FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
JUSTAS MAČINSKAS
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS – VARIO JONŲ
REDUKCIJOS ANTIOKSIDANTINĖS GALIOS ĮVERTINIMAS RYKŠTENĖS
(SOLIDAGO L.) RŪŠIES AUGALUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Prof. dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis Data
EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS – VARIO JONŲ
REDUKCIJOS ANTIOKSIDANTINĖS GALIOS ĮVERTINIMAS RYKŠTENĖS
(SOLIDAGO L.) RŪŠIES AUGALUOSE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Prof. dr. Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas Justas Mačinskas Data
TURINYS
SANTRAUKA... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 7
2. ĮVADAS ... 8
3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 9
4. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10
4.1. Rykštenės augalų apibūdinimas, biologinės savybės ir cheminė sudėtis ... 10
4.1.1. Rykštenės genties augalų morfologija ir paplitimas ... 10
4.1.2. Rykštenės genties augalų cheminė sudėtis ... 11
4.1.3. Rykštenės genties augalų farmakologinės savybės ... 12
4.2. Antioksidantai, jų poveikis bei įvertinimo metodikos ... 12
4.2.1. Bendra apţvalga ir papitimas augaliniame pasaulyje ... 12
4.2.2. Fenoliniai junginiai – kvercetino glikozidai ir chlorogeno rūgštis ... 13
4.2.3. Fenolinių junginių - kvercetino glikozidų ir chlorogeno rūgšties bioprieinamumas ... 15
4.2.4. Fenolinių junginių - kvercetino glikozidų ir chlorogeno rūgšties poveikis ţmogaus organizmui ... 15
4.2.5. Fenolinių junginių - kvercetino glikozidų ir chlorogeno rūgšties ekstrakcija iš augalinės ţaliavos ... 16
4.2.6. Polifenolinių junginių skirstymas efektyviąja skysčių chromatografija ... 17
4.3. Biologinė oksidacija ir antioksidantinio aktyvumo vertinimo metodai ... 18
4.3.1. Laisvųjų radikalų apibrėţimas ir poveikis ţmogaus organizmui ... 18
4.3.2. Polifenolinių junginių antioksidantinis vertinimas ... 18
5. TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI ... 22
5.1. Tyrimų objektas ... 22
5.2. Medţiagos ir reagentai ... 22
5.4. Tyrimo metodika ... 23
5.4.1. Rykštenės genties augalų lapų ir ţiedų ekstraktų paruošimas ... 23
5.4.2. Standartinių tirpalų bei reagento gamyba... 23
5.4.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos ... 24
5.4.4. Pokolonėlinis antioksidantinio aktyvumo tyrimas naudojant CUPRAC reagentą... ... 24
5.4.5. Antioksidantinio tyrimo metodikos validacija ... 25
5.4.6. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas. ... 25
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS... 26
6.1. Pokolonėlinės reakcijos su CUPRAC reagentu metodo optimizavimas ... 26
6.2. Metodikos validacija ... 29
6.2.1. Pakartojamumas ... 30
6.2.2. Tarpinis preciziškumas... 31
6.2.3. Tiesiškumas ... 32
6.2.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ... 32
6.3. Antioksidantinio aktyvumo kiekybinis įvertinimas augalinėje ţaliavoje ... 33
7. IŠVADOS ... 40
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 41
9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 42
SANTRAUKA
J. Mačinsko magistro baigiamasis darbas „Efektyviosios skysčių chromatografijos – vario jonų redukcijos antioksidantinės galios įvertinimas rykštenės (Solidago L.) rūšies augaluose“ / mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologijos chemijos katedra. – Kaunas.
Raktiniai ţodţiai: Solidago L., rykštenė, antioksidantai, efektyvioji skysčių chromatografija, pokolonėlinės reakcijos, CUPRAC.
Darbo tikslas: pritaikyti ir optimizuoti rykštenės (Solidago L.) ekstraktų antioksidantinio aktyvumo, atliekant ESC pokolonėlines reakcijas su CUPRAC reagentu, metodiką ir ištirti rykštenės ekstraktų antioksidantines savybes.
Tyrimo objektas ir metodai: rykštenės (Solidago L.) genties augalų lapų ir ţiedų antioksidantinio aktyvumo tyrimas, naudojant ESC pokolonėlinės reakcijos metodą su CUPRAC reagentu. Buvo naudojami rykštenės preparatų 70% metanoliniai ekstraktai (1:100), ekstrahuojama 50 min ultragarso vonelėje 25ºC temperatūroje. Chromatografinis skirstymas buvo atliktas naudojant 150x4,6 mm, 3 µm YMC kolonėlę, injekcijos tūris 10 µL. Mobilią fazę sudarė 0,05% trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo ir acetonitrilo gradientinė sistema, tėkmės greitis - 1,0 ml/min, CUPRAC reagento tėkmės greitis – 0,4 ml/min.
Darbo uţdaviniai: surinkti ir išanalizuoti literatūros duomenis, optimizuoti ir validuoti rykštenės (Solidago L.) genties augalų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimo metodiką, analizuojant kilpos ilgio, temperatūros ir reagento tėkmės greičio įtaką antioksidantiniam aktyvumui, naudojant CUPRAC reagentą. Pagal pagrįstą metodiką įvertinti rykštenės (Solidago L.) genties augalų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Išvados: optimalios rykštenės (Solidago L.) genties augalų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymo sąlygos su CUPRAC reagentu yra gaunamos naudojant 10 metrų ilgio PEEK kilpą (išorinis skersmuo - 1.58 mm, vidinis skersmuo - 0.25 mm), termostatuojant 50ºC temperatūroje ir reagentą į sistemą tiekiant 0,4 ml/min greičiu. Nustatyta, kad didţiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasiţymi vėlyvosios rykštenės lapų ir ţiedų metanoliniai ekstraktai. Didţiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasiţymėjo chlorogeno rūgštis ir kvercitrinas vėlyvosios rykštenės (S. gigantea Ait.) lapų metanoliname ekstrakte. Troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia buvo atitinkamai lygi 253,19 ± 123,71 ir 334,89 ± 180,55 µmol/g. Didţiausiu suminiu antioksidantiniu aktyvumu pasiţymėjo vėlyvosios rykštenės (Solidago gigantea Ait.) lapų ir ţiedų metanoliniai ekstraktai, kurių TEAC sumos atitinkamai buvo lygios 660,11 ± 279,36 ir 327,35 ± 104,03µmol/g. Buvo įvertintas duomenų statistinis reikšmingumas.
SUMMARY
J. Mačinskas master thesis “High pressure liquid chromatography – cupric ion reducing antioxidant capacity assay on Goldenrod (Solidago L.) type plants”/ scientific manager prof. dr.L. Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and ToxicologicalChemistry. - Kaunas.
Keywords: Goldenrod,Solidago L., high-performance liquid chromatography - post column reactions, CUPRAC, antioxidants.
The aim of the study: to optimise HPLC- cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC) assay with post-column detectionand evaluate antioxidant activity in leaves and flowers of Solidago L. type plants.
Materials and methods: leaves and flowers of Solidago canadensis L., Solidago gigantean Ait. and Solidago virgaurea L. were collected in different places of Lithuania and dried at 25 °C. 0.1 g of air-dried S. canadensis, S. gigantea and S. virgaurea leafs and flowers were extracted with 10 mL of methanol water mixture (70:30 v/v) by ultra-sonication at 25 °C for 50 min. The prepared extracts were passed through a 0.22 µm filter. Chromatographic fractionation of active agents was carried out with 150x4,6 mm, 3 µm YMC column (injection volume – 10 µL, elution flow rate – 1.0 mL/min). The mobile phase of gradient elution system consisted of 0.05% aqueous trifluoroacetic acid and acetonitrile, the flow rate of CUPRAC solution – 0,4 ml/min.
Objective: to collect and analyze literature data, to optimise and validate HPLC-CUPRAC assay with post-column detection on methanolic extracts of Goldenrod (Solidago L.) type plants, analyzing the coil length, temperature and reagent flow rate impact on antioxidant activity, to evaluate antioxidant activity of Goldenrod (Solidago L.) type plants methanol extracts using optimized test methodology.
Results: the best results of Solidago L. herbal extracts’ antioxidant activity were achieved while using 10 m length PEEK coil (OD 1.58 mm, ID 0.25 mm) with 50oC temperature maintained (the flow rate of CUPRAC solution was 0.4 ml/min, absorption was measured at 450 nm). Antioxidant activity was expressed as Trolox equivalent (TEAC). The strongest antioxidant properties were shownby leaves and flowers of S.gigantea Ait. The largest TEAC of chlorogenic acid (253,19 ± 123,71µmol/g) and quercitrin (334,89 ± 180,55 µmol/g)were observed in leaves of S. gigantea Ait. The total antioxidant reducing activity of tested compounds in flowers and leaves of Solidago L. was evaluated as well. The strongest antioxidant properties were shown in leaves (660,11 ± 279,36µmol/g) and flowers (327,35 ± 104,03µmol/g) of S.gigantea Ait.The statistical significance of the data was evaluated.
1. SANTRUMPOS
ABTS - 2,2'-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (angl. 2,2'- azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid));
CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant capacity);
DMD - diodų matricos detektorius (angl. Diode array detector); DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas;
ESC - efektyvioji skysčių chromatografija;
FRAP – geleţies redukcijos antioksidantinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power); LoD - aptikimo riba (angl. Limit of detection);
LoQ - nustatymo riba (angl. Limit of quantitation); PEEK - polietereterketonas (angl. Polyetheretherketone); R2 – determinacijos koeficientas;
RNS - reaktyvios azoto formos (angl. Reactive nitrogen species); ROS - reaktyvios deguonies formos (angl. Reactive oxygen species);
S/N - signalo ir bazinės linijos triukšmo santykis (angl. Signal to noise ratio); SSN – santykinis standartinis nuokrypis;
TEAC – trolokso ekvivalento antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant capacity).
