KAVOS PUPELIŲ (COFFEA ARABICA L.) SUDĖTYJE ESANČIŲ PAGRINDINIŲ BIOLOGIŠKAI AKTYVIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖ IR KIEKYBINĖ ANALIZĖ

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

JONAS LENGVENIS

KAVOS PUPELIŲ (COFFEA ARABICA L.) SUDĖTYJE ESANČIŲ

PAGRINDINIŲ BIOLOGIŠKAI AKTYVIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖ

IR KIEKYBINĖ ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Doc. dr. Andrejus Ţevţikovas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis Data:

KAVOS PUPELIŲ (COFFEA ARABICA L.) SUDĖTYJE ESANČIŲ

PAGRINDINIŲ BIOLOGIŠKAI AKTYVIŲ JUNGINIŲ KOKYBINĖ

IR KIEKYBINĖ ANALIZĖ

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Andrejus Ţevţikovas Data

Recenzentas Darbą atliko

Raimondas Benetis Magistrantas

Jonas Lengvenis

Data Data

TURINYS

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 12

1.1. Arabinis kavamedis (lot. Coffea arabica L.) ... 12

1.2. Augalo sėklų panaudojimas kavos pramonėje ... 13

1.2.1. Kavos pupelių apdirbimo procesas ... 14

1.3. Kavos pupelių cheminė sudėtis ... 16

1.3.1. Cheminė sudėtis ţaliose kavos pupelėse ... 16

1.3.2. Cheminė sudėtis skrudintose kavos pupelėse... 18

1.4. Tiriamųjų veikliųjų medţiagų savybės ... 19

1.4.1. Kofeino apibūdinimas ... 19

1.4.2. Chlorogeno rūgšties apibūdinimas ... 22

1.4.3. Kafestolio apibūdinimas ... 24

1.4.4. Trigonelino apibūdinimas ... 25

1.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymas tiriamosioms medţiagoms analizuoti .. 27

1.5.1. Medţiagų ekstrakcija ... 27

1.5.2. Chromatografinės analizės parametrų parinkimas ... 27

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 30

2.1. Tyrimo planavimas ... 30

2.2. Tyrimo objektas ir jo pasirinkimo kriterijai ... 30

2.3. Tyrimo medţiagos ir aparatūra ... 31

2.3.1. Medţiagos ir reagentai ... 31

2.3.2. Naudota aparatūra ... 31

2.4. Kavos pupelių skrudinimas ... 31

2.5. Tyrimo metodika ... 32

2.5.1. Tiriamų medţiagų išskyrimas iš ţalių ir skrudintų kavos pupelių ... 32

2.6. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos ... 33

2.7. Duomenų analizė ... 34

3.1. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ... 35

3.1.1. Specifiškumas ... 35

3.1.2. Tiesiškumas ... 37

3.1.3. Preciziškumas ... 40

3.1.4. Ribos ... 42

3.2. Ţalių C. arabica rūšies kavos pupelių tiriamųjų medţiagų kiekybinio įvertinimo rezultatai . 42 3.3. Skrudinimo proceso įtaka C. arabica rūšies kavos pupelių tiriamųjų medţiagų koncentracijoms ... 44

4. IŠVADOS ... 50

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 51

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 52

SANTRAUKA

J. Lengvenio magistro baigiamasis darbas „Kavos pupelių (Coffea arabica L.) sudėtyje esančių pagrindinių biologiškai aktyvių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė“/ mokslinis vadovas doc. dr. A. Ţevţikovas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra. – Kaunas.

Darbo tikslas: išsiaiškinti, kaip kinta kavos pupelių sudėtyje esančių pagrindinių biologiškai

aktyvių junginių (kofeino, chlorogeno rūgšties, kafestolio ir trigonelino) sudėtis bei kiekis, dėl pramoniniame apdorojime taikomo skrudinimo proceso, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką.

Darbo uţdaviniai: Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodiką

medţiagų kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui. Taikant ESC metodiką, identifikuoti ir nustatyti

Coffea arabica rūšies ţalių ir skrudintų kavos pupelių cheminę sudėtį. Palyginti, kaip pasikeitė

cheminių junginių sudėtis bei jų kiekybės rodikliai po skrudinimo proceso.

Tyrimo objektas ir metodai: Kavamedţio (lot. Coffea) genties augalo ţalios sėklos. Tyrimo

metu kokybiniam ir kiekybiniam junginių nustatymui naudotas ESC–DMD metodas. Kofeino, trigonelino, chlorogeno rūgčties (CGA) nustatymui buvo naudojami ţalių ir skrudintų kavos pupelių vandeniniai ekstraktai (2:100), ekstrahuota 10 min verdančiu vandeniu, o kafestolio nustatymui buvo ţalioms ir skrudintoms kavos pupelėms atlikta saponifikacija. Chromatografinis skirstymas buvo atliktas naudojant 250x4,6 mm, 5 μm ACE C18 kolonėlę, injekcijos tūris 10 μl. CGA, kafestolio, trigonelino nustatymui mobilią fazę sudarė 0,05% trifluoracto rūgšties vandeninio tirpalo ir acetonitrilo gradientinė sistema, o kofeino – trietilamino ir acetonitrilo gradientinė sistema, tėkmės greitis – 1,2 ml/min, kolonėlės temperatūra 25 °C.

Rezultatai ir išvados: Optimizuota efektyviosios skysčių chromatografijos metodika kofeino,

chlorogeno rūgšties, kafestolio bei trigonelino medţiagų kokybinei ir kiekybinei analizei, pagal specifiškumo, tiesiškumo, ribų ir preciziškumo kriterijus. Duomenys laikyti statistiškai patikimais, kai p < 0,05. Pritaikius ESC metodiką, identifikuota ir nustatyta Coffea arabica rūšies ţalių ir skrudintų kavos pupelių cheminė sudėtis. Ţaliose kavos pupelėse trigonelino, chlorogeno rūgšties, kafestolio ir kofeino nustatyta atitinkamai: 11,71 mg/g, 40,17 mg/g, 4,15 mg/g, 12,43 mg/g. Skrudintose kavos pupelėse trigonelino, chlorogeno rūgšties, kafestolio ir kofeino nustatyta atitinkamai: 4,61 mg/g, 4,88 mg/g, 4,24 mg/g, 15,50 mg/g. Eksperimentiškai įrodyta, kad po skrudinimo proceso kiekybės rodikliai pasikeičia netolygiai. CGA ir trigonelino kiekis sumaţėja, kofeino padidėja bei kafestolio praktiškai nepakinta. Šio darbo metu optimizuotas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas gali būti taikomas kokybinei ir kiekybinei kofeino, CGA, trigonelino ir kafestolio analizei atlikti, tiriant visas kavamedţio (Coffea L.) genties rūšis.

SUMMARY

The aim of the study: Find out, how to change the composition and quantity of the main

biologically active compounds (caffeine, chlorogenic acid, trigonelline and cafestol) in coffee beans for industrial roasting process, by high performance liquid chromatography method.

Objective: To optimize high performance liquid chromatography (HPLC) methodology for

qualitative and quantitative evaluation of substances. Applying HPLC methodology to identify and determine the chemical composition of green and roasted coffee beans in Coffea arabica. Compare how change the composition and quantity rate of the chemical compounds after the roasting process.

Object and methods: The object of research is the green seeds of Coffea genus. Qualitative

and quantitative determination of compounds was performed using HPLC-DAD. Green and roasted coffee beans was extracted with boiling water for 10 minutes for the determination of caffeine, trigonelline, chlorogenic acid (CGA). For determination of cafestol, green and roasted coffee beans were prepared by saponification. Chromatographic fractionation of active agents was carried out with 250x4,6 mm, 5 μm ACE-C18 column, injection volume – 10 μL, elution flow rate – 1.2 ml/min. The mobile phase of gradient elution system consisted of 0,05% aqueous trifluoroacetic acid and acetonitrile for evaluation of CGA, cafestol and trigonelline and the mobile phase of gradient elution system consisted of triethylamine and acetonitrile for evaluation of caffeine.

Results and Conclusions: The HPLC methodology was optimized for qualitative and

quantitative analysis of caffeine, chlorogenic acid, trigonelline and cafestol by criteria of specificity, linearity, precision and limits. Data were considered statistically reliable when p < 0,05. Applying HPLC methodology were identified and established chemical composition of green and roasted coffee beans of Coffea arabica kind. In Green coffee beans trigonelline, chlorogenic acid, cafestol and caffeine found respectively: 4,61 mg/g, 4,88 mg/g, 4,24 mg/g, 15,50 mg/g. In Roasted coffee beans trigonelline, chlorogenic acid cafestol and caffeine found respectively: 4,61 mg/g, 4,88 mg/g, 4,24 mg/g, 15,50 mg/g. Experimentally proved that after the roasting process the quantity changes unevenly. Content of CGA and trigonelline were reduced, caffeine increases and cafestol virtually unchanged. In this work, HPLC method was optimized and can be apply to both qualitative and quantitative analysis of caffeine, CGA, trigonelline and cafestol in the whole Coffea L. species of the genus.

SANTRUMPOS

ACN – acetonitrilas; CD – cukrinis diabetas;

DMD – diodų matricos detektorius;

DMD-MS – diodų matricos detektorius su masių spektrometru; ECF – Europos kavos federacija (angl. European Coffee Federation); ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FAO – Jungtinių Tautų maisto ir ţemės ūkio organizacija (angl. The Food and Agriculture

Organization of the United Nations);

ICO – Tarptautinė kavos organizacija (angl. International Coffee Organization); IŠL – išeminė širdies liga;

KOH – kalio hidroksidas; p - reikšmingumo lygmuo; R2 – koreliacijos koeficientas;

SN – standartinis nuokrypis;

SSN – santykinis standartinis nuokrypis; tBME – tret-butilmetileteris;

TFA – trifluoracto rūgštis; UV – ultravioletiniai spinduliai.

SĄVOKOS

Saponifikacija – riebalų skaidymas šarmais; riebalų muilinimas; Analitė – mėginyje nustatomas komponentas;

Mailardo reakcija – reakcija, kuri vyksta tuomet, kai esant aukštai temperatūrai cukrūs jungiasi su

baltymais ir susiformuoja naujos, sudėtingos molekulės;

ĮVADAS

Kava yra gėrimas, kuriuo kasdien mėgaujasi milijonai ţmonių visame pasaulyje, ne tik dėl plačiai vertinamo skonio ir stimuliuojančio poveikio. Kavą galima laikyti priemone socialiniams santykiams palaikyti bei taip pat ji daţnai geriama poilsio metu. Kavos populiarumas lėmė tai, kad ji tapo viena iš svarbiausių pasaulio prekių [30].

