Naujų 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir naujų 2-acetil-1-naftolio junginių sintezė ir antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

LAURYNAS ZUBAVIČIUS FF V kurso studentas

Naujų 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir

naujų 2-acetil-1-naftolio junginių sintezė ir antibakterinio

ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas

Darbo vadovas Prof. dr. Hiliaras Rodovičius Konsultantas Prof. dr. Alvydas Pavilonis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas Vitalis Briedis,______________________________ ___________m._______________mėn._________d.

Naujų 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir

naujų 2-acetil-1-naftolio junginių sintezė ir antibakterinio

ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas

Konsultantas Darbo vadovas

Prof. dr. Alvydas Pavilonis Prof. dr. Hiliaras Rodovičius

Parašas:_____________________ Parašas:________________________ Data:_______________________ Data:__________________________

Recenzentas Darbą atliko Vardas, pavardė, parašas Magistrantas

____________________________ Laurynas Zubavičius______________ Data:________________________ Data:___________________________

TURINYS

2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI 11

3. TYRIMŲ APŢVALGA 12

4. EKSPERIMENTINĖ DALIS 21

4.1. Kompiuterinio molekulinio modeliavimo programos pritaikymas 21

4.1.1. Metodika 21

4.2. Sintezuotų junginių aktyvumo prognozavimas naudojant PASSonline (Prediction of Activity Spectra of Substances) programa 23

4.3. 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (D-triptofano ir leucino) sintezė 23

4.3.1. 4-tiazolidinon-N-triptofano sintezė 25

4.3.2. 4-tiazolidinon-N-leucino sintezė 27

4.3.3. Ketonų/aldehidų įvedimas į 5 padėtį junginių 4-tiazolidinon-N-(tiprofano/leucino) struktūrą 30

4.3.3.1. Pasiruošimas preparatyvinei chromatografijai 33

4.4. Šifo bazių sintezė iš 2-acetil-1-naftolio 34

4.4.1. Sintezės ypatybės 35

4.4.2. Atliktos sintezės principas 37

4.4.3. ,,Mono“ Šifo bazių sintezė iš monoaminų 39

4.4.3.1. Reakcija, atliekama kaitinant ant kaitlentės su grįţtamuoju šaldytuvu 40

4.4.3.2. Reakcija, atliekama sulydymo metodu 41

4.4.3.3. Reakcija, atliekama veikiant mikrobangomis 41

4.5. Junginių grynumo tyrimai 43

4.6. Junginių struktūros tyrimai 45

4.7. Junginių mikrobiologinio aktyvumo tyrimai 45

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS 48

5.1. Projekto metu ketinamų sintezuoti junginių išankstinio biologinio aktyvumo vertinimas pasitelkiant kompiuterinio modeliavimo programą ,,SYBYL-X” 48

5.2. Sintezuotų junginių aktyvumo prognozavimas naudojant ,,PASSonline” (Prediction of Activity Spectra of Substances) programa 49

5.3. 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir naujų 2-acetil-1-naftolio junginių sintezė 52

5.4. Junginių struktūros analizė 57

5.5. Mikrobiologinio junginių aktyvumo tyrimai 58

6. IŠVADOS 62

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS 63

8. LITERATŪROS SĄRAŠAS 64

SANTRAUKA

Naujų 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir naujų 2-acetil-1-naftolio junginių sintezė ir antibakterinio ir priešgrybelinio aktyvumo tyrimas. Lauryno Zubavičiaus magistro baigiamasis darbas.

Lauryno Zubavičiaus magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas prof. dr. Hiliaras Rodovičius; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. - Kaunas

Darbo tikslas: susintetinti naujus antibakterinius ir priešgrybelinius 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir naujus 2-acetil-1-naftolio junginius ir nustatyti prijungtų pakaitų įtaką junginių priešmikrobiniam aktyvumui.

Uţdaviniai:

1. Apţvelgti esamą literatūrą apie bakterijų ir grybelių sukeliamas infekcijas.

2. Optimizuoti naujų galimų vaistų struktūrų paieškas, pasitelkiant kompiuterinio modeliavimo programą ,,SYBYL-X“ ir junginių biologinio aktyvumo prognozavimo programą ,,PASSonline“.

3. Susintezuoti naujus 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir naujus 2-acetil-1-naftolio junginius.

4. Atlikti junginių charakteristikų analizę, pasitelkiant junginių plonasluoksnės chromatogafijos, lydymosi temperatūrų, ESC, UV, IR spektrų metodus.

5. Nustatyti susintezuotų junginių mikrobiologinį aktyvumą prieš Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Bacillus subtillis, Bacillus cereus, Candida albicans.

Tyrimo metodai: junginių priešmikrobinis aktyvumas buvo prognozuojamas naudojant PASSonline ir kompiuterinio molekulių modeliavimo programą SYBYL-X 1.1. Antimikrobinis aktyvumas buvo tiriamas ,,in vitro” atmetimo būdu, ,,uţnuodytos lėkštelės metodu“ bakterijas uţnešant ant junginio tirpalo suspenduoto Miulerio-Hintono agare.

Tyrimo rezultatai: Gauti plačiausią aktyvumo spektrą turintys dviejų visiškai skirtingų struktūrų junginiai ŠBL-1, ŠBL-2 ir LZL-19.

Išvados: Galima teigti, kad Šifo bazės, sintezuotos iš 2-acetil-1-naftolio ir ketonų, turinčių 3 anglies atomų grandinę, bei 4-tiazolidinon-N-aminorūgščių dariniai, turintys pakaitus su nitrogrupe rodanino ţiedo 5 padėtyje, pasiţymi plačiu priešmikrobiniu poveikiu.