2. ĮVADAS
Pastaruoju metu vis daugiau dėmesio yra skiriama natūraliems antioksidantams ir jų naudai sveikatai. Augalai yra potencialūs natūralių antioksidantų – polifenolinių junginių šaltiniai. [1]Nepaisant didelio polifenolinių junginių paplitimo augaliniame pasaulyje, susidomėjimas polifenolinių junginių nauda sveikatai išaugo palyginus nesenai. Mokslininkai ir maisto produktų gamintojai susidomėjo polifenoliniais junginiais dėl jų antioksidantinių savybių ir naudos sveikatai, siekiant išvengti su oksidaciniu stresu susijusių ligų. [2]
Šio tyrimo metu buvo siekiama ištirti rykštenės genties augalų (Solidago L.) kaupiamų polifenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą.
Rykšenės (Solidago L.) genties augalai – astrinių šiemos (Asteraceae) daugiamečiai ţoliniai augalai su vienmečiais antţeminiais ūgliais. Šiai genčiai priklauso apie 120 rūšių augalų.[3] Lietuvoje savaime auga paprastoji rykštenė (S.Virgaurea L.) ir trys svetimţemės rūšys: aukštoji (S. altissima L.), kanadinė (S. canadensis L.) ir vėlyvoji (S.gigantea Ait.) rykštenės. Rykštenės genties augalai paplitę Vilniaus, Kauno, Tauragės, Rokiškio, Trakų, Pagėgių, Šakių rajonuose, Vilniaus ir Kauno mieste.[4]
Farmakologinį rykštenės preparatų aktyvumą daugiausiai lemia jos sudėtyje esantys fenoliniai junginiai. [5] Mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad Solidago L. augalų ekstraktai pasiţymi antimutageniniu, bakteriostatiniu, analgetiniu, antioksidantiniu, spazmolitiniu, sedaciniu aktyvumu. [6][7] Liaudies medicinoje rykštenės augalų preparatai yra vartojami simptominiui apatinių šlapimo takų uţdegimo gydymui, diurezės skatinimui, inkstų akmenligės prevencijai. [8] Šiuolaikinėje medicinoje rykštenės ţaliava įeina į vaistinių preparatų, maisto papildų ir arbatų mišinių sudėtį.
Antioksidantams augalinėje ţaliavoje tirti naudojami spektrofotometriniai arba modifikuoti efektyviosios skysčių chromatogafijos (ESC) metodai, kurie šiuo metu populiarėja. [9] Šiuose metoduose apjungiamas ESC skirstymas ir pokolonėlinės reakcijos detekcija. ESC pokolonėliniai metodai įvertina atskirų junginių antioksidantines savybes bei jų indėlį į bendrą kompleksinių mišinių antioksidantinį aktyvumą.[10]
Rykštenės augalinė ţaliava yra potencialus antioksidantų šaltinis, todėl verta tirti šio augalo sudėtyje esančių polifenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą. Optimizuotas ir validuotas ESC pokolonėlinis metodas su vario jonų redukcijos antioksidantinės galios (CUPRAC) reagentu leistų patikimai, tiksliai bei atkartojamai įvertinti antioksidantų sudėtį ir pasiskirstymą rykštenės (Solidago L.) augalinėje ţaliavoje bei šią ţaliavą standartizuoti.
Šis mokslinis darbas finansuotas Lietuvos Mokslo Tarybos (Nr. MIP-50/2013).
Darbo tikslas – optimizuoti ir validuoti rykštenės (Solidago L.) metanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymo, atliekant ESC pokolonėlines reakcijas su CUPRAC reagentu, metodiką ir ištirti ekstraktų antioksidantines savybes.
3. DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:Optimizuoti ir validuoti rykštenės (Solidago L.) metanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo nustatymo, atliekant ESC pokolonėlines reakcijas su CUPRAC reagentu, metodiką ir ištirti ekstraktų antioksidantines savybes.
Darbo uţdaviniai:
1. Susisteminti mokslinės literatūros duomenis apie rykštenės (Solidago L.) genties augalų kaupiamus antioksidantus, jų ekstrakcijos, chromatografinio skirstymo ir antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodus;
2. Optimizuoti rykštenės (Solidago L.) genties augalų metanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimo metodiką, analizuojant kilpos ilgio, temperatūros ir reagento tėkmės greičio įtaką antioksidantiniam aktyvumui, naudojant CUPRAC reagentą;
3. Validuoti optimizuotą rykštenės (Solidago L.) genties augalų metanolinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimo pokolonėlinę metodiką;
4. Pagal pagrįstą metodiką įvertinti rykštenės (Solidago L.) genties augalų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
4. LITERATŪROS APŢVALGA
4.1. Rykštenės augalų apibūdinimas, biologinės savybės ir cheminė sudėtis
Karalystė: Augalai (Plantea)
Skyrius: Magnolijūnai (Magnoliophyta) Klasė: Magnolijainiai (Magnoliopsida) Poklasis: Astraţiedţiai (Asteridae) Šeima: Astriniai (Asteraceae) Gentis: Rykštenė (SolidagoL.)
4.1.1. Rykštenės genties augalų morfologija ir paplitimas
Rykštenės (Solidago L.) genties augalai – astrinių šiemos (Asteraceae) daugiamečiai ţoliniai augalai su vienmečiais antţeminiais ūgliais. Šiai genčiai priklauso apie 120 rūšių augalų.[3]
Paprastoji rykštenė (Solidago virgaureae L.) yra rykštenės (Solidago L.) genties augalas, turintis cilindrišką ruoţuotą stiebą, kurio apatinė dalis daţnai būna rausvai violetinė, lygi arba plaukuota su trumpais lenktais plaukelias. Apatiniai bazaliniai lapai yra atvirkščiai kiaušiniški, pjūkliškai dantytu kraštu, siaurėjantys į ilgą, sparnuotą lapkotį. Stiebiniai lapai yra pakaitiniai, maţesni uţ bazalinius lapus, labiau elipsiški, šiek tiek dantytu kraštu ir trumpu lapkočiu. Abu lapo paviršiai lygūs arba su šiek tiek plaukuota lapo apatine puse ties gyslomis, ţiedynas šluotelė.[11]
Kanadinės rykštenės (S. canadensis L.) ir vėlyvosios rykštenės (S.gigantea Ait.) stiebai yra ţalsvai geltoni arba ţalsvai rudos spalvos su mėlynu arba violetiniu atspalviu ir su didesniais ar maţesniais grioveliais.[11][3]Apatinė dalis daţniausiai lygi, viršutinė daugiau arba maţiau plaukuota.[11]Stiebai kieti, su balkšva šerdimi, padengti vaško sluoksniu.[11][3]Vėlyvoji rykštenė uţauga iki 280 cm aukščio.[3]Lapai ţali, lancetiški su dantytu kraštu, 8-12 cm ilgio ir 1-3 cm pločio.[11][3] Lapų gyslotumas plunksniškas, vidurinės gyslos yra ţymiai storesnės nei šoninės.[3] Viršutinis paviršius ţalias, lygus, apatinis pilkšvai ţalias, plaukuotas, ypač ties gyslomis. Ţiedynai sudaryti iš keleto vienšalių, išlenktų graiţų, kurie tarpusavyje suformuoja piramidines šluoteles stiebų viršūnėse. Kiekvienas graiţas turi skraistę, sudarytą iš linijiškai lancetiškų, geltonai ţalios spalvos paţiedţių, kurie viena eile supa panašaus ilgio geltonus lieţuviškus ţiedus. Vamzdiški ţiedai yra geltoni, radiališkai išsidėstę ţiedo viduryje, tokio paties ilgio, ar kiek ilgesni nei lieţuviški ţiedai. Smulkinta ţaliava yra pilkai ţalios spalvos milteliai. Vaistinei ţaliavai naudojama vientisa arba smulkinta, išdţiovinta antţeminė augalo dalis, surinkta ţydėjimo metu. [11]
Vėlyvoji rykštenė (S.gigantea Ait.) (1 pav.) lengvai atskiriama nuo giminingos kanadinės rykštenės (S. canadensis L.) rūšies. Vėlyvoji rykštenė turi ilgesnes šaknis, rusvai baltus vaisius, lygesnį stiebą bei tankesnius ţiedynus. [3]
1 pav. Vėlyvoji rykštenė (Solidago giganteaAit.)(Šaltinis: http://pt.wikipedia.org)
Lietuvoje savaime auga paprastoji rykštenė (S.Virgaurea L.) ir trys invazinės rūšys: aukštoji (S. altissima L.), kanadinė (S. canadensis L.) ir vėlyvoji (S.gigantea Ait.) rykštenės. Pastarosios trys yra oficialiai pripaţintos invazinėmis rūšimis (Valstybės ţinios, 2012, Nr. 76-3953). Rykštenės genties augalai paplitę Vilniaus, Kauno, Tauragės, Rokiškio, Trakų, Pagėgių, Šakių rajonuose, Vilniaus ir Kauno mieste. Invazinės ryšys auga dirvonuose, pakėlėse, pagrioviuose, durpynų pakraščiuose, kvartalinėse miško linijose.[4] Vėlyvoji rykštenė natūraliai auga Šiaurės Amerikoje, XVIII amţiuje introdukuota Europoje. 1950 metais vėlyvoji rykštenė jau apėmė didelę dalį savo dabartinio pasiskirstymo Europoje. Augalas paplitęs nuo šiaurės Ispanijos iki pietų Skandinavijos, plačiai paplitęs visoje centrinėje Europoje. [3] Šiaurės Amerikoje randama apie 100 skirtingų rykštenės genties augalų rūšių, ir daugiau nei tuzinas rūšių Europoje, Azijoje, Pietų Amerikoje. [12]
4.1.2. Rykštenės genties augalų cheminė sudėtis