Kavos gamybai daţniausiai naudojamos arabinio kavamedţio (lot. Coffea arabica L.) sėklos (vadinamos kavos pupelėmis). Lietuvoje, kaip ir visame pasaulyje, kava yra vienas iš populiariausių ir vis daţniau vartojamų gėrimų kasdieniniame gyvenime. 2015 metais Lietuvoje vidutiniškai vieno gyventojo per metus suvartotos kavos kiekis siekė 4 kg, tačiau tai nėra didelis kiekis, nes tuo tarpu Suomijoje – 12,2 kg (daugiausiai Europoje) [99]. Remiantis kavos kiekio suvartojimu bei kavos pupelėse esančių cheminių junginių sudėtimi, galime daryti prielaidą, kad tam tikras suvartotas kavos kiekis gali įtakoti ţmogaus savijautą ir sveikatos būklę. Visos darbe tiriamos medţiagos (kofeinas, chlorogeno rūgštis (CGA), trigonelinas ir kafestolis) yra biologiškai aktyvios ir pasiţymi tam tikru, joms būdinu, farmakologiniu poveikiu [24].

Trigonelinas pasiţymi priešuţdegiminiu, antioksidantiniu, priešmigreniniu, anti-karcinogeniniu, hipocholesteroleminiu bei antidiabetiniu poveikiu [29], gali sukelti karcinomos ląstelių atsirarimą [7], bet gali ir slopinti [91]. Kofeinas veikia CNS [1], širdies ir kraujagyslių sistemą [104], gali ir sumaţinti, ir padidinti organizmo jautrumą insulinui [60]. CGA pasiţymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis ir dėl šios prieţasties yra plačiai ţinoma ir vertinama [104]. Lietuvoje pastaruoju metu pradėta vis daugiau vartoti ţalios kavos pupelių ir būtent dėl to, jog jos cheminėje sudėtyje yra daugiau chlorogeno rūgšties, kuri taip pat pasiţymi ir lipidų metabolizmu [16]. Kafestolis taip pat pasiţymi anti-kancerogeninėmis, hepatoprotekcinėmis ir neuroprotekcinėmis savybėmis [48], tačiau blokuoja cholesterolio homeostazę [68].

Kofeino, chlorogeno rūgšties, trigonelino ir kafestolio kokybinė ir kiekybinė sudėtis kavos pupelėse kinta priklausomai nuo jų apdorojimo proceso. Naudojamas skrudinimo procesas yra vienas iš pagrindinių faktorių, kuris lemia stiprų kavos pupelių cheminės sudietės pokytį [24]. Labai svarbu suprasti ir ţinoti, kaip kinta šių medţiagų koncentracija bei kokio farmakologinio poveikio vartojant kavą galima tikėtis.

Šiems junginiams nustatyti, plačiai pritaikomos efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) analizės metodikos. Šiame darbe atliekamas tyrimas, kurio metu nustatyta, kaip kinta kavos pupelėse esančių minėtų biologiškai aktyvių junginių kiekis skrudinimo proceso metu. Tyrimas atliekamas naudojant optimizuotą ir validuotą ESC analizės metodą. Nustatyti analizuojamų medţiagų kiekiai praktiškai parodo, kaip varijuoja šių junginių koncentracija skrudinimo proceso metu. Remiantis

gautais duomenimis ir ţiniomis apie šias medţiagas, galima individualiai pasirinkti, kokią kavą norime vartoti ir su kokia chemine sudėtimi.

Tytimo tikslas: išsiaiškinti, kaip kinta pagrindinių kavos pupelėse esančių biologiškai aktyvių junginių (kofeino, chlorogeno rūgšties, kafestolio ir trigonelino) sudėtis bei kiekis dėl pramoniniame apdorojime taikomo skrudinimo proceso taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas:

Išsiaiškinti, kaip kinta kavos pupelių sudėtyje esančių pagrindinių biologiškai aktyvių junginių (kofeino, chlorogeno rūgšties, kafestolio ir trigonelino) sudėtis bei kiekis, dėl pramoniniame apdorojime taikomo skrudinimo proceso, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką.

Darbo uţdaviniai:

1. Optimizuoti efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką kofeino, chlorogeno rūgšties, kafestolio bei trigonelino medţiagų mišinio kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui.

2. Taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, identifikuoti ir nustatyti

Coffea arabica rūšies ţalių kavos pupelių cheminę sudėtį iki skrudinimo proceso.

3. Taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodiką, nustatyti Coffea arabica rūšies kavos pupelių cheminę sudėtį po skrudinimo proceso.

4. Palyginti, kaip pasikeitė cheminių junginių sudėtis bei jų kiekybės rodikliai po skrudinimo proceso.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1.

Arabinis kavamedis (lot. Coffea arabica L.)

Arabinis kavamedis (lot. Coffea arabica L.) – daugiametis visţalis krūmas arba nedidelis medelis, priklausantis lipikinių (Rubiaceae) šeimai (1 pav.). Tai labiausiai paplitusi kavamedţių (Coffea) rūšis, auginama daugelyje tropinių šalių, tačiau galinti augti ir natūraliai [55, 43].

Kavamedis kilęs iš Afrikos atogrąţų, esančių šiaurės rytuose (Pietinė Etiopija), auga nuo 950 metrų iki 1,950 metrų virš jūros lygio zonoje. Plantacijose daţniausiai su kitos genties augalais yra apkarpomas ir savo forma primena nedidelį krūmą [55, 107]. Negenėjamas medelis apytiksliai išauga iki 5 metrų aukščio [98, 106], bet gali būti ir aukštesnis su būdingu horizontaliu šakojimusi [107]. Nors daţniausiai augalas neatsparus tropiniams karščiams, esančio ţemiau minėto jūros lygio, tačiau prisitaiko atvejų, kai šis augalas auga ir tropinėse vietovėse. Teigiama, jog dėl besikeičiančio klimato ir miškų nykimo, arabinio kavamedţio augimo sąlygoms tampant prastesnėms, gaunamas maţesnis šio augalo derlius [107, 5]. Šiuo metu, arabinis kavamedis komerciniais tikslais kultivuojamas kavos plantacijose paplitusiose įvairiose subtropiniuose ir tropiniuose srityse visame pasaulyje, o remiantis Tarptautinės kavos organizacijos (ICO – angl. International Coffee Organization) duomenimis, plačiausiai – Etiopijoje, Indonezijoje, Vietname, Indijoje, Brazilijoje [107, 99].

Arabinis kavamedis turi lygius, visţalius, daţniausiai blizgius, tamsiai ţalios spalvos, plačius, priešinius, trumpakočius, elipsės formos, lapus su banguotu kraštu bei gerai matomomis gyslomis. Po 3-4 vegetacijos metų pradeda vesti vaisius bei duoti derlių. Augalas pradeda ţydėti pavasarį. Ţiedai yra balti, aromatingi (kvapnūs), ţvaigţdės formos, hermafroditiniai, su baltu, vamzdišku ir paprastai turinčiu 5 vainiklapius vainikėliu bei po 2-9 sudaro paţastines kekes. Ţiedai ţydi stipriai prasiskleidę, todėl yra aiškiai matomi 5 statmeni ţiedo kuokeliai. Augalui praţydėjus, vaisiai prinoksta maţdaug 10 mėnesį. Prinokę vaisiai (kaulavaisiai) paprastai yra raudoni, tačiau nokstant, spalva gali keistis nuo nesubrendusių vaisių ţalios spalvos į geltoną, o vėliau iki raudonos arba purpurinės spalvos. Išorinis sluoksnis yra minkštas, valgomas ir saldaus skonio, viduje yra dvi arba kartais viena sėkla. Vaisiaus apyvaisis sudarytas iš blizgaus egzokarpio, storo mezokarpio ir gana plono, bet kieto vidinio endokarpio sluoksnio, kuriame ir yra sėklos. Sėklos yra ţalsvos spalvos (tamsiai rudos – tik po skrudinimo), 8.5-12.5 mm ilgio, elipsės formos su plokščiu vidiniu ir išgaubtu išoriniu paviršiumi bei giliu grioveliu, esančiu plokščioje pusėje. Kiekviena sėkla yra padengta plona membrana (epidermiu), kuri daţnai vadinama „sidabrine odele“, o pačią sėklą sudaro vadinamas endospermas. Po apdorojimo, plokščioje pusėje esančiame pailgame griovelyje, lieka matoma sidabrinės spalvos liekana [107, 98, 106].

Sunokę augalo vaisiai daţniausiai naudojami kavamedţio sėklų išgavimui. Šios sėklos yra naudojamos maisto pramonėje, daţniausiai kavos gamyboje ir plačiai ţinomos, kaip kavos pupelės.

1.2.

Augalo sėklų panaudojimas kavos pramonėje

Arabinis kavamedis, naudojamas kavos gėrimui ruošti, yra vienas iš svarbiausių komerciniams tikslams naudojamų augalų [107]. Teigiama, jog kavos pupelės yra viena iš vertingiausių tarptautinių prekių po naftos, ypač tokioms šalims, kaip Etiopija, kurios didţiausią bendro vidaus produkto dalį sudaro pajamos, gautos iš kavos pupelių eksporto [55]. Kavos eksporto mastas yra didţiulis. Remiantis ICO ir Jungtinių Tautų maisto ir ţemės ūkio organizacijos (angl. FAO – The Food and Agriculture Organization of the United Nations) pateiktais statistiniais duomenimis [99, 100], 2016 metais bendra kavos pupelių produkcija iš visų eksportuojančių šalių buvo 9097440 tonų ir tai sudarė 0,1 % daugiau, negu 2015 metais (1 pav.). O pasaulinis kavos suvartojimas nuo 2015 metų iki 2016 metų siekė 9342780 tonų, tai 1,9 % daugiau, negu buvo nustatyta 2012-2013 metais (2 pav.).

