BETULA L. LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAI

MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

GRETA PUPEIKYTĖ

BETULA L. LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Lekt., Dr. Lina Raudonė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKDEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof.dr. Vitalis Briedis

BETULA L. LAPŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDANTINIO

AKTYVUMO TYRIMAI

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Lekt., Dr. Lina Raudonė Data

Recenzentas Darbą atliko Magistrantė Greta Pupeikytė Data Data

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI ... 9

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 10

1.1. Betula L. genties augalų klasifikacija, taksonominė įvairovė, paplitimas ... 10

1.2. Betula L. rūšių morfologiniai poţymiai ir identifikavimas ... 12

1.3. B.pendula ir B. pubescens vaistinės augalinės ţaliavos ir jų biologiškai aktyvūs junginiai ... 14

1.4. B.pendula ir B. pubescens farmakologinio poveikio tyrimai ir panaudojimas ... 15

1.5. Fenolinių junginių klasifikacija, struktūra ir savybės ... 17

1.5.1. Flavonoidų sintezė, klasifikacija ir struktūra ... 18

1.5.2. Fenolinių rūgščių klasifikacija ir struktūra ... 21

1.6. Oksidacinis stresas, antioksidantai, antioksidantinio poveikio nustatymas ... 22

2. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI ... 24

2.1. Tyrimo objektas ... 24

2.2. Naudoti reagentai ir medţiagos ... 26

2.3. Naudota aparatūra ir priemonės ... 26

2.4. Cheminis berţų identifikavimo metodas ... 26

2.5. Nuodţiūvio nustatymas augalinėje ţaliavoje ... 27

2.6. Tiriamųjų mėginių paruošimas ... 27

2.7. Berţų lapų ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 27

2.7.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27

2.7.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28

2.7.3. Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas ABTS metodu ... 29

2.7.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu ... 30

2.8. B. pendula ir B. pubescens lapų ekstraktų fenolinių junginių kiekybinės sudėties nustatymas ESC 31 3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33

3.1. Cheminis berţų identifikavimo metodas ... 33

3.3. Bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių kitimo dinamikos nustatymas B. pendula ir B.

pubescens lapuose... 35

3.4. Antioksidantinio aktyvumo kitimo dinamikos nustatymas B. pendula ir B. pubescens lapų ekstraktuose ... 38

3.5. B. pendula ir B. pubescens lapų ekstraktų fenolinių junginių kokybinės sudėties nustatymas ESC 41 3.6. B. pendula ir B. pubescens lapų ekstraktų fenolinių junginių kiekybinės sudėties nustatymas ESC 42 4. IŠVADOS ... 46

5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 47

6. LITERATŪROS ŠALTINIAI ... 48

SANTRAUKA

G.Pupeikytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė lekt., Dr. Lina Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.

Pavadinimas: Betula L. lapų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo tyrimai.

Raktiniai ţodţiai: Betula pendula Roth., Betula pubescens Ehrh., berţas, fenoliniai junginiai,

spektrofotometrija, Folin – Ciocalteu, ABTS, CUPRAC.

Tyrimo tikslas: Nustatyti natūraliai augančių berţų (Betula pendula Roth. ir Betula pubescens

Ehrh.) lapų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę, kokybinę sudėtį ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą vegetacijos metu.

Darbo uţdaviniai: Surinkti berţų lapų ţaliavų mėginius vegetacijos laikotarpyje; nustatyti

suminį flavonoidų ir bendrą fenolinių junginių kiekį Betula L. lapuose, bei įvertinti kitimo dinamiką vegetacijos metu; nustatyti antioksidantinį aktyvumą taikant ABTS antiradikalinį ir CUPRAC redukcinį aktyvumą, spektrofotometriniais metodais; nustatyti Betula L. lapų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

Tyrimo objektas ir metodai: Natūraliai augantys Betula pendula ir Betula pubescens lapai.

Berţų lapų kiekybinės ir kokybinės fenolinių junginių, flavonoidų sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas, vegetacijos metu. Antioksidantinis aktyvumas nustatytas ABTS ir CUPRAC spektrofotometriniais metodais. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė sudėtis nustatoma efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (ESC).

Tyrimo rezultatai ir išvados:Suminis fenolinių junginių kiekis vegetacijos metu B.pendula lapuose įvairuoja 33,37 ± 1,45 mg/g iki 52,56 ± 0,74 mg/g, B.pubescens - 36,85 ± 3,53 mg/g iki 70,24 ± 1,19 mg/g. Bendras flavonoidų kiekis vegetacijos metu B.pendula lapuose varijuoja nuo 6,81 ± 0,2 mg/g iki 17,35 ± 0,29 mg/g, B.pubescens lapuose - 5,88 ± 0,15 – 33,24 ± 0,27 mg/g. Didesnis antiradikalinis ir redukcinis aktyvumas nustatytas B.pubescens lapuose, lyginant su B.pendula. Tyrimų metu nustatyta 12 flavonoidų : hiperozidas, kvercitrinas, astragalinas, avikuliarinas, rutinas, kvercetino malonil –

gliukozidas, kempferolio - gliukuronidas, apigeninas, miricetinas, kempferolis, izoramnetinas, kvercetinas) ir 1 fenolinė rūgštis: chlorogeno rūgštis. B.pendula lapuose nustatytas dominuojantis junginys - hiperozidas (0,83-9mg/g), o B.pubescens - chlorogeno rūgštis (1,45 - 6 mg/g).

SUMMARY

G. Pupeikytė master„s thesis. Supervisor lect,. Dr. Lina Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of pharmacy, Department of Pharmacognosy. - Kaunas

Title: Research of phenolic compounds and antioxidant activity in Betula L. leaves.

Keywords: Betula pendula Roth. ,Betula pubescens Ehrh., birch, phenolic compounds,

spectrophotometry, Folin – Ciocalteu, ABTS, CUPRAC.

The aim: To determine quantitative, qualitative composition of phenolic compounds and

flavonoids in birch (Betula pendula Roth. and Betula pubescens Ehrh.) leaves phenolic and to evaluate the antioxidant activity during the growing season.

The objectives of the Study: Collect raw material samples of birch leaves during the vegetation

period; determine the amount of total flavonoids and total phenolic compounds in leaves of Betula L. and to evaluate changes in the dynamics of in the vegetation season; determine antioxidant activity using ABTS radical cation binding and reducing activity using spectrophotometric method CUPRAC; determine phenolic compounds qualitative and quantitative composition HPLC of the Betula L. leaves.

Methods: Naturally growing Betula pendula and Betula pubescens leaves. Quantitative and

qualitative phenolics, flavonoids composition and antioxidant activity in leaves of the birch reaserched during the growing season. ABTS and CUPRAC spectrophotometric methods are used to determine the antioxidant activity. Phenolic compounds qualitative and quantitative composition is determined by the ESC.

Results and conclusions: Total amount of phenolic compounds in B.pendula leaves varies 33.37

± 1.45 mg/g and 52.56 ± 0.74 mg/g, B.pubescens - 36.85 ± 3.53 mg/g and 70.24 ± 1.19 mg/g during the growing season. Total amount of flavonoid. B.pendula leaves varies from 6.81 ± 0.2 mg/g and 17.35 ± 0.29 mg/g, B.pubescens leaves - 5.88 ± 0.15 to 33.24 ± 0.27 mg/g during the growing season. Increased antiradical and reduction activity is determined in B.pubescens leaves compared with B.pendula.

Research has shown 12 flavonoids: hyperoside, quercetin, astragalin, avicularin, rutin, quercetin malonyl glucoside,kaempferol-glucuronide, apigenin, myricetin, kaempferol, isorhamnetin, quercetin and 1 phenolic acid: chlorogenic acid. B.pendula leaves are dominated by the hyperoside (0,83-9 mg/g) and

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolino-6-sulfono rūgštis)

CUPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (ang. Copper Reduction Assay)

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija

FRAP – geleţies redukcijos antioksidacinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power)

GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. gallic acid equivalents)

RNS – reaktyviosios azoto formos (angl. reactive nitrogen species)

ROS – reaktyviosios deguonies formos (angl. reactive oxygen species)

ĮVADAS

Europoje vaistaţolių paruošos populiariai naudojamos, kaip pagalbinė priemonė maţinant ligos simptomus, pasirenkama kaip gydymo alternatyva [1]. Nors Lietuva pasiţymi augalinių resursų gausa, tačiau vaistaţolių auginimo verslas vis dar yra silpnai vystomas [2]. Natūraliose augavietėse rinktos vaistinės augalinės ţaliavos kokybė priklauso nuo klimatinių parametrų, dirvoţemio sudėties, augalo paplitimo, įvairovės, fenologinių tarpsnių, fitocenozės [3]. Vaistinės augalinės ţaliavos rinkimas turi būti vykdomas racionaliai ir tikslingai, kad būtų išsaugotas gamtinių sistemų tvarumas ir išteklių gausumas [2]. Fitocheminė sudėtis kinta priklausomai nuo augalo augimo ir vystimosi stadijų. Biologiškai aktyvių junginių maksimumas pasiekiamas tinkamu laiku surinktoje vaistinėje ţaliavoje [3]. Įvairių farmakologinių, ekologinių ir chemotaksonominių studijų metu tirtas flavonoidų komplekso įvairavimas skirtingose berţų genties augalų rūšyse [4, 5, 6]. Lietuvoje augančių berţų augalinių ţaliavų fitocheminės sudėties tyrimai nebuvo atlikti. Moksliniais tyrimais nustatyta didelė tarprūšinė biologiškai aktyvių junginių variacija karpuotųjų ir plaukuotųjų berţų augalinėse ţaliavose [5, 6, 7], todėl svarbu atskirti ir identifikuoti šias berţų rūšis.

