KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Valdas Jakštas
Lietuvoje augančių gudobelės (crataegus l.)
Genties augalų fitocheminės sudėties įvertinimas
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, farmacija (09 B)
Mokslinis vadovas:
prof. habil. dr. Valdimaras Janulis (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, farmacija – 09 B)
Konsultantas:
TURINYS
SANTRUMPOS 4
ĮVADAS 5
1. LITERATŪROS APŽVALGA 10
1.1 Gudobelės (Crataegus L.) genties charakteristika, sistematikos ypatumai,
augalų paplitimas ir panaudojimas medicinoje 10
1.1.1. Crataegus L. genties apibūdinimas 10 1.1.2. Gudobelių vaistinė augalinė žaliava, pagrindinės veikliosios medžiagos ir
panaudojimas medicinoje 15
1.1.3. Gudobelių moksliniai tyrimai ir fitopreparatai 20
1.2. Flavonoidų charakteristika, cheminės savybės ir panaudojimas medicinoje 21
1.2.1. Flavonoidai – biologiškai aktyvūs junginiai 21
1.2.2. Flavonoidų analizės metodai 25
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI 31
2.1. Tyrimų objektas 31
2.2. Tyrimų metodai 32
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 41
3.1. C. monogyna vegetatyvinių ir generatyvinių organų kiekinės sudėties ir įvairavimo įvertinimas 41
3.1.1. C. monogyna pumpurų flavonoidų sudėties įvairavimo tyrimas 41
3.1.2. C. monogyna žiedų flavonoidų sudėties tyrimas 51
3.1.3. C. monogyna žiedų su lapais žaliavos cheminės sudėties įvairavimo tyrimas 53 3.1.4. Flavonoidų kiekio įvairavimas C. monogyna lapuose 56
3.1.5. C. monogyna vaisių flavonoidų kiekinis tyrimas 69
3.1.6. Flavonoidų kiekio tyrimas C. monogyna šakose ir šaknyse 71 3.2. Biologiškai aktyvių junginių įvairavimas kitose Crataegus rūšyse 75
3.3. Rezultatų apibendrinimas. 88
IŠVADOS 93 LITERATŪROS SĄRAŠAS 95 DISERTACIJOS TEMA SPAUSDINTŲ DARBŲ SĄRAŠAS 106
SANTRUMPOS
DAB Vokietijos farmakopėja (vok. Deutsches Arzneibuch)
ESC efektyvioji skysčių chromatografija (angl. HPLC – high performance liquid chromatography)
ESCOP Europos fitoterapijos mokslinė bendrija GF SSSR Tarybų Sąjungos valstybinė farmakopėja
KE kapiliarinė elektroforezė (angl. CE – capillary electrophoresis) KFE kietų fazių ekstrakcija (angl. SPE – solid phase extraction)
maks maksimali reikšmė
min minimali reikšmė
n imties tūris
N teorinių lėkštelių skaičius
Ph. Eur. Europos farmakopėja (lot. Pharmacopoea Europea) proc. procentai
R s skiriamoji geba
SX vidurkio standartinė paklaida (angl. SE – standard error)
SSN santykinis standartinis nuokrypis (procentinis imties kitimo koeficientas,
angl. RSD – relative standard deviation)
TFA trifluoracto rūgštis (angl. trifluoracetic acid) VAŽ vaistinė augalinė žaliava
ĮVADAS
Pastaruosius penkiolika metų kasmet didėja gydytojų bei pacientų dėmesys augalinės kilmės vaistams bei maisto papildams (Cohen, 2004). Didėjantis susidomėjimas augalinėmis žaliavomis plečia šių žaliavų panaudojimo medicinoje, kosmetikos ir maisto pramonėje galimybes bei skatina naujai, šiuolaikiniais metodais, įvertinti ir aprašyti natūralius išteklius.
Natūralių augalinių išteklių moksliniams tyrimams Europos Sąjungoje skiriamas išskirtinis dėmesys. Paskutiniaisiais metais Europos Sąjungoje paskelbta keletas svarbių dokumentų, numatančių natūralių augalinių išteklių vartojimo ir kokybės užtikrinimo siekius: ,,Geros žemės ūkio praktikos (Good Agricultural Practice)” dokumentas, ,,Nuorodos Geros ūkininkavimo ir rinkimo praktikos taikymui ruošiant vaistinę augalinę žaliavą (Points to consider on Good agricultural and collection practice for starting
materials of herbal origin)”, augalų biotechnologijos perspektyvos Europoje ilgalaikė
vizija „Augalai ateičiai (Plants for the Future)”.
Širdies ir kraujagyslių sistemos ligos yra viena opiausių sveikatinimo problemų. Veiksmingų augalinių preparatų pasirinkimas širdies ir kraujagyslių sistemos ligų planinei fitoterapijai nėra didelis. Gudobelių preparatai – perspektyvūs vaistai širdies ir kraujagyslių sistemos ligoms gydyti (Weiss, Fintelmann, 1999), o jų farmakologinį poveikį patvirtina mokslinių tyrimų duomenys. Europos šalyse, pavyzdžiui Vokietijoje, tarp nereceptinių augalinės kilmės vaistų pagal gydytojų per metus išrašomų dienos dozių skaičių (DDS) gudobelių preparatai užima ketvirtą vietą (79,4 milijonai DDS). Gudobelių preparatams gaminti Vokietijoje per metus sunaudojama daugiau nei 400 tonų šios augalinės žaliavos (Sonnenschein, 2005).
Lietuvos teritorijoje natūraliai auga trys gudobelių rūšys: Crataegus monogyna Jacq., Crataegus laevigata (Poir.) DC., Crataegus rhipidophylla Gand. (Navasaitis ir kt., 2003). C. laevigata radviečių yra Klaipėdos regione, C. rhipidophylla paplitusi visoje Lietuvos teritorijoje, tačiau kai kuriuose regionuose ji reta, ir tik C. monogyna paplitusi ir dažna visoje Respublikoje.
Natūraliai ir daug kur augančios C. monogyna rūšies fitocheminės sudėties nustatymas svarbus vertinant vietinės vaistinės augalinės žaliavos kokybę bei racionaliai vartojant augalinius išteklius.
Vietiniai augaliniai ištekliai gali būti papildomi atvežtinėmis, Lietuvos teritorijoje natūraliai neaugančiomis rūšimis, porūšiais ar varietetais, kurie gali būti auginami Lietuvos gamtinėmis sąlygomis, o jų generatyviniai ir vegetatyviniai organai gali būti vaistinė augalinė žaliava. Introdukuotų gudobelių rūšių tyrimas leistų įvertinti papildomų augalinės žaliavos išteklių naudojimo tikslingumą.
Vertinant vaistingųjų augalų fitocheminę sudėtį svarbiausias rodiklis – tai biologiškai aktyvių junginių kiekio įvairavimas augalų generatyviniuose ir vegetatyviniuose organuose. Vaistinės augalinės žaliavos fitocheminės sudėties įvertinimui reikalingos žinios apie biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus augalų organuose ir audiniuose, cheminės sudėties įvairavimą skirtinguose krašto fitogeografiniuose regionuose rinktoje vaistinėje augalinėje žaliavoje bei įvairavimą, priklausantį nuo žaliavos rinkimo sąlygų.
Gudobelių vaistinėje augalinėje žaliavoje viena svarbiausių biologiškai aktyvių junginių grupių yra flavonoidai. Flavonoidų kieko nustatymą sausoje gudobelių žiedų su lapais vaistinėje augalinėje žaliavoje reglamentuoja Europos farmakopėja. Nustačius flavonoidų kokybės ir kiekio įvairavimą Lietuvos gudobelių organuose galima patikimai įvertinti vietinės vaistinės augalinės žaliavos kokybę bei žaliavos išteklių naudojimo pagrįstumą.
Literatūros šaltiniuose nepakanka duomenų apie biologiškai aktyvių junginių kiekius Lietuvoje ruošiamoje gudobelių žaliavoje bei apie biologiškai aktyvių junginių kaupimosi dėsningumus gudobelių generatyviniuose ir vegetatyviniuose organuose. Mokslinė literatūra nepateikia išsamių duomenų apie vienapiestės gudobelės kitų organų (pumpurų, šakų, šaknų, žievės) fitocheminę sudėtį. Atlikti tyrimai papildytų ir patikslintų turimas žinias apie gudobelių biologiškai aktyvių junginių kiekius ir jų įvairavimą. Nustačius viso augalo flavonoidų sudėties įvairavimą, galima tiksliau įvertinti augalo vieno ar kito organo vartojimo galimybes gydymo tikslams. Augalo atskirų dalių cheminės sudėties nustatymas svarbus ne vien ruošiant vaistinę žaliavą, bet ir tiriant flavonoidų kokybės bei kiekio įvairavimų reikšmę augalui. Tokio pobūdžio duomenys leistų panaudoti nustatytus cheminės sudėties skirtumus racionaliai planuojant žaliavos rinkimą, atliekant gudobelių fitopreparatų tikslesnę analizę, bei kryptingai kuriant naujus fitopreparatus.
Kompleksinis flavonoidų kitimų dėsningumų augalų organuose suvokimas svarbus ir reikalingas ieškant naujų vaistinių augalinių žaliavų bei vertinant galimų cheminės sudėties rodiklių įvairavimą kitų augalinių žaliavų ėminiuose.
Darbo tikslas – kompleksiškai ištirti Lietuvoje natūraliose augimvietėse bei lauko
kolekcijose augančių vienapiestės gudobelės bei kitų gudobelės genčiai priskiriamų introdukuotų rūšių vaistinės augalinės žaliavos cheminę sudėtį bei šios sudėties įvairavimą.
Uždaviniai:
1. Atlikti gudobelių lapų, žiedų, pumpurų ir vaisių žaliavų biologiškai aktyvių junginių – flavonoidų kokybinę ir kiekinę analizę skirtingais cheminio tyrimo metodais (ESC, KE, spektrofotometriniu metodu); įvertinti flavonoidų nustatymo efektyviais tyrimo metodais galimybes.
2. Įvertinti flavonoidų kiekius Lietuvos natūraliose augimvietėse rinktuose C.
monogyna pumpuruose, nustatyti pumpurų cheminės sudėties įvairavimą bei
fitocheminių rodiklių pokyčius, priklausančius nuo fenologinės fazės.
3. Įvertinti C. monogyna žiedų vaistinės augalinės žaliavos biologiškai aktyvių junginių kiekius.
4. Įvertinti flavonoidų kiekius natūraliose augimvietėse rinktuose gudobelių žiedų su lapais vaistinės augalinės žaliavos ėminiuose ir nustatyti skirtingose cenopopuliacijose surinktos šios žaliavos cheminės sudėties rodiklių įvairavimą.
5. Įvertinti C. monogyna lapų ėminiuose antrinių metabolitų kiekius; nustatyti lapų augalinės žaliavos fitocheminių rodiklių pokyčius, priklausančius nuo fenologinės fazės. 6. Įvertinti C. monogyna vaisių vaistinės augalinės žaliavos flavonoidų kiekius. 7. Ištirti ir įvertinti flavonoidų kiekius C. monogyna šakose ir šaknyse.
8. Atlikti biologiškai aktyvių junginių – flavonoidų – analizę Lietuvoje auginamų svetimžemių gudobelių rūšių lapų, žiedų ir vaisių; įvertinti skirtingų gudobelių rūšių lapų, žiedų ir vaisių cheminės sudėties skirtumus.
