MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
GIEDRĖ PRATKELYTĖ
CITRUSŲ (CITRUS L.) GENTIES AUGALŲ VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
CITRUSŲ (CITRUS L.) GENTIES AUGALŲ VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR
ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO NUSTATYMAS
Magistro baigiamasis darbas
Recenzentas Darbo vadovas
Prof. Liudas Ivanauskas
Data Data Darbą atliko Magistrantė Giedrė Pratkelytė Data
KAUNAS, 2018
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SANTRUMPOS ... 9
ĮVADAS ... 10
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 12
1.1. Citrus L. genties augalų morfologiniai požymiai ... 13
1.2. Citrus L. genties augalų kilmė, taksonomija, paplitimas ir produkcija ... 14
1.3. Citrus L. genties vaisių fitocheminė sudėtis ... 15
1.4. Citrusų (Citrus L.) genties augalų biologinis poveikis ... 17
1.5. Bendra Citrus L. genties fenolinių junginių apžvalga ... 20
1.6 Fenolinių junginių analizės metodai ... 22
1.7 Literatūros apibendrinimas ... 23
2. TYRIMO METODIKA ... 24
2.1. Tyrimų objektai ... 24
2.2. Medžiagos ir reagentai ... 25
2.3. Aparatūra ... 25
2.4.Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 26
2.5. Fenolinių junginių nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu ... 26
2.6. Spektrofotometriniai metodai ... 27
2.6.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27
2.6.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28
2.6.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatytmas DPPH metodu ... 29
2.7. Duomenų statistinis įvertinimas ... 29
3.1. Flavonoidų kokybinis ir kiekybinis nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių žaliavoje ESC ir
ESC – MS metodu ... 30
3.1.1. Kokybinis flavonoidų nustatymas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žaliavose ... 30
3.2. Metodo validacija ... 31
3.3. Kiekybinis flavonoidų nustatymas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žaliavose ... 33
3.3.1 Naringino koncentracijos nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių ekstraktuose ... 33
3.3.2. Izonaringino koncentracijos nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių ekstraktuose ... 35
3.4. Spektrofotometrinės analizės rezultatai ... 37
3.4.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatytmas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse ir sultyse ... 38
3.4.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatytmas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse ir sultyse ... 40
3.4.3 Antioksidantinio aktyvumo nustatytmas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse ir sultyse ... 42
IŠVADOS ... 45
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 46
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 47
SANTRAUKA
G. Pratkelytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas: prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.
Pavadinimas: Citrusų (Citrus L.) genties augalų vaisių fenolinių junginių ir antioksidacinio
aktyvumo nustatymas.
Tyrimo objektas ir metodai: Lietuvoje parduodamų citrusinių vaisių žievelės ir sultys. Citrusų
fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatyta ESC metodu, kurių tapatumas patvirtintas taikant ESC-MS metodą. Bendras fenolinių junginių kiekis įvertintas Folin-Ciocalteu metodu, bendras flavonoidų kiekis įvertintas atliekant reakciją su AlCl3. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas DPPH
spektrofotometriniu metodu.
Darbo tikslas: Nustatyti ir įvertinti fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties bei antioksidantinio aktyvumo įvairavimą Lietuvoje parduodamų Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse ir sultyse.
Darbo uždaviniai: Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinti flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių mėginiuose; įvertinti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio įvairavimą skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių mėginiuose, spektrofotometriniu metodu; nustatyti Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių metanolinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, taikant spektrofotometrinį DPPH metodą;
Rezultatai: ESC metodu nustatyti bei ESC-MS metodu patvirtinti Citrus L. genties vaisių
žievelėse ir sultyse šie fenoliniai junginiai: naringinas ir izonaringinas, kurių didžiausiasi kiekiai įvertinti geltonvaisės veislės tikrojo greipfruto “Jaffa sweetie” žievelėje ir sultyse. Didžiausias naringino kiekis nustatytas tikrojo greipfruto “Jaffa sweetie” žievelėse ir sultyse buvo 778,40±38,92 µg/ml ir 210,602±8,85 µg/ml, atitinkamai (p>0,05), bei didžiausias izonaringino kiekis nustatytas 123,70±6,06 µg/ml ir 49,584±1,69 µg/ml, atitinkamai žievelėse ir sultyse (p>0,05). Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas tikrojo greipfruto “Star Ruby” veislės vaisiaus žievelių ir sulčių ekstraktuose, kurie buvo 8,18±0,27 mg GAE/g ir 7,59±0,23 mg GAE/g, atitinkamai (p>0,05). Didžiausias bendras flavonoidų kiekis, nustatytas žaliosios citrinos “Mexican” žievelėse 2,63±0,08 mg RE/g (p>0,05) bei tikrojo mandarino “Celemenrubi” sultyse 2,81±0,09mg RE/g (p>0,05). Nustačius Citrus L. genties vaisių žievelių ir sulčių antioksidantinį aktyvumą DPPH metodu, didžiausias antioksidantinis aktyvumas įvertintas tikrojo
greipfruto “Star Ruby” žievelių (2608,11±114,76 μg/ml) ir tikrojo mandarino sulčių (479,02±0,21 µg/ml) ekstraktuose (p>0,05).
SUMMARY
G. Pratkelytė Master's thesis. Supervisor prof. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Lithuanian University of Health Sciences. - Kaunas.
Title: Determination of phenolic compounds and antioxidant activity in Citrus (Citrus L.) genus
plants fruits.
Object and methods: Peels and juices of citrus fruits which are sold in Lithuania. The qualitative
and quantitative composition of phenolic compounds were determined by HPLC method, which has been confirmed by using HPLC-MS method. The total phenolic compounds of citrus peels and juices were evaluated using the Folin-Ciocalteu method; the total amount of flavonoids were evaluated by reaction with AlCl3. Antioxidant activity was determined by DPPH spectrophotometric method.
The aim: To determine and assess a variety of quantitative and qualitative composition of
phenolic compounds and antioxidant activity in Citrus L. genus fruits peels and juices of plants sold in Lithuania.
Objectives: To evaluated the qualitative and quantitative composition of flavonoids in different
samples of Citrus L. genus fruit peels and juices using high-performance liquid chromatography (HPLC) method; to evaluated the total amount of phenolic compounds and total flavonoid content in different species of Citrus L. genus fruits peels and juice samples using spectrophotometric method; to analyse the antioxidant activity of citrus fruits peels and juice samples using spectrophotometric DPPH free radical scavenging method;
Results: Used HPLC and approved by HPLC – MS methods of Citrus L. genus fruit juices and
peels extracts determinated following phenolic compounds: naringin and isonaringin, which the highest levels determinated in grapefruit “Jaffa sweetie” peel and juice. The highest amount of naringin in grapefruit “Jaffa sweetie” peel and juice were 778,40 ± 38,92 μg / ml and 210,602 ± 8,85 μg / ml, respectively (p>0,05), the maximum isonarinin content were determined at 123, 70 ± 6,06 μg / ml and 49,584 ± 1,69 μg / ml, respectively in peel and juice (p>0,05). The highest amounts of phenolic compounds were found in grapefruit "Star Ruby" variety of fruit peel and juice extracts, which were 8,18 ± 0,27 mg GAE / g and 7,59 ± 0,23 mg GAE / g, respectively (p>0,05). The highest total amount of flavonoids found in lime "Mexican" peel was 2,63 ± 0,08 (p>0,05) and mandarin "Celemenrubi" juice was 2,81 ± 0,09 mg / g (p>0,05). The highest antioxidant activity were determined in grapefruit “Star Ruby” fruit peel (2608,11 ± 114,76 μg / ml) and juice (431,1054 ± 18,97 μg / ml) extracts (p>0,05).
PADĖKA
Dėkoju Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto, Medicinos akademijos, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros lekt. Mindaugui Marksai bei Farmakognozijos katedros dr. Kristinai Zymonei ir dok. Vaidotui Žvikui už pagalbą atliekant tyrimus ir analizuojant turimus duomenis.
SANTRUMPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
ESC–MS – efektyvioji skysčių chromatografija – masių spektrometrija FAO – Jungtinių Valstijų maisto ir žemės ūkio organizacija
PMF – polimetoksilinti flavonai TG – trigliceridai
MTL – mažo tankio lipoproteinai DTL – didelio tankio lipoproteinai
aPTT – aktyvus dalinis tromboplastino laikas Fb – fibrinogenas
ĮVADAS
Pastaruoju metu didėja natūralių biologiškai aktyvių junginių paklausa, nes žmonės pradėjo išreikšti didesnį susirūpinimą savo sveikata, ypač dėl sveikos mitybos. Epidemiologiniai tyrimai rodo, kad didelis polifenolinių junginių suvartojimas su maistu yra susijęs su sumažėjusia lėtinių ligų rizika. Atsižvelgiant į tai, Citrus L. genties augalų vaisiai yra pripažįstami kaip biologiškai aktyvių junginių, tokių kaip fenoliniai junginiai, vitaminai, karotinoidai ir skaidulos, šaltinis [1].
