MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
SANTA GASPARAVIČIŪTĖ
Lietuvos natūraliose augavietėse augančių rykštenės
(Solidago L.) rūšių fenolinių junginių įvairavimo
tyrimai spektrofotometriniu metodu
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Rūta Marksienė
KAUNAS
2017
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas:
Prof., dr. Vitalis Briedis
Data
Lietuvos natūraliose augavietėse augančių rykštenės (Solidago L.) rūšių
fenolinių junginių įvairavimo tyrimai spektrofotometriniu metodu
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Rūta Marksienė
Data
Recenzentas:
Parašas
Data
Darbą atliko:
Magistrantė
Santa Gasparavičiūtė
Data
KAUNAS
2017
TURINYS
SANTRAUKA ...6 SUMMARY ...8 SANTRUMPOS ...11 1. ĮVADAS ...12 2. LITERATŪROS APŽVALGA ...132.1 Paprastųjų rykštenių charakteristika ...13
2.2 Rykštenių (Solidago L.) cheminė sudėtis ...14
2.3 Solidago niederederi Khek charakteristika ...15
2.4Paprastųjų rykštenių (Solidago virgaurea L.) farmakologinės savybės ...16
2.4.1 Antimikrobinis poveikis. ... 16 2.4.2 Priešgrybelinis poveikis. ... 16 2.4.3 Antinavikinis poveikis... 16 2.4.4 Dalyvauja adipogenezėje. ...16 2.4.5 Priešuždegiminis poveikis. ... 16 2.4.6 Antioksidacinis poveikis. ... 17 2.4.7 Diurezinis poveikis. ... 17
2.4.8 Inkstų akmenligės gydymas. ... 17
2.5 Fenoliniai junginiai ...17
2.5.1 Fenolinių junginių struktūra ...17
2.6 Flavonoidai ...18
2.7 Fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymo metodai ...19
2.7.1 Spektrofotometriniai metodai ... 20
2.7.2 Reakcija su Folin – Ciocalteu regentu ... 20
2.7.3 Berlyno mėlio susidarymo metodas ... 20
2.7.4 Reakcija su aliuminio (III) chloridu ... 20
2.7.6 Dujų chromatografija (DC) ... 21
2.7.7 Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) ... 21
2.8 Augaliniai rykštenių preparatai ...22
3. TYRIMO METODIKA ...23
3.1 Tyrimo objektas ...23
3.2Reagentai ...23
3.3 Aparatūra ...23
3.4 Tiriamo pavyzdžio ruošimas ...24
3.5 Spekrofotometriniai metodai ...24
3.5.1 Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu ... 24
3.5.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 25
3.6 Statistinė duomenų analizė ...26
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ...27
4.1 Spektrofotometrinės analizės rezultatai ...27
4.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas S. virgaurea L. ir Solidago niederederi Khek lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 27
4.1.2 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 28
4.1.3 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas S. virgaurea L. lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 29
4.1.4 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas S. niederederi Khek lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 30
4.1.5 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose ir žieduose spektrofotometriniu metodu ... 31
4.1.6 Bendras flavonoidų nustatymas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 32
4.1.7 Bendras flavonoidų nustatymas S. virgaurea L. ir Solidago niederederi Khek žiedų ekstraktuose
skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 33
4.1.8 Bendras flavonoidų nustatymas Solidago virgaurea L. lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 34
4.1.9 Bendras flavonoidų nustatymas Solidago niederederi L. lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ... 35
4.1.10 Bendras flavonoidų kiekis nustatytas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose ir žieduose spektrofotometriniu metodu ... 36
4.2 Rezultatų apibendrinimas ...38
5. IŠVADOS ...39
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ...40
SANTRAUKA
S. Gasparavičiūtės magistro darbas „Natūraliose augavietėse augančių rykštenės (Solidago L.) rūšių fenolinių junginių įvairavimo tyrimai spektrofotometriniu metodu“, mokslinė vadovė Doc. Dr. R. Marksienė, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas, 2017.
Raktiniai žodžiai: rykštenė, hibridas, spekrofotomerija, fenoliniai junginiai, flavonoidai. Tikslas: Nustatyti rykštenės (Solidago L.) kaupiamų fenolinių junginių kiekį naudojant
spektrofotometrijos metodą.
Uždaviniai: 1. Parinkti tinkamas ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių išgavimui iš augalinės
žaliavos. 2. Nustatyti Solidago virgaurea L. lapų ir žiedų fenolinių junginių įvairavimą skirtingose augimo vietose spektrofotometriniu metodu. 3. Įvertinti Solidago niederederi Khek lapų ir žiedų fenolinių junginių įvairavimą skirtingose augimo vietose spektrofotometriniu metodu. 4. Nustatyti Solidago L. bendrą flavonoidų kiekį aliuminio (III) chloridu, spektrofotometriniu metodu.
Tyrimo metodika: Rykštenės rūšių (Solidago L. ir S. niederederi Khek) lapų ir žiedų ekstraktai
ruošiami susmulkintą žaliavą užpilant 70 proc. V/V etanolio ir ekstrahuojant ultragarso vonelėje 50 minučių kambario temperatūroje. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu metodu, naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatus apskaičiuojant remiantis galo rūgšties kalibraciniu grafiku mg/g. Bendras flavanoidų kiekis nustatytas aliuminio (III) chloridu reakcija spektrofotometriniu metodu, rezultatai apskaičiuoti ir išreikšti rutino ekvivalentu mg/g.
Rezultatai ir išvados: S. niederederi Khek lapų augalinėje žaliavoje daugiausiai fenolinių
junginių nustatyta Vilniaus rajone, Karklinėje (1935,87 GRE mg/g), mažiau fenolinių junginių nustatyta Vilniaus mieste, Versmių gatvėje (1922,64 GRE mg/g). Solidago virgaurea L. lapų augalinėje žaliavoje didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas taip pat Karklinėje (1733,51 GRE mg/g). S. Virgaurea L. žiedai augę Vilniaus rajone, Raguvėlėje pasižymi didžiausia fenolinių junginių gausa (1576,09 GRE mg/g). Mažiausiai fenolinių junginių nustatyta S. niederederi Khek žiedų ekstrakte (772,99 GRE mg/g), Raguvėlėje. Daugiausiai flavonoidų nustatyta rykštenių hibrido lapuose surinktuose šiauriausioje Vilniaus rajono dalyje – Karklinėje (212,04 RE mg/g).
Mažiausiai flavonoidų rykštenių hibrido lapai sukaupė augdami Vilniaus mieste, Kalno gatvėje (82,51 RE mg/g). Solidago virgaurea L. lapai daugiausiai flavonoidų sukaupė augdami Vilniaus rajone, Raguvėlėje (64,24 RE mg/g), mažiausiai Vilniaus mieste, Kalno gatvėje (24,19 RE mg/g). Daugiausiai flavonoidų nustatyta paprastųjų rykštenių žiedų augalinėje žaliavoje (101,00 RE mg/g) augusioje
pietiniame Vilniaus miesto regione, Kalno gatvėje, o mažiausiai šiauriausioje dalyje, Karklinėje (45,11 RE mg/g). Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p=0,025).
SUMMARY
S. Gasparavičiūtė master‘s thesis „Goldenrod (Solidago L.) species' Naturally occuring in Lithuania quantitative variability of phenolic compounds research using spectrophotometric method“, scient manager doc. dr. R. Marksienė; Lithuanian University of Health Science, Medical Academy, Faculty of Farmacy, Department of Analytical and Toxicology Chemistry – Kaunas, 2017.
Keywords: Goldenrod, hybrid, spectrophotometry, phenolic compounds, flavonoids.
The object of the research: extracts of Goldenrod (Solidago virgaurea L.) and Goldenrod
hybrid (Solidago niederederi Khek) leaves and flowers. Spectrophotometric method was used for the quantitive determination of phenolic compounds and flavonoids in the research.
The aim: Determine quantitative composition of phenolic comounds in Solidago L. using
spectrophotometry method.
The tasks: 1. Choosing appropriate conditions for the extraction of phenolic compounds from
the raw materials. 2. Identify phenolics variation of Solidago virgaurea L. leaves and flowers in different growth areas. 3. Value total phenolics variation of Solidago niederederi Khek leaves and flowers using spectrofotometric method. 4. Value total amount of flavonoids of Solidago L. leaves and flowers using aluminum chloride, spectrophotometric method.
Methodology: extracts of goldenrod species (Solidago virgaurea L. and Solidago niederederi
Khek) leaves and flowers prepared chopped material poured with 70 % v/v ethanol and extrahated in ultrasonic bath for 50 minutes at room temperature. Total amount of phenolic compounds were valued by spectrophotometry using Folin – Ciocalteu reagent, calculation of results based on gallic acid calibration curve mg/g. Total amount of flavonoids were valued by spectrophotometry, results calculated and expressed in equivalent of rutin mg/g.
Results of the study: The highest content of total phenolic compounds in S. niederederi Khek
leaf were determined Vilnius region, Karklinė (GRE 1935.87 mg/g), less phenolic compounds found in Vilnius, Versmių Street (GRE 1922.64 mg/g). The maximum amount of phenolic compounds in Solidago virgaurea L. are also determined in Karklinė (GRE 1733.51 mg/g). S. virgaurea L. flowers in Vilnius region, Raguvėlė provide the greatest amount of phenolics (GRE 1576.09 mg/g). At least phenolics found in S. niederederi Khek flower extract (GRE 772.99 mg/g) Raguvėlė. Most flavonoids found in hybrid leaves, collected in the northernmost district of Vilnius - Karklinėje (RE 212.04 mg/g).