Mokslinio darbo naujumas. Atlikus tyrimus, nustatyta biologiškai aktyvių
junginių – flavonoidų – kokybinė ir kiekinė sudėtis, kuri būdinga vietinei gudobelių vaistinei augalinei žaliavai. Pirmą kartą įvertintas Lietuvos cenopopuliacijose rinktos gudobelių žiedų ir lapų vaistinės žaliavos fitocheminės sudėties įvairavimas.
Pirmą kartą ištirtas Lietuvos gamtinėmis sąlygomis augančių gudobelių lapų žaliavos cheminės sudėties kitimas, priklausantis nuo fenologinės fazės. Pirmą kartą nustatyti hiperozido, viteksin-2”-O-ramnozido, rutino ir kitų flavonoidų kiekių kitimo dėsningumai vegetacijos periodu. Nustatytas hiperozido kiekio didėjimas lapuose vaisių brandos periodu.
Pirmą kartą nustatyti flavonoidų kiekiai Lietuvos teritorijoje rinktuose C. monogyna pumpuruose. Pirmą kartą įvertintas natūraliose augimvietėse rinktų C. monogyna pumpurų fitocheminės sudėties įvairavimas. Pirmą kartą nustatytas flavonoidų kiekių kitimas skirtingu fenologiniu periodu rinktuose gudobelių pumpurų ėminiuose.
Pirmą kartą įvertinta flavonoidų kokybinė ir kiekinė sudėtis C. monogyna šakose ir šaknyse.
Pirmą kartą ištirta Lietuvoje auginamų kolekcinių Crataegus ir Crataegomespilus individų cheminė sudėtis. Nustatyti fitocheminės sudėties skirtumai svetimžemių gudobelių rūšių lapuose, žieduose ir vaisiuose.
Mokslinė ir taikomoji darbo reikšmė. Pirmą kartą atlikti C. monogyna
cenopopuliacijose rinktos augalinės žaliavos biologiškai aktyvių junginių tyrimai padeda detaliau įvertinti natūralius krašto augalinius išteklius, racionaliau juos įsisavinti bei tausoti natūralias augalų populiacijas.
Alikti mažai tirtų gudobelių organų ir audinių (pumpurų, lapų, žievės, šaknų) tyrimai suteikia papildomų duomenų kompleksiniam C. monogyna cheminių rodiklių įvertinimui bei leidžia įvertinti dabar vartojamas ir perspektyvias vaistines augalines žaliavas. Darbo rezultatai parodė, jog C. monogyna pumpurų ir lapų flavonoidų kiekiai didesni nei farmakopėjose aprašytų žiedų ir žiedų su lapais vaistinių augalinių žaliavų. Gudobelių pumpurai ir lapai – tai perspektyvios augalinės žaliavos.
Atlikus svetimžemių gudobelių rūšių kolekcinių individų fitocheminį tyrimą, įvertinti Lietuvoje introdukuotų gudobelių augalinės žaliavos kokybiniai ir kiekiniai rodikliai, nustatytas vaistinės žaliavos ruošimo tikslingumas. Darbo rezultatai parodė, jog introdukuotos svetimžemės gudobelių rūšys gali būti sėkmingai naudojamos vaistinei augalinei žaliavai ruošti auginant šias rūšis didesniu mastu ir taip iš dalies kompensuojant natūralių populiacijų eksploatavimą.
Gauti darbo rezultatai patikslina vaistinės augalinės žaliavos rinkimo rekomendacijas, padeda racionaliau įsisavinti natūralius augalinės žaliavos išteklius.
Darbo rezultatų aprobavimas. Darbo rezultatai pristatyti konferencijose: Maisto
chemija ir technologija (Kaunas, Lietuva, 2005 m. balandžio 20 – 21 d.), Šiuolaikinės vaistažolininkystės raida (Kaunas, Lietuva, 2004 m. rugsėjo 17 – 18 d.), 14 International Symposium on Capillary Electroseparation Techniques (Roma, Italija, 2004 m. rugsėjo 12 – 15 d.), IX. Sjezd Česke farmaceuticke společnosti (Praha, Čekija, 2004 m. gegužės 13 – 15 d.), Fitoterapija i novyje technologii. 21 vek (Černogolovka, Rusija, 2004 m.
sausio 22 – 23 d.), Farmacija šiuolaikinėje visuomenėje (Kaunas, Lietuva, 2003 lapkričio 21 d.), Lietuvos biologinė įvairovė (būklė, struktūra, apsauga) (Vilnius, Lietuva, 2003 m. rugsėjo 25 – 26 d.), XII pasaulio lietuvių mokslo ir kūrybos simpoziumas (Čikaga, JAV, 2003 m. gegužės 21 – 25 d.).
Išspausdinti 8 moksliniai straipsniai (5 – pripažintuose Lietuvos mokslo žurnaluose, 1 – tarptautinės konferencijos užsienyje medžiaga). Išspausdintos 4 pranešimų tezės.
Disertacijos apimtis ir struktūra. Disertaciją sudaro įvadas, literatūros apžvalga,
metodika, tyrimų rezultatai ir jų aptarimas, išvados, literatūros sąrašas (139 literatūros šaltiniai), disertacijos tema paskelbtų darbų sąrašas. Pateikta 16 lentelių ir 38 paveikslai. Disertacijos apimtis 107 puslapiai.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Gudobelės (Crataegus L.) genties charakteristika, sistematikos ypatumai, augalų paplitimas ir panaudojimas medicinoje
1.1.1. Crataegus L. genties apibūdinimas
Gudobelės (Crataegus L.) gentis priklauso erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimos obelinių (Maloideae) pošeimiui (Navasaitis ir kt., 2003). Lotyniškas gudobelės genties pavadinimas Crataegus yra kilęs iš graikiško žodžio “kratos” – jėga, tvirtovė, nes šių augalų kieta mediena ir tvirti dygliai.
Gudobelių būdingi morfologiniai požymiai. Gudobelių – vasaržaliai
daugiakamieniai krūmai arba vienkamieniai medžiai iki 10 metrų aukščio. Subrendusį stiebą dengia pilkos, rusvos, rečiau gelsvos arba oranžinės spalvos žievė, dažnai nelygiai briaunota. Laja rutuliška, kiaušiniška, asimetriška. Šakos tvirtos, tiesios, išsilanksčiusios. Pumpurai smulkūs, apvalūs ar ovalūs, buka ar smailia viršūne, pražanginiai, atsilošę, padengti 4-6 spirale išsidėsčiusiais žvyneliais. Ūgliai rudi arba pilki, plaukuotumo pobūdis (kaip ir pumpurų, lapų bei žiedynų) priklauso nuo taksono. Gudobelėms būdingi dygliai (aksčiai) gali būti įvairių spalvų, ilgio (nuo 1,5 cm C. caucasica iki 10 cm C.
macracantha), tvirtumo ir išlinkimo. Lapai kotuoti, kiaušiniški, atvirkščiai kiaušiniški,
apskriti, elipsiški arba rombiški. Vienos lapalakščio pusės skiaučių skaičius būdingas atskiram taksonui ir gali įvairuoti nuo 1 iki 8. Lapalakščio kraštas gali būti lygus, stambiau ar smulkiau dantytas ar pjūkliškas, o kai kada ir karbuotas. Lapalakščio dydis kinta nuo 1 cm ilgio ir pločio (C. pycnoloba) iki 15 cm (C. mollis). Prielapiai gali būti tiesūs: nukrentantys ar išliekantys, dantyti bei pjūkliški. Gudobelėms būdinga heteroblastija: to paties fenotipo lapų lapalakčių dydis (ilgis ir plotis), skiaučių skaičius, skiautės dantelių skaičius, lapkočių ilgis, prielapių dydis, kinta nuo žydinčių šakų viršutinės iki pamatinės dalies. Skirtumų tarp lapalakščio dydžių ir spalvos gali būti ir tarp atskirų šakų (pavyzdžiui, žydinčių, trumpų ir išilgėjusių metūglių). Žiedai būna sukrauti skėtiškos kekės ar skėčio pavidalo žiedynuose ar augti pavieniui (C. uniflora). Žiedų žiedynuose gali būti iki 50. Kuokelių žiede 5-25 (išsidėstę 1-4 ratuose), viena apatinė mezginė sudaryta iš 1-5, rečiau – šešių vaislapėlių. Liemenėlių gali būti 1-5, rečiau – šeši. Taurėlapiai linijiški arba daugiau ar mažiau trikampiai, kraštas lygus (C.
monogyna, C. laevigata) ar karbuotas.Vainiklapių žiede 5, jie apvalūs, dažniausia balti,
kartais rausvi (kai kurių kultivuojamų C. monogyna ir C. laevigata variantų – tamsiai raudoni). Vaisiai – obuolėliai, rutuliški, plačiai elipsiški ar kiaušiniški, geltonai oranžiniai, raudoni ar juodi, su sausu miltingu ar sultingu minkštimu ir 1-5 kauliukais (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992).
Gudobelių fenologija. Gudobelės žydi vėlų pavasarį ar ankstyvą vasarą (Lietuvoje
– gegužės ir birželio mėn.). Žiedus apdulkina musės, vabalai, bitės, rečiau skruzdėlės. Vaisiai subrandinami vėlyvą vasarą ar rudenį (Lietuvoje – rugpjūčio ir rugsėjo mėn.). Kai kuriais metais dėl vabzdžių ar grybelių poveikio žiedams vaisių būna mažai ar jie būna nesubrendę. Gudobelių sėklas platina didieji paukščiai, smulkūs graužikai, kanopiniai ir lokiai. Sėklos gali plisti tekančiu vandeniu. Sėkloms sudygti reikia 2-6 metų. Individai brandos amžių pasiekia per dešimt ar daugiau metų (Christensen, 1992).
Gudobelių arealas ir paplitimas. Dauguma gudobelių atsparios šalčiams,
šviesamėgės. Nereiklios dirvožemiui, nors geriau auga vidutinio drėgnumo, gerai drenuotuose, kalkinguose dirvožemiuose. Gudobelės auga gerai apšviestose vietose, kalnų ir kalvų šlaituose, miškų aikštelėse, krūmynuose, stepėse, upių šlaituose, ežerų pakrantėse, palaukėse, kirtavietėse, pakelėse ir dykvietėse. Tik dvi rūšys – C. laevigata ir
C. rhipidophylla – gali augti netankiuose miškuose be laukymių. C. monogyna ir C. orientalis ankstyvuoju augalo gyvenimo periodu taip pat gali augti miškuose be
laukymių, tačiau vėliau gudobelės pradeda silpti, nustoja žydėti ir nuvysta. (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992).
Gudobelės natūraliai auga šiaurinio pusrutulio vidurinėje ir pietinėje klimato zonose bei subtropikuose. Daugiausia aprašytų gudobelių rūšių auga Šiaurės Amerikoje. Lietuvos teritorijoje natūraliai auga trys jų rūšys: C. monogyna Jacq., C. laevigata (Poir.) DC., C. rhipidophylla Gand., tačiau auginama dar apie 15 svetimžemių rūšių (Navasaitis ir kt., 2003). Lietuvoje augančios ar auginamos gudobelės sprogsta gegužės mėnesį (kartais birželio pradžioje), vegetuoti baigia anksti, dažniausiai liepos mėnesį, metūgliai iki rudens spėja sumedėti, todėl vietinės ir dauguma kanadietiškų gudobelių nebijo šalnų (Christensen, 1992).