Citrusai (Citrus L.), kurie priklauso rūtininių (lot. Rutaceae) šeimai, yra viena iš populiariausių pasaulio vaisių kultūrų, kurie buvo naudojami Rytų medicinoje kaip apetitą gerinanti, viduriavimą ir vėmimą mažinanti, atsikosėjimą lengvinanti bei meteorizmą ir skorbutą gydanti priemonė bei buvo viena iš tepalų sudedamųjų dalių gydant aknę ir egzemą [1,2].
Naujausi moksliniai tyrimai atskleidė, kad citrusinių vaisių žievelių ir sulčių ekstraktai, tiek iš jų išskirti biologiškai aktyvūs komponentai pasižymi plačiu biologiniu poveikiu: antioksidantiniu, antimikrobiniu, širdies ir kraujagyslių sistemą apsaugančiu ir priešvėžiniu poveikiu bei antidiabetiniu aktyvumu [3,4]. Būtent šie biologiniai poveikiai yra siejami su biologiškai aktyvių fitocheminių medžiagų gausa, įskaitant fenolinius junginius, kumarinus, limonoidus, karotinoidus ir eterinius aliejus, kurių šaltiniais laikomi citrusiniai vaisiai [5,6].
Šiuo metu, dėl didelio citrusų farmakologinio potencialo, labiausiai tyrinėjama šių augalų biologiškai aktyvių medžiagų grupė flavonoidai, priklausantys fenoliniams junginiams, kuriais susidomėjo ir farmacijos pramonė [7]. Šie junginiai pasižymi antioksidantiniu [8], priešgrybeliniu [9], priešuždegiminiu [10], antihiperlipideminiu [11], priešvėžiniu [12], antispazminiu [13], hipoglikeminiu [14] ir kardioprotekciniu aktyvumu [15].
Nors citrusai nėra natūraliai kultivuojami Lietuvoje, tačiau citrusinių vaisių galima įsigyti maisto prekių parduotuvėse, kuriuos įsigyję žmonės, vartoja juos kaip maisto produktus ir priemonės sustiprinti imunitetą dėl didelio vitamino C kiekio [16].
Darbo naujumas. Tyrimų apie citrusinių vaisių žievelių ir sulčių fitocheminę sudėtį yra tirta
daugelyje šalių, kuriose jie yra auginami, tačiau Lietuvoje jie nėra natūraliai kultivuojami ir tyrimų apie jų kokybinę ir kiekybinę sudėtį atlikta nėra. Šiame magistriniame darbe bus atliekami spektrofotometriniai Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimo tyrimai, bei efektyviosios skysčių chromatografijos būdu nustatyti pagrindiniai citrusų fenoliniai junginiai – naringinas ir izonaringinas.
antioksidantinio aktyvumo įvairavimą Lietuvoje parduodamų Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse ir sultyse.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – nustatyti ir įvertinti fenolinių junginių kiekybinės ir kokybinės sudėties bei antioksidantinio aktyvumo įvairavimą Lietuvoje parduodamų Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse ir sultyse.
Darbo uždaviniai:
1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu įvertinti flavonoidų kokybinę ir kiekybinę sudėtį skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių mėginiuose.
2. Įvertinti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio įvairavimą skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių mėginiuose, spektrofotometriniu metodu;
3. Nustatyti Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių metanolinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą taikant spektrofotometrinį DPPH metodą;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Citrus L. genties augalų morfologiniai požymiai
1 pav. Citrus L. genties augalų vaisiai
Citrusų (Citrus L.) genties augalai priklauso citrusinių (lot. Citroideae) pošeimiui, rūtininių (lot. Rutaceae) šeimai ir yra daugiamečiai visžaliai augalai [17].
Citrinmedžiai – medžiai arba krūmai, siekiantys nuo 5 iki 15 metrų aukštį, kurių jaunos šakos turi pavienių spyglių, o senos dažniausiai bespyglės [4]. Lapai dažniausiai paprasti – ištisiniai, lygiais kraštais bei tinkliškai gysloti [18]. Lapkotis dažnai būna sparnuotas [17]. Didžiojo ir tikrojo greipfrutinio citrinmedžių lapkočių sparneliai dideli, apelsininio citrinmedžio – mažesni, o tikrojo citrinmedžio lapkočiai be sparnelių [18]. Žiedai yra 2-4 cm skersmens, pažastiniai, labai kvapnūs, baltos arba rausvos spalvos, auga po vieną arba grupelėmis. Taurelė yra puodelio formos, sudaryta iš 5 taurėlapių ir dažniausiai būna 4-8 stori, pailgi, linijiniai žiedlapiai [4,17]. Vaisiai – ovalios arba pailgos formos uogos (lot. hesperidium) (1 pav.), dažniausiai nuo 4 cm (žaliosios citrinos) iki daugiau kaip 25 cm (didžiojo citrinmedžio) diametro [4]. Vaisiaus žievelė - tai spalvotoji perikarpo dalis, kuri išorėje turi daugybę eterinio aliejaus liaukučių, kurios suteikia vaisiui būdingą citrusų kvapą [17]. Šių eterinio aliejaus liaukučių skersmuo svyruoja nuo 10 μm iki maždaug 0,5 mm ir gali būti pastebimos plika akimi pavyzdžiui, tikruosiuose apelsinuose, tikruosiuose greipfrutuose bei tikruosiuose mandarinuose [19,20]. Endokarpas sudarytas iš segmentų, sultingų pūslelių, tarp kurių yra aptinkamos kelios sėklos, tačiau kai kurios citrusų rūšys yra besėklės [21,19]. Sėklos gali būti kūgio, kiaušinio ir ovalios formos, kurių išorinis sluoksnis yra rupus, gelsvos spalvos [19].
Citrusinių vaisių žievelė savo sudėtyje turi daug pigmentų, todėl skirtingų rūšių citrusiniai vaisiai gali būti ir skirtingų spalvų: nuo tamsiai oranžinės arba rausvos iki šviesiai oranžinės, geltonos arba žalsvos spalvos (1 pav.) [22,19,20]. Vidinė žievelės dalis - mezokarpas (albedo) yra baltas arba kartais turintis atspalvį (pvz., raudonuosiuose greipfrutuose ar raudonuosiuose apelsinuose). Žaliųjų citrinų ir mandarinų mezokarpas yra 1-2 mm storio, saldžių apelsinų 2-5 mm storio, o didžiųjų greipfrutų gali būti net iki 20 mm storio [20,23].
1.2. Citrus L. genties augalų kilmė, taksonomija, paplitimas ir produkcija
Citrusinių vaisių auginimas pasaulyje yra vystomas mažiausiai 4000 metų, tačiau tikroji jų kilmė nėra žinoma. Yra manoma, kad tikrieji citrusiniai vaisiai yra kilę iš pietrytinės Azijos žemyno dalies, o jų paplitimą po įvairias pasaulio dalis įtakojo naujų civilizacijų kūrimąsis, kolonijų plitimai bei prekybinių kelių judėjimai. Būtent iš Azijos, citrusai pirmiausiai pateko į Viduržemio jūros regioną iš kurio paplito po Šiaurės Afriką ir Pietų Europą [24].
1753 m. K. Linėjui išskyrus Citrus L. gentį, pagrindinis dėmesys buvo sutelktas į citrusų taksonomiją bei rūšis, priklausančias citrusų genčiai, tačiau dėl didelės genetinės įvairovės citrusuose, vis dar nėra aiškiai apibrėžtos citrusų taksonominės klasifikacijos [25]. Daugelyje tyrimų yra naudojamos dvi pagrindinės Citrus L. genties klasifikavimo sistemos, kurias pasiūlė Walter T. Swingle ir Tyosaburo Tanaka. Remiantis Swingle klasifikacija, visi citrusiniai augalai yra suskirstyti į 16 rūšių, o Tanaka išskyrė Citrus L. gentį plačiąja prasme ir įtraukė 156 rūšis, kaip tikrąsias botanines rūšis nepriklausomai nuo to ar tai yra tikrosios ar hibridinės rūšys [18]. Dar devintojo dešimtmečio viduryje buvo nustatyta bei morfologiniais ir biocheminiais, o šiandien ir genetiniais tyrimais patvirtinta, kad C. medica, C. maxima ir C. reticulata yra trys tikrosios citrusų rūšys, o kitos citrusų rūšys yra hibridinės kilmės [24,26].
Šiandien, remiantis FAO statistika, citrusiniai vaisiai auginami visame pasaulyje daugiau nei 140 šalių, tačiau didžioji dalis citrusų auga abiejose pusiaujo pusėse, apimančias tropines ir subtropines platumas. Labiausiai žinomi ir komerciškai svarbūs citrusiniai vaisiai yra tikrieji apelsinai, tikrosios citrinos, žaliosios citrinos, tikrieji greipfrutai ir tikrieji mandarinai. Pagal 2009 m. FAO duomenimis, Kinija, Brazilija, JAV, Indija, Meksika ir Ispanija yra pagrindinės citrusinių vaisių auginimo šalys, kurios sudaro beveik du trečdalius pasaulinio produkcijos [27,28].
Viduržemio jūros regionas, kurio pagrindinės augintojos yra Italija ir Ispanija sudaro apie 20% visos pasaulio citrusinių vaisių produkcijos. Italijoje auginamų citrusinių vaisių plotas yra sutelktas
pietiniuose regionuose, ypač Sicilijoje ir Kalabrijoje, kurios kartu atsakingos už daugiau nei 80% visos citrusų produkcijos Italijoje [29].