Paprastoji rykštenė (S.virgaurea L.) kaupia flavonoidus (1,5%) (kvercetiną, kempferolį ir jų glikozidus, stragaliną ir rutozidą) antocianidinus, triterpeninius saponinus, diterpeninius laktonus, fenolines rūgštis (kofeino rūgštį, chlorogeno ir vanilino rūgštis), maţus kiekius eterinių aliejų (kardinenas, alfa ir beta pinenai, limonenas, mikreną). [8] Augaluose randama saponinų, daugiausia jų kaupia vėlyvoji rykštenė (S. gigantea Ait.) iki 9,4 proc.[13] Šaknyse, kaip ir lapuose, taip pat randama
eterinių aliejų.[14][15] Vėlyvosios rykštenės eteriniame aliejuje buvo identifikuoti 95 komponentai.[12]
Tiriant polifenolinius junginius kanadinės rykštenės ekstraktų sudėtyje efektyviosios skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos būdu, nustatyta, kad augalas kaupia polifenolinius junginius, tokius kaip chlorogeno rūgštis, flavonoidus - kempferolio ir kvercetino glikozidus (nikotifloriną, rutiną, hiperozidą, izokvercitriną, kvercitriną, afzeliną, kvercetiną). [5][16] Kanadinė rykštėnė ţolėje dideliais kiekiais kaupia rutiną, vėlyvoji rykštenė lapuose - chlorogeno rūgštį, kvercitriną. [17][18] Didţiausias kiekis flavonoidų kanadinėje rykštenėje buvo nustatytas ţaliavoje, surinktoje ţydėjimo pradţioje (1,5 %). [18]
4.1.3. Rykštenės genties augalų farmakologinės savybės
Nustatyta, kad Solidago L. augalų ekstraktai pasiţymi antimutageniniu, bakteriostatiniu aktyvumu prieš S. aureus, S.faecalis, Bacillus subtilis, E. coli, Klebsiela pneumoniae, Pseudomonas aeruginosabakterijas.[6] Taip pat augalų ekstraktai pasiţymi analgetiniu, antioksidantiniu, spazmolitiniu, sedaciniu aktyvumu.[7][19]
Keletas neklinikinių tyrimų nustatė S.virgaurea diuretinį, priešuţdegiminį, spazmolitinį, analgetinį, antibakterinį ir antigrybelinį poveikį.[8]
Liaudies medicinoje vartojamų ekstraktų indikacijos: simptominis apatinių šlapimo takų uţdegimo gydymas, diurezės skatinimas, inkstų akmenligės prevencija.[8] Literatūros šaltiniuose paţymima, kad rykštenės genties augalai buvo naudojami esant šlapimo takų ir prostatos nusiskundimams, eterinis aliejus pasiţymi antimikrobinėmis savybėmis. [12]
Farmakologinį aktyvumą daugiausiai lemia preparatų sudėtyje esantys fenoliniai junginiai. [5] Augalo dalyse kaupiami eteriniai aliejai lemia bakteriostatinį, analgetinį aktyvumą. [14][15]
4.2. Antioksidantai, jų poveikis bei įvertinimo metodikos
4.2.1. Bendra apžvalga ir papitimas augaliniame pasaulyje
Antioksidantai – tai medţiagos, kurių molekulės turi gebą stabilizuoti ar neutralizuoti laisvuosius radikalus, prieš jiems atakuojant organizmo ląsteles. [20] Kai kurie antioksidantai, pavyzdţiui, glutationas, ubikvinolis ir kiti, yra gaminami ţmogaus organizme įprasto metabolizmo metu. Kitus antioksidantus ţmogaus organizmas gauna su maistu, o kai kurie iš jų yra būtini ţmogaus
mityboje (vitaminai C, E, β-karotenas). [21] Didelis kiekis antioksidantinėmis savybėmis pasiţyminčių medţiagų natūraliai aptinkamas augaliniuose šaltiniuose.[21] Augaluose antioksidantai yra antriniai metabolitai. [22] Antioksidantai padeda augalams gintis nuo ţalingo ultravioletinių spindulių ar kitų ţalingų veiksnių poveikio. Taip pat kai kurie antioksidantai lemia vaisių ar kitų augalo dalių spalvą, skonį.[2]
Dideli kiekiai antioksidantų aptinkami darţovėse, vaisiuose, medicininiuose augaluose, jų sultyse, ţaliojoje, juodojoje arbatoje, prieskoniniuose augaluose.[21][23] Dideli kiekiai antioksidantų randami raudonajame vyne, jų kiekis priklauso nuo vynuogių rūšies, aplinkos faktorių, vyno gamybos proceso. [22]
4.2.2. Fenoliniai junginiai–kvercetino glikozidai ir chlorogeno rūgštis
Augalų fenoliai yra aromatiniai hidroksilinti junginiai, daţniausiai sutinkami darţovėse, vaisiuose ir kituose augalinės kilmės maisto šaltiniuose. Fenoliniai junginiai sudaro didţiausią grupę antrinių augalų produktų, kurie gaminami aukštesniuose augaluose. Šių junginių struktūroje yra bent vienas aromatinis ţiedas su maţiausiai viena hidroksilo grupe. Jie yra sutinkami daugybėje augalinių vaistinių ţaliavų.[24] Yra ţinoma daugiau nei 8000 natūralių fenolinių junginių. [2]
Fenoliniai junginiai skirstomi į 15 pagrindinių grupių pagal struktūrą. Pagrindinės fenolinių junginių klasės apima fenolius (rezorcinolis), fenolines rūgštis (p-hidroksibenzoinė rūgštis), acetofenonus ir fenilaceto rūgštis, hidroksicinamono rūgštis (kofeino rūgštis), hydroksiantrochinonus, stlibenus (resveratrolis), flavonoidus (kvercetinas), lignanus, biflavonoidus, ligninus ir kt.[24]
Fenolinės rūgštys skirstomos į hidroksibenzoines ir hidroksicinamono rūgštis. Hidroksibenzoinės rūgštys turi C6-C1 struktūrą ir apima galo, p-hidroksibenzoinę, vanilino ir kitas rūgštis. Tuo tarpu hidroksicinamono rūgštys savo struktūroje turi trijų anglies atomų šoninę grandinę (C6-C3). Šiai grupei priskiriamos kofeino, p-kumarino ir kitos fenolinės rūgštys. Fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus ir pozicijos molekulėje. Nustatyta, kad hidroksicinamono rūgštys dėl struktūros ypatybių pasiţymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei hidroksibenzoinės rūgštys. [25][2] Pagrindiniai polifenolinių junginių maistiniai šaltiniai yra vaisiai, gėrimai (vaisių sultys, vynas, arbatos), darţovės. [18]
Chlorogeno rūgštis (2 pav.) yra daţniausiai pasitaikanti hidroksicinamono rūgštis. Kava yra pagrindinis chlorogeno rūgšties šaltinis kasdienėje mityboje. Kiti chlorogeno rūgšties šaltiniai yra obuoliai, kriaušės, įvairios uogos. [26]
2 pav. Chlorogeno rūgštis(Šaltinis: http://www.wikiwand.com/en/Chlorogenic_acid)
Flavonoidai yra pati gausiausia polifenolinių junginių grupė, kurioje yra daugiau nei 4000 įdentifikuotų junginių. Jos struktūrinį pagrindą sudaro C6-C3-C6 flavono skeletas. Flavonoidai pagal struktūrą skirstomi į grupes, atsiţvelgiant į flavono skeleto neprisotinimą ir oksidaciją. Daţnai flavonoidai egzistuoja glikozidų pavidalu, kurių struktūroje prie hidroksilo grupių jungiasi įvairūs cukrai (gliukozė, rutinozė ir kt.). [24][27]
Flavonoidai ţmogaus mityboje dideliais kiekiais randami darţovėse, vaisiuose. [28] Flavonoidai augaluose turi daug biologinių funkcijų. Jie apsaugo nuo ultravioletinės saulės spinduliuotės, įvairių patogenų, veikia kaip signalinės molekulės, dalyvauja auksino transporte, augalų reprodukcinėje sistemoje, suteikia ţiedams spalvą ir taip vilioja apdulkintojus. [29]
Kvercetinas (3 pav.) yra daţniausiai pasitaikantis bioflavonoidas darţovėse ir vaisiuose, ir yra daţniausiai glikozilintas. [28]
3 pav. Kvercetinas ir jo glikozidai
Kvercetino antioksidantinį poveikį lemia orto-dihidroksi struktūra B ţiede, 2,3-dvigubas ryšys su 4-okso funkcija C ţiede, 3,5-hidroksi grupės su 4-okso funkcijomis A ir C ţieduose, 3-hidroksi grupė, kurią glikozilinus prarandama dalis junginio antioksidantinio aktyvumo. [27][2] Taip pat kvercetinas, turėdamas dvi hidroksilo grupes yra pajėgus konjuguoti metalus, apsaugant nuo metalų sukelto laisvų radikalų formavimosi organizme.[2]
4.2.3. Fenolinių junginių - kvercetino glikozidų ir chlorogeno rūgšties bioprieinamumas
Antioksidantų poveikį in vivo stipriai įtakoja antioksidantų bioprieinamumas.[22] Nemaţai fenolinių junginių yra nepasisavinami dėl maţo jų tirpumo, stabilumo. Kai kurie polifenoliai pasisavinami tik dalinės degradacijos ţarnyne metu, kurią vykdo ţarnyno mikroflora. Kai kurie autoriai nurodo, kad tokių flavonoidų, kaip katechinas, kvercetinas ar izoflavonai, bioprieinamumas gali siekti 10-50 proc. [22] Fenolinių junginių pasisavinimą sunkina tai, kad fenoliniai junginiai egzistuoja skirtingose cheminėse formose. Didţioji dalis fenolinių junginių yra glikozilinti ir angliavendenių molekulės daro įtaką šių junginių tirpumui vandenyje ir difuzijai per biologines membranas. [22][27]
Kvercetinas sutinkamas ţmogaus mityboje daugiausia glikozidų formoje, todėl jo absorbcija daugiausia priklauso nuo glikozido pobūdţio.[30] Spėjama, kad kvercetino glikozidai necirkuliuoja ţmogaus kraujyje dideliais kiekiais dėl jų hidrolizės pasisavinimo metu. [31] Kvercetinas į kraują absorbuojamas per plonąjį ţarnyną. Deglikozilinimo procesas gali vykti ţarnyne arba jau patekus kvercetinui į kraują dalyvaujant glutationo S-transferazei. [30]
Nustatyta, kad tik trečdalis chlorogeno rygšties yra absorbuojama į kraujo apytakos sistemą. [26]