1 pav. Bendra produkcija iš visų eksportuojančių šalių (ICH prekybos statistika)[99]

2 pav. Pasaulinis kavos suvartojimas (ICH prekybos statistika)[99]

Remiantis ICO ir FAO, taip pat Europos kavos federacijos (angl. ECF – European Coffee Federation) [101] statistiniais duomenimis, kelis metus iš eilės didţiausia kavos pupelių eksportuotoja išlieka Brazilija, o vartotoju – Europos šalys. Lietuvoje kavos suvartojimas nėra toks didelis, lyginant su kitomis Europos šalimis. 2015 metais Lietuvoje vidutiniškai vieno gyventojo per metus suvartotos kavos kiekis siekė 4 kg, kai tuo tarpu Suomijoje – 12,2 kg, atitinkamai į Lietuvos panašus per metus suvartotos kavos kiekis tenka ir kitoms Baltijos šalimis: Latvijoje jis siekia 3 kg, Estijoje – 5,3 kg [99]. Lyginant tų pačių šalių kavos importą 2014 metais, visos trys Baltijos šalys: daugiausiai lėšų skyrė

skrudintai, maţiau tirpiai, o maţiausiai ţaliai kavai įsigyti, kai tuo tarpu Suomija priešingai – daugiausia ţaliai kavai, maţiau skrudintai ir maţiausiai tirpiai. Palyginus tai, kiek lėšų Lietuva bei Suomija investuoja į skirtingų kavos rūšių įsigijimą, galima teigti, kad Lietuva investuoja į skrudintą kavą 1,8 karto daugiau, į tirpią 1,03 karto maţiau bei net 78 kartus maţiau lėšų į ţalią, negu Suomija [100].

Pramoninėje kavos gamyboje daţniausiai yra naudojamos dvi kavamedţio rūšys: Coffea

arabica bei Coffea canephora (robusta) (didysis kavamedis) (iš kurių sėklų atitinkamai yra

gaminamos „Arabika“ arba „Robusta“ kavos rūšys) [35]. Liberinis kavamedis (Coffea liberica) taip pat kultivuojamas komerciniais tikslais, tačiau tik nedideliu procentu [2]. Kavos gėrimas daţniausiai gaminamas iš Coffea arabica kavamedţio genties skrudintų sėklų (pupelių). Arabinis kavamedis sudaro apie 64 % pasaulinės kavos produkcijos, o didysis kavamedis – 35 % [35]. Remiantis ICO statistiniais duomenimis, 2016 metais Coffea arabica sudarė 63 % visos pasaulinės kavos pupelių produkcijos [99].

1.2.1. Kavos pupelių apdirbimo procesas

Visas paruošimo procesas, nuo ţaliavos apdorojimo iki galutinio paruošimo (kavos uţplikymo puodelyje) – sudėtingas. Blizgūs raudoni vaisiai skinami, mėsinga išorinė uogų dalis pašalinama ir tada jų šviesios spalvos sėklos (pupelės) siunčiamos į malūnus, pašalinti standųjį išorinį sluoksnį, kuris gaubia sėklas. Paskui pupelės arba eksportuojamos, arba prieš eksportuojant, sumaišomos su kitomis to regiono pupelėmis. Sudėtingas skrudinimo procesas paprastai įvyksta toje šalyje, kurioje gėrimas ruošiamas [107, 35, 102].

Kavos derliui nuimti naudojami keturi metodai. Pirmuoju „nuplėšimo“ metodu derlius nuimamas rankomis, taip pašalinant visas prinokusias uogas, ţiedų likučius, neprinokusias ar stipriai pernokusias uogas. Antruoju metodu naudojamos šukos, kuriomis valomi medţiai. Šiuo metodu pašalinamos visos prinokusios uogos, paliekant neprinokusias uogas, taip pat ţalius lapus, kurie vis dar prijungę prie medţio šakų. Tai laiko verta investicija, kuri leidţia gauti didesnį derlių, nes neprinokusios uogos galiausiai taps prinokusiomis ir padidins būsimą derlių [102]. Trečiasis – derliaus nuėmimas gali būti mechaninis. Prie medţio kamieno pritvirtinamas virpintuvas, kuris nupurto visas prinokusias uogas, kurios nukrenta ant ţemės ir tampa lengviau pasiekiamos. Paskutinis būdas yra pats brangiausias, nes jo metu abiejomis rankomis skinamos tik prinokusios uogos. Šis metodas yra atliekamas tiek kartų, kiek reikia, kol nuskinamos visos uogos [102].

Norint išvengti derliaus supuvimo ar uţteršimo, kavos apdorojimas turi prasidėti iš karto po nuskynimo. Kavos vaisiai gali būti apdorojami dviem būdais: sausuoju arba drėgnuoju. Sausasis

metodas yra tradicinis originalus, pigiausias ir paprasčiausias būdas kavos apdorojime. Šis apdorojimas vis dar praktikuojamas daugelyje regionų visame pasaulyje. Šiame procese uogos paliekamos išdţiūti saulės atokaitoje [9, 74]. Jeigu sezonas drėgnas – naudojamos dţiovyklės. Sausuoju metodu uogos išdţiovinamos iki 10-12 % drėgmės [9]. Veikiant temperatūrai, vaisių dengiantis sultingas sluoksnis sudţiūsta, tampa trapiu ir lengvai pašalinamu. Sluoksnio pašalinimas daţnai atliekamas rankomis. Šis procesas nereikalauja, jog būtų naudojamas vanduo, tačiau yra reikalaujantis daug laiko ir darbo jėgos [74]. Siekiant pašalinti vaisiaus minkštimą šlapiuoju būdu, reikalinga speciali įranga ir didelis kiekis vandens. Vėliau pupelės yra saugomos fermentacijos rezervuaruose 24-36 valandoms, priklausomai nuo temperatūros. Tai palengvina pupelių minkštimo likučių bei gleivių pašalinimą, nes naudojami natūralūs fermentai. Pasibaigus fermentacijai, pupelės nuplaunamos švariu vandeniu rezervuaruose arba specialiuose plovimo mašinose [9]. Po to minkštimas išmetamas arba kompostuojamas, o sėklos dţiovinamos, naudojant natūralų, arba mechaninį dţiovinimo metodą iki optimalaus drėgmės likučio. Baigus dţiovinti, sėklos lukštenamos mechaniškai arba rankomis. Drėgnasis metodas greičiau nuvalo kavos pupeles, tačiau šio metodo metu naudojamas vanduo, padidina pelėsių atsiradimo riziką [74].

Pasibaigus dţiovinimo procesui, sausos, ţalios, išlukštentos kavos pupelės rūšiuojamos pagal dydį ir formą. Surūšiuotos kavos pupelės yra pakuojamos į atitinkamo dydţio, specialius, pakavimui skirtus maišus. Saugojimo patalpa turi būti gerai vėdinama ir sausa. Taip yra todėl, kad kava yra higroskopiška. Dţiovinta kava (sausuoju metodu) ir kava su luobelėmis (drėgnuoju metodu) lėčiau absorbuoja drėgmę, bet jų saugojimui reikalinga didesnė patalpa. Kavos pupelės gabenamos sunkveţimiais supakuotose originaliuose maišuose iki skrudinimo įrenginių [102]. Jei oras yra sausesnis nei kavos pupelės (santykinė drėgmė maţiau nei maţdaug 60%), kava laikymo ar transportavimo metu dţiūna toliau, tačiau, jei oras yra drėgnesnis (santykinė drėgmė daugiau nei 80%), kavos pupelės pradeda absorbuoti vandenį. Dėl to kavos vartojimas gali tapti problemiškas. Patartina, jog kavos pupelių santykinė drėgmė neviršytų 12 % [103].

Kavos gamyboje vienas iš svarbiausių procesų yra skrudinimas, nes jo metu atsiskleidţia kavos pupelių aromatas ir skonis. Skirtingas skrudinimas gali identiškų kavos pupelių skonį visiškai pakeisti [74]. Skrudinimo proceso metu ţalios kavos pupelės pereina įvairius etapus. Nuo 104 °C, jos susitraukia ir praranda drėgmę ir masę. Vėliau jų dydis padidėja beveik dvigubai. Nuo 197 °C kavos pupelės pradeda keisti spalvą, o aukštesnėje temperatūroje – greičiau įgyja tamsesnį atspalvį. Šio proceso metu, laisvos amino rūgštys reaguoja su redukuotu cukrumi, susidarant daugiau nei 110 aromatinių junginių. Skrudinimo metu sumaţėja rūgštingumas ir grįţta į pradinį pH lygį. Šviesiai skrudinta kava turi maţesnį pH, negu tamsesnio atspalvio [74]. Šio proceso metu, taip pat išsiskiria eterinis aliejus kafeolis (angl. caffeol), pupelėse esantis cukrus karamelizuojasi, o pupelės įgauna tam tikrą aromatą ir skonį. Pupelės tamsi spalva yra tiesiogiai susijusi su karamelizacija, o tai, kokio

tamsumo bus pupelių atspalvis, priklauso nuo skrudinimo trukmės ir temperatūros. Oficialiai yra pripaţinti 4 skrudinimo laipsniai: šviesus, vidutinis, tamsesnis ir tamsiausias. Vidutinio skrudinimo kava yra subtilaus skonio ir kvapo, kai tamsesnė – turi kartesnį skonį [67]. Buvo atliktas tyrimas, kuriame akcentuojama, jog ne tik skrudinimo temperatūra ir laikas yra svarbūs. Oro srautas taip pat turėtų būti laikomas vienu iš svarbiausių parametrų skrudinant kavos pupeles komerciniais tikslais, nes nustatyta, jog uţtikrinant optimalų oro srautą, pasiekiamas didesnis antioksidantų ir fenolinių junginių kiekis tame pačiame kavos kiekyje [45]. Po skrudinimo, kavos pupelės atvėsinamos ir sumalamos, arba ne [13]. Kaip paruošti (uţplikyti) kavą metodų yra labai daug, tačiau išskirti vieną geriausią nėra įmanoma [67], nes visi yra unikalūs savo paruošimo metodika, gaunant skirtingą vartojimo rezultatą [44].

Taigi, skrudinimo proceso metu įvyksta įvairaus pobūdţio cheminės reakcijos, kurios stipriai pakeičia kavos pupelių natūralią cheminę sudėtį. Vartotojas pasirenka, kokias kavos pupeles bei su kokia chemine sudėtimi ir kokiu paruošimo būdu jas vartos.

1.3.

