FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MANTAS BELECKAS
ANTIOKSIDACINIAI KANADINĖS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO
CANADENSIS) AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ TYRIMAI NAUDOJANT
ESC-ABTS POKOLONĖLINĮ METODĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas prof. dr. L. Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERISTETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis
ANTIOKSIDACINIAI KANADINĖS RYKŠTENĖS (SOLIDAGO
CANADENSIS) AUGALINIŲ EKSTRAKTŲ TYRIMAI NAUDOJANT ESC-ABTS
POKOLONĖLINĮ METODĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo Vadovas Liudas Ivanauskas Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantas Mantas Beleckas
Data Data
Turinys
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10
1.1. Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis L.) ... 10
1.2. Kanadinės rykštenės veikliosios medţiagos ... 11
1.3. Kanadinės rykštenės panaudojimas medicinoje ... 12
1.4. Solidago canadensis L. kaupiami fenoliniai, bei antioksidaciniu efektyvumu pasiţymintys veiklieji junginiai ... 13
1.5. Antioksidaciniai junginiai aptinkami Solidago L.: chlorogeno rūgštis, rutinas, isokvercitrinas ir hiperozidas ... 14
1.6. Antioksidantai, jų aktyvumas ir veikimo mechanizmas ... 17
1.7. ESC pokolonėliniai metodai taikomi antioksidacinio aktyvumo nustatymui ... 18
1.7.1. ESC-DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos ... 19
1.7.2. ESC-ABTS antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos ... 19
2. TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA ... 21
2.1. Tyrimo objektas ... 21
2.2. ESC-ABTS pokolonėliniui metodui naudojamos medţiagos ir įrengimai ... 22
2.3. Kanadinės rykštenės mėginių paruošimas ir ekstrakcija ... 24
2.4. ABTS darbinio tirpalo ruošimas ... 24
2.6. ESC-ABTS pokolonėlinis antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodas ... 25
2.6.1. Duomenų statistinis įvertinimas ... 26
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27
3.1. ESC-ABTS pokolonėlinės metodikos optimizavimas ... 27
3.2. ESC-ABTS pokolonėlinio metodo validacija ... 28
3.3. 7 Lietuvos regionų Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo palyginimas ... 30
3.4. 24 Lietuvos vietovių Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo palyginimas ... 33
4. IŠVADOS ... 37
SANTRAUKA
M. Belecko magistro baigiamasis darbas „Antioksidaciniai kanadinės rykštenės (Solidago
canadensis) augalinių ekstraktų tyrimai naudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą―/mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.
Raktiniai ţodţiai: Solidago canadensis, kanadinė rykštenė, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), antioksidacinis aktyvumas, ABTS.
Šio magistro baigiamojo darbo tiriamasis objektas Solidago canadensis L. ţiedų metanoliniai (70%) ekstraktai. Rykštenė – daugiametis augalas, priklausantis astrinių (Asteraceae) šeimos augalas. Kanadinės rykštenės pasiţymi diuretiniu, priešuţdegiminiu, antibakteriniu, antioksidaciniu, priešgrybeliniu, priešvėţiniu poveikiu.
Šio darbo tikslas – nustatyti kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedų ekstraktuose esančių veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą efektyviosios skysčių chromatografijos-2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ESC-ABTS) pokolonėliniu metodu.
Buvo paruošti kanadinės rykštenės ţiedų metanoliniai (70%) ekstraktai. Jie buvo analizuojami ESC-ABTS pokolonėliniu metodu. Tyrimo metu buvo identifikuoti 5 antioksidaciniai junginiai, kurie pasiţymėjo antioksidaciniu aktyvumu: chlorogeno rūgštis, rutinas. kvercitrinas, hiperozidas ir vienas neţinomas junginys.
Vertinant kanadinės rykštenės ţiedų antioksidacinius junginius ir jų antioksidacinį aktyvumą, pagal ţaliavos rinkimą 7 Lietuvos regionuose, Solidago canadensis ţiedų metanoliniuose ekstraktuose antioksidacinai junginiai kito nuo 0 µmol/g (hiperozido) iki 44,18µmol/g. Bendras antioksidacinis aktyvumas kito nuo 75,671 µmol/g iki 85,821 µmol/g. Didţiausias (85,821 µmol/g) nustatytas ekstrakte iš 4 regiono (Molėtų r.), maţiausias (75,671 µmol/g) - ţieduose rinktuose 7 regione (Vilniaus m./r.).
Vertinant kanadinės rykštenės ţiedų antioksidacinius junginius ir jų antioksidacinį aktyvumą, pagal ţaliavos rinkimą 24 Lietuvos vietovėse, antioksidacinai junginiai Solidago L. ekstraktuose kito nuo 0 µmol/g (hiperozido) iki 51,054 µmol/g (neţinomo junginio). Antioksidacinis aktyvumas kanadinės rykštenės ekstraktuose keitėsi nuo 56,52 µmol/g (Utenos rajono, Atkočiškių kaimo) iki 109,03 µmol/g (Utenos rajono, Antalgės kaimo).
Atlikta ekstraktuose gautų junginių ir jų antioksidacinio aktyvumo statistinė analizė lyginant pagal ţaliavos rinkimo regioną ir pagal vietovę.
SUMMARY
M. Beleckas Master‗s thesis ―Antioxidant properties determintion of Canadian goldenrod (Solidago canadensis) extracts by HPLC-ABTS post column method―, scientific manager prof. dr. L. Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Farmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry. – Kaunas.
Keywords: Solidago canadensis, Canadian goldenrod, high-performance liquid chromatography, antioxidant activity, ABTS.
The object of this Master‗s thesis was Solidago canadensis L.flowers methanol (70%) extracts. Goldenrod is a perennial plant, that belongs to the Asteraceae family. Canadian goldenrod has diuresis, anti-inflammatory, antibacterial, anti-oxidative, antifungal and anti-tumor functions.
The aim of work was to determine antioxidants and their activity in Solidago canadensis L.flowers extracts using HPLC-ABTS post column method.
Canadian goldenrod flores extracts were made using methanol (70%) solutions. They were investigated by HPLC-ABTS post column method. 5 antioxidants were determined wich had antioxidation qualities: chlorogenix acid, rutin, isoquercitrin, hyperoside and one unknown compund.
Identifying Canadian goldenrod‗s flowers antioxidant properties ant their activity, by 7 Lithuania‗s regions in which raw material was gathered, in Solidago canadensis flowers metanol extracts antioxidants in extracts varied from 0 µmol/g (hyperoside) to 44,18µmol/g (uknown compund). Antioxidation activity in Canadian goldenrod changed from 75,671 µmol/g to 85,821 µmol/g. Biggest activity (85,821 µmol/g) was in ekstacts from 4 region (Molėtai d.), lowest (75,671 µmol/g) in flowers gathered from 7 region (Vilnius city/ d.).
Identifying Canadian goldenrod‗s flowers antioxidant properties ant their activity, by 24 Lithuania‗s location in which raw material was gathered, in Solidago canadensis flowers metanol extracts antioxidants in extracts varied from 0 µmol/g (hyperoside) to 44,18µmol/g (uknown compund). Antioxidation activity in Canadian goldenrod changed from 56,52 µmol/g (Utena district, Atkočiškiai village) to 109,03 µmol/g (Utena district, Antalgė village).
Statistical analis was done with antioxidant and their activity comparing by wich region and location raw material was taken
SANTRUMPOS
ABTS 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalas BMR branduolių magnetinis rezonansas
CGA chlorogeno rūgštis
DMD diodų matricos detektoriaus
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas ESC efektyvioji skysčių chromatografija KFE kietafazė ekstrakcija
MAN minimali aptikimo riba
MNK minimali nustatymo koncentracija R2 koreliacijos koeficientas
RNS reaktyvios azoto formos ROS reaktyvios deguonies formos RSD radikalų surišimo detekcija SSN santykinis standartinis nuokrypis
TE elektronų perdavimas
TEAC trolokso ekvivalento antioksidacinė geba
TEAC troloksui ekvivalentiškų antioksidantų talpumo tyrimas UV ultravioletinės šviesos spinduliuotė
VAP vandenilio atomo perdavimas VIS regimosios šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Susidomėjimas augaliniais preparatais pastaruoju metu vis didėja, nes daugėja gydymo cheminiais vaistais sukeltų ligų, ypač nuo be saiko vartojamų temperatūrą maţinančių, priešuţdegiminių, antibakterinių, antihistamininių vaistų. Šiuolaikinis mokslas atranda vis naujų medţiagų, padedančių organizmui apsisaugoti nuo ardančio laisvųjų radikalų poveikio. Ypač tyrinėjama augalinės kilmės antioksidantų įtaka apsauginių ląstelių savybių stiprinimui, bei įvairių ligų profilaktikai.
Šio tyrimo objektas yra viena iš daugelio vaistinių augalų – kanadinė rykštenė (Solidago
canadensis L.). Augalo genties pavadinimas Solidago L. kildinamas iš lotyniško ţodţio solide, kuris
reiškia „gydyti―, „sutvirtinti― [1]. Rykštenės augaliniai vaistiniai preparatai plačiausiai naudojami kaip diurezę skatinanti priemonė [2]. Kanadinės rykštenės ţolė taip pat pasiţymi priešuţdegiminiu, antibakteriniu, priešgrybeliniu, priešvėţiniu poveikiu [3]. Augalo pavadinimas taikliai atspindi jo savybes – gydanti auksinė rykštė. Atliktų mokslinių tyrimų metu nustatyta, kad rykštenėje gausu fenolinių junginių, kurie pasiţymi atioksidaciniu aktyvumu, todėl pagaminti augaliniai ekstraktai turi teigiamos įtakos sveikatai [2].