SUMMARY

The new 5-aryliden-4-thiazolidinone-N-amino acids (leucine, tryptophan) and a new 2-acetyl-1-naphthol compound synthesis and antibacterial and antifungal activity assay. The master‟s thesis of Laurynas Zubavičius.

Tutor.: Hiliaras Rodovičius, Professor, D. Sc. Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences, Kaunas 2014.

The goal: to synthesize new antibacterial and antifungal 5-aryliden-4-thiazolidinone-N-amino acids (leucine, tryptophan) and a new 2-acetyl-1-naphthol compounds and establish substitutions influence on compounds for anti-microbial activity.

Objectives:

1. Review the existing literature on bacterial and fungal infections.

2. Optimize new structures of potential drug searches through computer simulation program, Sybyl - X compounds and biological activity prediction program, PASSonline.

3. Synthesise new 5 - ariliden - thiazolidine - 4 -N - amino acids (leucine, tryptophan) and a new 2-acetyl-1-naphthol compounds.

4. Perform an analysis of the characteristics of compounds using thin layer chromatography, melting temperatures, HPLC, UV, IR spectra methods.

5. Set synthesised compounds of microbial activity against Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Bacillus subtillis, Bacillus cereus, Candida albicans.

Research methods: antimicrobial activity of the compounds were predicted using “PASSonline” and computer molecular modeling program “Sybyl -X 1.1”. Antimicrobial activity was studied “in vitro” rejection method as “poisoned dish method”- bacteria applied on the solution suspending in a Muller - Hinton agar.

The results: Synthesised compounds having the widest spectrum of activity with two completely different structures of compounds SBL -1 , SBL -2 and LZL - 19th.

Conclusion: It can be argued that Schiff bases synthesized from 2-acetyl-1-naphthol and ketones having 3 carbon atoms in the chain, and 4-thiazolidine-N-amino acid derivatives having substitutes with a nitro group in 5th position of rhodanine ring, has a broad anti-microbial activity.

PADĖKA

Labai dţiaugiuosi galėdamas padėkoti uţ pagalbą, atliekant šį mokslinį darbą prof. dr. Hiliarui Rodovičiui, prof. dr. A. Paviloniui, prof. dr. Liudui Ivanauskui, prof. dr. Eduardui Tarasevičiui, doktorantams Liudui Šlepikui, Jonui Saliui ir Mindaugui Marksai.

SANTRUMPOS

B. cereus – Bacillus cereus B. subtilis – Bacillus subtilis C. albicans – Candida albicans DMSO – dimetilsulfoksidas E. coli – Escherichia coli ES – Europos sąjunga

S. aureus – Staphylococcus aureus

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija K. pneumoniae – Klebsiella pneumoniae MSK – maţiausia slopinančioji koncentracija NF – nitrofurantoinas

P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa P. mirabilis – Proteus mirabilis

PC – plonasluoksnė chromatografija PSO – Pasaulinė Sveikatos Organizacija AMR- antimikrobinis atsparumas

1. ĮVADAS

Šiuolaikinėje klinikinėje praktikoje pastebima vis didėjanti hospitalinių infekcijų atsparumo antibiotikams atvejų tendencija. Problemos aktualumas susijęs su hospitalinių infekcijų daţnėjimo ir atsparumo didėjimu. Kai kuriose Europos valstybėse per pastaruosius 5 metus infekcijų, atsparių antibiotikams skaičius maţėjo dėl taikomos rekomenduojamos prevencijos. Nepaisant naujų apsaugos metodų, pastebimas mirtingumo daţnėjimas uţsikrėtus rezistentiškais antibiotikams grybelių ir bakterijų štamais. Mokslininkai atsiţvelgdami į susidariusią situaciją tikina, kad problemos sprendimas yra būtinas ir neatidėliojimas [43;2;40]. Europos sveikatos organizacijos daţniausiai nurodo prevencijos ir naujų vaistų kūrimo būtinybę. Rezistentiškų patogenų paplitimas visuomenėje sąlygotų naujų epidemijų atsiradimą. Siūloma atsiţvelgti ne tik į sveikatai ir gyvybei gresiančius pavojus, tačiau ir į valstybių gydymui skiriamas išlaidas, kurios rezistentiškų infekcijų atvejais progresyviai išauga. Naujų vaistų sukūrimas leistų uţkirsti kelią infekcijų plitimui ir individualių mirčių atvejams [20;28;11;33;12;15;]. Remiantis naujomis vaistų kūrimo tendencijomis, pastebimas įvairiapusio objektyvumo taikymas. Svarbu vaistus, kurie atitiktų esminius kriterijus – skirtųsi nuo pirmtakų savo veikimo mechanizmu (tai leistų turėti didesnę vaistų pasirinkimo platumą). Rezistentiškų infekcijų susirgimo atvejams gydyti svarbu išsiaiškinti galimas silpniausias patogenų gyvavimo savybes. Daţnai kuriant vaistus atsiţvelgiama į mikroorganizmo ląstelėje vykstančius biocheminius procesus. Vienas efektyviausių būdų yra sustabdyti mikroorganizmo dauginimąsi arba jį nuţudant, slopinant svarbiausias gyvybinių funkcijų mechanizmus. Staphylococcus aureus būdinga baltymų grupė – sFabI yra nurodoma, kaip viena geriausių taikinių, kurią slopinant sustabdoma riebalų rūgščių sintezė, kas įtakoja bakterijų ląstelių sienelės gamybos stabdymą ir galutinį ląstelių dauginimąsi [43;2;40;15;23;10;39;21]. Analizuojant jau patvirtintai priešbakterinį aktyvumą turinčius junginius, buvo atsiţvelgta į dar neišplėtotas dvi junginių grupes. Naftaleno ir rodanino derivatų aktyvumas buvo tirtas prieš daugelį mikroorganizmų kaip bakterijos ir grybeliai (Enterobacter clocae, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Staphylococcus aureus, Pseudomona.auriginosa ir kt.). Taip pat junginiai pasiţymi ir platesniu veikimo prieš įvairias ligas spektru, kurių indikacijos nurodomos prieštraukuliniu, hipnotiniu, prieštuberkulioziniu, kardiovaskuliariniu, priešgrybeliniu, priešvėţiniu, antihistamininiu, priešvirusiniu, priešuţdegiminiu ir folikulus stimuliuojančiu poveikiais [18]. Nepaisant aprašytų junginių savybių atsiţvelgiama ir į siūlomos teorijos apie aminorūgščių įtraukimo į naujų junginių struktūrą. Atliktų tyrimų metu stebėta, kad aminorūgštys gali padidinti antimikrobinį junginių efektyvumą, atkartojant tam tikrus biocheminius procesus mikroorganizmuose atitinkamų aminorūgščių atţvilgiu [27; 34; 19; 31; 46; 4; 35; 9; 5; 42]. Pasitelkiant dar pilnai neišplėtotų junginių