At least flavonoids found in hybrid leaves, Vilnius, Kalno Street (RE 82.51 mg/g). The highest content of flavonoids Solidago virgaurea L. leaves were determined in Vilnius region, Raguvėlė (RE 64.24 mg/g), at least in Vilnius, Kalno Street (RE 24.19 mg/g). The maximum amount of flavonoids in hybrid flowers (RE 101.00 mg/g) are determined in the southern city of Vilnius region, kalno Street, and at least northernmost part Karklinėje (RE 45.11 mg/g). This difference is statistically significant (p=0.025).
PADĖKA
Dėkoju už rykštenių hibrido augalinę žaliavą, kuri buvo gauta 2013 – 2015 m. LMT finansuojamo projekto, Nr. MIP – 50/2013.
SANTRUMPOS
ESC efektyvioji skysčių chromatografijaDC dujų chromatografija GRE galo rūgšties ekvivalentas RE rutino ekvivalentas
1. ĮVADAS
Jau kelis dešimtmečius visame pasaulyje didėja susidomėjimas vaistiniais augalais ir jų farmakologinėmis savybėmis. Vis plačiau yra tyrinėjamos vaistiniuose augaluose kaupiamos biologinės medžiagos, jų nustatymas, išgavimas ir pritaikymas preparatų gamyboje.
Fenoliniai junginiai – viena plačiausių ir labiausiai nagrinėjamų junginių grupė, kuri pasižymi antioksidacinėmis savybėmis [1]. Dėl laisvųjų radikalų poveikio organizmo ląstelėms išsivysto širdies ligos, vėžiniai susirgimai ir kiti organų sistemų sutrikimai. Moksliniais tyrimais įrodyta, kad fenoliniai junginiai apsaugo žmogaus organizmą nuo laisvųjų radikalų poveikio [2]. Dėl šių priežaščių mokslininkai ieško ir tiria fenolinių junginių gausa pasižyminčias augalines žaliavas. Jų kokybei ir kiekybei ištirti naudojami įvairūs analizės metodai – efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, plonasluoksnė chromatografija, spektrofotometrija.
Šio darbo tyrimo objektas – paprastųjų rykštenių (Solidago virgaurea L.) ir rykštenių hibrido (Solidago x niederederi Khek) augalinė žaliava. Abi rūšys priklauso astrinių (Asteraceae) šeimai, augalai kaupia eterinius aliejus, saponinus, fenolinius junginius, flavonoidus, taninus [3][4]. Paprastoji rykštenė (Solidago virgaurea L.) auganti natūraliose Lietuvos augavietėse yra fenolinių junginių šaltinis bei pasižymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu. Rykštenių hibridas (Solidago niederederi Khek) Lietuvoje rastas Vilniaus mieste ir jo apylinkėse tik 2013 metais [5]. Išnagrinėjus atliktus tyrimus nustatyta, kad augalai pasižymi priešuždegiminiu, spazmolitiniu, antimikrobiniu, antinavikiniu, priešgrybeliniu poveikiu [3][6][7][8][1]. Sukelia diurezę, kurią nulemia saponinai bei flavonoidai [3]. Šios savybės yra svarbios kuriant preparatus iš vaistinės augalinės medžiagos. Iš Solidago L. rūšies augalų gaminami homeopatiniai preparatai bei maisto papildai. Preparatų formos įvairios – geriamieji lašai, sirupai, tabletės, kapsulės, arbatos.
Darbo naujumas ir aktualumas - paprastųjų rykštenių (S. virgaurea L.) augalinė žaliava yra plačiai išanalizuota, atlikti įvairūs tyrimai, išnagrinėtos augalo savybės, cheminė sudėtis, tačiau nėra atlikta tyrimų nustatančių fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį rykštenių hibrido (Solidago niederederi Khek) žiedų ir lapų augalinėje žaliavoje. Vieninteliai duomenys Lietuvoje apie Solidago niederederi Khek yra žinomi iš Birutės Karpavičienės ir Jolitos Radušienės 2014 metais atlikto tyrimo [5]. Todėl yra aktualu atlikti daugiau tyrimų su šia rūšimi, nustatyti kaupiamų aktyvių junginių kiekį ir palyginti su kitomis Solidago L. rūšimis. Gauta informacija gali būti panaudota kuriant ir gaminant vaistinius augalinius preparatus iš augalinės žaliavos.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1 Paprastųjų rykštenių charakteristika
1 pav. Paprastoji rykštenė (Solidago virgaurea L.)
Rykštenė (Solidago L.) – natūraliai augantis augalas plačiai paplitęs Šiaurės Amerikoje, Europoje ir Azijoje. Rykštenės priklauso astrinių (Asteraceae) šeimai, žinoma 120 rykštenės augalų rūšių [9]. Lietuvoje natūraliai paplitusi yra paprastoji rykštenė (Solidago virgaurea L.), be jos dažnai auginamos ir neretai sulaukėja bei savaime plinta kanadinės ir vėlyvosios rykštenės kilusios iš Šiaurės Amerikos [10]. Jau senovėje žmonės rykštenės žolę naudojo gydyti šlapimo takų ligas, prostatos sutrikimams bei inkstų akmenligei, o žiedai buvo naudojami kaip natūralūs geltoni dažai [3]. Atlikti tyrimai įrodo, jog diuretinį, detoksikuojantį, priešuždegiminį, tulžies sekreciją veikiantį poveikį nulemia gausybė augale kaupiamų aktyvių junginių, tokių kaip flavonoidai, polifenolinės rūgštys, saponinai, triterpenai ir eteriniai aliejai [11]. Naudingiausiais yra laikomi fenoliniai junginiai, kurie kaip ir manoma nulemia rykštenės farmakologinį poveikį [3][11].
Rykštenės užauga iki 1 m aukščio, stiebas žalsvai geltonos arba žalsvai rudos spalvos, šiek tiek su rausvu atspalviu, apatinė dalis lygi, o viršutinė šiek tiek apaugusi plaukeliais. Lapai žali, lancetiški, dantytais kraštais, maždaug 8-12 cm ilgio ir apie 1-3 cm pločio. Žiedyną sudaro geltoni graižai, kurie susitelkę žiedų viršūnėse ir sudaro savotiškas piramidės formos šluoteles. Šaknys cilindro formos, gumbuotos ir auga horizontaliai. Augalas dauginasi sėklomis ir šakniastiebiais. Žydi liepos – rugsėjo mėnesiais, sėklas subrandina rugsėjį. [12]. Augalo skonis apibūdinamas kaip rūgštus ir kartus [11]. Rykštenės nėra labai reiklūs augalai, jos gali augti įvairaus rūgštingumo dirvožėmyje, tiek saulėtose vietose tiek daliniame pavėsyje. Todėl gali būti aptinkamos pievose, miškuose, šlaituose, krūmuose. Rykštenė gali būti auginama ir kaip dekoratyvinis augalas [10].
2.2 Rykštenių (Solidago L.) cheminė sudėtis
Rykštenėse randama 0,4 – 0,5% eterinių aliejų (iš jų 40 – 46% sudaro x-kadinenas, aptinkama ir borneolio, bornilacetato, kadinolio, β-kariofileno, pineno, limoneno ir kt.), 0,2 – 0,3% di- ir tri- terpeninių saponinų, apie 1,5% flavonoidų, 0,2 – 1% (S. virgaurea L. - 1,5%), fenolio darinių, 10% taninų, rutino, chlorogeninės rūgšties, polisacharidų [4].
Tyrimais įrodyta, jog rykštenių augalinėje žaliavoje daugiausiai kaupiamų junginių yra taninai, flavonoidai ir fenoliniai junginiai [3]. (1 lentelė)
1 lentelė. Rykštenės žaliavoje vyraujantys junginiai.
Junginio pavadinimas Struktūra
Chlorogeno rūgštis
Rutinas
Kvercitinas
Izokvercitinas
2.3 Solidago niederederi Khek charakteristika
Šis natūralus rykštenių hibridas buvo atrastas 20 – ojo amžiaus pradžioje Austrijoje (Khek 1905) ir aprašytas Eugen‘o Khek‘o. Solidago niederederi Khek apibūdinamas kaip invazinės kanadinių rykštenių (S. Canadensis L.) ir natyvinių paprastųjų rykštenių (S. Virgaurea L.) natūraliai augantis hibridas [13]. Augalo apibūdinimą papildė Nilsson‘as (1976), kuris hibridą atrado Švedijoje ir Danijoje. Europoje Solidago niederederi Khek paplitęs septyniose šalyse: Austrija, Danija, Švedija, Norvegija, Jungtinė Karalystė, Vokietija ir Lenkija [14]. Natūraliai randamas kartu su motininėmis rūšimis (2 lentelė). Daugiau ar mažiau šis hibridas morfologiškai yra panašus į savo pirmtakus, ypač lapų forma, gyslotumu. Išsiskiria mažesniu žiedadulkių kiekiu ir subrandina tik kelis lukštavaisius [15]. Nors tarprūšinė hibridizacija rykštenių gentyje yra gana paplitusi, tačiau iki šiol Solidago niederederi Khek giminingumas nebuvo įrodytas molekuliniais metodais. 2016 metais lenkų mokslininkai Artur Pliszko ir Joanna Zalewska-Gałosz atliko tyrimą pasitelkdami polimorfizmo modelį išreikšta ITS sekomis ir remiantis cpDNA rpl32-trnL lokuso kintamumu įrodė, kad natūraliose populiacijose hibridizacija vyksta abiejomis kryptimis [13].