Vienapiestė gudobelė (C. monogyna Jacq.) – tai 2-5 (10) m aukščio krūmas ar
medis. Šakos rusvai pilkos, apaugusios retais rudos spalvos ylos formos aksčiais. Ūgliai pilkai rusvi, pliki ar šiek tiek plaukuoti, aksčiai tvirti, 0,5-1 (iki 2,1) cm ilgio. Pumpurai plačiai kiaušiniški, turi smailią viršūnę. Pumpurų žvyneliai lygūs, rausvi. Lapalakščiai
spalvos, lygi ar nežymiai plaukuota, apatinė pusė pilkai ar pūkuotai žalios spalvos, plaukuota, skiautės aštrios ar bukos, lapo kraštas netolygiai dantytas. Žydinčių ūglių lapai 1,1-5,7 cm ilgio, 0,8-6,0 cm pločio, skiaučių 1-3 poros (retai – lapas neskiautėtas), apatinės skiautės ilgis 1,3-4,2 kartus didesnis už plotį, skiautės lygiakraštės ar su 1-9 danteliais. Lapkočiai 1-3 cm ilgio pliki ar vos plaukuoti. Prielapiai 3-16 mm ilgio, pjautuviški ar inkstiški. Žiedynai skydiški su 4-18 žiedų. Žiedai 1,5-2,5 cm skersmens. Taurėlapiai pailgai trikampiški, apybuke viršūne. Vainiklapiai balti, beveik apskriti 3-7 mm ilgio, 4-7 mm pločio, kuokelių 16-20, dulkinė šviesiai rožinė ar purpurinė, liemenėlis vienas (rečiau – 2), tiesus. Vaisiai elipsiški ar cilindriški, 6-11 mm ilgio, 5-10 mm pločio, tamsiai ar ryškiai raudoni, su išliekančiais atsilenkusiais taurėlapių pėdsakais, kauliukas 1 (rečiau – 2) (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992).
C. monogyna rūšis paplitusi Europoje, išskyrus šiaurines sritis. Natūralus arealas
apima Pietų Skandinaviją ir Pabaltijo regioną šiaurėje, Krymą, Kaukazą, šiaurinį Iraką, Iraną ir Artimuosius Rytus pietryčiuose. Žmonių išplatinta ši rūšis auga laukinėse ekobendrijose ir kituose Šiaurinio pusrutulio regionuose bei Pietiniame pusrutulyje (Christensen, 1992; Williams ir kt. 1989). C. monogyna auga sausų miškų laukymėse, tarp krūmų, atvirose laukymėse, akmenuotuose šlaituose, šalia upių, palaukėse, gyvatvorėse. (Christensen, 1992; Rastitelnyje resursy SSSR, 1987).
Lietuvoje gali augti C. monogyna ir kitų gudobelių rūšių tarprūšiniai hibridai – tai
C. ×media Bechstein (Crataegus monogyna Jacq. ir C. laevigata (Poir.) DC. hibridas) bei C. ×kyrtostyla Fingerhuth (Crataegus monogyna Jacq. ir C. rhipidophylla Gand.
hibridas). Dažnai auginamos dekoratyvinių vienapiesčių gudobelių veislės, ypač
‘Variegata’ – dekoratyvūs krūmai su baltais žiedais ir baltai demėtais lapais, ‘Rubro Plena’ – krūmai ar medeliai su dekoratyviais raudonais pilnaviduriais žiedais.
Grauželinė gudobelė (C. laevigata (Poir.) DC. – 3-5 (8) m aukščio krūmai ar
medžiai. Šakos ir kamienas šviesiai pilki. Ūgliai rausvai rudi, kartais violetinio atspalvio, vos plaukuoti, aksčiai iki 1 cm ilgio. Lapalakščiai kiaušiniški ar atvirkščiai kiaušiniški, ovalūs, buka viršūne, plačiai pleištišku pamatu, odiški, blizgūs, tamsiai žalios spalvos, ties gyslomis blyškiai žalsvi ar plaukuoti, pamatas pleištiškas ar suapvalintas, skiautės bukos ar šiek tiek užaštrintos, lapo kraštas netolygiai dantytas. Žydinčių ūglių lapai 1,3-5,7 cm ilgio, 0,9-5,0 cm pločio, skiaučių 1-2 poros (retai – lapas neskiautėtas). Žiedynai skydiški su 3-12 žiedų. Žiedai 10-20 mm skersmens. Taurėlapiai trikampiški, vainiklapiai balti, 5-10 mm ilgio, 5-9 mm pločio, kuokelių 17-22, dulkinės rausvos (violetinės). Liemenėliai 2-3. Vaisiai smulkūs, raudoni, dažnai miltuoti, pailgai elipsiški, su
išliekančiais atsilenkusiais taurėlapių pėdsakais, 6-14 mm ilgio, 6-12 mm pločio, kauliukų 2-3 (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992).
C. laevigata rūšis paplitusi Vidurio ir Vakarų Europoje, Pietų Skandinavijoje,
Šiaurės Afrikoje. Lietuvoje savaiminė, tačiau žymiai retesnė už vienapiestę gudobelę, radvietės Girulių apylinkėse, Neringoje (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992).
Lietuvoje auginamos ir dekoratyvinės grauželinės gudobelės veislės. Dažna ‘Paul’s
Scarlet’ veislė – dekoratyvūs krūmai su tamsiai raudonais, pilnaviduriais žiedais.
Miškinė gudobelė (C. rhipidophylla Gand.) – 2-5 (8) m aukščio krūmai ar
medžiai. Šakos šviesiai ar rusvai pilkos. Šakelės tamsiai rudos. Ūgliai tamsiai rudi, blizgantys pliki ar vos plaukuoti, aksčiai reti, iki 1,5 cm ilgio. Pumpurai 1,5-4 mm ilgio, kiaušiniški, rudi. Lapalakščiai kiaušiniški ar atvirkščiai kiaušiniški, kartais beveik apskriti ar rombiški, smaila ar apysmaile viršūne, odiški, viršuje blizgūs, tamsiai žalios spalvos, apačioje pilkai žalsvi, plaukuoti, skiautės užaštrintos, kraštas pjūkliškas. Žydinčių ūglių lapai 2-6 cm ilgio, 2-6 cm pločio. Žiedynai skydiški su 5-18 žiedų. Taurėlapiai siaurai trikampiški, vainiklapiai pailgai lancetiški 5-9 mm ilgio, 6-10 mm pločio. Kuokelių 14-20; dulkinės rožinės. Liemenėlių (1-) 2, viršutinėje dalyje dažnai išlinkę. Vaisiai raudoni, neretai turi žalių dėmelių, ovalūs ar elipsiški, 8-15 mm ilgio, 5-11 mm pločio, su išliekančiais atsilenkusiais taurėlapių pėdsakais; kauliukų (1-) 2 (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992).
C. rhipidophylla paplitusi Vidurio ir Pietryčių Europoje, Pietų Skandinavijoje,
Baltijos šalyse, Kryme, Kaukaze. Auga retuose plačialapių medžių ar mišriuose miškuose, pamiškėse, šlaitų pievose, sausose upių pakrantėse (Navasaitis ir kt., 2003; Christensen, 1992; Rastitelnyje resursy SSSR, 1987).
Lietuvoje gali augti C. rhipidophylla Gand. bei C. laevigata (Poir.) DC. tarprūšinis hibridas C. ×macrocarpa Hegetschweiler.
Smulkialapė gudobelė C. microphylla Koch. (syn. Crataegus monogyna Jacq. var. brevispina (Kunze) Franco) – krūmas iki 4 m aukščio, natūraliai augantis Turkijoje,
Kryme, Kaukaze (taip pat ir rytinėjė bei pietinėje Užkaukazėje), šiaurės Irane. Lapalakščiai 1,3-4,3 cm ilgio, 1,2-3,6 cm pločio (Christensen, 1992).
Sibirinė gudobelė C. chlorosarca Maxim. Medis iki 10 m aukščio. Laja
dekotartyvi, piramidės formos. Lapai plačiai kiaušiniški, 9-10 skiaučių, iki 10 cm skersmens. Vaisiai apvalios formos, 1,0 cm diametro, juoda luobele ir žalios spalvos minkštimu. Auga Tolimuosiuose Rytuose, Kamčiatkoje, Sachaline upių pakrantėse,
šlaituose, pamiškėse pavieniui (Rastitelnyje resursy SSSR, 1987; Lietuvos TSR Flora, 4, 1971).
Švelnioji gudobelė C. mollis (Torr. Et Gray) Scheelle. Iki 10 m aukščio medžiai.
Laja plati, rutuliška. Ūgliai rausvai rudi. Šakos pilkos. Aksčiai – iki 5 cm ilgio, tvirti, labai aštrūs, tiesūs, stori, tamsiai rudi. Lapai 6-10 cm ilgio ir 4-10 cm pločio (iki 15 cm ilgio ir pločio), plačiai, beveik trikampiškai kiaušiniški. Pamatai apvalūs, tiesūs arba negiliai širdiški, viršūnės smailios, kraštai stambiai dvigubai dantyti. Viršutinė lapo pusė tamsiai žalia, apatinė šviesiai žalia. Žiedai balti, 2,0-2,5 cm skersmens, susitelkę žiedynuose po 10-15. Vaisiai kiaušinio ar rutulio formos, odelė oranžiškai raudona su baltais taškeliais, žvilganti, su trumpais švelniais plaukeliais, kauliukai 5 (3, 4). Savaime auga Šiaurės Amerikos upių slėnių miškų laukymėse ir pakraščiuose. Lietuvoje aptinkama sulaukėjusi (Christensen, 1992; Navasaitis ir kt., 2003; Gudžinskas, 1999).
Pošvelnė gudobelė Crataegus submollis Sarg. Iki 10 m aukščio medžiai. Lapai
panašūs C. mollis, tačiau lapalakštis daugiau odiškas, tvirtesnis. Vaisiai kiaušinio ar rutulio formos, odelė oranžiškai raudona. Savaime auga Šiaurės Amerikoje.
Sultingoji gudobelė Crataegus succulenta (Link) Schräd. var. macracantha (Lodd.) Eggl. (syn. C. macracantha Loddiges). Krūmas ar medelis iki 6 m aukščio.
Lapalakštis elipsiškas, odiškas, dantytu kraštu, vaisių luobelė ryškiai oranžiškai raudonos spalvos, kieta, blizgi. Rūšiai būdingi ypač ilgi (iki 10 cm) aksčiai. Savaime auga Šiaurės Amerikoje.
+Crataegomespilus dardarii Simon-Louis (syn. Crataegomespillus asnieresi.–
tarpgentinis C. monogyna Jacq. ir Mespilus germanica L. (baltažiedės šliandros) hibridas, todėl jam būdingas morfologinių požymių polimorfizmas (individai gali turėti skirtingų požymių). Medis iki 5 m aukščio. Žiedai dvilyčiai, balti. Skirtingų individų vaisiai gali būti įvairių dydžių: iki 15 mm skersmens, panašūs į gudobelių vaisius, iki 25 mm skersmens, tarpiniai, ir iki 35 mm skersmens, panašūs į šliandrų vaisius. Visų vaisių luobelė rudos spalvos. Augalas auginamas kultūroje, savaime neauga.