Svarbu atlikti kanadinės rykštenės ţaliavų, natūraliai augintų Lietuvos sąlygomis, ekstraktuose esančius veikliuosius junginius bei jų antioksidacinio anktyvumo tyrimus. Šie moksliniai tyrimai suteiktų vertingos informacijos apie gydomąsias Solidago canandensis savybes ir galėtų būti naudojami efektyvių augalinių preparatų gamybai . Be to antioksidacinės savybės Lietuvoje maţai tyrinėtos [2].
DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI
Darbo tikslas:
Nustatyti kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedų ekstraktuose esančių veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą ESC-ABTS pokolonėliniu metodu.
Darbo uţdaviniai:
1. Apibendrinti mokslinę literatūrą apie kanadinę rykštenę (Solidago canadensis L.) ir darbe pritaikomą ESC-ABTS pokolonėlinį metodą.
2. Panaudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą nustatyti ir įvertinti Lietuvoje rinktos kanadinės rykštenės turimus antioksidacinius junginius ir jų antioksidacinį aktyvumą.
3. Statistiškai įvertinti Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo kitimą priklausomai nuo ţaliavos rinkimo vietovių ir Lietuvos regionų.
1.
LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis L.)
Rykštenė – daugiametis augalas, priklausantis astrinių (Asteraceae) šeimos augalas (1 pav.). Tai yra viena didţiausių šios šeimos genčių, ţinoma apie 120 jos rūšių, iš kurių dauguma auga Šiaurės Amerikoje. Ji taip pat paplitusi ir Europos kontinente, todėl Lietuva ne išimtis [1]. Lietuvoje paplitusios rykštenės rūšys: Paprastoji rykštenė (Solidago virgaurea), Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis) ir Didţioji rykštenė (Solidago gigantea). Rykštenių rūšys nereikalauja ypatingų sąlygų augimui, daţniausiai auga ţmogaus paveiktose vietose, kur augalinė danga nepilnai susivėrusi: apleistuose dirvonuose, pakelėse, pagrioviuose, kvartalinėse miško linijose, pamiškėse, durpynų pakraščiuose ir panašiose vietose, iš kurių vėliau skverbiasi ir į natūralias buveines [4].
1 pav. Kanadinė rykštenė (Solidago canadensis) [5]
Rykštenės uţauga iki 1 m aukščio, nors ţinoma porūšių (pvz., S. virgaurea), kurie tepasiekia 10 cm aukštį. Stiebas turi kietą balkšvą šerdį. Augalo stiebas lapuotas, ţalsvai-geltonas arba ţalsvai-rudas, vietomis tamsiai rausvos spalvos, sferinis, turi daugiau ar maţiau matomus griovelius, apatinėje dalyje sklandus ir glotnus [6], o viršutinėje dalyje su plaukeliais [2]. Rykštenė viršutinėje dalyje šakojasi.
Lapai ţali, sėdintys, lancetiški, su dantytais krašteliais, maţdaug 8-12 cm ilgio ir 1-3 cm pločio. Viršutinė lapo pusė ţalia, ganėtinai lygi, o apatinė – pilkšvai-ţalia, plaukuota, ypač aplink gyslas.
Ţiedynus sudaro geltoni, 6–15 mm skersmens graiţai, kurie susitelkę į gausią šakotą šluotelę šakų viršūnėse. Kiekvienas graiţas turi vienašališkų, linijinių gelvai-ţalių paţiedţių, kuriuos supa eilė lieţuviškų, panašaus ilgio geltonų ţiedų, skraistę. Jie išsidėstę šiek tiek aukščiau vamzdiškų ţiedų, kurie išsidėstę graiţo viduryje ir yra tos pačios geltonos spalvos. Balti šilkiniai plaukeliai supa viršuje prisitvirtinusią maţą, rusvą mezginę [6]. Ţydi liepos– rugsėjo mėnesiais. Sutrintas augalas skleidţia švieţių morkų kvapą. Kartais auginamos kaip dekoratyvūs augalai, nes turi ryškius, iš toli matomus ţiedynus [1].
1.2. Kanadinės rykštenės veikliosios medţiagos
Europoje nustatyta, kad rykštenės ţolėje yra šios įvairios medţiagos: flavonoidai (1,5%) (kvercitrinas, kamferolis ir jo glikozidai, astragalinas ir rutozidas), antocianidai ir cianido dariniai. Kitoms sudedamosioms medţiagoms priskiriami triterpenianiai saponinai (iki 2%), fenolinis glikozidas- leiokarpozidas (0.08-0.48%) ir virgaureozidas A, fenolinės rūgštys (kofeino rūgštis, chlorogeno rūgštis (0.2-0.4%), ferulinė rūgštis, sinapininė ir vanilino rūgštis) ir maţas kiekis eterinių aliejų (cadinenas, α ir β pinenas, mircenas, limonenas, sabinenas ir germakrenas D) [7, 8]. Tyrimai parodė, kad rykštenės dominuojančios grupės yra flavonoidai, taninai ir fenoliniai junginiai, kurie sudaro 12,5 % visų Solidago L. augaluose kaupiamų veikliųjų medţiagų [1].
Karšta šarmine ekstrakcijos procedūra buvo išskirtas Solidago canadensis L. polifenolinis-polisacharidinis-baltyminis kompleksas. Tyrimas parodė, kad rykštenė sudaro angliavandeniai (43%), baltymai (27%), fenoliai (12%), urono rūgštis (10%) ir neorganinės medţiagos (8%). Ištyrus angliavandenių sudėtį buvo rasti 5 pagrindiniai monosacharidai: ramnozė (~23%), arabinozė (~20%), urono rūgštis (~19%), galaktozė (~17%), gliukozė (~14%) ir kitų medţiagų maţi kiekiai [9].
Plačiausiai Solidago L. veikliųjų medţiagų analizei naudojami efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) ir dujų chromatografijos – masių spektrometrijos (DC-MS) analizės metodai [10, 11].
ESC–MS analizės metodu nustatyta, kad iš Solidago L. besikaupiančių biologiškai aktyvių junginių 1,5–2,4 procento sudaro rutinas, kvercitrinas, astragalinas, izokvercitrinas, hiperozidas, o daugiau kaip 8 proc. – triterpeniniai saponinai [12].
Naudojant DC–MS metodą nustatyti Solidago Canadensis eterinių aliejų komponentai: 6-epi-alfa-kubabenas – 1,5 proc. ir 6-epi-beta-kubabenas – 20,5 proc. [13], taip pat nustatyti 46 komponentai, iš
kurių didţiausius kiekius sudaro germakrynas D – 28,6 proc., borneolio acetatas – 9,2 proc. ir limonenas – 5 proc. [14].
Lietuvoje su natūraliai augančiomis rykštenėmis tyrimų nėra labai daug, todėl būtų tikslinga jas išsamiai ištirti ir palyginti jų skirtingų rūšių antioksidacinį aktyvumą, o vėliau palyginti su pasaulyje augančiomis rykštenėmis.
1.3. Kanadinės rykštenės panaudojimas medicinoje
Nuo seno rykštenių antpilai pasiţymi šlapimą varančiu poveikiu, atpalaiduoja šlapimo takų lygiųjų raumenų spazmus ir maţina skausmą. Rykštenės ypač naudingos prasidėjus ūmiam šlapimo takų, pūslės uţdegimui, kai vargina daţnas ir skausmingas šlapinimasis [1]. Šlapimo organų infekcija (ŠOI) – viena daţniausių bet kurio amţiaus ţmonių ligų. Daţniausi ŠOI sukėlėjai – Escherichia coli ir kitos ţarnyno bakterijos [15]. Rykštenių ţolė taip pat naudojama esant inkstų akmenligei ir cistitui.
Rykštenės taip pat pasiţymi priešuţdegiminiu, antibakteriniu, antioksidaciniu, priešgrybeliniu, priešvėţiniu poveikiu [3]. Solidago L. rūšies augalų antpilus galima naudoti esant peršalimui, nes skatina prakaitavimą, taip pat kvėpavimo takų ligoms gydyti (skystina gleives ir maţina jų sekreciją) [1].
Plačiau tyrinėtas priešbakterinis Solidago canadensis L. šaknų eterinių aliejų poveikis. Tyrimai atlikti taikant dujų chromatografiją, dujų chromatografiją/masių spektrometriją ir branduolinio magnetinio rezonanso spektroskopiją. Buvo atpaţinta 75,4% medţiagų esančių aliejuje, tokių kaip timolis, α-kopaenas ir karvakrolis. Aliejų antimikrobinis aktyvumas nustatytas diskų difuzijos metodu parodė, kad aliejai turėjo reikšmingą antibakterinį poveikį prieš S. feacalis ir E. coli. Be to, nustatytas ir priešgrybelinis poveikis prieš C. Albicans [16].
Dar vieno atlikto tyrimo metu taip pat buvo nustatinėjamas antibakterinis kanadinės rykštenės ekstraktų poveikis. Buvo gaminami heksano, chloroformo, etilo acetato ir 50% vandeniniai etanolio ekstraktai iš Solidago canadensis L. ţolės ir tiriami diskų difuzijos metodu naudojant Muller Hinton agaro terpę. Antibakterinis poveikis buvo tiriamas prieš šias bakterijas: Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
coagulase-negative staphylococci, Candida albicans, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella para typhi A, Salmonella para typhi B, Enterobacter aerogenes, Shigella dysenteriae, Actinobacter baumanni, Seratia liquefaciens ir Proteus vulgaris.Visi ekstraktai pasiţymėjo
antibakteriniu veikimu, panašiu į standarto. Heksano ir chloroformo MSK buvo 300 μg/ml, o etilo acetato ir 50% vandeninio etanolio – 200 μg/ml [17]. Šis tyrimas atskleidė, kad kanadinės rykštenės ţolė pasiţymi priešinfekcinėmis savybėmis.
