LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
VIKTORIJA MIKUCKYTĖ
Rykštenės (Solidago L.) rūšies augalų antioksidacinio aktyvumo tyrimai
naudojant DPPH reagentą
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Prof. dr. Liudas Ivanauskas
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. Dr. Vitalis Briedis
Rykštenės (Solidago L.) rūšies augalų antioksidacinio aktyvumo tyrimai
naudojant DPPH reagentą
Magistro baigiamasis darbas
Kaunas, 2015 Recenzentas
Doc.dr.Andrejus Ževžikovas 2015-05-29
Darbo vadovas
Prof.dr. Liudas Ivanauskas 2015-05-29
Darbą atliko Magistrantė
Viktorija Mikuckytė 2015-05-29
Turinys
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Tiriamasis objektas (Solidago L.) ... 11
1.1.1. Rykštenės (Solidago L.) charakteristika ... 11
1.1.2. Rykštenės (Solidago L.) cheminė sudėtis ... 12
1.1.3. Rykštenės (Solidago L.) farmakologinės savybės ... 12
1.2. Fenolinių junginių apžvalga ... 14
1.3. Antioksidantai, jų poveikio mechanizmas ... 15
1.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 17
1.5. DPPH radikalų surišimo metodo pritaikymas antioksidacinio aktyvumo nustatymui ... 18
2. TYRIMO METODIKA ... 21
2.1. Tyrimų objektas ... 21
2.2. Cheminiai reagentai ... 22
2.3. Aparatūra ... 22
2.4. Rykštenės (Solidago L.) veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymui naudojami tyrimų metodai ... 24
2.4.1. Tiriamo pavyzdžio ruošimas ... 24
2.4.2. DPPH tirpalo ruošimas ... 24
2.4.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakijos detekcija metodas 24 2.4.4. Duomenų statistinis įvertinimas ... 25
3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26
3.1. ESC-DPPH pokolonėlinio metodo vystymas ir optimizavimas ... 26
3.1.1. Kilpos ilgio parinkimas ... 26
3.1.2. Temperatūros parinkimas ... 27
3.2. Metodikos validacija... 28
3.3. Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas žiedų žaliavose ... 30
3.4. Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas lapų žaliavose ... 34
Išvados ... 39
SANTRAUKA
Viktorijos Mikuckytės magistro baigiamasis darbas „Rykštenės (Solidago L.) rūšies augalų antioksidacinio aktyvumo tyrimai“ naudojant DPPH reagentą/ mokslinis vadovas prof. dr. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: rykštenė, efektyvioji skysčių chromatografija, antioksidantai, DPPH.
Šio darbo tiriamasis objektas yra rykštenė ( Solidago L), astrinių (Asteracea) šeimai, priklausantis daugiametis, kaupiantis fenolinius junginius, saponinus, taninus ir kt. veikliuosius junginius augalas. Rykštenė pasižymi antiuždegiminėmis, antioksidacinėmis, gastroprotekcinėmis, šlapimo išsiskyrimą skatinančiomis savybėmis.
Darbo tikslas - nustatyti Rykštenės (Solidago L.) ekstraktuose esančių veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą naudojant DPPH reagentą. Darbo uždaviniai - kiekybiškai įvertinti rykštenės veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą naudojant ESC -DPPH pokolonėlinį metodą, atliekant tam tikras pokolonėlinės metodikos modifikacijas (vertinant kilpos parametrų įtaką pokolonėlinei reakcijai) optimizuoti tinkamiausią metodiką rykštenėje esančių veikliųjų junginių nustatymui, įvertinti bendrą ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, bei palyginti veikliųjų junginių pasiskirstymą skirtinguose augalo organuose ir mėginiuose, rinktuose skirtingose Lietuvos apylinkėse.
Tyrimo rezultatai: optimaliausios sąlygos ESC-DPPH pokolonėlinės reakcijos vystymui yra 20 m kilpa ir 50ºC temperatūra. Rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, chlorogeninė rūgštis, rykštenės ekstraktuose nustatyti kaip antioksidacinį poveikį, turintys junginiai. Tiek lapų tiek žiedų žaliavose didžiausią antiradikalinę gebą parodė rutinas ir chlorogeninė rūgštis. Rutino antioksidacinis aktyvumas siekė iki 33980 µg/g, chlorogeninės rūgšties iki 58120 µg/g. Didžiausiu aktyvumu (77702,2 µg/g) pasižymėjo lapų mėginys iš Vilniaus rajono, Prašiškių gatvės, mažiausiu (18178 µg/g) - žiedų žaliava, rinkta Tauragės apskrityje, Pagėgių savivaldybėje, Birbintės kaime.
SUMMARY
Viktorija Mikuckytė the topic of master thesis „Determination of antioxidant activity of goldenrod (Solidago L.) species using DPPH assay” / scientific manager prof.dr. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Analytical Chemistry and Toxicology Cathedral. - Kaunas.
Keywords: Goldenrod , high-performance liquid chromatography, antioxidants, DPPH.
Goldenrod (Solidago L.) is a perennial medicinal plant of Asteraceae (Compositae) family. It accumulates many biologically active substances (phenolic compounds, saponins, tannins etc.). Solidago L. is known for its anti-inflammatory, antioxidant, gastroprotective, urinary excretion promoting properties.
The aim of this study – to determine antioxidative properties of active compounds accumulated in goldenrod ( Solidago L.), using DPPH assay. The tasks – to quantify antioxidant activity of goldenrod active compounds by ESC-DPPH post-column method and carrying out certain modifications of the post column method (measuring the loop parameters on the post column reaction), to optimize the appropriate methodology for determining of the active compounds, to assess overall antioxidant activity and compare the distribution of the active compounds in different plant organs and samples collected in different Lithuanian districts.
Results of the study: the optimal conditions for ESC-DPPH post column reaction development is 20 m loop and 50 ° C temperature. Rutin, hyperoside, isoquercitrine, quercitrine, chlorogenic acid was determined as antioxidant effect containing compounds in goldenrod. The greatest ability to neutralize radicals in extracts of leaves and flowers showed rutin and chlorogenic acid. The biggest antioxidant activity of rutin was 33980 µg /g, chlorogenic acid - up to 58120 µg / g. The highest activity (77702,2 µg/g) featured in leaf sample from Vilnius district, Prašiškių street, the smallest (18178 µg /g) - in the raw material of rings, collected in Tauragė district, Pagėgiai municipality, Birbintė village.
SANTRUMPOS
A etaloninio standarto trolokso kiekio ekvivalentas žaliavos kiekiui. CUPRAC vario redukcijos antioksidantinė galia
DPPH 2,2-difenil-1-pikrihidrazilo radikalas ESC efektyvioji skysčių chromatografija ET elektronų perdavimo reakcijos
FRAP trivalentės geležies jonų redukcijos jėga HAT vandenilio perdavimo reakcijos
MAK minimali aptikimo koncentracija MAR minimali aptikimo riba
ORAC deguonies radikalų absorbcinė geba R2 regresijos koeficientas
RNS aktyvios azoto formos ROS reaktyvaus deguonies forma SSN santykinis standartinis nuokrypis
TEAC trolokso ekvivalento antioksidacinė geba
TRAP bendras radikalų gaudyklės parametro nustatymo mtodas UV ultravioletinės šviesos spinduliuotė
ĮVADAS
Laisvųjų radikalų įtaka žmogaus organizmui šiuo metu yra viena labiausiai nagrinėjamų temų. Laisvieji radikalai organizme susidaro virškinant maistą taip pat veikiant išoriniams veiksniams tokiems kaip tabako dūmai radiacija ir kt. Šie junginiai žaloja organizmo ląsteles ir tai įtakoja širdies ligų, vėžio bei kitų organizmo sutrikimų vystymąsi. Tyrimais nustatyta, kad mityba, kurios pagrindą sudaro augaliniai produktai, daržovės ir vaisiai, turintys didelį antioksidantų kiekį gali padėti pristabdyi šį procesą. [1]
Šiuo metu didelis dėmesys yra skiriamas vaistinių augalinių žaliavų tyrimams, siekiant nustatyti jų savybes, galinčias turėti įtakos oksidacinio streso sumažinimui ir tam tikrų ligų prevencijai ir gydymui. Tai aktuali tema, nes augalinių vaistinių preparatų paklausa, dėl jų didesnio saugumo ir platesnio veikimo lyginant su cheminiais preparatais, pasaulyje didėja. [2]
Šio tyrimo objektas - rykštenė (Solidago L.), priklausantis astrinių (Asteracea) šeimai, kaupiantis fenolinius junginius, saponinus, taninus, mineralines medžiagas augalas. Atlikus įvairius tyrimus nustatytas platus augalo pritaikymas medicinoje. Rykštenė pasižymi antioksidacinėmis, prieuždegiminėmis, kardioprotekcinėmis, šlapimą varančiomis, spazmolitinėmis savybėmis. [3,4,5,6] Kaiser ir kt. atliktame tyrime nustatyta, kad rykštenės metanoliniai ekstraktai pasižymi priešmikrobinėmis savybėmis prieš S. Aureus, E. Coli ir B. cereus mikroorganizmus. [6]
Pasaulyje rykštenės preparatai plačiai vartojami pvz. Vokietijoje ir Prancūzijoje, iš šio augalo gaminami įvairūs augaliniai vaistiniai preparatai. Rykštenės žolė naudojama (Herba Solidaginis) įvairių arbatų, geriamųjų lašų, tablečių, kapsulių, tinktūrų, purškalų žaizdoms, taip pat homeopatinių vaistų gamybai. Farmacijos įmonė „Heel“ gamina homeopatinius preparatus – „Solidago Compositum“ tirpalą ir tabletes, Prancūzijoje gaminamas homeopatinis preparatas „Rhinallergy“ tabletėmis). Lietuvoje gaminama arbata „Diuretiko“ (UAB „Acorus Calamus“), kurios vaistažolių mišinyje yra Herba Solidagini. [7] Valstybinės vaistų kontrolės tarnybos duomenimis Lietuvoje registruotas homeopatinis vaistinis preparatas „Populus compositum SR“, kurio sudėtyje yra Solidago virgaurea L. ekstrakto. [8] Rykštenė kartu su spanguolių ekstraktu įeina į maisto papildų, vartojamų šlapimo takų uždegimo simptomų lengvinimui, sudėtį: Švedijoje gaminto „Cran Berry“, bei čekų „Urinal“ ir „Urinal Acut“, kurių taip pat galima įsygyti Lietuvos vaistinėse. [9]
junginių, todėl jų analizė moderniais efektyviosios skysčių chromatografijos, masių spektrofotometrijos ir kt. metodais leidžia įvertinti augalinės žaliavos kokybę ir kiekybinę sudėtį. Taip pat leidžia palyginti kaip šie biologiškai aktyvūs junginiai pasiskirsto skirtinguose augalo organuose.
