstraktų skirtingose rūšyse (p˂0,05), o tarp žiedų skirtingose augalų rūšyse statistinio reikšmingumo nėra (p˃0,05). Pagal gautus rezultatus galima teigti jog S. virgaurea lapai yra biologiškai aktyvesni už S. canadensis lapus.

SUMMARY

Master Thesis by V. Butkienė, Scientific Supervisor R. Marksienė, Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. Kaunas, 2015. This study was financed by Lithuanian Science Council (No. MIP – 50/2013).

Title: Antioxidant activity studies of Solidago L. found in Lithuania using spectrophotometric ABTS method.

Keywords: Solidago L., goldenrod, antioxidant activity, spectrophotometry, ABTS.

Study goals and methods: Different goldenrod (Solidago L.) leaves and flower extracts found in Lithuania. The total antioxidant activity found out by applying spectrophotometric ABTS radical-cation bonding method.

The aim of the study: to assess antioxidant power of European goldenrod (Solidago L.) leaves and flower extracts using ABTS spectrophotometric method.

Study objectives: to perform the study of different European goldenrod (Solidago L.) species, in particular, to compare antioxidant activity of different leaves and flower extracts collected from S. virgaurea and S. canadensis found in Lithuania; to compare various Solidago L. species and to sum up total antioxidant activity.

Conclusions: The study assessment of goldenrod (Solidago L.) leaves and flower extracts using the method ABTS spectrophotometry has shown that the leaves of S. virgaurea (914,27±0,97µg/g) and its flower extracts (899,32±2,88µg/g) have the highest antioxidant power. The leaves of S. virgaurea and S.canadensis collected from Rokiškis and Kaunas regions stand out to have highter antioxidant concentration as compared to their flower extracts. However, flower extracts of S. canadensis (876.23±7.69µg/g) from Vilnius region appear to have higher antioxidant acvitity than their leaves (868.77±1.92µg/g). The study of total statistical data processing of Solidago L. has shown that statistically singnificant difference can be found between the extracts of leaves in its different species (p<0.05), whereas no significant difference among flower extracts of this various species can be noticed (p>0.05). Thus, it can be stated that the leaves of S. virgaurea are biologically more active than the leaves of S. canadensis.

PADĖKA

Pirmiausia dėkoju magistro darbo vadovei doc. dr. Rūtai Marskienei už visokeriopą pagalbą rašant baigiamąjį magistro studijų darbą. Nuoširdžiai dėkoju vyresniajam laborantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant tyrimus spektrofotometru ir įgyvendinant tyrimų metodikas. Esu dėkinga Lietuvos sveikatos mokslų universitetui už suteiktą materialinę bazę ir kokybiškas darbo sąlygas, reikalingas tyrimams atlikti.

Taip pat dėkoju savo šeimos nariams, kolegoms ir draugams už suteiktą paramą ir palaikymą rašant šį baigiamąjį darbą.

SANTRUMPOS

CUPRAC- vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (anglų k. - cupric ion reducing antioxidant capacity)

DC-MS - dujų chromatografijos – masių spektrometrijos analizės metodai DNR - deoksiribonukleorūgštis

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. high performance liquid chromatography) FRAP - geležies redukcijos antioksidantinė galia (anglų k. Ferric reducing antioxidant power) ORAC - deguonies radikalų absorbcijos galia ( anglų k. Oxygen radical absorbance capacity) R2_{− koreliacijos koeficientas}

RNS – reaktyvios azoto formos ROS – reaktyvios deguonies formos SN – standartinis nuokrypis

SSN – santykinis standartinis nuokrypis

TEAC - troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (anglų k. Trolox equivalent antioxidant capacity)

TRAP - bendro radikalų gaudyklės parametro nustatymo metodas UV- ultravioletiniai spinduliai

ĮVADAS

Pastaruoju dešimtmečiu Lietuvoje didėja susidomėjimas vaistiniais augalais, jų farmakologinėmis savybėmis ir panaudojimu farmacijos pramonėje. Lietuvos ir užsienio šalių moksliniai tyrimai rodo, kad didelis dėmesys skiriamas biologiškai aktyvių medžiagų identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui vaistinėse augalinėse žaliavose. Apie antioksidantų poveikį ir jų svarbą žmogaus organizmui savo moksliniuose darbuose ir publikacijose aprašė Giedrė Kasparavičienė, Raimondas Raudonis, Jolita Radušienė ir kiti Lietuvos ir užsienio tyrėjai. Mokslininkai tyrinėja ne tik natūralių antioksidantų poveikį žmogaus organizmui, bet taip pat tobulina metodikas jų identifikavimui, bei kiekybiniam įvertinimui natūralios kilmės antioksidantų šaltiniuose. Pasak J. Radušienės Solidago L. rūšies augalai augantys natūralioje aplinkoje yra stiprus antioksidantų šaltinis ir gali būti naudojamas kaip žaliava maisto papildų ir daugiakomponenčių preparatų gamyboje [6].

Didėjant susidomėjimui augaluose nustatomų natūralių antioksidantų, kurie pasižymi žmogaus organizmo apsauginėmis savybėmis manoma, kad fenoliniai junginiai pasižymi didžiausia antioksidacine galia, tai įrodo moksliniuose šaltiniuose pateikiami rezultatai. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimui naudojami įvairūs šiuolaikiniai analizės metodai (dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, spektrofotometrija), pagrįsti skirtingais veikimo mechanizmais [2]. Šiais metodais (dujų chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, spektrofotometrija) tiriami augaliniai antioksidantai konkuruojančios ir nekonkuruojančios reakcijos principu, inaktyvuoja žinomą oksidantą dviem pagrindiniais būdais: vandenilio atomo perdavimo arba elektronų perdavimo reakcijomis [3].

Antioksidantų vartojimas stiprina ląstelės antioksidacinės apsaugos sistemas, padeda atkurti pažeistas struktūras bei geba neutralizuoti žalingas reaktyvias deguonies ir azoto formas. Epidemiologiniai tyrimai parodė antioksidantų gebėjimus sumažinti ar visai sustabdyti daugelio lėtinių ligų progresavimą [3].

Naujausiais duomenimis sintetiniai antioksidantai negali būti plačiai naudojami, kadangi jie keičia kraujo fermentinę sudėtį, sukelia ląstelių biocheminius pokyčius, kaupiasi riebaluose ir pasižymi kancerogeniniu poveikiu [44]. Norint pakeisti sintetinius antioksidantus, būtina ieškoti natūralios kilmės šaltinių bei atlikti išsamius tyrimus, kas leistų įsitikinti tuo, kad natūralūs antioksidantai yra ne tik saugesni, bet ir pasižymi didesniu efektyvumu prieš sintetinius antioksidantus [16,44].

Darbo tikslas yra įvertinti Lietuvoje augančios rykštenės (Solidago L.) genties augalų antioksidantinę galią, naudojant spektrofotometrinį ABTS metodą. Su Lietuvoje augančiais Solidago L. genties augalais atlikta labai mažai analitinių tyrimų, norint įsitikinti, kad rykštenės genties augalai gali būti stipriais antioksidantų šaltiniais būtina įvertinti antioksidantinį aktyvumą rykštenės augalinėse

žaliavose. Gauti tyrimų duomenys gali būti reikšmingi norint įrodyti, kad rykštenės genties augalai yra puikus natūralių antioksidantų šaltinis ir gali būti naudojami kaip alternatyva sintetiniams antioksidantams pakeisti.

Magistro darbą sudaro įvadas, turinys, literatūros apžvalga, eksperimentinių tyrimų objektas ir metodai, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, rekomendacijos, literatūros sąrašas. Eksperimentiniai tyrimai atlikti 2015 metais. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros laboratorijoje.

Temos aktualumas ir naujumas

Įvairių šalių moksliniai tyrimai su Solidago L. šeimos augalais nurodo, kad šios rūšies augalai kaupia fenolinius junginius, bei pasižymi antioksidantiniu aktyvumu ir yra naudojami farmacijos pramonėje. Šio tyrimo duomenys įrodo, kad Lietuvoje augančios Solidago L. rūšies augalų lapai ir žiedai pasižymi didele antioksidantine geba. Todėl galime daryti prielaidą, kad Lietuvoje augančios rykštenės gali būti naudojamos įvairių vaistinių ir kombinuotų preparatų gamyboje, kaip profilaktinė priemonė šlapimo sistemos ligų gydyme, bei kaip geras antioksidantų šaltinis.

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančios rykštenės (Solidago L.) genties augalų antioksidantinę galią, naudojant spektrofotometrinį ABTS metodą.

Darbo uždaviniai:

1. Atlikti skirtingų Solidago L. rūšių lapų ekstraktų antioksidantinį aktyvumo įvertinimą. 2. Atlikti skirtingų Solidago L. rūšių žiedų ekstraktų antioksidantinį aktyvumo tyrimą.

3. Palyginti S. virgaurea ir S. canadensis lapų ir žiedų ekstraktų surinktų skirtingose Lietuvos regionuose antioksidantinę galią.

LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Rykštenės (Solidago L.) paplitimas

Rykštenės augalai priklauso Solidago L. genčiai. Tai daugiametis augalas priklausantis astrinių (Asteraceae) šeimai. Rykštenė viena iš didžiausių šios šeimos genčių, žinoma apie 120 jos rūšių [2,4,28].

Lietuvoje savaime auga paprastoji rykštenė (S. virgaurea L.) ir introdukuotos svetimžemės rūšys, oficialiai pripažintos invazinėmis rūšimis: kanadinė (S. canadensis L.) ir vėlyvoji (S. gigantea) [5,6].

Kanadinė rykštenė (S. canadensis) yra labiausiai išplitusi Vilniaus, Kauno, Tauragės ir Rokiškio rajonuose bei Vilniaus ir Kauno miestuose. Vėlyvoji rykštenė (S. gigantea) labiausiai išplitusi Vilniaus ir Kauno miestuose bei Pagėgių, Šakių, Trakų ir Vilniaus rajonuose. Didžiausios kanadinės ir vėlyvosios augavietės (Kauno, Rokiškio ir Vilniaus rajonuose bei Vilniaus mieste), kuriose gausiai auga ir vietinė – paprastoji rykštenė (S. virgaurea). Šiose augavietėse buvo aptiktas savaiminis hibridas (S. canadensis × S. virgaurea) [6]. Savaime kanadinė rykštenė (S. canadensis L.), plačiai paplitusi Šiaurės Amerikoje. Į Europą atvežta kaip dekoratyvinis augalas. Europoje pirmą kartą išauginta 1645m. Dabar ši rūšis plačiai paplitusi Europoje kaip sulaukėjęs ir invazinis augalas. Ji aptinkama Belgijoje, Austrijoje, Airijoje, Vokietijoje, Lietuvoje, Norvegijoje, Čekijoje, Švedijoje, Olandijoje, Estijoje, Suomijoje, Danijoje, Islandijoje, Latvijoje, Lenkijoje, Slovakijoje. Sulaukėjusi kanadinė rykštenė (S. canadensis) randama ir Australijoje, Naujojoje Zelandijoje, Japonijoje, Kinijoje, Taivane [4,44]. Kanadinė rykštenė (S. canadensis) yra viena iš seniausiai į Europą iš Šiaurės Amerikos introdukuotų dekoratyvinių augalų [44].

Vėlyvoji rykštenė (S. gigantea), plačiai paplitusi visoje Europoje. Aptinkama Austrijoje, Čekijoje, Slovakijoje, Danijoje, Prancūzijoje, Vokietijoje, Didžiojoje Britanijoje, Vengrijoje, Italijoje, Jugoslavijoje, Lenkijoje, Rumunijoje, Šveicarijoje, rytų Europos šalyse, pietinėje Suomijoje, Švedijoje ir Norvegijoje [27,44].

1.2 Lietuvoje augančių (Solidago L.) klasifikacija, morfologija

Karalystė – Augalai (-Plantae-)

Skyrius – Magnolijūnai (-Magnoliophyta-) Klasė – Magnolijainiai (-Magnoliopsida-) Poklasis – Astražiedžiai (-Asteridae-) Šeima – Astriniai (-Asteraceae-) Gentis – Rykštenė (-Solidago L.-)

Rūšis - Paprastoji rykštenė (-Solidago virgaurea-)

Paprastoji rykštenė (Solidago virgaurea L.) (1pav.). augalo genties pavadinimas (Solidago) kilo iš lotyniško žodžio solide, kuris reiškia ,,gydyti‘‘, ,,sutvirtinti‘‘. Rūšies epitetas virgaurea sudarytas iš dviejų žodžių – virga (lot. rykštė) ir aurum (lot. auksas). Augalo pavadinimas tarsi atspindi jo savybes – gydanti auksinė rykštė [2,4]. Užauga nuo 20 cm iki 1 m aukščio, nors žinoma porūšių (pvz. S. virgaurea.ssp. minuta), kurie siekia 10 cm aukštį. Rykštenės stiebas stačias, lapuotas, viršutinėje dalyje šakojasi. Apatiniai lapai pailgai kiaušiniški, stambūs, kylant stiebu į viršų smulkėja ir viršūnėse tampa lancetiški. Graižai ryškiai geltoni, iki 1,5 cm skersmens, sutelkti šakų viršūnėse. Žydi liepos – rugsėjo mėnesiais. Sutrintas augalas skleidžia šviežių morkų kvapą. Dauginamas dalinant kerus arba sėklomis. Auga šviesiuose miškuose, pamiškėse, kirtavietėse, sausuose pievuose, šlaituose. Auga tiek lengvame, tiek sunkiame dirvožemyje, gerai toleruoja įvairaus rūgštingumo bei šarmingumo dirvą[4,19].

Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis L.) (2 pav.) daugiamečiai žoliniai augalai, dažniausios aptinkamos retai ganomose pievose, sąvartynų pakraščiuose, pakelėse. Nereiklios dirvožemiui, auga įvairios mechaninės sudėties, derlingumo, sausuose ir drėgnuose dirvožemiuose, dauginasi šakniastiebių dalimis ir sėklomis [38]. Stiebas šviesiai ar tamsiai žalios spalvos padengtas smulkiais šiurkščiais plaukeliais, viršuje šakojasi, užauga nuo 30 iki 214 cm. aukščio. Lapai yra smarkiai dantyti, lancetiški, nevienodo dydžio iš apačios padengti švelniais plaukeliais be lapkočio nuo 5 iki 12,5 cm ilgio. Žiedynas - viršūninė šluotelė stiebo pabaigoje. Žiedynas sudėtinis jo šakos ilgos, laibos, dažnai išlinkusios lanku. Viename žiedyne būna nuo 41 iki 4600 graižų. Žydi nuo liepos iki spalio mėnesio. Apdulkinamos vabzdžių. Sėklos yra lukštavaisius su retais plaukeliais. Tai šviesiamėgis augalas, retai aptinkamas pavėsingose vietose [2,42,44].

Vėlyvoji rykštenė (Solidago gigantea L.), (3 pav.) Išauga iki 50–120 cm aukščio, šakniastiebiai šakoti, ilgi. Stiebas žalias gali būti rausvo atspalvio lygus, padengtas melsvomis apnašomis, plikas, tik žiedyno srityje kartais su pavieniais plaukeliais. Lapai su trimis gyslomis lancetiški, kraštai smulkiai dantyti, smailia viršūne, apatinė lapų pusė negausiai plaukuota, viršutinė pusė plika. Žiedynas – kūgio pavidalo arba netaisyklinga šluotelė. Graižai su 1,5–3 mm ilgio koteliais. Žiedyne būna nuo 40 iki 600 graižų, lukštavaisis su 2–2,5 mm skristuku [7,27,38,]. Gerai auga įvairiuse dirvožemiuose: sausuose, nederlinguose, taip pat ir drėgnuose, netgi pelkiniuose dirvožemiuose. Dauginasi požieminiais šakniatiebiais, auga tankiais sąžalynais. Sėklas platina vėjas. Žydi rugpjūčio – spalio mėnesį. Dažniausiai įsikuria ir geriausiai auga vidutiniškai drėgnose ir derlingose vietovėse [38,42].

2 pav. Kanadinė rykštenė (S. canadensis)

1.3 Rykštenės (Solidago L.) farmakologinės savybės

Antimikrobinis aktyvumas: etanoliniai ir metanoliniai rykštenės ekstraktai pasižymi antimikrobiniu veikimu prieš Bacillus subtilis, Bacillus pumilis, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, ir Aspergillus niger [2,12,16,18].

Antioksidantinis ir priešuždegiminis aktyvumas: in vitro tyrimai, kurių metu polisacharidiniai junginiai buvo išskirti iš paprastosios rykštenės, parodė, kad jie slopina oksidaciją trombocituose [18]. Buvo nustatyta, kad etanoliniai rykštenės ekstraktai mažina uždegimą slopindami lipoksignazę (LOX) ir ksantino oksidazę. Saponinai, flavonoidai ir kofeino rūgšties esteriai, esantys kanadinės rykštenės žolėje, slopina leukocitų elastazę, proteazę, kuri dalyvauja uždegimo progresavime [31]. Atliktuose tyrimuose vandeniniai ir etanoliniai Solidago L. ekstraktai sumažino artrito sukeltą uždegimą žiurkių letenose 40 proc, lyginant su kontroline žiurkių grupe [16,22]. Nustatyta, kad tam daro įtaką rutinozidas, kuris mažina klinikinius artrito požymius ir padeda kovoti su uždegiminiais procesais [16]. Rykštenėje esantis rutinas slopina histamino atsipalaidavimą ir gali būti naudojamas astmos gydymui [14,28].

Antimuskarininis poveikis: vandenininiai ekstraktai iš (Solidago L.) slopino karbacholio sukeltus muskarininių receptorių susitraukimus žiurkių ir žmogaus šlapimo pūslės audiniuose [13].