Dar viena svarbi savybė yra citotoksinis poveikis vėţinių ląstelių kultūroms – rykštenės lapų ekstraktai sėkmingai ţudo prostatos ir krūties karcinomos, įvairių melanomų, taip pat smulkialąstės plaučių karcinomos vėţines ląsteles. Bandymai su ţmonėmis dar neatlikti, bet teigiamai nuteikia tai, jog pelėms rykštenės ekstraktų injekcijos ne tik sumaţino auglių dydį, bet ir nesukėlė jokio šalutinio poveikio [1].
Buvo tyrinėjamas Solidago L. rūšies augalų vandeninių šakniastiebių, lapų ir ţiedynų ekstraktų priešuţdegiminis poveikis pelėms. Tyrimas parodė, kad rykštenių ekstraktai slopino ląstelių uţdegiminį poveikį, kurį sukėlė karageninas. Be to, šakniastiebių vandeninis ekstraktas ir jo gautos frakcijos sumaţino uţdegimą skatinančių mediatorių išsiskirimą į uţdegiminio proceso vietą. Iš visų šakniastiebių ekstraktų butanolinė frakcija parodė didţiausią priešuţdegiminį veikimą [18].
Kanadinės rykštenės preparatai pasiţymi stipriu antioksidaciniu efektu (saugo organizmo ląsteles nuo laisvųjų radikalų atakos), kuris, kaip parodė atliktas tyrimas, yra stipresnis nei ţaliosios arbatos ar askorbo rūgšties ( vitamino C) [19].
1.4. Solidago canadensis L. kaupiami fenoliniai, bei antioksidaciniu efektyvumu
pasiţymintys veiklieji junginiai
Rykštenė turi daug junginių: flavonoidų, antocianidinių ir cianidinių darinių, triterpeninių saponinų, fenolinių glikozidų, rūgščių, bei maţas kiekis eterinių aliejų [7, 8], tačiau ne visos jos pasiţymi antioksidaciniu poveikiu. Vieną didţiausių antrinių metabolitų grupę augaluose sudaro fenoliniai junginiai. Šie junginiai pagal molekulės struktūrą skirstomi į penkias klases: fenolinės rūgštys, flavonoidai, taninai, stilbenai bei kumarinai. Fenolinės rūgštys ir flavonoidai turi daugiausia junginių ir yra labiausiai ištyrinėtos klasės [20].
Flavonoidai gausiai paplitę augaliniame pasaulyje. Augaluose jų veikimas būna įvairus: suteikia lapams spalvą veikdami kaip pigmentai, katalizuoja elektronų pernašą nuo šviesos priklausančioje fotosintezės fazėje, veikia kaip fermentų inhibitoriai, saugo nuo ţalingų UV spindulių. Taip pat jie yra svarbūs augalų fiziologiams bei biocheminiams procesams [21].
Fenolinės – rūgštys dariniai, kurie sudaryti iš benzoinės rūgšties ir cinamono rūgšties. Valgomieji augalai hidroksibenzoinių rūgščių grupės atstovų turi retai – jų aptinkama tik kai kuriuose raudonos spalvos vaisiuose, svogūnuose, juoduosiuose ridikuose (iki kelių dešimčių miligramų kilograme švieţios ţaliavos). Svarbus galo rūgšties šaltinis yra arbatmedţio lapai. Kur kas daţniau augaluose randami hidroksicinamono rūgščių grupės atstovai – didţiausia jų koncentracija aptinkama mėlynėse, kiviuose,
slyvose, vyšniose, obuoliuose, o kavos rūgštis – kavoje. Daţniausiai aptinkamos šios fenolinės rūgštys – p-kumaro, kavos, ferulinė ir sinapo rūgštys [22].
Šių medţiagų kiekis svyruoja ir priklauso nuo augalo brendimo stadijos. Taip pat junginių kiekio svyravimas gali būti paveiktas ir dėl augalo augimo sąlygų, kaip ir skiriasi skirtingose augalo dalyse (lapuose, šakniastiebiuose, ţiedynuose ir kt.) [23].
Solidago canadensis L.ţaliavoje iš fenolinių rūgčių junginių suteikiančių antioksidacinių savybių
galima rasti chlorogeno rūgštį, o iš flavonoidų – rutiną, izokvercitriną, hiperozidą ir kt [7].
1.5. Antioksidaciniai junginiai aptinkami Solidago L.: chlorogeno rūgštis, rutinas,
isokvercitrinas ir hiperozidas
2 pav. Chlorogeno rūgšties cheminė struktūra [24]
Chlorogeno rūgštis (CGA)- C16H18O9, (1S,3R,4R,5R)-3-[(3,4-Dihidroksicinamoil)oksi]-1,4,5- trihidrokiciklohexankarboksilinė rūgštis. Tai balti arba beveik balti kristaliniai milteliai ar adatėlės, laisvai tirpstančios verdančiame vandenyje, acetone ir etanolyje (96%) [25]. Chlorogeno rūgštis gali turėti keletą izomerų: kriptochlorogeno rūgštį, neochlorageno rūgštį ir kitas dėl funkcinėse grupėse atsiradusių izomerizacinių posūkių. [26]
Chlorogeno rūgštis – daţnai augaluose aptinkama temperatūrai jautri fenolinė rūgštis, kuri susidaro kavos ir chino rūgščių esterifikacijos metu (2 pav.). Chlorogeno rūgštis yra viena labiausiai paplitusių fenolinių rūgščių augaluose. Obuoliuose ši rūgštis yra viena dominuojančių polifenolinių junginių, obuolio minkštime chlorogeno rūgšties kiekis sudaro apie 90 proc. visų polifenolinių junginių [27]. Chlorogeno rūgštis yra plačiai tiriama dėl savo galimų farmakologinių savybių, be to tyrimai parodė,
kad ji lengvai pasisavinama ir metabolizuojama ţmogaus organizme CGA gaunant su ţaliaja arbata, jei augalas jos turi [28]. CGA pasiţymi antioksidacinėmis, antidiabetinėmis ir antilipideminėmis savybėmis [29, 30]. Ji taip pat gali būti naudojama medicinoje, kaip junginys atsparus ŢIV sukeliamam AIDS susirgimui [31].
3 pav. Rutino cheminė struktūra [24]
Rutinas (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-3-[α-L-ramnopuranozil-(1→6)-β-D-gliukopirano-ziloksi]-4H-chromen-4-onas) yra flavonoido kvercitrino glikozidas, kuris po hidrolizės skyla į kvercitriną ir rutinozidą (pav. 3). Tai geltoni kristaliniai milteliai, tamsėja veikiami šviesos spindulių, maţai tirpūs vandenyje ir etanolyje (96%), tirpūs amoniake [32].
Atlikus tyrimus su pelėmis nustatyta, kad rutinas maţina trombų susidarymą [33]. Taip pat tyrimą atlikus su ţiurkėmis nustatytas priešuţdegiminis rutino poveikis [34]. In vitro tyrimu nustatytas antioksidacinis rutino aktyvumas [35].
Buvo atliktas tyrimas su vėţį turinčiomis laboratorinėmis pelėmis. Tyrimo rezultatai parodė, kad ekstraktai su rutinu pasiţymėjo citotoksiniu poveikiu, nes gydytų pelių išgyvenamumo laikas padidėjo 50 dienų [35].
4 pav. Izokvercitrino cheminė struktūra [24]
Izokvercitrinas (2-(3,4-dihidroksifenil)-3-(β-D-gliukofuranosiloksi)-5,7-dihidroksi-4H-1-benzo-piran-4-onas) yra flavonoido kvercetino glikozidas [37].
Atliktų tyrimų metu nustatyta, jog izokvercitrinas pasiţymi dideliu antioksidaciniu poveikiu [38, 39]. Jis turėjo didţiausia efektą stabdant ląstelių mirtį, kurios buvo paveiktos vandenilio peroksidu [38].
Taip pat nustatytas priešuţdegiminis, antihipertenzinis ir diuretinis poveikis [40, 41, 42].
5 pav. Hiperozido cheminė struktūra [24]
Hiperozidas (2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-dihidroksi-4-okso-4H-chromen-3-il-β-D-galakto-piranozidas) – blankiai geltonų, adatų formos, kvercetino galaktozidas [43].
Atlikti tyrimai parodė, kad hiperozidas, kaip ir kiti kvercetino glikozidai pasiţymi priešuţdegiminiu [44], antioksidaciniu [45], priešgrybeliniu [46], antimikrobiniu bei antivirusiniu veikimu [47].
1.6. Antioksidantai, jų aktyvumas ir veikimo mechanizmas
Antioksidantas – tai medţiaga, kuri efektyviai redukuoja prooksidantą sudarydama netoksiškus arba maţai toksiškus junginius, taip išvengiami arba sumaţinami biologinių taikinių oksidaciniai paţeidimai [48]. Labai didelę prooksidantų dalį biologinėse sistemose sudaro reaktyvios deguonies formos (ROS) ir reaktyvios azoto formos (RNS), kurios skirstomos į dvi grupes – radikalus ir neradikalus. Prooksidantai veikia baltymus, nukleorūgštis ir lipidus, todėl gali lemti su amţiumi susijusių ligų, tokių kaip širdies ar kraujagyslių susirgimų, Parkinsono ir Alzhaimerio ligos, kataraktos, bei vėţinių susirgimų, etiologiją, todėl antioksidantų atliekami tyrimai yra svarbūs [49].