2 pav. Pagrindiniai pasaulio citrusinių vaisių auginimo regionai (pažymėti oranžine spalva) [28].
1.3. Citrus L. genties vaisių fitocheminė sudėtis
Citrusiniai vaisiai pasižymi didele biologiškai aktyvių junginių gausa, kurių pokyčius įtakoja nokimo laikotarpis, augalo rūšis ir veislė, augimo klimatas ir dirvožemis, vaisių laikymo sąlygos ir kiti faktoriai [30,31,18].
Fenoliniai junginiai. Citrusiniai vaisiai ir jų sultys išsiskiria kaip vieni turtingiausių fenolių šaltinių [32].
Antocianai. Cianidino 3-gliukozidas ir cianidin-3- (6'-malonil) -gliukozidas yra pagrindiniai antocianinai trijų veislių raudonųjų apelsinų sultyse, kurių lygis vaisiuose skyrėsi pagal koncentraciją: “Moro”> “Sanguinello”> “Tarocco” [34].
Flavonoidai. Flavonoidai yra pagrindinė biologiškai aktyvių junginių klasė aptinkama citrusiniuose vaisiuose, ypač žievelėse, minkštime ir sėklose. Citrusų flavonoidai skirstomi į tris pagrindinius tipus: flavononus, flavonus ir flavonolius. Flavononai yra dominuojanti grupė, kurių glikozidų pavidalu yra gerokai didesnis kiekis nei laisvųjų flavononų. Dažniausiai aptinkami citrusų flavononai yra hesperetinas ir jo glikozidai (hesperidinas ir neohesperidinas), naringeninas ir jo glikozidai (narirutinas ir naringinas) [22,35,36,31]. Flavonai ir jų glikozidai yra antra pagrindinė flavonoidų grupė, kurią sudarią sudaro diosminas, apigeninas, luteolinas, diosmetinas ir tangeretinas [35, 38]. Palyginus flavonolius su flavanonais ir flavonais, flavonolių kiekis yra daug mažesnis. Kaempferolis ir kvercetinas yra dažniausiai aptinkami flavonoliai citrusuose [35].
Fenolinės rūgštys. Citrusų žievelėse nustatytos šios fenolinės rūgštys: kavos, ferulo, sinapo ir p- kumaro rūgštys, iš kurių didžiausias kiekis nustatytas chlorogeninės rūgšties [37]. Remiantis atliktais tyrimais, tikrųjų greipfrutų ir tikrųjų apelsinų žievelių mėginiuose nustatytas didžiausias chlorogeninės rūgšties kiekis 2,45 ppm ir 1,95 ppm atitinkamai. Kavos rūgšties buvo nustatyta 0,19, 0,166, 0,07 ir 0,04 ppm tikrųjų apelsinų ir tikrųjų greipfrutų žievelių, tikrųjų apelsinų ir tikrųjų citrinų sulčių mėginiuose, atitinkamai [33].
Kumarinai. Furanokumarinai, metoksilinti ir hidroksilinti kumarinai yra labiausiai paplitę tarp citrusų, kurių kiekis įvairuoja tarp skirtingų citrusų veislių [38]. Vertinant bendrą kumarinų kiekį, didžiausias kiekis šių metabolitų yra žaliosiose citrinose, mažesnis tikruosiuose greipfrutuose, o mažiausias tikruosiuose mandarinuose. Didžiausias ostolio kiekis aptinkamas tikruosiuose apelsinuose, limetino – tikrosiose citrinose ir žaliosiose citrinose, bergamotino daugiausiai nustatoma tikruosiuose greipfrutuose [39].
Karotinoidai. Citrusai kaupia karotinoidus tiek žievelėje, tiek vaisių minkštime, o jų turinys
priklauso nuo citruso rūšies. Tikrieji mandarinai ir tikrieji apelsinai paprastai kaupia daugiausia karotinoidų, įskaitant β-kriptoksantiną, violaksantiną, liuteiną ir zeaksantiną. Tikrųjų greipfrutų ir didžiųjų greipfrutų vaisiai daugiausia kaupia fitoeną, fitoflueną, ζ-karotiną, β-karotiną ir likopeną (raudonieji greipfrutai). Tikrieji citronai, tikrosios citrinos ir žaliosios citrinos kaupia mažiausiai karotinoidų [30,40].
Eteriniai aliejai. Pagrindiniai citrusų eterinio aliejaus junginiai yra monoterpenai (α-pinenas,
β-pinenas) iš kurių d-limonenas aptinkamas visų citrusinių vaisių žievelių eteriniame aliejuje ir sudaro 80– 95 % visų citrusinių aliejų. Terpenoidai, kurie sudaro maždaug 5 % aliejaus suteikia citrusams specifinį aromatą. Karbonilo junginiai (aldehidai ir ketonai) labai prisideda prie citrusinių vaisių aromato. Monoterpenų aldehidai neralis ir geranialis, kurie dažniausiai aptinkami santykiu 2:3, suteikia tipišką citrinų aromatą, seksviterpenų ketonas nootkatonas ir 1-p-menten-8-tiolis yra pagrindiniai junginiai suteikiantys tikrųjų greipfrutų aromatą. Tikrųjų apelsinų aromatą labiausiai lemia aldehidai ir ketonai: n-oktanalis ir n-dekanalis, o tikrųjų mandarinų aromatą suteikia dekanalis, a-sinensalis ir linalolis [41,22].
Limonoidai. Citrusų limonoidai dideliais kiekiais yra nustatomi sultyse ir kituose audiniuose kaip
vandenyje tirpūs limonoidų gliukozidai arba sėklose kaip vandenyje netirpūs limonoidų aglikonai. Dažniausiai nustatomi limonoidai yra limoninas ir nomilinas, kurie yra aglikonų pavidalu, o tipiškas ir dažniausiai nustatomas gliukozidas yra limonino gliukozidas [41].
Vitaminas C. Citrusiniai vaisiai yra vitamino C šaltinis, kurio didžiausi kiekiai aptinkami vaisių
žievelėse lyginant su sultimis [42]. Ištyrus trijų citrusinių vaisių žieveles, nustatyta, kad Orlando veislės tikruosiuose apelsinuose yra 62,45 mg/100g, Kinnow veislės tikruosiuose mandarinuose 54,87 mg/100g ir
Eureka veislės tikrosiose citrinose 25,68 mg/100g vitamino C [43]. Tačiau askorbo rūgšties kiekis niekada nėra stabilus ir priklauso nuo tam tikrų faktorių [44].
1.4. Citrusų (Citrus L.) genties augalų biologinis poveikis
Antimikrobinis aktyvumas. Ištirta, kad etanoliniai citrusinių vaisių (Citrus limon, Citrus
paradisi, Citrus sinensis, Citrus reticulata) žievelių ir sulčių dėrinių ekstraktai pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš gram-teigiamas (Gr+) bakterijų padermes: Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Streptococcus mitis, Streptococcus salivarius, Streptococcus pneumoniae ir gram-neigiamas (Gr-) bakterijų padermes: Klebseilla pneumoniae, Escherichia coli. Palyginus antimikrobinį aktyvumą tarp skirtingų citrusinių vaisių rūšių ekstraktų, nustatyta tokia antimikrobinio aktyvumo mažėjimo seka: Citrus limon> Citrus reticulata> Citrus paradisi> Citrus sinensis. Tyrimo metu taip pat nustatyta, kad citrusų vaisiai pasižymi didesniu antimikrobiniu aktyvumu prieš gramteigiamų nei prieš gramneigiamų bakterijų padermes [45].
Antidiabetinis poveikis. Atliktas in vivo tyrimas, kurio metu nustatyta, kad tikrųjų apelsinų (lot.
Citrus sinensis) vaisių žievelių ekstraktas pasižymi antidiabetiniu poveikiu, kuris siejamas su žievelėse esančiais flavononais - hesperidinu ir naringinu. Eksperimento metu nustatyta, kad 500 mg/kg Citrus sinensis žievelių ekstrakto dozė, pasižymi didžiausiu gliukozės koncentraciją kraujo serume mažinančiu aktyvumu žiurkių modeliuose. Be to, nustatyta, kad Citrus sinensis žievelių ekstraktas pasižymėjo didesniu gliukozės koncentraciją kraujo serume mažinančiu aktyvumu (61.36 ± 5.57 %) nei antidiabetinis vaistas – glibenklamidas (42.76 ± 12.48 %) [46].
Kitame in vitro tyrime nustatyta, kad naringeninas, kurio dideli kiekiai randami tikruosiuose greipfrutuose, aktyvuoja aktyvuotą proteino kinazę ir tiesiogiai stimuliuoja gliukozės įsisavinimą raumenyse, priklausomai nuo dozės ir laiko, bet nepriklausomai nuo insulino. Didžiausia stimuliacija stebima 2 val., naudojant 75 μM naringenino koncentraciją. Tyrimo duomenys taip pat rodo, kad naringenino poveikis gliukozės įsisavinimui raumeninėse skaidulose yra tokio pačio lygio kaip ir didžiausia insulino stimuliacija (192,8 ± 24%, p <0,01 (naringeninas) ir 190,1 ± 13%, p <0,001 (insulinas) [47].