Priešnavikinis poveikis: atlikti tyrimai parodė, kad rykštenės ekstraktai naikina krūties vėžio ląsteles, įvairias melanomas, plaučių vėžines ląsteles [2,6]. Vandeniniai ir etanoliniai ekstraktai iš rykštenės lapų arba žiedų (1 mg/ml) veikia citotoksiškai žmogaus prostatos vėžio PC3 ląstelėse in vitro. Pelėms buvo suleistos prostatos vėžio ląstelės (AT6.1). Gydymo metu kas tris dienas buvo suleistos fosfatų buferinių tirpalų injekcijos su rykštenės 5 mg/kg ekstraktu skirtos į pilvaplėvės ertmę arba į pilvaplėvės ertmę ir poodį, gydymas truko 25 dienas. Rykštenės ekstraktai slopino auglio augimą lyginant su kontroline pelių grupe [26].

Diuretinis poveikis: tyrimuose naudojant vandeninį rykštenės ekstraktą žiurkėms buvo pastebėtas diurezės padidėjimas, taip pat natrio, kalio ir chlorido jonų pasišalinimas [13,28].

Analgetinis poveikis: atliktuose in vitro tyrimuose buvo veikiami trys receptoriai susiję su ūmaus skausmo perdavimu centrinėje nervų sistemoje. Tyrimo rezultatai parodė, kad paprastosios rykštenės ekstraktai biologiškai veikė slopindami skausmo receptorius [16,22,28].

Brazilijos universitete buvo atliktas dvigubai aklas tyrimas su 5% Solidago chilensis L. geliu. Tyrime dalyvavo 20 savanorių turinčių nugaros problemų. 10 iš jų buvo paskirtas šis gelis 2 k.d. 15 dienų, kitiems paprastas gelis. Statistiniai analizės rezultatai parodė, kad bandomajai grupei sumažėjo skausmas ir padidėjo lankstumas lyginant su placebo grupe [40].

Priešgrybelinis poveikis: in vitro tyrimuose, triterpenoidiniai glikozidai, išskirti iš

paprastosios rykštenės slopino žmogaus patogeninių mielių (Candida ir Cryptococcus rūšių) augimą [11]. Eteriniai aliejai ir etanolio ištraukos iš lapų ir šaknų Solidago chilensis slopino penkių skirtingų

siūlinių grybelių padermių augimą [28].

Širdies ir kraujagyslių sistema: atliekant tyrimus su gyvūnais kurių metu buvo naudojamas

rykštenės ekstraktas buvo pastebėtas hipotenzinis poveikis [18,22,37].

1.4 Solidago L. panaudojimas liaudies medicinoje

Nuo seno rykštenė buvo vartojama kaip vaistažolė liaudies medicinoje. Dažniausiai gydymui buvo naudojama vaistinės žaliavos antžeminė dalis (žolė), renkama augalui žydint: nupjauti stiebai su žiedynais buvo surišami, kabinami viršūnėmis žemyn, džiovinami pavėsyje [4,10].

Liaudies medicinoje Solidago L. žolelių nuoviras buvo dažnai naudojama kaip diuretikas (skatina šlapimo išsiskyrimą, todėl bakterijos nenusėda ant gleivinės, o pašalinamos kartu su šlapimu taip pat gerina šlapimo pūslės gleivinės gijimą). Solidago L. nuoviras ar ekstraktas pasižymi antiseptiniu, priešuždegiminiu, spazmus atpalaiduojančiu bei skausmą mažinančiu veikimu, gydo inkstų ir šlapimo pūslės akmenligę, cistitą, opinį cistitą, šlapimo nelaikymą, prostatos hipertrofiją [2,19,16,33].

Rykštenių saponinai ir eteriniai aliejai veikia grybelius, todėl rykštenės antpilais sėkmingai buvo gydomos burnos ir lytinių organų kandidozės, odos grybeliniai susirgimai, egzemos. Rykštenė naudinga sutrikus virškinimui, viduriuojant, sergant bronchine astma, plaučių tuberkulioze, ūmiomis kvėpavimo takų infekcijomis, ūminiu laringitu, gripu, reumatu, artritu, enteritu, diabetu. Išoriškai naudojamas augalas gydo sunkiai gyjančias žaizdas [4,8.19,33,44].

Moldovoje ir Baltarusijoje buvo naudojami rykštenės žiedai su kiaulės taukų ar sviesto mišiniu nuo tuberkuliozės, odos dermatito, nudegimų ir reumato gydyme. Kaukaze požeminės dalies (šaknies) tinktūros - žaizdų gijimui skatinti. Komi Respublikoje, Kaukaze, Sibire rykštene gydoma skrofuliozė. Kinijos liaudies medicinoje sėklų nuoviras naudojamas pilvo pūtimui mažinti, esant mėnesinių ciklo sutrikimams, taip pat choleros ir viduriavimo gydyme [19].

1.5 Solidago L. preparatai šlapimo sistemos gydyme

Remiantis moksline literatūra Solidago L. plačiai paplitusi visame pasaulyje. Ją kaip augalinę gydomąją žaliavą vis dažniau pripažįsta įvairių šalių mokslininkai. Atliekti įvairūs moksliniai tyrimai

patvirtina, kad visos Solidago L. rūšys turi panašias vaistines savybės ir gali būti naudojamos gydymo tikslams. [8,10,21].

Solidago L. augalinė žaliava yra naudojama viena ir mišiniuose su kitais augalais. Iš rykštenės žolės gaminamos įvairios arbatos, kapsulės, geriamieji lašai, granulės, tabletės, tinktūros. Prancūzijoje gaminamas rykštenės vaistinis preparatas nuo alergijos [2]. Vokietijoje, Australijoje, Čekijoje, Vengrijoje, Italijoje, Lenkijoje, Rusijoje, Malaizijoje rykštenės preparatai yra naudojami, kaip pagalbinė priemonė gydant šlapimo takų ligas (šlapimo pūslės infekcijas, šlapimo takų dirginimą, šlapimo pūslės ir inkstų akmenligę) [8,22]. Atlikti tyrimai parodė, kad rykštenės nuovirai išplauna bakterijas, mažina šlapimo takų spazmus, numalšina uždegimą [20].

Lietuvoje taip pat galima įsigyti preparatų į kurių sudėtį įeina Solidago L. Labiausiai paplitę preparatai gaminami Čekijoje (“Urinal”, “Urinal Akut” minkštos kapsulės), Suomijoje (“Care Lady” tabletės), Lietuvoje gaminama arbata “Diuretiko”, kurio vaistažolių mišinyje yra Herba Solidaginis. Lietuvos rinkoje esantys preparatai naudojami šlapimo sistemos ligų profilaktikai ir gydymui [2].

Italijoje rykštenės (Solidago L.) žaliava buvo tiriama kaip papildoma priemonė kompleksinėje terapijoje su antibiotikais. Buvo atliktas tyrimas kuriame dalyvavo moterys sergančiomis dažnai pasikartojančiomis šlapimo takų infekcijomis. Kartu su antibiotikais papildomai buvo naudojama žolelių arbata (Cistimev®), kurios sudėtyje yra Solidago virgaurea. Pacientai buvo suskirstyti į 2 grupes: A grupė naudojo antibiotikus ir fitoterapinį preparatą, B grupė tik antibiotikus. Tyrimas truko 3 mėnesius. Po šio tyrimo 12 mėnesių vyko stebėjimas kurio metu nustatyta, kad moterys naudojusios antibiotikus kartu su preparatu (Cistimev®) rečiau sirgo pasikartojančiomis šlapimo takų ligomis [24].

Remiantis tyrimais galima daryti išvada, kad Solidago L. preparatai yra naudingi šlapimo takų ligų profilaktikoje ir gydyme.

1.6 Solidago L. cheminė sudėtis

Remiantis moksline literatūra ir išanalizavus mokslinių tyrimų rezultatus nustatyta, kad Solidago L. žaliavoje kaupiamos šios veikliosios medžiagos: diterpenai ir triterpeniniai saponinai, flavonoidai (kvercetinas, kamferolis, astragalinas, izokvercetinas, rutinas, hiperozidas). Flavonoidų kiekis lapuose yra 1.44-1.98%, pumpuruose 0.67%, žieduose 1,14%, o vaisiuose 0,36%. Taip pat flavonoidinių glikozidų (3-arabinosidų, 3-galaktosidų, 3-gliukozidų, 3-rutinosidų). Išskiriamas nedidelis kiekis eterinių aliejų (D-pineno, mirceno, limoneno, sabibeno, barneolio) jų kiekis yra 0,32-0,38%, monosacharidai (galaktozės, galakturono rūgštis, gliukozės, arabinozės, ramnozės, ksilozės). Fenolinės rūgštys (chlorogeno, vanilino, kofeino), p-kumarino, salicilo r, acto r., nikotino. Fenolinis

glikozidas-leikarbozidas, taninų. Taip pat yra saponinų, kurie būdingi tik rykštenėms (virgaurea saponinai, canadensis saponinai, gigantea saponinai) [2,4,10,22,28,31].

Tiriant mineralines medžiagas Solidago L. augalinėje žaliavoje buvo nustatytas kalio, magnio, geležies, vario, cinko mikroelementų kiekis [10].