Nors berţynai Lietuvoje uţima apie 20 proc. visų medynų ploto [8], tačiau literatūros duomenų apie fenolinių junginių kiekio įvairavimą berţų lapuose vegetacijos metu nedaug. Pagal nustatytą berţų lapuose biologiškai aktyvių junginių kiekio įvairavimą galima spręsti, kuriame augalo fenologiniame tarpsnyje tikslinga rinkti vaistinę augalinę ţaliavą. Liaudies medicinoje berţo vaistinės augalinės ţaliavos naudojamos sergant kepenų, šlapimo takų uţdegimu, podagra, reumatu, tuberkulioze, bronchitu bei įvairių odos ligų gydyme [4]. Farmakologinį aktyvumą lemia kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai – eterinio aliejaus komponentai, dervos, saponinai, bet svarbiausi yra flavonoidai ir fenolinės rūgštys [9]. Fenoliniai junginiai pasiţymi antioksidantiniu aktyvumu ir gali apsaugoti nuo oksidacinių paţeidimų. Fenolinių junginių kiekio ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas yra svarbus vertinant ţaliavų kokybę.

Mokslinio darbo naujumas. Pirmą kartą nustatytas suminis fenolinių junginių kiekis, bendras

flavonoidų kiekis, įvertintas antioksidantinis aktyvumas, identifikuota fitocheminė sudėtis natūraliai augančių Lietuvoje Betula pendula Roth. ir Betula pubescens Ehrh. lapuose, vegetacijos metu.

Tyrimo tikslas - nustatyti natūraliai augančių berţų (Betula pendula Roth. ir Betula pubescens

Ehrh.) lapų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę, kokybinę sudėtį ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą vegetacijos metu.

DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI

Darbo tikslas - Nustatyti natūraliai augančių berţų (Betula pendula Roth. ir Betula pubescens

Ehrh.) lapų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę, kokybinę sudėtį ir įvertinti antioksidantinį aktyvumą vegetacijos metu.

Darbo uţdaviniai:

1. Parinkti tinkamiausią karpotųjų ir plaukuotųjų berţų lapų ekstrakcijos metodą ir tinkamiausias ekstrakcijos sąlygas.

2. Ištirti Lietuvoje natūraliose augavietėse augančių karpotųjų ir plaukuotųjų berţų lapų suminį flavonoidų ir bendrą fenolinių junginių kiekybinę sudėtį.

3. Ištirti karpotųjų ir plaukuotųjų berţų lapų flavonoidų ir fenolinių rūgščių komplekso kokybinę ir kiekinę sudėtį efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

4. Atlikti karpotųjų ir plaukuotųjų berţų lapų ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimus taikant ABTS radikalų katijonų surišimo ir CUPRAC redukcinį aktyvumą, spektrofotometriniais metodais.

1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Betula L. genties augalų klasifikacija, taksonominė įvairovė, paplitimas

1753 m. Karlas Linėjus išskyrė vieną berţų rūšį ir pavadino Betula alba. Šiuo pavadinimu jis apjungė dvi berţų rūšis: karpotąjį ir plaukuotąjį berţus. Dvidešimto amţiaus pabaigoje A. W. Roth, aprašė Betula pendula, taip pat šį berţą aprašė ir F. Ehrhardt, tačiau jį pavadino Betula verrucosa [10].Taksonominė Betula genties įvairovė ir pasiskirstymas pavaizduotas 1 lentelėje.

1 lentelė. Betula genties augalų įvairovė ir paplitimas [10]

Gentis Betula

Skyrius Eubetula Betulaster

Poskyris Costatae Albae Nanae Acuminatae

Rūšis B. costata Trautuv. B. globispica Shiras B. medewediewii Regel B. utilis D.Don B. ermanii Cham. B. chinensis Maxim. ir kt. B. pendula Roth. B.pubescens Ehrh. B. japonica Sieb. B. papyrifera Marsh. B. minor Fern. B. platyphylla Sukatchev ir kt. B. nana L. B. fruticosa Pall. B. exilis Sukacz. B. pumila L. B. humilis Schrenk ir kt. B. maximowicziana Regel B. alnoides Buch.-Ham. B. luminifera Winkl. Paplitimas Azija Šiaurės Amerika. Azija Šiaurės Amerika Europa Azija Šiaurės Amerika Europa Azija

Karpotasis berţas (liet. sinon.: berţas karpuotis (Mln), berţas kasočius (Gr), berţas sviruoklis (Mln), berţas svyruoklis (Rkt), karpuotasis berţas (Rkt), skarotasis berţas (Pet, St), lot. Betula pendula Roth. (sinonimas – Betula verrucosa Ehrh., Betula pendula f. Dalecaelica (L.f.)), angl. European white

Albea poskyriui [8, 10, 11]. Lotyniškas Betula Pendula pavadinimas yra siejamas su laibų šakelių

svyruokliškumu [8, 12]. Plaukuotasis berţas (liet. Sinon.: baltasis berţas (Mln), berţas pašepėlis (Mln), tošinis berţas (Mln), lot. Betula pubescens Ehrh. ( angl. Downy birch) priklauso berţinių (Betulaceae) šeimai, Betula genčiai, Eubetula skyriui, Albea poskyriui [10, 13].

Betula L. gali augti įvairaus tipo ţemėje, sausuose smėlio dirvoţemiuose, drėgnuose durpynuose,

iškirstose ar gaisro nuniokotose vietovėse, sunkiai auga potvynių uţsemtose teritorijose [10, 14, 15]. Intensyviausiai auga normalaus drėgnumo priesmėlio, priemolio dirvoţemiuose. Pirmoje vegetacijos pusėje jautrūs krituliams, oro temperatūrai, bei dirvoţemio drėgmei, nes remiantis Mikšio duomenimis pastebėta lapijos masės kintamumas dėl permainingų oro sąlygų. Ozoliničius ir Stakėnas siejo, 1993-1994 metų sausringo laikotarpio įtaką berţų defoliacijai. Karpotasis berţas jautrus apledėjimams, oro taršai, taip pat gali pakenkti ir sausringas laikotarpis [8].

Berţai gali augti gana atšiauriomis sąlygomis. Jie natūraliai paplitę Azijoje, beveik visoje Europoje, maţai paplitę Islandijoje, Graikijoje ir Pirėnų pusiasalyje, o Švedijoje B.pendula ir B.

pubescens sudaro 10% visų medţių sumos, Suomijoje - 15%. Pirmajame paveiksle pavaizduota karpotojo

berţo paplitimo sritis. Plaukuotojo berţo arealas panašus kaip ir karpotojo berţo, tačiau labiau paplitęs šiaurinėje dalyje, retai sutinkamas pietinėje Europos dalyje [8, 14, 15].

Lietuvoje berţynai uţima apie 20% visų medynų ploto, daţniausiai auga karpotasis berţas. Daugiausiai berţynų auga Lietuvos vidurio šiaurinėje ir šiaurės rytų dalyje, paveikslas 2 [8].

2 pav. Beržynų plotas tūkst. ha. [8]

1.2. Betula L. rūšių morfologiniai poţymiai ir identifikavimas

Karpotasis berţas ir plaukuotasis berţas yra panašūs tarpusavyje morfologiniais poţymiais [16]. Berţų rūšys identifikuojamos remiantis lapų, šakų, ţievės, sėklų, pumpurų, ūglių makroskopine analize [12, 14].

Karpotojo berţo (Betula pendula) stiebas daţniausiai vienas, uţauga iki 30 metrų aukščio, šakos kylančios į viršų, o smulkios šakelės lygios, nusvirusios ţemyn [8, 10, 12]. Lietuvos miškuose augantys 60-70 metų berţai uţauga iki 27 m. aukščio, ir 26 cm skersmens. Greičiausiai auga būdami 20-30 metų [8]. Jaunų berţų ţievė yra lygi, rausvai ruda, senesnių medţių - sidabriškai balta, gali būti su atsipleišėjusia tošimi [8, 10]. Ţiauberis apatinėje stiebo dalyje yra tamsi, kieta, giliai sutrūkinėjusi (akmeninė tošis) [12]. Pumpurai praţanginiai, turi platų pleištišką pagrindą, bukai nusmailėjantys, maţai arba iš viso nelipnūs [8]. Sprogsta balandţio pabaigoje – geguţės pradţioje [8]. Jauni ūgliai ploni, liekni, pliki, raudonai rudi su karputėmis [8, 12, 14]. Lapai – paprasti, kotuoti apie 2 cm ilgio, neplaukuoti [8, 12]. Lapalakštis trikampio ar rombo formos, 3-7 cm ilgio ir 2-6 cm pločio [8, 12, 14]. Lapalakščio viršūnė nusmailėjusi, ilga, gali būti palinkusi į šoną, lapo kraštas dvigubai dantytas [10, 12]. Lapo viršutinė pusė ţvilganti, tamsiai ţalios spalvos, apatinė – šviesiai ţalios spalvos, su gyslomis (3-5 poros šoninės gyslos) galima pastebėti liaukingai taškuotą paviršių [8]. Lapų viršutinis ir apatinis paviršiai lygūs. Berţai yra

vienanamiai. Kuokeliniai ţirginiai susidaro rudenį, susitelkę po 1-4 ūglių galuose, po ţiemos išsiskleidţia ir tampa iki 10-15 cm ilgio [8]. Piesteliniai ţirginiai susidaro pavasarį, būna apie 3 cm ilgio ir apie 0,3 cm pločio, ritiniški, ţali, statūs. Jų ţvyneliai iš pradţių būna ţali, o vėliau rudai ţalsvi, triskiaučiai, apie 5 mm ilgio ir pločio [8]. Ţvynelių skiautes kiaušiniškai plačios, bukos, o vidurinė dalis pailga. Berţo sėklos yra maţos su plačiais sparneliais, 2-3 kart platesni uţ riešutėlį 3-5 mm pločio [8, 12]. Prinoksta liepą – rugpjūtį, išnešiojama vėjo [8, 12].