Rykštenės rūšies augalai natūraliai auga ir yra kultivuojami Lietuvos teritorijoje, įvairiuose regionuose, tačiau mokslinių tyrimų su šios rūšies augalais atikta mažai. Lietuvos sąlygomis augintų rykštenių sudėties ir aktyvių junginių ištyrimas suteiktų naudingos informacijos bei duotų galimybę panaudoti šių augalų žaliavas, augalinių preparatų gamyboje. [7]
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Nustatyti Rykštenės (Solidago L.) ekstraktuose esančių veikliųjų junginių
antioksidacinį aktyvumą naudojant DPPH reagentą.
Darbo uždaviniai:
1. Atliekant tam tikras pokolonėlinės metodikos modifikacijas (vertinant kilpos parametrų įtaką pokolonėlinei reakcijai) optimizuoti tinkamiausią metodiką rykštenėje esančių veikliųjų junginių nustatymui.
2. Kiekybiškai įvertinti rykštenės veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą naudojant ESC-DPPH pokolonėlinį metodą.
3. Įvertinti bendrą ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, bei palyginti veikliųjų junginių pasiskirstymą skirtinguose augalo organuose ir mėginiuose, rinktuose skirtingose Lietuvos apylinkėse.
1.
LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Tiriamasis objektas (Solidago L.)
1.1.1. Rykštenės (Solidago L.) charakteristika
Rykštenė – tai augalas priklausantis astrinių (Asteraceae) šeimai, natūraliai augantis ir aptinkamas Šiaurės Amerikoje, Europoje, bei Azijoje. Yra žinoma apie apie 120 augalo rūšių, iš kurių dažniausios: Solidago altissima L., S. gigantea L. ir S. graminifolia L. Lietuvoje paplitusi paprastoji rykštenė (S. virgaurea L.) [7] Dar viduramžiais augalo žolė buvo vartojama šlapimo takų ligoms, inkstų akmenligei, prostatos sutrikimams gydyti, o žiedai ir lapai buvo naudojami kaip natūralūs geltoni dažai. [10, 11]
Rykštenė gali užaugti iki 1 metro aukščio, nors kai kurie porūšiai (pvz. S. virgaurea ssp. minuta) siekia tik apie 10 cm. [7] Stiebas žalsvai geltonos arba žalsvai rudos spalvos, šiek tiek su rausvu atspalviu, apatinė dalis lygi, o viršutinė šiek tiek apaugusi plaukeliais. Lapai žali, lancetiški, dantytais kraštais, maždaug 8-12 cm ilgio ir apie 1-3 cm pločio. Žiedyną sudaro geltoni graižai, kurie susitelkę žiedų viršūnėse ir sudaro savotiškas piramidės formos šluoteles. [12] Sutrynus augalą jaučiamas šviežias morkų kvapas. Žydi liepos – rugsėjo mėnesiais. Dauginama dalinant kerus arba sėklomis, auga tiek lengvame,
tiek sunkiame dirvožemyje, saulėtoje vietoje ar iš dalies pavėsyje, išgyvena įvairaus rūgštingumo dirvoje. Dėl savo ryškių geltonų žiedų daug kur auginamos kaip dekoratyvūs augalai. [7,11]
1.1.2. Rykštenės (Solidago L.) cheminė sudėtis
Rykštenės rūšies augaluose nustatyti šie veiklieji junginiai: flavonoidai (S. virgaurea -1,5%, S. canadensis 2,4%, S.gigantea -3,9%), [13] diterpeniniai saponinai ir triterpeniniai saponinai 0,2 – 0,3%, seksviterpenai, rūgštys, fenoliniai junginiai (leiokarpozidai bei virgaureozidai) 0,2 – 1%. Taip pat yra eterinių aliejų 0,4 – 0,5% (iš jų 40 – 46% sudaro χ-kadinenas, kiti junginiai: borneolis, bornilacetatas, kadinolis, β-kariofilenas, pinenas, limonenas ir kt. ) 10% taninų, [14] Visi šie junginiai apsprendžia farmakologinį augalo aktyvumą. Tyrimais įrodyta, kad rykštenės junginiai: flavonoidai, taninai ir fenoliniai junginiai yra pagrindinės grupės, kurios sudaro 12,5 procento visų Solidago L. augaluose besikaupiančių veikliųjų medžiagų. [7] Atlikus tyrimus su europietiškąja rykštene pastebėta, kad didžiausias flavonoidų kiekis augale būna vegetatyvinėje vystymosi stadijoje, o mažiausias - žiedynų formavimosi etape, bei augalui žydint. Flavonoidų kiekis augale, daugumos autorių teigimu, tiesiogiai priklauso nuo šviesos kiekio, kurį augalas gauna, tačiau kiti tyrimai tai paneigia, todėl manoma, kad biologiškai aktyvių junginių sintezė vyksta veikiant įvairiems aplinkos faktoriams. Polifenolinių rūgščių, kurios nulemia antioksidacinį, priešuždegiminį, tulžies išsiskyrimą skatinantį poveikį, kiekis augale priklauso nuo žaliavos rinkimo laiko ir vietos. [ 15]
1.1.3. Rykštenės (Solidago L.) farmakologinės savybės
Rykštenė pasižymi diureziniu poveikiu - skatina šlapinimąsį, gali atpalaiduoti spazmus bei palengvinti skausmą. Rykštenės preparatus patartina vartoti ištikus ūmiam šlapimo takų, šlapimo pūslės uždegimui, esant dažnam ir skausmingam šlapinimuisi. [7] Teigiamas rykštenės poveikis šlapimo takams gali būti susijęs su flavonoidų, ypatingai, kvercitino gebėjimu inhibuoti fermentą endopeptidazę, taip sureguliuojant normalų šlapimo susidarymą ir nutekėjimą. [13]
Tiriant augalo priešuždegimines savybes buvo atliktas tyrimas su pelėmis, kurioms dimetilbenzenu dirbtinai buvo sukelta ausų edema. Rezultatai parodė, kad rykštenės ekstraktas visiškai panaikino dimetilbenzeno sukeltą poveikį. [3] Dar vienas in vivo tyrimas padėjo nustatyti S. chilensis glikolio ekstraktų antiuždegiminio poveikio mechanizmą: slopinant leukocitų ir neutrofilų veiklą,
sumažėjo pelių pleurito požymiai. Taip pat buvo inhibuojama meloperoksidazė, adenozindeaminazė, TNF-α (auglio nekrozės faktorius), slopinamas ląstelių infiltracijos procesas, bei uždegimo mediatorių išskyrimas. [4] Kito tyrimo metu saponinai, flavonoidai ir kavos rūgšties esteris inhibavo leukocitų elastazės ir proteazės fermentus taip slopindami uždegimo progresavimą.[13]
Rykštenės priešgrybelinės savybės buvo įrodytos tiriant jos veikliųjų junginių aktyvumą prieš penkias siūlinių grybelių padermes ir mieles. Labiausiai jautrus pasirodė žmogaus patogeninis dermatofitas. [3]
Rykštenė taip pat turi priešvėžinių savybių, atlikus tyrimus buvo nustatytas citotoksinis poveikis prieš įvairių auglių formų ląsteles, apimant: prostatos karcinomą, melanomą ir mažų ląstelių plaučių karcinomą. Norint nustatyti citotoksinį aktyvumą in vivo buvo atliktas tyrimas su žiurkėmis. Į žiurkių kūną buvo įvestos prostatos karcinomos ląstelės, o po to buvo švirkščiamas frakcionuotas rykštenės ekstraktas, po 25 dienų gauti rezultatai parodė, kad auglio augimą jis ženkliai sumažino, nesukeldamas jokių šalutinių poveikių. [3]
Antioksidacinis aktyvumas viena svarbiausių rykštenės savybių. Atlikus tyrimą su 35 rūšių augalais, kurie tradiciškai buvo vartojami palengvinti diabeto simptomus, buvo nustatyta, kad Solidago canadensis L. antioksidacinis poveikis buvo stipresnis nei žaliosios arbatos, askorbo rūgšties bei trolokso. [3] Walid Hamdy El-Tantawy 2014 metais publikuoto tyrimo rezultatai parodė, kad rykštenė ir kaptoprilis turi panašų kardioprotekcinį poveikį, toks augalo poveikis širdžiai pasireiškia, dėl antioksidacinių savybių. [5]
Kai kurie farmakologiniai tyrimai parodė statistiškai reikšmingą gastroprotekcinį rykštenės veikliųjų junginių poveikį - buvo pastebėtas terpenų ir jų darinių efektyvumas gydant skrandžio opas. Šis efektas gali pasireikšti įvairiais mechanizmas pvz. stimuliuojant gleivinės apsaugos faktorius. Vienų tyrimų metu buvo nustatyta, kad rykštenės ekstraktų, kurių koncentracijos – 100 mg/kg, parodė panašų efektyvumą į lansoprazolio (20mg/kg) be to, fitopreparatas neturėjo jokio poveikio skrandžio gleivinei ir nesutrikdė rūgšties sekrecijos. [4]
Rykštenė taip pat turi teigiamą poveikį kepenims, tai savo tyrime su S. microglossa L. nustatė mokslininkai. Kaip žalojantį kepenis faktorių tyrėjai naudojo acetaminofeną ir gauti rezultatai parodė, kad tiek acetil-cisteinas tiek rykštenės ekstraktas reikšmingai sumažino jo neigiamą poveikį kepenims. [16]
1.2. Fenolinių junginių apžvalga
Fenoliniai junginiai – tai antriniai augalų metabolitai, kurie įtakoja augalų morfologiją ir fiziologinius procesus, vykstančius augaluose. Jie atlieka didelį vaidmenį augalų augimo ir reprodukcijos procesuose, apsaugo juos nuo įvairių žalojančių aplinkos veiksnių, suteikia spalvą bei juslines savybes. Tai viena plačiausių fitocheminių junginių grupių. Priklausomai nuo jų cheminės struktūros. Šie junginiai skirstomi į 8 pagrindines grupes: flavonoidus, fenolines rūgštis, stilbenus, chinonus, kumarinus, ligninus, ksantonus ir chromonus [17,18]
Flavonoidai sudaro didžiausią fenolinių junginių grupę augaluose. Šiuo metu yra identifikuota daugiau kaip 6500 skirtingos cheminės struktūros flavonoidų. Tai yra mažo molekulinio svorio junginiai, susidedantys iš penkiolikos anglies atomų, išdėstytų C6-C3-C6-konfigūracija. Iš esmės struktūrą sudaryta iš dviejų aromatinių žiedų, A ir B, sujungtų trimis anglies tiltais, paprastai šie junginiai sudaro heterociklinį žiedą. Struktūra pavaizduota 2 paveikslėlyje. Pagrindinės flavonoidų klasės: flavonoliai, flavonai, flavanonai, katechinai antocianidinai, izoflavonai, dihidroflavonoliai ir chalkonai.[17,19] Dažniausiai pasitaikantys flavonoidai yra: kemferolis, mircetinas, kvervetinas, apigeninas, liuteolinas ir kt. [20]