Kavos pupelių cheminė sudėtis

1.3.1. Cheminė sudėtis ţaliose kavos pupelėse

Kavoje yra daugiau nei tūkstantis skirtingų cheminių junginių. Kavos sudėtį sudaro angliavandeniai, lipidai, azoto junginiai, vitaminai, mineralai, alkaloidai, ir fenoliniai junginiai [67]. Daţnai teigiama, jog kofeino kiekis kavoje yra vienas iš pagrindinių kokybės rodiklių, nes kavos farmakologinis poveikis priklauso nuo šio junginio [46]. Tačiau kavos sukeliamas farmakologinis poveikis priklauso nuo kavos pupelėse esančių cheminių junginių komplekso [24].

Pagrindinė ţalios kavos pupelių cheminė sudėtis pirmiausia priklauso nuo genetinių (kaip rūšies tipas) ir fiziologinių (kaip subrendimo laipsnis) aspektų bei aplinkos sąlygų skirtinguose augaviečių regionuose [24]. Kavos pramonėje kavos pupelių gamybai naudojamos dvi pagrindinės kavamedţio C. arabica ir C. canephora rūšys skiriasi ne tik savo panaudojimo procentu, bet ir chemine sudėtimi. Nors chemine sudėtimi C. arabica ir C. canephora kavos pupelės yra labai panašios, tačiau gali skirtis kavos pupelėse randamų cheminių junginių ir elementų kiekiai. Pavyzdţiui, kava „Robusta“ turi didesnį antioksidantų bei kofeino kiekį, lyginant su kava „Arabika“ [24, 26].

Ţalioje ir skrudintoje kavoje esančius cheminius junginius galima suskirstyti į lakiuosius ir nelakiuosius. Nelakią frakciją daugiausia sudaro: vanduo, angliavandeniai ir skaidulos, baltymai ir laisvosios amino rūgštys, lipidai, mineralinės medţiagos, organinės rūgštys, o taip pat chlorogeno

rūgštis, trigonelinas ir kofeinas (1 lentelė). Junginiai esantys ţaliose kavos pupelėse, kaip chlorogeno rūgštis, kofeinas, trigonelinas, tirpi ląsteliena ir diterpenai (iš lipidų frakcijos) pasiţymi bioaktyvumu ir taip pat yra svarbūs veiksniai, suteikiant gėrimui skonį bei aromatą po skrudinimo proceso [24]. Nedideli fenolinių junginių kiekiai, kaip antocianinai ir lignanai, buvo nustatyti kaip likučiai po vaisiaus pašalinimo [26]. Kaip kofeino metabolitai nustatyti teofilino ir teobromino pėdsakai [56]. Taip pat kavos pupelės pasiţymi gausiu neorganinių elementų kiekiu. Indukciniu plazmos masių spektrometriniu metodu nustatyta, jog komerciniu būdu įsigytose ţalių kavos pupelių sudėtyje vyrauja Mg, P, K, ir Ca, taip pat galima rasti ir kitų neorganinių elementų pėdsakų [70].

1 lentelė. Žalių C. arabica ir C. canephora sėklų cheminė sudėtis (šaltinis sudarytas remiantis Farah A. Coffee Constituents)[24]

Komponentas Koncentracija (g/100 g)

Coffea arabica Coffea canephora

Angliavandeniai / skaidulos Sacharozė Redukuotas cukrus Polisacharidai Lignino Pektinas Azoto junginiai Baltymai / peptidai

Laisvos amino rūgštys Kofeinas

Trigonelinas

Lipidai

Kavos aliejus (trigliceridai su steroliais / tokoferoliais) Diterpenai (laisvi ir esterinti)

Mineralai Rūgštys ir esteriai Chlorogeno rūgštys Alifatinės rūgštys Kvininė rūgštis 6,0-9,0 0,1 34-44 3,0 2,0 10,0-11,0 0,5 0,9-1,3 0,6-2,0 15–17,0 0,5-1,2 3,0-4,2 4,1-7,9 1,0 0,4 0,9-4,0 0,4 48-55 3,0 2,0 11,0-15,0 0,8-1,0 1,5-2,5 0,6-0,7 7,0–10,0 0,2-0,8 4,4-4,5 6,1-11,3 1,0 0,4

Neskrudintose kavos pupelėse yra nustatomas maţas kiekis lakiųjų junginių, kurie kavos pupelėms suteikia silpną, bet joms būdingą aromatą. Šią frakciją sudaro maţdaug 100 skirtingų junginių [24]. Labiausiai paplitusios lakiųjų junginių klasės yra: alkoholiai, esteriai, angliavandeniliai ir aldehidai, tačiau taip pat yra identifikuojami ir ketoniniai, pirazino, furano, ir sieros junginiai [24, 81]. Kavamedţio vaisių brendimo stadija yra labai svarbi, kadangi jos metu ţaliose kavos pupelėse susidaro lakieji junginiai. Lakiųjų junginių sudėtis uogose buvo ištirta [61] ir nustatyta, kad, kaip ir sėklose, visuose jų nokimo laikotarpio stadijose dominuoja tie patys lakūs junginiai – daugiausiai alkoholiai, pagrinde etanolis. Pernokusios kavos uogos, kurios gamina juodas su defektais sėklas, pasiţymi didele lakiųjų junginių koncentracija, kurioje dominuoja esteriai, po to alkoholiai, ketonai, ir aldehidai, su labai maţu monoterpenų kiekiu.

1.3.2. Cheminė sudėtis skrudintose kavos pupelėse

Skrudinimo proceso metu, kavos pupelėse įvyksta stiprus cheminės sudėties pasikeitimas dėl pirolizės, karamelizacijos, Strecker'io degradacijos ir Mailardo reakcijų [25]. Vieni junginiai sunaikinami, o kiti susiformuoja, įskaitant stipraus ar vidutinio lakumo biologiškai aktyvius junginius ir chemines medţiagas, kurios yra svarbios gėrimo aromatui ir skoniui [24]. Galutinė skrudintos kavos sudėtis skiriasi priklausomai nuo ţaliavos, skrudinimo laipsnio, skrudinimo įrenginio, laiko, temperatūros ir oro srauto greičio skrudinimo kameroje [24, 25].

Skrudintose kavos pupelėse yra maţesnė koncentracija nei ţaliose pupelėse tokių termolabilių junginių, kaip chlorogeno rūgštis, trigonelinas ir diterpenai [25]. Laisvos amino rūgštys, peptidai ir baltymai yra suskaidomi ar reaguoja su kitais junginiais, pavyzdţiui, su cukrumi Mailardo reakcijos metu, tampa pirmtakais lakiųjų junginių, tokių kaip furanų, piridinų, pirazinų, pirolų ir aldehidų ir melanoidinų susiformavime [24]. Melanoidinas yra atsakingas uţ kavos pupelių spalvą ir tam tikro masto kavos antioksidacinį aktyvumą [24, 59]. Skrudinimo metu lipidų frakcija nėra stipriai paveikiama, išskyrus diterpeninius junginius, kurie jautresni karščiui. Sacharozės sumaţėja dėl karamelizacijos, pirolizės ir Mailardo reakcijų (2 lentelė) [24].

2 lentelė. Skrudintų C. arabica ir C. canephora sėklų cheminė sudėtis (šaltinis sudarytas remiantis Farah A. Coffee Constituents)[24]

Komponentas Koncentracija (g/100 g)

Coffea arabica Coffea canephora

Angliavandeniai / skaidulos Sacharozė Redukuotas cukrus Polisacharidai Lignino Pektinas Azoto junginiai Baltymai / peptidai

Laisvos amino rūgštys Kofeinas

Trigonelinas Nikotino rūgštis

Lipidai Kavos aliejus (trigliceridai) Diterpeniniai esteriai Mineralai Rūgštys ir esteriai Chlorogeno rūgštys Alifatinės rūgštys Kvininė rūgštis Melanoidinai 4,2 0,3 31-33 3,0 2,0 7,5-10 N 1.1-1.3 1,2-0,2 0,016-0,026 17,0 0,9 4,5 1,9-2,5 1,6 0,8 25 1,6 0,3 37 3,0 2,0 7,5-10 N 2,4-2,5 0,7-0,3 0,014-0,025 11.0 0,2 4,7 3,3-3,8 1,6 1,0 25 N – nenustatyta

Po skrudinimo nustatyta daugiau nei 950 junginių įvairiose kavos rūšyse. Skrudintose kavos pupelėse paprastai randama įvairių klasių lakių junginių: furanų ir piranų, pirazinų, pirolų, ketonų ir fenolių, angliavandenilių, alkoholių, aldehidų, rūgščių ir anhidridų, esterių, laktonų, tiofenų, oksazolų, tiazolų, piridinų, aminų ir įvairių sieros bei azoto junginių. Kokie nauji lakūs junginiai ir kiek jų po skrudinimo proceso susidarys, priklauso nuo tų medţiagų pirmtakų [24].

Kavos pupelėse taip pat yra nustatomos ir šalutinės medţiagos. Viena iš svarbiausių medţiagų yra ochratoksinas A [24], kuris randamas ne tik augalinės kilmės maisto ţaliavose ir iš jos pagamintuose produktuose, bet ir gyvūninės kilmės produktuose [4]. Ochratoksinas A pasiţymi kancerogeninėmis, teratogeninėmis ir imunosupresinėmis savybėmis bei geba sukelti ūminius ir chroniškus inkstų funkcijos sutrikimus [24]. Jeigu šis toksinas nustatomas ţaliose kavos pupelėse, bus nustatytas ir po skrudinimo proceso, tik po skrudinimo jo kiekis yra maţesnis, tačiau uţterštumas išliks [4].

Remiantis pateiktais duomenimis, skrudinimo proceso metu kinta visų rūšių kavos pupelių cheminė sudėtis. Vienų cheminių junginių kiekis maţėja, o kai kurių (pavyzdţiui, nikotino rūgšties, naujai susidariurių lakių junginių) didėja. Drėgmės kiekis esantis kavos pupelėse taip pat stipriai sumaţėja ir gali siekti 1.5%–5% [24].

1.4.