Lietuvoje paprastųjų ir kanadinių rykštenių hibridas pirmą kartą aptiktas Vilniaus miesto apylinkėse 2013 metais [5]. Solidago niederederi Khek Lietuvoje yra labai mažai tyrinėtos, vieninteliai turimi duomenys yra gauti iš Birutės Karpavičienės ir Jolitos Radušienės atlikto tyrimo, todėl yra tikslinga atlikti išsamią šios rūšies analizę, ją palyginti su kitomis natūraliai augančiomis rykštenėmis bei jų kaupiamomis veikliosiomis medžiagomis.
2 lentelė. Rykštenės rūšių (S. canadensis L., S. virgaurea L., Solidago niederederi Khek) morfologinis palyginimas.
S. canadensis L. S. virgaurea L. Solidago niederederi Khek Stiebai telkiasi į krūmą ,
viršūtinėje dalyje padengtas plaukeliais, žalsvos spalvos, stačias, apie 1,5 – 2,0 m aukščio;
lapai lancetiški, su viena pora šoninių gyslų, ant stiebo paraleliškai išsidėstę;
stiebas vienas, beveik lygus, nuožulniai stačias, rausvos spalvos, apie 0,5 – 1,0 m aukščio;
lapai lancetiški, su daug trumpų šoninių gyslų;
Stiebai telkiasi į krūmą, viršūtinėje dalyje padengtas plaukeliais, žalsvos ar švelniai rusvos spalvos, nuožulniai stačias, apie 1,2 – 1,5 m aukščio;
lapai lancetiški, pailgi, daug;
2.4
Paprastųjų rykštenių (Solidago virgaurea L.) farmakologinės savybės
2.4.1 Antimikrobinis poveikis. paprastųjų rykštenių metanoliniai ir heksano ekstraktai
pasižymi didesniu antibakteriniu poveikiu prieš gram – teigiamas bakterijas (Staphylococcus aureus, Staphylococcus faecalis, Bacillus subtilis) negu prieš gram – neigiamas (Escherichia coli, Klebisiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) [3][6][1].
2.4.2 Priešgrybelinis poveikis. mikrobiologiniais tyrimais įrodytas rykštenės slopinamasis
poveikis prieš Candida albicans grybelį. Vandeniniame augalo ekstrakte esantys saponinai slopina mielių siūlinių gijų bei bioplėvelės formavimąsį [16][7].
2.4.3 Antinavikinis poveikis. Paprastųjų rykštenių (S. Virgaurea L.) ekstraktai pasižymi stipriu
citotoksiniu poveikiu prieš įvairias navikines ląsteles: prostatos, krūties, melanomos, plaučių karcinomos. Aktyvūs komponentai aptinkami augalo lapuose: α – tokoferolio kvinonas, trans – fitolis ir 2 – metoksibenzil – 2,6 – dimetoksibenzoatas [8].
2.4.4 Dalyvauja adipogenezėje
.
Naujausiais tyrimais įrodyta, kad rykštenė dalyvauja riebalųapykaitoje. Paprastųjų rykštenių etanolinis žolės ekstraktas slopina adipogenezę 3T3-L1 adipocitų ląstelėse [17].
2.4.5 Priešuždegiminis poveikis. S. virgaurea L. etanoliniai ir metanoliniai vandeniai
ekstraktai pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, kadangi ten gausu fenolinių darinių. Šis poveikis yra įrodytas in vivo ir in vitro tyrimais. Naujausias tyrimas atliktas su laboratorinėmis pelėmis, kurios buvo
suskirstytos į tris grupes: 1 – leidžiamas indometacinas (10mg/kg), 2 – etilaceto/n-butanolio frakcija, 3 – junginiai išskirti iš paprastųjų rykštenių ekstrakto. Iš S. virgaurea L. ekstrakto išskirti fenoliniai junginiai pasižymėjo nepaprastai dideliu priešuždegiminiu poveikiu lyginant su įprastu antiuždegiminiu preparatu (indometacinu) [18].
2.4.6 Antioksidacinis poveikis. Metanoliniai ir vandeniniai paprastųjų rykštenių ekstraktai
pasižymi antioksidaciniu poveikiu, stipresnis antioksidacinis veikimas pastebėtas metanoliniuose ekstraktuose [19]. Atlikus instrumentinės analizės tyrimus buvo pastebėta atvirkštinė priklausomybė tarp su maistu suvartojamų antioksidantų ir žmonių sergamumu įvairiomis ligomis. Šis augalas kaupia tiek polinius ir nepolinius antioksidantinius junginius, todėl įvardijamas kaip natūralus antioksidantų šaltinis [3].
2.4.7 Diurezinis poveikis. Rykštenės atpalaiduoja spazmus ir mažina skausmą [11]. Vienas
atliktas tyrimas įrodė rykštenių naudą šlapimo takų infekcijų gydyme. Tiriamųjų grupei kartu su antibiotikais vartojusiai rykštenės preparatą, mažiau pasireiškė pakartotinas šlapimo takų uždegimas [20].
2.4.8 Inkstų akmenligės gydymas. Dėl rykštenėje kaupiamų flavanoidų, konkrečiai
kvercetino, palengvinamas vandens pertekliaus pašalinimas iš organizmo, padidinant šlapimo tekėjimą per inkstus ir šlapimo pūslę. Tokiu būdu inkstai yra valomi ir taip padedama pašalinti susikaupųsį smėlį, kuris po kiek laiko gali išsivystyti į inkstų akmenis [19].
2.5 Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai apibūdinami kaip augalų antriniai metabolitai, kurie susidaro iš pentozės fosfato, šikimato, fenilpropanoido. Šie junginiai yra labai svarbūs augalų augime ir reprodukcijoje, suteikia apsaugą prieš patogenus, kenkėjus, ligų sukelėjus, plėšrūnus [21]. Pastaruoju metu atlikti antoksidaciniai tyrimai patvirtina, jog fenoliniai junginiai gauti iš augalų yra daug efektyvesni antioksidantai in vitro negu vitaminai E ar C, gauti iš vaisių, daržovių ar raudono vyno, todėl galima manyti, jog toks poveikis pasireikš ir in vivo [22]. Fenoliniai junginiai dalyvauja žalingų procesų neutralizavime žmogaus organizme [23]. Daugelis šių junginių tiesiogiai suriša žalingus O2 •-, HO• ,ROO• ir NO• radikalus, kurie yra aptinkami biologinėse sistemose [9]. Į fenolinių junginių grupę įeina – fenolinės rūgštys, flavanoidai, kvinonai, kumarinai, lignanai, stilbenai ir taninai [20].
2.5.1 Fenolinių junginių struktūra
Struktūriškai fenoliniai junginiai yra sudaryti iš aromatinio žiedo, prie kurio yra prisijungusios viena ar daugiau hidroksilo grupių. Fenolinių junginių molekulės varijuoja nuo paprastų iki stipriai
polimerizuotų darinių, dažnai vadinamų „polifenoliais“ [21][20]. Lentelėje nurodytos fenolinių junginių klasės (3 lentelė). Flavonoidai ir taninai yra laikomi pagrindiniais polifenoliais gaunamais iš maisto produktų (vaisių, daržovių).
3 lentelė. Fenolinių junginių klasės ir jų struktūra.
Klasė Struktūra
Paprastieji fenoliai, benzokvinonai C6
Hidroksibenzoinės rūgštys C6-C1
Acetofenonai, fenilacetinės rūgštys C6-C2 Hidroksicinamoninės rūgštys, fenilpropanoidai
(kumarinai, izokumarinai, chromonai, chromenai) C6-C3 Naftochinonai C6-C4 Ksantonai C6-C1-C6 Stilbenai, antrachinonai C6-C2-C6 Flavonoidai, izoflavonoidai C6-C3-C6 Lignanai, neolignanai (C6− C3)2 Biflavonoidai (C6− C3 − C6)2 Ligninai (C6− C3)n Kondensuoti taninai (C6− C3 − C6)n
2.6 Flavonoidai
Flavonoidai apibūdinami kaip mažos molekulinės masės junginiai, sudaryti iš penkiolikos anglies atomų (C6-C3-C6). Paprastai flavonoidų struktūra susideda iš dvieju aromatinių žiedų A ir B, sujungtų trijų anglies atomų, kurie dažniausiai yra susijungę į heterociklinį žiedą C, dėl to gali sugerti šviesą UV spektro dalyje [24]. (3 pav.) Ši savybė panaudojama nustatant fenoliniu junginių bei flavonoidų kiekį [25]. Aromatinis žiedas A gaunamas acetato/malonato metaboliniu keliu, o B žiedas gaunamas iš fenilalanino. C žiedo varijacijos nulemia flavonoidų grupę: flavonoliai (kvercetinas ir kampferolis), flavonai (luteolinas, apigeninas ir chrizinas), flavanonai, flavanoliai (katechinas), isoflavonai (genisteinas), flavanonoliai ir antocianidinai [21][21] [26].