tyrimų medţiagą tikimasi susintezuoti naujos struktūros antimikrobinius junginius. Optimizuoti ir susiaurinti galimai aktyvių naujai sintezuojamų junginių struktūras buvo pasitelkta kompiuterinio modeliavimo programa ,,SYBYL-X“. Šios programos dėka buvo įmanoma gana objektyviai atsiţvelgti į numanomų sintezei junginių struktūros charakteristikas, patekimo į baltymo aktyvųjį centrą, jungimosi prie taikinio stiprumą [23; 8; 44; 43].

Pasitelkus apţvelgtą literatūros šaltiniuose minimą informaciją, buvo susintezuoti nauji 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) junginiai (LZL-4, LZL-5, LZL-6, LZL-10, LZL-10, LZL-15, LZL-16, LZL-19, LZL-Y, LZL-LL) ir naujus 2-acetil-1-naftolio junginius (ŠBL-1, ŠBL-2, ŠBL-3, ŠBL-4, ŠBL-5, ŠBL-6, ŠBL-7, ŠBL-8, ŠBL-9, ŠBL-10, ŠBL-11, ŠBL-12, ŠBL-13, ŠBL-14, ŠBL-15, ŠBL-16(g), ŠBL-16(z), ŠBL-17, ŠBL-18, ŠBL-19).

2. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŢDAVINIAI

Problema: didėjantis mikroorganizmų rezistenciškumas kelia vis didesnę grėsmę ţmonių populiacijai dėl vis maţėjančios galimai vartojamų antibiotikų pasirinkimo. Stengiamasi rasti būdų, kuriais būtų įmanoma kovoti prieš vaistams rezistenciškų mikoroorganizmų sukeliamas infekcijas, todėl siekiama sukurti naujus antimikrobinius vaistus.

Darbo tikslas: susintetinti naujus antibakterinius ir priešgrybelinius naujus 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (leucino, triptofano) ir naujus 2-acetil-1-naftolio junginius ir bei nustatyti prijungtų pakaitų įtaką junginių priešmikrobiniam aktyvumui.

Uţdaviniai:

1. Apţvelgti esamą literatūrą apie bakterijų ir grybelių sukeliamas infekcijas.

2. Optimizuoti naujų galimų vaistų struktūrų paieškas „in silico“ metodu, pasitelkiant programą ,,SYBYL-X“ ir junginių biologinio aktyvumo prognozavimo programą ,,PASSonline“.

3. Susintezuoti naujus 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (Leucino, Triptofano) ir naujus 2-acetil-1-naftolio junginius.

4. Atlikti junginių charakteristikų analizę, pasitelkiant junginių plonasluoksnės chromatogafijos, lydymosi temperatūrų, ESC, UV, IR spektrų metodus.

5. Nustatyti susintezuotų junginių mikrobiologinį aktyvumą prieš Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Bacillus subtillis, Bacillus cereus, Candida albicans.