Tiriamųjų veikliųjų medţiagų savybės

1.4.1. Kofeino apibūdinimas

Kofeinas yra metilksantinas (kaip teofilinas ir teobrominas), natūrali medţiaga gaunama iš purino ir randama pasauliniu mastu įvairiuose augalų šeimose (3 pav.) [104]. Grynas kofeinas yra balti arba beveik balti kristaliniai milteliai vidutiniškai tirpus vandenyje ir etanolyje, labai gerai – verdančiame vandenyje [93]. Dideli kofeino kiekiai randami guaranoje (lot. Paullinia cupana), arbatmedţio lapuose, kolamedţio riešutuose, kavos pupelėse, matės lapuose ir kakavos pupelėse. Kofeinas ir kofeino turintys augalai labai plačiai vartojami ruošiant gėrimus [88], taip pat įeina į daugelio vaistinių preparatų sudėtį [5] bei yra maisto papildų sudedamoji dalis [1].

Kofeinas yra purino grupės alkaloidas, pasiţymintis kartumu, tačiau jis įtakoja ne daugiau nei 10 % kavos gėrimo kartumo. Šis alkaloidas yra termiškai stabilus ir jo koncentracija C. canephora rūšyje yra maţdaug du kartus didesnė, nei randama C. arabica (1, 2 lentelės) [24]. Kofeinas yra vienas iš pagrindinių biologiškai aktyvių junginių aptinkamų tiek ţalioje, tiek skrudintoje kavoje. Skrudinimo proceso metu jo koncentracija reikšmingai nepakinta, tačiau gali atsirasti maţi nuostoliai dėl sublimacijos. Tačiau dėl kitų junginių nuostolių gali būti pastebėtas kofeino kiekio padidėjimas [24, 31]. Teigiama, jog skrudinimo proceso metu, kofeino kiekis faktiškai nepakinta, jeigu išlieka stabilus skrudinamoje temperatūroje. Atsiţvelgiant į tai, kad skrudinimo metu pupelės praranda masę, jų sudėtyje esančio kofeino santykis, lyginant su bendra mase, didėja [64]. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu atliktame tyrime, tiriant kavos pupeles iš įvairių vietovių, nustatyta, kad iš visų kavos pupelių skrudinimo laipsnių (įskaitant ţalias), daţniausiai didţiausia kofeino koncentracija yra šviesaus skrudinimo pupelėse, o didinant skrudinimo intensyvumą, pradeda maţėti [31]. Tačiau kofeinas pasiţymi išskirtiniu elgesiu, kai skrudinimas yra atliekamas 200 °C ir 300 °C temperatūroje. Skrudinimo metu 300 °C temperatūroje, junginio kiekis sumaţėja staigiau dėl vykstančios kofeino sublimacijos bei išsiskyrimo su garais, o 200 °C temperatūroje – gali išsiskirti kartu su garais [28].

1.4.1.1. Kofeino farmakokinetika ir poveikio mechanizmas

Kofeinas yra beveik visiškai absorbuojamas iš virškinamojo trakto. Tariamas pasiskirstymo tūris yra tarp 0,35 – 1,1 l/kg [104]. Nors maistas absorbciją lėtina, tačiau junginys yra lipofilinis, todėl greitai pasiskirsto visuose organizmo skysčiuose ir audiniuose [3]. Jis patenka į nervų ląsteles, placentą, motinos pieną ir seiles [5]. Kofeinas metabolizuojamas citochromo P450 izofermento CYP1A2 pagalba. Vaistai, kurie inhibuoja arba indukuoja šį fermentą, gali padidinti, arba sumaţinti junginio koncentraciją [88]. Demetilinimo, oksidacijos procesų ir acetilinimo metu, susidaro kofeino metabolitai, kurie vėliau pašalinami su šlapimu [5].

Kavoje esančio kofeino biologinis efektas pagrinde susijęs su poveikiu adenozino receptoriams, kuris nepriklauso nuo suvartojamo kavos kiekio [67, 66], tačiau kofeino veikimo mechanizmas yra platesnio pobūdţio. Dėl tiesiogiai blokuojamų adenozino receptorių bei fosfodiesterazės fermento inhibicijos, padidėja tarpląstelinis ciklinio adenozino monofosfato (cAMP), ciklinio guanozino monofosfato bei kalcio kiekiai [66]. Blokuodamas adenozino receptorius, pasiţymi centriniu bei rečiau periferiniu poveikiu [1], tačiau geba paveikti ir autonominę nervų sistemą [58].

1.4.1.2. Kofeino farmakologinis poveikis

Metilksantinai veikia CNS, inkstus, širdies ir griaučių bei lygiuosius raumenis. Kofeinas selektyviausiai veikia CNS [1]. Maţomis ir vidutinėmis dozėmis kofeinas pirmiausiai paveikia smegenų ţievę ir stimuliuoja fizines bei sensorines funkcijas. Dėl kofeino padidėja deguonies kiekis CNS ląstelėse, todėl padidėja psichikos imlumas (gebėjimas suvokti) ir efektyvumas bei sumaţėja nuovargis [104, 66].

Kofeino efektas kardiovaskuliarinei sistemai yra paremtas vazomotorinių centrų stimuliacija ir iš dalies miokardo suţadinimu, todėl sukelia tiesioginį teigiamą chronotropinį ir inotropinį poveikį širdţiai [104, 1]. Didesnėmis dozėmis kofeinas atpalaiduoja kraujagyslių lygiuosius raumenis, tačiau smegenų kraujagyslių – sutraukia, dėl to pasireiškia galvos skausmas [104].

Kofeinas stimuliuoja skrandţio sulčių ir virškinamųjų fermentų sekreciją bei turi silpną diuretinį poveikį, dėl to padidėja natrio, kalio ir chloridų išsiskyrimas su šlapimu [66]. Diuretinis poveikis susijęs su renino sekrecijos stimuliavimu, blokuojant andenozino A1 receptorius proksimaliniuose kanalėliuose [60]. cAMP koncentracijos padidėjimas veikia lygiųjų raumenų spazmolizę ir skatina lipolizę bei glikogenolizę [104].

Patekus į organizmą dideliems kiekiams kofeino, atsiranda pykinimas, vėmimas, galvos skausmas, nerimas, baimės jausmas. Sutrinka širdies darbas: prasideda tachikardija, gali atsirasti aritmijos. Padaţnėja šlapinimasis, galimas viduriavimas [5]. Suaugusiems toksiškumą gali sukelti apie l g kofeino, o mirtį – 5-10 g. Toksinė koncentracija kraujyje – 200 μmol/l [3]. Dėl ilgalaikio kavos bei kofeino turinčių gėrimų piktnaudţiavimo, rečiau vaistais, palaipsniui gali išsivystyti priklausomybė, vadinama kofeinizmu. Šio sindromo metu atsiranda tipiški kardiovaskulinės ir virškinimo sistemų bei neuropsichotiniai pokyčiai [3]. Tačiau dėl to, kad kofeinas neveikia dopaminerginių smegenų struktūrų, susijusių su malonumu ir įpratimu, galimybė priprasti ir tapti priklausomam yra nedidelė [1]. Tiriant kepenų fermentus, nustatytas kofeino hepatoprotekcinis poveikis [54]. Nustatytas atvirkštinis ryšys tarp kavos suvartojimo ir 2 tipo cukrinio diabeto (CD) rizikos atsiradimo vyrams ir moterims. Per 4 metų tyrimo laikotarpį, didėjant kavos suvartojimui, nustatyta maţesnė rizika, o maţinant kavos vartojimą – didesnė rizika patologijos atsiradimui [11]. Taip pat nustatyta, jog ūmus kofeino vartojimas blogina gliukozės toleravimą ir sumaţina viso kūno jautrumą insulinui, nes kava be kofeino, priešingai negu kava su kofeinu, pasiţymėjo teigiamu efektu CD metu [71]. Pastebėta, kad ilgalaikis nuolatinis kofeino vartojimas yra atvirkščiai susijęs su sutrikusia gliukozės tolerancija ir kofeinas gali būti ne pagrindinis faktorius esantis kavoje, kuris maţina gliukozės koncentraciją [84, 23]. Tuo tarpu, vienu iš svarbiausių junginių tampa chlorogeno rūgštis [84]. Trumpalaikiu vartojimo metu, kofeinas pablogina gliukozės toleravimą bei jautrumą insulinui, o ilgalaikio vartojimo metu – gali padidinti jautrumą insulinui [60]. Rekomenduojama, kad asmenys, kuriems kyla rizika susijusi su

metaboliniu sindromu, gliukozės netoleravimu ir 2 tipo CD, vartotų kavą be kofeino [71, 84], tačiau duomenys yra prieštaringi, nes ar kava su kofeinu, ar be, vis tiek maţina riziką susirgti CD [23].

Duomenys, gauti iš in vitro, in vivo ir klinikinių tyrimų metu, parodė, kad kava turi apsauginį poveikį prieš degeneracines nervų sistemos ligas (Alzheimerio ligą bei Parkinsono ligą) ir šoninę amiotrofinę sklerozę [37].

Neurodegeneraciniai sutrikimai yra stipriai susiję su oksidaciniu stresu ir uţdegiminiu procesu smegenyse [37]. Kofeinas gali sumaţinti oksidacinį stresą, kurį sukelia cholesterolio kiekis organizme [63], pasiţymi neuroprotekcinėmis savybėmis bei gerina atmintį [47]. Be kofeino, kavos pupelėse esančios tokios medţiagos, kaip chlorogeno rūgštis, kavos rūgštis, kaveolis ir trigonelinas, taip pat įtakoja bendrą kavos neurofarmakologinį poveikį, nes pasiţymi antioksidacinėmis ir priešuţdegiminėmis savybėmis [37]. Duomenys rodo, kad junginys esantis kavoje ir pasiţymintis stipresniu neuroprotekciniu poveikiu negu kofeinas, ar chlorogeno rūgštis yra kvercetinas [50].

Be minėtų savybių, stiprus kofeino vartojimas nėštumo metu gali būti ţalingas vaisiaus širdies ir kraujagyslių sistemai [21]. Kofeinas gali padidinti kraujospūdį, sutrikdyti kairiojo skilvelio sistolinį ir diastolinį funkcijas pacientams, sergantiems išemine širdies liga (IŠL) [90]. Tačiau daţniausiai toksiškumas širdies ir kraujagyslių sistemai atsiranda tada, kai ţmogus serga hipertenzija, tachikardija, turi riziką atsirasti aritmijoms, IŠL bei tromboembolijoms [21].

1.4.2.