Pastaba. Europoje, siekiant geriau vykdyti geros vaistinės augalinės žaliavos
auginimo bei rinkimo praktikos reikalavimus, sėkmingai bandoma kultivuoti perspektyvius gudobelių Crataegus spp. chemotipus (Vokietijoje nuo 1996 m. Pharmaplant, Arternas). Azijoje ir Amerikoje gudobelių vaisiai taip pat renkami nuo selekcijos pagalba atrinktų gudobelių, auginamų kultūroje (Sonnenschein, Plescher 2005; Peschel).
Crataegus spp. sistematikos ypatumai. K. Linėjus (1753) aprašė devynias Crataegus rūšis. Vėliau botanikai aprašė daug naujų gudobelės rūšių, ypač gausų būrį
(apie 1000 rūšių) 19 amžiuje aprašė Naujojo pasaulio floros tyrinėtojai. 18 ir 19 amžiuje dalis mokslininkų manė, kad Crataegus L. gentį reikėtų padalinti į dvi ar daugiau genčių, tačiau toks požiūris neprigijo. Šiuo metu nors ir pripažįstama, kad Crataegus L. gentis yra labai plati, tačiau nedaloma. Mokslininkai gudobelės Crataegus L. genčiai priklausomai nuo rūšies taksono sampratos priskiria nuo 150 iki 1200 augalų rūšių. Visoms šios genties rūšims būdingas kintamumas. Tarprūšinė hibridizacija, introgresija ir poliploidija bei apomiksė sukuria palankias sąlygas naujoms genotipų linijoms atsirasti (Christensen, 1992). Erškėtinių Rosaceae Juss. šeimai būdinga ir tarpgentinė hibridizacija, kuri dar labiau didina atskiros rūšies ar porūšio kintamumą. Regionuose, kur auga dvi ar daugiau gudobelių genties rūšių, taip pat ten, kur šalia gudobelių auga genetiškai artimos kitų genčių rūšys, įmanoma šių rūšių hibridizacija. Hibridų atsiradimas būdingas ir botanikos sodų kolekcijoms. Kintamumas apsunkina tikslų atskiro individo taksono įvertinimą, o kartu ir chemotaksonominę analizę, tačiau natūralių ar dirbtinių hibridų vegetacinių ir generacinių organų fitocheminės sudėties tyrimas išlieka prasmingas, nes tokiu būdu galima įvertinti ir nustatyti naujas, spontaniškai atsiradusias, genetines linijas. Kultūroje auginami jų atstovai galėtų būti naudojami geresnės kokybės ir geresnės ekonominės išeigos, unikalių fitocheminių ir fitoterapinių parametrų vaistinei augalinei žaliavai ruošti.
Identifikavimo problema, susijusi ne tik su gudobelių rūšių kintamumu, bet ir su gudobelėms būdinga heteroblastija, svarbi atrenkant augalus kultivavimui bei renkant VAŽ natūraliose cenopopuliacijose. Tikslus taksono įvertinimas būtinas, užtikrinant gerą VAŽ auginimo ir rinkimo praktiką, tačiau net tokia praktika neužtikrina VAŽ fitocheminės sudėties stabilumo, todėl svarbiausias VAŽ standartizavimo būdas turėtų būti veikliųjų mežiagų tapatybės ir kiekio įvertinimas šiuolaikiniais fitocheminio tyrimo metodais (ESC, KE).
1.1.2. Gudobelių vaistinė augalinė žaliava, pagrindinės veikliosios medžiagos ir panaudojimas medicinoje
Gudobelių vaistinė augalinė žaliava, aprašoma daugelyje farmakopėjų (Europos,
Barnes ir kt., 2002). Kai kuriose farmakopėjose (Tarybų Sąjungos, Vokietijos) aprašyta gudobelių žiedų (Flores) vaistinė augalinė žaliava.
Europos šalyse vaistinė augalinė žaliava dažniausia renkama nuo Crataegus
monogyna, C. rhipidophylla, C. laevigata, rečiau – nuo C. pentagyna, C. submollis, C. sanguinea, C. nigra, ir C. azarolus. (Ph.Eur., 2005; ESCOP, 2003; WHO, 2002;
Steinhoff, 2005).
Gudobelių pumpurai kaip farmakopėjinė vaistinė augalinė žaliava šiuo metu nenaudojami ir apie jų naudojimą gydymo tikslams nepavyko rasti literatūros duomenų. Lapai ir žiedai susiformuoja iš pumpurų, todėl yra didelė tikimybė, kad pumpuruose yra tos pačios veikliosios medžiagos kaip ir žieduose bei lapuose. Be to, gali būti ir kitokių veikliųjų medžiagų. Duomenys apie gudobelių pumpuruose esančius flavonoidų kiekius būtų naudingi ne tik mokslininkams, bet ir gamybininkams, besidomintiems naujais potencialiais vaistinės žaliavos šaltiniais.
Biologiškai aktyvios medžiagos, nustatytos gudobelių VAŽ. Crataegus
monogyna Jacq. žaliavoje nustatyti įvairūs flavonai ir jų glikozidai: viteksinas
(apigenin-8-C-gliukozidas), viteksin-2”-O-ramnozidas, izoviteksinas (saponaretinas, apigenin-6-C-gliukozidas), izoviteksin-2”-O-ramnozidas, viteksin-2”-O-(4’”-O-acetil)-ramnozidas, viteksin-4’-O-ramnozidas, orientinas (liuteolin-8-C-gliukozidas), orientino ramnozidas, izoorientinas (liuteolin-6-C-gliukozidas), izoorientin-2”-O-ramnozidas, acetilorientinas, viceninas 1 ksilozil-8-C-gliukozidas), viceninas 2 (apigenin-6-C-gliukozid-8-C-ksilozidas), viceninas 3 (apigenin-6-C-gliukozid-8-C-gliukozidas), apigenin-7-O-gliukozidas, šaftozidas (apigenin-6-C-gliukozid-8-C-arabinozidas), izošaftozidas (apigenin-6-C-arabinozid-8-C-gliukozidas), liuteolin-7-O-gliukozidas, liuteolinas; flavonoliai ir jų glikozidai: hiperozidas (kvercetin-3-O-galaktozidas), rutinas (kvercetin-3-O-rutinozidas), kvercetinas, kvercitrinas (kvercetin-3-O-ramnozidas), izokvercitrinas (kvercetin-3-O-gliukozidas), spireozidas (kvercetin-4’-O-gliukozidas), krategidas (kvercetin-3-O-arabinozidas), kvercetin-3-O-ramnogalaktozidas, kempferolis, kemferol-3-O-neohesperozidas, 8-metoksikemferolis, 8-metoksikemferol-3-O-gliukozidas, 8-metoksikemferol-3-O-neohesperozidas, dihidroflavonų glikozidai: naringenin-5-O-gliukozil-7-O-gliukozidas, eriodiktol-5-O-gliukozil-3’-O-gliukozidas, eriodiktol-7-O-gliukozidas (Petereit ir kt., 2005, Nikolov ir kt., 1981, 1982; Sheng, 2001; Rastitelnyje resursy SSSR, 1987; ESCOP, 2003; Fong ir kt., 2002; Chang Q ir kt., 2001, 2002; Bruneton, 1995; Dauguet ir kt., 1993, Barnes ir kt., 2002); epikatechinas, oligomeriniai procianidinai (katechino ir epikatechino įvairaus laipsnio polimerai),
antocianai, kumarinai, cianogeninis glikozidas leukocianidinbiozidas, chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, askorbo rūgštis, triterpenai: oleino, ursolo, krategolo rūgštys, aminai: cholinas, acetilcholinas, trimetilaminas; karotinoidai: α- ir β-karotinas, kriptoksantinas, violaksantinas, β-karotino 5,6:5’,6’-diepoksidas, steroidai: β-sitosterinas, alkaloidas oksiantinas, raugai, cukrūs, riebalų rūgštys, alifatiniai angliavandeniliai: n-triakontanas, 1-nonakozanolis, alkoholiai: sorbitolis (vaisiuose), kalio druskos (Petereit ir kt., 2005, Sheng, 2001; Rastitelnyje resursy SSSR, 1987; ESCOP, 2003; 2002; Bruneton, 1995).
Įvairiuose literatūros šaltiniuose nurodomas flavonoidų suminis kiekis C. monogyna lapuose ir žieduose įvairuoja nuo 1,0 iki 3,0 proc. (Ph. Eur., 2005; Nikolov ir kt., 1981; Rastitelnyje resursy SSSR, 1987; ESCOP, 2003; 2002; Bruneton, 1995). 1996 metais ištirta 180 Vidurio Europos C. monogyna žiedų ir lapų VAŽ ėminių. Nustatytas šių ėminių suminis flavonoidų kiekis įvairavo nuo 0,28 iki 1,92 proc. sausos masės (vidurkis 1,15 proc.). Individai, nuo kurių rinkta geriausios kokybės VAŽ, kultivuoti. Kultūriniuose plotuose ruoštos geriausios kokybės VAŽ flavonoidų kiekis siekė 3,8 proc. (Sonnenschein, Plescher, 2005; Peschel, 2004). Čekijoje augančių gudobelių lapuose ir žieduose ESC metodu nustatyta 10,58 mg/g viteksin-2”-O-ramnozido, 6,93 mg/g hiperozido (Sladkovsky ir kt., 2003). Jaunų kolekcinių C. monogyna medelių lapuose ESC metodu nustatyta acetilramnozido 3,60 – 9,02 mg/g, viteksin-2”-O-ramnozido 0,93 – 5,20 mg/g, hiperozido 0,42 – 2,29 mg/g (Kirakosyan ir kt., 2004). Laboratorijoje augintame C. monogyna lapų parenchimos audinyje nustatytas flavonoidų suminis kiekis vidutiniškai sudarė 7,01 mg/g sausos masės (Bahorum ir kt., 2003).
C. rhipidophylla nustatyta: hiperozidas, viteksin-4’-O-ramnozidas,
viteksin-2”-O-ramnozidas acetilviteksin-4’-O-viteksin-2”-O-ramnozidas, viteksinas, rutinas, kvercetinas, kvercitrinas, 5,8,3’,4’-tetrahidroksiflavono-7-O-gliukozidas, kratenacinas, apigenin-7-O-gliukozidas, liuteolino gliukozidas, oligomeriniai procianidinai, leukoantocianidinai (Rastitelnyje resursy SSSR, 1987; Miller, 1998).
C. laevigata lapuose nustatyta: hiperozidas, O-ramnozidas,
viteksin-2”-O-(4’”-O-acetil)-ramnozidas, viteksinas, kvercetinas, kvercitrinas, rutinas. Atlikus hidrolizę, nustatyti kvercetinas ir apigeninas (Skerget ir kt., 2005, Kirakosyan ir kt., 2004).
C. microphylla C. Koch. atlikus flavonoidų glikozidų hidrolizę nustatyti aglikonai
C. chlorosarca Maxim. lapuose nustatyti hiperozidas ir viteksino ramnozidas
(Rastitelnyje resursy SSSR, 1987).