3. TYRIMŲ APŢVALGA

Šiuolaikinėje klinikinėje medicinos praktikoje vyrauja kol kas pilnai iki galo neišsprendţiama problema – antibiotikams atsparios infekcijos. Antimikrobinis atsparumas (AMR) tai sąvoka suformuluota įvardinti mikrobiologinių organizmų atsparumą prieš antimikrobinių vaistų poveikį. Teigiama jog, antimikrobiniu atsparumu gali pasiţymėti visi mikroorganizmai (bakterijos, grybai, virusai ir parazitai). AMR problemą yra stengiamasi sustabdyti pasauliniu mastu dėl to, kad AMR įvardinama kaip daugelio hospitalinių infekcijų pasibaigusių mirtimi prieţastimi. AMR taip pat įtakoja vis labiau brangstančias pasaulines ţmonių gydymo išlaidas, kadangi šiuo atveju pacientų gydymas trunka ilgiau, didėja rizika atsirasti ir išplisti naujoms, bei atsparioms antimikrobiniams vaistams padermėms [43]. Naujausiais duomenimis daţniausi AMR sukėlėjai Europos Sąjungoje yra įvardijami šie: meticilinui atsparus Staphylococcus aureus (MRSA), vankomocinui atsparus Enteroccoci (VRE), išplėstinio spektro beta laktamazės bakterijos (ESBL) E. coli ir Klebsiella pneumoniae, karbapenemazę produkuojanti Klebsiella pneumoniae, polifarmaciškai atspari Pseudomonas aeruginosa, bei Clostridium difficile [2]. Daţniausiai Europos Sąjungoje (2009-2012 m.) stacionarizuotų pacientų kraujo serumuose yra nustatomos atsparios priešmikrobiniams vaistams Klebsiella pneumoniae padermės. Remiantis statistikos duomenimis, teigiama, kad nuo 2009 iki 2012 metų Europos Sąjungoje susirgimų susijusių su atspariomis trečios kartos cefalosporinams, fluorchinolonams ir amino glikozidams Klebsiella pneumoniae padermėmis išaugo nuo 8,2% iki 11,8%. Duomenys fiksuoti ir Lietuvos Respublikoje, kur susirgimų skaičius ţenkliai viršijo ES vidurkį ir siekė 2009 m. nuo 25 iki 50%, o iki 2012 m. išaugo daugiau nei 50% ir pagal susirgimų rodiklius prisivijo Graikiją [24] (1 pav.).

1 pav.: Trečios kartos cefalosporinams, fluorchinolonams ir amino glikozidams atsparios Klebsiella pneumoniae padermės paplitimas Europos Sąjungoje 2009 ir 2012 metais (European Centre for Disease Prevention and Control)

Pasauliniu mastu viena rimčiausių problemų išlieka auksinio stafilokoko sukeliama infekcija, kurios padermė yra atspari ţinomiems priešmikrobiniams vaistams, kitaip vadinama MRSA

(angl. MRSA – methicillin resistant Staphylococcus aureus) – meticilinui atsparia auksinio stafilokoko paderme. Problema yra vertinama kaip auganti dėl to, kad iš statistinių duomenų surinktų Jungtinėje Karalystėje nuo 1993 iki 2011 m. įţvelgiamas MRSA susirgimų skaičiaus maţėjimas, tačiau mirštamumas nuo šios infekcijos didėja [29]. Nepaisant didelio MRSA aukų skaičiaus, jos sukeltų infekcijų gydymas pareikalauja labai daug lėšų, pvz.: 2005 metais JAV buvo uţregistruoti 94 tūkstančiai MRSA susirgimų atvejų iš kurių 19 tūkstančių (20,2%) baigėsi pacientų mirtimi, o 2007 metais JAV MRSA susirgimams gydyti buvo išleista apie 8 mlrd. JAV dolerių [20; 33]. 2009 – 2012 m. Europos Sąjungoje atliktų statistinių tyrimų duomenys verčia specialistus vertinti MRSA padėtį optimistiškiau, kadangi procentinė susirgimų šia infekcija išraiška ţenkliai nedidėja. Nepaisant to, vidutinis sergamumas minėtuoju laikotarpiu išliko aukštas - 18%, kur septyniose iš 30 valstybių vidurkis viršija 25% [40] (2 pav.).

2 pav.: MRSA paplitimas Europos Sąjungoje 2009 ir 2012 metais (European Centre for Disease Prevention and Control)

Pagrindinė MRSA atsiradimo prieţastis – mutavusios ir naujomis savybėmis pasiţyminčios auksinio stafilokokų bakterijų padermės, kurių ląstelių biocheminiai pakitimai sąlygoja bakterijų nejautrumą meticilinui. Prieţastys dėl kurių bakterijų kolonijose atsiranda mutavusių individualių patogeniškų bakterijų kelios: platus ir neracionalus antibiotikų skyrimas, vartojimas ir genų selekcija. Mutavusios bakterijos būna atsparesnės meticilinui ilgesnį laiką nei lyginant su įprastinėmis jautriomis šiai vaistinei medţiagai. Susidaro sąlygos dėl ko galutinai nenuţudytos atsparios auksinio stafilokoko bakterijos ima daugintis taip perduodant savo naują genetinį kodą, pasireiškiantį kaip atsparumas antibiotikams. Naujos mutavusios auksinio stafilokoko bakterijos ima progresyviai daugintis, didėja jų santykinis kiekis lyginant su jautriomis meticilinui bakterijomis, taip sudarant maţesnes konkurencines sąlygas bakterijų gyvavimo visumoje. Galiausiai viso ko pasekoje išsivysto meticilinui atspari infekcija [28; 11]. Specialistai neatmeta prielaidos, kad iki 2020 metų MRSA problema gali tik blogėti [16]. Dėl didelio problemos aktualumo, svarbu ieškoti naujų būdų kovoti su jos prieţastimis. Svarbiausia yra surasti tinkamus ir efektyvius naujos struktūros vaistus, ne

panašius į beta laktaminius antibiotikus. Taip pat aktualu, kad naujai sintezuoti junginiai būtų aktyvūs prieš pasirinktus naujus bakterijų ląstelių biocheminius taikinius, kurie ţenkliai nepakistų net atsiradus genetinėms bakterijų mutacijoms [12].