Flavonoidai gausiai paplitę augaliniame pasaulyje. Augaluose jie atlieka įvairias funkcijas: suteikia lapams spalvą, taip pat katalizuoja elektronų perdavimą nuo šviesos priklausančioje fotosintezės fazėje. Flavonoidai yra svarbūs augalų biocheminiams ir fiziologiams procesams, jie veikia kaip fermentų inhibitoriai, taip pat apsaugo augalus nuo žalingų UV spindulių. [21]
Polifenoliniai junginiai dažniausiai randami tiek maistui vartojamuose tiek ir nevalgomuose augaluose. Tyrimais buvo nustatyta, kad šie junginiai pasižymi įvairiu biologiniu poveiku gyvybinėms sistemoms, įskaitant antioksidacinį aktyvumą. Vaistažolės yra naudojamos daugelyje sričių, įskaitant mediciną, maisto, dažų. kvepalų, kosmetikos pramones. Daugelis augalų rūšių, kaupiančių polifenolinius
junginius buvo pripažinti, kaip turintys gydomųjų savybių ir keliantys teigiamą poveikį sveikatai: stimuliuoja virškinimą, turi priešuždegiminį poveikį, pasižymi antimikrobiniu, antlipideminiu, antimutageniniu bei antikarcinogeniniu poveikiu. [22]
Solidago L. žaliavoje iš fenolinių junginių daugiausia randama flavonoidų taip pat fenolinių rūgščių iš kurių dažniausiai pasitaikanti chlorogeninė rūgštis. [10]
1.3. Antioksidantai, jų poveikio mechanizmas
Didelis laisvųjų radikalų kiekis biologinėse sistemose gali sukelti biomolekulių oksidaciją, dėl ko atsiranda audinių pažeidimai, kurie įtakoja įvairių ligų vystymasį. Laisvieji radikalai skatina vėžio, širdies ir kraujagyslių ligų, aterosklerozės, neurozinių sutrikimų, odos ligų, alergijų ir kitų lėtinių ligų atsiradimą. Antioksidantai – tai medžiagos, kurios geba neutralizuoti šiuos junginius ir mažina jų sukeliamą žalingą poveikį. Antioksidantai gali būti tiek didelės molekulinės masės (įvairūs baltymai, fermentai) tiek mažos molekulinės masės junginiai. [23,24] Gyvame organizme yra natūralių, antioksidantinį poveikį turinčių medžiagų, kurios turi gebėjimą kovoti su laisvaisiais radikalais. Superoksido dismutazė, glutationo reduktazė, tioredoksinas, tioliai – tai buferinės, apsauginės sistemos esančios kiekvienoje organizmo ląstelėje. Natūralūs antioksidantai, apsaugantys ląstelės membranas nuo žalojančio poveikio taip pat yra α-Tokoferolis (vitaminas E), bei askorbo rūgštis (vitaminas C). Nefermentiniai antioksidantai yra karotenoidai, flavonoidai, kiti polifenoliniai junginiai, α-lipoinė rūgštis glutationas ir t.t. [25] Atsižvelgiant į mechanines funkcijas gali būti skirstomi į: prevencinius, neutralizuojančius atstatančius ir atnaujinančius . Prevenciniai antioksidantai veikia kaip pirmosios linijos gynyba ir slopina reaktyviųjų deguonies (ROS) ir azoto (RNS) rūšių susidarymą , pavyzdžiui, redukuodami vandenilio peroksidą ir lipidų hydroperoksidus, atitinkamai, į vandenį ir lipidų hidroksidus, arba izoliuodami metalo jonus (pvz. geležies, vario). Neutralizuojantys antioksidantai pašalina reaktyvias junginių formas dar prieš joms pažeidžiant biologiškai svarbias molekules ir veikia kaip antrosios linijos gynyba – tokiu antioksidantiniu poveikiu pasižymi dauguma fenolinių junginių ir aromatiniai aminai. Trečiosios linijos gynyboje dalyvauja kai kurie fermentai, jų funkcija yra atstatytį laisvųjų radikalų padarytą žalą bei atstatyti pažeistų lastelių funkciją. Kai kurie antioksidantai yra generuojami esant būtinumui ir perkeliami į pažaidos vietą – tai vadinamas de novo mechanizmas, veikiantis kaip ketvirtosios linijos gynyba. [26]
Antioksidanto atsakas į skirtingus laisvuosius radikalus ar atskiras oksidantų grupes gali būti skirtingas. Pavyzdžiui karotenoidai yra prastesni peroksilo radikalo slopintojai lyginant su fenoliniais junginiais, tačiau jie puikiai neutralizuoja deguonies poveikį. Nėra vieno mechanizmo apibūdinančio antioksidantų ir laisvųjų radikalų sąveiką, tačiau antioksidantinio aktyvumo metodai bendrai suskirstyti į dvi kategorijas t.y laisvųjų radikalų inaktyvacija vyksta dviem pagrindiniais mechanizmais: [27, 28]
1) Vandenilio perdavimo reakcijomis (HAT) AH + X• → XH + A•
2) Elektronų perdavimo reakcijomis (ET) X• + AH → X– + AH•+
AH•+ + H2O ↔ A• + H3O+ X– + H3O+ → XH + H2O M(III) + AH → AH+ + M(II)
Abiejų reakcijų metu pasiekiamas vienodas rezultatas, tačiau skiriasi reakcijos kinetika ir potencialios šalutinės reakcijos. HAT ir ET reakcijos dažnai vyksta vienu metu ir kuris mechanizmas dominuos priklauso nuo antioksidanto struktūros ir jo savybių (tirpumo, pasiskirstymo koeficiento) bei terpės (tirpiklio tipo, pH). Jungties disociacijos energija ir jonizacijos potencialas yra du pagrindiniai veiksniai, kurie lemia antioksidantinio poveikio mechanizmą ir antioksidantų efektyvumą [27, 28]
HAT tipo reakcijų metu vyksta vandenilio atomo perdavimas laisvajam radikalui, kuris tokiu būdu yra neutralizuojamas ir tampa stabiliu junginiu. Šios reakcijos nepriklauso nuo tirpiklio ir pH, jos vyksta gana greitai nuo kelių sekundžių iki minutės. Dažniausiai taikomi HAT tipo reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai: deguonies radikalų absorbcinė geba (ORAC), antioksidanto surištų radikalų suminis matas (TRAP) ir krocino blukinimo metodas. Taikant šiomis reakcijomis pagrįstus antioksidantinio nustatymo metodus dažnai gaunami didesni rezultatai dėl atsiradusių redukuojančių priemaišų (pvz. metalų jonų). [27, 28]
ET reakcijų metu oksidantu būna stabilus laisvas radikalas arba kintamo valentingumo metalo jonas. Antioksidantas neutralizuoja oksidantą, perduodamas jam vieną elektroną ir jį redukuoja. Taikant ET tipo metodus santykinis junginio reaktyvumas priklauso nuo junginio funkcinės grupės jonizacijos potencialo ir deprotinizacijos proceso. Jonizacijos potencialo vertė mažėja, didėjant pH, o tuo pačiu suintensyvėja elektronų perdavimo procesas, todėl galima teigti, kad ET reakcijos priklauso nuo pH. Rūgštinėje terpėje antioksidanto priešradikalinis aktyvumas apribojamas, o šarminėje terpėje
antioksidantas įgyja didesnę redukcinę galią, ET reakcijos yra sąlyginai lėtos ir gana ilgai užtrunka. [27,28]
1.4. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai
Antioksidantinis aktyvumas – tai veikliųjų junginių (antioksidantų) gebėjimas apsaugoti biologines sistemas nuo žalingų reaktyvių deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formų. Išaugus antioksidantų svarbai medicinoje, biologijoje, maisto pramonėje bei kitose srityse imta ieškoti paprastų, patogių bei patikimų būdų antioksidaciniam aktyvumui įvertinti. Literatūroje aprašyti metodai skirstomi į dvi grupes pagal antioksidacinio poveikio mechanizmą:
Metodai pagrįsti HAT tipo reakcijomis (ORAC, TRAP)
Metodai pagrįsti ET tipo reakcijomis (TEAC, DPPH, FRAP, CUPRAC)
Taikant HAT tipo metodus vyksta konkurencinės reakcijos tarp antioksidanto ir substrato, jie konkuruoja dėl termiškai generuotų peroksilo radikalų. HAT principu yra pagrįstas ORAC metodas (deguonies radikalų absorbcinė geba, angl. Oxygen Radical Absorbance Capacity). Šiuo metodu nustatomas antioksidanto gebėjimas inhibuoti peroksilo radikalų sukeltą oksidaciją. Peroksilo radikalas susidaro terminio skilimo metu iš AAPH ir reaguoja su fluoroforu, dėl šios reakcijos per laiką sumažėja fluorescencijos intensyvumas, kurio pokytis po to kiekybiškai išmatuojamas,taip pat nustatomas reakcijos greitis bei įvertinama antioksidanto galia, išreiškiama trolokso ekvivalentu. Kitas HAT reakcijomis pagrįstas metodas - TRAP (antioksidanto sugaudytų radikalų suma angl. Total radical trapping antioxidant parameter), kuriuo nustatomas antioksidantų gebėjimas įsiterpti į reakcijų seką, kurių metų generuojamas peroksilo radikalas. [27, 28, 29]
ET reakcijomis pagrįstų metodų principas yra oksidanto redukavimas iki kitos spalvos junginio. TEAC (Trolokso ekvivalento antioksidacinė geba, angl. Trolox-Equivalent Antioxidant Capacity) metodas, kuriuo nustatinėjant antioksidantinį aktyvumą yra naudojamas ABTS substratas. Pastarasis oksiduojamas peroksilo radikalo arba kitų oksidantų sudaro metastabilų ABTS·+ radikalą, kuris pasižymi intensyvia, mėlynai žalia spalva ir gali būti nustatomas spektrofotometriškai, kai bangos ilgis 600 – 750 nm. Šiuo atveju antioksidantinis aktyvumas yra nusakomas kaip gebėjimas sumažinti tiriamojo bandinio spalvos intensyvumą. ET reakcijomis taip pat pagrįsti CUPRAC (vario antioksidacinė redukcijos galia, angl. Copper Reduction Assay) bei FRAP (geležies antioksidacinė
redukcijos galia, angl. ferric reducing antioxidant power ) metodai, kuriuos taikant naudojami (atitinkamai) vario (Cu2+) ir geležies jonai (Fe3+), kurie yra redukuojami iki Cu+ ir Fe2+ jonų, o norint įvertinti antioksidacinį aktyvumą matuojamas tirpalų spalvos pokytis. Vienas dažniausiai naudojamų metodų antioksidaciniam aktyvumui augalinėse žaliavose nustatyti yra DPPH radikalų surišimo metodas , kuriuo matuojama antioksidanto geba surišti 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo radikalą. [27,28,29] Pastarasis metodas ir bus pritaikomas šio tyrimo metu.