Plaukuotasis berţas (Betula pubescesns) auga iki 20-25 metrų aukščio [8, 12]. Laja kiaušiniška, šakos stambios gali kilti smailiu kampu arba būti gulsčios, o maţos šakelės beveik nenusvirusios [12]. Jaunų medelių ţievė lygi, rausvai ruda, vėliau balta, sueiţėjusi tik liemens apatinėje dalyje [8]. Ţiauberis susidaro tik apatinėje stiebo dalyje [12]. Jauni ūgliai plaukuoti, vėliau pliki be karpelių, apvalūs [8, 12]. Pumpurai praţanginiai, rudi, lipnūs [8, 12]. Sprogsta balandţio pabaigoje – geguţės pradţioje [8]. Lapo širdiškas pagrindas gali būti apvalus arba trikampiškai apvalus, viršūnė buka, trumpa [8]. Lapalakščių abi pusės būna plaukuotos, vėliau tik apatinėse lapų pusėse tarp gyslotumo lieka plaukų kuokštelių [8, 12]. Lapo kraštai pjūkliškai dantyti. Lapkočiai plaukuoti, ilgesni, nei karpotojo berţo [12]. Plaukuotojo berţo lapai yra švelnesni, rudenį nukrenta anksčiau lyginant su karpotojo berţo lapais [8]. Kuokeliniai ir piesteliniai ţiedai ţirginiuose [8]. Piesteliniai ţirginiai iš pradţių statūs, vėliau nusvyra, kaip ir karpotojo berţo [8]. Vaisynai 2,5 -3,0 cm ilgio, 9-10 mm pločio, plaukuotu koteliu [8]. Ţvyneliai triskiaučiai padengti trumpais plaukeliais, pakraščiai blakstienoti. Sėklos – plokšti riešutėliai su dviem sparneliais, pamaţu byra beveik iki ţiemos [8, 12].

Natūraliomis Lietuvos gamtos sąlygomis, atvirose vietovėse berţai pradeda derėti sulaukę 10-15 metų, medynuose – 20-30 metų amţiaus. Vokietijoje berţų derėjimas prasideda anksti po 5-10 metų, o dirbtinėmis sąlygomis dar anksčiau po 2 metų [17].

B.pendula ir B. pubescens atskirti ir identifikuoti galima šiais būdais: mikroskopiniu,

morfologiškai ir chemiškai [7, 12, 19].

Vienas iš seniausių berţų atskyrimo metodų yra – morfologinis, lyginant vegetatyvines ir generatyvines augalo dalis, bei vertinant jų matavimo parametrus.V. Bareika ir R. Ozolinčius nustatė, kad geriausi B.pendula ir B. pubescens rūšių morfologiniai, diagnostiniai skirtumai yra pumpurų lipnumas, ţiauberies pakilimo aukštis, lapo viršūnės forma, ūglių karpotumas ir plaukuotumas, lapalakščio forma, ţievės supleišėjimo gylis, lapo bei lapkočio plaukuotumas, atstumas nuo pamato iki plačiausios lapo dalies, lapo pamato forma [19].

Morfologinis berţų identifikavimas nėra tikslus. Vienas iš patikimesnių identifikavimo metodų - cheminis metodas. Tai reakcija tarp 1,4-dinitrofenilhidrazino reagento ir vidinės berţo ţievės [12].

Vidinėje berţo ţievėje kaupiamas diarilheptanoido gliukozidas – platyfiliozidas [16]. Reakcijos tarp 1,4-dinitrofenilhidrazino reagento ir platyfiliozido rezultate susidaro oranţinės spalvos nuosėdos [12]. Karpotojo berţo karnienoje platyfiliozido kaupiama daugiau lyginant su plaukuotoju berţu. Todėl oranţinės nuosėdos susidaro tik su karpotojo berţo karnienos mėginiu, o su plaukuotojo berţo – nesusidaro [16].

1.3. B.pendula ir B. pubescens vaistinės augalinės ţaliavos ir jų biologiškai aktyvūs

junginiai

Europos farmakopėjoje nurodyta B.pendula ir B.pubescens vaistinė augalinė ţaliava – lapai [20]. Kazachstano mokslininkai gilinosi fenolinių junginių kiekio įvairavimą berţų lapuose, pumpuruose, ţirginiuose [7]. Fitocheminės sudėties tyrimai atliekami ir su kitomis berţo teikiamomis augalinėmis ţaliavomis (sula, pumpurai, ţievė).

B. pendula nuo B. pubescens skiriasi stiebo chemine sudėtimi. Fenolinis junginys

dehidrosalidrozidas randamas B. pendula stiebuose, o B. pubescens – nėra. B. pendula jaunų stiebų paviršiaus liaukose kaupiami triterpenai, papyriferinė rūgštis kartu su deacetilpapyriferine rūgštimi, skirtingai nuo B. pubescens [10]. Berţo ţievėje esti eterinių aliejų; triterpenoidų – betulino rūgštis, betulinas, betulinolio aldehidai, ursolio ir oleanolio rūgštys [4]. Karpotųjų berţų vidinėje ţievėje kaupiama platyfiliozido daugiau nei plaukuotųjų berţų [16]. Berţų šakose ir lapuose kaupiasi sunkieji metalai Cu, Ca, Mn, Fe, Pb, Cd, Sr [9].

Karpotųjų ir plaukuotųjų berţų lapuose nustatyta apie 3% flavonoidų [9]. Berţų lapuose kaupiami flavonolių glikozidai: miricetino-3-gliukuronidas, miricetino-3-galaktozidas, miricetino-3 gliukozidas, miricetino heksozidas, kempferolio gliukuronidas, kempferolio-3-glikozidas, kempferolio heksozidas, kvercetino-3-ramnozidas (kvercitrinas), kvercetino-3-gliukuronidas, kvercetino pentozidas, kvercetino – 3 – gliukozidas, daugiausiai nustatyta – kvercetino–3–galaktozido (hiperozido). B. pendula lapuose kaupiamas kempferolio acetilgliukuronidas, o B. pubescens lapuose - kempferolio acetilgliukozidas, taip pat flavonoidų aglikonas - kvercetinas [5]. Nustatyti flavonai – luteolino ir apigenino dariniai [5, 6]. Berţų lapuose nustatyti flavan-3-olių dariniai: (±) – katechino, prodelfinidino, procianidino cheminiai junginiai [5]. Pagrindiniai cheminiai junginiai berţų lapuose yra miricetino, kempferolio, kvercetino glikozidai [5]. Valkama ir kiti nustatė ESC skirtingų berţų rūšių lapų paviršiaus flavonoidus: B. pendula nustatyti flavonai – apigenino, luteolino dariniai, akacetinas, pentahidroksiflavonas trimetileteris, tetrahidroksiflavono dimetileteris; B. pubescens - nustatyti falvonai – apigeninas ir jo dariniai, akacetinas, flavonono dimetileteris, pentahidroksiflavonas trimetileteris,

flavonoliai - kempferolis ir jo dariniai, flavonolio metileteris, flavononai - naringeninas, flavonono metileteris [21].

Berţų lapų augalinėje ţaliavoje nustatytos fenolinės rūgštys: kavos rūgštis, chino rūgštis, neochlorogeno rūgštis, kriptochlorogeno rūgštis, daugiausiai - chlorogeno rūgšties. Nustatyti rūgščių glikozidai – kumaro rūgšties O – heksozidas. B. pendula kaupiama - kavos rūgšties O – heksozidas, o B.

pubescens – ferulo rūgšties O – heksozidas [5, 9]. Nustatyta ir kita cheminių junginių grupė priskiriama

fenoliniams junginiams – taninai. B. pubescens lapuose nustatyti hidrolizuoti taninai: 1-O-galolyl-ß-D-gliukozė, 1,6-di-O-galolyl-ß-D-1-O-galolyl-ß-D-gliukozė, 1,2,6-tri-O-galolyl-ß-D-1-O-galolyl-ß-D-gliukozė, 1,2,3,6-teta-O-galolyl-ß-D-gliukozė, 1,2,3,4,6-penta-O-galolyl-ß-D-1,2,3,6-teta-O-galolyl-ß-D-gliukozė, kasuaricinas, telimagrandinas, pedunculaginas [22].