Grybelinės infekcijos, tokios kaip kandidozės, yra laikomos opiomis medicininės praktikos problemomis, kurios labai daţnai pasireiškia imunosupresantus vartojantiems ligoniams. Taip pat šios infekcijos kelia grėsmę ne tik dėl sukeliamų simptomų ir sunkaus gydymo, bet ir dėl pacientų mirties atvejų. Intensyviosios terapijos metu grybelinės infekcijos yra traktuojamos kaip vienos daţniausių [7; 24]. Pastaruoju metu pastebima, jog daţniausi uţsikrėtimo invazinėmis grybelinėmis infekcijomis atvejai yra priskiriami hospitalinėms (nozokominėms) infekcijoms. Šių infekcijų pagrindinė prieţastis yra nusilpęs arba po organų transplantacijų priverstinai slopinamas pacientų imunitetas, ko pasekoje maţėja baltųjų kraujo kūnelių ir kovos su infekcijomis efektyvumas. Pagrindinai yra išskiriamos tik dvi patogeninių grybelinių infekcijų rūšys, t.y. kandidozės (Candida) ir aspergylozės (Aspergillus) [1]. Remiantis statistiniais duomenimis surinktais iki 2009 metų, įţvelgiama tendencija, jog aspergiliozės yra išstumiamos iš pirmosios vietos pagal susirgimo mastus invazinėmis grybelinėmis infekcijomis Europoje. Invazinėmis grybelinėmis infekcijomis iš kurių kandidozėmis sirgusių pacientų buvo registruota nuo 28% iki 59%, o invazinėmis aspergiliozėmis nuo 38% iki 80% [17]. 2013 metų balandţio mėnesį Berlyne paskelbti 3,1 milijardo ţmonių populiacijos susirgimų grybelinėmis infekcijomis duomenys. Duomenys rinkti pasitelkiant šaltinius nuo 2001 metų iki dabar. Analitikai įţvelgia daţnus susirgimų atvejus ţemesnio išsivystymo šalyse kaip Kenija, Nigerija, Senegalas ir kt. Tyrimo metu duomenys rinkti apie grybelinių infekcijų sukeliamas ligas kaip kandidozės, chroniškos kvėpavimo takų aspergiliozės, pneumoniją, histoplazmones ir kt. (1 lentelė). Tyrėjai įvardija duomenis kaip ne galutinius, kadangi daugelis susirgimų atvejų neuţfiksuoti dėl prastų sveikatos sistemų maţiau išsivysčiusiose šalyse [30].

Valstybė Duomenys (metai) Bendras susirgimų skaičius grybelinėmis infekcijomis

Austrija 2006-2007 130 964 Brazilija 2010 3 200 000 Kinija 2009-2013 21 829 000 Airija 2010 11 739 Kenija 2010-2012 2 502 560 Nyderlandai 2013 254 010 Nigerija 2009 17 941 657 Senegalas 2008-2011 2 396 321

1 lentelė: Susirgimų grybelinėmis infekcijomis statistiniai duomenys pasaulio valstybėse

Daugelyje šaltinių nurodoma, jog pagrindinės minėtųjų infekcijų įveikimo priemonės yra naujų vaistų sintezė ir prevencijos prieš infekcijas tobulinimas. Pastaruoju metu vis daţniau yra

pasirenkamas labiau orientuotas ir objektyvesnis kelias į naujų vaistų sintezę, nei aktyvių pakaitų molekulėje kaitaliojimas ir biologinio efektyvumo nustatymas [43]. Kryptingas naujų vaistinių junginių sintezės pasirinkimas prasideda nuo infekcijos sukėlėjo ląstelėse vykstančių gyvybinių mechanizmų įvertinimo ir realių taikinių nustatymo. Taikiniai vėliau analizuojami ,,in silico„„ metodu, kuris leidţia numatyti galimas naujo vaisto molekulės sąveikos su taikiniu charakteristikas. To pasekoje nusprendţiama, kiek potencialiai vaistas bus efektyvus ,,in vitro“. Kompiuterinio modeliavimo principu galima lengviau susiaurinti sintezės apimtis ir optimizuoti naujų vaistų paiešką vien dėl to, kad atmetami potencialiai neaktyvūs vaistai [43; 2; 40; 15; 23].

Šiuolaikinėje medicinoje vartojamų priešmikrobinių vaistų veikimo mechanizmai yra susiję su patogeninių bakterijų biocheminių procesų trikdymu ir stabdymu. Vaistai skirstomi į keletą pagrindinių grupių: ląstelės sienelės, DNR, fosfolipidinės membranos, baltymų slopikliai ir folinės

rūgšties apykaitos sutrikdymą skatinantys vaistai [10]. Patogeninių bakterijų riebalų rūgščių apykaitos sistema yra įvardijama kaip vienas iš potencialiausių galimų taikinių. Vienas iš šios kaskados elementų yra saFabI baltymai, kurie dalyvauja dalyvauja riebalų rūgščių nesočiojo ryšio redukcijos reakcijose. Nuslopinus saFabI, tikslingai sutrikdoma riebiųjų rūgščių sintezė, kas stabdo bakterijų ląstelių sienelių sintezę (3 pav.). To pasekoje, bakterijos nebegeba vystytis ir daugintis. Pasitelkiant difenil eterius, dalyvaujančius riebalų rūgščių sintezėje, tokius kaip triklozanas, juos galima pritaikyti nustatant potencialias vaisto prisijungimo vietas. Jo prisijungimo principiniu modeliu vėliau galima remtis, lyginant gautus kompiuterinio vaisto molekulės jungimosi prie saFabI rezultatus [10; 39; 21].