1.5. DPPH radikalų surišimo metodo pritaikymas antioksidacinio aktyvumo
nustatymui
DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) (3 pav.) yra stabilus, organininės kilmės azoto radikalas, turintis ryškiai violetinę spalvą. Jis yra komerciškai prieinamas ir patogus, nes prieš naudojimą jo nereikia aktyvuoti. Tyrimo metu violetinės spalvos radikalas yra redukuojamas antioksidanto iki šviesiai geltonos spalvos junginio hidrazino (4 pav.). Antioksidanto redukcinė (DPPH radikalų surišimo) galia gali būti įvertinta elektronų sukinių rezonansu arba stebint tirpalo absorbcijos mažėjimą, kai bangos ilgis 515-528 nm. [27,28, 30,31]
DPPH metodas yra gana paprastas ir greitai atliekamas. Metodui vykdyti papildomai reikalingas tik UV-VIS spektrofotometras. Dėl šių savybių DPPH yra plačiai taikomas tiriant antioksidantų redukcines savybes. Nepaisant šių teigiamų savybių, metodas taip pat turi ir savų trūkumų. DPPH
3 pav. 2,2 -difenil-1-pikrilhidrazilo radikalas
4 pav.. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazinas (ne radikalas)
reagentas turi būti tirpinamas tik organiniuose tirpikliuose ( dažniausiai alkoholiniuose), nes yra netirpus vandenyje, dėl to apribojamas jo naudojimas hidrofilinių antioksidantų tyrimuose. Tačiau lipofilinių antioksidantų (pvz. fenolinių junginių) tyrimuose DPPH yra puikiai pritaikomas. Tiriant antioksidantus šiuo metodu yra svarbu reguliuoti patenkamos šviesos bei deguonies kiekius į reagento tirpalą, nes šie veiksniai gali įtakoti veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo sumažėjimą. Taip pat labai svarbu užtikrinti optimalų vandens kiekį tirpiklyje, kad neįvyktų reagento koaguliacija. Kitas trūkumas yra tas, kad DPPH molekulės sandara nėra labai artima reaktyviojo peroksilo radikalo sandarai, todėl dauguma antioksidantų, kurie pasižymi greita reakcija su peroksilo radikalu, su DPPH reagentu gali reaguoti labai lėtai arba būti visai inertiški šiam reagentui.[27, 28, 30]
Anksčiau buvo teigiama, kad DPPH radikalų surišimo metu vyksta vandenilio atomų perdavimas, tačiau vėlesnių tyrimų metu buvo nustatyta, kad pirmiausia įvyksta greitas elektronų perdavimas, o tik tada, priklausomai nuo terpės vandenilinių ryšių stiprumo, lėtai atiduodamas vandenilio atomas.[27, 28, 30]
ESC pokolonėlinis metodas su DPPH reagentu pradėtas naudoti jau 2000 Kolevos ir kt. Tyrėjai laisvuosius radikalus surišančių junginių atrankai kompleksiniuose mišiniuose, naudojo metanolinį DPPH tirpalą. ESC išskirstytos analitės reaktoriuje reagavo su DPPH radikalais, kurių redukcija buvo fiksuojama absorbciniu detektoriumi ir esant 517 nm bangos ilgiui. Reakcijos sąlygos buvo: kilpa, padaryta iš 15 m ilgio 0,25 mm vidinio skersmens polietereterketono (PEEK, angl. polyetheretherketone) vamzdelio. DPPH reagentas į reaktorių buvo švirkščiamas pertraukiamo veikimo siurbliu. Autoriai taip pat optimizavo tokius parametrus, kaip DPPH tirpalo koncentracija, reakcijos laikas, organinio tirpiklio ir terpės pH įtaka pokolonėlinei reakcijai. Tyrėjai nustatė, kad efektyviausiai tiriamo junginio aptikimo ribos pasiekiamos naudojant 10-5 M koncentracijos DPPH metanolinį tirpalą. Nustatyta optimaliausia reakcijos trukmė 30 sekundžių. Taip pat padaryta išvada kad, rūgštinė reakcijos terpė ir perdidelis organinio tirpiklio kiekis neigiamai veikia metodo jautrumą. [28]
DPPH dėl savo savybės elgtis kaip laisvajam radikalui yra praktiškai pritaikomas daugelyje sričių. Juo nustatinėjamas antiradikalinis aktyvumas tam tikruose maisto produktuose. Taip pat šio junginio pagalba galima nustatyti antioksidantiškai veikiančių junginių kiekį biologinėse sistemose. Šis analizės būdas buvo sėkmingai panaudojamas tiriant antioksidacines kviečių grūdų ir sėlenų, įvairių daržovių, konjuguotos linolinės rūgšties, įvairių augalinių žolelių, sėklų ir jų aliejų savybes, panaudojus įvairias skirtingas tirpiklių sistemas, įskaitant etanolį, acetoną, metanolį, vandeninius įvairių alkoholių ir benzeno tirpalus. Tai taip pat patogus būdas analizuoti cisteino, glutationo, askorbo rūgšties, tokoferolio,
polihidroksinių aromatinių junginių, alyvuogių aliejaus, vaisių, sulčių ir vyno antioksidacines savybes. [31]
DPPH radikalas plačiai pritaikomas augalinių ekstraktų veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymui visame pasaulyje. 2014 metais publikuotame straipsnyje aprašomas turkų atliktas tyrimas, kurio metu, naudojant DPPH reagentą, buvo tiriamas šarminiuose dirvožemiuose augančių saulėgražų (Helianthus annuus) antioksidacinis aktyvumas. [32] Kitame straipsnyje „Comparison of ABTS (TEAC), DPPH, FRAP, and ORAC assays for estimating antioxidant activity from guava fruit extracts“ buvo lyginami antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai, tiriant gvajavos vaisių ekstraktus. Buvo gaminami metanoliniai ir dichlormetano ekstraktai, kuriuose buvo nustatinėjamas askorbo rūgšties, fenolinių junginių ir karotenoidų antioksidacinės savybės. Gauti rezultatai parodė aukštą koreliaciją tarp DPPH, FRAP, TEAC ir ORAC metodų, matuojant junginių antioksidantinį aktyvumą metanoliniuose gvajavos vaisių ekstraktuose. [33]
2.
TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimų objektas
Buvo tiriama Lietuvoje kultivuojamos kanadinės rykštenės (Solidago Canadensis L.) ir didžiosios rykštenės ( Solidago gigantea L.), priklausančios Astrinių (Asteraceae) šeimai, augalinė žaliava ( lapai ir žiedai). Žaliavos buvo rinktos skirtinguose Lietuvos regionuose, augalų žydėjimo metu. 1 lentelėje pateikiamos žaliavų rinkimo vietos: Lietuvos regionas bei geografinė padėtis.