4.2.4. Fenolinių junginių - kvercetino glikozidų ir chlorogeno rūgšties poveikis žmogaus organizmui
Yra atlikta daugybė tyrimų, kuriuose įrodytos polifenolinių junginių antioksidantinės, antimikrobinės, antivėţinės savybės. [24] In vitro, in vivo ir epidemiologinių tyrimų metu nustatyta, kad antioksidantai maţina su amţiumi susijusių ligų riziką ir geba padėti išvengti širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių bei onkologinių ligų.[20][2]
Epidemiologinių tyrimu metu buvo pastebėtas “prancūziškas paradoksas”. Nors prancūzų mityba santykinai gausi prisotintų riebalų, tačiau Prancūzijoje yra santykinai maţas sergamumas širdies ir kraujagyslių ligomis. Manoma, kad tai gali lemti didelis raudonojo vyno suvartojimas, kuriame gausu fenolinių junginių. [22] Nustatyta, kad Vidurţemio jūros dieta, kuri gausi vaisių ir darţovių, padeda sumaţinti širdies ir kraujagyslių ligų riziką. Tai aiškinama tuo, kad antioksidantai stabdo maţo tankio lipoproteinų oksidacijos procesą ir taip lėtina aterosklerozės vystymąsi. Taip pat nustatytas antioksidantų poveikis kraujagyslių endoteliui, flavonoidai padeda reguliuoti kraujagyslių toną, maţina trombocitų agregaciją, didina glutationo lygį ląstelėse. [20] Keletas studijų naudojant skirtingus ţiurkių hipertenzijos modelius parodė, kad kvercetinas pasiţymi nuo dozės priklausančiu
antihipertenziniu aktyvumu. Taip pat didelių dozių kvercetino antihipertenzinis poveikis 1 laipsnio hipertenzijos pacientams buvo įrodytas naudojant dvigubai aklą, placebu kontroliuojamą, randomizuotą tyrimą. [32]
Nustatyta, kad natūralių antioksidantų kupina ţmogaus mityba padeda išvengti ar atidėti neurodegeneracinių ligų vystymasį ţmonių ir gyvūnų modeliuose. [28] Įrodyta antioksidantų nauda neurodegeneracinių ligų, tokių kaip Alzheimerio ir Parkinsono ligos, prevencijoje. [20]
Naudojant ląstelių modelius buvo nustatyta, kad flavonoidai (rutinas) gali stabdyti vėţinių ląstelių augimą. Šis aktyvumas pasireiškia keliais molekuliniais mechanizmais. [33]
Nustatyta, kad flavonoidai padeda apsaugoti organizmą nuo kenksmingos hiperglikeminės būklės. Įrodyta flavonoidų nauda 2 tipo cukrinio diabeto ir jo komplikacijų prevencijoje. [20] Naudojant grauţikų modelius su dirbtinai sukeltu viršsvoriu, buvo nustatyta, kad kvercetinas veikdamas adipocituose maţina uţdegimą ir didina jautrumą insulinui. [31]
Antioksidantai taip pat padeda gydyti menopauzės simptomus ir su tuo susijusius patologinius procesus. [20] Taip pat pastebėta potenciali flavonoidų nauda odai vartojant juos išoriškai. Flavonoidai (kvercetinas ir rutinas) įterpti į emulsijas su vandenine faze ir aplikuoti ant odos, jai suteikia apsaugą nuo ultravioletinių spindulių. [34]
4.2.5. Fenolinių junginių - kvercetino glikozidų ir chlorogeno rūgšties ekstrakcija iš augalinės žaliavos
Polifenoliniai junginiai gali būti ekstrahuojami iš švieţios, sušaldytos ar išdţiovintos augalinės ţaliavos. Polifenolinių junginių tirpumas tirpikliuose priklauso nuo cheminės junginių prigimties, tirpiklio poliškumo.[2]
Polifenolinių junginių ekstrakcijos sąlygos stipriai lemia galutinę ekstrakcijos išeigą. Tyrimų metu nustatyta, kad rykštenės genties augalų ekstraktai, turintys sudėtyje daugiau flavonoidų ir chlorogeno rūgšties, pasiţymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu. [35] Todėl tinkamų ekstrakcijos sąlygų parinkimas tiriant antioksidantines preparatų savybes yra labai svarbus.
Fenolinės rūgštys ir flavonoidų glikozidai pasiţymi hidrofilinėmis savybėmis, todėl gerai ekstrahuojasi hidrofiliniais tirpikliais. [35] Kvercetino glikozidai yra tirpūs vandenyje, todėl lengvai ekstrahuojasi poliniuose tirpikliuose. Tačiau šių junginių tirpumas vandenyje nėra stabilus ir labai priklauso nuo ekstrakcijos temperatūros ir trukmės. [5] Ilga ekstrakcija ir aukšta temperatūra padidina fenolinių junginių oksidacijos tikimybę, kas gali lemti maţesnę ekstrakcijos išeigą. [2]
Nustatyta, kad metanolis yra efektyvus ekstrahentas maţesnės molekulinės masės polifenoliams ekstrahuoti. [2] Taip pat 70 proc. ir didesnės koncentracijos metanolis leidţia inaktyvuoti polifenolių oksidazes, kurios yra plačiai paplitusios augaluose.[36]
Polifenolinių junginių ekstrakcijai gali būti pritaikomas ultragarsas. Šis metodas paremtas tuo, kad akustinės bangos sukelia maţų burbuliukų susidarymą, kurie sprogdami ţaloja ląstelių sieneles ir didina jos pralaiduma ekstrakcinėms medţiagoms, taip didindami ekstrakcijos išeigą. Nustatyta, kad šis metodas sukelia maţesnę fenolinių junginių degradaciją nei naudojant kietos-skystos fazės, mikrobangų ar subkritinio skysčio ekstrakciją. Ekstrakcija ultragarsu yra labai naudinga, nes nereikalauja brangių instrumentų, yra efektyvi. [37] Tokie ekstrakcijos metodai, kaip soksleto ekstrakcija ar maceracija, yra maţiau efektyvūs ir neekologiški dėl reikalingo didelio kiekio organinių tirpiklių. [2]
Polifenolinių junginių ekstrakciją iš rykštenės ţolės plačiau tyrinėjo P. Apati, Guo Jie Cui Gui-Youa ir kiti moksilinkai. [38][35] Moksliniais tyrimais nustatyta, kad polifenolinių junginių ekstrakcija iš rykštenės ţolės 70 proc. metanoliu ekstrahuojant ultragarso vonelėje 50 min., 25ºC temperatūroje yra efektyvi šių junginių išskyrimui iš rykštenės augalinės ţaliavos. [17]
4.2.6. Polifenolinių junginių skirstymas efektyviąja skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija yra populiariausias ir patikimiausias metodas fenoliniams junginiams analizuoti, sukurta daugybė tyrimo metodikų.[2] Atvirkštinių fazių chromatografija yra labiausiai tinkama polifenolių skirstymui naudojant efektyviąją skysčių chromatografiją, todėl polifenoliniams junginiams tirti daţniausiai yra naudojama C18 atvirkštinių fazių kolonėlė.[5][2]Polifenolinaims junginiams skirstyti gali būti naudojamos izokratinės ir gradientinės eliuavimo sistemos daţniausiai pritaikant acetonitrilą, metanolį, organinių rūgščių tirpalus. [2] Nustatyta, kad gradientinis polifenolių mišinių skirstymas leidţia gauti gerus junginių skirstymo rezultatus (Rs >1,00, skaičiuojant pagal Snyder metodą). [5] Dėl polifenolinių junginių optinio aktyvumo patogu naudoti ultravioletinių (UV) spindulių ar diodų matricos detektorius (DMD). [2]
Tiriant efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymą polifenoliniams junginiams tirti rykštenės ţolėje, buvo nustatyta, kad atvirkštinių fazių skysčių chromatografija yra patikimas ir atsikartojantis metodas rutiniškai tirti polifenolinius junginius rykštenės ţolės ekstraktuose. Lyginant šį metodą su kapiliarinės elektroforezės metodu, buvo nustatyta, kad efektyvioji skysčių chromatografija yra 10 kartų jautresnė. [16]
4.3. Biologinė oksidacija ir antioksidantinio aktyvumo vertinimo metodai
4.3.1. Laisvųjų radikalų apibrėžimas ir poveikis žmogaus organizmui
Laisvieji radikalai yra labai trumpos gyvavimo trukmės molekulės.[39]Šios molekulės susidaro vykstant normaliems fiziologiniams oksidaciniams procesams ir yra būtinas energijos gamybai ląstelėse, taip pat uţima svarbų vaidmenį perduodant signalus. [39] Tačiau problemos iškyla, kai oksidacijos proceso metu perduodami neporuoti elektronai. To pasekoje susidaro laisvieji radikalai – reaktyvios azoto ir deguonies formos, įskaitaint superoksido (O2·-), peroksilo (ROO·), alkoksilo (RO·), hidroksilo (HO·) ir nitrito oksido (NO·) radikalus. Hidroksilo ir alkoksilo laisvieji radikalai yra labai reaktyvūs ir organizme greitai atakuoja molekules artimose ląstelėse ir sukelia oksidacinę paţaidą. Superoksido anijonas, lipidų hidroperoksidazės, azoto oksido radikalai yra maţiau reaktyvūs. Reaktyvios deguonies formos (ROS) gali būti ne vien radikalai, pavyzdţiui, deguonis, vandenilio peroksidas ir hidrochlorido rūgštis (HOCl). [40]
Ţmogaus organizme yra antioksidantinės sistemos, kurios atiduoda elektronus ir apsaugo nuo laisvųjų radikalų paţaidos. Jos gali būti skirstomos į gaminamas organizme (endogenines), ir gaunamas su maistu (egzogenines). Pirmąją sistemą sudaro ţmogaus organizme gaminami fermentai, pavyzdţiui, Se-glutationo peroksidazė, katalazė, superoksido dismutazė, lipidų peroksidazės, taip pat ir ne fermentai, kaip glutationas, melatoninas, plazmos proteinų tioliai.[40][39]