Chlorogeno rūgšties apibūdinimas

Chlorogeno rūgštis (CGA) (4 pav.) yra natūralus polifenolinis junginys, susidarantis įvairiose skirtingose augalų rūšyse arba jų dalyse, pavyzdţiui, ţaliose kavos pupelėse. Chemiškai – kavos rūgšties ir kvininės rūgšties esteris [54]. Ţaliose kavos pupelėse bendras chlorogeno rūgšties kiekis yra sudarytas iš pagrindinių 3 kafeolikvininės rūgšties (angl. caffeoylquinic acid) izomerų, dar vadinamų chlorogeno, kriptochlorogeno ir neo-chlorogeno rūgštimi (atitinkamai angl. 3-O-caffeoylquinic acid (3-CQA), 4-O-caffeoylquinic acid (4-CQA) ir 5-O-caffeoylquinic acid (5-CQA)) [87]. Chlorogeno rūgštis ir susiję junginiai yra ţalių kavos pupelių fenolinės frakcijos pagrindiniai komponentai [26, 65] ne tik pačiose kavos pupelėse, bet ir pupeles dengiančioje vadinamojoje „sidabrinėje odelėje“ [65]. C.

canephora rūšyje CGA koncentracija yra daug didesnė, negu C. arabica rūšyje [33].

CGA yra termiškai nestabili. Kavos pupelių apdorojimo metu, CGA gali būti izomerizuojama, hidrolizuota arba suskaldyta į maţos molekulinės masės junginius. Aukšta skrudinimo temperatūra gali dalį transformuoti į kvinolaktonus ir, kartu su kitais junginiais, melanoidinus [26]. Koks CGA kiekis bei antioksidacinis poveikis bus kavos pupelėse, priklauso nuo skrudinimo proceso laipsnio, nes tamsiai skrudintos kavos pupelės gali turėti apie 6 kartus maţiau bendro CGA kiekio, negu ţalios [52]. Komerciniu būdu įsigytose kavos pupelėse nustatyta, jog didinat skrudinimo laipsnį, CGA palaipsniui maţėja [57]. CGA prisideda prie bendro kavos kartumo, nes selektyvios fermentacijos būdu hidrolizavus CGA laktonus – sumaţinamas kavos kartumas [40].

1.4.2.1. Chlorogeno rūgšties farmakologinis poveikis

Chlorogeno rūgšties buvimas kavos pupelėse suteikia joms stiprias antioksidacines savybes. Abi pagrindinės kavos pramonėje naudojamos kavos rūšys pasiţymi šiomis savybėmis, tačiau C.

robusta rūšies antioksidacinis poveikis yra beveik dvigubai stipresnis negu C. arabica [33].

Jau buvo minėta, jog CGA dėl antioksidacinių savybių pasiţymi efektyviu teigiamu poveikiu reguliuojant gliukozės kiekį organizme, esant hiperglikemijai [76], ir kaip prevencijos priemonė CD bei neurodegeneracinių ligų atvejais. In vitro ir in vivo tyrimais, nustatytas priešuţdegiminis, o tuo pačiu ir hepatoprotekcinis bei antikancerogeninis poveikis. Rezultatai rodo, kad CGA dalinai apsaugo nuo anglies tetrachlorido sukeltos kepenų fibrozės, slopindama oksidacinį stresą kepenyse bei neleidţia progresuoti kepenų ląstelių ir gaubtinės ţarnos karcinomai, slopindama naviko augimą [73, 89, 72, 80]. Uţdegimo metu CGA prisideda prie kalio jonų kanalų aktyvacijos bei inaktyvacijos, todėl ne tik slopina uţdegimo procesą, bet ir pasiţymi analgeziniu poveikiu [53]. Dėl antioksidacinių savybių CGA veikia širdies ir kraujagyslių sistemą. Pasiţymi kardioprotekciniu efektu, gali apsaugoti miokardą [6], o klinikinių tyrimų metu, dėl kavoje esančios CGA ir jos metabolitų, pagerėjo azoto oksido pasisavinimas kraujagyslėse [94].

Be jau minėtų CGA savybių, prie junginio plataus veikimo spektro dar galima priskirti: anksiolitinį, antibakterinį, priešvirusinį (kuris pasireiškė in vitro ir in vivo prieš Hepatito B virusą), priešgrybelinį (suardant jų struktūrą) poveikį [12, 36, 79, 85]. Tačiau viena iš pagrindinių savybių, dėl kurios Lietuvoje pradėta vartoti vis daugiau ţalių kavos pupelių – svorio maţinimas. Tiriant nutukusias peles, gauti rezultatai rodo, kad kavos ir chlorogeno rūgšties vartojimas pagerino kūno svorį, lipidų apykaitą ir su nutukimu susijusių hormonų lygį, reguliuojant genus bei baltymus, susijusius su adipogeneze ir lipidų metabolizmu baltajame riebaliniame audinyje ir kepenyse [15, 16].

1.4.3.

Kafestolio apibūdinimas

Kafestolis (angl. „Cafestol“) ir kaveolis (angl. „Kahweol“) (5 pav.) yra riebaluose tirpūs junginiai, ţinomi kaip pentacikliniai diterpenai, kurių yra iš kavos pupelių gaunamame aliejuje. Vienintelis skirtumas tarp kafestolio ir kaveolio yra papildoma dviguba jungtis, esanti kaveolio struktūroje [42].

5 pav. Kafestolio (A) ir kaveolio (B) struktūrinės formulės

Kafestolio ir kaveolio koncentracija priklauso nuo kavos rūšies. Abi medţiagos yra randamos kavos pupelėse – lyginant su C. arabica rūšimi, C. canephora rūšyje yra nustatoma perpus maţiau kafestolio ir maţas kiekis kaveolio, tačiau pastarasis junginys gali būti ir nenustatytas [14]. Šie biologiškai aktyvūs junginiai ir jų dariniai yra sočiųjų (daugiausiai) ir nesočiųjų riebalų rūgščių druskos arba esteriai bei sudaro maţdaug 20 % kavos pupelių lipidų frakcijos [97, 75]. Tik nedideli kafestolio ir kaveolio kiekiai (apie 0,7 – 3,5 %) yra laisvi kavos pupelėse, kaip diterpeniniai alkoholiai, o dauguma esterifikuoti su riebalų rūgštimis ir egzistuoja diterpeninių esterių forma. Identifikuota iki 14 skirtingų riebalų rūgščių esterių, susijusių su kafestoliu ir kaveoliu, labiausiai paplitę junginiai su: palmitino rūgštimi (36 – 49 %), o po to linolo rūgštimi (22 – 30 %) ir keletas kitų, kurios sudėtyje yra maţais kiekiais, pavyzdţiui, oleino, stearino ir arachidono rūgštimis [97].

Skrudinimo proceso metu visa lipidų frakcija, įskaitant trigliceridus ir sterolius, išlieka atspari karščiui. Nors diterpenai yra jautresni karščiui, tam tikras kiekis vis tiek yra randamas skrudintose kavos pupelėse, ypatingai C. arabica rūšyje ir įvairiais kiekiais [24, 14, 97]. Abu junginiai yra ekstrahuojami karštu vandeniu, bet priklausomai nuo kavos paruošimui taikomo metodo, gali būti sulaikomi ant popierinio filtro ir į kavą nepatekti [92, 41], o jeigu patenka, tai tik maţesniais kiekiais [18]. Tai patvirtina atliktas tyrimas, kurio metu nustatyta, jog didţiausia kafestolio koncentracija yra kavoje, kuri buvo paruošta šiais metodais – prancūzišku, turkišku ir paprastu kavos uţvirinimu [92].

1.4.3.1. Kafestolio farmakologinis poveikis

Didelis kafestolio suvartojimas susijęs su padidėjusiu homocisteino ir maţo tankio lipoproteinų („blogojo cholesterolio“) kiekiu ţmogaus kraujo plazmoje, kuris gali netiesiogiai padidinti širdies ir kraujagyslių ligų atsiradimo riziką [24, 96]. Tyrimo metu su pelėmis, buvo nustatyta, jog vartojant reguliariai kafestolį, cholesterolio lygis serume buvo pakilęs 40 %, trigliceridai buvo padidėję 62 %, o bendras lipolitinis aktyvumas plazmoje (tiek lipoproteinų lipazės, tiek kepenų lipazės aktyvumas) buvo smarkiai sumaţėjęs (atitinkamai 34 % ir 21 %). Taigi, kafestolis blokuoja cholesterolio homeostazę [68]. 2013 metais atliktas klinikinis tyrimas su savanoriais. Tyrimo metu buvo patvirtinta, jog filtruotoje kavoje per popierinį filtrą yra diterpenų bei nustatyta, kad po suvartojimo bendro cholesterolio koncentracija pakilo 0.46 mmol/l – 0.59 mmol/l, maţo tankio lipoproteinų – 0.36 mmol/l – 0.44 mmol/l, didelio tankio lipoproteinų – 0.09 mmol/l [18].

Kafestonis turi ir teigiamų savybių. Kavos diterpenai pasiţymi anti-kancerogeninėmis, hepatoprotekcinėmis ir neuroprotekcinėmis savybėmis. Tyrimai su pelėmis patvirtino, jog kafestolis ir kaveolis kepenyse pasiţymi nuo dozės priklausomu antioksidaciniu veikimu, sukeldamas hepatoprotekcinį poveikį [48]. Taip pat pasiţymi apsauginiu poveikiu prieš vandenilio peroksido sukeltą oksidacinį stresą bei DNR paţaidą [49]. Šis diterpenas gali sukelti visišką neuroprotekcinį poveikį, tačiau dėl sukeliamo cholesterolio padidėjimo, jo vartojimas yra ginčytinas. Todėl kafestolis nėra laikomas, vienu iš geriausių, kandidatų Parkinsono ligai gydyti [83]. Epidemiologiniai tyrimai parodė, atvirkštinį ryšį tarp kavos vartojimo ir tam tikrų vėţio rūšių, pavyzdţiui, kepenų ląstelių karcinomos, ar inkstų vėţio atveju [17, 51]. Nustatyta, jog kafestolis inkstų ląstelėse reguliuoja ląstelių apoptozę, taip pasiţymėdamas anti-kancerogeniu poveikiu [17]. Kadangi, kafestolis pasiţymi priešuţdegiminėmis savybėmis bei geba slopinti angiogenezę, įtakodamas angiogenezinio signalo perdavimo kelią, tokiu būdu sumaţindamas navikų atsiradimo riziką [86].