Antioksidaciniai junginiai ROS/RNS radikalus ir neradikalus inaktyvuoja dviem pagrindiniais mechanizmais: vandenilio atomo perdavimo (VAP) ir elektronų perdavimo (EP) reakcijomis [50]. VAP ir EP reakcijos daţnai vyksta vienu metu ir dominuojantis mechanizmas priklauso nuo antioksidanto struktūros ir jo savybių (tirpumo, pasiskirstymo koeficiento) bei terpės (tirpiklio tipo, pH). Jungties disociacijos energija ir jonizacijos potencialas yra du pagrindiniai faktoriai, kurie lemia antioksidantinio poveikio mechanizmą ir antioksidantų efektyvumą [51]. Suminis antioksidantinis aktyvumas apima:
1) ROS/RNS generacijos slopinimą ir jų surišimo gebėjimą; 2) redukcinę galią;
3) pereinamųjų metalų sujungimo gebėjimą; 4) antioksidantinių fermentų aktyvavimą; 5) oksidacinių fermentų slopinimą.
Įvairiapusiškam fenolinių junginių antioksidantiniam poveikiui nusakyti, atliekami tyrimai dirbtinėse modelinėse sistemose in vitro skirtingais reakcijų mechanizmais su įvairiais oksidantais ir jų taikiniais [52]. Pagal atliktus tyrimus prognozuojamos antioksidacinių junginių veikimas in vivo sistemose.
VAP reakcijomis pagrįstuose antioksidantinio aktyvumo nustatymo metoduose antioksidantas suriša laisvąjį radikalą atiduodamas vandenilio atomą ir sudarydamas stabilius junginius. VAP reakcijų neįtakoja tirpiklio rūšis ir terpės pH. Jos yra labai greitos, trunka nuo kelių sekundţių iki
keliolikos minučių. Redukuojančių priemaišų (pvz.: metalų jonų) buvimas VAP reakcijomis pagrįstuose metoduose įtakoja klaidingai didesnį antioksidantinį aktyvumą [50].
Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai, priklausantys EP reakcijoms, matuoja antioksidanto gebėjimą atiduoti vieną elektroną ir redukuoti oksidantą, kuris yra stabilus laisvasis radikalas arba kintamo valentingumo metalo jonas [52]. EP reakcijomis pagrįstuose antioksidantinio aktyvumo nustatymo metoduose tiriamio junginio reaktyvumas priklauso nuo jo reaktyvių funkcinių grupių jonizacijos potencialo ir deprotonizacijos prie tam tikrų pH sąlygų [50]. Šios reakcijos yra priklausomos nuo pH, nes didėjant terpės pH reikšmei, maţėja jonizacijos potencialas ir yra didinama deprotonizacija. Todėl, tiriamasis junginys lengviau atiduoda savo elektronus. EP reakcijomis pagrįstuose metoduose pH reikšmingai įtakoja tiriamų junginių redukcinę galią (rūgštinėje terpėje antioksidacinio junginio redukcinė galia gali sumaţėti, o bazinėje- išaugti) [53, 54]. EP reakcijos santykinai lėtos, reikalaujančios daug laiko kol pasiekiama pusiausvyros būsena. EP reakcijomis pagrįsti metodai susideda iš dviejų komponentų: ţinomo (standartinio) oksidanto ir tiriamo antioksidanto. Vyksta nekonkuruojanti reakcija, kurios metu antioksidantas atiduoda elektroną standartiniam oksidantui. Redukuojantis standartiniam oksidantui, stebimas absorbcijos spektro pokytis regimosios šviesos srityje [55]. Reakcijos mišinio spalvos pokyčiai yra proporcingi antioksidanto redukcinei galiai. Galimas rezultatų kintamumas dėl fiksuoto laiko skirtumų, taip pat dėl įvairių priemaišų (ypač metalo jonų) įtakos [50].
Daţniausiai naudojami EP reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai yra: DPPH radikalų surišimo metodas, ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas, geleţies redukcijos antioksidantinė galia (FRAP) ir vario redukcijos antioksidantinė galia (CUPRAC) [52].
1.7. ESC pokolonėliniai metodai taikomi antioksidacinio aktyvumo nustatymui
Pastaruoju metu vis plačiau taikomi efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėliniai antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai. Juose taikomas efektyvus biologiškai aktyvių junginių skirstymas ir pokolonėlinės reakcijos naudojant įvairius reagentus (daţniausiai DPPH ir ABTS radikalai) [56, 57, 58, 59].1.7.1. ESC-DPPH antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos
Pirmieji ESC pokolonėlinį metodą išvystė Koleva ir kt. panaudodami DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo) tirpalą, kuris suriša ir atrinka laisvuosius radikalus kompleksiniuose mišiniuose. ESC išskirstyti veiklieji junginiai reaktoriuje reaguoja su DPPH radikalais ir uţrašomos neigiamos smailės prie 514 nm bangos ilgio, gautos po absorbcinio detektoriaus fiksacijos įvykus redukcijai. Tyrimo metu naudota 15 m 0,25 mm vidinio diametro PEEK vamzdelio reakcijos kilpa. Pertraukiamo veikimo švirštinio siurblio pagalba į reaktorių buvo tiektas DPPH tirpalas. Autoriai optimizavo metodą ir nustatė, kad geriausios tiriamųjų junginių aptikimo ribos pasiekiamos naudojant 10-5 M koncentracijos DPPH metanolinį tirpalą, kai reakcija vyksta 30s. Metodo jautrumą maţino didelis organinio tirpiklio kiekis ir rūgštinė terpė. Autorių nuomonę ESC-DPPH pokolonėlinis metodas yra pigus, paprastas ir universalus antioksidaciniam kompleksinių mišinių nustatymui, todėl tyrimą plėtojo ir tobulino daug kitų mokslininkų [60].
Pukalskas ir kt. [61] panaudojo ankstesnių mokslininkų tyrimus ir išvystė sudėtingą ESC-RSD-DMD-KFE-BMR sistemą tiesioginiam antioksidantų tyrimui. Eliuentas su atskirtais tiriamaisiais junginiais po diodų matricos detektoriaus (DMD) yra dalijamas į 2 skirtingas tėkmes: 1- patenka į radikalų surišimo detekcijos (RSD) sistemą, kur sumaišomas su DPPH ir amonio acetato buferiniu tirpalu, 2- į kietafazės ekstrakcijos (KFE) ir branduolių magnetinio rezonanso (BMR) aptikimo sistemą. Šio metodo pagrindinė problema, kad BMR detektorius pasiţymi menku jautrumu, kurį pavyko patobulinti Exachou ir kt. [62]. Autoriai įmontavo 2 kelių voţtuvą taip pašalindami prieš tai aptarto metodo trūkumą. Patobulintas metodas leidţia tirti tik antioksidacinių savybių turinčius junginius.
1.7.2. ESC-ABTS antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodikos
ABTS (2,2‗- azino- bis-(3 –etilbenzotiazolino –6- sulfoninės rūgšties) radikalų surišimo metodas yra vienas iš daţniausiai taikomų antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų. ABTS radikalas-katijonas (ABTS•+) yra stabilus, ilgai išsilaikantis spalvotas radikalas, kuris regimosios šviesos spektre turi kelis absorbcijos maksimumus prie 415, 650, 734 ir 815 nm bangos ilgių. ABTS•+ sukuriamas cheminių reakcijų pagalba arba fermentinių būdų [63]. Pirmasis – originalus metodas buvo pavadintas TEAC ir pagrįstas metmioglobino aktyvacija. Jos metu metmioglobinas sujungiamas su H2O2 ir pagaminami ferilmioglobino radikalai, kurie reaguoja su bespalviu ABTS reagentu ir sudaromi spalvoti
ABTS•+. Taip pat šis reagentas gali būti gaunamas vandeninėje ar organinėje terpėje ABTS radikalą veikiant kalio persulfatu, mangano oksidu ir 2,2′-azo-bis(2-aminopropanu) [57]. Antiradikaliniu aktyvumu pasiţymintys junginiai surišami su susidariusiais ABTS radikaliniais katijonais, nes originaliame TEAC metode ABTS•+ susidarymas vyksta vėliau nei mėginio įdėjimas. Tiriamojo bandinio antiradikalinis aktyvumas įvertinamas pamatavus reakcijos mišinio absorbciją, kuri parodo nesurištų ABTS•+ kiekį. Tačiau šis metodas buvo iškritikuotas, nes taip dedant medţiagas antioksidantai gali susijungti su H2O2 ir gaunamas klaidingai rodomas antiradikalinis aktyvumas [56].
Naujesnis ABTS radikalų- katijonų surišimo metodas yra patobulintas, kuriame prieš reakciją sudaromas stabilus ABTS•+ ir įvedamas kartu su tiriamais antioksidantais. Šis reagentas gaunamas vandeninėje ar organinėje terpėje ABTS radikalą veikiant kalio persulfatu, mangano oksidu, 2,2′-azo-bis(2-aminopropanu) ir reakcijos metu reaguoja tik su gautu ABTS•+ radikalu- katijonu (6 pav.) [57]. Atliekant antioksidantinio aktyvumo tyrimą ABTS+ radikalų – katijonų surišimo metodu ABTS+ radikalas reaguoja su tam tikru junginiu, pasiţyminčiu antioksidantinėmis savybėmis. Po reakcijos ABTS+ koncentracija sumaţėja. Spalvotas ABTS+ katijonas redukuojamas į pradinę bespalvę ABTS formą. ABTS radikalų surišimo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu [58].