Tyrimais įrodyta, kad rykštenėje dominuoja taninai ir fenoliniai junginiai (chlorogeno r.), flavonoidai (rutinas, izokvercitinas, kvercitinas, hiperozidas) (1 lentelė). Jie sudaro 12,5 proc. visų Solidago L. augaluose besikaupiančių veikliųjų medžiagų [2].

1 lentelė. Rykštenės (Solidago L.) žaliavoje dominuojantys junginiai

Pavadinimas Cheminė formulė

Rutinas

Izokvercitinas

Kvercitinas

Chlorogeno rūgštis

1.7 Laisvieji radikalai

Laisvieji radikalai – tai chemiškai aktyvūs vienetai (atomas, molekulių grupė ar jonas), turintys neporinius elektronus išorinėje orbitalėje. Jie dažniausiai veikia toje vietoje kur susiformuoja nes yra nestabilūs ir egzistuoja trumpą laiką,[1]. Laisvieji radikalai susidaro dėl organizmo viduje vykstančių metabolinių procesų, dėl išorinių veiksnių (rūkymo, ore esančių teršalų, rentgeno spindulių, ozono.) ir dėl fiziologinių veiksnių (pvz. streso) [29]. Laisvieji radikalai ląstelėje suardo DNR grandinę, baltymų fragmentaciją, lipidų peroksidaciją [1,16]. Jų reikšmė nustatyta daugelyje ligų, tokių kaip cukrinis diabetas, miokardo infarktas, arterinė hipertenzija, katarakta, vėžys ir kt., vystymosi patogenezėje. Su laisvųjų radikalų gamyba taip pat siejamas nutukimas bei senėjimas [3,16]. Žmogaus organizme pastoviai formuojasi laisvieji radikalai. Nedidelė jų koncentracija reikalinga ląstelei normaliai funkcionuoti. Jie saugo organizmą nuo bakterijų, virusų, naikina išsigimusias ląsteles [1].

Ląstelės turi mechanizmus, kurie jas apsaugo nuo laisvųjų radikalų nepageidaujamo poveikio. Apsauginį vaidmenį atlieka:

 fermentinė sistema (pvz., superoksido dismutazė, glutationo peroksidazė, gliutationas, gliukozės-6-fosfatazės dehidrogenazė)

 nefermentinė sistema – antioksidantai [1,3,15,17].

Sutrikus pusiausvyrai tarp laisvųjų radikalų formavimosi ir antioksidantinės sistemos pajėgumo, vystosi oksidacinis stresas [1].

Oksidacinis stresas – tai aktyvių deguonies formų ir laisvųjų radikalų poveikis, kurio metu sukeliami ląstelės metabolizmo pokyčiai, susiję su DNR bei baltymų pažeidimu. Lipidų peroksidacija sukelia uždegiminius procesus, širdies ligas, vėžinius susirgimus. Oksidacinio streso metu išsiskiria labai didelis kiekis aktyvių deguonies ir/arba azoto junginių (ROS/RNS) [3,15]. Antioksidantinė sistema patikimai dirba tik tuomet, kai suderintai veikia visi antioksidantai [1].

1.8 Antioksidantai

Antioksidantai - tai medžiagos ar junginiai, kurie žmogaus organizme apsaugo arba pristabdo oksidacijos reakcijų plitimą organuose. Antioksidantai suriša laisvuosius radikalus, neleidžia jiems susiformuoti ir skatina organizmo apsauginius mechanizmus prieš laisvuosius radikalus, taip sumažindami oksidacinį stresą ląstelėse [3,36]. Pagal kilmę antioksidantai yra skirstomi į sintetinius ir natūralius [39]. Iš sintetinių antioksidantų labiausiai paplitęs alkilinti fenoliniai junginiai. Natūraliems antioksidantams priskiriami fenoliniai junginiai ( L-takoferolis, flavonoidai iš jų antocianai, fenolinės r.) askorbo r., karotenoidai ir kt. [32].

Natūralūs antioksidantai skirstomi į mažos molekulinės masės junginius, gali būti tirpūs vandenyje ir riebaluose [3,32].

Vandenyje tirpūs antioksidantai (pvz. askorbo r. ) yra skirti apsaugoti ląstelės citoplazmą, kraujo, limfos ir kitų biologinių skysčių ląsteles nuo savaiminio oksidinimo [3,32].

Riebaluose tirpūs antioksidantai (pvz. karotenoidai, α-takoferolis) lokalizuojasi ten, kur yra laisvųjų radikalų ir peroksidų taikiniai – biologinės struktūros, jos labiausiai pažeidžiamos peroksidinio oksidinimo procesų metu. Tokios struktūros pirmiausiai yra biologinės membranos, kraujo lipoproteidai, o pažeidžiamiausi taikiniai juose yra polinesočiosios riebiosios rūgštys [3,32].

Ląstelė apsaugai naudoja visą spektrą fermentų, inaktyvuojančių radikalus ir peroksidus. Tačiau fermentų antioksidantinė apsauga nėra tokia universali kaip mažos molekulinės masės antioksidantų. Fermentinė antioksidantinė sistema pajėgi surišti tik mažiausiai aktyvius superoksidus. Labiau aktyvūs, atitinkamai ir pavojingesni organizmui radikalai sunaikinami tik dalyvaujant mažos molekulinės masės antioksidantams [32].

Antioksidantų vartojimas padeda išvengti negatyvių oksidinimo reiškinių organizme ir kelia darbingumą [32]. Buvo nustatyta, kad dėl toksinio poveikio žmogaus organizmui, sintetinių antioksidantų vartojimas turi būti ribojamas, todėl ieškoma vis naujų augalinių antioksidantinių šaltinių. Augaluose antioksidantai kaupiasi augalui augant, nokstant. Augaluose galima rasti įvairius antioksidantus, tokius kaip azoto junginiai, vitaminai bei fenoliniai junginiai. In vitro atlikti tyrimai parodė, kad fenoliai yra stipresni antioksidantai net už vitaminą C ir E [39].

1.9 Fenoliniai junginiai

Fenoliai yra antriniai augalų metabolitai, apsaugantys augalus nuo ultravioletinių spindulių, aplinkos streso ir įvairių patogeninių mikroorganizmų. Jie yra svarbūs augalų vystymuisi ir dauginimuisi. Mokslininkai in vitro tyrimų metu nustatė, kad šios molekulės pasižymi stipriu

antioksidantiniu aktyvumu. Daugelis fenolių dalyvauja neutralizuojant žalingus procesus žmogaus organizme [15]. Jie geba tiesiogiai surišti biologinėse sistemose aptinkamus žalingus O2 •-, HO• , ROO• ir NO• radikalus, neradikalinės prigimties ONOO-, 1_O

2, H2O2 ir HOCl rūgštį, taip pat

nefiziologinius radikalus, tokius kaip DPPH• ir ABTS•+ [3].

Įvairiuose augaluose randama apie 8000 natūralių junginių, priklausančių fenolinių junginių klasei. Juos sieja bendra struktūrinė savybė: aromatinis žiedas, prie kurio prijungtos viena ar keletas hidroksilo grupių bei galimos kitos cheminės modifikacijos [3,15,34]. Fenoliniai junginiai dažnai yra vadinami - polifenoliais. Fenoliai skirstomi į keturias pagrindines klases: flavonoidus, fenolines rūgštis, ligninus, stilbenus, (2 lentelė) [34].

2 lentelė. Pagrindinės fenolinių junginių klasės ir struktūrinės formulės

Fenolinių junginių klasė Struktūrinė formulė

Flavonoidai

Fenolinės rūgštys

Ligninai

Gamtoje fenoliai skirstomi į mažai paplitusius (pirokatecholis, rezorcinolis), plačiai paplitusius (flavonoidai ir jų dariniai) ir polimerus (taninai, ligninai) [37]. Fenolinės rūgštys ir flavonoidai yra labiausiai ištyrinėtos ir daugiausiai junginų turinčios grupės [34,37] (5pav.).

5 pav. Fenolinių junginių klasifikacija

Fenolinės rūgštys skirstomos į 2 klases [4,12]. Fenolinių rūgščių antioksidantinį aktyvumą lemia funkcinių hidroksi (-OH) grupių skaičius ir jų pozicija, lyginant juos su karboksi (-COOH) grupe. Didėjant -OH grupių skaičiui fenolinių rūgščių molekulėje, didėja ir jų antioksidantinis aktyvumas [12].

Flavonoidinių polifenolių išskiriama daugiausiai. Jų struktūra C6-C3-C6 turi 15 anglies atomų ir

yra suskirstyti į 6 pogrupius [3,15,37].