Dar vienas mokslinis tyrimas atliktas siekiant įvertinus tikrojo mandarino, tikrojo apelsino, tikrojo greipfruto ir žaliosios citrinos žievelių ekstraktų poveikį Wistar žiurkių gliukozės koncentracijai kraujo serume, kurios buvo maitinamos standartine laboratorine dieta, sumaišyta su 1% cholesterolio ir 0,25%
tulžies druskos miltelių. Palyginus citrusų žievelių ekstraktų gliukozės koncentraciją kraujo serume mažinantį poveikį su etaloninio vaisto - metformino (20 mg / kg) poveikiu, nustatyta, kad citrusų vaisių žievelės pasižymi stipresniu gliukozės kiekį kraujo plazmoje mažinančiu poveikiu nei metforminas [48].
Antiaterosklerozinis poveikis. 2010 metais, Kanados mokslininkai atliko in vivo tyrimą, kurio
metu patvirtino hipotezę, kad citrusų flavonoidas - naringeninas apsaugo nuo aterosklerozės. Tyrimo metu, 6 mėnesius, 3 C57BL/6 Ldlr -/- žiurkių grupėms buvo taikytos trys skirtingos dietos : mažo kaloringumo dieta, kurią sudarė 4% kalorijų, didelio kaloringumo vakarietiška dieta, kurią sudarė 42% kalorijų ir 0,05% cholesterolio bei vakarietiška dieta, papildyta 3% naringeninu. Ekperimento metu buvo pastebėta, kad aterosklerozė, aortos arkos ir pilvo ertmės aortos dalyse, sumažėjo daugiau kaip 70% bei cholesterolio kiekis ir trigliceridų nusėdimas aortoje sumažėjo daugiau kaip 50%, vakarietišką dietą papildžius 3% naringeninu. Taip pat nustatyta, kad mitybą papildžius naringeninu, 80% sumažėjo kepenų trigliceridų ir cholesterilo esterio masės. Be to, naringeninas normalizavo vakarietiškos dietos sukėlą hiperinsulinemiją ir nutukimą iki tokio lygio, kuris buvo pastebėtas pelėse, kurioms buvo skirta mažo kaloringumo dieta [49].
Antihiperlipideminis poveikis. Atliktas tyrimas siekiant nustatyti C. sinensis ir C. paradisi
hipolipideminį poveikį žiurkėms, vartojančioms cholesteroliu pripildytą dietą. Tyrimo metu Wister žiurkėms buvo skiriamos skirtingos dozuotės sulčių bei jų kombinacijos: Citrus sinensis 2, 5, 8 ml/kg, Citrus paradisi 0,1, 0,3, 0,5 ml/kg, kombinacijos: 2 ml/kg + 0,1 ml/kg (SPL-1) ir 5 ml/kg + 0,3 ml/kg (SPL-2) atitinkamai. Tyrimo rezultatai buvo lyginami su kontroline grupe ir etanoliniu vaistu - atorvastatinu (10 ml/kg). Gauti rezultatai rodo, kad visos trys C. sinensis ir C. paradisi dozės mažina cholesterolio, trigliceridų ir mažo tankio lipoproteinų koncentracijas, bet didelio tankio lipoproteinų padidėjimas buvo reikšmingas skiriant tik 8 ml/kg ir 0,3 ml/kg, atitinkamai. Gyvūnai, vartoję C. sinensis ir C. paradisi derinio dozes, taip pat parodė didelį cholesterolio, MTL ir TG kiekio sumažėjimą, kuris buvo labai panašus į atorvastatino poveikį, tačiau SPL-2 derinys reikšmingai padidino DTL lygį [50].
Antikoaguliacinis poveikis. Atlikti in vitro / in vivo tyrimai, kurių metu nustatytas tikrųjų citrinų
(lot. Citrus limon) sulčių poveikis kraujo parametrams, krešėjimo ir antikoaguliacijos faktoriams. Eksperimento metu triušiams buvo skiriamos trys skirtingos Citrus limon sulčių dozės (0,2ml/kg, 0,4ml/kg, 0,6ml/kg). Kontrolinei grupei skiriamas fiziologinis tirpalas bei kaip standartiniai vaistai buvo pasirinkti aspirinas ir varfarinas. In vitro tyrimo rezultatai parodė, kad grupėje, kuri vartojo tikrųjų citrinų sultis labai padidėjo trombino laikas ir aktyvaus dalinio tromboplastino laikas bei reikšmingai sumažėjo fibrinogeno koncentracija lyginant su kontroline grupe, o aPTT vertės buvo labai arti natrio heparino
vertės. Gauti in vivo tyrimo rezultai parodė, kad 0,4 ml / kg Citrus limon sulčių dozė pasižymi maksimaliu antikoaguliaciniu poveikiu, nes vartojant šią dozę reikšmingai padidėjo raudonųjų kraujo kūnelių skaičius, hemoglobino koncentracija ir labai sumažėjo eritrocitų pasiskirstymo plotis. Pastebėtas statistiškai reikšmingas kraujavimo laiko ir trombino laiko padidėjimas bei Fb sumažėjimas. Nustatyta, kad 0,4ml/kg Citrus limon dozės reikšmingai slopina trombocitų agregaciją, kurią sukelia adenozino difosfatas, kolagenas, epinefrinas ir arachidono rūgštis. 0,4ml/kg Citrus limon dozės poveikis proteinui C ir trombino antitrombino kompleksui reikšmingai padidėjo po 30 ir 60 dienų ir išsiskyrė iš kitų dozių [51].
Priešopinis poveikis. Indijos mokslininkai Papiya Bigoniya ir Kailash Singh atliko tyrimą, kurio metu
įvertino, iš Citrus sinensis (L.) Osbeck išdžiovintos žievelės išskirto flavonoido hesperidino priešopinį aktyvumą. Poveikis įvertintas naudojant indometacino ir hipoterminio streso sukeltų opų žiurkių modelius, skiriant 150, 300 ir 450 mg / kg hesperidino dozes. Gauti tyrimo rezultatai rodo, kad skiriant 300 ir 450 mg / kg hesperidino dozes reikšmingai (p<0,01-0.001) padidėjo skrandžio pH, sumažėjo bendras rūgštingumas ir opų indeksas lyginant su indometacino grupe. Taip pat nustatyta, kad 450 mg / kg hesperidino dozė slopina oksidacinį ląstelių pažeidimą, reikšmingai padidindama superoksido dismutitazės (p <0,001), redukuoto glutationo ir katalazės (p <0,05) lygį, bei reikšmingai normalizuoja indometacino sukeltą ekstremalų mucino kiekio sumažėjimą, kurio poveikio 450 mg / kg dozė buvo lygi omeprazolio 20 mg/kg dozei [52].
Indijos mokslininkai atliko kitą tyrimą, kuriuo nustatė C. medica vandeninio ekstrakto priešopinį poveikį etanolio sukeltoms skrandžio opoms žiurkėse. Gauti tyrimo rezultatai atskleidė, kad skiriant 250 mg/kg ekstrakto dozę reikšmingai sumažėja opų skaičius, opų sunkumo lygis, procentinis opų kiekis bei opų indeksas palyginus su negydyta grupe. Tačiau opų sumažėjimas buvo reikšmingiausias skiriant 500 mg/kg C. medica ekstrato dozę, kurios poveikis buvo panašus į ranitidino grupės poveikį [53].
Priešvėžinis aktyvumas. Jungtinių Amerikos Valstijų mokslininkai (2008) ištyrė šešių citrusų
flavanoidų antineoplastinį poveikį. Tyrimo metu buvo naudojamas žiurkėno skruosto maišelio modelis, į kurį buvo dedama flavonoidų (2,0-2,5%) ir kancerogeno 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (0,5%) tirpalai. Eksperimento duomenys rodo, kad 4 flavonoidai (hesperetinas, neohesperidinas, tangeretinas ir nobiletinas) tyrimo metu buvo neaktyvūs, o naringinas ir naringeninas reikšmingai sumažino navikų skaičių, kurių rezultatai buvo 2,53 (naringino grupė) ir 3,25 (naringenino grupės), lyginant su kontroline grupe, kurios rezulatas buvo 5,00. Naringinas taip pat žymiai sumažino naviko dydį, kuris lyginant su kontroline grupe (269 mm3) buvo 77,1 mm3 [12].
1.5. Bendra Citrus L. genties fenolinių junginių apžvalga
Citrusiniai vaisiai yra fenolinių junginių, ypač flavonoidų ir fenolinių rūgščių šaltiniai. Mokslininkai vis daugiau dėmesio skiria citrusinių vaisių fenoliniams junginiams, nes daugelis epidemiologinių tyrimų parodė, kad vartojant dideli polifenolinių junginių kiekį turinčių maisto produktų ir gėrimų, sumažėja širdies ir kraujagyslių ligų, insulto ir tam tikrų vėžio formų rizika [54].