1.4.4. Trigonelino apibūdinimas

Trigonelinas (6 pav.) yra alkaloidas, biologiškai kilęs iš nikotino rūgšties fermentinio metilinimo metu. Trigonelinas yra randamas abiejose C. Canephora ir C. arabica kavos rūšyse ir yra antras pagal kiekį alkaloidas kavos pupelėse po kofeino. Junginys prisideda prie kavos gėrimo kartumo, bet yra termiškai nestabilus ir skrudinimo metu konvertuojamas į nikotino rūgštį ir kitus azoto junginius, kurie prisideda prie kavos aromato: pirolus, piridinus, pirazinus ir metilnikotinato junginį [24, 42].

6 pav. Trigonelino struktūrinė formulė

Nikotino rūgštis, taip pat vadinama niacinu, vitaminu B3 arba vitaminu PP, susiformuoja kavos pupelių skrudinimo metu demetilinimo būdu iš trigonelino. Intensyvus skrudinimo procesas aukštesnėje temperatūroje įtakoja, jog po skrudinimo trigonelino kiekis bus daug maţesnis, o niacino kiekis aukštesnis, negu ţemesnėje temperatūroje [42].

1.4.4.1. Trigonelino farmakologinis poveikis

Trigonelino buvimas ţaliose kavos pupelėse, lemia tai, jog po skrudinimo proceso susidaro nauji junginiai, kaip niacinas, kurie pasiţymi jiems būdingu biologiniu aktyvumu. Tačiau taip pat trigonelinas pasiţymi jam būdingu specifiniu poveikiu.

Trigonelinas pasiţymi priešuţdegiminiu, antioksidantiniu, anti-karcinogeniniu, priešmigreniniu, hipocholesteroleminiu bei antidiabetiniu poveikiu [29]. Tiriant ţiurkes, kurioms buvo sukeltas 2 tipo cukrinis diabetas, trigonelino vartojimas sukėlė hipoglikeminį bei anti-dislipideminį poveikį [78]. Taip pat sergant cukriniu diabetu, padidėja tikimybė patirti kaulų lūţių riziką. Nors trigonelinas pasiţymi antidiabetiniu poveikiu, tyrimo rezultatai rodo, kad, esant tam tikroms sąlygoms, trigonelinas gali pakenkti kaulams [27]. Tačiau siekiant išvengti cukrinio diabeto komplikacijos, tokios kaip diabetinė nefropatija, kai inkstuose pasireiškia oksidacinis stresas bei ląstelių apoptozė, trigonelinas gali turėti svarbų vaidmenį, maţinant inkstų patiriamą ţalą [29].

Nustatyta, jog trigonelinas yra fitoestrogenas, kuris per estrogeno receptorius net maţomis koncentracijomis gali stimuliuoti ţmogaus krūties navikines ląsteles (MCF-7) [7]. Bet šiuo atveju, trigoneliną galima įvertinti dvejopai. Remiantis duomenimis, gautais iš epidemiologinių ir tyrimų su gyvūnais, apsauginį poveikį gaubtinės ţarnos kancerogenezėje sukelia estrogenų veikimas. Nepaisant to, kad estrogenų pakaitinė terapija teigiamai koreliuoja su padidėjusia krūties vėţio rizika, tyrimai parodė, kad trigonelinas gali moduliuoti gaubtinės ţarnos ląstelių fiziologiją ir galiausiai apsaugoti šias ląsteles nuo kancerogeninio poveikio [91].

Analizuojant gyvūnais paremtus modelius, pastebėta trigonelino savybė regeneruoti dendritus ir aksonus, todėl atsirado prielaida, jog trigonelinas gali pagerinti atmintį. Ši savybė padėtų Alzhaimerio liga sergantiems ţmonėms [82]. Be visų minėtų poveikių, kavoje esantis trigonelinas,

kartu su chlorogeno rūgštimi bei kavos rūgštimi bakteriostatiškai slopina dantų ėduonies bakterijų

Streptococcus mutans augimą, neleidţiant prisitvirtinti prie danties emalio [8].

1.5.

Efektyviosios skysčių chromatografijos pritaikymas tiriamosioms

medţiagoms analizuoti

1.5.1. Medţiagų ekstrakcija

Visos tiriamos medţiagos gali būti analizuojamos efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodu [38]. Tam, kad tiriamąsias medţiagas būtų galima identifikuoti bei kiekybiškai nustatinėti ESC metodu, reikia atlikti šių medţiagų ekstrakciją iš kavos pupelių. Ekstrakcija priklauso nuo medţiagų tirpumo konkrečiame tirpiklyje bei jų būvio augalinėje ţaliavoje.

Kofeino, chlorogeno rūgšties bei trigonelino ekstrakcija nėra sudėtinga, nes medţiagos gerai tirpsta karštame vandenyje [2, 10, 62]. Be distiliuoto vandens, junginių ekstrakcijai gali būti naudojami vandens / acetonitrilo [38], vandens / alkoholio, ar su kitokiu organiniu tirpikliu sudaryti mišiniai. Ekstrakcija priklauso nuo pasirinktos tyrimo metodikos, prireikus gali būti atliekamas tų ekstraktų valymas ir gryninimas [34, 77].

Su kafestoliu yra priešingai, jis priklauso kavos pupelių lipidų frakcijai, sunkiau tirpsta vandenyje ir kaip minėta anksčiau, kaip laisvo junginio kavos pupelėse yra maţa koncentracija, nes didţioji dalis susijungusi su riebalų rūgštimis. Todėl ekstrakcijai naudojama saponifikacija [38, 22, 97]. Remiantis moksliniais tyrimais, geriausias diterpenų išskyrimas, kuriuo metu gaunama didţiausia koncentracija – tiesioginė karšta saponifikacija [22].

1.5.2. Chromatografinės analizės parametrų parinkimas

Literatūroje yra pateikiamos įvairios nustatymo metodikos. ESC analizės metu, junginių sulaikymo laikai gali skirtis. Tai priklauso nuo naudojamų įrenginių, kolonėlės, eliuavimo rūšies, eliuento (judančios fazės), tekėjimo greičio bei detektoriaus rūšies. Identifikavus, medţiagų koncentracija yra nustatoma pagal gradavimo grafiką, sudarytą remiantis atitinkamų medţiagų etaloniniais tirpalais.

Analizės metu daţnai pritaikoma atvirkštinių fazių chromatografija bei metodiką atitinkančios įvairios kolonėlės. Taip pat naudojama gradientinė arba izokratinė eliuavimo sistema, daţniausiai eliuentu pasirenkant acetonitrilą, vandenį, metanolį, arba tam tikros koncentracijos organinių ir neorganinių rūgščių tirpalus. Kaip detektorius ESC metode gali būti naudojami: ultravioletinių (UV)

spindulių, diodų matricos (DMD) arba diodų matricos detektorius su masių spektrometru DMD-MS. Remiantis atliktais moksliniais tyrimais, papildomi analizės parametrai yra pateikiami 3 lentelėje.

3 lentelė. Tiriamosioms medžiagoms tirti ESC metodui pritaikomi parametrai

Nustatinėtas komponentas (ai); literatūros šaltinis Judri fazė Eliuento tėkmės greitis, ml/min; Bangos ilgis λ, nm Injekcijos tūris Temperatūra, °C Kofeinas, CGA, trigonelinas, [38] A – 5 % acto rūgštis, B – acetonitrilas; Gradientinė analizė: 0 - 5 min – 5 % B, 5 - 10 min – 5 – 13 % B, Iki 35 min – 13 % B. 0,7 272 325 264 N 25 Kafestolis, kaveolis, [38] Izokratinis eliuavimas; 55/45 (v/v), acetonitrilas/ vanduo. 0,9 220 290 N 25

CGA, [10] Vanduo / acto rūgštis / metanolis,

799/ 1/ 200 ml 1 278 20 μl N

CGA, [54]

A – vanduo + 1 % fosforo rūgštis, B – acetonitrilas; Gradientinis eliuavimas: 0 min – 10 % B, 20 min – 20 % B, 25 min – 30 % B, 35 min – 40 % B, 40 min – 40 % B 1 324 10 μl 25 Kofeinas [95] Metanolis / vanduo; Izokratinis eliuavimas: 25 % metanolis 1 272 10 μl 25 CGA, [19] A – 0,1 % TFA vandenyje, B – acetonitrilas; Gradientas pagal A: 0 min – 95 (%), 10 min – 80 (%), 12 min – 80 (%), 15 min – 95 (%), 15.1 min – 5 (%), 16.5 min – 5 (%), 16.6 min – 95 (%), 19 min – 95 (%) 1,5 330 3 μl 25 Kofeinas, CGA, [69] A – mišinys iš 80% (v/v) 10 mM citrinos rūgšties (pH 2,5) ir 20% (v/v) metanolio B – 100% (v/v) metanolis; Gradientas pagal A: 100 % – 19 min, iki 80 % per 6 min, 10 min išlaikoma 80 %, iki 60 % per 15 min, 10 išlaikoma 60 %, iki 100 % per 1 min,

ir išlaikomas santykis 9 min.

1,0 272

325 N 30

Trigonelinas, [69] A – 0.5% acto rūgštis

B – metanolis;

Linijinis gradientas pagal A: 100 % – 7 min,

70 % per 15 min,

70 % išlaikoma 18 min, iki 100 % per 5 min ir išlaikoma 7 min. Kaveolis, kafestolis, [22] Izokratinis eliuavimas: acetonitrilas/ vanduo, 55/ 45 v/v;

Analizės laikas 35 min.

0,9 290

230 N 25

Kafestolis, [97]

A – vanduo,

B – acetonitrilas (ACN);

Linijinis gradientas pagal ACN: 0 iki 10 min – 60 %,

iki 15 min – 90 %, iki 20 min – 90 %, iki 35 min – 60 %

1,0 220 20 μl N

N – nepateikta, A – tirpiklis, B – tirpiklis

Atlikus literatūros analizę, suţinota, kokiose kavos pupelėse ir kokiais kiekiais yra aptinkamos tiriamosios medţiagos: kofeinas, CGA, kafestolis ir trigonelinas. Taip pat suţinota, kaip kavos pupelių sudėtyje esančios cheminės medţiagos turėtų kisti apdorojimo metu bei kuo farmakologiškai yra svarbios vartojimo metu. Įgytos ţinios apie kofeino, CGA, kafestolio ir trigonelino ekstrakciją iš kavos pupelių, padės paruošti šias medţiagas analizei. O ţinios apie šioms medţiagoms pritaikomas ESC metodikas ir jų variacijas – optimizuoti ESC metodiką, kuria remiantis, galėtų būti atliekamas kavos pupelėse esančių tiriamųjų medţiagų kokybinis ir kiekybinis įvertinimas, analizuojant jų pokytį po apdorojimo proceso.