6 pav. ABTS•+ gavimas ir panaudojimas [64]
Antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodas, naudojant ABTS+ radikalą yra stabilus, patikimas, jautrus, lengvas, patikimas, nebrangus [56]. ABTS•+ privalumas, tai kad jis tirpus vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, kas leidţia nustatyt hidrofilinių ir lipofilinių junginių antioksidacinį aktyvumą [63]. Šis metodas taip pat turi keletą trūkumų, nes bet koks junginys, kurio redokso potencialas maţesnis nei ABTS•+ (0,68 V) gali reaguoti su šiuo radikalu-katijonu, tačiau šis surišimo metodo trūkumas nėra esminis ir netrukdo plačiam jo pritaikymui vaistinių augalinių ţaliavų ekstraktų [59]. Pastarasis metodas bus taikomas šio tyrimo metu.
2.
TYRIMO OBJEKTAS IR METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedai surinkti iš įvairių Lietuvos miestų ir jų rajonų 2012 metais ţydėjimo metu. Ţaliava dţiovinta šildomoje dţiovykloje 45°C temperatūroje, saugoma tamsioje, tamsioje, vėsioje ir vėdinamoje patalpoje. 1 lentelėje pateikiamos ţaliavos rinkimo vietos: Lietuvos regionas ir geografinė padėtis pagal koordinates.
1 lentelė. Solidago canadensis L. ţaliavų rinkimo vietovės
Ţaliavos numeris (Regiono nr.) Lietuvos vietovė Geografinė padėtis RŢ1 (Reg.1) Anykščių r.,Traupis 55° 30' Š. Plat. 24° 44' R.Ilg
RŢ2 (Reg.2) Ignalinos m. 55° 19' Š. Plat. 26° 10' R.Ilg
RŢ3 (Reg.3) Kaunas, Islandijos pl. 54° 56' Š. Plat. 23° 56' R.Ilg RŢ4 (Reg.3) Kaunas, Raudondvario pl. 54° 55' Š. Plat. 23° 48' R.Ilg RŢ5 (Reg.4) Molėtų r.,Cezariškiai 55° 14' Š. Plat. 25° 27' R.Ilg RŢ6 (Reg.5) Tauragės apsk., Birbintė 55° 08' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg RŢ7 (Reg.5) Tauragės apsk., Birbintė 1 55° 08' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg RŢ8 (Reg.5) Tauragės r. Oplankys 55° 10' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg RŢ9 (Reg.5) Tauragės r. Oplankys 1 55° 10' Š. Plat. 22° 08' R.Ilg RŢ10 (Reg.6) Utena, Aukštaičių g. 55° 29' Š. Plat. 25° 38' R.Ilg RŢ11 (Reg.6) Utena, Eţero g. 55° 29' Š. Plat. 25° 35' R.Ilg RŢ12 (Reg.6) Utena, K.Ladygos g. 55° 28' Š. Plat. 25° 36' R.Ilg RŢ13 (Reg.6) Utena, Kupiškio g. 55° 30' Š. Plat. 25° 34' R.Ilg RŢ14 (Reg.6) Utena, Pievų g. 55° 30' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg RŢ15 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 55° 30' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg RŢ16 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 1 55° 30' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg
RŢ17 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 2 55° 31' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg RŢ18 (Reg.6) Utena, Uţpalių g. 3 55° 31' Š. Plat. 25° 37' R.Ilg RŢ19 (Reg.6) Utenos r., Liaumuškos 55° 27' Š. Plat. 25° 34' R.Ilg RŢ20 (Reg.6) Utenos r., Politiškės 55° 27' Š. Plat. 25° 46' R.Ilg RŢ21 (Reg.6) Utenos r., Tauragnai 55° 26' Š. Plat. 25° 47' R.Ilg RŢ22 (Reg.6) Utenos r., Vosgėliai 55° 27' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg RŢ23 (Reg.6) Utenos r., Vosgėliai 1 55° 27' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg RŢ24 (Reg.6) Utenos r.,Antalgė 55° 29' Š. Plat. 25° 28' R.Ilg RŢ25 (Reg.6) Utenos r.,Antalgė 1 55° 29' Š. Plat. 25° 28' R.Ilg RŢ26 (Reg.6) Utenos r.,Atkočiškės 55° 31' Š. Plat. 25° 34' R.Ilg RŢ27 (Reg.6) Utenos r.,Deguliai 55° 26' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg RŢ28 (Reg.6) Utenos r.,Velbiškės 55° 24' Š. Plat. 25° 31' R.Ilg RŢ29 (Reg.7) Vilniaus r. Papiškės 54° 43' Š. Plat. 25° 07' R.Ilg RŢ30 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg RŢ31 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 1 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg RŢ32 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 2 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg RŢ33 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 3 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg RŢ34 (Reg.7) Vilniaus r. Riešė 4 54° 47' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg RŢ35 (Reg.7) Vilnius, Kalvarijų g. 54° 43' Š. Plat. 25° 16' R.Ilg
RŢ – kanadinės rykštenės ţiedų mėginiai
2.2. ESC-ABTS pokolonėliniui metodui naudojamos medţiagos ir įrengimai
Analizės metu naudojamos medţiagos: Išgrynintas vanduo (Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedfordas, MA, JAV)); Acetonitrilas (ACN) (Roth GmbH (Karlsruhas, Vokietija));
Metanolis 70% (Roth GmbH (Karlsruhas, Vokietija)); Etanolis (Stumbras (Kaunas, Lietuva));
99% grynumo trifluoracto rūgštis ( TFA) (Sigma-Aldrich (Buchs, Šveicarija)); 98% ABTS (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija) ir (St. Louis, JAV)); 98% troloksas (Fluka Chemika (Buchs, Šveicarija));
99% TFA (Fluka Chemika (Buchs, Šveicarija));
Natrio citratas (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija); Citrinos rūgštis (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija); Kalio persulfatas (Sigma-Aldrich (Steinheimas, Vokietija);
95,33% chlorogeno rūgštis (HWI ANALYTIK GmbH (Ruelzheimas, Vokietija)); 97,11% rutino trihidratas (HWI ANALYTIK GmbH (Ruelzheimas, Vokietija)); 94,16% isokvercitrinas (HWI ANALYTIK GmbH (Ruelzheimas, Vokietija)). Tyrimo metu naudota aparatūra ir įrengimai:
Vandens gryninimo sistema Millipore (Bedfordas, MA, JAV);
Chromatografas Waters 2695 (Waters Corporation, Milfordas, CT, JAV); Ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mahwah, JAV);
Fotodiodų matricos detektorius Waters 996 (Waters Corporation);
3 μm YMC kolonėlė 150×4,6 mm (YMC Europa Gmbh, Dinslakenas Vokietija); Waters 2487 UV/VIS detektorius (Waters Corporation).
Principinė ESC pokolonėlinio metodo naudojant ABTS reagentą schema naudojant išvardintą aparatūrą pavaizduota (7 pav.)
7 pav. ESC- ABTS pokolonėlinės reakcijos principinė schema [69]
2.3. Kanadinės rykštenės mėginių paruošimas ir ekstrakcija
Solidago L. genties augalų, ţiedų ekstraktai buvo paruošti pagal metodus, kuriuos naudojo kiti
mokslininkai savo tyrimuose [65]. Mėginiams paruošti naudota ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mahwah, JAV). Grynos ţaliavos ekstrakcijai atlikti buvo pasirinktas vandeninis 70% metanolio tirpalas (V/V). Metanolis buvo pasirinktas dėl savo didelio poliškumo laisviems radikalams [66]. Tiriamos ţaliavos ekstraktai buvo gaminami santykiu 1:100 (masė/tūris), tiriamojo objekto sveriant 0,1 gramo ir uţpilant tirpikliu iki 10 ml ţymos. Paruošti ekstraktai buvo laikomi ultragarso vonelėje 50 min, palaikant pastovią 25ºC temperatūrą.Prieš ekstraktų injekaciją į ESC sistemą visi mėginiai buvo filtruoti per 0,22 µm sterilius nailoninius švirkštinius filtrus (diametras-13 mm, gauta iš –Carl Roth GmbH & Co. KG, Vokietija).
2.4. ABTS darbinio tirpalo ruošimas
ABTS milteliai ištirpinami išgrynintame vandenyje (2 mM) ir pridedama kalio persulfato (0,7 mM). Mišinys laikomas 16-17 h. tamsoje kambario temperatūroje kol pasiekiama reakcijos pusiausvyra. Gautas pradinis ABTS radikalo-katijono tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki darbinės 110 μM ABTS•+ koncentracijos. Atliekant ESC-ABTS pokolonėlinių metodų palyginamuosius tyrimus, pradinis ABTS radikalo-katijono tirpalas iki darbinės 110 μM koncentracijos skiedţiamas acetatiniu buferiu (300 mM, pH 3,6) [67].
2.5. ESC taikymas Solidago canadensis L. veikliųjų junginių kokybiniam
įvertinimui
Analizė buvo atlikta su Waters 2695 chromatografu (Waters Corporation, Milfordas, JAV) bei fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996 PDA (Waters Corporation). Veikliųjų junginių atskyrimui naudota 150×4,6 mm, 3 µm YMC kolonėlė ( YMC Europe Gmbh, Dinslakenas, Vokietija), kuri visos analizės metu laikyta išoriniame termostate, palaikant pastovią 25ºC temperatūrą. Analizės metu injekuota 10 µl tiriamo tirpalo, mobilios fazės tėkmės greitis – 1,0 ml/min. Taikyta gradientinė sistema, kurios eliuacijos sąlygos skirtingais laiko intervalais nurodytos 2 lentelėje. Chromatografinių smailių viršūnių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių junginių sulaikymo laikų bei UV absorbcijos spektrų 210 – 400 nm ribose sutapimus. Individualių serijų standartų tirpalai buvo ruošiami su 70% etanoliu. Flavonoidų ir fenolinių rūgščių aptikimas atitinkamai atliktas prie 355 nm ir 324 nm bangos ilgių.