Berţų lapų cheminėje sudėtyje yra ir kitų kaupiamų junginių: triterpenoidai - betulino rūgštis, betulafolientatralolis, betulafolientrilolis ir jo oksidas; vitaminai - C, E, PP, karotenas [4], eterinių aliejų sudėtyje dominuoja bicikliniai seskviterpeniniai junginiai: α – betulenolis, α – betulenolio acetatas, ß– betulenalis, ß–betulenolis [23]. Lapuose kaupiamas triptofano metabolitas - kynureninė rūgštis [24].

Berţų pumpuruose kaupiami flavonoidai, daugiausia procianidinų, katechinų, epigalokatechinų. Nustatyti miricetino, kemferolio, kvercetino glikozidai, bei apigenino, kvercetino aglikonai [4, 5]. Pumpuruose kaupiami eteriniai aliejai, kurių pagrindiniai komponentai seskviterpeniniai junginiai: α – kopaenas, germakrenas, δ–kadinenas, birkenalis, (E)–ß–kariofilenas, kariofileno oksidas, α–betulenolio acetatas, ß–betulenalis [23, 25], vitaminas C, riebalų rūgštys – palmitino, linolo ir linoleno rūgštys [4].

Berţo sulos pagrindiniai cheminiai komponentai – gliukozė ir fruktozė. Taip pat yra mineralinių medţiagų – Ca, Na, K, Mg, Fe, amino rūgščių ir vitamino PP [4].

1.4.

B.pendula ir B. pubescens farmakologinio poveikio tyrimai ir panaudojimas

B.pendula ir B. pubescens augalinės ţaliavos liaudies medicinoje naudojamos sergant kepenų,

šlapimo takų uţdegimu, podagra, reumatu, tuberkulioze, bronchitu bei įvairių odos ligų gydyme [4]. Berţų lapai naudojami kaip tradicinis augalinis vaistinis preparatas, kuris pasiţymi diuretiniu aktyvumu [9]. Triterpeninių junginių ekstraktas iš išorinės berţo ţievės, kuriame yra virš 80% betulino naudojamas keratozių gydymui [26]. Alkoholinis berţo pumpurų ekstraktas skatina plaukų augimą, o lapų nuoviras – stiprina plaukus, maţina pleiskanojimą [4, 27]. Pumpurų tinktūra pasiţymi diuretiniu, prakaitavimą skatinančiu, antiseptiniu, priešuţegiminiu poveikiais [4]. Lapai ir sula naudojami panašiems gydymo tikslams, kaip ir pumpurai. Berţų lapų augalinė ţaliava naudojamos anemijos gydymui [4].

Betulino rūgštis ir betulinolis yra priskiriami pentacikliniams triterpeniniams junginiams, kurie gali būti naudojami onkologinių ligų prevenciniame gydyme [28]. Dahelean ir kiti ESC metodu berţų ţievės ekstraktuose nustatė iki 90 proc. betulino, kurisslopina ţmogaus vėţinių ląstelių linijų poliferacinį aktyvumą, bei pasiţymi priešuţdegiminiu poveikiu [28]. Ebeling mokslininkų grupės tyrimai parodė, kad pagrindiniai biologiškai aktyvūs junginiai berţo ţievėje - triterpeniniai junginiai ir betulinas reguliuoja antiuţdegiminių citokinų, chemokinų, ciklooksigenazės - 2 kiekį, bei keratinocitų migraciją. Dėl veikliųjų junginių įtakos imuninei sistemai siejamas ţaizdų gijimą skatinantis poveikis [29]. Yi ir kiti tyrime su gyvūnais nustatė betulino rūgšties imunomoduliacinį aktyvumą, dėl sumaţėjusių IgM, IgG ir interleukinų kiekio serume [30]. Jäger ir kiti farmakokinetiniame tyrime su gyvūnais nustatė didţiausią betulino koncentraciją plazmoje - 0,33 µg/ml, po 28 dienų subkutaninio vartojimo. Tyrime nepastebėtas triterpeninio ekstrakto toksiškumas gyvūnams [31].

Aktyvuoti limfocitai turi įtakos reumatoidinio artrito ligos eigai. Grundemann ir kiti in vitro tyrime nustatė berţų (B.pendula) lapų ekstraktų slopinantį poveikį proliferacinių limfocitų aktyvumą. Autoriai sieja biologinį aktyvumą su kvercetino – monoglikozidais, kurie identifikuoti ESC ir skysčių chromatografijos – masės spektrometrijos metodais [32].

B. pendula lapų ekstraktas pasiţymi antimikrobiniu veikimu. Wojnicz ir kiti nustatė bakterinių

ląstelių gyvybingumą (proc.) priklausomai nuo berţų lapų ekstrakto koncentracijos (mg/ml) (0.125 mg/ml – 51 proc., 20 mg/ml – 6 proc.). Lapų ekstrakte nustatyti dominuojantys propiofenonų dariniai, flavonoliai (kvercetinas ir jo dariniai), fenolinės rūgštys, kurios siejamos su antibakteriniu aktyvumu. [33]. Duric ir kiti tyrė metanolinių B. pendula lapų, pumpurų, ţiedų ekstraktų ir lapų, pumpurų nuovirų antibakterinį aktyvumą. Nustatytas tyrimo objektų aktyvumas prieš Staphylococcus aureus. Metanolinis vidinės ţievės, pumpurų, ţiedų ekstraktų, pumpurų nuoviro aktyvumas prieš Bacillus subtilis. Metanolinis pumpurų, ţiedų, lapų vidinės ţievės ekstraktų aktyvumas prieš Pseudomonas aeruginosa [34].

Mashentseva ir kiti in vitro ir in vivo atliktuose tyrimuose tirti berţo vegetatyvinių organų (lapų, pumpurų, ūglių, ţirginių, ţievės) etanoliniai ekstraktai ir nustatytas fenolinių junginių, flavonoidų kiekis ir antioksidantinis aktyvumas. In vitro tyrimuose nustatyta, kad berţo ţievės ekstraktas pasiţymėjo geriausiu IC50 parametru ABTS•+ antiradikaliniu aktyvumu, šis poveikis siejamas su bendru fenolinių junginių kiekiu. In vivo tyrime nustatyta, kad berţų pumpurai sumaţina lipidų oksidaciją audiniuose panašiu rezultatu, kaip vitaminas E [7].

Plaukuotųjų berţų lapų ekstraktas pasiţymi diuretiniu aktyvumu. Tyrimas atliktas su laboratorinėmis ţiurkėmis, siekiant nustatyti šlapalo ir elektrolitų kitimą. Rezultatai buvo lyginami su hidrochlorotiazidu [35]. Rumunijos mokslininkai tyrė gyvūnų modelyje berţo sulos, pumpurų diuretinį

poveikį ir šlapimo rūgšties išsiskyrimą. Rezultatus lygino su furozemidu. Nustatyta, kad berţų sula pasiţymi stipriu diuretiniu aktyvumu (72,94 proc.), bei skatina du kartus didesnį šlapimo rūgšties išsiskyrimą nei furozemidas ar berţo pumpurų ekstraktas [36].

Italų mokslininkai tyrė B.pendula metanolinio lapų ekstrakto sudėtį ir gastroprotekcinį poveikį. Atliktas in vivo tyrimas su Wistar ţiurkėmis, kurioms etanoliu sukeltos opos. Geriausiu gastroportekciniu aktyvumu pasiţymėjo 400 mg/kg -1

berţų lapų metanolinis ekstraktas. Autoriai ESC metodu identifikavo flavonoidus, dominuojantys junginiai – miricetino ir kvercetino glikozidai [37].

1.5. Fenolinių junginių klasifikacija, struktūra ir savybės

Fenoliniai junginiai yra viena gausiausių biologinių aktyvių junginių grupė [38]. Augaluose fenolinės rūgštys dalyvauja maistinių medţiagų įsisavinime, baltymų sintezėje, fotosintezėje, skatina fermentų aktyvumą. Flavonoidai, kai kuriems augalams suteikia spalvą, dėl šios savybės priviliojami vabzdţiai, kurie svarbūs augalų apdulkinime. Taip pat jie pasiţymi antioksidantiniu aktyvumu ir apsaugo augalo ląstelės nuo reaktyviųjų deguonies formų (ROS) susidarymo [39]. Fenoliniai junginiai pasiţymi antiuţdegiminiu, antioksidantiniu, antivėţiniu aktyvumu [7, 33, 39].

Fenoliniai junginiai chemiškai apibūdinami kaip junginiai, kurie struktūroje turi bent vieną benzeno ţiedą su prisijungusia viena ar keliomis hidroksi grupėmis. Šie junginiai gali būti klasifikuojami atsiţvelgiant į anglies atomų skaičių [38]. Daţniausiai nustatomi konjuguoti su cukrais arba organinėmis rūgštimis [38]. Fenolinių junginių klasifikacija pateikta 2 lentelėje

2 lentelė. Fenolinių junginių klasifikacija Fenoliniai junginiai

Fenolinės rūgštys Flavonoidai Stilbenai Lignanai Taninai

Hidroksicinamono rūgštys Flavonai Flavonoliai Flavanonai Hidroksibenzenkarboksirūgštys Flavanoliai

Antocianidinai Izoflavonoidai

1.5.1. Flavonoidų sintezė, klasifikacija ir struktūra

Flavonoidų sintezė susijusi su pirminio metabolizmo tarpiniais produktais. Fenilpropanoidinio kelio fermentas fenilalanino amonio liazė katalizuoja fenilalaniną į cinamatą, o tai skatina tarpinio 4-kumaryl-CoA produkto susidarymą, kuris dalyvauja flavonoidų sintezėje. 4-4-kumaryl-CoA ir trys malonyl-CoA molekulės kondensuojasi į produktą, kuris veikiamas chalkono sintazės susidaro flavonoidų struktūros naringenino chalkonas. Ši reakcija dar vadinama malonato metabolizmo keliu. Chalkonas izomerizuojamas į flavononą. Flavononą veikiant įvairiomis fermentinėmis modifikacijomis gali susidaryti dihidroflavonoliai, leukoantocianidinai, antocianidinai ir kitos flavonoidų grupės [40, 41]. 3 paveiksle pavaizduota flavonoidų sintezės schema.