Fenolinės rūgštys. Pagal struktūrą, fenolinės rūgštys yra suskirstytos į hidroksibenzoines ir
hidroksicinamono rūgštis. Fenolinių rūgščių molekulėje yra fenolio žiedas ir karboksi grupė bei gali būti viena arba daugiau hidroksilo (OH-) ir metoksi (-CH3O) grupių pakaitų, kurių išsidėstymas ant aromatinio žiedo lemia individualių junginių skirtumus [56]. Dauguma fenolinių rūgščių egzistuoja sujungtose formose per esterio, eterio arba acetalio jungtis su kitais struktūriniais komponentais, polifenoliais arba su mažesnėmis organinėmis molekulėmis. Ir tik maža dalis fenolinių rūgščių egzistuoja laisva forma [57]. Hidroksicinamono rūgštys yra labiausiai paplitusios fenolinės rūgštys tarp citrusinių vaisių, kurioms būdinga C6-C3 struktūra [58]. Vertinant hidroksicinamono rūgščių kiekį tarp Citrus paradisi ir Citrus sinensis vaisių, nustatytas toks, šių fenolinių rūgščių kiekis: ferulo rūgštis> sinapo rūgštis> p-kumaro rūgštis> kavos rūgštis. Hidroksibenzoinėms rūgštims būdingas C1-C6 struktūros pagrindas [57]. Hidroksibenzoinės rūgštys, tokios kaip galo ir protokatechino rūgštys yra aptinkamos nedideliais kiekiais ir pasižymi mažesniu antioksidaciniu aktyvumu lyginant su hidroksicinamoninėmis rūgštimis [54].
Flavonoidai. Tai natūralūs junginiai, plačiai paplitę citrusiniuose vaisiuose, kurių struktūros
pagrindą sudaro 2-fenil-benzo- γ-pirono žiedas. 1930 m. Iš C. sinensis buvo išskirta nauja medžiaga, kuri, kaip buvo manoma, yra naujos klasės vitaminas ir buvo pavadintas vitaminu P. Vėliau paaiškėjo, kad ši medžiaga buvo flavonoidas (rutinas). Pagrindiniai citrusų flavonoidai yra suskirstyti į tris pagrindines klases tokias kaip flavonai (pvz., apigeninas, liuteolinas ir diosmetinas), flavonoliai (pvz., kvercetinas ir kaempferolis), flavanonai (pvz., hesperetinas ir naringeninas) [39,59,60,61]. Taip pat flavonoidams priskirimi ir polimetoksilintiflavonai (pvz., tangeretinas, nobiletinas), kurie kartais laikomi atskiru flavonoidų tipu dėl jų ypatingos struktūros (polimetoksilinimo) ir aukšto biologinio aktyvumo, bei antocianinai (pvz., cianidin 3-gliukozidas ir cianidin 3-(6”-malonil)-β-gliukozidas), kurie aptinkami tik raudonuosiuose „Moro“, „Tarocco“, „Sanguinello“ veislės tikrųjų apelsinų minkštime ir žievelėse bei Citrus limon „ISA Red Lemon“ veislės žievelėje [34,62]. Nors citrusų flavonoidai egzistuoja dviejų formų: aglikonų ir glikozidų, tačiau augaluose dažniausiai sutinkami glikozilinti flavonoidai [39,60,61].
Flavononai. Citrusų vaisiuose flavanonai sudaro apie 95% visų flavonoidų, kurie dažniausiai
suskirstyti į dvi kategorijas: neohesperidozidus ir rutinozidus [15,39]. Flavanono neohesperidozidai pasižymi karčiu skoniu ir apima naringiną, neohesperidiną ir neoeriocitriną. Priešingai nei neohesperidozidai, flavanono rutinozidai, kuriems priskiriami hesperidinas, narirutinas, didiminas yra beskoniai [39]. Flavononai dar vadinami dihidroflavonais, kurie turi prisotintą C žiedą, todėl, skirtingai nei flavonai, dviguba jungtis tarp 2 ir 3 pozicijų yra prisotinta [63].
Flavonai. Citrusų vaisiuose flavonai ir jų glikozidai yra antra pagrindinė flavonoidų grupė po
flavanonų. Priešingai nei flavononai, flavonų C-2 ir C-3 padėtyse yra dviguba jungtis. Dažniausiai aptikami laisvi citrusų flavonai yra apigeninas, liuteolinas, diosmetinas ir chrizoeriolis. Šie flavonai nėra unikalūs citrusiniams vaisiams, nes yrs aptinkami daugelyje kitų augalų. Citrusų flavonų glikozidams labiausiai būdingos cukraus dalys yra gliukozė, rutinozė ir neohesperidozė. O-glikozidai ir C-glikozidai yra dvi pagrindinės flavonų glikozidų formos [64].
Polimetoksilinti flavonai. Citrusinių vaisių žievelėse yra aptinkami polimetoksilinti flavonai,
tageretinas, nobiletinas ir sinensetinas, kurie turi dvigubą ryšį tarp C2 ir C3 padėčių ir karbonilo grupę C žiedo C4 padėtyje bei mažiausiai keturias metoksigrupes (OCH3) benzo-γ-pirono bazinėje struktūroje
[63,65]. PMF dažniausiai aptinkami Citrus genties augaluose, ypač dviejų citrusų rūšių, Citrus sinensis ir Citrus reticulata žievelėse [66].
Flavonoliai. Citrusiniuose vaisiuose flavonolių kiekis aptinkamas daug mažesnis nei kitų
flavonoidų. Skiriamoji flavonolių savybė yra tai, kad C-3 padėtis yra hidroksilinta. Citrusuose dažniausiai aptinkami flavonoliai yra kempferolis ir kvercetinas. Flavonolio glikozidai yra gaunami iš C-3 ar C-7 padėties O-glikozilinimo su gliukoze ir rutinoze metu. Kartais tiek C-3, tiek C-7 padėtys vienu metu gali būti O glikozilintos [64].
1.6 Fenolinių junginių analizės metodai
Spektrofotometrinė analizė. Spektrofotometrija yra viena iš palyginti paprastų augalinėje
žaliavoje esančių fenolinių junginių kiekio nustatymo metodų. Šis analizės metodas yra populiarus dėl mažų sąnaudų, jautrumo, greičio ir patikimumo. UV-Vis spektrofotometrija yra vienas iš dažniausiai naudojamų metodų, kurio veikimo principas dažniausiai priklauso nuo tiriamojo tirpalo medžiagos absorbuotos spinduliuotės ultravioletinio (UV) ir regimojo (VIS) spektrų. Kolorimetrinės reakcijos yra plačiai naudojamos UV / Vis spektrofotometriniuose metoduose, kurios yra lengvai atliekamos, greitos, pigios ir dažnai atliekamos laboratorijoje [67, 68,69].
Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojamas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas. Augalinių ekstraktų polifenoliai reaguoja su specifiniais redokso reagentais (Folin-Ciocalteu reagentu), sudarydami mėlyną kompleksą, kurį galima išmatuoti regimosios šviesos spektrofotometrija. Reakcija formuoja mėlyną chromoforą, sudarytą iš fosfomolibdeno komplekso, kurio didžiausia chromoforų absorbcija priklauso nuo šarminio tirpalo ir fenolinių junginių koncentracijos [70, 71].
Bendras flavonoidų kiekis augalinėje žaliavoje taip pat gali būti įvertintas kolorimetriniais metodais vykdant flavonoidų reakciją su AlCl3. Metanoliniai arba etanoliniai augaliniai ekstraktai leidžia
nustatyti bendrą flavonoidų kiekį esant λ = 410-423 nm [72].
Antioksidantinis aktyvumas gali būti išmatuojamas spektrofotometriniu būdu tiek grynoje medžiagoje, tiek naudojant įvairių vaistinių augalų mišinius. Literatūroje yra pateikiama daugybė bendrų antioksidantinių savybių nustatymo metodų, tačiau dažniausiai naudojami naudojami šie : DPHH - radikalų surišimo metodas, FRAP – geležies jonų redukcinio aktyvumo metodas, ORAC – deguonies radikalų absorbcijos pajėgumo nustatymo metodas ir ABTS - radikalų – katjonų surišimo metodas. Remiantis taikytu reakcijos mechanizmu, pagrindiniai antioksidaciniai analizės tyrimai gali būti suskirstyti į dvi kategorijas: vandenilio atomo pernešimo reakcijas ir vieno elektrono pernašos reakcijos pagrįstos analizės [73].
Efektyvioji skysčių chromatografija. ESC metodas yra vienas iš plačiausiai taikomų metodų
fenolinių junginių kiekybinei ir kokybinei analizei augalinėje žaliavoje, kurių analizę įtakoja įvairūs veiksniai, įskaitant mėginio grynumą, judančiąją fazę, kolonelės tipą ir detektorius. Nustatant fenolinius junginius citrusų žaliavoje, dažniausiai naudojama atvirkštinių fazių chromatografija, kurioje nejudančioji fazė yra nepolinė, o judančioji – polinė, tokia kaip metanolis ar acetonitrilas. Paprastai esant normaliai atvirkštinės fazės būsenai, labiau polimeriniai junginiai išplaunami pirmiausiai. Pradžioje išplaunami diglikozidai, o pabaigoje - monoglikozidai ir aglikonai. Išplautas medžiagas ir jų išplovimo laikus fiksuoja prie ESC sistemos prijungtas tam tikros rūšies detektorius (UV, MS, fotodiodų ir kt.). Taikant ESC metodą, įdentifikuoti junginiai vaizduojami skirtingomis smailėmis ir skirtingu jų sulaikymo laiku [72,75,76].