Iki šiol trūksta patikimų mokslinės literatūros duomenų apie kitų gudobelių organų (pumpurų, šakų, šaknų, žievės) fitocheminę sudėtį. Suvokus viso augalo cheminės sudėties įvairavimą, galima tiksliau įvertinti augalo vieno ar kito organo vartojimo gydymo tikslams pagrįstumą. Tokio pobūdžio duomenys leistų panaudoti nustatytus cheminės sudėties skirtumus racionaliam žaliavos rinkimo planavimui bei kryptingam gudobelių fitopreparatų kūrimui ir, žinoma, tikslesnei jų analizei.
Gudobelių preparatų vartojimas gydymo tikslams pagrįstas gausiais gudobelių
VAŽ bei iš jų gautų vaistinių formų farmakodinaminių ir farmakokinetinių parametrų tyrimai, kurių atlikta tikrai nemažai (tarp jų ir dvigubai aklų, randomizuotų). Daugelis autorių rekomenduoja gudobelių preparatus vartoti kaip širdį tonizuojančią priemonę, esant funkciniams širdies veiklos sutrikimams bei persirgus sunkiomis širdies veiklą sutrikdžiusiomis ligomis, padidėjus kraujospūdžiui. Preparatai vartojami esant I ir II laipsnio širdies veiklos funkciniams sutrikimams (pagal NYHA – Niujorko širdies asociacijos patvirtintą skalę – tai pacientai, sergantys širdies liga, sukeliančia lengvus fizinio aktyvumo apribojimus; pacientai gerai jaučiasi ilsėdamiesi, o įprasta fizinė veikla jiems sukelia nuovargį, smarkų širdies plakimą, dusulį ar krūtinės anginos pobūdžio skausmus), angioneurozėms, hipertenzijai. Gudobelių vaisiai vartojami sergant kai kuriomis aritmijomis bei paroksizmine tachikardija. Gudobelių preparatus galima vartoti esant periferiniams kraujo apytakos sutrikimams, sukeltiems aterosklerotinių pakitimų, ypač seniliniu periodu. Eksperimentiniai duomenys patvirtina galimybę šiuos preparatus vartoti esant ir III laipsnio pagal NYHA širdies nepakankamumui. Tiriamas preparatų poveikis pacientams su hipercholesterolemija (Holubarsch, 2005; Brixius ir kt., 2005; Koch ir kt., 2005; Chang Q ir kt., 2002; Valli, Giardina, 2002; Miller AL, 1998; Fong, Bauman, 2002; Zapatero, 1999; Chung, 2004, von Burstin, 2001; Miller GM ir kt., 2000). Atliekant eksperimentinius gudobelių VAŽ bei iš jų gautų vaistinių formų tyrimus
in vitro ir in vivo, nustatytas koronarinio debeto didėjimas ir miokardo oksigenacijos
gerėjimas. Gauti geri rezultatai vartojant gudobelių preparatus po širdies infarkto (Miller AL, 1998; Chung, 2004; Brixius ir kt., 2005; Koch ir kt., 2005; Holubarsch, 2005; Kim ir kt., 2000; Ghilsalberti ir kt., 1998). Nustatytas širdies metabolizmo gerėjimas, kartu mažėja laktatų kiekis išemijos metu (Miller, 1998; Brixius ir kt., 2005; Koch ir kt., 2005; Holubarsch, 2005; von Burstin, 2001; Mashour, 1998). Įrodytas gudobelių preparatų teigiamas inotropinis efektas bei neigiamas chronotropinis efektas. Antihipertenzinis
preparatų poveikis stipresnis nei teofilino. Ypač stipriai kraujagysles plečia hiperozidas. Šis flavonoidas didina minutinį koronarinių indų debetą in vitro ir in vivo bei nutraukia indukuotą koronarų spazmą. Gudobelių flavonoidų mišinys veikia antiaritmiškai, dėl neigiamo batmotropinio efekto bei sutrumpėjusio efektyvaus refrakterinio periodo. Gudobelių ekstraktas mažina indukuotos skilvelvių tachikardijos (pereinančios į virpėjimą) trukmę. Gaunamas geras efektas vartojant šiuos flavonoidus Hiso pluošto kojyčių blokados atveju (Miller, 1998; Chung, 2004). Gudobelių flavonoidų mišinys reguliuoja kalio ir natrio jonų santykį miokardo ląstelėse (didina intraląstelinio kalio ir mažina intraląstelinio natrio kiekį). Flavonoidų mišinys turi priešvirusinį veikimą (ypač stipriai prieš Herpes virusą veikia C. rhipidophylla ekstraktas). Manoma, kad stipriausiai prieš virusus veikia hiperozidas. Nustatytas monoacetilviteksinramnozido antiišeminis veikimas (Miller, 1998). Kardioprotekcinis veikimas gali būti susijęs su žmogaus neutrofilų elastazės slopinimu (Miller, 1998; Chung, 2004). Gyvuliukams su hiperlipidemija, vartojusiems gudobelių tinktūrą, kraujyje nustatytas cholesterolio ir trigliceridų kiekio mažėjimas (Miller, 1998; Chang Q ir kt., 2002; Chung, 2004). Manoma, kad toks gudobelių preparatų farmakologinis veikimas negali būti priskirtas vienam būdingam junginiui. Gudobelių biologiškai aktyvios medžiagos veikia sinergiškai (t.y. kompleksiškai, bendrai). Siekiant efektyvaus medicininio veikimo reikėtų vartoti visą šio augalo VAŽ (vaisių, žiedų ar jaunų ūglių) ekstraktą. Būtina atkreipti dėmesį į skirtingų gudobelių organų fitocheminės sudėties skirtumus, kurie gali iš dalies koreguoti gautų vaistinių formų farmakologinį veikimą.
Gudobelių preparatų šalutinis poveikis nežymus. Vartojant gudobelių preparatus didelėmis dozėmis (nuo 900 iki 1800 mg per dieną), gali pasireikšti virškinimo sutrikimai, širdies virpėjimas, krūtinės skausmai, kraujotakos sutrikimai, vertigo (de Smet, 2002). Didelis toksiškumas (LD50) pasireiškia pelėms vartojant per os 18,5 ml/kg, žiurkėms – 33,8 ml/kg 10 proc. gudobelių lapų ir žiedų etanolinio ekstrakto, o pelėms injekuojant flavonoidų tirpalą – 1,56 g/kg flavonoidų. Gudobelės gali stiprinti rusmenių preparatų, beta-blokatorių ir kitų hipotenzinių vaistų poveikį. Vartojant šiuos vaistus kartu su gudobelių preparatais, gali tekti keisti dozes (Awang ir kt., 2001; Valli, Giardina, 2002).
1.1.3. Gudobelių moksliniai tyrimai ir fitopreparatai
Mokslinių tyrimų kryptys. Išstudijavus iki 2005 metų sausio 1 dienos Medline
PubMed duomenų bazėje (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) paskelbtus mokslinius darbus, galima daryti išvadą, kad šiuo metu gudobelė ir jos preparatai ypač plačiai ir įvairiapusiškai tyrinėjami. Pasirinkus raktinį žodį Crataegus, ieškos programa duomenų bazėje randa daugiau nei 300 mokslinių straipsnių. Suskirsčius straipsnius pagal publikavimo metus, galima pastebėti, kad per paskutiniuosius 15 metų gudobelių tyrimų skaičius nuolat didėja: nuo 2 straipsnių 1989 metais iki 24 straipsnių 2004 metais.
Didelį mokslininkų susidomėjimą flavonoidais (viena pagrindinių gudobelių vaistinės augalinės žaliavos farmakologiškai aktyvių medžiagų grupė) rodo ypač daugėjantys moksliniai straipsniai nuo 1989 (388 straipsniai) iki 2004 metų (2691 straipsnis), skirti šiems junginiams.
Publikuojamuose darbuose galima išskirti tris svarbiausias gudobelių mokslinio tyrimo kryptis:
1) biologinė – ekologinė: įvairių gudobelių rūšių botaninių savybių tyrimas (populiacijų ir atskirų ekotipų tyrimai in situ ir ex situ), gudobelių taksonominė analizė, gudobelių ekologinės aplinkos tyrimas, fenotipų reakcijos į įvairios kilmės stresą tyrimai; 2) fitocheminė – farmacinė: gudobelių vaistinės augalinės žaliavos bei gudobelių preparatų įvairiatiksliai veikliųjų medžiagų fitocheminiai tyrimai;
3) farmakologinė – fitoterapinė: gudobelių veikliųjų medžiagų veikimo būdo tyrimas laboratorijose, fitoterapinių indikacijų ieška, ikiklinikiniai ir klinikiniai tyrimai.
Lietuvoje atliekami vienapiesčių gudobelių populiacijų ir atskirų ekotipų botaniniai tyrimai (Labokas, 2002), introdukuotų gudobelių rūšių paplitimo ir auginimo galimybių Lietuvoje tyrimai (Baronienė, Liagienė, 2004), Lietuvoje natūraliai augančių bei introdukuotų gudobelių vaistinės augalinės žaliavos fitocheminiai tyrimai bei naujos gudobelių vaistinės augalinės žaliavos paieškos, atliekami technologiniai bei fitocheminiai naujų gudobelių preparatų tyrimai (Savickas ir kt., 2004; Bernatonienė R. ir kt., 2004).
Gudobelių preparatai Lietuvoje. Lietuvoje iki 2003 m. sausio 2 d. užregistruoti
6475 vaistai. Augalinės kilmės preparatai sudaro 7,38 proc. visų Lietuvoje registruotų vaistų. Lietuvoje yra užregistruota keletas vaistų formų, kurių gamybai naudojama gudobelių vaistinė augalinė žaliava. Tai arbatos, skysti ir sausi ekstraktai, tinktūros. Nuo
seno Lietuvoje vartojami ,,Širdies darbą gerinantys lašai” (arba ,,Širdies lašai”), kurių gamybai naudojama gudobelių VAŽ (Barsteigienė ir kt., 2003).
Vaistiniai preparatai, kurių gamybai buvo naudota gudobelių vaistinė augalinė žaliava, 2003 metų duomenimis užėmė 19,4 proc. visų augalinių vaistinių preparatų rinkos. Didžiausią paklausą turėjo ,,Širdies darbą gerinantys lašai” (,,Širdies lašai”) ir sudarė 11,7 proc. visų augalinių preparatų pardavimo. ,,Širdies darbą gerinantys lašai” sudarė 60,3 proc. visų gudobelių preparatų pardavimo, gudobelių skystasis ekstraktas – 32,3 proc., o gudobelių tinktūra – 3,9 proc.
97 proc. visų gudobelių preparatų sudaro skystos vaistų formos. Iš kitų vaistų formų reikėtų išskirti gudobelių sausąjį ekstraktą. Jis 2003 metų duomenimis sudaro tik 0,1 proc. rinkos, tačiau būtent sausasis ekstraktas yra perspektyvi, lengvai ir tiksliai dozuojama vaisto forma, kurios pasiūla ir vartojimas turėtų didėti.
37,1 proc. visų preparatų, kurių gamybai naudojama gudobelių vaistinė augalinė žaliava, sudaro preparatai, kuriems gaminti naudojama tik gudobelių vaistinė augalinė žaliava, kita dalis preparatų – mišiniai su kitomis vaistinėmis augalinėmis žaliavomis.