3 pav. Flavonoidų sintezės schema

Flavonoidai yra viena iš gausiausių junginių grupių priskiriama prie fenolinių junginių. Šiems junginiams būdingas C6-C3-C6 bendras struktūrinis pagrindas, kuris parodytas 4 paveiksle. A ir B aromatinius ţiedus skiria trijų anglies molekulių grandinė (heterociklis ţiedas C). A ţiedas kilęs iš trijų malonyl-CoA molekulių, o B ţiedas kilęs kondensacijos metu iš 4-kumaril-CoA. B aromatinis ţiedas prisijungęs prie antros, trečios arba ketvirtos heterociklinio C ţiedo padėties. Flavonoidų struktūroje kaip heterociklis ţiedas C gali būti pirano, pirilio arba pirono ţiedas. Atsiţvelgiant į C ţiedo modifikaciją, flavonoidai gali būti suskirstyti į šešis poklasius: flavonai, flavonoliai, flavanoliai, flavononai, antocianidinai ir izoflavonoidai [38, 40, 42].

4 pav. Flavonoidų struktūrinis pagrindas [42]

Flavonai. Šių junginių struktūrai būdinga dviguboji jungtis heterocikliniame C ţiede tarp C2 ir C3 padėties (paveikslas 5). Atstovai: apigeninas, luteolinas [38].

5 pav. Flavonų pagrindinė struktūra [38]

Flavonoliai. Junginiai paplitę gaubtasėklių augaluose. Struktūrai būdingas neprisotintas

heterociklinis ţiedas ir C3 padėtyje esanti hidroksi grupė (paveikslas 6). Atstovai: kvercetinas, kempferolis, miricetinas [38, 42].

6 pav. Flavonolių pagrindinė struktūra [38]

Flavanonai. Šių junginių struktūrai būdinga prisotinta 3 anglies molekulių grandinė, taip pat yra

7 pav. Flavonono pagrindinė struktūra [38]

Flavanoliai. Šių junginių struktūrai būdinga prisotinta trijų anglies molekulių grandinė, tačiau

skirtingai nei flavononai turi C3 padėtyje hidroksi grupę (paveikslas 8). Flavanoliai egzistuoja aglikonų struktūros arba sudaro sudėtingus polimerinius junginius, tačiau glikozidų nesudaro. Atstovai: katechinas, galokatechinas [38, 42].

8 pav. Flavanolių pagrindinė struktūra [38]

Antocianidinai. Antocianidinų struktūros pagrindą sudaro flavilio (2 - fenilbenzopirilio)

katijonas (9 paveikslas). Gamtoje esti glikozilinti junginiai. Šie junginiai nudaţo spalvotai augalo lapus ir ţiedus. Spalva priklauso nuo pH, sudaromų kompleksinių junginių su metalų jonais, cukraus molekulių išsidėstymo struktūroje. Atstovai: pelargonidinas, cianidinas, malvidinas, delfinidinas [38, 42].

9 pav. Antocianidinų bendra struktūra [38]

Izoflavonoidai. Jų struktūros pagrindas pavaizduotas 10 paveikle. Šie junginiai natūraliai paplitę

Pupinių šeimos atstovų cheminėje struktūroje. B ţiedas prisijungęs prie pirono trečio anglies atomo. Atstovai: genistinas, daidzeinas, gliciteinas ir kiti [43].

10 pav. Izoflavonoidų bendra struktūra [38]

Flavonoidai gali egzistuoti laisvo pavidalo (aglikono), tačiau dauguma jų yra glikozilinti. Skirstomi į O - glikozidus ir C - glikozidus, priklausomai nuo cukraus prisijungimo vietos ir padėties. O – glikozidai turi cukraus pakaitą prisijungusį prie aglikono hidroksi grupės, daţniausiai 3 arba 7 padėtyje. C – glikozidai turi cukraus pakaitą prisijungusį prie anglies molekulės, daţniausiai prie C6 arba C8 padėties [38].

1.5.2. Fenolinių rūgščių klasifikacija ir struktūra

Tik maţa dalis fenolinių rūgščių egzistuoja laisvos formos, daţniausiai jie prisijungę prie esterių, eterių, ar acetatinių jungčių. Gali būti prisijungę prie didelių polifenolinių junginių arba maţesnių organinių molekulių. Fenolinės rūgštys priklauso fenoliniams junginiams, kurie skirstomi į keletą pagrindinių grupių, atsiţvelgiant į anglies struktūrą: hidroksibenzenkarboksirūgšties, hidroksicinamono rūgšties struktūras (11 paveikslas) [38, 40].

Hidroksibenzenkarboksirūgštys- tai prie fenolinio ţiedo prisijungusi karboksi grupė. Būdingas

C1-C6 struktūros pagrindas. Hidroksibenzenkarboksirūgščių junginiai gali egzistuoti laisvos formos ir glikozilintų esterių pavidalo. Atstovai: galo rūgštis, salicilo rūgštis, vanilino rūgštis (11 paveikslas) [38, 40, 42].

Yra šešios daţniausiai pasitaikančios hidroksicinamono rūgštys: cinamono rūgštis, p-kumaro rūgštis, kavos rūgštis, ferulo rūgštis, 5-hidroksiferulo rūgštis ir sinapo rūgštis (11 paveikslas). Šiai grupei būdinga C3-C6 struktūros pagrindas [40, 42].

1.6. Oksidacinis stresas, antioksidantai, antioksidantinio poveikio nustatymas

Lėtinės ligos, įskaitant onkologines ligas, širdies ir kraujagyslių ligas, uţdegimines ligas, ir kitas degeneracines ligas, yra susijusios su oksidaciniu stresu ir reaktyviųjų deguonies (ROS) ir azoto formų susidarymu (RNS) [40]. Oksidacinis stresas gali būti apibrėţiamas, kaip disbalansas tarp prooksidanto ir antioksidanto, bei gali sukelti potencialią ţalą [44]. Reaktyvios deguonies formos (superoksido anijonas (O2•-), hidroksilo radikalas (OH•), vandenilio peroksidas (H2O2), peroksilo radikalas (ROO•), hipochloro rūgštis (HClO), peroksinitritas (ONOO-_{)) paţeidţia DNR, oksiduoja lipidus, sukelia struktūrinių baltymų} modifikacijas [45].

Antioksidantai klasifikuojami į tiesioginius ir netiesioginius. Tiesioginiai antioksidantai sąveikauja su ROS ir maţina jų kiekį sąveikaujant su biomolekulėmis, taip pat atkuria biologinių molekulių aktyvią formą. Tačiau tiesioginiai antioksidantai susinaudoja sąveikaujant su ROS, todėl jų veikimo laikotarpis ribotas. Šiai klasei priskiriami vitaminas E, C, karotenai [45]. Netiesioginiai antioksidantai skatina tiesioginių antioksidantų aktyvumą, veikimą, didina bendrą ląstelės antioksidacinę galią. Šiems antioksidantams priskiriami fenolinės rūgštys, lipo rūgštis, melatoninas, izotiocianatas [45].

Antioksidantų veikimo mechanizmai aiškinami keliais būdais. Antioksidantai inaktyvuoja ROS ar lipidų peroksidacijos radikalus vandenilio atomo perdavimo ir elektronų perdavimo reakcijomis, bei apsaugo nuo ROS susidarymo katalizuojant metalams [40, 46]. Aplinkoje ir organizme susidarę superoksido radikalas ir vandenilio peroksidas gali būti transformuojami, katalizuojant Fe2+ ir Cu+ metalams, į pavojingą hidroksilo radikalą, kuris pasiţymi dideliu reaktyvumu [44, 45]. Fenoliniai junginiai yra ţinomi kaip metalų chelatoriai. Metalų chelacija sumaţina reakcijos greitį ir taip siekiama išvengti oksidacijos proceso [40]. Fenoliniai junginiai geba neutralizuoti laisvus radikalus atiduodant elektroną arba vandenilio atomą, bei inhibuoja laisvųjų radikalų prekusorių susidarymą, dėl to maţėja oksidacijos greitis. Manoma, kad flavonoidai galėtų būti kaip profilaktinė, papildoma priemonė lėtinėms ligoms gydyti [40, 41].

Fenoliniai junginiai turi tinkamą cheminę struktūrą laisvų radikalų neutralizavimui, nes jų struktūroje yra fenolinė hidroksi grupė, kuri yra linkusi atiduoti vandenilio atomą, ar elektroną laisvam radikalui ir sudaro stabilų junginį. Taip pat cheminei struktūrai būdinga konjuguota aromatinių ţiedų sistema, kuri geba perkelti nesuporuotus elektronus [38]. Augalinių ţaliavų antioksidantinis aktyvumas tikrinamas in vitro modelinėse sistemose, o vėliau in vivo. Yra sukurta in vitro modelių sistemų, kuriomis siekiama įvertinti augalinių ţaliavų antioksidantinį aktyvumą. Šiais metodais galima pagrįsti ir susieti fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą [40].