Esant fiziopatologinėms situacijoms (rūkymas, tarša, UV radiacija, uţdegimas ir t.t.) endogeninės antioksidantinės sistemos nepakanka, todėl siekiant išvengti oksidacinės paţaidos reikia organizmui gauti pakankamai egzogeninių antioksidantų. [40]Disbalansas tarp antioksidantinės organizmo sistemos ir padidėjusios laisvųjų radikalų produkcijos skatina senėjimo procesus ir yra susijęs su įvariomis ţmogaus ligomis, tokiomis kaip aterosklerozė, hipertenzija, opinis kolitas, onkologinės, neurodegeneracinės (Parkinsono, Alzheimerio) ligos.[28][40][39][41]
4.3.2. Polifenolinių junginių antioksidantinis vertinimas
Antioksidantinio aktyvumo tyrimai gali būti klasifikuojami į elektronų perdavimo reakcijomis (EP) arba vandenilio atomo perdavimo (VAP) reakcijomis paremtus metodus. [24] VAP reakcijos paremtos laisvųjų radikalų neutralizavimu atiduodant vandenilio atomą. [2] EP reakcijos paremtos redokso reakcija tarp antioksidanto ir reagento, kuris yra oksidantas ir reakcijos metu keičia spalvą. [2] Reakcijų metu galutinis rezultatas vienodas (neutralizuoti ROS/RNS laisvieji radikalai), tačiau skiriasi reakcijos kinetika ir potencialios šalutinės reakcijos. VAP ir EP reakcijos daţnai vyksta vienu metu ir
dominuojantis mechanizmas priklauso nuo antioksidanto struktūros ir jo savybių (tirpumo, pasiskirstymo koeficiento) bei terpės (tirpiklio tipo, pH). Antioksidantai prieš įvairius prooksidantus elgiasi skirtingai, todėl nėra vieno universalaus metodo galinčio tiksliai įvertinti tiriamajame bandinyje esančių junginių suminį antioksidantinį poveikį prieš visus in vivo aptinkamus prooksidantus, atspindėti antioksidantų tarpusavio sąveikas ar jų elgesį kompleksinėse antioksidantinėse sistemose.[10]
Antioksidantams augalinėje ţaliavoje tirti naudojami spektrofotometriniai arba modifikuoti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodai, kurie šiuo metu sparčiai populiarėja. [9]Daţniausiai naudojami EP reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai. [10]EP reakcijomis paremti antiradikalinio aktyvumo nustatymo metodai apima ABTS, CUPRAC, DPPH, FRAP metodus, kurie naudoja skirtingus chromogeninius redokso reakcijos reagentus su skirtingais standartiniais redokso potencialais.[24]
FRAP metodas. Geleţies redukcijos antioksidantinė galia (angl.Ferric reducing-antioxidant power). Šis tyrimo metodas paremtas antioksidantų gebos redukuoti geleţies joną nustatymu. Tyrimo metu vyksta geleţies ir 2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniacyklopenta-1,4-dieno chlorido (TPTZ) komplekso redukcija rūgštinėje terpėje. Reakcijos rezultatai fiksuojami matuojant šviesos absorbcijos pokyti 593 nm šviesos bangos ilgyje. [41]
DPPH radikalų surišimo metodas. Šis metodas paremtas DPPH reagento (1,1-difenil-2-pikrilhidrazilo), kuris yra stabilus laisvasis radikalas, reakcija su antioksidantu. Reakcijos metu vykstantys elektronų mainai sukelia reagento struktūros pokyčius. [41]Violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami antiradikaliniu aktyvumu pasiţyminčių junginių į blankiai geltoną hidraziną. DPPH radikalų surišimo galia organinėje terpėje vertinama matuojant absorbcijos sumaţėjimą prie fiksuoto bangos ilgio (515-528 nm intervale), kai absorbcija tampa stabili arba fiksuojant elektronų sukinio rezonansą. [10] Šis metodas skirtas vertinti tik organiniuose tirpikliuose (ypač alkoholiuose) tirpių antioksidantų antiradikalinį aktyvumą. [24]
ABTS metodas. Šis antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodas paremtas spalvos išblukimo matavimu reakcijos metu tarp antioksidanto ir ţalsvai melsvo ABTS (2,2-azino-bis(3-etilbenztiazolino-6-sulfonio rūkšties) radikalo. Antioksidantas redukuoja reagentą, ko pasekoje išnyksta reagento spalva. ABTS reagentas yra stabilus radikalas, kuris gali būti paruošiamas keliais skirtingais būdais. [41]
CUPRAC metodas. Vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant capacity).Šis metodas pagrįstas vario-neokuproino komplekso (II) redukcija į vienvalentę formą. Metodas yra gana naujas, pirmą kartą paskelbtas turkų mokslininkų K. Güçlü, M. Altun, M. Özyürek, S. E. Karademir, R. Apak. [24]Vykstant CUPRAC redokso reakcijai polifenoliniai antioksidantai verčiami į juos atitinkančius chinolonus. Tuo tarpu Cu(II)-neokuproino reagentas, kaip
oksidantas, virsta Cu(I)-neokuproino chromogenu, kuris absorbuoja 450 nm šviesos bangos ilgio elektromagnetinę spinduliuotę.[42]CUPRAC metodas atliekamas neutralioje terpėje, yra tinkamas hidrofiliniams ir lipofiliniams antioksidantams, daţniausiai pasitaikantiems flavonoidams vertinti.[24]CUPRAC reagentas yra stabilus, tinkamas tirti tiolio tipo antioksidantus (skirtingai nei FRAP metodas), selektyvus, nes turi nedidelį redokso potencialą, todėl paprasti cukrūs ar citrinos rūgštis, kurie nėra tikri antioksidantai, nereaguoja su šiuo reagentu. Metodo trūkumas yra tai, kad CUPRAC reagentas nereaguoja su izoliuotomis angliavandenilių dvigubomis jungtimis. [43]
Paprasti antioksidantiniai testai naudojant spektrofotometrą tinka tik bendram ekstrakto antioksidantiniam aktyvumui nustatyti. Tokie testai neleidţia identifikuoti atskirų ekstrakto junginių tapatybės ir indėlio bendram ekstrakto antioksidantiniam aktyvumui. Todėl nuo 1996 metų buvo pradėti vystyti ir taikyti modifikuoti DPPH, ABTS antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai vienoje sistemoje su efektyviąja skysčių chromatografija, kuri leidţia išskirstyti individualius antioksidantus prieš jų reakciją su reagentu. [9] Tai leidţia įdentifikuoti ir kiekybiškai įvertinti antioksidantus, bei jų indėlį bendram ekstrakto antioksidantiniui aktyvumui.[44]Šiuo metu šiuos metodus naudoja ir vysto įvairios mokslininkų grupės. [9]
Modifikuotas ESC-CUPRAC (4 pav.) antiradikalinio aktyvumo nustatymo metodas yra greitas, nebrangus, universalus, naudoja stabilų reagentą, kuris nėra jautrus orui, saulės poveikiui, tirpiklio rūšiai. [45] Šį metodą savo tyrimuose sėkmingai pritaikė S. Çelik, M.Özyürek, L. Yildiz ir kiti mokslininkai tirdami augalinius ekstraktus. [45][36][46] Buvo nustatyta, kad tyrimo rezultatus gali lemti reagento tėkmės greitis, koncentracija, temperatūra, prie kurios vyksta reakcija, reakcijos laikas. [47][48] Reakcijos laikas priklauso nuo reagento tėkmės greičio ir reakcijos kolonėlės tūrio. [48] Modifikuotas ESC-CUPRAC metodas yra santykinai greitas. Nustatyta, kad visi antioksidantai pasiekia apie 80% viso antioksidantinio aktyvumo per maţiau nei 1 minutę reakcijos kilpoje. Tai leidţia atlikti tikslius antioksidantinio aktyvumo skaičiavimus reakcijai pasibaigus. [46]
Paprastai visi antioksidantinio aktyvumo tyrimai lygina tiriamųjų junginių antioksidantinį aktyvumą su gerai ţinomų antioksidantų (trolokso, vitamino C) antiradikaliniu aktyvumu. Daţniausiai antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas troloksui ekvivalentiškos antioksidantinės galios (TEAC) vienetais. [41]
Rykštenės ekstraktų antioksidantines savybes tyrė P. Apati, M.Marksa ir kiti mokslininkai. P.Apati nustatė, kad metanoliniai kanadinės rykštenės (S. canadensis L.) ţolės ekstraktai DPPH tyrimo metu pasiţymi reikšmingomis antioksidantinėmis savybėmis atiduodant vandenilio atomus. Taip pat buvo nustatytas ir įvertintas etanolinių ekstraktų aktyvumas apsaugant lipidines membranas nuo peroksidacijos bei flavanoidų glikozidų aktyvumas indukuojant glutationo S-transferazę, kurios aktyvumas daro įtaką fermentinei antioksidantinei sistemai ţmogaus organizme. Antioksidantinių kanadinės rykštenės tyrimų metu buvo nustatyta, kad vandenilio donorinės ir redukcinė jėgos daugiausia koreliuoja su chlorogeno rūgšties koncentracija preparate, kai tuo tarpu chelatinė ir superoksidus sujungiančios savybės koreliuoja su rutino kiekiu preparate. [16] Tuo tarpu M.Marksa tiriant rykštenės metanolinių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą optimizavo ESC-ABTS ir ESC-DPPH metodikas.[49]
5.