Didelė gudobelių preparatų paklausa iš dalies paaiškinama didėjančiu susidomėjimu augalinės kilmės vaistais. Vertinant gudobelių žaliavos perspektyvas, reikėtų prisiminti, kad širdies ir kraujagyslių sistemos ligos visame pasaulyje yra viena opiausių problemų. Širdies ir kraujagyslių sistemos ligų planinei fitoterapijai veiksmingų ir nežymaus šalutinio poveikio augalinių preparatų pasirinkimas tikrai nėra didelis. Europos gydytojai gudobelių vaistinę žaliavą širdies ir kraujagyslių sistemos ligoms gydyti vartoja jau daugiau nei šimtą metų (de Smet ir kt., 2000; Miller GM ir kt., 2000). 21 amžiuje ši žaliava taip pat išlieka populiari gydytojų ir mokslininkų tarpe.
1.2. Flavonoidų charakteristika, cheminės savybės ir panaudojimas medicinoje
1.2.1. Flavonoidai – biologiškai aktyvūs junginiai
Flavonoidai - tai biologiškai aktyvūs junginiai, kurių aglikono struktūros pagrindas
– flavanas (2-fenil-benzo-γ-pirono žiedas). Natūraliai jie egzistuoja kaip monoglikozidai (hiperozidas, viteksinas), diglikozidai (rutinas) arba kaip aglikonai (liuteolinas, kvercetinas). Flavonoidai aptinkami beveik visuose induočiuose augaluose, taip pat kai kuriuose dumbliuose, kerpsamanėse, samanose (Iwashina, 2000). Flavonoidai – tai
augalų antriniai metabolitai, žinomi kaip natūralūs vaisių ir daržovių pigmentai, suteikiantys raudoną, geltoną, mėlyną spalvas.
Flavonoidų biosintezė įmanoma visuose žaliuosiuose augaluose (Havsteen, 2002).
Flavonoidų biosintezė – daugiapakopis biocheminis procesas, prasidedantis fenilalanino deamininimu. Kondensuojantis malonil-CoA ir p-kumaril-CoA (kafeoil-CoA) susidaro benzo-γ-pirono žiedas. Skirtingais proceso etapais susidaro fenilpropanoidai (chlorogeno rūgštis), C-glikozilflavonai, flavonoliai, proantocianidinai, antocianai, 3-deoksiantocianai ir flobafenai bei ligninas (Knott, 2003; Yoshitama, 2000; Havsteen, 2002; Grotewold ir kt., 1998; Whiting, 2001; Lovkova, 2001).
Flavonoidų reikšmė augalams nėra iki galo ištirta, manoma, kad jie atlieka
biocheminių procesų moduliatorių funkcijas (Conseil, 1998; Middleton ir kt., 2000; Havsteen, 2002; Hakkinen, 2000). Nustatyta flavonoidų svarba ekranuojant UV spinduliavimą (Burchard ir kt., 2000; Middleton ir kt., 2000). Šaknų išskiriami flavonoidai aktyvuoja azotą fiksuojančių bakterijų dauginimąsi (Peters, 1986) bei atlieka signalų vaidmenį augalų ir grybų ląstelių cheminiame bendravime, formuojant mikorizę (Vierheilig ir kt., 1998).
Flavonoidų kiekį vaistinėje augalinėje žaliavoje lemia įvairūs aplinkos ir
genetiniai faktoriai: augimvietė, sezoniškumas, gamtinės sąlygos. Įvairių polifenolinių darinių (tarp jų ir flavonoidų) susikaupimas atskiruose augalo organuose ar audiniuose priklauso nuo vidinių ir išorinių veiksnių, sąlygojančių fermentų aktyvumą, biosintezės prekursorių kiekį audinyje. Atskirų polifenolių kiekio įvairavimas audinyje priklauso nuo hidroksilinimo, metilinimo, kondensacijos ir glikozidinių grupių susidarymo aktyvumo (Vvedenskaya, Vorsa, 2004; Bahorum ir kt., 2003).
Pastaruoju metu vis daugiau skelbiama mokslinių darbų, apie genetinių (populiacijų, ekotipų ir hibridų) bei aplinkos (dirvožemio, klimato, sezoniškumo, kenkėjų, ligų sukelėjų, sunkiųjų metalų) veiksnių įtaką flavonoidų susikaupimui augaluose (Estiarte ir kt., 2004; Švelikova ir kt., 2002; Vvedenskaya, Vorsa, 2004; Picchioni, Graham, 2001; Whiting, 2001; Nybakken ir kt., 2004; Bagdonaitė, 2003; Percival, Fraser, 2001; Awad ir kt., 2001; Hakkinen, 2000). Tiriamas fermentų poveikis flavonoidų kiekio kitimui augalo audiniuose (Lez-Barrio, 2004; Makris, 2002).
1 lentelė. Flavonoidų kiekio (mg/g) skirtumai C. monogyna lapuose prieš ir po stresinio poveikio, pagal Kirakosyan, 2004
Diena 0 Kontrolė (Diena 10) Drėgmės trūkumas Drėgmės perteklius Šaltis (4°C) Genėjimas Chlorogeno rūgštis 0,017±0,009 0,057±0,012 0,362±0,039 0,183±0,012 0,042±0,015 0,111±0,014 Katechinas 0,291±0,035 0,351±0,086 1,544±0,212 0,678±0,018 0,215±0,018 0,417±0,024 Epikatechinas 0,340±0,024 0,525±0,091 0,905±0,071 0,444±0,036 0,358±0,026 0,588±0,046 Viteksinas 0,064±0,005 0,118±0,044 0,111±0,03 0,019±0,005 0,096±0,008 0,139±0,025 Viteksin-2’’- O-ramnozidas 1,238±0,099 1,046±0,154 0,925±0,048 0,715±0,055 5,198±0,391 0,977±0,075 Acetil-viteksin-2’’-O -ramnozidas 9,022±0,773 6,578±0,789 3,597±0,168 4,685±0,211 8,097±0,685 4,983±0,038 Hiperozidas 0,424±0,038 0,469±0,041 0,431±0,027 0,464±0,051 2,292±0,188 0,548±0,033 Kvercetinas 0,018±0,006 0,047±0,008 0,092±0,007 0,081±0,009 0,064±0,004 0,062±0,007 Rutinas 0,026±0,005 0,072±0,011 0,357±0,043 0,044±0,006 0,071±0,008 0,320±0,027
Skelbiami duomenys apie flavonoidų kiekinės sudėties kitimą gudobelių lapuose dėl augalo organizmui nepalankių, sukeliančių stresinę reakciją, aplinkos sąlygų – 1 lentelė (Kirakosyan ir kt., 2004). C. monogyna medelius (vienerių metų amžiaus) 10 dienų paveikus stresinę reakciją sukeliančiomis aplinkos sąlygomis: drėgmės trūkumu bei pertekliumi, šalčiu (4ºC) bei dalies lapijos pašalinimu). Nustatyta, kad vandens deficitas didina chlorogeno rūgšties, katechino ir epikatechino gamybą, o vandens perteklius didina chlorogeno rūgšties, katechino ir epikatechino kiekius. Įdomu, kad ir drėgmės trūkumas, ir perteklius mažina ir viteksin-2”-O-ramnozido, ir acetilviteksin-2”-O-ramnozido kiekius. Šalčio faktorius svarbus Lietuvos gamtinėmis sąlygomis. Pateikti duomenys rodo flavonoidų kiekio didėjimą dėl šalčio streso: hiperozido ir viteksin-2”-O-ramnozido kiekiai padidėja 4-5 kartus. Genėjimas – svarbus faktorius, į kurį būtina atsižvelgti racionaliai planuojant daugkartinį lapų žaliavos rinkimą. Genėjimas mažina acetilviteksin-2”-O-ramnozido kiekį gudobelių lapuose, nedaug didina hiperozido kiekį, o acetilviteksin-2”-O-ramnozido kiekiui įtakos neturi.
Tyrimus atlikę su C. laevigata minėti bendraautoriai nustatė, jog drėgmės trūkumas mažina acetilviteksin-2”-O-ramnozido kiekį lapuose, viteksin-2”-O-ramnozido kiekis išlieka panašus, o hiperozido padaugėja 2-3 kartus. Hiperozido kiekį didina ir vandens
perteklius, ir šaltis. Šaltis didina ir viteksin-2”-O-ramnozido, ir acetilviteksin-2”-O-ramnozido kiekius. Palyginus tyrimų rezultatus, pastebimas šalčio poveikis hiperozido ir kitų flavonoidų kiekiams abiejų rūšių lapų žaliavoje. Būtent šalčio įtaka gali būti reikšminga Lietuvos regiono gudobelių žaliavos cheminiams rodikliams.
Flavonoidų biologinis aktyvumas. Literatūra plačiai aprašo flavonoidų
antioksidantines savybes, P vitamininį aktyvumą bei C vitaminą tausojantį poveikį (Miliauskas, 2004; Havsteen, 2002; Zhang ir kt., 2001; Sheng, 2001; Choi ir kt., 2002; Kaur, 2001; Middleton ir kt. 2000). Per pastaruosius dešimtmečius labai pasikeitė požiūris į flavonoidus kaip į svarbią biologiškai aktyvių junginių grupę, dalyvaujančią įvairiuose organizmo biocheminiuose procesuose bei reguliacijos mechanizmuose. Jau žinoma, kad flavonoidai žmogui būtini ir turi būti gaunami su maistu. Kasdien suvartojamų flavonoidų kiekis gali siekti iki 1 gramo (Havsteen, 2002).
Nustatytas įvairialypis flavonoidų poveikis fermentinių sistemų (kinazių, fosfolipazės A2, lipoksigenazės ir cikloksigenazės, ATP-azės, fosfolipazės C, fosfodiesterazės, adenilatciklazės, atvirkštinės transkriptazės, ornitindekarboksilazės, topoizomerazės, gliutation-S-transferazės, azoto oksido sintetazės ir kitų) veiklos reguliacijai (Middleton ir kt., 2000; Scuro ir kt., 2004; Havsteen, 2002; Brixius ir kt., 2005; Lez-Barrio; 2004, Scuro ir kt., 2004). Moksliniais darbais pagrįstas ir įrodytas flavonoidų priešuždegiminis veikimas, siejamas su jų antioksidantiniu poveikiu, eikozanodus formuojančių fermentų slopinimu bei kitais nenustatytais mechanizmais. Flavono darinių priešuždegiminis poveikis susijęs su flavono žiedų struktūriniais elementais: C žiedo 2,3 dviguba jungtis, A žiedo 5,7 hidroksilo grupės , B žiedo 4' ar 3',4' hidroksilo grupės. Peroraliai vartojant flavonoliai (flavono dariniai, turintys C-3 hidroksilo grupę) slopina lipoksigenazės poveikį veikia priešuždegimiškai (Kim ir kt., 2004; Middleton ir kt., 2000; Havsteen, 2002). Bandymais in vivo (su žiurkėmis) ir in
vitro (su tiroidperoksidaze) įrodytas C-glikozilflavonų (viteksino) antitiroidinis efektas
(Gaitan ir kt., 1995). Kai kuriems flavonoidams būdingas hepatoprotekcinis ir citoprotekcinis poveikis (Middleton ir kt., 2000), priešbakterinis veikimas (Puupponen-Pimia ir kt., 2001; Havsteen, 2002), priešvirusinis veikimas (kvercetinas ir kai kurie kiti flavonoidai slopina ŽIV-1 proteinazę ir integrazę) (Middleton ir kt. 2000; Havsteen, 2002) bei fitoestrogeninis, kontracepcinis veikimas (Vaya, Tamir, 2004; Middleton ir kt., 2000; Havsteen, 2002). Paskutiniu metu daugėja mokslinių darbų, nagrinėjančių flavonoidų reikšmę gydant vėžį (Saenz ir kt., 1997, Havsteen, 2002).