Daugiausiai fenolių randama aukštesniuosiuose augalų audiniuose, vaisiuose (vynuogėse, obuoliuose, kriaušėse, uogose) daržovėse, grūduose, šokolade taip pat įvairios kilmės augaliniuose skysčiuose arbatoje ir kavoje, vyne. Juos taip pat sintetina kai kurios grybų ir bakterijų rūšys. Fenoliai suteikia augalui kartumo skonį, kvapą, spalvą. Tyrimai parodė, kad ilgainiui vartojant maistą prisotintą fenoliais galima apsisaugoti nuo vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto, astmos, osteoporozės,

Fenoliniai junginiai

Fenolinės rūgštys

Ligninai Stilbenai Flavonoidai

Hidroksi-benzenkarb oksirūgštys Hidroksi-cinamono rūgštys Izoflavo-noidai

Flavonoliai Flavonai Katechimai Flavononai

Antociani-dai Galo Vanilino Siringo Protokate-cho rūgštys Kavos Ferulo Sinapo Chlorogeno p-kumaro rūgštys Genisteinas Daidzeinas Glyciteinas Formononi-tinas Cianidinas Pelargoni-dinas Delfinidinas Peonidinas Malvidinas Eriodiktio-nas Hesperidi-nas Naringeni-nas Katechimas Apikatechi-mas Epigaloka-techimas Epikate-chimo galatas Epigaloka-techimo galatas Apigeninas Chritezinas Liuteolinas Kvercetinas Kemferolis Miricetinas Galantinas Gisetinas

infekcijų ir neurodegeneracinių ligų. Fenolių kiekiui augaluose daro įtaką daugybė veiksnių - augalo veislė, rūšis, prinokimo laipsnis, derliaus nuėmimas, aplinkos veiksniai perdirbimo ir saugojimo metu. Buvo pastebėta, kad fenolių rūgšties kiekis mažėja augalui bręstant. Fenoliai pasižymi funkcijų įvairove: vieni jų gali būti toksiniai kiti pritraukiantys apdulkintojus ir sėklų platintojus. [12,15,37,34].

1.10 Fenolinių junginių išskyrimas ir analizės metodai

Siekiant išanalizuoti fenolinius junginius, esančius augalinėje žaliavoje, pirmiausiai turi būti atliktas teisingas bandinio paruošimas. Bandinys gali būti džiovinamas ore, džiovyklėje arba veikiamas šalčio, paskui sumalamas. Tyrimai parodė, kad liofilizacijos metu išlieka daugiau fenolinių junginių nei džiovinant. Ekstrakcijai fenoliniai junginiai gali būti išgaunami iš šviežių, sušaldytų arba džiovintų augalų mėginių. Kaip tirpikliai gali būti naudojamas metanolis, etanolis, acetonas, etilocitatas, įvairūs jų deriniai tarpusavyje arba mišiniai su išgrynintu vandeniu. Nuo tirpiklio priklauso kokį kiekį polifenolių norima išgauti. Ekstrakcijos metu svarbu pasirinkti tinkamą temperatūrą. Įprastai fenolių koncentracija nustatoma esant 20-50ºC, nes daugiau kaip 70ºC skatina greitą fenolių skilimą. Bandinių ekstrakcijai dažniausiai pasirenkami metodai, kurie yra efektyvūs, greiti, mažina organinių tirpiklių sąnaudas, - tai superkritinių skysčių ekstrakcija, ekstrakcija ultragarsu, mikrobangomis, aukštu slėgiu [15,30].

Mokslinės literatūros šaltiniuose fenolinių junginių analizės metodai parenkami atsižvelgiant į tyrimo tikslą, mėginio pobūdį. Dažniausiai taikomi šie metodai: efektyvioji skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija, dujų chromatografija – masių spektrometrija, taip pat spektrofotometrija, plonasluoksne chromatografija. Plačiausiai rykštenės veikliųjų medžiagų analizei naudojami efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) ir dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) analizės metodai [2]. Fenolinių junginių identifikavimas paremtas fenolinės grupės dalyvavimu oksidacijos reakcijose, jei tos pačios reakcijos metu yra oksiduojama fenolinė grupė ir redukuojamas reagentas, tuomet galimas kiekybinis nustatymas, kuris dažnai atliekamas spektrofotometriniu metodu, nes fenoliai sudaryti iš vieno ar kelių aromatinių žiedų, absorbuojančių UV šviesą [30].

1.11 Spektrofotometrinis metodas

Spektrofotometrinis metodas tai vienas iš paprasčiausių kiekybiniam įvertinimui taikomų metodų. Šis metodas pagrįstas šviesos absorbcijos matavimu, kiek šviesos cheminė medžiaga absorbuoja. Tiriamosios medžiagos tirpalo spalvos intensyvumas lyginamas su standartinio tirpalo

šviesos intensyvumu. Pagrindinis principas tas, kad kiekvienas junginys sugeria arba praleidžia šviesą per tam tikrame diapazone esantį bangos ilgį. Spektrofotometrinis metodas yra jautrus ir pakankamai greitas [3,43]. Prieš naudojant spektrofotometrinį metodą vienos ar kitos medžiagos kiekybiniam nustatymui, pirmiausiai sudaromas kalibravimo grafikas naudojant standartinius tirpalus su tiksliai žinomomis analizuojamos medžiagos koncentracijomis. Išmatavus absorbciją brėžiamas gradavimo grafikas, abscisų ašyje atidedant koncentracijas, o ordinačių ašyje absorbciją. Vėliau išmatavus analizuojamo tirpalo absorbciją, pagal gradavimo grafiką randama ieškomos medžiagos koncentracija tirpale [14].

Spektrofotometrinis metodas taikomas sudėtiniuose mišiniuose, tokiuose kaip augalinės žaliavos ekstraktai, maisto ir biologiniai pavyzdžiai, įvertina visų bandinyje esančių junginių suminį antioksidantinį aktyvumą, tačiau jis netinka individualiems junginiams nustatyti [3]. Šis metodas dažnai taikomas fenolinių junginių nustatymui Asteracea šeimos augalų žaliavoje [23].

1.12 Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

Literatūroje aprašyti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai pagal veikimo mechanizmą yra skirstomi į dvi grupes.

Metodai pagrįsti vandenilio perdavimo reakcijomis vyksta konkurencinės reakcijos tarp antioksidanto ir substrato, konkuruojantys dėl termiškai generuotų peroksilo radikalų. (ORAC, TRAP) [3].

ORAC - Deguonies radikalų absorbcijos pajėgumo nustatymo metodas. Jo metu antioksidantas absorbuoja deguonies radikalą, taip yra nutraukiama deguonies radikalų sukelta oksidacija, nes prie radikalo prijungiamas vandenilio atomas. Tyrime deguonies radikalas nuo fluorescencinio junginio prisijungia prie junginio, kuris nepasižymi fluorescencinėmis savybėmis, taip galima kiekybiškai nustatyti fluorescencijos intensyvumą. Antioksidanto geba mažinti deguonies radikalų kiekį yra nustatoma laikui bėgant [25].

TRAP - Bendro radikalų gaudyklės parametro nustatymo metodas, juo nustatoma antioksidantų junginių geba prisijungti deguonies radikalą, susidariusį iš AAPH ar ABAP (2,2-azobis-(2-amidopropanas) dihidrochloridas). Šiuo metodu nustatomas antioksidantų sulaikymo laikas, proporcingas antioksidantiniam aktyvumui [41].

Metodai pagrįsti elektronų perdavimo reakcijomis, kurių principas yra oksidanto redukavimas iki kitokios spalvos junginio (TEAC, DPPH, FRAP, CUPRAC) [3].

DPPH - (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil-hidratas) - laisvųjų radikalų metodas taikomas antioksidantiniam poveikiui įvertinti. Tai tamsiai violetinės spalvos kristalai tirpstantys organiniuose

tirpikliuose. Naudojant DPPH galima lengvai įvertinti antioksidantinį poveikį spektrofotometro pagalba matuojant absorbcijos sumažėjimą prie fiksuoto bangos ilgio (515-528nm intervale). Metodo principas pagrįstas spalvų kaita (vandenilio atomas yra atiduodamas molekulei, DPPH radikalai yra redukuojami) susidaro stabili ne radikalinė DPPH forma ir violetinė spalva pereina iki geltonos [29,43,36].

FRAP - ( geležies jonų redukcijos, antioksidantinės galios tyrimas) šis metodas įvertina antioksidantų gebėjimą redukuotis iš juodos spalvos geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino (Fe(III)-TPTZ) komplekso į intensyviai mėlynos spalvos (Fe(II)-TPTZ) kompleksą, reakcija vyksta rūgštinėje terpėje. Absorbcijos padidėjimas išmatuojamas prie 593 nm bangos ilgio [3,12].

CUPRAC metodas (vario jonų redukcijos antioksidantinės galios tyrimas) pagrįstas dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) komplekso redukcija antioksidantu į chromogeninį Cu(I)-Nc kompleksą, kurio absorbcijos maksimumas yra prie 450 nm bangos ilgio. Tyrimai CUPRAC metodu yra atliekami neutraliomis pH7 terpėje [3,9].