Augaluose flavonoidai dalyvauja žiedų ir sėklų pigmentacijoje, vaidina svarbų vaidmenį augalų reprodukcijoje ir apsauginėse reakcijose nuo abiotinio streso (UV šviesos) ar biotinio streso tokio kaip plėšrūnai ir patogenai [27].
3 pav. Flavonoidų struktūrinė formulė.
2.7 Fenolinių junginių ir flavonoidų nustatymo metodai
Norint nustatyti fenolinių junginių kiekybinį ir kokybinį įvairavimą privaloma pasiruošti augalinės žaliavos ekstraktus. Tiriamos medžiagos gali būti ektrahuojamos iš šviežios, šaldytos ar džiovintos augalinės žaliavos, kuri po to dažniausiai yra smulkinama arba malama, tokiu būdu manoma, kad tirpiklis/ekstrahentas geriau prasiskverbia ir efektyviau vyksta ekstrakcija [28]. Metodų, kaip iškirti fenolinius junginius yra daug ir įvairių, tačiau dažniausiai naudojamas metodas su organiniais arba neorganiais tirpikliais. Ekstrakcijos greitis ir efektyvumas priklauso nuo laiko, temperatūros, tirpiklio ir mėginio fizikocheminių savybių, pakartojimų skaičiaus, augalinės žaliavos kaupiamų aktyvių junginių. Svarbus žingsnis yra tirpiklio parinkimas, dažniausiai naudojami: vanduo, acetonas, etiloacetatas, alkoholiai (metanolis, etanolis ir propanolis) ir jų mišiniai [29].
Junginių ekstrakcijos būdų yra labai daug, tradiciniai ir ankščiau dažnai naudoti yra Soksleto metodas ir maceracija. Šių metodų pagrindiniai privalumai: trumpas ekstrakcijos laikas, mažos tirpiklio sąnaudos [30]. Tačiau jie yra mažai efektyvūs, todėl atrasti ir ištobulinti nauji metodai: ultragarsas (UAE - ultrasound-assisted extraction), mikrobangos (MAE – microwave-assisted extraction), superkritinių skysčių ekstrakcija (SFE – supercritical fluid extraction), subkritinio vandens ekstrakcija (SCWE – sub-critical water extraction) ir aukšto hidrostatinio slėgio skysčių ekstrakcija (HHPP – high hydrostatic pressure processing). Šie metodai žymiai sutrumpina ekstrakcijos laiką, sumažina teršalų skleidimą ir yra paprasti atlikti [31].
Fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybiniam nustatymui naudojama daug įvairių metodų ir jų variacijų. Populiariausi ir dažniausiai naudojami yra efektyvios skysčių chromatografija (ESC), dujų
chromatografija (DC), jų kombinacijos su masių spekrometrija, kapiliarinės elektroforezės metodai, spektrofotometriniai metodai [32].
2.7.1 Spektrofotometriniai metodai
Dažniausiai bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti naudojami kolorimetriniai metodai: Folin- Ciocalteu ir Berlyno mėlio susidarymo metodas dėl jų paprastumo ir greitumo.
2.7.2 Reakcija su Folin – Ciocalteu regentu
Metodas yra paremtas chemine redukcija, kuri vyksta šarminėje terpėje, fenoliniai junginiai reaguoja su fosfovolframo ir fosfomolibdato rūgščių kompleksu. Šios reakcijos metu Folin – Ciocalteu reagento spalva kinta nuo geltonos iki mėlynos. Gautų ekstraktų absorbcija matuojama UV spektrofotometru, po 30 – 60 min. 750 nm šviesos bangos ilgyje. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas pagal galo rūgšties ekvivalentą [33]. Šis metodas nėra specifinis fenoliniams junginiams, juo galima nustatyti askorbo rūgštį, aromatinius aminus ir cukrus.
2.7.3 Berlyno mėlio susidarymo metodas
Naudojamas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti augalinėje žaliavoje. Jis paremtas
polifenolinių junginių reakcija rūgštinėje terpėje su kalioheksocianoferoatu ir geležies (III) chloridu. Augalinėje žaliavoje esantys polifenoliai reaguoja su geležies cianido jonu ir oksiduojasi, kai tuo tarpu geležies cianido jonas (𝐹𝑒(𝐶𝑁)63−) yra redukuojamas iki geležies cianido jonų (𝐹𝑒(𝐶𝑁)
64−). Tada 𝐹𝑒(𝐶𝑁)64− reaguojant su trivalentės geležies jonu susidaro Berlyno mėlynojo kompleksas (𝐹𝑒4−[𝐹𝑒(𝐶𝑁)6]3) [34]. Gauto tirpalo absorbcija matuojama 720 nm šviesos bangos ilgyje, UV-Vis spektrofotometru, fenolinių junginių koncentracija apskaičiuojama pagal tanino rūgšties standartą. Berlyno mėlio susidarymo metodas taip pat nėra selektyvus vien tik fenoliniams junginiams, nes trivalentę geležį gali redukuoti ir kitos medžiagos esančios tiriamojoje augalinėje žaliavoje, kurios turi oksidacinių – redukcinių savybių.
Bendram flavonoidų kiekiui augalinėje žaliavoje nustatyti naudojama reakcija su aliuminio (III) chloridu ir reakcija su 2,4 – dinitrofenilhidrazinu.
2.7.4 Reakcija su aliuminio (III) chloridu
Metodas pagrįstas flavonoido ir aliuminio komplekso susidarymu rūgštinėje terpėje. 𝐴𝑙𝐶𝑙3 sudaro stabilius ryšius su C-4 keto grupe ir C-3 bei C-5 hidroksilo grupėmis esančiomis flavonoiduose. Atsižvelgiant į taikomą metodiką, absorbcija yra matuojama pasirinktame šviesos bangų ilgio intervale,
flavonoidų koncentracija išreiškiama rutino, kvercetino, galo rūgšties ar kitos medžiagos ekvivalentu [35].
2.7.5 Reakcija su 2,4 – dinitrofenilhidrazinu (DNPH)
Metodas pagrįstas 2,4 – dinitrofenilhidrazono susidarymu, reaguojant 2,4 –
dihidrofenilhidrazinui su aldehidinėmis ir ketoninėmis grupėmis. Reakcija vykdoma rūgštinėje terpėje, gautą tirpalą kaitinant 50℃ temperatūroje 50 min., tirpalui atvėsus iki kambario temperatūros matuojama absorbcija 495 nm šviesos bangos ilgyje. Flavonoidų kiekis apskaičiuojamas sudarant standartinę kreivę [36][37].
2.7.6 Dujų chromatografija (DC)
Tai dar vienas metodas skirtas išskirti, identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti fenolinius junginius, kondensuotus taninus ir flavonoidus [38]. Pagrindinis dujų chromatografijos trūkumas yra tai, kad DC analizė nėra taikoma kartu su HPLC metodu dėl fenolinių junginių lakumo.
Lakiems junginiams sukurti naudojami kelių tipų reagentai. Pirmoji grupė: etilo ir metilo chloroformatas, diazometanas ir dimetil sulfoksidas kartu su metil jodatu naudojami sudaryti metil arba etil esterinius fenolius [39]. Kitą reagentų grupę sudaro trimetilsililo dariniai (trifluoroacetamidas, N – (tert-butikdimetilsilil)-N-metiltrifluoroacetamidas ir trimetilsililo junginiai) [33]. Ši sililatų reakcija yra paprasta, susidaro mažai pašalinių produktų ir susidaro daug lakių junginių, kurie netrukdo analizei [40]. Fenolinių junginių analizei dažniausiai naudojamos 30 m ilgio lydyto kvarco kolonėlės, kurių skersmuo 25 – 32 μm, o pastovios fazės dalelių dydis – 0,25 μm [41].
Dujų chromatografijos metodas tikslesnius duomenis suteikia, kai yra derinamas su masių spektrometrija. Atlikti tyrimai parodė, kad fenolinių junginių ir flavonoidų analizė efektyvesnė ją atlikus su DC – MS, negu su ESC [42][43]. Kinijoje buvo atliktas tyrimas, naudojant DC – MS metodą, kurio metu išskirti eterinių aliejų komponentai iš Solidago Canadensis L. Daugiausiai nustatyta germakryno D – 28,6 proc., borneolio acetato – 9,2 proc. ir limoneno – 5 proc. [44].
2.7.7 Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC)
ESC metodas taikomas fenolinių junginių tiek kiekybinei tiek kokybinei analizei. Metodo tikslumą veikia daug faktorių: mėginio grynumas, mobili fazė, kolonėlės tipas ir detektoriai [45]. Dažniausiai fenoliniai junginiai analizuojami tokiomis sąlygomis: naudojamas foto diodų matricos detektorius, chromatografinis skirstymas atliekamas naudojant atvirkštinių fazių C18 analitinę kolonėlė (RP-C18) su prieškolone, 25℃ temperatūroje, eliuentų sistema sudaryta iš polinių rūgščių organinių
tirpiklių [46]. Pietų Karolinos universitete buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo kiekybiškai ir kokybiškai įvertintos biologiškai aktyvios medžiagos kaupiamos Solidago virgaurea L. augalinėje medžiagoje – rutinas, kvercetinas, astragalinas, izokvercetinas, hiperozidas (sudaro 1,5 – 2,4 proc.), triterpeniniai saponinai (sudaro daugiau kaip 8 proc.) [47].