1 lentelė. Solidago L. žaliavų rinkimo vietovės
Žaliavos numeris Lietuvos regionas Geografinė padėtis
ŽC1 ir LC1 Utenos raj., Deguliai 55° 26 Š. Plat. 25° 31 R.ilg. ŽC2 ir LC2 Kaunas, Raudondvario pl. 54°55 Š. Plat. 23°48 R.ilg. ŽC3 ir LC3 Vilniaus r. Riešė 54° 47 Š. Plat. 25° 16' R.Ilg. ŽG4 ir LG4 Kaunas,Islandijos pl. 54°56 Š. Plat. 23°56 R. Ilg. ŽC5 ir LC5 Vilnius, Žemieji Karačiūnai 54°43 Š.plat. 25°18 R.Ilg. ŽC6 ir LC6 Vilniaus r. Papiškės 54°43 Š. Plat. 25°07 R.ilg. ŽG7 ir LG7 Vilnius, Prašiškių g. 54° 46 Š. Plat. 25° 16 R. Ilg. ŽC8 ir LC8 Šilutės r. Verdainė 55°20 Š.Plat. 21°30 R. Ilg. ŽC9 ir LC9 Utenos r., Vosgėliai 55° 27 Š. Plat. 25° 31 R.ilg. ŽC10 ir LC10
Tauragės apskritis, Pagėgių sav.
Birbintė 55°08 Š. Palt. 22°08 R. Ilg.
ŽC – kanadinės rykštenės žiedų mėginiai LC – kanadinės rykštenės lapų mėginiai ŽG – didžios rykštenės žiedų mėginiai LG – didžiosios rykštenės lapų mėginiai
Rykštenės augalinė žaliava buvo džiovinama pagal nustatytus reikalavimus vėsioje, ne aukštesnėje nei 25 oC temperatūros, gerai vėdinamoje, sausoje, bei apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių vietoje.
2.2. Cheminiai reagentai
Gradientinio švarumo eliuentai :
Acetonitrilas (Sigma-Aldrich, Buchs, Šveicarija)
Trichluoracto rūgštis (99% , Sigma-Aldrich, Buchs, Šveicarija)
Ultragrynas vanduo (18,2 mΩcm-1, Millipore vandens valymo sistema (Bedford, JAV))
Chemiškai švarūs reagentai:
Natrio citratas (Sigma-Aldrich, Belgija) Citrinų rūgštis (Sigma-Aldrich, Belgija) Kalio peroksidisulfatas (99%, Roth, Vokietija) Metanolis (99,9%, Roth, Vokietija)
Etanolis (96,3%, Stumbras, Kaunas, Lietuva)
DPPH radikalas (95%, Sigma-Aldrich Chemie, Vokietija)
HPLC grynumo standartiniai junginiai:
Troloksas (98%, Fluka Chemika, Buchs, Šveicarija) Chlorogeninė rūgštis (95.33% HWI Analytik GmBH) Izokvercetinas (94.16%, HWI Analytik GmBH ) Rutino trihidratas (97.11%, HWI Analytik GmBH)
2.3. Aparatūra
Solidago L. genties augalų, žiedų, ir lapų ekstraktams ruošti naudota ultragarso vonelė BioSonic UC100 (Mavajai, JAV)
Solidago L. veikliųjų junginių identifikavimas ir jų antioksidacinio aktyvumo nustatymas atliktas Waters 2695 chromatografu. Naudota ESC sistema (Waters 2695 chromatografas) sudaryta iš
judrios fazės (0,05% trifluoracto rūgšties (A) ir acetonitrilo (B)), kolonėlės (4,6×150 mm, dalelių skersmuo 3 µm, YMC, Europe Gmbh, Vokietija), detektoriaus (Waters UV/VIS 2487, λ= 520 nm), DPPH reagento siurblio (Gilson pump 305, Midletonas, JAV), DPPH reakcijos detektoriaus ( λ=517 nm) ir duomenų registravimo sistemos. Principinė schema pavaizduota 5 paveiksle.
5 pav. ESC- DPPH pokolonėlinės reakcijos principinė schema
2.4. Rykštenės (Solidago L.) veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo
nustatymui naudojami tyrimų metodai
2.4.1. Tiriamo pavyzdžio ruošimas
Tiriamos žaliavos ekstraktai buvo gaminami santykiu 1:100 (w/v) iš 0,1 gramo tiriamojo objekto, užpilant tirpiklio iki 10 ml. Ekstrakcijai atlikti buvo pasirinktas vandeninis 70% metanolio tirpalas (V/V). Paruošti ekstraktai 50 min laikyti ultragarso vonelėje, kurios pastovi temperatūra buvo 25ºC. Prieš ekstraktus injekuojant į ESC sistemą visi tiriamieji pavyzdžiai buvo filtruoti per 0,22 µm sterilius nailoninius švirkštinius filtrus (diametras-13mm, Carl Roth GmbH & Co. KG, Vokietija).
2.4.2. DPPH tirpalo ruošimas
Pradinis reagento tirpalas ruošiamas ištirpinus 15 mg DPPH radikalų 500 ml acetonitrilo. Pagamintas tirpalas laikomas tamsiuose buteliuose, apsaugotuose nuo tiesioginių saulės spindulių. Paruošiamas 14,7 g/l koncentracijos amonio acetato buferis (pH – 7,4). Darbinis DPPH tirpalas gaunamas sumaišius acetonitrilo ir buferio tirpalus. Galiausiai atliekamas paruošto DPPH tirpalo standartizavimas pagal optinį tankį spektrofotometru (Dynamika DB-20, Šveicarija) prie 520 nm bangos ilgio. Gautas tirpalo absorbcijos dydis turi būti iki 0,500±0,005 AV.
2.4.3. Efektyviosios skysčių chromatografijos su pokolonėline DPPH reakijos
detekcija metodas
Chromatografinis skirstymas atliekamas 4,6×150 mm, 3 µm YMC kolonėle (laikyta išoriniame termostate palaikant 25ºC temperatūrą. Po skirstymo judri fazė su išskirstytais junginiais patenka į maišymo trišakį, kur yra sumaišoma su DPPH reagentu, kuris tuo pačiu metu tiekiamas ESC siurblio Gilson pump 305. Sumaišyti tirplai patenka į reakcijos kilpą, iš kurios po reakcijos tiriamasis tirpalas patenka į Waters UV/VIS 2487 detektorių, kuriame matuojama pratekančio tirpalo absorbcija. Analizės sąlygos:
Gradientinė sistema: A – trifluoracto rūgšties vandeninis tirpalas (0,05 %), B – acetonitrilas;
Eliuacija: 0 min – 95% A ir 5% B, 5 min – 88% A ir 12% B, 50 min – 70% A ir 30% B, 51 min – 10% A ir 90% B, 56 min – 10% A ir 90% B, 57 min – 95% A ir 5% B; Injekcijos tūris 10 µl;
Tėkmės greitis: 1 ml/min; Detekcija: λ=520 nm;
DPPH reagento tėkmės greitis-1 ml/min.
Kilpa - 20 metrų, pagaminta iš TFE (išorinis diametras 1,58 mm, vidinis 0,25mm), laikoma termostate esant 50oC temperatūrai.
2.4.4. Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenys statistiškai įvertinti „MS Excell 2007” (Microsoft, JAV) programa ir „SPSS 20” (“IBM, JAV)” statistikos programa. Rezultatai laikyti statistiškai reikšmingais, kai p<0,05.
3.
TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. ESC-DPPH pokolonėlinio metodo vystymas ir optimizavimas
Efektyviosios skysčių chromatografijos pokolonėlinės reakcijos metodo rezultatų patikimumas priklauso nuo efektyvaus kompleksinių junginių išskirstymo bei nuo cheminės reakcijos, vykstančios tarp antioksidanto ir pasirinkto reagento. Norint tai užtikrinti svarbu parinkti optimalias sąlygas reikalingas cheminei reakcijai vykti pokolonėlinėje sistemoje. Šiame darbe eksperimentiniams tyrimams naudojamos validuotos ESC sistemos ir chromatografinio skirstymo metodikos, kurios užtikrina optimalias ir stabilias chromatografinės analizės sąlygas.
Šio tyrimo metu Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymui buvo naudojamas DPPH reagentas, kurio veikimo mechanizmas pagrįstas elektronų pernašos (redokso) reakcijomis. Redokso reakcijoms vykti įtakos turi reagentų koncentracija, reakcijos terpė ir reakcijos laikas. [34] Reagento koncentracija ir reakcijos terpė pasirinkta, remiantis moksliniuose literatūros šaltiniuose aprašyta metodika.
Pokolonėlinėje sistemoje vykstančių reakcijų trukmė gali svyruoti priklausomai nuo kai kurių pasirinktų reakcijos sąlygų. Anksčiau atlikti ESC pokolonėlinės sistemos tyrimai, kurių metu nustatyta, kad reakcijos laikas reaktoriuje priklauso nuo trijų pagrindinių faktorių: 1) chromatografinio skirstymo metodikos eliuentų tėkmės greičio; 2) pokolonėlinio reagento tėkmės greičio; 3) reaktoriaus reakcijos kilpos tūrio. Šiam tyrimui eliuentų ir pokolonėlinio reagento tėkmės greitis buvo pasirinti optimalūs, remiantis anksčiau atliktais tyrimais [34]Taip pat pagal anksčiau patvirtintas metodikas buvo pritaikytas detektorius, eliuacijos greitis, tirpiklių sistema, injekavimo tūris ir detektoriaus bangos ilgis.
Optimizavus ESC metodiką gaunami rezultatai yra tikslūs, o gauti duomenys atsikartojantys. Ši optimizuota metodika yra tinkama atlikti Solidago L. junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymą.