Dujų chromatografija (DC). Tai dar vienas metodas, taikomas fenolinių junginių, tokių kaip
fenolinės rūgštys, kondensuoti taninai ir flavonoidai atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui. Pagrindinė problema atliekant dujų chromatografijos analizę yra fenolinių junginių derivatizacija ir jų nepastovumas. Tačiau dujų chromatografijai būdingi du privalumai: 1.) metodas pasižymi aukštu selektyvumu; 2.) galimybė kiekybiškai įvertinti sudėtiniuose mišiniuose esančių junginių dideles ir labai mažas koncentracijas. Dujų chromatografijos būdų analizuojamos lakios medžiagos dujų
fazėje, mėginio komponentus ištirpinant tirpiklyje ir išgarinant, kad analitės būtų atskirtos paskirstant mėginį tarp dviejų, nejudančiosios ir judančiosios fazių. Judančioji fazė yra chemiškai inertiška dujos, dažniausiai naudojamos helio dujos, kurios padeda pernešti analitės molekules per šildomą kolonėlę. Dujų chromatografija yra vienintelis chromatografijos metodas, kuris nenaudoja mobiliosios fazės sąveikai su analite [72, 74, 77].
1.7 Literatūros apibendrinimas
Nors Citrus L. genties augalai labiausiai auginami tropinėse ir subtropinėse pusiaujo platumose, kurios yra palankios citrusų auginimui, jie yra eksportuojami po visą pasaulį dėl didelės jų paklausos, kuri yra susijusi su sveika gyvensena ir jų biologiniu poveikiu.
Šiuo metu Citrus L. genties augalų vaisiai yra plačiai tyrinėjami mokslininkų, dėl jų plataus biologinio poveikio žmogaus sveikatai, kurie siejami su citrusų polifenoliniais junginiais. Citrusai yra laikomi fenolinių junginių šaltiniais, kurie yra stiprūs antioksidantai apsaugantys žmogaus organizmo ląsteles nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio, kuris yra susijęs su lėtinių ligų, tokių kaip vėžys, diabetas, širdies ir kraujagyslių sistemos ligos, vysymųsi. Todėl labai svarbu, taikant tinkamus analizės metodus, nustatyti citrusinių vaisių fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo pasiskirstymą tarp skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių.
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimų objektai
Tyrimo metu buvo tirti Citrus L. genties citrusinių vaisių džiovintų žievelių ir šviežių sulčių mėginiai:
1 lentelė. Skirtingų citrusinių vaisių rūšių veislės ir kilmė
Augalas Vaisius Veislė Kilmė
Greipfrutinis citrinmedis (Citrus padarisi)
Tikrasis greipfrutas Star ruby Meksika
Apelsininis citrinmedis (Citrus sinensis)
Tikrasis apelsinas Valencia Pietų Afrikos Respublika Mandarininis citrinmedis (Citrus reticulata) Tikrasis mandarinas Celemenrubi Ispanija Tikrasis citrinmedis (Citrus limon)
Tikroji citrina Primofiori Ispanija
Rūgščiavaisis citrinmedis
(Citrus aurantifolia)
Žalioji citrina Mexican lime Meksika
Greipfrutinis citrinmedis (Citrus padarisi)
Tikrasis greipfrutas Marsh Pietų Afrikos
Respublika Greipfrutinis citrinmedis
(Citrus padarisi)
Tikrasis greipfrutas Sunrise Meksika
Greipfrutinis citrinmedis (Citrus padarisi)
Tikrasis greipfrutas Jaffa sweetie Izraelis
Didysis citrinmedis (Citrus maxima)
Didysis greipfrutas Jaffa Sweetie Izraelis
Didysis citrinmedis (Citrus maxima)
2.2. Medžiagos ir reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”); Metanolis 99,9 % (Sigma-Aldrich);
Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich); Etanolis 96% (Vilniaus degtinė);
Ledinė acto rūgštis (99,5% Sigma-Aldrich);
Aliuminio chloridas (99,99% Sigma-Aldrich); Heksametilentetraminas (≥99,9 % Roth, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV); Etilacetatas (99,5 % Sigma-Aldrich);
Acetonitrilas 99,9 % (Sigma-Aldrich).
2.3. Aparatūra
Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija); Elektrinis malūnas (Retsch 200, Haan, Vokietija);
Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV); Termostatinė ultragarsinė vonelė (Heidolph, Schwabach, Vokietija); Skysčių chromatografas Waters 2695;
ACE C18 (250 mm x 4,6 mm);
Spektrofotometras (Dynamica, HALO DB-20);
Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės; Centrifuga Hermle Z206A („Denville Scientific Inc“, JAV); Džiovinimo spinta.
2.4.Tiriamųjų mėginių paruošimas
Ekstraktai ruošiami iš 1,0 g ( 0,001 g tikslumu) tikrojo greipfruto (C.paradisi), tikrojo apelsino (C. sinensis), tikrosios citrinos (C. limon), žaliosios citrinos (C. aurantifolia), tikrojo mandarino (C. reticulata) ir didžiojo greipfruto (C.maxima) išdžiovintų ir susmulkintų vaisių (Citrus L.) žievelių ir iš 200 ml šviežiai išspaustų sulčių. Ekstrakcija buvo vykdoma 15 min. su 5 ml etilacetatu ultragarsinėje vonelėje, o po to centrifuguojant 5 min. esant 4000 aps/min greičiui. Gautas tirpalas nupilamas į apvaliadugnę kolbą ir viskas pakartojama tris kartus. Po to buvo atliekamas gauto skysčio sukoncentravimas esant 50 º C temperatūrai, 40 rpm aps/min. naudojant rotacinį garintuvą. Gautas sausas likutis ekstrahuojamas 5 ml metanoliu (100 %). Gauti ekstraktai laikomi šviesaus stiklo buteliukuose tolimesniems tyrimams.
2.5. Fenolinių junginių nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC)
metodu
Įranga
Tyrime naudotas skysčių chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters 996, 200 - 400 nm bangų ilgio diapazonas). Biologiškai aktyvių junginių atskyrimui naudota chromatografavimo kolonėlė - ACE C18 (250 mm x 4,6 mm), sorbento dalelių dydis 5 μm.
ESC metodo sąlygos
Atsižvelgiant į mokslininkų tyrimus, tiriamųjų junginių atskyrimui taikytas gradientinis eliuevimas. Kiekvieno koncentruoto ekstrakto 6 μl tūris įpurškiamas ir analizuojamas esant 280 nm bangos ilgiu. Eliuentas A: acetonitrilas, eliuentas B: vanduo, kurio srautas 1 ml / min. Naudojamas šis tiesinis gradientas: 0,0 min, 10% A; 10 min., 20% A; 35 min., 40% A; 45 min, 100% A; 50 min, 100% A; 51 min., 10% A. Kolonėlės temperatūra 30 ° C.
ESC- MS įranga ir sąlygos
ESC metodu nustatytų flavonoidų patvirtinimui buvo taikomas ESC-MS metodas, naudojant „Waters Acquity UPLC“ chromatografas bei fotodiodų matricos „Xevo TQD“ detektorius su elektroniniu jonizacijos šaltiniu (ESI). Analizei buvo naudojamas YMC Triart C18 (100 x 2,0 mm 1,9 μm) kolonėlė. Kolonėlės temperatūra buvo palaikoma 40 ° C. Flavonoidų kiekio nustatymui taikyta gradientinis eliuavimas: 0,1% (v/v) skruzdžių rūgšties (tirpalas A) ir acetonitrilas (tirpalas B), kurio tėkmės greitis – 0,5 ml / min. Pritaikytos tokios eliuacijos sąlygos. A tirpalo proporcijos: nuo 0 iki 1 min. - 95%, 5 min. - 70%, 7 min. 50%, nuo 7.5 iki 8 min. 0%, nuo 8,1 iki 10 min. 95%.
2.6. Spektrofotometriniai metodai
Metodai atliekami remiantis Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, analizinės ir toksikologinės chemijos katedroje atliktais kitų farmacijos magistrantų darbais [78,79].
2.6.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas atliekamas naudojant Folin - Ciocalteu reagentą. Tyrimams atlikti ruošiamas darbinis reagentas: 7% natrio karbonato tirpalas paruošiamas 17,5 g medžiagos tirpinant 250 ml distiliuoto vandens. Analizei imama 1 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, kuris sumaišomas su 1 ml Folin - Ciocalteu reagentu, 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7 % natrio karbonato tirpalo ir distiliuotu vandeniu praskiedžiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Po inkubacinio laikotarpio spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 750 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimas kartojamas tris kartus.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlygomis kaipir tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje augalinės žaliavos ekstrakto yra naudojama 1 ml metanolio.
Metanoliniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant galo rūgšties 100 % metanolinį tirpalą paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ir 2,5 mg/ml.
Gauti duomenysvertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 0,9068x + 0,0617;
R2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/g.
2.6.2 Bendro flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Tyrimui pirmiausia gaminamas reagentas iš 4 ml, 96 % etanolio, 0,2 ml, 33% ledinės acto rūgšties, 0,8 ml, 5 % heksametilentetramino (5 g medžiagos tirpinami 100ml distiliuoto vandens), 0,6 ml, 10 % aliuminio chlorido (10 g aliuminio chlorido miltelių tirpinami 100 ml distiliuoto vandens) ir 0,2 ml citrusinių vaisių žievelių ekstrakto ir 1 ml citrusinių vaisių sulčių ekstrakto. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 30 min. kambario temperatūtoje, tamsoje.
Lyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoje augalinio ekstrakto naudojamas 100 % (v/v) metanolis.
Praėjus inkubaciniam laikotarpiui (30 min.) atliekami matavimai su spektrofotometru prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai atliekami tris kartus.
Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 mg/ml ) rutino tirpalai. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5 skirtingų tirpalo koncentracijų.
Duomenys įvertinami pagal rutino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 0,9465x - 0,0950;
R2 = 0,9960;
y = absorbcijos dydis
2.6.3 Antioksidacinio aktyvumo nustatytmas DPPH metodu
DPPH tirpalo paruošimas. 3,75 mg DPPH medžiagos tirpinama 125 ml acetonitrilo ir 125 ml
natrio citrato tirpalo. Pagamintas tirpalas iki naudojimo turi būti laikomas tamsioje vietoje. Analizei imama 3000 µl DPPH tirpalo, pilama 20 µl citrusinių vaisių žievelių ekstrakto ir 100 µl citrusinių vaisių sulčių ekstrakto ir gerai sumaišius laikoma 30 min. tamsioje vietoje. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoj augalinio ekstrakto pilamas toks pat kiekis metanolio 100%. Pirmiausia matuojamas palyginamasis tirpalas, o vėliau visi tiriamieji ekstraktai. DPPH surišimo absorbcija apskaičiuojama iš palyginamojo tirpalo absorbcijos atėmus tiriamo ekstrakto absorbcijos dydį. Absorbcija matuojama prie 515 nm bangos ilgio.
Gauti rezultatai vertinami pagal trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygtį y = -532,46x - 0,569;
R2 = 0,993;
y = absorbcijos dydis;
x = bendras medžiagų kiekis išreikštas TE (trolokso ekvivalentu) µg/g.
2.7. Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas programomis „MS Excel 2007“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir „SPSS 20.0“ (IBM, JAV) statistiniu paketu. Apskaičiuotas tyrimų duomenų matematinis vidurkis, standartinis nuokrypis ir statistinis duomenų reikšmingumas.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1 . Flavonoidų kokybinis ir kiekybinis nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių
žaliavoje ESC ir ESC – MS metodu
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo atliktas kokybinis ir kiekybinis flavonoidų įvertinimas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių metanoliniuose ekstraktuose. Analizės metu nustatyti du pagrindiniai junginiai – naringinas ir izonaringinas, kurie įvertinti atsižvelgiant į chromatografinį profilį pagal kitų mokslininkų tyrimų duomenis.
Kokybinis ESC tyrimas buvo atliktas remiantis Karen M. ir kt.(2013) atliktais moksliniais tyrimais, kurių metodiką pritaikėme flavononų įvertinimui citrusų žaliavoje. Gavome panašų chromatografinį profilį kaip ir Castro-Vazquez L. ir kt. (2016) atliktame tyrime bei minėtame straipsnyje ir papildomai atlikome ESC-MS tyrimą junginių tapatybės patvirtinimui.
Atlikus ESC-MS tyrimą, nustatėme du pagrindinius flavonoidus, kurie patvirtina gautus ESC rezultatus. Kiekybiniam naringino ir izonaringino įvertinimui buvo pasirinktas naringeninas, todėl naringino ir izonaringino kiekiai buvo išreikšti naringenino ekvivalentui. Tiksliam kiekybiniam įvertinimui buvo atlikta ESC metodikos validacija atsižvelgiant į naringeniną.
3.1.1. Kokybinis flavonoidų nustatymas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių
žaliavose
Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ir sulčių ekstraktuose, ESC metodu identifikuoti flavonoidai – izonaringinas ir naringinas, kurių ekstraktų chromatogramos pateiktos 3 ir 4 paveiksluose.
3 pav. Tikrojo greipfruto (Citrus paradisi) “Star Ruby” sulčių ekstrakto chromatograma. 1 – izonaringinas (sulaikymo trukmė 18,127 min.), 2 – naringinas (sulaikymo trukmė 19,169 min.).
4 pav. Didžiojo greipfruto (Citrus maxima) “Jaffa Red Pomelo” sulčių ekstrakto chromatograma. 1 – naringinas (sulaikymo trukmė 19,169 min.).
3.2. Metodo validacija
Atlikta naringenino metodikos validacija įvertinant šiuos kriterijus: rezultatų glaudumą (rezultatų pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą), specifiškumą, tiesiškumą, aptikimo ir nustatymo ribas. Naringenino kalibracinės kreivės charakteristika pavaizduota 2 lentelėje.
Glaudumas (preciziškumas) buvo nustatytas įvertinant pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą. Pakartojamumas įvertintas apskaičiuojant tą pačią dieną viena po kitos atliekant 6 pakartojimus, tomis pačiomis analizės sąlygomis, naudojant tą patį naringenino etalono tirpalą. Tarpinis preciziškumas įvertintas atliekant tiriamosios analitės analizę po 5 injekcijas 3 dienas iš eilės. Po to, vertinamas santykinis standartinis nuokrypis (SSN), apskaičiavus smailės ploto ir sulaikymo laiko santykį, kuris turi būti ne didesnis kaip 5 proc.
2 lentelė. Analitės kalibracinės kreivės charakteristika Analizuojamos medžiagos pavadinimas Koreliacijos koeficientas R2 Ribos µg/ml Atsikartojamumas % Tarpinis preciziškumas % Aptikimo riba µg/ml Nustatymo riba µg/ml Naringeninas 0.9999 1,68-108,12 0,11 0,2 0,04 0,14
Specifiškumas nustatytas lyginant analičių ir standartinių tirpalų chromatogramas, t.y. smailių sulaikymo laikus.
Tiesiškumas buvo įvertintas nustačius smailės ploto tiesinę priklausomybę nuo analitės/medžiagos koncentracijos. Tiesiškumas nustatytas įvertinant kalibravimo kreivės koreliacijos koeficientą R2 (6 pav.)
Naringenino aptikimo ir nustatymo ribos buvo įvertintos, lyginant analitės smailės aukštį su bazinės linijos triukšmu.
3.3. Kiekybinis flavonoidų nustatymas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių
žaliavose
3.3.1 Naringino koncentracijos nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių
ekstraktuose
Naringino nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ekstraktuose. Gauti rezultatai
pavaizduoti 7 pav. Didžiausias naringino kiekis, nustatytas ESC metodu, buvo tikrojo greipfruto “Jaffa sweetie” geltonvaisės veislės žievelių mėginyje (778,40±38,92 µg/ml). Vertinant tikrojo greipfruto raudonvaises veisles “Star Ruby” ir “Sunrise”, nustatyta panaši flavanono - naringino koncentracija, kuri buvo 685,02±33,57 µg/ml ir 671,59±32,24 µg/ml, atitinkamai. Mažesnė naringino koncentracija nustatyta kitoje geltonvaisėje tikrojo greipfruto “Marsh” veislės žievelės mėginyje (397,19±17,48 µg/ml). Vertinant didžiojo greipfruto dviejų veislių “Jaffa Sweetie” ir “Jaffa Red Pomelo” žievelių ekstraktus, nustatyta naringino koncentracijos buvo 243,40±12,17 µg/ml ir 195,38±8,79 µg/ml, atitinkamai. Mažiausia naringino koncentracija nustatyta tikrojo mandarino “Celemenrubi” žievelės ekstrakte (50,30±2,46 µg/ml). Naringinas nebuvo nustatytas tikrojo apelsino “Valencia”, žaliosios citrinos “Mexican” ir tikrosios citrinos “Primofiori” žievelių ekstraktuose (p>0,05).
7 pav. Naringino kiekio įvairavimas skirtingų rūšių citrusinių vaisių žievelių ekstraktuose Naringino nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių sulčių ekstraktuose. Didžiausias
(210,60±8,85 µg/ml). Tikrojo greipfruto “Sunrise” ir “Jaffa Sweetie” veislėse nustatytas naringino kiekis sulčių ekstraktuose buvo 131,81±6,59 µg/ml ir 108,719±4,35 µg/ml atitinkamai. Mažiausia naringino koncentracija įvertinta tikrojo greipfruto “Marsh” geltonvaisės veislės sulčių ekstrakte (43,05±2,07 µg/ml) (8 pav.). Priešingai nei tikrojo mandarino “Celemenrubi” veislės vaisių žievelių ekstrakte, sulčių ekstrakte naringinas nėra aptinkamas. Be to, naringinas nėra aptinkamas ir tikrojo apelsino (Citrus sinensis) “Valencia”, žaliosios citrinos (Citrus aurantifolia) “Mexican” ir tikrosios citrinos (Citrus limon) “Primofiori” sulčių ekstraktuose (p>0,05).