TYRIMŲ OBJEKTAS IR METODAI
5.1. Tyrimų objektas
Rykštenės (Solidago L.) genties augalų lapai ir ţiedai. Tyrimams naudota paprastosios rykštenės (S. virgaurea L.), kanadinės rykštenės (S. canadensis L.) ir vėlyvosios rykštenės (S.gigantea Ait.) lapai ir ţiedai, surinkti natūraliose augimvietėse Vilniaus mieste ir Vilniaus rajone (Santariškių, Riešės, Trakų Vokės, Nemenčinės teritorijose), ţydėjimo pradţioje. Ţaliava buvo išdţiovinta šildomoje dţiovykloje 25°C temperatūroje ir saugoma tamsioje, sausoje, vėsioje, gerai vėdinamoje patalpoje.
5.2. Medţiagos ir reagentai
Naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai yra analitinio švarumo. Chromatografinėje analizėje mobiliai fazei sudaryti buvo naudotas acetonitrilas (ACN) ir 99% švarumo trifluoracto rūgštis (TFA) (Buchs, Šveicarija). Išgrynintas vanduo (18.2 mΩcm-1) buvo ruošiamas naudojant vandens valymo sistemą „Millipore“ (Bedford, JAV). Taip pat buvo naudotas chemiškai išvalytas 99.9% metanolis (Roth, Vokietija) ir 96,3% etanolis (Stumbras, Lietuva). Buvo naudoti šie referentiniai standartai: troloksas (98%), įsigytas iš „FlukaChemika“ (Buchs, Šveicarija), chlorogeno rūgštis (95,33%), hiperozidas (93,51%), izokvercitrinas (94,16%), rutintrihidratas (97,11%), įsigyti iš „HWI AnalytikGMBH“, kvercitrinas (98,5%), įsigytas iš „Extrasynthese“ (Prancūzija). Šių medţiagų tirpalai buvo ruošiami naudojant 70% etanolį. CUPRAC reagentui sudaryti buvo naudojamas vario (II) chlorido dihidratas, gautas iš „Alfa Aesar GmbH & Co KG“ (Karlsruhe, Vokietija), neokuproinas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija). Buferinei sistemai sudaryti buvo naudojamas amonio acetatas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich“ (Belgija).
5.3. Naudota aparatūra
Ekstrakcija atlikta naudojant ultragarso vonelę BioSonic UC100 (New Jersey, JAV).Ekstraktų filtravimui buvo naudoti 0,22 µm nailono mikrofiltrai (diametras - 13mm, įsigyti iš „Carl Roth GmbH & Co. KG“ (Vokietija).
Rykštenės (Solidago L.) genties augalų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimo metodika buvo optimizuota ir validuota, analizuojant kilpos ilgio, temperatūros ir reagento tėkmės greičio įtaką antioksidantiniam aktyvumui, naudojant chromatografą Waters 2690/5 (Waters Corporation, Milford,
JAV) su YMC-Pack ODS-A (150x4,6 mm I.D; S-3µm) kolonėle (YMC Europe Gmbh, Vokietija), Gilson 805 degazatoriumi, Waters temperatūriniu moduliu (Waters Corporation, Milford, JAV). Junginių įdentifikavimui buvo naudotas diodų matricos detektorius Waters 996 PDA (Waters Corporation, Milford, JAV) (210,0-400,0 nm). CUPRAC reagentas į sistemą buvo tiekiamas naudojant Gilson 305 pompą (Midleton, JAV). Reakcija vyko polietereterketono (PEEK) (išorinis skersmuo- 1,58 mm; vidinis skersmuo - 0,25 mm) 3, 5 ir 10 metrų ilgio reakcijos kilpose, naudojant termostatą Waters PCR module (Milford, JAV). Pokolonėlinės reakcijos UV detektorius – Waters 2487 UV/VIS (Waters Corporation, Milford, JAV). pH rodiklis gaminant buferinį amonio acetato tirpalą buvo išmatuotas pH–metru „Knick“ (Vokietija).
5.4. Tyrimo metodika
5.4.1. Rykštenės genties augalų lapų ir žiedų ekstraktų paruošimas
Buvo nustatytas visų surinktų ir paruoštų ekstraktų gamybai ţaliavų likutinis drėgmės kiekis. Po to buvo gaminami smulkintos ir dţiovintos ţaliavos 1:100 metanoliniai ekstraktai. Atsveriama 0,1 g (tiksli masė) smulkintos ţaliavos, uţpilama 10 ml 70 proc. vandeniniu metanolio tirpalu ir ekstrahuojama 50 minučių ultragarso vonelėje BioSonic UC100 (Mavay, JAV), 25ºC temperatūroje. Gauti lapų ir ţiedų ekstraktai buvo filtruojami pro popierinį filtrą į 25 ml kolbutes ir siekiant didesnio švarumo perfiltruojami švirkštiniais mikrofiltrais.
5.4.2. Standartinių tirpalų bei reagento gamyba
CUPRAC reagento gamyba. Reagentas buvo gaunamas sumaišius 1,0-2 M CuCl2x2H2O
druskos, 7,5x10-3 M neokuproino ir acetaninio buferio, kurio pH=7, tirpalus santykiu 1:1:1. Sumaišytas tirpalas buvo saugomas nuo šviesos poveikio. CuCl2 tirpalas buvo gaminamas 0,17 g
CuCl2x2H2O druskos tirpinant išgrynintame vandenyje ir skiedţiant matavimo kolboje iki 100 ml.
Neokuproino tirpalas buvo gaminamas tipinant 0,1566 g neokuproino 95 proc. etanolyje ir skiedţiant matavimo kolboje išgrynintu vandeniu iki 100 ml. Acetatinio buferio vandenilio jonų rodiklis yra 7 tada, kai amonio acetato koncentracija yra 10-2 M. Gaminant acetatinį buferį buvo atsverta 0,077 g amonio acetato, tirpinama vandenyje ir praskiesta vandeniu matavimo kolboje iki 1000 ml. Buferio vandenilio jonų rodiklis buvo patikrintas pH-metru (pH 7).
Standartinių antioksidantų tirpalų gamyba. Standartinis antioksidantų tirpalas buvo ruošiamas tirpinant chlorogeno rūgštį, rutiną, hiperozidą, izokvercitriną ir kvercitriną 70% etanolyje.
Trolokso tirpalas buvo ruošiamas troloksą tirpinant taip pat 70% etanolyje. Sudarant trolokso kalibracijos kreivę buvo ruošiami skirtingų koncentracijų trolokso tirpalai nuo 0,00118 iki 0,605 mg/ml.
5.4.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos
Polifenolinių junginių chromatografiniui skirstymui rykštenės augalinėje ţaliavoje buvo naudojama M.Marksos ir kt. optimizuota ir validuota ESC skirstymo metodika.[49]
Junginių skirstymas buvo atliekamas naudojant ankstesnėje dalyje nurodytą aparatūrą. Injekcijos tūris - 10µl, mobilios fazės greitis – 1,0ml/min. Kolonėlė buvo laikoma termostate, kuris tyrimo metu palaikė pastovią 25ºC temperatūrą. Tyrimo metu buvo naudota mobilios fazės gradientinė sistema, sudaryta iš 0,05% trifluoracto rūgšties tirpalo vandenyje ir acetonitrilo. Mobilios fazės sudėtis skirtingais laiko intervalais nurodyta 1 lentelėje. Junginių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laikų bei UV absorbcijos spektrų 210 – 400 nm intervalo ribose sutapimus. Identifikavimui buvo naudojamas diodų matricos detektorius (DMD).
1 lentelė. ESC mobilios fazės gradientinės sistemos sudėtis
Laikas (min) Tėkmės greitis
(ml/min) Komponentų koncentracija (%) Trifluoracto rūgštis (0,05%) Acetonitrilas 0 1 95 5 5 1 88 12 50 1 70 30 51 1 10 90 56 1 10 90 57 1 95 5
5.4.4. Pokolonėlinis antioksidantinio aktyvumo tyrimas naudojant CUPRAC reagentą
Efektyviosios skysčių chromatografijos būdu išskirstyti junginiai toliau dalyvavo pokolonėlinėje reakcijoje. Prie sistemos buvo prijungta Gilson 305 pompa, kuri į sistemą tiekė CUPRAC reagentą 0,4 ml/min greičiu. Reagentui trišakyje susimaišius su iš chromatografavimo kolonėlės ištekėjusia mobilia faze, mišinys buvo leidţiamas per PEEK reakcijos kilpą, kurioje vyko
pokolonėlinė reakcija. Siekiant reguliuoti reakcijos temperatūrą kolonėlė buvo įdėta į termostatą Waters PCR module. Reakcijos rezultatams nustatyti buvo naudojamas UV detektorius – Waters 2487 UV/VIS, kuris reakcijos rezultatus matavo 450 nm šviesos bangos ilgyje.
5.4.5. Antioksidantinio tyrimo metodikos validacija
Metodo tinkamumas vertinamas pagal pagrindinius specifinius reikalavimus, pritaikytus numatytam metodui:
1. Rezultatų glaudumas (atkartojamumas, tarpinis preciziškumas); 2. Aptikimo (LoD) ir nustatymo ribos (LoQ);
3. Tiesiškumas.
5.4.6. Tyrimų duomenų statistinis įvertinimas.
Eksperimentiniai duomenys apdoroti naudojant statistinius duomenų analizės paketus SPSS 20.0 (SPSS Inc., JAV) ir Microsoft Office Excel (Microsoft, JAV). Visi eksperimentai buvo kartoti tris kartus ir duomenys išreikšti vidurkiais ± standartinė paklaida. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirstinių buvo nustatyti naudojant kelių nepriklausomų imčių vidurkių palyginimo dispersinės analizės (angl. One-Way ANOVA) testus. Statistiškai reikšmingi skirtumai tarp skirstinių buvo nustatyti pagal Tukey kriterijų. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05.