3.1.1. Kilpos ilgio parinkimas
Augalinio antioksidanto ir DPPH reagento reakcijos kinetika priklauso nuo įvairių, jau anksčiau minėtų veiksnių. Priklausomai nuo pasirinktų sąlygų, antioksidacinė reakcija gali vykti nuo kelių minučių iki kelių valandų. [34] Vienas svarbesnių etapų vykdant ESC – DPPH pokolonėlines reakcijas yra tinkamas reakcijos reaktoriaus kilpos parametrų parinkimas. Šio tyrimo metu buvo atliekami reakcijų
bandymai, kurių metu buvo siekiama išanalizuoti kaip skirtingų ilgių kilpos įtakoja pokolonėlinį procesą. Eksperimento metu nebuvo keičiamos kitos reakcijos sąlygos - buvo naudojami tie patys bandiniai, reagentai, bei instrumentai. Šiam tyrimui panaudotos dvi skirtingų parametrų reakcijos kilpos: 3m ir 20m( TFE, vidinis diametras -0.25 mm , išorinis diametras -1.58 mm). Eksperimentas buvo vykdomas kambario temperatūroje. Atlikus analizę buvo nustatyta, kad naudojant ilgesnę reakcijos reaktoriaus kilpą buvo gautas didesnis neigiamas smailių aukštis. Remiantis rezultatais galima daryti išvadą, kad tiriant Solidago L. ekstraktuose esančius veikliuosius junginius, pasižyminčius antioksidacinėmis savybėmis ir naudojant DPPH reagentą tinkamiausias kilpos ilgis tiksliam antioksidantų įvertinimui yra 20 metrų. Gauti rezultatai pavaizduoti 6 pav.
Statistiškai įvertinus duomenis galima teigti, kad 20 metrų ir 3 metrų kilpų smailių aukščiai reikšmingai skyrėsi. Apskaičiuotas reikšmingumo lygmuo, naudojant T-testą nepriklausomoms imtims (p < 0,05).
3.1.2. Temperatūros parinkimas
Kilpos ilgis yra svarbus faktorius norint užtikrinti efektyvų antioksidacinio aktyvumo nustatymą efektyviosios skysčių chromatografijos DPPH pokolonėlinės reakcijos metodu. Tačiau taip pat labai svarbu parinkti optimalų temperatūrinį kilpos aplinkos režimą. 2015 metais publikuotame straipsnyje
-25000 -20000 -15000 -10000 -5000 0
3 metru kilpa 20 metru kilpa
S m ail ės au k štis Clorogeno r Rutinas Izokvercitrinas
Marksa ir kt. įrodo temperatūros įtaką augaliniuose ekstraktuose esančių junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymui. Šio tyrimo metu buvo analizuojama kaip temperatūrinė aplinka įtakoja tiriamų veikliųjų junginių smailių auksčius chromatogramose. Gauti rezultatai parodė, kad pasiekus 55 o
C ir didesnę temperatūrą smailių aukštis sumažėja, galimai dėl to, kad įvyksta termodestrukciniai aktyvių komponentų pakitimai. Taip pat šio mokslinio tyimo autoriai tegia, kad 25-35 oC temperatūroje nėra tikslinga nustatinėti Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą, nes antioksidantų kiekiai yra didesni aukštesnėje temperatūroje. Galiausiai padaryta išvada, kad optimaliausia temperatūra vykti pokolėnėlinėms DPPH reakcijoms yra 50 o
C temperatūra. Esant šiai temperatūrai ir naudojant 20 m ilgio kilpą analičių smailių aukščiai gerokai padidėjo, tai greičiausiai įvyko dėl pasikeitusios DPPH reagento ir antioksidanto reakcijos kinetikos. [35] Taigi, remiantis šio tyrimo rezultatais buvo pasirinkta optimaliausia 50oC temperatūra Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymui.
3.2. Metodikos validacija
Pokolonėlinės analizės efektyviam atlikimui yra svarbu užtikrinti optimalias chromatografinio skirstymo sąlygas, bet nemažiau svarbu yra įsitikinti metodo patikimumu. ESC-DPPH metodika buvo validuota nustatant šiuos parametrus: preciziškumą, specifiškumą, minimalią nustatymo ribą (MNK) bei minimalią aptikimo ribą (MAR). Taip pat svarbūs kriterijai metodikai įteisinti yra kalibracinės kreivės lygtis ir koreliacijos koeficientas. Minėti kriterijai ir atspindi kritinius kiekybinio vertinimo taškus. [35]
Duomenys pateikti 2 lentelėje.
Metodo specifiškumas buvo įvertintas atsižvelgiant į du parametrus: sulaikymo trukmę, kuri atsispindėjo tiriamųjų junginių chromatogramose ir PDA spektro atitikimą standartui. Chromatogramose tiriamųjų junginių sulaikymo trukmė turi sutapti su standartų sulaikymo trukmėmis bei spektriniais duomenimis.
ESC pokolonėlinio metodo jautrumas buvo įvertintas atsižvelgiant į du parametrus: minimalią aptikimo ribą (MAR) ir minimalią aptikimo koncentraciją (MAK). Ribos buvo apibrėžtos nustatant signalo – triukšmo santykį. [35]
Metodo preciziškumas buvo nustatytas pagal pakartojamumo (intra-day) bei tarpinio preciziškumo (inter–day) parametrus. Siekiant įvertinti pakartojamumo parametrą tą pačią dieną, tomis pačiomis sąlygomis ( tie patys reagentai, tiriamieji pavyzdžiai bei naudojami instrumentai) 5 kartus buvo atliekamas 4 analičių (chlorogeninės rūgšties, rutino, izokvercitrino, trolokso) vertinimas. Metodo tarpinio
preciziškumo įvertinimas buvo atliktas trijomis skirtingomis dienomis. [35] Intra – day ir inter – day preciziškumas buvo išreikštas santykinio standartinio nuokrypio dydžiu (SSN). SSN- tai atsitiktinio dydžio standartinio nuokrypio ir vidurkio santykis, kuris išreiškiamas procentais. [34]
Gauti pokolonėlinio metodo ESC- DPPH pakartojamumo ir atkuriamumo variacijos koeficientai, kurie neviršijo 3.00 proc. Toks rezultatas yra priimtinas kiekybiniam junginių antiradikalinio aktyvumo įvertinimui. [35]
.
Rykštenės (Solidago L.) žiedų ir lapų ekstraktuose, esančių veikliųjų junginių antioksidacio aktyvumo nustatymui išreikšti naudojamas etaloninis trolokso standartinis tirpalas. Signalo priklausomybė nuo žalingųjų radikalų koncentracijos išreikšta trolokso standarto kalibracine kreive, apskaičiuota naudojant tokią trolokso koncentraciją, kuri reikalinga sukelti ekvivalentišką antioksidacinį aktyvumą (μm). Trolokso kreivė reikalinga norint įvertinti antiradikaliniu poveikiu pasižyminčių junginių aktyvumo kiekybiškumą. Koncentracijos intervale 0,8-205 µg/mL gauta kalibracinė kreivė yra kvadratinės išraiškos (R2=0,9988, Y=-3,86·101·x2+1,81·104·x+1,01·104). [35]
2 lentelė. Tiesioginio ESC-DPPH metodo tiesiškumo, atkuriamumo, minimalios aptikimo ribos (MAR) ir minimalios nustatymo ribos (MNR) reikšmės [35]
Parametrai DPPH pokolonėlinis metodas Troloksas Chlorogeninė rūgštis Rutinas Izokvercitrinas Tiesiškumas (µg/ml) 0.80-205 1.88-60 0.94-30 1.00-33 Preciziškumas: Intra-day SSN (%)a Inter-day SSN (%)b 0.30 1.60 1.90 3.00 1.60 2.00 2.30 2.60 MNR (µg/ml) 0.87 0.83 0.42 0.44 MAR (µg/ml) 1.18 2.77 1.33 1.48
Antioksidantiškai aktyvių junginių aktyvumo kiekybiniam įvertinimui skaičiuojamas trolokso ekvivalentas (ET). ET išreiškiamas trolokso kiekiu (μg), kuris tokiomis pat tyrimo sąlygomis formuoja atitinkamą laisvų DPPH* radikalų surišimo aktyvumą, įvertintą pagal trolokso kalibracinę kreivę (y = ax + b). [34]
ET (μg) apskaičiuojamas pagal formulę:
𝐸𝑇 =𝑆𝑗𝑢𝑛𝑔 − 𝑏 𝑎
čia Sjung. – antioksidantiškai aktyvaus junginio neigiamos smailės plotas DPPH chromatogramoje; a ir b – trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties (y=ax+b) reikšmės. [34]
Antioksidantiškai aktyvių junginių aktyvumas augalinėje žaliavoje įvertintas taikant antiradikalinio aktyvumo ekvivalentą (A). Viename augalinės žaliavos masės kiekyje – grame - esančio pasirinkto junginio A išreiškiamas tokiu trolokso kiekiu (μg), kuris tokiomis pat tyrimo sąlygomis formuoja atitinkamą laisvų DPPH radikalų surišimo aktyvumą, įvertintą pagal trolokso kalibracinę kreivę.
A = ET(jung)(μg) Vinj(ml) × Vekst(ml) mžal(g) , ( μg g)
čia ET(jung) – pasirinkto antioksidantiškai aktyvaus junginio trolokso kiekio ekvivalentas (μg); Vinj – injekuotas bandinio tūris (ml); Vekst – tiriamos augalinės žaliavos ekstrakto kiekis (ml); mžal – tiriamos augalinės žaliavos atsvertas (tikslus) kiekis. [34]
3.3. Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas žiedų
žaliavose
Atliktas Solidago L. žiedų žaliavų, rinktų skirtinguose Lietuvos regionuose, antrinių metabolitų įvertinimas ESC – DPPH pokolonėliniu metodu. Šis metodas gali būti taikomas tiriant įvairius augalus ir yra patogus, nes vienos analizės metu galima identifikuoti aktyvius junginius, bei nustatyti, kokio stiprumo antioksidacinį aktyvumą atitinkamas junginys įtakoja.[34] Junginiai identifikuojami lyginat standartų sulaikymo trukmes su analičių sulaikymo trukmėmis, kurios atsispindi cromatogramose. Rykštenės žiedų metanolinių ekstraktų UV/DPPH chromatograma, gauta atlikus antioksidaciniu poveikiu pasižyminčių Solidago L. junginių tyrimą ESC- DPPH pokolonėliniu metodu. Žiedų ekstraktuose identifikuoti 5 junginiai, kurių sulaikymo laikai: chlorogeninės rūgšties 11,4 min, rutino 23,95 min, hiperozido 25,83 min, izokvercitrino 25,5 min, kvercitrino 30,25 min. Junginių detekcija atlikta esant 520 nm bangos ilgiui. UV chromatogramoje dominuoja rutino smailė. Chromatograma pateikta 7 pav.