Gauti naringino nustatymo citrusinių vaisių sulčių mėginiuose rezultatai buvo palyginti su kitų tyrėjų duomenimis. Ribeiro IA ir Ribeiro MHL (2008) Portugalijoje atliko šviežiai spaustų tikrųjų greipfrutų (Citrus paradisi), tikrųjų apelsinų (Citrus sinensis) ir žaliųjų citrinų (Citrus aurantifolia) sulčių naringino analizę. Gauti naringino tyrimo rezultatai tikruosiuose greipfrutuose buvo 476,82 µg/ml, tikruosiuose apelsinuose 209,68 µg/ml, o žaliųjų citrinų sultyse naringinas nebuvo nustatytas. Kadangi nėra tiksliai nurodyta, kokia C. paradisi veislė buvo naudojama Portugalijoje atliktame tyrime, palyginta naringino koncentracija su visų Lietuvoje tirtų C. paradisi veislių sulčių mėginiais, kurio koncentracija buvo 2,26 “Jaffa sweetie”, 3,61 “Sunrise”, 6,48 “Star Ruby” ir 11,07 “Marsh” kartų didesnė nei šių C. paradisi tirtų veislių sulčių mėginiuose. Naringinas nebuvo nustatytas C. aurantifolia sulčių mėginyje ir priešingai nei Portugalijoje atliktame tyrime, naringinas taip pat nenustatyas C. sinensis sulčių mėginyje.
3.3.2. Izonaringino koncentracijos nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių
ekstraktuose
Izonaringino nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių žievelių mėginių ekstraktuose.
Didžiausia izonaringino koncentracija nustatyta tikrojo greipfruto “Jaffa sweetie” geltonvaisės veislės žievelės mėginyje (123,70±6,06 µg/ml). Tikrųjų greipfrutų “Sunrise” ir “Star Ruby” raudonvaisių vaisių veislėse bei tikrojo apelsino “Valencia” vaisių žievelių ekstraktuose nustatyti mažesni izonaringino kiekiai, kurių koncentracija buvo 39,73±1,97 µg/ml, 36,26±1,56 µg/ml, 11,63±0,50 µg/ml, atitinkamai. Mažiausia koncentracija įvertinta tikrojo mandarino “Celemenrubi" žievelės ekstrakte (2,56±0,10 µg/ml) (9 pav.). Izonaringinas nebuvo nustatytas žaliosios citrinos (C.aurantifolia), tikrosios citrinos (C.limon) ir didžiojo greipfruto (C.maxima) žievelių ekstraktuose.
9 pav. Izonaringino kiekio įvairavimas skirtingų rūšių citrusinių vaisių žievelių ekstraktuose Izonaringino nustatymas Citrus L. genties augalų vaisių sulčių mėginių ekstraktuose.
Izonaringino koncentracija citrusinių vaisių sulčių ekstraktuose yra žymiai mažesnė lyginant su žievelių ekstraktais. Šio flavonoido kiekis citrusų sulčių ekstraktuose įvairuoja nuo 2,52±0,12 µg/ml iki 49,58±1,69 µg/ml. Tikrojo greipfruto “Jaffa sweetie” geltonvaisės veislės sulčių mėginyje, kaip ir žievelių ekstrakte, nustatyta didžiausia izonaringino koncentracija (49,58±1,69 µg/ml). Tikrojo apelsino “Valencia” sulčių mėginyje yra įvertintas izonaringinas, kurio koncentracija yra mažiausia lyginant su kitomis citusų rūšimis (2,52±0,12 µg/ml) (10 pav.). Taip pat izonaringinas nebuvo nustatytas didžiojo greipfruto (C.maxima), žaliosios citrinos (C. aurantifolia) ir tikrosios citrinos (C.limon) sulčių mėginiuose.
10 pav. Izonaringino kiekio įvairavimas skirtingų rūšių citrusinių vaisių sulčių ekstraktuose
3.4. Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Spektrofotometrinės analizės metu, atsižvelgiant į citrusinių vaisių sezoniškumą, buvo įvertinti 5 skirtingų rūšių citrusinių vaisių žievelių ir sulčių metanoliniai ekstraktai 100 % (v/v), kurių bandymai buvo atlikti po tris kartus. Tyrimo metu buvo įvertintas bendras fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidacinio aktyvumo įvairavimas skirtingų rūšių citrusinių vaisių žievelių ir sulčių ekstraktuose.
Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu. Citrusų žaliavų suminis fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas pagal galo rūgšties ekvivalentą ir išreikštas mg/g. Bendras flavonoidų kiekis įvertintas aliuminio chlorido spektrofotometriniu metodu, kuris apskaičiuotas pagal rutino ekvivalentą ir išreikštas mg/g. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas buvo atliekamas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) metodu. Laisvųjų radikalų surišimo geba apskaičiuota pagal antioksidanto trolokso ekvivalentą ir išreikšta µg/ml.
3.4.1 Bendro fenolinių junginių kiekio nustatytmas skirtingų Citrus L. genties augalų
vaisių žievelėse ir sultyse
Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių žievelių ekstraktuose. Pagal gautus rezultatus, kurie pavaizduoti 11 pav., nustatyta, kad bendras fenolinių
junginių kiekis citrusinių vaisių žievelių ekstraktuose įvariruoja nuo 3,70±0,14 mg GRE/g iki 8,18±0,27 mg GRE/g. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas tikrojo greipfruto “Star Ruby” žievelės ekstrakte (8,18±0,27 mg GRE/g). Mažesni fenolinių junginių kiekiai įvertinti tikrojo apelsino “Valencia” (5,30±0,21 mg GRE/g), žaliosios citrinos “Mexican” (5,94 ±0,16 mg GRE/g) bei tikrosios citrinos “Primofiori” (4,65±0,20 mg GRE/g) žievelių ekstraktuose. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas tikrojo mandarino “Celemenrubi” (3,70±0,14 mg GRE/g) mėginyje (p>0,05).
11 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingų rūšių citrusinių vaisių žievelių ekstraktuose (n=3)
Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingų Citrus L. genties augalų vaisių sulčių mėginių ekstraktuose. Nustatytas didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis tikrojo greipfruto “Star Ruby” (7,59±0,23 mg GRE/g) ir tikrojo apelsino “Valencia” (6,11±0,21 mg GRE/g) sulčių mėginiuose. Mažesnė, tačiau tarpusavyje panaši, šių junginių koncentracija nustatyta žaliosios citrinos “Mexican” (4,58±0,17 mg GRE/g) ir tikrojo mandarino “Celemenrubi” (4,89±0,21 mg GRE/g) sulčių mėginiuose. Mažiausias bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas tikrosios citrinos “Primofiori” veislės sulčių mėginyje (2,83±0,13 mg GRE/g) (12 pav.) (p>0,05).
12 pav. Bendro fenolinių junginių kiekio įvairavimas skirtingų rūšių citrusinių vaisių sulčių ekstraktuose (n=3)
Lyginant bendrą fenolinių junginių kiekio įvairavimą tarp skirtingų citrusinių vaisių žaliavų (žievelių ir sulčių) mėgininių, pastebėta, kad didžiausias šių junginių kiekis įvertintas Citrus L. genties augalų vaisių žievelėse, kurie svyruoja nuo 3,70±0,14 mg GRE/g iki 8,18±0,27 mg GRE/g. Tačiau tikrojo apelsino “Valencia” ir tikrojo mandarino “Celemenrubi” sulčių mėginiai parodė didesnius fenolinių junginių kiekius nei žievelės, kurie buvo 6,11±0,21 mg GRE/g ir 4,89±0,21 mg GRE/g, atitinkamai.
Gauti tyrimo rezultatai buvo palyginti su literatūroje pateiktais kitų tyrėjų gautais rezultatais. Irkin R. ir kt. (2015) Turkijoje atliko keturių skirtingų citrusinių vaisių žievelių ir sfulčių, suminio fenolinių junginių kiekio spektrofotometrinį tyrimą. Nustatyto suminio fenolinių junginių kiekio rezultatai žievelėse ir sultyse buvo didesni lyginant su Lietuvoje atliktų tyrimų duomenis. Turkijoje atlikto tyrimo suminio fenolinių junginių kiekio rezultatai citrusų žievelėse nustatyti tikrojo greipfruto 13,71 mg GRE/g, tikrojo apelsino 11,08 mg GRE/g, tikrojo mandarino 9,31 mg GRE/g, tikrosios citrinos 5,35 mg GRE/g bei sultyse 657,65 mg GRE/g, 532,44 mg GRE/g, 636,73 mg GRE/g, 579,41 mg GRE/g, atitinkamai. Palyginus su Lietuvoje tirtų skirtingų citrusinių vaisių žievelių ir sulčių ekstraktų gautais rezultatais, Turkijoje tirtų citrusinių vaisių bendras fenolinių junginių kiekis buvo didesnis C. paradisi 1,67, C. sinensis 2,08 , C. reticulata 2,51, C. limon 1,15 kartų citrusinių vaisių žievelių ekstraktuose bei 86,55, 87,02, 130,21, 204,30 atitinkamai didesnis kartų kiekis sulčių mėginiuose. Fejzić A. ir Ćavar S. (2014) Bosnijoje ir Hercegovinoje atliko keturių skirtingų citrusinių vaisių, įsigytų maisto prekių praduotuvėje, žievelių ir sulčių suminio fenolinių junginių kiekio nustatymą spektrofotometriu Folin-Ciocalteau metodu. Atlikto tyrimo suminio fenolinių junginių kiekio rezultatai citrusų žievelėse buvo C. paradisi 0,283 ±