ABTS arba TEAC - radikalų-katijonų surišimo metodas (2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)). Šis metodas pagrįstas jonų mainais, aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu (TEAC). Šio metodo esmė: oksiduotas ABTS peroksido radikalas, virsta spalvotu ABTS•+ katijonu. Tyrimo metu yra matuojama reaguojančių junginių geba sumažinti ABTS•+ radikalo spalvos intensyvumą. Sumaišius spalvotą ABTS tirpalą su medžiaga, kuri gali būti oksiduota, ABTS tirpalas praranda spalvą, o medžiaga įgauna kitą spalvą. Spektrofotometru matuojama ABTS•+ spalvos absorbcija esant tokiems bangų ilgiams: 415, 645, 734 ir 815 nm. Šis metodas pasižymi pigumu ir paprastumu. Jis yra naudojamas daugelyje mokslinių tyrimų, gali būti taikomas plačiame pH intervale. Atsižvelgiant į pH, galima reguliuoti pagal kurį mechanizmą vyks reakcija. ABTS•+ yra tirpus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, neturi įtakos joninei jėgai, todėl gali būti naudojamas daugelyje tyrimų nustatant hidrofilinių ir lipofilinių antioksidantų oksidacinį pajėgumą ekstraktuose, maiste, gėrimuose, biologiniuose žmogaus organizmo skysčiuose. Šis metodas turi ir trūkumų tačiau jie nėra esminiai ir netrukdo plačiam jo panaudojimui [3,12,43,36].

Korėjoje buvo atliktas tyrimas siekiant ištirti antioksidantų aktyvumą laukiniuose augalų ekstraktuose tarp kurių buvo ir Solidago virgaurea. Antioksidantiniam aktyvumui nustatyti buvo pasirinkti DPPH ir ABTS metodai. Tyrimas parodė, kad šie augalai turi daug naudingų polifenolių ir jie gali būti naudingais antioksidantų šaltiniais apsaugančiais žmogaus ląsteles nuo laisvųjų radikalų pažaidos. Tyrimų rezultatai neparodė reikšmingos koreliacijos tarp DPPH ir ABTS metodų [45].

2013 m. publikuotame straipsnyje buvo aprašytas tyrimas, kurio tikslas nustatyti antioksidantinį aktyvumą augalų labiausiai paplitusių Graikijoje (Eucalyptus globulus, Origanum vulgare, Mentha pulegium, Thymus vulgaris, Lavandula vera, Rosmarinus officinalis, Matricaria chamomilla, Mellisa officinalis, Salvia officinalis). Augalai buvo atrinkti pagal bendrą fenolių kiekį,

fenolinių junginių buvimas buvo patvirtintas Folin-Ciocalteu metodu. Antioksidantinį aktyvumą nustatyti buvo pasirinkta ABTS ir DPPH metodais. Atsižvelgiant į rezultatus buvo padaryta išvada, kad abu metodai geba sujungti laisvuosius radikalus [40]. Dirbant tiksliai ABTS metodas yra labai paprastas, veiksmingas ir automatizuotas [43]. ATBS metodas bus taikomas šio tyrimo metu.

1.13 Literatūros apžvalgos apibendrinimas

Analizuojant mokslinės literatūros šaltinius galima teigti, kad Solidago L. augalai yra paplitę visame pasaulyje. Lietuvoje paplitusi kanadinė rykštenė (S. canadensis) taip pat S. gigantea, S. virgaurea. Tyrimais nustatyta, kad rykštenės (Solidago L.) vandeniniai, etanoliniai ir metanoliniai ekstraktai pasižymi antimikrobiniu, diuretiniu, analgetiniu, prišgrybeliniu, antioksidantiniu, antimuskarininiu ir hipotenziniu poveikiu, taip pat buvo plačiai naudojama liaudies medicinoje kaip diuretikas, sutrikus virškinimui, viduriuojant, sergant bronchine astma, plaučių tuberkulioze, ūmių kvėpavimo takų infekcijomis, ūminiu laringitu, gripu, reumatu, artritu, enteritu, diabetu. Išoriškai naudojamas augalo ištraukos gydo sunkiai gyjančias žaizdas.

Mokslinių tyrimų rezultatai parodė, kad Solidago L. žaliavoje kaupiamos tokios veikliosios medžiagos, kaip diterpenai, triterpeniniai saponinai, flavonoidai, flavonoidinių glikozidų, eteriniai aliejai, monosacharidai, fenolinės rūgštys: chlorogeno, vanilino, kofeino, p-kumarino, nikotino, salicilo ir acto. Rasta saponinų kurie būdingi tik rykštenėms (S. virgaurea, S. canadensis, S. gigantea). Tyrimais įrodyta, kad Solidago L. žaliavoje kaupiasi kalio, magnio, geležies, vario, cinko mineralinės medžiagos.

Solidago L. flavonoidai, taninai ir fenoliniai junginiai yra dominuojančios grupės, kurios sudaro didžiają dalį visų Solidago L. augaluose besikaupiančių veikliųjų medžiagų.

Fenolinių junginių molekulės pasižymi stipriu antioksidantiniu aktyvumu, kadangi yra tiesiogiai susiję su laisvųjų radikalų surišimu biologinėse sistemose ir daugelis dalyvauja neutralizuojant žalingus procesus žmogaus organizme. Jų antioksidantinis aktyvumas įrodytas daugybe in vitro tyrimų, jie geba tiesiogiai surišti biologinėse sistemose aptinkamus žalingus radikalus. Ilgainiui vartojant maistą prisotintą fenoliais galima apsisaugoti nuo vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, diabeto, osteoporozės, infekcijų ir neurodegeneracinių ligų, astmos.

Mokslinės literatūros šaltiniuose fenolinių junginių nustatymui taikomi šie metodai: efektyvioji skysčių chromatografija kartu su masių spektrometrija, dujų chromatografija – masių spektrometrija, taip pat spektrofotometrija ir plonasluoksnė chromatografija.

2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI

2.1 Tyrimo objektas

Solidago L. rūšies augalų tyrimai atlikti su 2 rykštenės rūšimis: S. virgaurea, S. canadensis. Analitiniai tyrimai atlikti su išdžiovintais, mechaniškai susmulkintais rykštenės lapais ir žiedais. Žaliava surinkta Vilniaus, Kauno, Rokiškio rajonuose (5 pav.).

5 pav. Solidago L. augalinės žaliavos rinkimo vietos

Tiriamieji augalų preparatai buvo išskirstyti pagal rūšis ir paženklinti atitinkamais ženklinimais, pateiktais 3 ir 4 lentelėse.

3 lentelė. S. virgaurea pavyzdžių ženklinimas ir rinkimo vietovės

Augalo pavadinimas Pavyzdžio numeris Rajonas

12V Vilniaus rajonas

13V Rokiškio rajonas

Solidago virgaurea 14V Vilniaus rajonas

15V Vilniaus rajonas

4 lentelė. S. canadensis pavyzdžių ženklinimas ir rinkimo vietovės

Augalo pavadinimas Pavyzdžio numeris Rajonas

17C Rokiškio rajonas

Solidago canadensis 18C Vilniaus rajonas

19C Vilniaus rajonas

20C Kauno rajonas

2.2 Naudoti reagentai ir tirpikliai

1. Metanolis 99% įsigytas iš Sigma-Aldrich (Buchs, Jav.)

2. 2,2ꞌ-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties)(ABTS) diamonio druskos milteliai (99 proc.) 3. Kalio persulfatas (99,8 proc.)(Alfa Aesar, Vokietija)

4. Išgrynintas vanduo.

5. Naudotas standartas troloksas ≥98% paruošti tirpalai iš Fluka (Buch, Šveicarija).

2.3 Naudota aparatūra

1. Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mavajai, JAV); 2. Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedford, MA)

3. Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija) 4. Analitines svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija)

5. Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV)

2.4 Rykštenės augalinės žaliavos ir metanolinių ekstraktų paruošimas analitiniams

tyrimams

Žaliava džiovinta šildomojoje džiovykloje 45ºC temperatūroje, saugoma tamsioje, vėsioje ir vėdinamoje patalpoje. Išdžiovinta augalinė žaliava mechaniškai susmulkinama elektriniu malūnėliu.

Tiriamieji mėginiai ruošiami ultragarsinės ekstrakcijos būdu. Ekstraktų ruošimui naudotas 70% metanolio ir išgryninto vandens mišinys. Gaminta 10 ml metanolinio ekstrakto, sverta rykštenės lapų, žiedų ėminiai 0,1 g. (tikslus svėrinys), gaminant santykiu 1:100 (v/v). Paruošti ekstraktai buvo laikomi

ultragarso vonelėje 50 min. palaikant pastovią 25°C temperatūrą, filtruojami per 0,45µm membraminius filtrus (Q-Max RR Syringe Filters, PTFE).

2.5 Radikalo-katijono surišimas ABTS metodu

Tiriamųjų bandinių radikalo-katijono surišimas tirtas ABTS spektrofotometriniu metodu. ABTS darbinio tirpalo paruošimas. 54,865 mg ABTS diamonio druskos miltelių ir 9,461 mg kalio persulfato ištirpinta 50ml išgryninto vandens. Paruoštas tirpalas 16-17 val. laikomas kambario temperatūroje tamsoje, kol ABTS ir kalio persulfatas visiškai sureaguoja. Reakcijos metu susidaro stabilus ABTS radikalas-katijonas. Gautas pradinis ABTS radikalo-katijono tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu iki darbinės 0,7±0,005 AV koncentracijos, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui. Šviežias darbinis ABTS.+ _{laikomas tamsaus stiklo butelyje, saugančiame nuo tiesioginės saulės} šviesos.