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1.

Tyrimo planavimas

Tyrimo atlikimas vykdytas pagal šiuos etapus:

1. Konkretaus tyrimo objekto pasirinkimas (konkrečios rūšies ţalios kavos pupelės);

2. Kofeino, trigonelino bei chlorogeno rūgšties (CGA) ekstrahavimas iš kavos pupelių distiliuotu vandeniu;

3. Saponifikacijos pritaikymas kafestolio ekstrakcijai iš kavos pupelių;

4. Optimizavimas ir pritaikymas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodikos kafestolio, kofeino, CGA bei trigonelino identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui;

5. Ţalių kavos pupelių skrudinimas skirtingomis sąlygomis;

6. Tiriamųjų medţiagų ekstrakcija iš ţalių ir skrudintų kavos pupelių;

7. Kofeino, CGA, trigonelino ir kafestolio identifikavimas ir kiekybinis įvertinimas pritaikant anksčiau eksperimentiškai optimizuotą ESC metodiką;

8. Gautų duomenų analizė ir vertinimas.

2.2.

Tyrimo objektas ir jo pasirinkimo kriterijai

Kavamedţio (lot. Coffea) genties augalo ţalios sėklos, kitaip ţinomos, kaip kavos pupelės. Kofeino, chlorogeno rūgšties, kafestolio, trigonelino identifikavimui bei kiekybiniam nustatymui prieš skrudinimą ir po skrudinimo naudota arabinio kavamedţio (lot. Coffea arabica) rūšies ţalios sėklos. Nuspręsta įsigyti ţalias „Brazil Santos 100 % Arabica“ kavos pupeles. Šios kavos pupelės pasirinktos dėl to, jog:

 Kilusios iš Brazilijos, šalies, kuri išlieka didţiausia kavos pupelių eksportuotoja pasaulyje;

 C. arabica rūšyje yra aptinkamos visos tyrimo metu analizuojamos medţiagos;  Šios rūšies kavos pupelės yra plačiausiai naudojamos kavos pramonėje;

 Tyrimo metu, geriausiai analizuoti konkrečią rūšį, kilusią iš to paties regiono, nes iš skirtingų kultivavimo vietų kilusios C. arabica rūšys gali skirtis savo chemine sudėtimi, todėl sunkiau būtų tiksliai nustatyti, kaip kinta kofeino, CGA, kafestolio ir trigonelino koncentracija kavos pupelių apdorojimo metu.

 Ţalių kavos pupelių pasirinkimą lėmė tai, jog kavos gamintojai nenurodo kokiomis sąlygomis buvo apdorotos jų prekybos vietose parduodamos kavos pupelės. Dėl to nėra įmanoma

objektyviai atlikti analizę ir įvertinti gautus duomenis, nes nėra ţinoma, dėl kokio kavos pupelių apdorojimo faktoriaus (pavyzdţiui, skrudinimo temperatūros, laiko) pakito pupelių cheminė sudėtis.

2.3.

Tyrimo medţiagos ir aparatūra

2.3.1. Medţiagos ir reagentai

Naudoti reagentai, tirpikliai ir standartai yra analitinio švarumo. Chromatografinėje analizėje mobiliai fazei sudaryti buvo naudotas 99% švarumo trifluoracto rūgštis (TFA) (Buchs, Šveicarija), acetonitrilas (99,9%) ir trietilaminas (99%) iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija). Išgrynintas vanduo buvo ruošiamas naudojant vandens valymo sistemą „Millipore“ (Bedford, JAV). Taip pat buvo naudotas chemiškai išvalytas 96 % etanolis (Spiritus Vilnensis, Lietuva). Buvo naudoti šie referentiniai standartai: kofeinas (99%), chlorogeno rūgštis (98.0%), kafestolis (98%), trigonelinas (98%), įsigyti iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija). Iš ten pat įsigytas dietileteris (99,5%), o kitas saponifikacijai naudotas reagentas, kalio hidroksidas – „Riedel-de Haën“ (Vokietija).

2.3.2. Naudota aparatūra

ESC analizei naudotas chromatografas Waters 2695 su fotodiodų matricos detektoriumi (Waters 996, 210 – 400 nm bangų ilgio diapazonas). Medţiagų atskyrimui naudota chromatografinė kolonėlė ACE C18 (25cm×4,6 mm), sorbento dalelių dydis 5μm. Papildomai naudota aparatūra: analitinis malūnėlis IKA® A11 basic (Volietija), ultragarso vonelė WiseClean (Vokietija), laboratorinis inkubatorius „MEMMERT“, centrifugatorius „Centurion Scientific C2 Series“, magnetinė maišyklė su kaitintuvu „HEIDOLPH Magnetic“.

2.4.

Kavos pupelių skrudinimas

Coffea arabica rūšies ţalių kavos pupelių skrudinimo procesas buvo atliktas 199 ± 5 °C ir 300 ± 10 °C temperatūrose bei skirtingais laiko intervalais. 199 ± 5 °C temperatūroje kavos pupelės buvo skrudinamos: 10 min, 20 min, 30 min, 40 min, 50 min, 60 min, 70 min, 80 min, 90 min, 100 min, 110 min, 120 min, 130 min, 140 min. 300 ± 10 °C temperatūroje kavos pupelės buvo skrudinamos: 2,5 min, 5 min, 10 min. Vėliau pupelės buvo atvėsintos ir naudojamos tiriamųjų cheminių junginių ekstrakcijai.

2.5.

Tyrimo metodika

2.5.1. Tiriamų medţiagų išskyrimas iš ţalių ir skrudintų kavos pupelių

2.5.1.1. Kofeino, chlorogeno rūgšties ir trigonelino ekstakcija iš ţalių ir skrudintų

kavos pupelių

Ţalios ir skrudintos kavos pupelės sumalamos elektriniu malūnėliu. Kavos pupelėms tirti taikytas mėginio paruošimo būdas: 2,0 g susmulkintos kavos pupelių masės uţpilama 100 ml distiliuoto vandens, pašildoma iki virimo ir 10 minučių virinama, po virinimo praskiesta iki 100 ml. Vėliau ekstraktas filtruojamas per popierinį filtrą, gautas filtratas vėl filtruojamas per 0,45 μm membraninį švirkštinį filtrą. Prireikus, gali būti atliekamas ekstrakto praskiedimas. Gautas antrinis filtratas tiriamas ESC metodu.

2.5.1.2. Kafestolio ekstakcija iš ţalių ir skrudintų kavos pupelių

Kafestolio ekstrakcija iš skrudintų ir ţalių kavos pupelių atlikta, naudojant tiesioginę karštą saponifikacijos metodiką, kuri schematiškai pateikta 7 paveikslėlyje.

7 pav. Saponifikacijos proceso atlikimo schema

Į mėgintuvėlį suberiama 0,2 g susmulkintos ţalios ar skrudintos kavos pupelių masės. Įpilama 2 ml 2,5 mol/l kalio hidroksido (KOH) (96 % etanolyje) ir mėgintuvėlis uţdaromas. Vėliau paliekamas 1 valandą 80 °C temperatūros vandens vonioje, kas 5 min sumaišant. Vėliau įpilama 2 ml išgryninto vandens ir vandeninė fazė 3 kartus ekstrahuota su 2 ml dietileteriu (daţnai analizei naudojamas ir tret-butilmetileteris (tBME)). Fazėms atskirti centrifuguota 2 min/3000 rpm greičiu. Surinka organinė fazė

homogenizuojama su 2 ml vandens ir vanduo vėliau pašalinamas. Organinis ekstraktas išgarinamas naudojant švelnią azoto dujų srovę iki sauso likučio. Prieš analizę eterinis ekstraktas resuspenduojamas 4 ml 60 % acetonitrilo / 40 % vandens mišinyje, filtruojamas per 0,45 μm membraninį švirkštinį filtrą. Gautas filtratas tiriamas ESC metodu.

2.6.

Efektyviosios skysčių chromatografijos metodo sąlygos

Eksperimentiniu būdu bei remiantis atlikta literatūros apţvalga, optimizuotas ir validuotas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas. Dėl to galima ESC metodą pritaikyti kokybiniam ir kiekybiniam C. arabica ţalių ir skrudintų kavos pupelių veikliųjų medţiagų analizei.

Tyrimas atliktas naudojant Waters 2695 chromatografą (Waters Corporation, Milford, USA) su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 996. ESC metu naudota kolonėlė – ACE C18, kurios parametrai: 250 mm x 4,6 mm, naudojamo sorbento dalelių dydis 5 μm. Visais tyrimo atvejais termostate buvo palaikoma 25 °C temperatūra, o analizei naudojamas tiriamojo tirpalo injekcijos tūris – 10 µl. Mobilios fazės (eliuento sistemos) tėkmės greitis – 1,2 ml/min.

Tiriant chlorogeno rūgštį, trigoneliną bei kafestolį, buvo naudojama judrios fazės (eliuento) sistema, sudaryta iš 0,05% trifluoracto rūgšties (TFA) tirpalo vandenyje (pH 2,4) ir acetonitrilo (ACN). Naudotas gradientinis eliuavimo rėţimas, santykinai keičiant eliuento sudėtį skirtingais laiko intervalais (4 lentelė). Kofeino nustatymui naudota gradientinė sistema, sudaryta iš ACN ir trietilamino (pH 7,4) (5 lentelė), sudaryta labiau šarminės chromatografavimo sąlygos.

4 lentelė. Eliuacijos parametrai kafestolio, chlorogeno rūgšties bei trigonelino nustatymui Laikas, min Eliuento tėkmės greitis, ml/min 0,05% Trifluoracto rūgštis, % Acetonitrilas, %

0-3 1,2 100 0

3-23 1,2 75 25

23-35 1,2 10 90

35-40 1,2 0 100