Visi 5 antioksidaciniu aktyvumu pasižymintys junginiai buvo nustatyti Solidago gigantea L. žiedų mėginiuose, o Solidago Canadensis L . mėginių chromatogramose nustatytos ir įvertintos 3 analičių smailės. Kanadinės rykštenės mėginiuose didžiausią antioksidacinį aktyvumą parodė chlorogeninė rūgštis ir rutinas, o didžiosios rykštenės ekstraktuose dominavo chlorogeninė rūgštis taip pat nemažą antiradikalinį poveikį turintys hiperozidas ir kvercitrinas. Tyrimo rezultatai pateikti 3 lentelėje.
7 pav. Solidago L. žiedų metanolinių ekstraktų chromatograma. 1 – chlorogeno rūgštis; 2 – rutinas; 3 – hiperozidas 4 –izokvercitrinas 5 – kvercitrinas.
Žiedų mėginys
Chlorogeninė
rūgštis Rutinas Hiperozidas Izokvercitrinas Kvercitrinas
Bendras antioksidacinis aktyvumas ŽC1 16154 23350 - 730 - 40234 ŽC2 11998 33366 - 832 - 46196 ŽC3 24632 19692 - 480 - 44804 ŽG4 13702 454 4840 1478 7766,2 28240,2 ŽC5 11838 33980 - 1254 - 47072 ŽC6 12230 13994 - 1144 - 27368 ŽG7 17896 182 6808 1160 9144 35190 ŽC8 12588 25276 - 854 - 38718 ŽC9 6598 17402 - 648 - 24648 ŽC10 8758 8456 - 964 - 18178
3 lentelė. Solidago L. žiedų ekstraktuose, esančių junginių antioksidacinis aktyvumas (µg/g)
8 pav. Solidago L. žieduose, esančių veikliųjų junginių antioksidacinis aktyvumas proc.
Kaip matoma iš 8 paveikslėlio didžiausias rutino antioksidacinis aktyvumas (72,15 proc.) nustatytas Ž5 žaliavoje, kuri rinkta Vilniuje, Žemuosiuose Karačiūnuose, mažiausias (0,25proc) - ŽG7 (Solidago gigantea L.) žaliavoje, rinktoje Vilniuje, Prašiškių gatvėje (0,25proc). Izokvercitrino antiradikalinė geba Solidago L. lapų ekstraktuose svyravo nuo 0,15 proc iki 29, 95 proc. Aktyviausias izokvercitrinas, esantis didžiosios rykštenės žaliavoje (ŽG4), rinktoje Kaune, Islandijos plente, mažiausiai aktyvus – Vilniuje, Riešėje rinktoje žaliavoje. Chlorogeninės rūgšties antioksidacinis aktyvumas vyravo nuo 23,28 proc. iki 52,13 proc. – didžiausias Ž3 žaliavoje. Hiperozidas ir Kvercitrinas nustatyti tik Solidago gigantea L. žaliavose (ŽG4 ir ŽG7). ŽG4 žaliavoje junginiai atitinkamai pasižymėjo 18,72 proc ir 29,89 proc. antiradikaliniu aktyvumu. ŽG7 žaliavoje esantys junginiai buvo aktyvesni - 20, 11 proc. ir 30,75 proc. 2011 metais Didier Fraisse ir kt. atliktame tyrime, kuriame buvo tiriama 18 astrinių šeimai priklausančių augalų buvo gauti panašūs rezultatai - nustatyta, kad Solidago gigantea L. 18,15 % antioksidacinio aktyvumo sudaro chlorogeninė rūgštis.[36]
Vertinant Solidago L. žiedų, rinktų skirtingose Lietuvos regionuose, ekstraktus nustatytas juose esančių veikliųjų junginių bendras antioksidacinis aktyvumas, kuris svyravo nuo 18178 μg/g iki 47072 μg/g . Didžiausia reikšmė (47072 μg/g) nustatyta Ž5 žaliavoje, rinktoje Vilniaus mieste, Žemuosiuose Karačiūnuose, o mažiausia reikšmė ( 18178 μg/g) - Ž10 žaliavoje, kuri surinkta Tauragės apskrityje, Pagėgių sav. Birbintės kaime. Rezultatai pateikti 9 pav.
Statistiškai apdorojus duomenis galima teigti, kad antioksidacinis aktyvumas skirtinguose Lietuvos regionuose rinktose Solidago L. žaliavose reikšmingai skyrėsi (p < 0,05). Duomenų reikšmingumo statistiniam įvertinimui pritaikyta vienfaktorinė dispersinė analizė ( ANOVA).
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 45000 50000 ŽC1 ŽC2 ŽC3 ŽG4 ŽC5 ŽC6 ŽG7 ŽC8 ŽC9 ŽC10 B en d ras an tioks id ac in is ak tyvum as µ g/g
3.4. Solidago L. veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas lapų
žaliavose
Analizuojant Solidago gigantea L. lapų metaloninius ekstraktus, taip buvo identifikuoti 5 junginiai (rutinas, kvercitrinas, izokvercitrinas, chlorogeninė rūgštis ir hiperozidas), pasižymintys antiradikaliniu poveikiu. Solidago canadensis L. lapų ekstraktuose nustatyti trys junginiai(chlorogeninė rūgštis, izokvercitrinas, rutinas). Junginių identifikavimas vyko pagal standartinių junginių sulaikymo laikus. Lapų metanolinės ištraukos UV/DPPH chromatograma, gauta atlikus rykštenės lapuose esančių bioaktyvių junginių tyrimą tiesioginiu ESC-DPPH metodu pavaizduota 10 pav. Didžiausia neigiama smailė - chlorogeninės rūgšties, kurios sulaikymo trukmė 11,46 min, mažiausia smailė – hiperozido.
Atliktas Solidago L. fenolinių junginių antioksidacinio aktyvumo nustatymas lapų žaliavose, surinktose skirtingose Lietuvos vietovėse. Gauti rezultatai parodė, kad didžiausią radikalinį aktyvumą Solidago canadensis L žaliavose parodė chlorogeninė rūgštis bei rutinas, o Solidago gigantea L. ekstraktuose dominavo chlorogeninė rūgšis bei kvercitrinas. Tyrimo rezultatai pateikti 4 lentelėje
10 pav. Solidago L. žiedų metanolinių ekstraktų chromatograma. 1 – chlorogeno rūgštis; 2 – rutinas; 3 – hiperozidas 4 – izokvercitrinas 5 – kvercitrinas.
10 paveikslėlis. Solidago L. žiedų metanolinių ekstraktų chromatograma. 1 – chlorogeno rūgštis; 2 – rutinas; 3 – hiperozidas 4 – izokvercitrinas 5 – kvercitrinas.
Vertinant Solidago L. lapų ekstraktų veikliųjų junginių antioksidacinį aktyvumą, nustatyta, kad aktyviausia (58120 µg/g) yra chlorogeninė rūgštis, esanti LG4 žaliavoje, rinktoje Kaune, Islandijos plente. Rutino antioksidacinis aktyvumas svyravo nuo 52µg/g iki 32880 µg/g. Mažiausia antiradikalinė geba pasižymėjo LG4 žaliavoje, esantis rutinas, didžiausia – L2 žaliavoje rinktoje Kaune, Raudodvario plente. Kvercitrino antiradikalinis aktyvumas didžiosios rykštenės LG7 žaliavoje, rinktoje Vilniuje, Prašiškiuose buvo 34659,6 µg/g, LG4 žaliavoje – 13348 µg/g. Hiperozidas ir izokvercitrinas nepasižymėjo dideliu aktyvumu lapų ekstraktuose, didžiausios junginių antioksidacinio aktyvumo reikšmės atitinkamai siekė 226 µg/g ir 1064 µg/g. Rezultatai pateikti 11 pav.
Lapų
mėginys: Chlorogeninė rūgštis Rutinas Hiperozidas Izokvercitrinas Kvercitrinas
Bendras antioksidacinis aktyvumas L1 27360 13448 - 718 - 41526 L2 26262 32880 - 530 - 59672 L3 18552 7004 - 86 - 25642 LG4 58120 52 78 1064 13348 72662 L5 25730 6326 - 148 - 32204 L6 34120 13368 - 588 - 48076 LG7 42060 220 226 536,6 34659,6 77702,2 L8 36620 18654 - 246 - 55520 L9 32620 7978 - 34 - 40632 L10 21262 6926 - 302 - 28490
Tiriant Solidago L. lapų, rinktų skirtingose Lietuvos regionuose, ekstraktus nustatytas juose esančių veikliųjų junginių bendras antioksidacinis aktyvumas, kuris, kaip matoma iš 12 pav., svyravo nuo 25642 μg/g iki 77702,2 μg/g . Didžiausia reikšmė (77702,2 μg/g) nustatyta LG7 žaliavoje, rinktoje Vilniaus mieste, Prašiškių gatvėje, o mažiausia reikšmė (25642 μg/g) - L3 žaliavoje, kuri surinkta Vilniuje, Riešėje. Solidago gigantea L. esantys veiklieji junginiai pasižymėjo didesniu aktyvumu nei, junginiai esantys Solidago canadensis L. žaliavų ekstraktuose. Atlikus statistinę analizę nustatyta, kad duomenys tarp skirtingose Lietuvos vietose rinktų žaliavų ekstraktų reikšmingai skyrėsi (p ˂ 0.05).