2.8 Augaliniai rykštenių preparatai
Ne tik Lietuvoje, bet ir kitose Europos šalyse yra gaminami augaliniai vaistiniai preparatai iš Solidago L. rūšies augalų. Pietryčių Vokietijoje įsikūrusi homeopatinių preparatų įmonė „PEKANA“, kuri gamina homeopatinius geriamuosius lašus „Akutur“, 30ml, kurių sudėtyje yra Solidago virgaurea augalinio ekstrakto. Preparatas vartojamas esant šlapimo sistemos sutrikimams. Čekijos farmacijos įmonė „Mediate“ gamina maisto papildą „APOTHEKE“ spanguolių ir paprastosios rykštenės sirupą. Preparato sudėtyje yra paprastųjų rykštenių stiebų ekstraktas (1g). Dar viena Čekijos farmacijos įmonė „WALMARK“ gamina gerai žinomus maisto papildus padedančius palaikyti normalią šlapimo sistemos, šlapimo pūslės ir apatinių šlapimo takų funkcijas – „Urinal“. Į jų sudėtį įeina paprastųjų rykštenių ekstraktas 10:1. Rykštenių augalinės žaliavos naudojamos arbatų gamyboje. Lietuvoje gaminama arbata „Diuretico“, UAB „Acorus Calamus“, kurios vaistažolių mišinyje yra paprastųjų rykštenių žolė.
3. TYRIMO METODIKA
3.1 Tyrimo objektas
Paprastosios rykštenės (Solidago virgaurea L.) ir (Solidago niederederi Khek) žiedai ir lapai kultivuojami trijose Vilniaus miesto ir dvejose Vilniaus rajono apylinkėse. Žaliavos rinkimo vietos:
1. Vilniaus miestas, Džiaugsmo gatvė (54° 54' 26", 25° 33' 40 (WGS)) 2. Vilniaus miestas, Kalno gatvė (54° 52' 27", 25° 30' 52 (WGS)) 3. Vilniaus miestas, Versmių gatvė (54° 42' 38", 25° 23' 29 (WGS)) 4. Vilniaus rajonas, Raguvėlė (54° 40' 35", 25° 23' 01 (WGS)) 5. Vilniaus rajomas, Karklinė (54° 40' 03", 25° 22' 58 (WGS))
Surinkti augalinės žaliavos žiedai ir lapai buvo laikomi kambario temperatūroje, gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugant žaliavą nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdžiovinti rykštenių žiedai ir lapai buvo laikomi popieriniuose maišeliuose, ne aukštesnėje kaip 25℃ temperatūroje, sausoje vietoje.
3.2
Reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”); Metanolis 99,8% (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija);
Natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Rutino reagentas (97,11%, “HWI ANALYTIK GMBH”); Etanolis 96% (Vilniaus degtinė);
Ledinė acto rūgštis (99,5% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Aliuminio chloridas (99,99% Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija); Heksametilentetraminas (≥99,9 %, Roth, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV);
3.3 Aparatūra
Paprastųjų rykštenių (Solidago virgaurea L.) ir hibrido (Solidago niederederi Khek) augalinės žaliavos ekstraktai buvo gaminami naudojant ultragarso vonelę (WiseClean). Bendras fenolinių
junginių, flavonoidų kiekis buvo nustatytas naudojant spektrofotometrą (Dynamica, HALO DB-20). Bandiniams tirti panaudotos 1 cm skersmens kiuvetės.
3.4 Tiriamo pavyzdžio ruošimas
Ekstraktai buvo ruošiami iš 0,05 g susmulkintų rykštenių žiedų ir lapų. Ekstrakcija vykdoma 50 min. su 10 ml, 70% (v/v) metanoliu vibracinėje vonioje. Gautas ekstraktas filtruojamas per 25 mm skermens, 0,22 mikrometrų porų dydžio švirkštų filtrus (Frisenette). Ekstraktai laikomi stikliniuose buteliukuose tolimesniems tyrimams.
3.5 Spekrofotometriniai metodai
3.5.1 Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu
Tyrimams atlikti paruošiamas darbinis reagentas: 7% natrio karbonato tirpalas paruošiamas 17,5 g medžiagos tirpinant 250 ml distiliuoto vandens. Analizei imamas 1 ml augalinės žaliavos metanolinio ekstrakto, kuris sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, 9 ml distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7% natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25 ml. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas 90 min. kambario temperatūroje, tamsoje. Po inkubacinio laikotarpio spektrofotometru matuojama tirpalo absorbcija 750 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai kartojami tris kartus.
Lyginamas tirpalas ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas, tačiau vietoje rykštenės augalinės žaliavos ekstrakto yra pilamas 1 ml distiliuoto vandens.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamieji tirpalai, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšties tirpalai. Naudojant galo rūgšties 70 proc. metanolinį tirpalą paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties tirpalai: 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ir 2,5 mg/ml (4 pav.).
Gauti duomenys vertinami pagal galo rūgšties kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį
y = 0,9068x + 0,0617; 𝑅2 = 0,996;
y = absorbcijos dydis;
4 pav. Galo rūgšties kalibracinis grafikas bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti.
3.5.2 Bendro flavonoidų kiekio, išreikšto rutino ekvivalentu, nustatymas spektrofotometriniu metodu
Tyrimui pirmiausia gaminamas reagentas iš 4 ml, 96% etanolio, 0,2 ml, 33% ledinės acto rūgšties, 0,8 ml, 5% heksametilentetramino (5g medžiagos tirpinami 100 ml distiliuoto vandens), 0,6 ml, 10% aliuminio chlorido (10 g aliuminio chlorido miltelių tirpinami 100 ml distiliuoto vandens), distiliuoto vandens ir 0,2 ml vaistinės augalinės žaliavo ekstrakto. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir paliekamas stovėti 30 min. kambario temperatūroje, tamsoje.
Lyginamasis tirpalas gaminamas taip pat, tik vietoje augalinio ekstrakto naudojamas 70% (v/v) etanolis.
Praėjus inkubaciniam laikotarpiui (30 min.) atliekami matavimai su spektrofotometru prie 407 nm bangos ilgio. Matavimai kartojami tris kartus.
Ruošiami skirtingų koncentracijų (0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 mg/ml) rutino tirpalai. Kalibracinis rutino grafikas sudaromas iš 5 skirtingų tirpalo koncentracijų (5 pav.).
Duomenys įvertinami pagal rytino kalibracinio grafiko tiesinės regresijos lygtį y = 0,9465x – 0,0950; 𝑅2 = 0,9960; y = absorbcijos dydis; 1.926 1.089 0.549 0.32 0.148 0.087 y = 0.9068x + 0.0617 R² = 0.996 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Op tin is tank is, A
x = bendras flavonoidų kiekis, išreikštas RE (rutino ekvivalentu) mg/ml.
5 pav. Rutino kalibracinė kreivė bendram flavonoidų kiekiui nustatyti.
3.6 Statistinė duomenų analizė
Gautų duomenų analizė atlikta „Microsof Office Excel 2015” (Microsoft, JAV), „SPSS 20“ (IBM, JAV) programinėmis įrangomis. Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, suvesti į duomenų bazę, statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, kai p<0,05.
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
Tyrimams buvo naudojami paprastųjų rykštenių (Solidago virgaurea L.) ir rykštenių hibrido (Solidago niederederi Khek) žydėjimo metu surinkti lapai ir žiedai iš skirtingų augimo vietų. Žaliavos buvo renkamos Vilniaus mieste ir rajone, kultivavimo vietos išskirtos į dvi šiaurines (Vilniaus raj. Raguvėlė, Vilniaus raj. Karklinė) ir tris pietines dalis (Vilniaus miestas Džiaugsmo g., Kalno g., Versmių g.).
4.1 Spektrofotometrinės analizės rezultatai
Spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami naudojant metanolinius (70%) (v/v) paprastųjų rykštenių (Solidago virgaurea L.) ir rykštenių hibrido (Solidago niederederi Khek) žiedų ir lapų ekstraktus. Tiriant ekstraktus buvo nustatytas bendras fenolinių junginių ir flavonoidų įvairavimas augalinėje žaliavoje. Bendras fenolinių junginių kiekis išreikštas galo rūgšties ekvivalentu GRE mg/g, o bendras flavonoidų kiekis išreikštas rutino ekvivalentu RE mg/g.
Tyrime analizuota šiauriniuose ir pietiniuose Vilniaus miesto ir rajono regionuose surinkta augalinė žaliava, iš kiekvieno regiono buvo rinkta po tris žaliavas, bandymai pakartoti tris kartus (n=3). Gautų rezultatų tarpusavo reikšmingumas buvo statistiškai įvertintas. Statistiškai reikšmingas skirtumas buvo laikomas, kai p<0,05. Gauti rezultatai pateikiami 6 - 15 paveiksluose.