Kompiuterinio modeliavimo programos, kaip ,,Sybyl-X„„ yra sukurtos palengvinti naujų vaistų sintezės planavimą ir jų aktyvumo prognozavimą. Šios programos sukurtos pagal simuliatoriams būdingą realybės atkartojimą. Programose įkeliami molekulių modeliai atitinka realių baltymų ir prie jų besijungiančias molekules [23]. Bakterijų taikinių (šiuo atveju saFabI) ir potencialių vaistų molekulių teorinis jungimasis yra derinamas su programoje įdiegtomis ir nustatytomis normomis, kurios generuojamos pagal esamas chemijos ir fizikos teorines ţinias. Naudojant kompiuterinio modeliavimo programas galima nustatyti įmanomas jungčių ir besijungiančių junginių charakteristikas. Daţnai informatyviomis charakteristikomis įvardijami: molekulės tirpumas (lipofiliškumas/hidrofobiškumas), maţiausi atstumai tarp potencialių jungimosi centrų, Ppi (baltymų tarpusavio elektrostatinės sąveikos dydis), jungties stiprumo balo palyginimą su kontrolinėmis molekulėmis ir kt. Dėl trimatės vizualizacijos galimybės, įmanoma apspręsti fizinį molekulės prieinamumą prie aktyvaus taikinio centro, jos selektyvumą ir lengvesnes įţvalgas vaistų molekulių tobulinimui. Kompiuterinio modeliavimo programos palengvina ir optimizuoja darbo planavimą kuriant naujus vaistus, kadangi tai greitas, efektyvus ir informatyvus metodas. Taip pat molekulinio modeliavimo programose galima koreguoti nustatymus, kurie leidţia vaistinės molekulės ir taikinio jungimosi metu apskaičiuoti ir galimus molekulių vidinius fizinius judėjimus ir kitimus [23;8;44;32].

Į įvairovę orientuota sintezė (ĮOS – angl. ,,DOS„„ – diversity oriented synthesis) yra naujų junginių sintezėje naudojama strategija [26]. Jos atveju pasirenkami įvairios molekulių struktūrų komplektai. Lyginant su įprastine sintezės strategija (į taikinį orientuotų junginių sinteze), ĮOS apima įvairesnį ir platesnį junginių spektrą.

4 pav.: Po ĮOS pritaikymo gaunamų duomenų (C) pasiskirstymo palyginimas su: (A) medicininės ir kombinacinės cheminės sintezės strategija; (B) į taikinį orientuotų junginių sintezės strategija (D. Martin Burke Dr, L. Stuart Schreiber Prof.)

Tai leidţia išlaikyti kryptingumą ir įvairiapusiškumą junginių efektyvumo pasireiškime. Pagrindinis ĮOS tikslas – uţpildyti chemijos erdvę pagal struktūrinę įvairovę ir sudėtingumą (4 pav.) Pritaikant ĮOS yra pastebėta, kad naujai gauti junginiai, kurie tarpusavyje visiškai skiriasi savo

struktūra, bet nesikeičia struktūrinėmis dalimis, leidţia greičiau atrasti tam tikros struktūros junginius, kurie tenkintų biologinio poveikio poreikį. Pritaikant į taikinį orientuotą sintezę tikimąsi gauti kuo daugiau panašios struktūros junginių (analogų) su iš anksto numanomu efektyvumu. Abi šios strategijos yra apibūdinamos kaip tinkamos ieškant naujų būdų kuriant vaistus, tačiau autoriai neaptaria galimybės apjungti šių dviejų poţiurių į bendrą pasirinkimą [26; 6; 13].

Alfa-Naftolis yra paprastos struktūros policiklinis aromatinis angliavandenilis turintis pirmoje padėtyje hidroksigrupę. Alfa-naftolis turi izomerą – β-naftolį, kurio hidroksilas jungiasi į antrąją padėtį. Šie abu izomerai turi bendrą naftaleno struktūrą. Beta naftolis dėl turimų dvigubų jungčių pasiţymi fluoresuojančiomis savybėmis ir dėl to pritaikomi medicinoje kaip bioţymekliai (5 pav.). Mokslinės literatūros šaltiniuose daţniausiai teigiama, kad naftolio struktūrą turintys junginiai pasiţymi priešvėţinėmis savybėmis. Tačiau taip pat randama duomenų, kad naftaleno derivatai, kurie gaunami sintezės metu iš alfa arba beta naftolių turi ţenklų antimikrobinį poveikį. Tyrimų metu nustatytas minimalios koncentracijos (0,1-0,4 µM) aktyvumas prieš Enterobacter clocae, Klebsiella pneumonia, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Candida parapsilosis, Candida tropicalis. Taip pat tyrimų metu buvo lyginami naftolio junginių aktyvumai su ampicilinu ir kanamicinu. To pasekoje buvo įrodytas maţesnis, tačiau ţymus antimikrobinis aktyvumas, lyginant su kontroline grupe. Tiriant struktūros-aktyvumo ryšį, buvo pastebėta, kad prijungus panašias į acetilo grupę pakaitus į naftolio pirmą ir antrą padėtis buvo pagerintas antimikrobinis aktyvumas [27;34;19;31;25].

5 pav.: a) alfa-naftolis; b) beta-naftolis; c) 2-acetil-1-naftolis

2-acetil-1-naftolis, tai naftaleno stuktūrą turintis junginys, pirmoje padėtyje turintis hidroksilo, o antroje padėtyje acetilo grupes. Tyrimai parodė, kad turėdamas šiuos pakaitus, 2-acetil-1-naftolis pasiţymi priešmikrobiniu veikimu. Remiantis ankstesniais tyrimais atliktais su naftalenu, prieinama išvados, kad prie naftaleno prijungus pakaitus kaip aceto grupes, priešmikrobinis veikimas nėra panaikinamas. Kaip 2-acetil-1-naftolis, taip ir jo derivatai pasiţymi priešmikrobiniu veikimu. Tyrimai atlikti su S.aureus ir P.auriginosa, o junginių aktyvumo kontrolei pasirinktas streptomicinas. Streptomicino aktyvumas įvertintas 30 mm prieš P.auriginosa ir 28 mm prieš S.aureus augimo

slopinimo skersmenis. Aktyviausi junginiai, turintys būdingą 2-acetil-1-naftolio struktūrą turėjo 27 mm prieš P.auriginosa ir 30 mm prieš S.aureus augimą slopinimo poveikio skersmenimis [30; 21].