12 pav. Bendras Solidago L. lapų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas µg/g
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 LC1 LC2 LC3 LG4 LC5 LC6 LG7 LC8 LC9 LC10 Antiok sid ac in is ak tyvum as µ g/g Chlorogeninė rūgštis Rutinas Hiperozidas Izokvercitrinas Kvercitrinas 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 LC1 LC2 LC3 LG4 LC5 LC6 LG7 LC8 LC9 LC10 B en d ras an tioks id ac in is ak tyvum as µ m /g
11 pav. Solidago L. lapų ekstraktuose, esančių veikliųjų junginių antioksidacinis aktyvumas (µg/g)
Lyginant Solidago L. žaliavų (žiedų ir lapų) bandinius, rinktus skirtingose Lietuvos vietovėse bei vertinant jų laisvųjų radikalų surišimo gebą naudojant ESC- DPPH pokolonėlinį metodą, matyti, jog stipresniu aktyvumu pasižymi rykštenės lapų žaliavose, esantys junginiai, išskyrus žaliavas, rinktas Vilniaus rajone - Riešėje ir Žemuosiuose Karačiūnuose, kuriose didesnis junginių aktyvumas matomas žiedų žaliavose . Solidago gigantea L. lapų ekstraktuose esantys junginiai pasižymėjo ženkliai didesniu aktyvumu nei esantys žiedų žaliavose. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu (77702,2 µg/g) pasižymėjo didžiosios rykštenės lapų mėginys iš Vilniaus rajono, Prašiškių gatvės, mažiausiu (18178 µg/g) - kanadinės rykštenės žiedų žaliava, rinkta Tauragės apskrityje, Pagėgių savivaldybėje, Birbintės kaime. Rezultatai pateikti 13 pav. Atlikus statistinę analizę, nustatyta, kad antioksidacinis aktyvumas tarp lapų ir žiedų ekstraktų iš skirtingų Lietuvos regionų reikšmingai skyrėsi. (p ˂ 0.05).
Apibendrinant rezultatus galima teigti, kad skirtingose Lietuvos apylinkėse augančios rykštenės (Solidago L.) lapuose ir žieduose, esantys veiklieji junginiai (hiperozidas, kvercitrinas, rutinas, izokvercitrinas, chlorogeninė rūgštis) pasižymi antioksidaciniu aktyvumu ir gali įtakoti augalo gydomųjų savybių pasireiškimą. Skirtingose vietovėse rinktų žaliavų ekstraktai pasižymėjo skirtinga antiradikaline geba, tai įrodo, kad aplinkos sąlygos turi įtakos Solidago L. veiliųjų junginių antioksidaciniam aktyvumui.
13 pav. Solidago L. lapų ir žiedų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo (µg/g) palyginimas.
13 paveikslėlis. Solidago L. lapų ir žiedų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo (µg/g) palyginimas. 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 Antiok sid ac in is ak tyvum as µ g/g Žiedai Lapai
Dėl savo savybių Lietuvoje augančios rykštenės (S. Canadensis ir S.gigantea) augalų ekstraktai galėtų būti naudojami farmacijos pramonėje, vaistinių augalinių preparatų gamyboje. Tačiau reikėtų atlikti platesnius tyrimus su Solidago L. augalų rūšimis siekiant tuo įsitikinti.
Išvados
1. Atlikus kilpos ilgio modifikacijas, nustatyta, kad rykštenėje esančių veikliųjų junginių antioksidacinio aktyvumo įvertinimui ESC-DPPH pokolonėliniu metodu tinkamiausia yra 20 metrų reakcijos reaktoriaus kilpa.
2. Kiekybiškai įvertintas rykštenės veikliųjų junginių antioksidacinis aktyvumas panaudojant ESC-DPPH pokolonėlinį metodą. S. gigantea žaliavose nustatyti 5 junginiai, turintys antioksidacinių savybių: rutinas, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas ir chlorogeninė rūgštis, S.canadensis – 3 junginiai (izokvercitrinas, chlorogeninė rūgštis, rutinas). Didžiausiu aktyvumu tiek žiedų tiek lapų žaliavų ekstraktuose pasižymėjo chlorogeninė rūgštis (58120 µg/g) ir rutinas (33980 µg/g).
3. Įvertinus bendrą ekstraktų antioksidacinį aktyvumą, bei palyginus veikliųjų junginių pasiskirstymą skirtinguose augalo organuose ( lapuose ir žieduose) ir mėginiuose, rinktuose skirtingose Lietuvos apylinkėse, nustatyta, kad didesniu aktyvumu pasižymėjo lapų žaliavose, esantys veiklieji junginiai. Dižiausiu aktyvumu (77702,2 µg/g) pasižymėjo lapų mėginys iš Vilniaus rajono, Prašiškių gatvės, mažiausiu (18178 µg/g) - žiedų žaliava, rinkta Tauragės apskrityje, Pagėgių savivaldybėje, Birbintės kaime. Rezultatai tarpusavyje reikšmingai skyrėsi (p<0,05).
Literatūros sąrašas:
1. S.K Sharma, Lalit Singh, Suruchi Singh. A Review on medicinal plants having antioxidant potential. Indian Journal of Research in Pharmacy and Biotechnology 2013;1(3): 2320 – 3471.
2. F. Pourmorad, S. J. Hosseinimehr, N. Shahabimajd. Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants. African Journal of Biotechnology 2006; 5(11):1142-1145.
3. Tao JIANG, Bao-Kang HUANG, Lu-Ping QIN. A survey of chemical and pharmacological studies on Solidago. Journal of Chinese Integrative Medicine 2006;4(4 ): 430-435
4. Angélica A. Mercandeli, Geisilane P. Bessa, Silas N. Ronchi, Tatiana P. S. Segato, Ary G. da Silva. Evidence for the Safe Use of the Extract from the Brazilian Arnica, Solidago chilensis Meyen, in Primary Health Care. Chinese Medicine, 2012; 3: 4-8.
5. Walid Hamdy El-Tantawy. Biochemical effects of Solidago virgaurea extract on experimental cardiotoxicity. J Physiol Biochem 2014;70:33–42.
6. Johane Guay, Pierre Champagne, Pascal Guibord, Joerg Gruenwald. The Efficacy and Safety of a Patent Pending Combination of Ginger and Goldenrod Extracts on the Management of Cold Symptoms: A Randomized, Double-Blind Controlled Trial. Food and Nutrition Sciences 2012;3:1651-1657.
7. Marksa M., Radušienė J., Marksienė R., Kiliuvienė G. Rykštenės (Solidago. L) rūšies augalų ir rykštenėje besikaupiančių veikliųjų medžiagų svarba gydant šlapimo organų ligas. Medicinos teorija ir praktika T. 18 (Nr. 2), 2012. p. 158–160 p. [Žiūrėta 2014-09-17] Prieiga per internetą:
http://www.mtp.lt/files/medicina_TP_2012_2_str07.pdf
8. Prieiga per internetą [žiūrėta 2015-03-15] http://extranet.vvkt.lt/paieska/ 9. Prieiga per internetą [žiūrėta 2015-03-15] http://www.vaistai.lt/
10. Thiem B., Wesołowska M., Skrzypczak L., and Budzianowski J. Phenolic compounds in two Solidago L. species from in vitro culture. Acta Poloniae Pharmaceutica – Drug Reasearch, 2001;58:277 – 281.
11. Edita Stefanica, Zlatko Puskadijaa, Ivan Stefanica, Dragan Bubalob. Goldenrod: a valuable plant for beekeeping in northeastern Croatia. Bee World 2003;84(2): 00–00.
12. European Pharmacopea 6.0, p. 1999 – 2001.
13. Barbara Kołodziej, Radosław Kowalski and Bogdan Kędzia. Antibacterial and antimutagenic activity of extracts aboveground parts of three Solidago species: Solidago virgaurea L.,
Solidago canadensis L. and Solidago gigantea Ait. Journal of Medicinal Plants Research 2011; 5(31):6770-6779.
14. Šiukšta R. Paprastoji rykštenė – Solidago virgaurea L. 2008. [žūrėta 2014-10-12] Prieiga per internetą: http://www.botanikos-sodas.vu.lt/lt/zalieji-puslapiai/augalu-gentys/rykstene
15. Wiesława Rosłon, Ewa Osinska, Katarzyna Mazur, Anna Geszprych. Chemical characteristics of European goldenrod (Solidago virgaurea L. subsp. virgaurea) from natural sites in central and eastern Poland. Acta Sci. Pol., Hortorum Cultus 2014;13(1):55-65.
16. S.M. Sabirac, S.D. Ahmad, A. Hamid, M.Q. Khan, M.L. Athayde, D.B. Santos, A.A. Boligon, J.B.T. Rocha. Antioxidant and hepatoprotective activity of ethanolic extract of leaves of Solidago microglossa containing polyphenolic compounds. Food Chemistry 2012;131:741–747.
17. N.C. Cook and S. Samman. Flavonoids - Chemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources. Nutritional Biochemistry 1996;7:66-76.
18. Chantal G.M. Heijnen, Guido R.M.M. Haenen, Jef A.J.M. Vekemans, Aalt Bast. Peroxynitrite scavenging of flavonoids: structure activity relationship. Environmental Toxicology and Pharmacology 2001;10:199–206.
19. Nagendran Balasundram, Kalyana Sundram, Samir Samman. Phenolic compounds in plants and agri-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence, and potential uses. Food Chemistry 2006;99:191–203.
20. Donato F. Romagnolo PhD, MS and Ornella I. Selmin PhD. Flavonoids and Cancer Prevention: A Review of the Evidence. Journal of Nutrition in Gerontology and Geriatrics 2012; 31:206– 238.
21. Elliott Middleton, JR., Chitan Kandaswami, and Theoharis C. Theoharides. The Effects of Plant Flavonoids on Mammalian Cells: Implications for Inflammation, Heart Disease,and Cancer. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics 2000;52:673–751.
22. Aneta Wojdyło, Jan Oszmianski, Renata Czemerys. Antioxidant activity and phenolic compounds in 32 selected herbs. Food Chemistry 2007;105:940–949.
23. C. Güntner, C. Barra, M.V. Cesio, E. Dellacassa, L. Ferrando, F. Ferreira, C. García, G. González, H. Heinzen, A. Lloret, D. Lorenzo, P. Menéndez, D. Paz, S. Soule, A. Vázquez, P. Moyna. ANTIOXIDANT PROPERTIES OF SOLIDAGO CHILENSIS L. FLAVONOIDS. Acta horticulturae 1999;501:159-163.