4.1.1 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas S. virgaurea L. ir Solidago niederederi Khek lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Pagal galo rūgšties ekvivalentą apskaičiuotas bendras fenolinių junginių kiekis. Rezultatai vaizduojami 6 paveiksle. Iš sudarytos diagramos nustatyta, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis yra Solidago niederederi Khek lapuose, Karklinėje, šiauriausioje Vilniaus rajono dalyje (1935,87 GRE mg/g). Mažiau fenolinių junginių nustatyta Vilniaus mieste, Versmių gatvėje (1922,64 GRE mg/g). Solidago virgaurea L. lapų augalinėje žaliavoje didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas taip pat Karklinėje (1733,51 GRE mg/g). Mažiausias fenolinių junginių kiekis ivertintas tiek paprastųjų rykštenių (1413,96 GRE mg/g), tiek rykštenių hibrido (1386,41 GRE mg/g) augalinėje žaliavoje surinktoje pietinėje Vilniaus miesto dalyje. Galima teigti, kad skirtingose vietovėse surinkta lapų augalinė žaliava kaupia panašius fenolinių junginių kiekius, tačiau beveik visuose regionuose daugiau fenolinių junginių nustatoma rykštenių hibrido lapuose. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių nenustatyta, p>0,05.
6 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas (mg/g) paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3.
4.1.2 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Pagal gautus rezultatus išreikštus galo rūgšties ekvivalentu, nustatyta kad didžiausia fenolinių junginių gausa pasižymi S. virgaurea L. žiedai surinkti Vilniaus rajone, Raguvėlėje (1576,09 GRE mg/g). Mažiausiai fenolinių junginių nustatyta S. niederederi Khek žiedų ekstrakte (772,99 GRE mg/g), Raguvėlėje. Iš gautų duomenų nustatytas didelis skirtumas tarp tiriamų augalų rūšių kaupiamų fenolinių junginių kiekio. Paprastųjų rykštenių žiedų augalinėje žaliavoje fenolinių junginių kiekis svyruoja nuo 1279,17 GRE mg/g iki 1576,09 GRE mg/g. Raguvėlėje, Vilniaus rajone paprastųjų rykštenių žieduose nustatyta du kartus daugiau fenolinių junginių (1576,09 GRE mg/g) negu S. niederederi Khek žieduose (772,99 GRE mg/g). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių nenustatyta, p>0,05. (7 pav.)
1386.41 1515.16 1648.32 1563.96 1733.51 1413.98 1732.96 1922.64 1522.88 1935.87 0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Fe noli nių j ung ini ų kiekis GRE m g/g S. virgaurea S. niederederi
7 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas (mg/g) paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido žieduose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3.
4.1.3 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas S. virgaurea L. lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su paprastųjų rykštenių lapų ir žiedų ekstraktais gauti panašūs fenolinių junginių kiekiai. (8 pav.) Ryškiausias skirtumas matomas tarp Vilniaus rajone, Karklinėje surinktų augalinių žaliavų. Lapuose nustatyta 1733,51 GRE mg/g fenolinių junginių, o žieduose 1279,17 GRE mg/g. Kituose regijonuose nustatyti panašūs fenolinių junginių kiekiai, kurie svyruoja nuo 1380,00 GRE mg/g iki 1580,00 GRE mg/g. Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad paprastųjų rykštenių ir lapų ir žiedų augalinė žaliava yra vertinga fenolinių junginių išgavimui. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių, p>0,05.
1373.73 1377.59 1478.50 1576.09 1279.17 859.56 986.93 1053.93 772.99 1031.59 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 1600.00 1800.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Fe noli nių j ung ini ų kiekis GRE m g/g S. virgaurea S. niederederi
8 pav. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas (mg/g) paprastųjų rykštenių lapuose ir žieduose, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3.
4.1.4 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas S. niederederi Khek lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su rykštenių hibridu nustatyti dideli skirtumai tarp lapų ir žiedų kaupiamų fenolinių junginių kiekio, lapai kaupia nuo 1,5 iki 2 kartų daugiau nei žiedai. (9 pav.) Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta hibrido lapuose surinktuose šiaurinėje dalyje, Karklinėje (1935,87 GRE mg/g), mažiausiai fenolinių junginių nustatyta hibrido žieduose taip pat Karklinėje (1031,59 GRE mg/g), tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių nenustatyta, p>0,05. (9 pav.)
1386.41 1515.16 1648.32 1563.96 1733.51 1373.73 1377.59 1478.50 1576.09 1279.17 0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00 1200.00 1400.00 1600.00 1800.00 2000.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Fe noli nių j ung ini ų kiekis GRE m g/g Lapai Žiedai
9 pav. Suminio fenolinių junginių (mg/g) įvairavimas rykštenių hibrido lapuose ir žieduose, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3;
4.1.5 Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose ir žieduose spektrofotometriniu metodu
Įvertinus bendrą fenolinių junginių kiekį mg/g augalinėse žaliavose nustatyta, kad paprastųjų rykštenių žiedai kaupia pusantro karto didesnį fenolinių junginių kiekį - 7085,08 GRE mg/g, o rykštenių hibrido žieduose nustatyta 4705,01 GRE mg/g fenolinių junginių. Lapų augalinėje žaliavoje didesnis fenolinių junginių kiekis nustatytas S. niederederi Khek – 8528,34 GRE mg/g, o S. virgaurea L. lapuose nustatyta 7847,38 GRE mg/g fenolinių junginių. Rezultatai pavaizduoti 14 paveiksle.
1413.98 1732.96 1922.64 1522.88 1935.87 859.56 986.93 1053.93 772.99 1031.59 0.00 500.00 1000.00 1500.00 2000.00 2500.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Fe noli nių j ung ini ų kiekis GRE m g/g lapai žiedai
14 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis Solidago virgaurea ir Solidago niederederi lapų ir žiedų augalinėje žaliavoje, nustatytas spektrofotometriniu metodu.
4.1.6 Bendras flavonoidų nustatymas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Pagal rutiną išreikštas bendras flavonoidų kiekis, gauti rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle. Rykštenių hibrido lapuose nustatytas tris kartus didesnis už paprastųjų rykštenių flavonoidų kiekis. Daugiausiai flavonoidų nustatyta rykštenių hibrido lapuose surinktuose šiauriausioje Vilniaus rajono dalyje – Karklinėje (212,04 RE mg/g). Mažiau flavonoidų nustatyta hibrido lapuose, rinktuose pietiniame regijone (186,90 RE mg/g). Mažiausiai flavonoidų rykštenių hibrido lapai sukaupė augdami Vilniaus mieste, Kalno gatvėje (82,51 RE mg/g). Solidago virgaurea L. lapai daugiausiai flavonoidų sukaupė Vilniaus rajone, Raguvėlėje (64,24 RE mg/g), o mažiausiai Vilniaus mieste, Kalno gatvėje (24,19 RE mg/g). Bendras flavonoidų kiekis tarp rūšių skiriasi tris kartus, bet statistiškai šis skirtumas nėra reikšmingas, p>0,05. 7085.08 7847.38 4705.01 8528.34 0.00 2000.00 4000.00 6000.00 8000.00 10000.00 12000.00 Žiedai Lapai Fe noli nių j ung ini ų kiekis GRE m g/g
10 pav. Suminis flavonoidų įvairavimas (mg/g) paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3;
4.1.7 Bendras flavonoidų nustatymas S. virgaurea L. ir Solidago niederederi Khek žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Pagal gautus rezultatus (11 pav.) ir iš jų sudarytą diagramą nustatyta, kad flavonoidų daugiausiai sukaupta paprastųjų rykštenių žiedų augalinėje žaliavoje (101,00 RE mg/g) surinktoje pietiniame Vilniaus miesto regijone, Kalno gatvėje, o mažiausiai šiauriausioje dalyje, Karklinėje (45,11 RE mg/g). Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p=0,025). Rykštenių hibrido žiedų augalinėje žaliavoje daugiausiai flavonoidų nustatyta pietiniame Vilniaus miesto regijone, Versmių gatvėje (67,30 RE mg/g), o mažiausiai šiaurinėje dalyje, Raguvėlėje (32,22 RE mg/g). Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05. 24.30 24.19 24.83 64.24 36.56 121.92 82.51 186.90 124.56 212.04 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Flavonoidų kiekis R E mg /g S. Virgaurea S. Niederederi
11 pav. Suminis flavonoidų įvairavimas (mg/g) paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido žieduose taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3; *p<0,05 statistiškai reikšmingas skirtumas.
4.1.8 Bendras flavonoidų nustatymas Solidago virgaurea L. lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su paprastųjų rykštenių lapais ir žiedais, įvertinus duomenis matyti, kad dideli flavonoidų kiekio skirtumai pastebimi tik keliuose pietiniuose Vilniaus miesto regijonuose ir šie skirtumai nustatyti kaip statistiškai reikšmingais (p<0,05). Žieduose surinktuose Kalno gatvėje nustatyta penkis kartus didesnis falvonoidų kiekis negu lapuose (žieduose – 101,00 RE mg/g, o lapuose – 24,29 RE mg/g). Įvertinus gautus rezultatus, galima teigti, kad žiedai kaip flavonoidų šaltinis yra naudingesnė augalinė žaliava negu lapai.