ABTS laisvojo radikalo surišimo metodika: 40µl tiriamojo rykštenės ekstrakto sumaišoma kiuvetėje su 2,9 ml darbinio ABTS.+ _{tirpalo. Sumaišytas tiriamasis mėginys 60 min. laikomas tamsoje,} po to spektrofotometru (,,Dinamica’’, Halo DB-20, Šveicarija) išmatuojamas mišinio absorbcijos sumažėjimas, esant 734 nm šviesos bangos ilgiui.

Antiradikalinio aktyvumo apskaičiavimas: Rykštenės ekstrakto antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas troloksui ekvivalentiška antioksidacine galia (TEAG) [35].

TEAG apskaičiuojamas pagal trolokso kalibracinę kreivę (kalibracijos ribos, 7,2µg 𝑚𝑙−1₋

920µg 𝑚𝑙−1₎

Y =0.6784-0.000736x X - TEAG (µg 𝑚𝑙−1 ₎

Koreliacijos koeficientas: 𝑅2_{= 0.99}

2.6 Duomenų apdorojimas ir statistinė analizė

Tyrimų duomenys apdoroti Microsoft Office Excel 2013 (Microsoft, JAV) ir „SPSS 20“ (IBM, JAV) programinėmis įrangomis. Bandymai buvo pakartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip vidutinė reikšmė, paskaičiuotas standartinis nuokrypis (SN). Apskaičiuotas tyrimo duomenų standartinis santykinis nuokrypis (SSN). Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.

Gautos S. virgaurea ir S. canadensis lapų ir žiedų antioksidantinės galios vidutinės reikšmės ir standartiniai nuokrypiai pateikti 5 ir 6 lentelėse.

5 lentelė. Statistinės S. virgaurea lapų ir žiedų reikšmės išreikštos TEAGABTS, µg/g

Solidago virgaurea Nr. Lapai SN(±) SSN Žiedai (SN) SN(±) SSN 12V 914,265 0,97 0,0011 899,32 2,88 0,0032 13V 907,47 0,96 0,0011 840,895 2,88 0,0031 14V 910,87 1,92 0,0021 866,03 1,92 0,0022 15V 906,115 0,95 0,0011 872,145 2,88 0,0033 16V 907,45 0,99 0,0011 895,92 1,92 0,0021

6 lentelė. Statistinės S. canadensis lapų ir žiedų reikšmės išreikštos TEAGABTS, µg/g

Solidago canadensis Nr. Lapai SN(±) SNN Žiedai (SN) SN(±) SNN 17C 895,92 1,92 0,0021 895,245 4,80 0,0054 18C 870,145 7,63 0,0088 870,79 0,96 0,0011 19C 867,39 3,85 0,0044 881,655 2,88 0,0032 20C 893,21 1,92 0,0022 837,50 3,85 0,0046

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 Solidago L. augalų antioksidantiniai tyrimai spektrofotometriniu metodu

Siekiant įvertinti Solidago L. antioksidantinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu, šiame skyriuje pateikiami ir analizuojami S. virgaurea ir S. canadensis lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų tyrimo rezultatai. Antioksidantinis aktyvumas nustatomas panaudojant ABTS+ radikalą, kadangi tai yra lengvas, stabilus, patikimas, jautrus ir nebrangus metodas [43].

3.2 Antioksidantinio aktyvumo rezultatų įvertinimas

Tyrimo metu buvo lyginamas antioksidantinis aktyvumas tarp S. virgaurea lapų ir žiedų, S. canadensis lapų ir žiedų, jų metanoliniuose ekstraktuose. Taip pat įvertinama antioksidantinio aktyvumo priklausomybė nuo augimo vietos. Atliktas suminis Solidago L. rūšies augalų lapų ir žiedų palyginimas.

3.2.1 Solidago virgaurea lapų ir žiedų antioksidantinis įvertinimas

6 paveiksle pateikti duomenys apie S. virgaurea lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų antioksidantinį kiekį žaliavoje µg/g. Norint nustatyti antioksidantų kiekį augalo lapuose ir palygintį su žiedais, tyrimams buvo paimti Lietuvoje augantys S. virgaurea augalai iš skirtingų augaviečių. Tyrimais nustatyta, kad S. virgaurea lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų antioksidantiniai kiekiai žaliavose surinktose skirtingose augavietėse skyrėsi. Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti augalo lapuose lyginant su žiedais visuose augavietėse. Rezultatai svyravo nuo (914,265±0,97µg/g) iki (906,115±0,95µg/g). Tuo tarpu žiedų ekstraktuose buvo aptikta nuo (899,32±2,88µg/g) iki (840,90±2,88µg/g). Didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo 12V ir 14V lapų mėginiai, 13V ir 16V lapų mėginiuose antioksidantinė koncentracija skyrėsi nežymiai, o mažiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo 15V mėginio lapai. Didžiausi S. virgaurea žiedų antioksidantiniai kiekiai nustatyti 12V taip pat 16V mėginiuose. 13V pavyzdžio žiedų antioksidantinis aktyvumas buvo mažiausias (840,90±2,88µg/g.) jo koncentracija palyginus su lapais skyrėsi 1,08 karto, tuo tarpu 12V ir 16V koncentracija skyrėsi 1,01 karto. Statistiškai reikšmingi skirtumai (p<0,05) nustatyti 13V ,14V ir 15 V mėginiuose tarp lapų ir žiedų, tuo tarpu kituose pavyzdžiuose tarp lapų ir žiedų statistinis

reikšmingumas nenustatytas. Statistiškai reikšmingi rezultatai (p<0,05) gauti tarp skirtingų pavyzdžių vertinant žiedų antioksidantinę galią, tarp lapų rezultatų reikšmingų skirtumų nenustatyta.

Iš pateiktų duomenų galime spręsti, kad didesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo S. virgaurea lapai visose tirtose augavietėse. 12V mėginyje esančios žaliavos antioksidantinis kiekis buvo didžiausias ir lapuose ir žieduose, o mažiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas 13V mėginio žieduose.

6 pav. Solidago virgaurea lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų antioksidantiniai kiekiai µg/g.

3.2.2 Solidago canadensis lapų ir žiedų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas

Įvertinus (žr.7 pav.) S. canadensis lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų antioksidantinius kiekius surinktoje žaliavoje skirtingose augavietėse nustatyta, kad skirtumas tarp lapų ir žiedų 17C ir 18C pavyzdžiuose labai nedidelis, tačiau 19C pavyzdžio žieduose antioksidantų kiekis buvo 1,02 karto didesnis nei lapuose. O 20C lapai buvo aktyvesni už žiedus 1,06 karto.

Didžiausia antioksidantinė galia nustatyta lapuose 17C (895,92±1,92µg/g) ir 20C (893,21±1,92µg/g) pavyzdžiuose. Pateikti duomenys rodo, kad antioksidantinis kiekis 17C žieduose buvo taip pat labai aukštas (895,25±4,80µg/g.), mažiausiu antioksidantiniu pajėgumu pasižymėjo 20C žiedai (837,50±3,85µg/g). Statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) nustatytas 20C mėginyje tarp lapų ir žiedų, tuo tarpu kituose pavyzdžiuose tarp lapų ir žiedų statistinis reikšmingumas nenustatytas.

914,265 907,47 910,87 906,115 907,45 899,32 840,9 866,03 872,15 895,92 780 800 820 840 860 880 900 920 940 12V 13V 14V 15V 16V k o ncent ra cij a µ g /g Lapai Žiedai

7 pav. Solidago canadensis lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų antioksidantiniai kiekiai µg/g.

3.2.3 Solidago virgaurea lapų ir žiedų suminiai antioksidantinių kiekių vidurkiai

skirtingose Lietuvos vietovėse

8 paveiksle pateikti duomenys apie analizuotus S. virgaurea lapų ir žiedų suminių vidurkių antioksidantinius kiekius iš rykštenės žaliavos surinktos skirtingose Lietuvos miestuose. Tyrimo rezultatai parodė, kad didesniu antioksidantiniu kiekiu pasižymi S. virgaurea lapai visuose trijuose vietovėse palyginus su žiedais. Didžiausias antioksidantinis kiekis nustatytas Vilniaus rajono lapų žaliavoje (910,41±4,09 µg/g). Rokiškio ir Kauno rajonuose lapų antioksidantiniai kiekiai pasiskirstė tolygiai – (907,45±0,96) ir (907,47±0,99µg/g). Suminių vidurkių antioksidantinis aktyvumas žieduose varijavo nuo (840,9±2,88µg/g) iki (895,92±1,92µg/g). Didžiausias suminis antioksidantų kiekis (895,92±1,92 µg/g) nustatytas Kauno rajone surinktoje S. virgaurea žiedų žaliavoje. Statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti tarp žiedų suminių vidurkių kiekių, skirtingose augavietėse (p<0,05). Vertinant lapų ėminius tarp skirtingų augaviečių statistinis reikšmingumas nenustatytas (p>0,05).