2 lentelė. Eliuacijos sąlygos skirtingais laiko intervalais
Laikas Trifluoracto rūgštis (A) (%) Acetonitrilas (B) (%)
0 min 95 5 5 min 88 12 50 min 70 30 51 min 10 90 56 min 10 90 57 min 95 5
2.6. ESC-ABTS pokolonėlinis antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodas
Antioksidacinių medţiagų nustatymui iš kanadinės rykštenės augalinės ţaliavos buvo pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinis metodas naudojant ABTS reagentą.Įvedus mėginius į efektyviosios skysčių chromatografijos metodo detekcijos sistemą, judri fazė su tiriamais junginiais per reakcijos kilpą eina į maišymo trišakį, kur tuo pačiu metu yra tiekiamas ABTS reagento tirpalas 0,5ml/min Gilson pump 305 (Middletonas, WI, JAV) siurblio pagalba. ESC-ABTS sistemoje naudojama 3 m (vidinis diametras 0,25 mm, išorinis diametras 1,58 mm) reakcijos kilpa, kuri teramostatuojama 50°C temperatūroje. Antioksidacinių medţiagų reakcija su ABTS pasireiškė reagento
spalvos pasikeitimu nustatant naudojant Waters 2487 UV/VIS detektorių (Waters Corporation). Tiriamųjų tirpalų detekcija atliekama prie 650 nm šviesos bangos ilgio. Signalo stiprumas išreiškiamas neigiamų aktyvių junginių (isokvercitrino, rutino, hiperozido, chlorogeno rūgšties ir neţinomo junginio) pikais. Ekstraktų junginių antioksidacinis aktyvumas pokolonėliniu metodu buvo vertinamas pagal trolokso standarto ekvivalentą. Kalibravimo kreivės paruoštos naudojant trolokso etanolinį tirpalą aštuoniuose praskiedimuose, koncentracijų intervalas: 0,625- 80 mg/ml. Metodas pritaikyta pagal ankstesnius mokslininkų atliktus tyrimus [65].
2.6.1. Duomenų statistinis įvertinimas
Grafiniam gautų rezultatų pavaizdavimui naudota MS Excel (Microsoft, JAV) kompiuterinė programa. Duomenys statistiškai įvertinti „SPSS 20‖ (―IBM, JAV)‖ statistikos programa. Apskaičiuoti regresijos koeficientai, koreliacijos koeficientai, standartinės paklaidos. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.
3.
TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. ESC-ABTS pokolonėlinės metodikos optimizavimas
Solidago canadensis L. ţiedų, rinktų skirtinguose Lietuvos regionuose, metanolinių ekstraktų
antioksidacinių junginių nustatymui pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos-ABTS pokolonėlinis metodas. Jis pasirinktas dėl lengvo, patogaus ir daug laiko bei sąnaudų nereikalaujančio antioksidacinių medţiagų kokybinio ir kiekybinio nustatymo mėginiuose. Buvo identifikuoti penki
Solidago canadensis ţiedų ekstraktuose nustatyti antioksidacinių junginių kiekiai: chlorogeno rūgšties
(1), rutino (2), izokvercitrino (3), hiperozido (4) ir vieno neţinomo junginio (5), kurių sulaikymo laikai matomi PDA ir UV/VIS detektorių chromatogramose (8 pav.). Kadangi dirbant su ABTS reagentu, reakcijos trukmė maţiau reikšminga nei eliucijos zonų plitimas, reagentas turi perspektyvą taikymui su trumpomis kilpomis tokiose derivatizacijos metodikose, kuriose chromatografinis skirstymas yra formuojamas atsiţvelgiant į ,,greičio― rodiklį arba į jautrumą. Esamoje chromatrografinio skirstymo aplinkoje Solidago canadensis ţaliavos antioksidacinio aktyvumo įvertinimo tyrimams su ABTS reagentu taikytos optimaliausios sąlygos yra 3 metrų kilpa, ją termostatuojant prie 50o
C. Junginių aptikimas atliktas prie 650 nm šviesos bangos ilgio. Metodikos nustatymai atlikti pagal ankstesnius mokslininkų tyrimus [65].
Atlikto tyrimo metu nepavyko nustatyti tik vienos medţiagos, tačiau ji turėjo didelę įtaką antioksidaciniam aktyvumui dėl didelio jos kiekio ir buvo įtraukta į rezultatus. ESC-ABTS pokolonėline metodika gauti rezultatai yra tikslūs, o duomenys atsikartojantys. Ši optimizuota metodika yra tinkama atlikti antioksidacinių junginių nustatymui.
8 pav. Solidago canadensis L. ţiedų metanolinių ekstraktų PDA ir UV/VIS detektorių
chromatogramos. Chromatogramos pikai: 1 – chlorogeno rūgšties; 2 – rutino; 3 – izokvercitrino; 4 – hiperozido; 5 – neţinomas junginio
3.2. ESC-ABTS pokolonėlinio metodo validacija
Pokolonėlinės analizės efektyviam junginių atskirimui yra svarbu uţtikrinti optimalias chromatografinio skirstymo sąlygas, bet taip pat svarbu yra įsitikinti metodo patikimumu. ESC-ABTS metodas buvo validuotas nustatant šiuos parametrus: specifiškumą, tiesiškumą, preciziškumą, minimalią nustatymo koncentraciją (MNK) bei minimalią aptikimo ribą (MAR). Taip pat svarbūs kriterijai metodikai įteisinti yra kalibracinės kreivės lygtis ir koreliacijos koeficientas. Minėti kriterijai ir atspindi kritinius kiekybinio vertinimo taškus. Duomenys pateikti 3 lentelėje.
ESC pokolonėlinio metodo jautrumas buvo įvertintas atsiţvelgiant į minimalią aptikimo ribą (MAR) ir minimalią nustatymo koncentraciją (MNK). Ribos buvo apibrėţtos nustatant signalo – triukšmo santykį. Minimalios aptikimo ribos signalo triukšmo santykis 3:1, minimalios nustatymo koncentracijos – 10:1.
Metodo specifiškumas buvo įvertintas atsiţvelgiant į du parametrus: sulaikymo trukmę, kuri atsispindėjo tiriamųjų junginių chromatogramose ir PDA spektro atitikimą standartui. Chromatogramose tiriamųjų junginių sulaikymo trukmė turi sutapti su standartų sulaikymo trukmėmis bei spektriniais duomenimis.
Metodo preciziškumas buvo nustatytas pagal pakartojamumo bei tarpinio preciziškumo parametrus. Pakartojamumas buvo nustatytas 4 analičių (chlorogeninės rūgšties, rutino, izokvercitrino, trolokso) penkiais vertinimais tą pačią dieną, nekeičiant tyrimo sąlygų (tie patys reagentai, tiriamieji pavyzdţiai ir instrumentai). Metodo tarpinio preciziškumo įvertinimas buvo atliktas analizę atliekant trimis skirtingomis dienomis. Pakartojamumas ir tarpinis preciziškumas buvo išreikštas santykinio standartinio nuokrypio dydţiu (SSN). SSN – tai atsitiktinio dydţio standartinio nuokrypio ir vidurkio santykis, kuris išreiškiamas procentais.
Gauti pokolonėlinio metodo ESC-ABTS pakartojamumo ir atkuriamumo variacijos koeficientai, kurie neviršijo 3.00 proc. Toks rezultatas yra priimtinas kiekybiniam junginių antiradikalinio aktyvumo įvertinimui.
3 lentelė. Tiesioginio ESC-ABTS metodo tiesiškumo, preciziškumo, minimalios aptikimo ribos (MAR) ir minimalios nustatymo koncentracijos (MNR) reikšmės
a
Pakartojamumas b
Tarpinis presiziškumas Parametrai
ABTS pokolonėlinis metodas
Troloksas Chlorogeninė rūgštis Rutinas Izokvercitrinas Tiesiškumas (µg/ml) 0.625-80 1.88-60 0.94-30 1.00-33 Preciziškumas: pakartojamumas SSN (%)a Tarpinis preciziškumas SSN (%)b 0.30 0.40 2.20 2.50 2.20 2.90 1.20 1.30 MNK (µg/ml) 0.26 0.78 0.39 0.42 MAR (µg/ml) 0.36 2.62 1.75 1.39
Kanadinės rykštenės (Solidago canadensis L.) ţiedų ekstraktuose, esančių veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymui išreikšti naudojamas etaloninis trolokso standartinis tirpalas. Rykštenės ekstraktų radikalinių medţiagų koncentracijos signalo priklausomybė pagrįsta pagal trolokso standarto kalibracinę kreivę. Ji buvo apskaičiuota pagal trolokso koncentraciją reikalingą sukelti ekvivalentišką antioksidacinį aktyvumą (μm). Antioksidacinių junginių kiekybiniam įvertinimui nustatyti buvo sudaryta trolokso kalibracinė kreivė. Buvo įvesti aštuoni skirtingi ABTS reagento trolokso tirpalai, kurių koncentracijos vyravo 0.625-80 µg/mL. Tiesioginė koreliacija tarp trolokso kiekio ir neigiamų viršūnių dydţio buvo apibrėţta aukščio koreliacijos faktoriumi- ABTS (R2
). Kalibracinės kreivės išreikštos pagal troloksą buvo kvadratinės išraiškos: ABTS-(R2
) = 0,9991 (Y=-1,54·102x2+4,16·104 ·x-2,08·104). Atliekant kalibracinės kreivės sudarymą, pirmiausia taikyta tiesinės priklausomybės lygtis, tačiau po pakartotų analizių determinacijos koeficientų (R2) išraiška gavosi nepatikima kiekybiniams tyrimams. Dėl to buvo pasirinkta ne tiesinė, o kvadratinė kalibracinės kreivės išraiška. Rezultatams įtakos galėjo turėti, sąlyginai didelės trolokso reagento koncentracijos.