48.71 101,00* 87.06 64.13 45.11 37.61 59.59 67.30 32.22 32,33* 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Flavonoidų kiekis R E mg /g S. Virgaurea S. Niederederi
12 pav. Suminis flavonoidų kiekis (mg/g) paprastųjų rykštenių lapuose ir žieduose, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3; *p<0,05 statistiškai reikšmingas skirtumas.
4.1.9 Bendras flavonoidų nustatymas Solidago niederederi L. lapų ir žiedų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Iš gautų duomenų sudarytų diagramų nustatyta, kad rykštenių hibrido lapų augalinė žaliava kaupia didesnį flavonuodų kiekį, žieduose nustatyta dvigubai ar net trigubai mažesnis flavonoidų kiekis. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas lapuose, surinktuose Vilniaus rajone, Karklinėje (212,04 RE mg/g), mažiausias flavonoidų kiekis nustatytas lapų augalinėje žaliavoje, surinktoje pietiniame regijone, Kalno gatvėje (82,51 RE mg/g). Žiedų augalinėje žaliavoje didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas Vilniaus mieste, Versmių gatvėje (67,30 RE mg/g), o mažiausiai nustatyta – 32,22 RE mg/g, Raguvėlėje, Vilniaus rajone. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių, p>0,05.
24,30 24,19* 24.83 64.24 36.56 48,71 101,00* 87,06 64,13 45,11 0.00 20.00 40.00 60.00 80.00 100.00 120.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g.
Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Flavonoidų kiekis R E mg /g Lapai Žiedai
13 pav. Suminis flavonoidų kiekis (mg/g) rykštenių hibrido lapuose ir žieduose, taikant spektrofotometrinį tyrimo metodą; n=3;
4.1.10 Bendras flavonoidų kiekis nustatytas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose ir žieduose spektrofotometriniu metodu
Įvertinus ir palyginus Solidago virgaurea L. ir Solidago niederederi Khek lapų ir žiedų augalinėse žaliavose kaupiamą flavonoidų kiekį nustatyta, kad paprastųjų rykštenių žieduose daugiau flavonoidų (346,01 RE mg/g) negu rykštenių hibrido žieduose (229,05 RE mg/g). Lapų augalinėje žaliavoje didesnis flavonoidų kiekis nustatytas rykštenių hibrido augalinėje žaliavoje – 727,95 RE mg/g. Paprastųjų rykštenių lapų augalinėje žaliavoje nustatytas keturis kartus mažesnis flavonoidų kiekis (174,12 RE mg/g) už rykštenių hibrido lapuose nustatytą flavonoidų kiekį.
121.92 82.51 186.90 124.56 212.04 37.61 59.59 67.30 32.22 32.33 0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 Vilnius Džiaugsmo g. Vilnius Rokantiškės, Kalno g. Vilnius Versmių g. Vilniaus r. Raguvėlė Vilniaus r. Karklinė Flavonoisų ki ekis R E mg /g lapai žiedai
15 pav. Bendras flavonoidų kiekis Solidago virgaurea ir Solidago niederederi žieduose ir lapuose, nustatytas spektrofotometriniu metodu.
346.01 174.12 229.05 727.95 0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00 600.00 700.00 800.00 900.00 Žiedai Lapai F lavo niudų kiekis R E mg /g
4.2 Rezultatų apibendrinimas
Įvertinus Solidago virgaurea L. ir Solidago niederederi Khek lapų augalinėje žaliavoje kaupiamą fenolinių junginių kiekį nustatyta, kad daugiausiai fenolinių junginių yra augalinėse žaliavose augusiose Vilniaus rajone, Karklinėje (šiauriausias regionas): paprastųjų rykštenių lapuose - 1733.51 GRE mg/g, rykštenių hibrido lapuose - 1935.87 GRE mg/g, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių nėra, p>0,05.
Palyginus paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido žiedų augalinėje žaliavoje kaupiamą fenolinių junginių kiekį nustatyta, kad daugiausiai fenolinių junginių yra paprastųjų rykštenių žiedų augalinėje žaliavoje rinktoje Vilniaus rajone, Raguvėlėje (šiauriausias regionas) - 1576.09 GRE mg/g, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių nenustatyta, p>0,05.
Įvertinus Solidago virgaurea L. lapuose ir žieduose kaupiamą fenolinių junginių kiekį galima teigti, jog abi žaliavos kaupia panašų fenolinių junginių kiekį, kiekviename regione skirtumas tarp lapų ir žiedų svyruoja nuo 10 iki 13 proc. Ištyrus Solidago niederederi Khek lapų ir žiedų augalines žaliavas nustatyta, kad lapuose kaupiama nuo pusantro iki dviejų kartų daugiau fenolinių junginių. Nustatytas bendras fenolinių junginių kiekis paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose ir žieduose. Gauti rezultatai parodė, kad Solidago virgaurea L. žieduose nustaytas pusantro karto didesnis fenolinių junginių kiekis nei Solidago niederederi Khek. Paprastųjų rykštenių lapuose nustayta 9 proc. mažesnis fenolinių junginių kiekis.
Nustatytas ir palygintas flavonoidų kiekis paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapuose. Daugiausiai flavonoidų nustatyta rykštenių hibrido lapuose surinktuose šiauriausioje Vilniaus rajono dalyje – Karklinėje (212,04 RE mg/g). Solidago virgaurea L. lapuose visuose regionuose flavonoidų kiekis mažesnis iki septinių kartų. Statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta, p>0,05. Tiriant žiedų augalinę žaliavą buvo nustatyta , jog daugiausiai flavonoidų sukaupta paprastųjų rykštenių žiedų augalinėje žaliavoje (101,00 RE mg/g) surinktoje pietiniame Vilniaus miesto regione, Kalno gatvėje, o mažiausiai šiauriausioje dalyje, Karklinėje (45,11 RE mg/g). Šis skirtumas yra statistiškai reikšmingas (p=0,025), todėl galima teigti, kad flavonoidų kiekis priklauso nuo augavietės.
Šiame darbe pateiktų rezultatų negalime lyginti su kitų autorių moksliniais darbais, kadangi nebuvo rasta tyrimų atliktų su atitinkamomis sąlygomis, metodais bei šiomis rykštenių rūšimis.
5. IŠVADOS
1. Išnagrinėjus kitų autorių mokslinę literatūrą buvo pasirinktos ekstrakcijos sąlygos: žaliava ekstrahuojama 50 min. su 10 ml, 70% (v/v) metanoliu vibracinėje vonioje. Gautas ekstraktas filtruojamas per 0,22 mikrometrų porų dydžio filtravimo popierių. Ekstraktai laikomi stikliniuose buteliukuose tolimesniems tyrimams.
2. Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta Solidago virgaurea L. lapuose, surinktuose šiauriausiame Vilniaus rajono dalyje, Karklinėje 1733,51 GRE mg/g fenolinių junginių. Daugiausiai fenolinių junginių nustatyta paprastųjų rykštenių žieduose, surinktuose taip pat šiauriniame regione, Vilniaus rajone, Raguvėlėje - 1576.09 GRE mg/g. Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad paprastųjų rykštenių ir lapų ir žiedų augalinė žaliava yra vertinga fenolinių junginių išgavimui. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių, p>0,05.
3. Nustatytas bendras fenolinių junginių įvairavimas paprastųjų rykštenių ir rykštenių hibrido lapų ir žiedų augalinėse žaliavose. Paprastųjų rykštenių žiedai kaupia pusantro karto didesnį fenolinių junginių kiekį - 7085,08 GRE mg/g, o rykštenių hibrido žieduose nustatyta 4705,01 GRE mg/g fenolinių junginių. Lapų augalinėje žaliavoje didesnis fenolinių junginių kiekis nustatytas S. niederederi Khek – 8528,34 GRE mg/g, o S. virgaurea L. lapuose nustatyta 7847,38 GRE mg/g fenolinių junginių. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių nenustatyta, p>0,05.
4. Nustatyta, kad paprastųjų rykštenių žieduose daugiau flavonoidų (346,01 RE mg/g) negu rykštenių hibrido žieduose (229,05 RE mg/g). Lapų augalinėje žaliavoje didesnis flavonoidų kiekis nustatytas rykštenių hibrido augalinėje žaliavoje – 727,95 RE mg/g. Paprastųjų rykštenių lapų augalinėje žaliavoje nustatytas keturis kartus mažesnis flavonoidų kiekis (174,12 RE mg/g).
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktais spektrofotometriniais tyrimais ir gautais rezultatais nustatyta, kad Solidago virgaurea L. žiedų augalinė žaliava yra vertingesnė tiek fenoliniais junginiais tiek flavonoidais už rykštenių hibrido žiedų augalinę žaliavą. Galima teigti, jog paprastųjų rykštenių žiedai yra vertingesni preparatų gamyboje.
Rykštenių hibrido augalinės žaliavos yra labai mažai išnagrinėtos, Lietuvoje neatlikta jokių tyrimų, kadangi ši rūšis mūsų krašte pastebėta tik prieš keletą metų, todėl būtų tikslinga toliau tęsti tyrimus. Kadangi šio darbo metu įvertinti tik bendri fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai, tai verta identifikuoti žaliavose esančius fenolinius junginius ir jų kiekius.