Šifo bazės tai ketonai arba aldehidai, kurių karbonilo grupė pakeista į imino arba azometino grupes (6 pav.). Šiose grupėse anglies atomas, priklausęs vienam iš ketonų arba aldehidų susijungia dvigubuoju ryšiu su radikalo azoto atomu. Yra daugelis šifo bazių sintezės būdų ir metodikų [35]. Vienos skiriasi reakcijos aplinka, kiti metodika. Pastaruoju metu daţnai naudojamas elementarusis maišymas tirpiklyje, kuriame tirpsta pasirinkti aminai ir ketonai (arba aldehidai). Kitas metodas – sulydymas. Jo metu svarbu išvengti naudojamų junginių, kurie galėtų skilti sulydymui vykstant. Viena naujesnių metodikų – mikrobangų naudojimas sintezės metu. Mikrobangų naudojimas reakcijos greitį ţenkliai padidina, o laiką sumaţina. Aplinkos sąlygų keitimui pasitelkiami įvairūs katalizatoriai (ZnCl2, TiCl4, MgSO4-PPTS, Ti(OR)4), kurie reakcijos metu geba pašalinti susidariusį vandenį iš sistemos, nes jis įtakoja grįţtamosios reakcijos buvimą ir nepilnaverčių šifo bazių susidarymą. Pagal biologinį aktyvumą, Šifo bazių struktūrą turintys junginiai gali pasiţymėti priešmikrobiniu, priešgrybeliniu ir prievirusiniais poveikiais. Šifo bazės azotinė jungtis daţniausiai tampa jungtimi tarp keleto skirtingų ciklizuotų struktūrų ir uţima beveik centrines molekulių dalis [35; 9; 5].

6 pav.: Šifo bazių struktūra

4-tiazolidinonai yra tiazolidino derivatai su karbonilo grupe ketvirtoje pozicijoje (7 pav.) [41]. Šitai struktūrai būdingi junginiai yra tirti dėl įvairaus biologinio aktyvumo. Literatūroje minimi prieštraukulinis, hipnotinis, prieštuberkuliozinis, kardiovaskuliarinis, priešbakterinis, priešgrybelinis, priešvėţinis, antihistamininis, priešvirusinis, priešuţdegiminis ir folikulus stimuliuojantis poveikiai. Pastarųjų junginiai skyrėsi nuo 4-tiazolidinono struktūros tuo, kad antroje, trečioje ar (ir) padėtyse turėjo aktyvius pakaitus, kaip pavyzdţiui difluor-fenilas. Kalbant vien tik apie priešbakterinį aktyvumą, autoriai aprašo tyrimų metu nustatytus priešmikrobinius aktyvumus prieš Staphylococcus

iš esmės svarbus heterociklinis ţiedas, kadangi jam nesant buvo fiksuojamas priešmikrobinio aktyvumo praradimas [6; 11; 12; 13; 33].

7 pav.: 4-tiazolidinono struktūra

Rodaninas tai 2-tiokso-4-tiazolidinonas, kuris skiriasi nuo 4-tiazolidinono struktūros antroje padėtyje esančiu sieros atomu (7 pav.). Nagrinėtoje literatūroje autoriai nurodo rodaniną kaip potencialių priešmikrobinių vaistų pagrindą. Taip pat paţymima, kad atlikti tyrimai su rodanino derivatais rodo aktyvumą prieš keleto iš pagrindinių Gram-neigiamų bakterijų rūšių (pvz.: Staphylococcus aureus), kurios klinikinėje praktikoje buvo įgijusios atsparumą net keletai antibiotikų (S.aureus atveju meticilinui ir chinolonams). Pastarojo tyrimo metu nustatyta minimali slopinamoji rodanino derivatų koncentracija – nuo 1 iki 32 μg/ml. Taip pat minimas aktyvumas prieš kai kurias Gram-teigiamas bakterijų rūšis ir pastebėtas aktyvumas lyginant su kontroline norfloksacino ir oksicilino grupe (nuo 1 μg/ml) [37].

8 pav.: Rodanino struktūra

Mimikrija nurodoma kaip biologinių molekulių atkartojamumo ir pritaikymo praktikoje poţiūris bei strategija. Biologinės reikšmės molekulių struktūras stengiamasi atkartoti naujai sintezuojamuose vaistuose dėl tam tikrų prieţasčių kaip lengvesnis prieinamumas prie taikinio ar įtraukimo į mikroorganizmų baltymų sintezės procesus. Šis metodas leidţia į patogeniškų organizmų baltymus patalpinti klaidingos informacijos junginius, kurie priimami mikroorganizmo kaip homogeniškos molekulės, tačiau slopina baltymų sintezę ir taip sutrikdo mikroorganizmo gyvybines veiklas. Aminorūgštys yra vienos iš daugelio galimų variantų, kuriuos būtų galima įvesti į naujų vaistų

struktūrą siekiant atkartoti mikroorganizmų ląstelių mechanizmuose dalyvaujančias aminorūgštis. Aminorūgščių struktūrų įtraukimas atstotų naujo farmakoforo buvimo vaisto molekulėje [38].