3.3. 7 Lietuvos regionų Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir
antioksidacinio aktyvumo vidurkių palyginimas
Tyrimo metu augalinė ţaliava buvo paimta iš 7 skirtingų Lietuvos regionų ir apskaičiuotas jose nustatytų antioksidacinių junginių ir jų aktyvumo vidurkis, kad būtų galima palyginti ţaliavą tarp skirtingų regionų . Kanadinės rykštenės ţiedų mėginiuose nustatyti 5 antioksidaciniai junginiai, iš kurių didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu pasiţymėjo neidentifikuotas junginys. Taip pat rykštenės ekstraktuose nustatytas didelis chlorogeno rūgšties kiekis. Antioksidacinis aktyvumas išreikštas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEAC) gramui ţaliavos. Tyrimo rezultatai pateikti 4 lentelėje.
4 lentelė. Solidago L. ţiedų ekstraktuose, esančių junginių antioksidacinis aktyvumas (µmol/g) pagal ţaliavos rinkimo regioną
Regionas Chlorogeninė rūgštis Rutinas Izokvercitrinas Hiperozidas Neţinomas j.
Reg. 1 26,876 12,754 2,221 0,673 42,842 Reg. 2 21,078 15,321 1,639 0,424 44,18 Reg. 3 23,874 15,73 1,961 0,068 42,903 Reg. 4 24,083 19,475 3,47 0 38,792 Reg. 5 28,101 14,914 1,115 0,26 40,761 Reg. 6 24,126 14,374 2,72 0,281 38,7 Reg. 7 23 11,601 2,055 0,267 38,748
9 pav. Antioksidacinių junginių procentinis pasiskirstymas Solidago canadensis L. augalinių ţaliavų ekstraktuose rinktų iš skirtingų regionų
Kaip matoma iš 4 lentelės ir 9 pav. neţinomas junginys ir chlorogeno rūgštis kanadinės rykštenės ţaliavos metanoliniuose ekstraktuose pasiţymi didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu proc. ir kiekybiškai. Didţiausias chlorogeno rūgšties antioksidacinis aktyvumas (28,101 µmol/g) nustatytas ekstraktuose rinktuose 5 regione (Tauragės apsk./r.), maţiausias (21,078 µmol/g) – 2 regione (Ignalinos mieste). Rutino antioksidacinis aktyvumas Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose varijavo nuo 11,601 µmol/g iki 19,475 µmol/g. Daugiausiai rutino nustatyta ekstraktuose rinktuose 4 regione (Molėtų r.), o maţiausiai 7 regione (Vilniaus m./r.). Izokvercitrino antioksidacinis aktyvumas vyravo nuo 1,115 µmol/g iki 3,47 µmol/g – didţiausias 4 regione rinktų ţaliavų (Molėtų r.), maţiausias – 5 regione (Tauragės apsk./r.). Hiperozido antioksidacinis aktyvumas lyginant su kitais junginiais buvo labai maţas ir jo visiškai nenustatyta ekstraktuose iš 4 regiono (Molėtų r.), o didţiausias kiekis (0,673 µmol/g) 1 regione rinktų ţaliavų (Anykščių r.). Neţinomas junginio antioksidacinis aktyvumas buvo didţiausias ir svyravo nuo 38,7 µmol/g iki 44,18 µmol/g, atitinkamai maţiausias buvo ekstraktuose iš 6 regiono (Utenos m./r.), didţiausias - 2 regiono ekstraktuose (Ignalinos mieste).
Vertinant Solidago canadensis L. ţiedų, rinktų 7 skirtinguose Lietuvos regionuose, metanolinius ekstraktus, nustatytas bendras antioksidacinis aktyvumas pagal vidutinį antioksidacinių junginių kiekį pasiskirsčiusį regionų ţaliavoje. Jis kito nuo 75,671 µmol/g iki 85,821 µmol/g. Didţiausia reikšmė (85,821 µmol/g) nustatyta ekstrakte iš 4 regiono (Molėtų r.), maţiausia (75,671 µmol/g) - 7 regione (Vilniaus m./r.). Rezultatai pateikti 10 pav.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Reg. 1 Reg. 2 Reg. 3 Reg. 4 Reg. 5 Reg. 6 Reg. 7
Antiok sid ac in ių jun gin ių p roc . p asis k irt ym as au gali n iu ose ek str ak tuose Neţinomas j. Hiperozidas Izokvercitrinas Rutinas Chlorogeno rūgštis
10 pav. Bendras Solidago canadensis L. antioksidacinis aktyvumas (µmol/g) ţiedų ekstraktuose
Tyrimo rezultatus apdorojus statistiškai, buvo bandoma išsiaiškinti ar priklausomai nuo Lietuvos regionų, kuriuose rinkti Solidago canadensis ţiedai, priklauso ir jų antioksidacinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvmas, tačiau statistinis reikšmingumas nenustatytas (p>0,05)(p- patikimumo lygmuo). Pateiktoje 5 lentelėje Solidago canadensis kiekvienas antioksidacinis junginys ir jo aktyvumas buvo statistiškai vertinamas tarp skirtingų regionų ir nustatyta statistinė reikšmė.
5 lentelė. Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose, esančių antioksidacinių junginių statistiniai duomenys pagal regionus
Antioksidacinis junginys p statistinė reikšmė
Chlorogeno rūgštis 0,784
Rutinas 0,398
Izokvercitrinas 0,456
Hiperozidas 0,401
Neţinomas j. 0,684
Kadangi skirtinguose regionuose Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose esantys antioksidaciniai junginiai neparodė statistinio reikšmingumo buvo lyginamos visos rinktos ţaliavos pagal vietoves. 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88
Reg. 1 Reg. 2 Reg. 3 Reg. 4 Reg. 5 Reg. 6 Reg. 7
A n tioks id ac in is ak tyvum as (µm ol/ g)
3.4. 24 Lietuvos vietovių Solidago canadensis L. antioksidacinių junginių ir
antioksidacinio aktyvumo palyginimas
Tolimesnio tyrimo metu paimti Solidago canadensis L. ţaliavos n=35 ėminiai iš 24 skirtingų Lietuvos vietovių. Kanadinės rykštenės ţiedų ekstraktuose nustatyti 5 antioksidaciniai junginiai, kurių pasiskirstymas kito nei regionuose. Lietuvos vietovėse rinktuose ir tirtuose kanadinės rykštenės ekstraktuose neţinomo junginio kiekis taip pat pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu. Antioksidacinis aktyvumas išreikštas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TEAC) gramui ţaliavos.
Iš informacijos pateiktos 9 pav. matome, kad Solidago canadensis L. ţaliavų ekstraktuose, panašiai kaip ir regionuose, vyravo chlorogeno rūgštis ir neţinomas junginys. Maţesni chlorogeno rūgšties kiekiai nustatyti ekstraktuose rinktuose Utenoje, Uţpalių gatvėje (1) ir Vilniuje, Kalvarijų gatvėje atitinkamai 14,038 µmol/g ir 14,136 µmol/g. Didţiausias šio antioksidanto aktyvumas nustatytas metanoliniuose ekstraktuose rinktuose Vilniaus rajone, Riešėje (3) (37,294 µmol/g), nors iš šalia tos pačios vietovės rinktose ţaliavose (Vilniaus r., Riešėje (2)) jo nustatyta 15,225 µmol/g. Rutino antioksidacinis aktyvumas Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose keitėsi nuo 5,239 µmol/g iki 23,900 µmol/g. Maţiausias rutino antioksidacinis aktyvumas nustatytas ekstraktuose iš Utenos m. Uţpalių gatvėje (1), o didţiausias Utenos r. Atkočiškėse. Izokvercitrino antioksidacinis aktyvumas vyravo nuo 0,479 µmol/g iki 6,109 µmol/g – svarbu tai, kad didţiausias aktyvumas nustatytas ekstraktuose rinktuose Utenos r. Antalgės kaime, o maţiausias tame pačiame kaime iš netoli esančios kitos vietos. Nustatytas hiperozido antioksidacinis aktyvumas buvo maţiausias iš visu 5 junginių. 12 Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktuose nenustatyta hiperozido, kurie buvo rinkti Kauno mieste prie islandijos plento, Molėtų rajone, Cezariškiuose, Utenos mieste Eţero g., Kupiškio g. ir Utenos uţpalių g., taip pat Utenos rajono Vosgėlių, Vosgėlių (1), Antalgės Atkočiškių ir Degulių kaimuose ir miesteliuose, bei Vilniaus miesto Kalvarijų gatvėje ir Papiškėse. Didţiausias (6,101 µmol/g) hiperozido antioksidacinis aktyvumas nustatytas ţaliavoje iš Utenos r. Antalgės (1) kaimo. Neţinomas junginio antioksidacinis aktyvumas ekstraktuose, rinktuose iš 24 skirtingų vietovių, buvo didţiausias ir varijavo nuo 27,228 µmol/g iki 51,054 µmol/g, atitinkamai maţiausias – Utenos r. Antalgės kaime rinktuose ţieduose, didţiausias – Utenos rajone, Tauragnuose prie ţvyro karjero rinktuose ţieduose.