Iš pateiktų duomenų matome, kad Vilniaus rajone surinkta S. virgaurea lapų žaliava pasižymėjo didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu, lyginant su Rokiškio ir Kauno rajonais. Didžiausia žiedų antioksidantinė geba nustatyta Kauno rajone surinktoje žaliavoje.

895,92 870,145 _867,39 893,21 895,25 870,79 881,66 837,5 780 800 820 840 860 880 900 920 17C 18C 19C 20C k o ncent ra cij a µg /g Lapai Žiedai

8.pav. Skirtingose Lietuvos rajonuose surinktos Solidago virgaurea žaliavos (lapų ir žiedų) ekstraktų antioksidantiniai aktyvumai

3.2.4 Solidago canadensis lapų ir žiedų suminiai antioksidantinių kiekių vidurkiai

skirtingose Lietuvos vietovėse

Analizuojant 9 paveiksle pateiktus S. canadensis lapų ir žiedų suminių vidurkių antioksidantinius kiekius žaliavoje surinktoje Vilniaus, Kauno ir Rokiškio rajonuose. Iš pateiktų duomenų matome, kad kiekiai lapuose svyruoja nuo (868,77±1,95µg/g) iki (895,92±1,92µg/g). Nustatyta, kad lapų žaliavoje surinktoje Rokiškio rajone suminis vidurkis lapuose yra (895,92±1,92µg/g), o žieduose - (895,25±4,80µg/g). Pateikti duomenys rodo, kad antioksidantinė koncentracija lapuose ir žieduose yra vienodai aukšta. Kauno rajone surinkto ir ištirto S. canadensis antioksidantinis rodyklis lapuose yra (893,21±1,92µg/g) žieduose (837,5±3,85µg/g). Nustatyta, kad Kauno rajone S. canadensis suminių vidurkių antioksidantinis kiekis tarp lapų ir žiedų skiriasi 1,07 karto, lapuose yra daug didesnis, nei žieduose. Vilniaus rajono Solidago canadensis antioksidantinis kiekis lapuose buvo (868,77±1,92µg/g) žieduose (876,23±7,69µg/g). Tai reiškia, kad Vilniaus rajone surinktoje žaliavoje antioksidantinis kiekis žieduose yra didesnis nei lapuose. Statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti vertinant lapų ėminius ir žiedų ėminius, tarp skirtingu augaviečių (p<0,05). Kauno rajone surinktoje žaliavoje statistiškai reikšmingi rezultatai nustatyti tarp lapų ir žiedų (p<0,05) , kituose regionuose statistiškai reikšmingo skirtumo nebuvo (p>0,05) .

Iš pateiktų duomenų matome, kad skirtinguose Lietuvos vietovėse surinktos S. canadensis lapų ir žiedų antioksidantinio kiekio suminis vidurkis yra skirtingas. Nustatyta, kad didžiausiu

910,42 _{907,47 907,45} 879,17 840,9 895,92 780 800 820 840 860 880 900 920

Vilniaus r. Rokiškio r. Kauno r.

k o n centra cija µ g /g Lapai Žiedai

antioksidantiniu kiekiu pasižymi S. canadesis lapai ir žiedai surinkti Rokiškio rajone. Rokiškio ir Kauno rajone didesnis antioksidantų aktyvumas nustatytas lapuose, lyginant su Vilniaus rajonu, tačiau Kauno rajone, lyginant su Vilniaus ir Rokiškio rajonu, antioksidantinis aktyvumas žieduose yra mažesnis.

9 pav. Skirtingose Lietuvos rajonuose surinktos Solidago canadensis žaliavos (lapų ir žiedų) ekstraktų antioksidantiniai aktyvumai

3.2.5 Suminis lyginamasis Solidago L. lapų ir žiedų antioksidantinio aktyvumo

įvertinimas

10 paveiksle pateiktas suminis S. virgaurea ir S. canadensis lapų ir žiedų antioksidantinių kiekių palyginimas. S virgaurea koncentracija lapuose buvo (909,39±3,31µg/g); žieduose – (881,67±23,88µg/g). S canadensis koncentracija lapuose – (874,86±14,99µg/g); žieduose (871,3± 24,65µg/g). Įvertinus S. virgaurea ir S canadensis suminius antioksidantinius kiekius lapų ir žiedų žaliavoje nustatyta, kad S. virgaurea pasižymi didesne antioksidantine koncentracija lapų ir žiedų žaliavoje.

Atlikus galutinius skaičiavimus galima daryti prielaidą, kad S. virgaurea lapų ir žiedų ekstraktai pasižymi didesniu antioksidaciniu aktyvumu nei S. canadensis. Pateikti duomenys rodo, kad S. canadensis žaliavoje antioksidantinis kiekis lapuose ir žieduose mažai kuo skiriasi, tačiau S. virgaurea žaliavos antioksidantinis suminis kiekis tarp žiedų ir lapų skiriasi žymiai ir lapai pasižymi daug aukštesne antioksidantinė geba, lyginant su žiedais. Atlikus statistinį duomenų apdorojimą,

868,77 895,92 _893,21 876,23 895,25 837,5 760 780 800 820 840 860 880 900 920

Vilniaus r. Rokiškio r. Kauno r.

k o ncent ra cij a µg /g Lapai Žiedai

statistiškai reikšmingi skirtumai nustatyti tarp lapų ekstraktų (p<0,05), o tarp žiedų skirtingose augalų rūšyse statistinio reikšmingumo nėra (p>0,05).

10 pav. Suminis Solidago L. lapų ir žiedų antioksidantinio aktyvumo palyginimas tarp skirtingų augalų rūšių.

3.3.Tyrimų rezultatų apibendrinimas

Rykštenės Solidago L. antioksidantiniam aktyvumui nustatyti šiame tyrime buvo taikomas spektrofotometrinis ABTS metodas in vitro.

Tyrimams atlikti buvo naudojama S. virgaurea ir S. canadensis rūšies augalinė žaliava - lapai ir žiedai, surinkti Kauno, Vilniaus ir Rokiškio rajonuose. Tyrimo metu buvo lyginamas antioksidantinis aktyvumas tarp S. virgaurea, S. canadensis lapų ir žiedų metanoliniuose ekstraktuose. Taip pat lyginami suminiai antioksidantų kiekiai tarp skirtingų rūšių.

Tyrimo metu nustatyta, kad tarp S. virgaurea lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo S. virgaurea lapai visose tirtose augavietėse. 12V lapų antioksidacinis aktyvumas buvo didžiausias (914,265±0,97µg/g), o 15V mažiausias. 13V žiedų antioksidantinis aktyvumas buvo mažiausias (840,90±2,88µg/g.) ir jo koncentracija palyginus su lapais skyrėsi 1,08 karto. Statistiškai reikšmingi rezultatai (p˂0,05) gauti tik tarp žiedų iš skirtingų augaviečių, tarp lapų statistinio reikšmingumo nenustatyta.

909,39 874,864 881,6675 871,3 820 840 860 880 900 920 940 Lapai Žiedai k o ncent ra cij a µg /g S. virgaurea S. canadensis

Įvertinus S. canadensis lapų ir žiedų metanolinių ekstraktų antioksidantinę galią nustatyta, kad didžiausia antioksdantų koncentracija yra 17C ir 20C lapų pavyzdžiuose. Rezultatai lapuose svyravo nuo (895,92±1,92µg/g) iki (867,39±3,85µg/g). 18C ir 19C pavyzdyje antioksidantų kiekis buvo didesnis žieduose. Mažiausiu antioksidantiniu pajėgumu pasižymėjo 20C žiedai (837,50±3,85µg/g) jų kiekis palyginus su lapais skyrėsi 1,06 karto. Statistinis reikšmingumas nustatytas tik tarp lapų ir žiedų 20C mėginyje. (p˂0,05).

Didžiausia suminė antioksidantų koncentracija nustatyta S. virgaurea žieduose surinktuose Kauno rajone, o lapuose - Vilniaus rajone. Statistiškai reikšmingi skirtumai (p˂0,05) nustatyti tarp žiedų suminių vidurkių skirtinguose miestuose, lapų mėginiuose tarp skirtingų miestų statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (p˃0,05).

Didžiausiu suminiu antioksidantų kiekiu išsiskyrė S. canadensis lapai ir žiedai iš Rokiškio rajono. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p˂0,05) nustatytas tarp lapų ir žiedų Kauno rajone.

Palyginus S. virgaurea ir S. canadensis augalines žaliavas didesnis antioksidantų kiekis nustatytas S. virgaurea žaliavoje. Lapai pasižymėjo didesne antioksidantine galia lyginant juos su žiedais abiejuose žaliavos rūšyse. Atlikus statistinį duomenų apdorojimą, statistiškai reikšmingas skirtumas (p˂0,05) nustatytas tarp skirtingų rušių lapų ekstraktų.

Mūsų gautus rezultatus patvirtina moksliniai tyrimai kurių metu buvo tirtas polifenolių kiekis Solidago L. žieduose, lapuose ir stiebuose. Lapuose buvo nustatytos didesnės antioksidantų koncentracijos lyginant su žiedais [46].