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Pokolonėlinės reakcijos su CUPRAC reagentu metodo optimizavimas
Optimizuojant pokolonėlinės reakcijos su CUPRAC reagentu tyrimo metodiką buvo analizuojama kilpos ilgio, temperatūros ir CUPRACreagento tėkmės greičio įtaka antioksidantinio aktyvumo nustatymui rykštenės preparatuose. Metodika buvo optimizuojama atsišvelgiant į signalo ir bazinės linijos triukšmo santykį (S/N).
Pirmiausia buvo optimizuojama reakcijos kilpos ilgio ir temperatūros įtaka standartinių antoksidantų S/N santykiui. Literatūros šaltiniuoe nurodoma, kad šie parametrai yra svarbūs reakcijos rezultatams, reakcijos kilpos parametrai gali įtakoti chromatogramų smailių aukščius ir bazinės linijos triukšmą. Tuo tarpu temperatūra turi įtakos reakcijos kinetikai, gali keisti reakcijų mechanizmą.[49] ESC junginių skirstymas vyko pagal anksčiau nurodytas sąlygas. CUPRAC reagento tėkmės greitis buvo pasirinktas 0,5 ml/min, kuris buvo nurodytas kaip geriausias R. Raudonio ir kt. apţvalginiame straipsnyje. [44] CUPRAC reagento tirpalo absorbcijos pokytis įvykus reakcijai su antioksidantu buvo matuojamas esant 450 nm šviesos bangos ilgiui. Buvo tiriamos trijų skirtingų ilgių PEEK (išorinis skersmuo - 1.58 mm, vidinis skersmuo - 0.25 mm) kilpos – 3, 5 ir 10 metrų ilgio. Tyrimas buvo atliekamas penkiuose skirtinguose temperatūriniuose reţimuose - 25, 35, 45, 50 ir 55ºC.
Ištyrus kilpos ilgio ir temperatūros įtaką chlorogeno rūkšties signalo ir bazinės linijos triukšmo santykiui (S/N), nustatyta, kad geriausias statistiškai reikšmingas (p<0,05) S/N santykis gaunamas naudojant 10 metrų PEEK kilpą 50ºC temperatūroje (5 pav).
5 pav. Chlorogeno rūgšties S/N priklausomybė nuo kilpos ilgio ir temperatūros
Naudojant 10 metrų ilgio kilpą ir 50ºC temperatūrą, rutino S/N santykis (6 pav.) yra statistiškai reikšmingai (p<0,05) didţiausias, nei naudojant kitas tyrimo sąlygas. Temperatūros maţinimas reikšmingai maţina S/N reikšmę visose tirtose kilpose.
0 10 20 30 40 25 35 45 50 55 S/N s an tyki s Temperatūra, ºC 3 metrai 5 metrai 10 metrų
6 pav. Rutino S/N priklausomybė nuo kilpos ilgio ir temperatūros
Tuo tarpu hiperozido S/N santykiui būdingos panašios priklausomybės nuo kilpos ilgio ir temperatūros tendencijos (7 pav.). Didţiausa S/N reikšmė gaunama naudojant 10 metrų ilgio reakcijos kilpą 50ºC temperatūroje. Temperatūros didinimas ir maţinimas statistiškai reikšmingai (p<0,05) maţina S/N santykį visose tirtose kilpose. Ir rutino ir hiperozido atveju 10 metrų kilpos naudojimas leidţia gauti reikšmingai didesnes (p<0,05) S/N reikšmes temperatūrose iki 50ºC, nei naudojant kito ilgio kilpas.
7 pav. Hiperozido S/N priklausomybė nuo kilpos ilgio ir temperatūros
Įvertinus izokvercitrino ir kvercitrino S/N priklausomybę, nustatyta, kad 10 metrų kilpos naudojimas 50ºC temperatūroje leidţia gauti statistiškai reikšmingai (p<0,05) didesnės S/N reikšmes nei naudojant kito ilgio reakcijos kilpas toje pačioje ir kitose temperatūrose. (8 ir 9 pav.)
8 pav. Izokvercitrino S/N priklausomybė nuo kilpos ilgio ir temperatūros
0 10 20 30 40 25 35 45 50 55 S/N s an tyki s Temperatūra, ºC 3 metrai 5 metrai 10 metrų 0 200 400 600 800 25 35 45 50 55 S/N s an tyki s Temperatūra, ºC 3 metrai 5 metrai 10 metrų 0 50 100 150 25 35 45 50 55 S/N s an tyki s Temperatūra, ºC 3 metrai 5 metrai 10 metrų
9 pav. Kvercitrino S/N priklausomybė nuo kilpos ilgio ir temperatūros
Iš gautų duomenų matyti, kad optimaliausias kilpos ilgis yra 10 metrų, o reakcijos temperatūra - 50ºC. 55ºC temperatūros naudojimas sumaţina S/N santykį. Tai gali lemti didelis bazinės linijos triukšmas ir maţesnis atsakas dėl iš dalies suskilusių tiriamųjų medţiagų. Tuo tarpu ţema temperatūra nesukelia didelio atsako dėl lėtos redokso reakcijos kinetikos.[49]Naudojant 3 metrų reakcijos kilpą daţniausiai gaunamos santykinai maţos S/N reiškmės. Tai gali lemti silpnas signalas dėl per trumpo reakcijos laiko ir nespėjusių sureaguoti su reagentu tiriamųjų medţiagų.
Naudojant 10 metrų ilgio PEEK reakcijos kilpą ir 50ºC temperatūrą, buvo tiriama CUPRAC reagento tėkmės greičio įtaka standartinių antioksidantų S/N santykiui. Iš gautų duomenų (10 pav.) nustatyta, kad geriausios tyrimo sąlygos gaunamos reagentą leidţiant 0,4 ml/min greičiu, tačiau visų junginių atveju gauti duomenys statistiškai nereikšmingi (p>0,05).
10 pav. Standartinių antioksidantų S/N priklausomybė nuo reagento tėkmės greičio
Apibendrinant visus gautus duomenis galima teigti, kad geriausi antioksidantinio aktyvumo tyrimo rezultatai gaunami naudojant 10 metrų ilgio PEEK kilpą (išorinis skersmuo- 1.58 mm, vidinis
0 20 40 60 80 25 35 45 50 55 S/N s an tyki s Temperatūra, ºC 3 metrai 5 metrai 10 metrų 0 100 200 300 400 500 600 700 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 S/N s an tyki s
CUPRAC reagento tėkmės greitis, ml/min
Chlorogeno rūgštis Rutinas
Hiperozidas Izokvercitrinas Kvercitrinas
skersmuo- 0.25 mm), termostatuojant 50ºC temperatūroje, o CUPRAC reagentą į sistemą tiekiant 0,4 ml/min greičiu. Tai reiškia, kad taikant šią metodiką galima gauti didţiausią tyrimo tikslumą, maţiausias detekcijos ir kiekybinio nustatymo ribas. Taikant šią metodiką efektyviosios skysčių chromatografijos būdu išskirstyti junginiai pokolonėlinėje reakcijoje gerai sureaguoja su CUPRAC reagentu gaunamos kokybiškos, junginius atitinkančios antioksidantinio aktyvumo tyrimo chromatogramos (11 pav). Antioksidantinio aktyvumo chromatogramos smailės (450 nm) atitinka junginių chromatografinio išskirstymo smailes (360 nm).
Šis tyrimas, kuriame buvo optimizuotas ESC-CUPRAC metodas rykštenės (Solidago L.) genties augalinių ţaliavų antioksidantiniams tyrimams, buvo pristatytas tarptautinėje konferencije „The 5th International Conference on Pharmaceutical Sciences and Pharmacy Practise“ 2014 metų lapkričio 22 dieną Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Farmacijos fakultete (1 priedas).
11pav. Standartinio antioksidantų tirpalo ESC-CUPRAC chromatogramos naudojant
optimalias sąlygas.(1-chlorogeno rūgštis; 2-rutinas; 3-hiperozidas; 4-izokvercitrinas; 5-kvercitrinas)
6.2. Metodikos validacija
Optimizuotas metodas buvo validuotas atsiţvelgiant į pakartojamumo, tarpinio preciziškumo, tiesiškumo kriterijus, taip pat buvo nustatytos aptikimo ir kiekybinio nustatytymo ribos.
6.2.1. Pakartojamumas
Pakartojamumas (angl. Repeatability) išreiškia tyrimo metodikos tikslumą tomis pačiomis veikimo sąlygomis per trumpą laiko tarpą, tyrimą atliekant tą pačią dieną, esant tai pačiai įrangai ir dirbant tam pačiam analitikui. Tinkamumo kriterijus yra variacijos koeficientas, kuris kiekybiniam nustatymui neturėtų viršyti 5%.
Tyrimo metu pakartojamumas buvo vertinamas skaičiuojant sulaikymo laikus ir smailių plotus viena po kitos tiriant 5 vienodas tiriamųjųantioksidantų tirpalųinjekcijas. (12 pav.)
Pakartojamumo santykiniai standartiniai nuokrypiai sulaikymo laikui skiriasi nedaug, tačiau nėra didesni nei 5% (2 lentelė). Daugiausiai varijuoja chlorogeno rūgšties sulaikymo laikas – 0,37%.
Tuo tarpu akartojamumo santykiniai standartiniai nuokrypiai (SSN) smailės plotui yra didesni, tačiau nėra didesni nei 5%. Didţiausias santykinis standartinis nuokrypis smailės plotui nustatytas chlorogeno rūgščiai ir siekia 1,8%.
Apibendrinant gautus rezultatus galima teigti, kad tiriamųjų tirpalų santykinis standartinis nuokrypis sulaikymo trukmei irsmailės plotui neviršija 5 % ribos ir rezultatų atkartojamumas atitinka reikalavimus. Remiantis šiuo kriterijumi, optimizuotas metodas yra tinkamas kiekybiniui antioksidantų vertinimui su CUPRAC reagentu.