11 pav. Solidago canadensis L. ţieduose rinktuose iš 24 skirtingų vietovių ekstraktuose, esančių junginių antioksidacinis aktyvumas (µmol/g)
0 10 20 30 40 50 Anykščių r.,Traupis Ignalina, Agarinio g. Kaunas, Islandijos pl. Kaunas, Raudondvario pl. Molėtų r.,Cezariškiai Tauragės apsk., Birbintė Tauragės apsk., Birbintė 1 Tauragės r. Oplankys Tauragės r. Oplankys 1 Utena, Aukštaičių g. Utena, Eţero g. Utena, K.Ladygos g. Utena, Kupiškio g. Utena, Pievų g. Utena, Uţpalių g. Utena, Uţpalių g. 1 Utena, Uţpalių g. 2 Utena, Uţpalių g. 3 Utenos r., Liaumuškos Utenos r., Politiškės Utenos r., Tauragnai Utenos r., Vosgėliai Utenos r., Vosgėliai 1 Utenos r.,Antalgė Utenos r.,Antalgė 1 Utenos r.,Atkočiškės Utenos r.,Deguliai Utenos r.,Velbiškės Vilniaus r. Papiškės Vilniaus r. Riešė Vilniaus r. Riešė 1 Vilniaus r. Riešė 2 Vilniaus r. Riešė 3 Vilniaus r. Riešė 4 Vilnius, Kalvarijų g.
Kanadinės rykštenės ektraktų antioksidacinis junginių aktyvumas (µmol/g)
L iet u vos vi etov ė Neţinomas j. Izokvercitrinas Hiperozidas Rutinas Chlorogeno r
12 pav. Solidago canadensis L. ţiedų ekstraktų bendras antioksidacinis aktyvumas lyginant ţaliavą pagal 24 rinkimo vietoves (µg/g)
85,37 82,64 81,63 87,44 85,82 68,30 99,53 92,36 80,42 84,53 82,46 93,61 76,95 79,08 61,96 56,87 70,13 71,48 72,13 101,69 100,95 76,64 66,75 56,52 100,88 109,03 83,37 78,76 71,49 83,09 62,79 65,12 104,20 80,55 62,46 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00 Anykščių r.,Traupis Ignalina, Agarinio g. Kaunas, Islandijos pl. Kaunas, Raudondvario pl. Molėtų r.,Cezariškiai Tauragės apsk., Birbintė Tauragės apsk., Birbintė 1 Tauragės r. Oplankys Tauragės r. Oplankys 1 Utena, Aukštaičių g. Utena, Eţero g. Utena, K.Ladygos g. Utena, Kupiškio g. Utena, Pievų g. Utena, Uţpalių g. Utena, Uţpalių g. 1 Utena, Uţpalių g. 2 Utena, Uţpalių g. 3 Utenos r., Liaumuškos Utenos r., Politiškės Utenos r., Tauragnai Utenos r., Vosgėliai Utenos r., Vosgėliai 1 Utenos r.,Antalgė Utenos r.,Antalgė 1 Utenos r.,Atkočiškės Utenos r.,Deguliai Utenos r.,Velbiškės Vilniaus r. Papiškės Vilniaus r. Riešė Vilniaus r. Riešė 1 Vilniaus r. Riešė 2 Vilniaus r. Riešė 3 Vilniaus r. Riešė 4 Vilnius, Kalvarijų g.
Antioksidacinis aktyvumas µmol/g
L
iet
u
vos vi
Vertinant n=35 Solidago canadensis L. ţiedų, rinktų dvidešimt keturiuose skirtingose Lietuvos vietovėse, ekstraktus nustatytas antioksidacinis aktyvumas pagal bendrą antioksidacinių junginių kiekį esantį ţaliavoje. Jis varijavo nuo 56,52 µmol/g iki 109,03 µmol/g. Ţaliava su didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu rinkta iš Utenos rajono, Atkočiškių kaimo, maţiausia iš Utenos rajono, Antalgės kaimo. Rezultatai pateikti 12 pav.
Tyrimo rezultatus apdorojus statistiškai, buvo bandoma išsiaiškinti ar priklausomai nuo Lietuvos vietovių, kuriose rinkti Solidago canadensis ţiedai, priklauso ir jų antioksidacinių junginių kiekis ir antioksidacinis aktyvmas, tačiau statistinis reikšmingumas nenustatytas (p>0,05).
Galima teigti, jog rezultatams įtakos galėjo turėti kanadinės rykštenės ekstraktų paruošimui naudoto metanolio koncentracijos nuokrypiai, naudota metodika ir jos jautrumas, taip pat Solidago
4.
IŠVADOS
1. Tyrimo metu išanalizuota mokslinė literatūra apie kanadinę rykštenę (Solidago canadensis L.), jos ekstraktuose esančius veikliuosius junginius, bei jų antioksidacinį aktyvumą. Darbe aptarti ESC pokolonėliniai metodai. Pritaikytas ESC-ABTS pokolonėlins metodas.
2. Naudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą buvo tiriami Solidago canadensis L. ţiedų, suskirstytų pagal jų rinkimo regioną, metanoliniai (70%) ekstraktai. Tyrimo metu buvo identifikuoti 5 antioksidaciniai junginiai, kurie pasiţymėjo antioksidaciniu aktyvumu: chlorogeno rūgštis, rutinas, kvercitrinas, hiperozidas ir vienas neţinomas junginys, kuris pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu. Kanadinės rykštenės ţiedų metanoliniuose ekstraktuose antioksidacinai junginiai kito nuo 0 µmol/g (hiperozido) iki 44,18µmol/g. Bendras antioksidacinis aktyvumas kito nuo 75,671 µmol/g iki 85,821 µmol/g. Didţiausias (85,821 µmol/g) nustatytas ekstrakte iš 4 regiono (Molėtų r.), maţiausias (75,671 µmol/g) – ţieduose rinktuose 7 regione (Vilniaus m./r.).
3. Naudojant ESC-ABTS pokolonėlinį metodą buvo tiriami n=35 Solidago canadensis L. ţiedų,
surinktų iš 24 skirtingų vietovių, metanoliniai (70%) ekstraktai. Tyrimo metu buvo identifikuoti 5 antioksidaciniai junginiai, kurie pasiţymėjo antioksidaciniu aktyvumu: chlorogeno rūgštis, rutinas,
kvercitrinas, hiperozidas ir vienas neţinomas junginys, kuris pasiţymėjo didţiausiu antioksidaciniu aktyvumu. Antioksidacinai junginiai Solidago L. ekstraktuose kito nuo 0 µmol/g (hiperozido) iki 51,054 µmol/g (neţinomo junginio). Antioksidacinis aktyvumas kanadinės rykštenės ekstraktuose keitėsi nuo 56,52 µmol/g (Utenos rajono, Atkočiškių kaimo) iki 109,03 µmol/g (Utenos rajono, Antalgės kaimo).
4. Atlikus gautų duomenų statistinę analizę gauta, kad antioksidaciniai junginiai ir jų antioksidacinio aktyvumo pasiskirstymas, Solidago canadensis L. ekstraktuose, neturi statistinio reiškimingumo nei pagal regionų, nei pagal vietovių ţiedų rinkimo vietas (p>0,05).
5.
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Šiukšta R. Paprastoji rykštenė – Solidago virgaurea L. 2008. Prieiga per internetą: http://www.botanikos-sodas.vu.lt/lt/zalieji-puslapiai/augalu-gentys/rykstene
2. Marksa M., Radušienė J., Marksienė R., Kiliuvienė G. Rykštenės (Solidago. L) rūšies augalų ir rykštenėje besikaupiančių veikliųjų medţiagų svarba gydant šlapimo organų ligas. Medicinos teorija ir praktika T. 18 (Nr. 2), 201.. p. 158-160 Prieiga per internetą:
http://www.mtp.lt/files/medicina_TP_2012_2_str07.pdf
3. Prieiga per internetą http://medicinalplants.us/goldenrod-background-actions.
4. Viltrakytė J, Karpavičienė B, Radušienė J. „Invazinių rykštenių rūšių geografinis ir ekologinis paplitimas Lietuvoje―. Konferencijos pranešimų santraukos. Studentų mokslinė praktika, 2013. p. 60. Prieiga per internetą:
http://studentai.lmt.lt/DOKUMENTAI/KONFERENCIJOS/2013_SMP_I_FBTZ.pdf#page=61
5. Pavek, P.L.S.. Plant guide for Canada goldenrod (Solidago canadensis). USDA-Natural Resources Conservation Service. Pullman, WA 2011. Prieiga per internetą:
http://plants.usda.gov/plantguide/pdf/pg_soca6.pdf
6. European Pharmacopoeia 7.0, 01/2008. 1892. p. 1141- 1142
7. Doc. Ref. EMEA/HMPC/285759/2007 London, 4 September 2008.
8. Tao Jiang, Bao-Kang Huang, Lu-Ping Qin. A survey of chemical and pharmacological studies on
Solidago. Journal of Chinese Integrative Medicine; Volume 4, July, 2006.
9. M. Sutovska, P. Capek, M. Kocmalova, S. Franova, I. Pawlaczyk, R. Gancarz. Characterization and biological activity of Solidago canadensis complex. International Journal of Biological Macromolecules, 25 September, 2012. Prieiga per internetą:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813012003753
10. Güntner C, Barra M.V. Cesio, Dellacassa E, Ferrando L, Ferreira F, García C. Antioxidant Properties of Solidago Chilensis L. Flavonoids. II Wocmap Congress Medicinal and Aromatic Plants, Part 2: Pharmacognosy, Pharmacology, Phytomedicine, Toxicology. 1999.
11. Lendl A, Reznicek G. Two New Saponins from Solidago gigantea. Scientia Pharmaceutica (Sci. Pharm.) 75, 2007. p. 111-120.
12. Catherine A, Rice-Evans, Packer L. Flavonoids in health and disese. University of Southern California School of Pharmacy, 2005. p. 40.