Vieni iš populiariausių antioksidacinio aktyvumo nustatymo būdų yra DPPH radikalų ir ABTS radikalų – katijonų surišimo įvertinimas, vario (CUPRAC) ir geleţies (FRAP) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymas. Remiantis spektrofotometrine analize ir pasirinkus nustatymo metodiką, įvertinamas tiriamojo tirpalo (antioksidanto) pakitęs absorbcijos spektras regimosios šviesos srityje [47].

ABTS (2,2‟-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) reagentu yra sudaromas radikalas - katijonas (ABTS•+_{), kuris yra spalvotas, stabilus, naudojamas siekiant įvertinti antiradikalinį aktyvumą in}

vitro. Absorbcijos maksimumas nustatomas regimosios šviesos spektre esant 415, 650, 815, 734 nm

bangos ilgiui [47]. Šiuo metodu nustatoma antioksidantinė galia lipofilinių ir hidrofilinių tirpalų [48]. Sugeneravus tam tikrą ABTS•+ _{kiekį įvedamas tiriamasis bandinys (antioksidantas), ir po tam tikro laiko} intervalo įvykusios tiesioginės reakcijos, išmatuojamas absorbcijos spektras, kuris lygus likusiam ABTS•+ kiekiui [47, 48]. Šis metodas paremtas elektronų perdavimo ir atomo perdavimo reakcijomis [47].

DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) yra stabilus azoto radikalas, kuris yra redukuojamas junginių, pasiţyminčių antiradikaliniu aktyvumu. Absorbcijos pokytis matuojamas 515-528 nm bangos ilgio intervalu. Šis metodas paremtas elektronų perdavimo ir atomo perdavimo reakcijomis [47].

CUPRAC metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į chromogeninį vienvalenčio vario ir neokuproino kompleksą [47]. Absorbcijos maksimumas pasiekiamas esnat 450 nm bangos ilgiui [46]. CUPRAC reagentas yra stabilesnis ir pagaminamas lengviau, nei ABTS•+ reagentas. Antioksidantinis metodas tinka norint įvertinti lipofilinių ir hidrofilinių antioksidantų galią. Šis metodas paremtas elektronų perdavimo reakcijomis [47].

FRAP metodu įvertinamas antioksidantų gebėjimas, rūgštinėje terpėje, redukuoti trivalentę geleţį į dvivalentę geleţį. Metodas paremtas elektronų perdavimo reakcijomis [47].

2. TYRIMO OBJEKTAI IR METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimo objektas –15-20 metų, nederantys Betula genties augalai - natūraliai augančių karpotųjų berţų (Betula pendula Roth.) lapai, surinkti 2013, 2014 metais ir natūraliai augančių plaukuotųjų berţų (Betula pubescens Ehrh.) lapai, surinkti 2014 metais. Vaistinių augalų lapai rinkti Trakų rajone, Varnikų kaime 5 mėnesius – nuo geguţės vidurio iki rugsėjo mėnesio pabaigos, spalio vidurio. Surinkta vaistinė augalinė ţaliava buvo dţiovinama gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugota nuo tiesioginių saulės spindulių. Išdţiovintas tiriamasis objektas supakuotas į popierinius maišelius ir laikytas tamsioje, sausoje vietoje. Tyrimams naudotos augalinės ţaliavos ėminių duomenys pateikti 3 lentelėje. Pumpurų sprogimo pradţia apibūdinama, kai lapinių pumpurų išsiskleidţia 10 proc. Lapų kritimo pabaiga - kai nukrinta beveik visi matomi berţų lapai [49]. Pagal klimatinį rajonavimą – Lietuvos pietryčių aukštumų rajono dalis, aukštaičių parajonis (vidutinė metinė oro temperatūra 6,1-6,7 °C, kritulių kiekis per metus 610 – 690 mm) [50].Vidutinė vegetacijos periodo temperatūra: 2013 metų – 14,98 ° C, 2014 metų –13,47° C. Suminis kritulių kiekis berţų lapų vegetacijos laikotarpiu: 2013 metų - 401,5 mm, 2014 metų – 408,3 mm. Bendrasis saulės spinduliuotės vegetacijos laikotarpio vidurkis: 2013m – 15,29 MJ/m2_{, 2014 metų –} 17,46 MJ/m2 [51].

3 lentelė. Augalinės žaliavos mėginių rinkimo data ir vieta

Ţaliavos rinkimo data

Ţaliavos pavadinimas

Fenologinis tarpsnis Rinkimo vieta

2013-04-27 Masinis pumpurų sprogimas.

2013-05-10 B.pendula lapai Sulapojimo pradţia Trakų rajonas

2013-05-24 B.pendula lapai Masinis sulapojimas Trakų rajonas 2013-06-09 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-06-25 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-07-07 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-07-22 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-08-03 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-08-20 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-08-29 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2013-09-27 B.pendula lapai Visiškas lapų pageltimas, lapų kritimo

pradţia

Trakų rajonas

2013-10-13 B.pendula lapai Visiškas lapų pageltimas, masinis lapų

kritimas

Trakų rajonas

2014-04-15 Masinis pumpurų sprogimas

2014-04-27 B.pendula lapai B.pubescens lapai

Sulapojimo pradţia (mėginio nėra) Trakų rajonas

2014 -05-09 B.pendula lapai Masinis sulapojimas (mėginio nėra) Trakų rajonas 2014-05-09 B.pubescens lapai Masinis sulapojimas Trakų rajonas 2014-05-31 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-05-31 B.pubescens lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-06-14 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-06-14 B.pubescens lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-06-28 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-06-28 B.pubescens lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-07-15 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-07-15 B.pubescens lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-08-09 B.pendula lapai Visiškas sulapojimas Trakų rajonas

2014-08-09 B.pubescens lapai Lapų rudeninio geltimo pradţia Trakų rajonas

2014-08-24 B.pendula lapai Lapų rudeninio geltimo pradţia Trakų rajonas

2014-08-24 B.pubescens lapai Lapų masinis pageltimas Trakų rajonas

2014-09-09 B.pendula lapai Lapų masinis pageltimas Trakų rajonas

2014-09-09 B.pubescens lapai Visiškas lapų pageltimas, lapų kritimo

pradţia

Trakų rajonas

2014-09-28 B.pendula lapai Visiškas lapų pageltimas, lapų kritimo

pradţia

Trakų rajonas

2014-09-28 B.pubescens lapai Lapų kritimo pabaiga Trakų rajonas

2.2. Naudoti reagentai ir medţiagos

Naudoti analitinio švarumo tirpikliai, reagentai ir standartai: 96,3 proc. V/V etilo alkoholis (AB „Stumbras“, Kaunas, Lietuva), 2,4-dinitrofenilhidrazinas (,,Sigma – Aldrich“, St. Louis, JAV), 35 proc. V/V vandenilio chlorido rūgštis (,,Sigma – Aldrich“, St. Louis, JAV), Folin-Ciocalteu reagentas (,,Sigma-Aldrich“, St. Louis, JAV), natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija), galo rūgšties monohidratas (,,Sigma-Aldrich“, St. Louis, JAV), aliuminio chlorido heksahidratas („Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Steinheim, Vokietija), 98 - 100 proc. V/V acto rūgštis (,,Sigma–Aldrich“, St. Louis, JAV), heksametilentetraminas („Alfa Aesar“, Massachusetts, JAV), kvercetino dihidratas (,,Carl Roth GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija), ABTS (2,2-azinobis (etil-2,3-dihidrobenzotiazolin-6-sulfoninė rūgštis, ,,Alfa Aesar„„, Massachusetts, JAV), kalio persulfatas (,,Alfa Aesar GmbH & Co“, Karlsruhe, Vokietija), vario (II) chlorido dihidratas (,,Carl Roth GmbH& Co”, Karlsruhe, Vokietija), neokuprionas („Alfa Aesar“, Massachusetts, JAV), amonio acetatas (,,Sigma-Aldrich„„, St. Louis, JAV), troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) (,,Sigma-Aldrich„„, St. Louis, JAV).

2.3. Naudota aparatūra ir priemonės

Tyrime naudota aparatūra: analitinės svarstyklės (Sartorius Cp6M-0CE, Vokietija), ultragarsinė vonelė (Bandelin SONOREX Digital,Vokietija), spektrofotometras (Beckman DU – 70, JAV), mechaninė purtyklė (Laboratory shaker 358S, Lenkija), elektrinis malūnėlis (Binatone, Jungtinė Karalystė), chomatografas (Waters 2695, Milford, USA).

2.4. Cheminis berţų identifikavimo metodas

Gaminamas 2,4 - dinitrofenilhidrazino tirpalo reagentas. Atsveriama 0,4 g 2,4-dinitrofenilhidrazino miltelių ir ištirpinami 100 ml 2 M vandenilio chlorido rūgštyje. Tirpalas paliekamas 24 valandoms ir filtruojamas. Švieţio berţo ţievės mėginiai dedami į mėgintuvėlius uţpilami 2,4-dinitrofenilhidrazino reagento tirpalu. Tyrimo rezultatai nustatomi po 1 valandos [7, 12].