2 lentelė. Standartinių antioksidantų atkartojamumo santykiniai standartiniai nuokrypiai
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), %
Sulaikymo laikui Smailės plotui
Chlorogeno rūgštis 0,37 1,8 Rutinas 0,15 1,5 Hiperozidas 0,14 1,7 Izokvercitrinas 0,14 1,8 Kvercitrinas 0,16 1,4 Troloksas 0,13 1,6 6.2.2. Tarpinis preciziškumas
Tarpinis preciziškumas (angl. Intermediate precision) yra variacijos keoficientas, kuris kiekybiniui metodui neturi viršyti 10%. Tarpiniui preciziškumui įvertinti 2 dienas buvo tiriamos standartinių antioksidantų tirpalų vienodos injekcijos, po 5 injekcijas kasdien. Buvo skaičiuojamos SSN reikšmės smailės plotui ir sulaikymo laikui. Gauti rezultatai pateikti 3 lentelėje.
Tarpinio preciziškumo santykinis standartinis nuokrypis tirtų junginių sulaikymo laikui skiriasi nedaug ir neviršija 10%. Labiausiai varijuoja chlorogeno rūgšties sulaikymo laikas – 1,35%, maţiausiai trolokso – 0,14%.
3 lentelė. Standartinių antioksidantų tarpinio preciziškumo SSN reikšmės
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis (SSN), %
Sulaikymo laikui Smailės plotui
Chlorogeno rūgštis 1,35 0,6 Rutinas 0,73 3,5 Hiperozidas 0,73 1,9 Izokvercitrinas 0,69 1,4 Kvercitrinas 0,54 3,1 Troloksas 0,14 2,9
Vertinant tarpinio preciziškumo santykinius standartinius nuokrypius smailės plotui, galima pabrėţti, kad labiausiai varijuoja rutino smailės plotas – 3,5%. Tarpinio preciziškumo SSN reikšmės neviršija 10%, todėl tyrimo metodika atitinka keliamus reikalavumus ir yra tinkama atlikti kiekybinius antioksidantų tyrimus.
6.2.3. Tiesiškumas
Tiesiškumas (angl. Linearity) yra gebėjimas gauti detektoriaus atsako įverčius chromatogramose, kurie tiesiogiai proporcingi analitės kiekinei koncentracijai mėginyje. [50] Tiesiškumas įvertinamas kalibravimo kreivės sudarymo metodu, nustatomas koreliacijos koeficientas R2.
Antioksidantinis aktyvumas buvo išreiškimas troloksui ekvivalentiškuantioksidantiniu aktyvumu (TEAC),µmol/g vienetais, todėl antioksidantų koncentracijos buvo skaičiuojamos pagal trolokso standartinę kalibracijos kreivę. Kreivė buvo sudaryta tiriant skirtingų trolokso koncentracijų smailių plotus. Tiesioginė priklausomybė tarp trolokso kiekio ir smailės ploto buvo nustatyta pagal koreliacijos faktoriaus dydį. Gauta trolokso koreliacijos kreivė buvo išreikšta tokia formule: Y=2,06·107+9,61x104. Koreliacijos faktoriaus dydis R2=0,999. Koreliacijos kreivės tiesiškumo ribos yra 0,00118-0,605 mg/ml.
6.2.4. Aptikimo ir nustatymo ribos
Riba (angl. Range) yra tarpas tarp viršutinės ir apatinės koncentracijos, kuriame yra įrodyta, kad analizės procedūros yra tinkamos naudojimui. Jos reikalingos numatyti analitės koncentracijų tiriamame mėginyje intervalą, tinkamą metodikos taikymui kiekybiniuose tyrimuose.
Aptikimo riba (angl. Detection Limit) yra maţiausias kiekis analitės mėginyje, kurį dar įmanoma aptikti.
Kiekybinio nustatymo riba (angl. Quantitation Limit) yra maţiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai nustatomas tinkamo tikslumo ribose.
Validacijos metu ribos buvo apskaičiuojamos iš chromatoramų signalo ir bazinės linijos triukšmo santykio. Apskaičiuotos ribos nurodytos 4 lentelėje.
4 lentelė. Tirtų antioksidantų nustatytos aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos
Junginys Aptikimo riba (LoD), µg/ml Kiekybinio nustatymo riba (LoQ),
µg/ml Chlorogeno rūgštis 6,95 23,18 Rutinas 0,63 2,04 Hiperozidas 0,034 0,113 Izokvercitrinas 0,217 0,723 Kvercitrinas 0,82 2,73 Troloksas 6,13 18,57
6.3. Antioksidantinio aktyvumo kiekybinis įvertinimas augalinėje ţaliavoje
Tyrimo metu buvo kiekybiškai įvertinti trijų rykštenės rūšių (S.canadensis L., S. virgaurea L., S. gigantea Ait.) lapų ir ţiedų metanoliniuose ekstraktuose esančių veikliųjų junginių, pasiţyminčių antioksidantinėmis savybėmis, antiradikalinis aktyvumas. Tyrimai buvo atlikti su 24 ėminiais (S. canadensis – 6, S. virgaurea – 6, S. gigantea – 12). 12 iš jų buvo lapų preparatai, kiti 12- ţiedų.
Buvo nustatytas augalinės rykštenės ţaliavos likutinis drėgmės kiekis. Europos farmakopėja nurodo, kad likutinis drėgmės kiekis šioje ţaliavoje negali viršyti 10%. Šio testo rezultatai pateikti 5 lentelėje. Nustatyta, kad visos tirtos augalinės ţaliavos atitinka Europos farmakopėjos nuodţiūvio reikalavimus, nuodţiūvis neviršija 10%.
5 lentelė. Rykštenės augalinėje žaliavoje nustatytas likutinis drėgmės kiekis
Ţaliavos numeris
Rūšis Nustatytas likutinis drėgmės kiekis
ţaliavoje, proc. Lapai Ţiedai 1 S. canadensis 9,02 8,17 2 S. canadensis 9,03 8,0 3 S. canadensis 8,96 7,8 4 S. virgaurea 8,9 8,43 5 S. virgaurea 9,44 8,09 6 S. virgaurea 9,5 8,17 7 S. gigantea 8,91 7,69 8 S. gigantea 9,23 7,97 9 S. gigantea 9,15 7,25 10 S. gigantea 8,68 7,72 11 S. gigantea 9,64 7,85 12 S. gigantea 9,02 8,23
Antioksidantiniui aktyvumui vertinti buvo naudojamas trolokso kalibracijos grafikas, sudarytas naudojant vienodas antioksidantinio aktyvumo tyrimo sąlygas. Kiekybiniui antioksidantinio aktyvumo įvertinimui apskaičiuotos troloksui ekvivalentiškos antioksidantinės galios (TEAC) reikšmės. Jos buvo išreikštos µmol/g matavimo vienetais. Tai trolokso tirpalo koncentracija (µmol) turinti ekvivalentišką antiradikalinį aktyvumą kaip ir 1 µmol tiriamo bandinio.
Siekiant tiksliau palyginti skirtingų rykštenės rūšių ir atskirų junginių (chlorogeno rūgšties, rutino, hiperozido, izikvercitrino, kvercitrino) įtakojamą antioksidantinį aktyvumą, buvo sudarytos stulpelinės diagramos.
Kiekybiškai įvertinus atskirų antioksidantų antiradikalinį aktyvumą rykštenės augalų lapų metanoliniuose ekstraktuose, buvo nustatyta, kad didţiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasiţymi chlorogeno rūgštis ir kvercitrinas, esantys vėlyvosios rykštenės (S. gigantea Ait.) lapuose, troloksui ekvivalentiškos antioksidantinės galios buvo lygios atitinkamai 253,19 ± 123,71 ir 334,89±180,55 µmol/g. (13 pav.) Rutino antioksidantinis aktyvumas yra didesnis kanadinėje rykštenės (S. canadensis L.) ir paprasios rykštenės (S. virgaurea L.) lapuose, nei vėlyvosios rykštenės (S.gigantea Ait.) lapuose. Rutino antioksidantinis aktyvumas paprastosios rykštenės lapų ekstrakte yra statistiškai reikšmingai didesnis (p<0,05), nei vėlyvosios rykštenės lapų ekstrakte. Tuo tarpu hiperozido ir izokvercitrino antioksidantinis aktyvumas buvo nedidelis visų tirtų rūšių lapuose ir TEAC reikšmės nesiekė 30 µmol/g. Kvercitrino ir izokvercitrino antioksidantinis aktyvumas vėlyvosios rykštenės lapų ekstraktuose yra statistiškai reikšmingai didesnis (p<0,05), nei kitų rykštenės rūšių lapų ekstraktuose. Tuo tarpu chlorogeno rūgšties antioksidantinis aktyvumas vėlyvosios rykštenės lapuose nėra statistiškai reikšmingai didesnis nei kitų rūšių lapuose (p>0,05). Tai lemia didelės santykinės TEAC reikšmių paklaidos. Kadangi augalai buvo rinkti skirtingose vietovėse, galima manyti, kad didelį standartinį nuokrypį lemia aplinkos faktoriai, tokie kaip dirvoţemis, drėgmės kiekis, saulės apšvietimas ir kt. Lyginant kitų duomenų statistinį reikšmingumą, statistiškai reikšmingo skirtumo nenustatyta (p>0,05).
13 pav. Antioksidantų antiradikalinis aktyvumas skirtingų rykštenės rūšių lapuose,
išreikštas µmol/g
Tiriant antioksidantinį aktyvumą rykštenės preparatų ţieduose, nustatytas maţesnis ţiedų antioksidantinis aktyvumas, lyginant su lapų antioksidantiniu aktyvumu. Stipriausiomis antioksidantinėmis savybėmis ţieduose pasiţymi velyvosios rykštenės sudėtyje esantis kvercitrinas. (14 pav.) Jo troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia siekia 111,3 ± 87,04 µmol/g, tačiau
129,92 97,84 3,5 144,6 129,38 7,42 5,47 253,19 20,95 21,12 29,97 334,89 0 100 200 300 400 500 600 Chlorogeno rūgštis
Rutinas Hiperozidas Izokvercitrinas Kvercitrinas
TE A C , µ m o l/g