Apibendrinant flavonoidus galima apibūdinti kaip biologiškai aktyvių junginių grupę, turinčią įvairiapusį veikimą ir ypač svarbią šiuolaikiniam farmacijos mokslui. Reikia atkreipti dėmesį, kad flavonoidų aglikonų biologinis veikimas ir aktyvumas skiriasi nuo tų pačių flavonoidų glikozidų biologinio veikimo ir aktyvumo (Bohm, 1998; Havsteen, 2002), todėl informatyviausi ir prasmingiausi būtų tie augalinės žaliavos fitocheminės analizės metodai, kurie kiekvieno farmakologiškai aktyvaus flavonoido aglikono ar glikozido kiekį įvertintų atskirai.
1.2.2. Flavonoidų analizės metodai
Flavonoidams iš vaistinės augalinės žaliavos isškirti dažniausia naudojama
ekstrakcija alkoholio (metanolio ar etanolio) bei vandens mišiniais (Antolovich ir kt., 2000). Pavyzdžiai ruošiami naudojant įvairią metanolio koncentraciją: 45 proc. (WHO, 2002), 50 proc. (Park, Cha 2003), 70 proc. (Svedstrom ir kt., 2002; WHO, 2002; Gaedcke, 2005), 80 proc. (Alemanno ir kt., 2003), 85 proc. (Park, Cha, 2003), 100 proc. (Skerget ir kt., 2005). Pavyzdžiams ruošti taip pat pasirenkamas įvairios koncentracijos etanolis: 30 proc. (Gaedcke, 2005), 45 proc. (Pharmeuropa, 2004; Ph. Eur. 2005; DAB, 10; Steinhoff, 2005; Gaedcke, 2005), 60 proc. (Ph. Eur. 2005; Gaedcke, 2005), 70 proc. (Vierling ir kt., 2003; Gaedcke, 2005; Savickienė ir kt., 2002; Bernatonienė J. ir kt., 2003; Savickas ir kt., 2004; Kalvėnienė, 2005), 80 proc. (Chang, 2001; Zhang, Xu 2001). Retais atvejais pavyzdžiams ruošti naudojami kiti ekstrahentai: 60 proc. ar 70 proc. acetono tirpalas vandenyje (Gaedcke, 2005; Schieber ir kt., 2001).
Ruošiant vaistų formas, flavonoidams iš vaistinės augalinės žaliavos išskirti dažniau naudojamas etanolis. Naudojamos etanolio koncentracijos įvairuoja nuo 45 iki 70 proc. ir, retais avejais, naudojamas kitokios koncentracijos etanolis, vandens – metanolio, vandens – acetono mišiniai ir vanduo. Būtina paminėti, kad etanolio – vandens mišiniai tinka visoms ekstraktų formoms gaminti. Tuo tarpu metanolio – vandens mišiniai vartojami tik sausiems ir, retesniais atvejais, tirštiems ekstraktams gaminti (Steinhoff B., 2005; Gaedcke, 2005).
Ekstrakcija atliekama Soksleto aparate, ultragarsinėje vonioje (Skerget ir kt., 2005; Svedstrom ir kt., 2002), šildant su grįžtamu šaldytuvu (Ph. Eur. 2005), maceruojant (Bernatonienė J. ir kt., 2003). Ekstrakcijos laikas įvairuoja nuo 30 sekundžių iki 96 val. Žaliavos ir ekstrahento santykis įvairuoja nuo 1:2 iki 1:200 (Bohm, 1998).
Pavyzdžio valymas yra svarbus tiriant daugiakomponenčius mišinius, pavyzdžiui
biologinius skysčius: plazmą, serumą, šlapimą, fermentacines terpes ar dirvožemį. Tiriant flavonoidus augaliniuose ekstraktuose, analičių kokybinis ir kiekinis nustatymas kai kuriais atvejais taip pat gali būti komplikuotas. Tokiu atveju, tiriamajam pavyzdžiui ruošti naudojami įvairūs atskyrimo metodai. Dažnai naudojama ekstrakcija skirtingo polingumo skysčiais, kietų fazių ekstrakcija, nusodinimas, dializė, garinimo metodai (Sladkovsky ir kt., 2003). Kietų fazių ekstrakcijai atlikti dažnai naudojamas poliamidinis sorbentas. Flavonoidai išplaunami metanoliu (Li ir kt., 2002) ar kitu polingesniu eliuentu, tirpinančiu analites. Tyrimą atliekant efektyviais tyrimo metodais (ESC ir KE metodai), daugiakomponenčio mišinio atskyrimas vyksta analizės metu. Jei analičių atskyrimas tenkina analitiko poreikius, tai taupant laboratorinius išteklius bei laiką, fitocheminę analizę galima atlikti pavyzdžio papildomai nevalant, tačiau tyrimą atliekant ESC ir KE metodais, rekomenduotina iš tiriamo pavyzdžio pašalinti mikrodaleles. Mikrodalelės pašalinamos filtruojant per membraninius fitrus. Filtravimas per 0,22 μm porų skersmens membranas pašalina smulkiausias daleles ir makromolekules, todėl prieš atliekant analizę ESC metodu, tirpalus rekomenduojama filtruoti būtent minėto dydžio filtrais (Snyder, 1997; Li ir kt., 2002).
Ruošiant pavyzdį ESC analizei, reikia atkreipti dėmesį į analitės kiekį pavyzdyje. Rekomenduojamas analičių kiekis tiriamajame tirpalo ėminyje 4 mm skersmens kolonėlėms turėtų būti mažesnis nei 10 μg, todėl tiriamąjį ekstraktą gali tekti skiesti. Retesniais atvejais, kai analičių koncentracija tiriamajame tirpale mažesnė už naudojamo metodo aptikimo ar nustatymo ribą, tai tiriamąjį pavyzdį gali tekti koncentruoti. Dažnai analitės koncentruojamosi naudojant garinimą ir kietų fazių ekstrakciją (Bohm, 1998; Snyder, 1997).
Flavonoidų cheminio tyrimo metodai. Vaistinės augalinės žaliavos analizė bei
veikliųjų medžiagų kokybinis ir kiekinis įvertinimas būtinas siekiant užtikrinti fitopreparatų veiksmingumą ir saugumą vartotojui. Kokybiniam flavonoidų nustatymui naudojama IR ir UV spektroskopija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, masių spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija su UV ir diodų matricos detektoriais, masių spektrometrais, dujų chromatografija su masių spektrometrais ir branduolių magnetinio rezonanso detektoriais bei kiti rečiau naudojami metodai: rentgeno spindulių difrakcija, rezonansinė Ramano spektroskopija.
Flavonoidų kiekiniams tyrimams naudojama UV ir regimojo spektrų absorbcinė spektrofotometrija, plonasluoksnė chromatografija, skysčių chromatografija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė ir kiti metodai (ciklinė voltamperometrija) (Bohm, 1998; Wang, Huang, 2004; Whiting, 2001; Pharmeuropa, 2004; DAB 1997; Veit, Witting, 2005).
Būtina paminėti, jog flavonoidų analizei augaliniuose ekstraktuose reikalingi efektyvūs, jautrūs ir atrankūs metodai, pateikiantys ne tik kokybinę, bet ir tikslią kiekinę informaciją, kuri yra pakankamai informatyvi atskirų flavonoidų ir jų glikozidų kiekių įvairavimui žaliavos ėminiuose įvertinti.
Spektrofotometrinė analizė. Praktiniam kiekiniam analičių tyrimui spektrofotometriniu metodu naudojama analičių savybė sudaryti reakcijos produktus su boro rūgštimi ir aliuminio jonu pasislenkant antram absorcijos maksimumui UV spektro srityje į regimosios srities pusę (t.y. įvykus absorcijos maksimumo batochrominiam poslinkiui) (Bohm, 1998; Ph. Eur. 2005).
Efektyvioji skysčių chromatografija. Pirmi moksliniai darbai, kuriuose ESC
panaudota kaip fitocheminės analizės metodas, pradėti skelbti nuo 1980 metų (Bohm, 1998). Šiuolaikinėse laboratorijose ESC – dažniauisiai naudojamas kiekinės polifenolių analizės metodas (Antolovich ir kt., 2000). 2 lentelėje pateiktos literatūroje skelbiamos flavonoidų analizės metodikos.
Nustatant flavonoidus tiriamajame tirpale efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, dažnai naudojamas gradientinis skirstymas. Atvirkštinių fazių chromatografijai tinka C8 ar C18 kolonėlės (2 lentelė). Eliuavimui naudojamas vanduo ir acetonitrilas ar/ir metanolis. Atskyrimui tinkamiausias pH palaikomas į eliuentus pridedant skruzdžių rūgšties, acto rūgšties, TFA ar fosfatinių buferių (Unger, Weber, 1999). Paskutiniu metu vyrauja nuomonė, jog TFA labiau tinka flavonoidams atskirti nei fosforo, skruzdžių ar acto rūgštys (Tolonen, 2003; Laura ir kt., Alltech).
Flavonoidų detekcijai dažniausia naudojami spektrofotometriniai UV ar diodų matricos detektoriai, kiekinė analizė dažnai atliekama pasirenkant bangos ilgį 340 – 370 nm intervale, dažniausiai 360 ar 365 nm (Antolovich, 2000).
ESC informatyvesnis metodas nei spektrofotometrinis metodas ir jautresnis nei KE, tačiau metodas turi ir trūkumų: ilgas analizės laikas, maža skiriamoji geba.