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Kołodziej B, Kowalski R, Kedzia B. Antibacterial and antimutagenic activity of extracts aboveground parts of three Solidago species: Solidago virgaurea L., Solidago canadensis L. and Solidago gigantea Ait. J Med Plants Res [Internet]. 2011;5(31):6770–9. Available from:http://www.scopus.com/inward/record.url?eid=2-s2.0-84855888500&partnerID=tZOtx3y1 2. Koksal E., Bursal E., Dikici E., Tozoglu F., Gulcin I. Antioxidant activity of Melissa officinalis
leaves. J Med Plants Res. 2011;5(2):217–22.
3. Demir H, Acik L, Bali EB, Koc Y, Kaynak G. Antioxidant and antimicrobial activities of Solidago virgaurea extracts. African J Biotechnol. 2009;8(2):274–9.
4. R. Šiukšta. Rykštenė (Solidago) [Internet]. 2008. Available from: http://www.botanikos-sodas.vu.lt/puslapiai/augalų-gentys/rykštenė
5. Birute Karpaviciene JR. Weed Science Morphological and Anatomical Characterization of Solidago × niederederi and Other Sympatric Solidago Species.
6. Thiem B, Golińska O. Antimicrobial activity of Solidago virgaurea L. from in vitro cultures. Fitoterapia. 2002;73(6):514–6.
7. Lauren??on L, Sarrazin E, Chevalier M, Prcheur I, Herbette G, Fernandez X. Triterpenoid saponins from the aerial parts of Solidago virgaurea alpestris with inhibiting activity of Candida albicans yeast-hyphal conversion. Phytochemistry. 2013;86(November):103–11.
8. Gross SC, Goodarzi G, Watabe M, Bandyopadhyay S, Pai SK, Watabe K. Antineoplastic activity of Solidago virgaurea on prostatic tumor cells in an SCID mouse model. Nutr Cancer. 2002;43(1):76–81.
9. Marksa M, Rudušienė J, Marksienė R KG. Rykštenės ( Solidago . L ) rūšies augalų ir rykštenėje besikaupiančių veikliųjų medžiagų svarba gydant šlapimo organų ligas. 2012;18(2):158–60. 10. Paprastoji rykštenė 2008. Available from: http://www.sos03.lt/Vaistazoles/Paprastoji_rykstene 11. Wiesława Rosłon, Ewa Osińska, Katarzyna Mazur AG.pdf. 2014.
12. European Pharmacopoeia 6.0. p.1999–2001.
13. Pliszko A, Zalewska-Gaosz J. Molecular evidence for hybridization between invasive Solidago canadensis and native S. virgaurea. Biol Invasions. 2016;18(11):3103–8.
14. Pliszko A. A new locality of Solidago ×niederederi Khek (Asteraceae) in Poland. Biodivers Res
Conserv 2013;29(1):57–62. Available from:
http://www.degruyter.com/view/j/biorc.2013.29.issue-1/biorc-2013-0008/biorc-2013-0008.xml 15. Pliszko A. Neotypification of Solidago × niederederi (Asteraceae). Phytotaxa. 2015;230(3):297–
16. Chevalier M, Medioni E, Prêcheur I. Inhibition of Candida albicans yeast-hyphal transition and biofilm formation by Solidago virgaurea water extracts. J Med Microbiol. 2012;61(PART7):1016–22.
17. Wang Z, Kim JH, Jang YS, Kim CH, Lee J-Y, Lim SS. Anti-obesity effect of Solidago virgaurea var. g igantea extract through regulation of adipogenesis and lipogenesis pathways in high-fat diet-induced obese mice (C57BL/6N). Food Nutr Res [Internet]. 2017;61(1):1273479. Available from: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/16546628.2016.1273479
18. Abdel Motaal A, Ezzat SM, Tadros MG, El-Askary HI. In vivo anti-inflammatory activity of caffeoylquinic acid derivatives from Solidago virgaurea in rats. Pharm Biol [Internet]. 2016;54(12):2864–70. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27249953
19. Apáti P, Szentmihályi K, Kristó ST, Papp I, Vinkler P, Szoke É, et al. Herbal remedies of Solidago - Correlation of phytochemical characteristics and antioxidative properties. J Pharm Biomed Anal. 2003;32(4–5):1045–53.
20. Frumenzio E, Maglia D, Salvini E, Giovannozzi S, Di Biase M, Bini V CE. Role of phytotherapy associated with antibiotic prophylaxis in female patients with recurrent urinary tract infections. 2013;
21. Balasundram N, Sundram K, Samman S. Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food Chem. 2006;99(1):191–203. 22. Rice-Evans C, Miller N, Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds. Trends Plant
Sci [Internet]. 1997;2(4):152–9. Available from:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1360138597010182
23. Dai J, Mumper RJ. Plant phenolics: Extraction, analysis and their antioxidant and anticancer properties. Molecules. 2010;15(10):7313–52.
24. de Rijke E, Out P, Niessen WMA, Ariese F, Gooijer C, Brinkman UAT. Analytical separation and detection methods for flavonoids. J Chromatogr A. 2006;1112(1–2):31–63.
25. JANULIS V, PUODŽIŪNIENĖ G MF. Fitocheminė analizė, Mokomoji knyga. Kaunas. 2008. 89-108 p.
26. Weston LA, Mathesius U. Flavonoids: Their Structure, Biosynthesis and Role in the Rhizosphere, Including Allelopathy. J Chem Ecol. 2013;39(2):283–97.
27. Rispail N, Morris P, Webb Kj. Phenolic Compounds: extraction and analysis. Lotus Jpn Handb. 2005;349–54.
28. Giao, M.S.; Pereira, C.I.; Fonseca, S.C.; Pintado, M.E.; Malcata FX. Effect of particle size upon the extent of extraction of antioxidant power from the plants Agrimonia eupatoria, Salvia sp. And Satureja montana. 2009. 412-416 p.
29. Garcia-Salas P, Morales-Soto A, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A. Phenolic-compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules. 2010;15(12):8813–26. 30. Luthria DL. Application of green chemistry principles for extraction of phytolipids and phenolic
compounds. Indian J Chem - Sect B Org Med Chem. 2006;45(10):2291–6.
31. Hasmida MN, Nur Syukriah AR, Liza MS, Mohd Azizi CY. Effect of different extraction techniques on total phenolic content and antioxidant activity of quercus infectoria galls. Int Food Res J. 2014;21(3):1039–43.
32. Naczk M, Shahidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. J Chromatogr A. 2004;1054(1– 2):95–111.
33. Zadernowski R, Czaplicki S, Naczk M. Phenolic acid profiles of mangosteen fruits (Garcinia mangostana). Food Chem. 2009;112(3):685–9.
34. Graham HD. aoH. 1992;801–5.
35. Perumalla S, Nayeem N. Research Article Determination of Total phenolic acids , condensed tannins and flavonoids in the leaves of Caesalpinia pulcherrima ( Linn .). :16–9.
36. Chia-Chi Chang, Yang M-H, Wen H-M, Chern J-C. Estimation of Total Flavonoid Content in Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods. J Food Drug Anal. 2002;10(3):178–82. 37. Mir SA, Bhat AS, Ahangar AA. A simplified 2 , 4-dinitrophenylhydrazine assay for Flavonoids
and its comparison with a Standard flavonoid assay. 2014;6(2):751–8.
38. Proestos C, Boziaris IS, Nychas GJE, Komaitis M. Analysis of flavonoids and phenolic acids in Greek aromatic plants: Investigation of their antioxidant capacity and antimicrobial activity. Food Chem. 2006;95(4):664–71.
39. Smolarz HD. Application of GC-MS method for analysis of phenolic acids and their esters in chloroformic extracts from some taxons of Polygonum L. genus. 2001;46, 439–444.
40. Of J, Chemistry A, Mars R. Phenolic acids in foods : An overview of analytical methodology phenolic acids in foods : An overview of analytical methodology. 2015;(November):2866–87. 41. Shadkami F, Estevez S, Helleur R. Analysis of catechins and condensed tannins by thermally
assisted hydrolysis/methylation-GC/MS and by a novel two step methylation. J Anal Appl Pyrolysis. 2009;85(1–2):54–65.
42. Dos Santos Pereira A, Costa Padilha M, De Aquino Neto FR. Two decades of high temperature gas chromatography (1983-2003): What’s next? Microchem J. 2004;77(2):141–9.
43. Deslauriers I. Recovery, Separation and Characterization of Phenolic Compounds and Flavonoids from Maple Products. Arbor Ciencia Pensamiento Y Cultura. 2001.
44. Li D, Pan S, Zhu X, Tan L, Cao Y. Anticancer Activity and Chemical Composition of Leaf Essential Oil from Solidago canadensis L. in China. Renew Sustain Energy, Pts 1-7. 2012;347–
353(1–7):1584–9.
45. CD S. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and flavonoids. 2007; 46. KM, Kalili de VA. Recent developments in the HPLC separation of phenolic compounds. 2011; 47. Catherine A, Rice-Evans PL. Flavonoids in health and disese. 2005;40.