2.5. Nuodţiūvio nustatymas augalinėje ţaliavoje

Nuodţiūvis nustatomas remiantis Ph.Eur. 01/2005, 2.2.32 ,,Masės netektis dţiovinant“. Susmulkinta tiriamoji ţaliava su elektriniu malūnėliu. Atsverta po 1g (masės skirtumas tarp mėginių svėrimo 0,01 g) tiriamos augalinės ţaliavos ir laikyta dţiovinimo spintoje (105 ° C temperatūra). Maksimalus berţų lapų nuodţiūvis galimas iki 10 procentų [20]. Nuodţiūvis (proc.) skaičiuojamas naudojantis formule:

𝑋 =(𝑚 −𝑚1)

𝑚 x 100; %

m – žaliavos masė prieš džiovinimą (g); m1 - žaliavos masė po džiovinimo (g).

2.6. Tiriamųjų mėginių paruošimas

Vaistinė augalinė ţaliava sumalama elektriniu malūnėliu, atsveriama ir uţpilama skirtingos koncentracijos etanoliu. Iš kiekvienos augalinės ţaliavos mėginio pagaminti etanoliniai ekstraktai santykiu 1:100. Ekstrahuojama ultragarsu 30 min. uţkimštuose rudo stiklo buteliukuose. Ultragarsinės vonelės galia 10 x10 proc. Ekstrakcija pradedama kambario temperatūros vandenyje.

Gauti ekstraktai filtruojami pro sudrėkintą distiliuoto vandens popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliuką. Sandariai uţsukti buteliukai laikomi kambario temperatūroje. Iš kiekvieno vaistinės augalinės ţaliavos mėginio pagaminti trys ekstraktai, kurie gaminami tokiomis pačiomis sąlygomis.

2.7. Berţų lapų ekstraktų spektrofotometrinė analizė

2.7.1. Suminio fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Suminis fenolinių junginių kiekis etanoliniuose berţų lapų ekstraktuose nustatytas remiantis Folin – Ciocalteu kolorimetriniu metodu naudojantis spektrofotometru Beckman DU®-70 (JAV). Folin-Ciocalteu reagentas praskiedţiamas 10 kartų distiliuotu vandeniu ir gaunamas darbinis reagentas. Į kolbutę įpilamas 0,4 ml paruoštas vaistinės augalinės ţaliavos ekstraktas, sumaišomas su 2,0 ml pagamintu darbiniu reagentu ir 1,6 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalo. Gautas mišinys sumaišomas ir laikomas tamsoje kambario temperatūroje 1 val. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija esant 765 nm bangos ilgiui.

Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GAE) gramui ţaliavos. Apskaičiuojama remiantis formule:

𝐺𝐴𝐸 = 𝐶 × 𝑉

𝑚 ; 𝑚𝑔/𝑔

C- galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml); m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g) [7, 52].

Paruošti standartiniai etanoliniai galo rūgšties tirpalai skirtingomis koncentracijomis intervale 0,00625 -0,1 mg/ml. Suminis fenolinių junginių kiekis vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono galo rūgšties kalibracinę kreivę. Galo rūgšties kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 12 paveiksle.

12 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė

2.7.2. Suminio flavonoidų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu

Bendras flavonoidų kiekis nustatomas ekstraktą veikiant aliuminio chlorido tirpalu parūgštintoje terpėje. Suminis flavonoidų kiekis įvertinamas pagal kvercetino kiekį.

Į 5 ml matavimo kolbutę įpilama 0,2 ml paruoštos vaistinės augalinės ţaliavos ištrauka (karpotojų ar plaukuotųjų berţų lapų etanolinio ektraktro), sumaišoma su 2,0 ml 96 proc. V/V etanoliu, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalu, 0,3 ml 10 proc. aliuminio chlorido tirpalu. Po 30 minučių į tirpalų mišinį įpilamas 5 proc. heksametilentetramino tirpalas ir skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki ţymės. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant 407 nm bangos ilgiui. y = 12.944x + 0.0007 R² = 0.999 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Op tin is tan kis, A

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 5 ml matavimo kolbutę įpilant 0,2 ml vaistinės augalinės ţaliavos ištraukos (karpotųjų ar plaukuotųjų berţų lapų etanolinio ektraktro), sumaišoma su 2,0 ml 96 proc. V/V etanoliu, 0,1 ml 30 proc. acto rūgšties tirpalu ir skiedţiama išgrynintu vandeniu iki ţymės. Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas kvercetino ekvivalentais gramui sausos ţaliavos. Apskaičiuojama remiantis formule:

𝑋 =𝐶 × 𝑉

𝑚 ; 𝑚𝑔/𝑔

C- kvercetino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml); m – vaistinės augalinės žaliavos pasvertas kiekis (g)[53].

Ruošiami etaloniniai kvercetino tiriamasis ir palyginamasis tirpalai skirtingomis koncentracijomis intervale 0,01562 - 0,5 mg/ml. Tačiau skirtingai nuo tiriamojo tirpalo vietoj 0,2 ml paruoštos augalinės ţaliavos ištraukos pilama 0,2 ml etaloninio kvercetino tirpalo. Bendras flavonoidų kiekis vertinamas pagal etalono kvercetino kalibracinę kreivę. Kvercetino kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 13 paveiksle.

13 pav. Kvercetino kalibracinė kreivė

2.7.3. Laisvųjų radikalų surišimo nustatymas ABTS metodu

Laisvųjų radikalų surišimo įvertinimas analizuotas spektrofotometriniu metodu [7].

Paruoštas 2 mM koncentracijos motininis ABTS tirpalas paliekamas 16 val. tamsaus stiklo buteliuke. Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas praskiedus motininį tirpalą distiliuotu vandeniu iki 0,800 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas distiliuotas vanduo. y = 1.7811x - 0.007 R² = 0.997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.91 0 0.2 0.4 0.6 Opti n is tan ki s, A Kvercetino koncentracija, mg/ml

Imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo, pridedama 20 µl tiriamojo ektrakto ir sumaišoma. Mišinys laikomas 1 val. kambario temperatūroje, tamsoje. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis esat 734 nm bangos ilgiui.

Laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui ţaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:

𝑇𝐸 𝐴𝐵𝑇𝑆 =𝐶 × 𝑉

𝑚 ; µ𝑚𝑜𝑙/𝑔

C – trolokso koncentracija (µmol/L) , nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g) [48].

ABTS•+

surišimui naudojamas etaloninis antioksidantas – troloksas. Trolokso kalibracinė kreivė sudaroma po 1 val. trunkančios tiesioginės reakcijos tarp ABTS•+

ir antioksidanto, kai išmatuojama tirpalo absorbcija (A), kuri proporcinga likusiai ABTS•+ koncentracijai (0,800-A). Trolokso kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 14 paveiksle.

14 pav. Trolokso kalibracinė kreivė

2.7.4. Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu

CUPRAC metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į chromogeninį vienvalenčio vario ir neokuproino kompleksą [47].

CUPRAC reagentas sudalytas iš trijų lygių dalių sumaišytų iš 10 mM vario (II) chlorido, 7,5 proc. neokuproino ir 1 M amonio acetato buferio tirpalų.

Imama 3 ml darbinio CUPRAC reagento, pridedama 20 µl tiriamojo ektrakto ir sumaišoma. Mišinys laikomas 1 val. kambario temperatūroje, tamsoje. Spektrofotometru išmatuojamas mišinio absorbcijos pokytis esat 450 nm bangos ilgiui.

y = 0.2214x + 0.0132 R² = 0.9987 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 200 400 600 800 1000 A b sor b ci jos p o kyti s

Redukcinio aktyvumo geba išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE) gramui ţaliavos. Apskaičiuojama pagal formulę:

𝑇𝐸 𝐶𝑈𝑃𝑅𝐴𝐶 =𝐶 × 𝑉

𝑚 ; µmol/g

C – trolokso koncentracija (µmol/L), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V – ekstrakto tūris (L); m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis (g).

Ruošiami etaloniniai trolokso tiriamieji tirpalai skirtingomis koncentracijomis intervale 50 – 800 µmol/L. Redukcinis aktyvumas vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono trolokso kalibracinę kreivę Trolokso kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 15 paveiksle.

15 pav. Trolokso kalibracinė kreivė

2.8. B. pendula ir B. pubescens lapų ekstraktų fenolinių junginių kiekybinės sudėties

nustatymas ESC

ESC analizė atlikta su Waters 2695 chomatografas (Milford, USA) su diodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, USA). Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 5-μm ACE C18 analitinę kolonėlę (250 × 4.6 mm) su prieškolone 5-μm ACE C18 (20 × 4.0 mm) (Aberdeen, Scotland), 25 °C temperatūroje. Eliuentų sistema sudaryta iš: 1% (v/v) skruzdţių rūgšties (A) ir acetonitrilo (B). Eliucijos sistema: 10–15% tirpiklis B 0–20 min, 15% tirpiklis B 20–30 min, 15–30% tirpiklis B 30–45 min, 30–40% tirpiklis B 45–55 min. Judrios fazės tėkmės greitis 1 ml/min, injekuoto ekstrakto tūris - 10 μl. Fenoliniai junginiai identifikuoti pagal smailių sulaikymo trukmę ir UV spektrą (λ = 200–600 nm) palyginant juos su ţinomais standartais. Flavonoidų absorbcijos dydţiai gauti ir junginių

y = 0.1125x - 0.0016 R² = 0.9994 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1 0 200 400 600 800 1000 Op tinis t an ki s, A

kiekiai apskaičiuoti esant 360 nm bangos ilgiui, o chlorogeno rūgštis – 320 nm bangos ilgiui. Kiekybinis fenolinių junginių įvertinimas atliktas pagal standartų kalibracines kreives.