2 lentelė. Flavonoidų kiekinio nustatymo ESC metodikos Šaltinis Naudota
kolonėlė
Judri fazė Judrios fazės
kitimo gradientas
λ, (nm)
Eliuavimas vandens – metanolio tirpalais
Chromolith Performance RP18, 100×4,6 mm A: metanolis, B: 0,1 proc. TFA vandenyje 0 min 45 proc. A, 1–3 min 90 proc. A; 4 ml/min 365 Sha, 1998 Shim-pak ODS,
100×6,0mm, 5µm A: metanolis, B: 0,025mol/l ortofosforo rūgštis vandenyje (pH 3) 50 proc. A (izokratas) 370 Skerget, 2005 Symmetry C18, 250×4,6 mm, Waters A: fosfatinis buferis (pH 3), B: metanolis 0–5 min 5 proc. B, 35 min 100 proc. B 367 Grotewold, 1998 Altex Ultrasphere C18, 5 µm, 4,6×250 mm A: 0,1 proc. fosforo rūgštis vandenyje, B: 0,1 proc. fosforo rūgštis metanolyje 0 min 10 proc. B, 35 min 99 proc. B; 1 ml/min 340
Eliuavimas vandens – acetonitrilo tirpalais
Park, 2003 Bondapak C18,
30×7,8 mm A: acetonitrilas, B: 2 proc. acto rūgštis vandenyje 0 min 15 proc. A, 27 min 30 proc. A; 3 ml/min 254 Kurioka, 2002 Wakosil-II-5C18 RS, 4,6x250 mm A: 0,1 proc. TFA vandenyje, B: acetonitrilas 0 min 10 proc. B, 40 min 40 proc. B 360 Crozier, 1997 Symmetry C18, 5µm, 150 ×3.6mm, Waters A: acetonitrilas, B: TFA vandenyje (pH 2,5) 0 min 15 proc. A, 30 min 35 proc. A; 1 ml/min 365 Kirakosyan, 2004 Phenomenex Luna C-18, 150×4.60mm, 5µm A: 0,1 proc. TFA vandenyje, B: 0,1 proc. TFA acetonitrile 0 min 5 proc. B, 30 min 100 proc. B; 1 ml/min; 40°C 280 Middleton, 1999 Supelcosil LC-318, 250×4.60mm, 5µm, Supelco A: 0,1 proc. TFA vandenyje, B: 0,1 proc. TFA acetonitrile 0 min 10 proc. B, 35 min 50 proc. B, 36 min 100 proc. B; 1,2 ml/min 254, 340 Kovacs, 2004 Eurospher 100-C8, 250×4.0 mm, 5 µm A: acetonitrilas, B: 0,1 proc. TFA vandenyje 0 min 10 proc. A, 25– 30 min 43 proc. A; 1 ml/min 280 Alemanno, 2003 Kromasil C18, 250×4,6 mm, 5µm A: acetonitrilas B: vanduo, pH 2,6 0 min 20 proc A, 20 min 65 proc. A; 1 ml/min 330 Li, 2002 Ymc Ods -
Aqtm RP18, 5µm, 120 Å, 4.6×250 mm, Waters A: 0,1 proc. TFA vandenyje, B: acetonitrilas, C: vanduo 0–8 min 80 proc. A, 20 proc. B; 8–15 min 32 proc. B, 68 proc. C; 15–55 min 64 proc. B, 36 proc. C; 55–65 min 95 proc. B, 5 proc. C 200 – 400
2 lentelės tęsinys Makris, 2002 Symmetry C18, 5µm, 150mm×3.6mm , Waters A: ortofosforo rūgštis vandenyje (pH 2,5), B: acetonitrilas: ortofosforo rūgštis vandenyje (pH 2,5) (6:4, v/v) 0 min 0 proc. B, 60 min 40 proc. B, 70 min 50 proc. B, 80 min 20 proc. B; 1 ml/min 290 Chang, 2001 Radial-pak C18 cartridge, 100×3,8 mm, 4µm, Waters, A: 5 proc. acetonitrilas fosfatiniame buferyje (pH 2,4), B: 25 proc. acetonitrilas fosfatiniame buferyje (pH 2,4) 0 min 10 proc. B, 20–30 min 80 proc. B; 1 ml/min 360 Puupponen-Pimia, 2001 Nova-Pak C-18, 3,9×150 mm, 4 µm, Waters A: fosfatinis buferis pH 2,6, B: 80 proc. acetonitrilas vandenyje, C: fosfatinis buferis pH 1,5 0-5 min 100 proc. A, 15 min 96 proc. A, 4 proc. B, 25 min 92 proc. A, 8 proc. B, 25,01 min 8 proc. B, 92 proc. C, 45 min 20 proc. B, 80 proc. C, 50 min 30 proc. B, 70 proc. C, 55 min 40 proc. B, 60 proc. C, 65-70 min 80 proc. B, 20 proc. C 365 Wang, 2004 Hypersil BDS C18, 5µm, 250×4.6mm A: acetonitrilas B: 1 proc. tetrahidrofuranas vandenyje su fosforo rūgštimi iki pH 3 0-8min 30 proc A, 8-12 min 100 proc. A; 1,2 ml/min 270 Schieber, 2001 Aqua 5µm C18, 250×4.6 mm
A: 2 proc. acto rūgštis vandenyje,
B: 0,5 proc. acto rūgštis vandens ir acetonitrilo mišinyje (1:1)
0 min 10 proc. B, 50 min 55 proc. B, 60 min 100 proc. B
370
Eliuavimas vandens – metanolio – acetonitrilo tirpalais
Sladkovsky, 2003 Discovery RP Amid C 16 A: acetonitrilas, B: metanolis, C: acetonitrilas: metanolis: 0,085 proc. ortofosforo rūgštis vandenyje (7:13:80 v/v) 0-4 min 100 proc. C, 9 min 7 proc. A, 5 proc. B, 88 proc. C, 12 min 15 proc. A, 85 proc. C, 15 min 30 proc. A, 70 proc. C, 20 min 45 proc. A, 55 proc. C, 25 min 55 proc. A, 45 proc. C; 0.5 ml/min 280 λ – bangos ilgis
Kapiliarinė elektroforezė – vis plačiau naudojamas efektyvus tyrimo metodas,
kuriam būdinga didelė skiriamoji geba, analizės atlikimo sparta, minimalus sunaudojamo pavyzdžio bei buferių tirpalų kiekis, galimybė taikyti nanokiekių analizei. Kai kurių autorių nuomone, KE efektyvumu lenkia izokratines ESC sistemas ir yra lyginama su gradientinėmis ESC sistemomis, tačiau ESC gradientinė analizė ilgai trunka ir yra sudėtingesnė. KE trūkumas – metodika dar nėra visapusiškai pritaikyta ir išvystyta natūralių biologiškai aktyvių komponentų analizei (Skerget ir kt., 2005).
Pirmą kartą KE flavonoidų analizei buvo panaudota 1991 metais (Pietta, Mauri, 1991). Literatūra pateikia keletą optimalių metodikų flavonoidams skirstyti kapiliarinės zonų elektroforezės metodu, tačiau dauguma tyrėjų analizuoja modelinius mišinius (Akiyama ir kt., 2000) ir tik keli nagrinėja augalinių ekstraktų skirstymo problemas (Suntorsuk, 2002).
KE – greitas, efektyvus ir lankstus metodas, įgalinantis išskirstyti sudėtingus mišinius. Šios charakteristikos siejamos su aukšta darbo įtampa ir efektyviu Džaulio šilumos išsklaidymu mažo vidinio skersmens silikagelio kapiliaruose (Wang, Huang, 2004). Analičių migracija kapiliarinės zonų chromatografijos metodu vyksta dėl dviejų jėgų: elektroforezinio mobilumo ir elektroosmozinės tėkmės. Elektroosmozinė tėkmė įtakojama krūvį turinčios vidinės kapiliaro sienelės. Lydyto silikagelio kapiliarai turi silanolinių grupių (pI=1,5), kurios lengvai jonizuojasi ir dėl to vidinė kapiliaro sienelė įgauna neigiamą krūvį. Teigiamai įkrauti elektrolito jonai yra pritraukiami prie neigiamai įkrautos sienelės ir taip suformuojamas elektrinis dvisluoksnis. Suteikus įtampą, katijonai, kartu ir tirpiklis – vanduo, juda link katodo. Rezultatas - buferinio tirpalo elektroosmozinė tėkmė neigiamo elektrodo kryptimi. Tipišku atveju analitė injekuojama anodiniame kapiliaro gale, o detekcija atliekama katodiniame. Skirstymo mechanizmas pagrįstas analičių masės ir krūvio santykiu. Dalelės krūvių kiekis varijuoja priklausomai nuo darbinio buferio pH. Tiriamieji flavonoidai turi neigiamą krūvį, kai pH didesnis nei 8 (Wang, Huang, 2004), todėl ir darbinio buferio pH turi būti didesnis nei 8.
Laukiami rezultatai. Tikimasi, kad didžiosios dalies Lietuvoje rinktų C. monogyna
vaistinės augalinės žaliavos ėminių kokybė atitiks vaistinei augalinei žaliavai keliamus reikalavimus. Didelė galimybė, kad atskiros gudobelių rūšių populiacijos ar atskiri fenotipai turės statistiškai reikšmingai didesnį suminį flavonoidų kiekį ar didesnį atskirų farmakologiškai aktyvių flavonoidų (hiperozido, viteksin-2”-O-ramnozido, rutino ar kt.) kiekį. Gretimų mokslo sričių specialistų tolesni tyrimai padėtų įvesti kokybiškesnius genotipus į kultūrą ar net išvesti atskiras gudobelių veisles.
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA
2.1. Tyrimų objektasVaistinės augalinės žaliavos ėminiai. C. monogyna pumpurų, žiedų, lapų ir vaisių
ėminiai rinkti 2001 – 2004 m. balandžio – spalio mėn. įvairiuose Lietuvos fitogeografiniuose regionuose. C. monogyna Lietuvos cenopopuliacijų pumpurų ir žiedų su lapais cheminės sudėties tyrimui vaistinė augalinė žaliava buvo rinkta 2001 m. Ventos (V1, V2, V3), Šušvės (Š1, Š2, Š3) upių, Dusios ežero (D1, D2, D3) apylinkėse nuo natūraliai augančių ekotipų. Kolekcinių individų cheminės sudėties tyrimui naudota vaistinė augalinė žaliava rinkta Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodo (VDU KBS) Ekspozicijų ir kolekcijų skyriuje, Botanikos instituto (BI) Mokslinėje eksperimentinėje bazėje bei Klaipėdos universiteto botanikos sode (KU BS). Veikliųjų medžiagų kiekio įvairavimui, priklausančiam nuo fenologinės fazės, įvertinti augalinė žaliava buvo rinkta 2003 – 2004 m. nuo trijų C. monogyna kolekcinių individų. Du individai (VL1, VL2) auginami Vilniaus miesto apylinkėse (vienas jų – BI Mokslinėje eksperimentinėje bazėje), trečias (KBS) auginamas Kauno miesto teritorijoje, VDU KBS Ekspozicijų ir kolekcijų skyriuje. Veikliųjų medžiagų kiekio įvairavimo skirtingose augalo lajos dalyse rinktuose lapuose įvertinimui naudoti lapai, rinkti nuo natūraliai Obelijos ežero apylinkėse augančio C. monogyna individo. Lietuvoje natūraliai neaugančių, bet sėkmingai auginamų svetimžemių gudobelių rūšių VAŽ ėminiai rinkti 2002 – 2004 metais Kauno (VDU KBS Ekspozicijų ir kolekcijų skyriuje), Vilniaus, Klaipėdos (KU Botanikos sode) regionuose, augalų lauko kolekcijose. C. chlorosarca, C.
chrysocarpa, C. microphylla, C. × prunifolia, C. succulenta var macracantha bei +Crataegomespilus dardarii fitocheminiam tyrimui naudoti Kauno regione (VDU KBS)
auginamų kolekcinių individų žaliavos ėminiai. C. mollis tirti trijų (Kauno, Vilniaus ir Klaipėdos regionuose auginamų) kolekcinių individų žaliavos ėminiai. C. submollis tirti trijų (dviejų Kauno, vieno Klaipėdos regione auginamų) kolekcinių individų žaliavos ėminiai.
Ėminiai rinkti nuo 1–2 m aukštyje virš žemės paviršiaus augančių šakų (išskyrus įvairavimo skirtingose augalo lajos dalyse rinktuose lapuose įvertinimui).
Fitocheminiams tyrimams naudota orasausė žaliava be išorinių pažeidimo požymių. Gauti tyrimų duomenys perskaičiuoti visiškai sausai žaliavai.