Statistinė duomenų analizė. Gauti tyrimų rezultatai apdoroti ir susisteminti naudojant Microsoft

Office Excel (Microsoft, JAV) ir SPSS 17.0 (SPSS Inc., JAV) kompiuterine programa. Visi tyrimai atlikti po tris kartus. Rezultatai įvertinti naudojant aprašomosios statistikos (padėties ir sklaidos) charakteristikas, o gauti rezultatai išreikšti vidurkiu ± standartinis nuokrypis. Duomenų analizei naudotas tiesinis regresijos modelis. Kiekvieno regresijos modelio tinkamumui įvertinti buvo naudojamas determinacijos koeficientas R2 ir p-reikšmė (p), gauta tikrinant hipotezę apie regresijos netiesiškumą. Tarp nagrinėjamų kintamųjų buvo tiriamas tiesinio koreliacinio ryšio stiprumas, kurį įvertina Spirmeno koreliacijos koeficientas (R). Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas, taikant vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA). Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05.

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Cheminis berţų identifikavimo metodas

Tiksliam berţų rūšių identifikavimui pasirinkta švedų mokslininkų 1995 metais paskelbta metodika [16]. Tyrimas remiasi reakcija tarp berţo ţievėje kaupiamo platyfiliozido ir 2,4-dinitrofenilhidrazino reagento, susidaro oranţinės spalvos nuosėdos [16]. Lietuvos mokslininkai Dr. Vytautas Bareika ir Dr. Vidas Stakėnas gilinosi į karpotojo ir plaukuotojo berţų identifikavimo metodus, naudojo cheminį metodą. Mokslininkai rekomendavo greitą cheminį metodą, trūkstant patirties identifikuojant karpotajį ir plaukuotąjį berţus [12]

Tyrimo rezultatai pateikti 16 paveiksle. Karpotasis berţas identifikuotas paţymėtuose mėgintuvėliuose numeriu 2, dešinėje paveikslo pusėje, dėl iškritusių oranţinės spalvos nuosėdų. Kairėje paveikslo pusėje - reagento tirpale nuosėdų nėra, tirpalas skaidrus, šviesiai geltonos spalvos, identfikuojamas - plaukuotasis berţas.

16 pav. 1 - 2,4-dinitrofenilhidrazino reagento tirpalas su plaukuotųjų beržų žievės mėginiais; 2 - 2,4-dinitrofenilhidrazino reagento tirpalas su karpotųjų beržų žievės mėginiais

3.2. Fenolinių junginių ekstahavimo metodo parinkimas

Atliekamas ekstrahento koncentracijos tyrimas, kuriame naudojami vandens ir įvairių koncentracijų etanolio mišiniai. Folin-Ciocalteu metodu spektrofotometriškai nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis galo rūgšties ekvivalentais. Gauti rezultatai pavaizduoti 17 paveikle.

17 pav. Fenolinių junginių kiekis (mg/g) naudojant vandenį ir skirtingos koncentracijos vandens – etanolio mišinius.

Daugiausia fenolinių junginių ekstrahuota 60 proc. V/V etanoliu (40,2 ± 1,74 mg/g), maţiausiai - distiliuotu vandeniu ir 96,3 proc. V/V (atitinkamai 24,0 ± 1,01 mg/g ir 26,87 ± 0,87 mg/g) (p<0.05). Literatūros šaltiniuose minimi daţniausiai naudojami tirpikliai: alkoholiai (etanolis, metanolis), acetonas, dietileteris ir etilacetatas, tačiau šiuose grynuose organiniuose tirpikliuose nevisiškai išsiekstrahuoja fenolinės rūgštys (hidroksibenzenkarboksirūgštys ir hidroksicinamono rūgštys). Todėl mokslininkai rekomenduoja ekstrakcijai naudoti alkoholio - vandens ar acetono - vandens mišinius [39]. Berţų lapų ekstraktai daţniausiai gaminami su vandens ir etanolio mišiniais [9]. Atsiţvelgiant į gautus rezultatus, nustatytas tinkamiausias ekstrahentas – 60 proc. V/V etanolis, kuris naudojamas tolimesniuose tyrimo etapuose.

Nėra vienintelio standartinio fenolinių junginių išgavimo būdo [54]. Fenolinių junginių ekstrakcijai gali būti naudojami įvairūs metodai: skysčių – skysčių ekstrakcija, kietafazė ekstrakcija, soksleto ekstrakcija, superkritinė skysčių ekstrakcija, mikrobangomis, purtymu, mechaniniu maišymu paremta ekstrakcija [39, 54]. Šiame tyrime pasirinkta mechaniniu purtymu ir ultragarsu paremta ekstrakcija, skirtingu laiko intervalu. Folin-Ciocalteu metodu spektrofotometriškai nustatomas bendras fenolinių junginių kiekis galo rūgšties ekvivalentais. Gauti rezultatai pateikti 18 paveiksle.

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Vanduo 40% etan 60% etan 70% etan 80% etan 96.3% etan

Fe n o lin ių ju n gi n ių kiekis mg /g

Ekstrakcijoje naudojami vandens ir skirtingos koncentracijos vandens -etanolinio mišiniai

18 pav. Fenolinių junginių kiekis (mg/g)skirtingais laiko intervalais, ekstrakciją vykdant skirtingais būdais

Remiantis gautais rezultatais nustatyta, ekstrakcija ultragarso vonele gaunami didesni fenolinių junginių kiekiai lyginant su mechanine purtykle. Didţiausia fenolinių junginių išeiga nustatyta ekstrakcija ultragarso vonele, kuri truko 30 min. (34,31± 0,83mg/g) (p<0.05).

Atsiţvelgiant į eksperimentinio tyrimo gautus rezultatus, pasirenkamas 60 proc. V/V etanolio tirpiklis, bei vaistinės augalinės ţaliavos (berţų lapų) ekstrakcija ultragarso vonelia, trukmė - 30 min.

3.3. Bendras fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių kitimo dinamikos nustatymas B.

pendula ir B. pubescens lapuose

Spektrofotometriniai analizės metodai nebrangūs, paprasti ir suteikia naudingos informacijos apie fenolinių junginių kiekybinę sudėtį [54]. Fenolinių junginių kiekybinė sudėtis yra svarbi vertinant augalinės ţaliavos kokybę.

2013 metų B. pendula rinktų lapų ekstraktuose fenolinių junginių kiekis svyravo nuo 33,37 ± 1,45 mg/g iki 52,56 ± 0,74 mg/g. Nustatyti keli fenolinių junginių maksimumai (p<0,05). Geguţės pabaigoje, masinio sulapojimo metu, nustatyta 47,0 ± 0,36 mg/g ir rugsėjo pabaigoje, visiško lapų pageltimo metu – 52,56 ± 0,74 mg/g. Maţiausiai liepos pradţioje, visiško sulapojimo metu - 33,37 ± 1,45 mg/g (p<0,05). Flavonoidų kiekis ekstraktuose svyravo nuo 7,39 ± 0,003 mg/g iki 17,35 ± 0,29 mg/g, daugiausiai nustatyta geguţės pirmoje dekadoje (p<0,05), sulapojimo pradţioje (paveikslas 19).

0 5 10 15 20 25 30 35

5 min. 10 min. 15 min. 30 min. 45 min. 60 min.

Fe n o lin ių ju n gi n ių k iek is, m g/ g Laikas, min Mechaninė purtyklė Ultragarso vonelė

19 pav. 2013 metų B. pendula lapų ekstraktų bendro fenolinių junginių (mg/g) ir flavonoidų kiekių (mg/g) kitimo dinamika vegetacijos metu (n=3)

2014 metų B. pendula rinktų lapų ekstraktuose fenolinių junginių kiekis svyravo nuo 35,23 ± 0,9 mg/g iki 49,35 ± 1,37 mg/g. Fenolinių junginių maksimumas nustatytas rugsėjo pabaigoje, visiško lapų pageltimo metu (p<0,05), o maţiausiai - birţelio viduryje, visiško sulapojimo metu (35.23 ± 0,9 mg/g) (p<0,05). Flavonoidų kiekis svyravo nuo 6,83 ± 0,24 mg/g iki 15,96 ± 0,49 mg/g. Didţiausias flavonoidų kiekis nustatytas rugpjūčio mėnesio pirmoje dekadoje, visiško sulapojimo metu (p<0.05) (paveikslas 20).

20 pav. 2014 metų B. pendula lapų ekstraktų bendro fenolinių junginių (mg/g) ir flavonoidų kiekių (mg/g)kitimo dinamika vegetacijos eigoje (n=3)

Bendras fenolinių junginių kiekis B.pendula lapų mėginiuose vegetacijos metu 2013 ir 2014 tyrimo metais įvairuoja nuo 33,37 ± 1,45 mg/g iki 52,56 ± 0,74 mg/g ir nuo 35,23 ± 0,9 mg/g iki 49,35 ±

0 10 20 30 40 50 60 C, m g/ g

Lapų rinkimo datos

Suminis fenolinių junginių kiekis Suminis flavonoidų kiekis 0 10 20 30 40 50 60 C, m g/ g

Lapų rinkimo datos

Suminis fenolinių junginių kiekis Suminis flavonoidų kiekis