4. EKSPERIMENTINĖ DALIS

4.1. Kompiuterinio molekulinio modeliavimo programos pritaikymas

Kompiuterinio modeliavimo ,,Sybyl-X“ programos pagalba buvo optimizuojama galimai aktyvių junginių paieška. Programos esmė – susiaurinti numanomų ir labiausiai aktyvių junginių sąrašą. Junginiai išlaikė 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (D-triptofano ir leucino) ir Šifo bazių sintetintų iš 2-acetil-1-naftolio struktūrą. Sintezei potencialiai skirtų junginių analizei buvo naudojama bandomoji ,,Sybyl-X” programa. Analizės metu buvo sekamas kiekvieno junginio kompiuterinės molekulės versijos prisijungimo prie Staphylococcus aureus rūšiai būdingų baltymų klasės sFabI (4BNF) monomerų charakteristika. Junginių jungimosi analizės metu buvo stebimas galimas fizinis molekulės prieinamumas prie taikinio NADH+ sistemos, maţiausi įmanomi atstumai nuo aktyvių molekulės centrų iki taikinio vandenilio atomų, kas uţtikrintų potencialų ir stiprų vandenilinių jungčių atsiradimą. Taip pat analizės metu buvo atsiţvelgiama į programos apskaičiuojamą jungimosi balą (score- angl., balas).

4.1.1. Metodika

Kompiuterinis modeliavimas pradedamas nusibraiţant galimų sintezėje bandysimų susintetinti molekulines struktūras su ,,ChemAxon“ kompanijos kurta programa ,,Marvin Sketch“. Uţsaugotos junginių formulės kompiuteriniu formatu ,,MDL SDfile“. ,,Sybyl-X“ programoje patalpinama informacija apie 4BNF baltymą. Baltymas būtinai paruošiamas junginių kompiuteriniam jungimuisi. Baltymo molekulė iš polimerinės paverčiama į monomerą. Iš baltymo yra pašalinama kristalografijos metodu nustatyta prie baltymo prisijungusią triklozano molekulę. Triklozano molekulė atskirai uţsaugoma tolimesniems palyginimams su modeliuotomis molekulėmis. Galutiniame paruošimo etape baltymas privalo būti rodomas kaip monomeras, neturintis prijungto etalono molekulės – triklozano. Toliau seka programos ir kompiuterinės informacijos tikslumo apie baltymą validavimas. Validavimo metu yra stengiamasi prijungti kontrolinę triklozano molekulę prie numatyto baltymo monomero identiškai kaip buvo prieš ištrinant triklozano molekulę iš monomero struktūros. Validavimas atliekamas gana ilgai, kadangi reikia nustatinėti daugelį programinių ir skaičiavimo parametrų. Parametrai nustatomi atsiţvelgiant, ar norima apskaičiuoti galimą naujų vaisto molekulių

vidinį judėjimą, išsilankstymą prisijungimo metu, maksimalų 20 prisijungimo variantų ir kitus faktorius, galinčius įtakoti rezultatų kintamumą. Atlikus validaciją, uţsaugomi triklozano prijungimo parametrai kitai jungimo sesijai. Numanomų junginių molekulių prijungimo prie 4BNF monomero sesijų metu naudojami identiški uţsaugotieji parametrai, uţtikrinantys kompiuterinio modeliavimo poţiūriu objektyvius rezultatus. Taip pat tikrinama, ar prisijungęs junginys neišeina uţ validavimo metu nustatytos fiziškai prieinamos vietos monomero aktyviojioje erdvėje. Visų prijungimo sesijų metu uţfiksuotas potencialiai aktyviausias junginys – ŠBL-15 (9 pav.), kurio jungimosi balas buvo įvertintas 6,15, o atstumas tarp artimiausių junginio ir baltyme esančio NADH+

atomų –1,869 Ao. (Ao -Angstremas - atstumo tarp atomų matavimo vienetai), uţtikrinančiu tvirtą vandenilinį ryšį. Taip pat programa apskaičiavo iš viso prognozuojamas 6 prisijungimo vietas. 4 iš jų buvo tarp junginio nitro grupėje esančių azoto, degonies ir NADH+

vandenilio atomų. Likusios dvi jungtys buvo fiksuojamos baltymo aktyvaus centro periferijoje. Lyginant su kontroline triklozano molekule, ŠBL-15 prognozuojamas kaip aktyviau besijungiantis prie taikinio, kadangi triklozanas įvertintas 3,99 prisijungimo balo, o atstumas uţtikrinantis vandenilinius ryšius – 2,88 Ao

.

4.2. Sintezuotų junginių aktyvumo prognozavimas naudojant „PASSonline”

(Prediction of Activity Spectra of Substances) programą

Numatomų sintezuoti junginių priešmikrobinį aktyvumą buvo nuspręsta prognozuoti pasitelkiant PASSonline (Prediction of Activity Spectra of Substances) programą. Ši programa suteikia galimybę atlikti junginių biologinio aktyvumo prognozę, remiantis jau ankščiau sukurtų vaistų struktūros-aktyvumo sukauptais duomenimis. PASSonline programa buvo naudota 33-iejų projekte numatomų sintezuoti junginių prognozinei analizei. Programos rezultatai vertinami pagal dvi pagrindines tikimybių reikšmes ir biologinio aktyvumo kategorijų nurodymą. Tikimybių reikšmės: Pa – nuspėjamas molekulės aktyvumas ir Pi – nuspėjamas molekulės neaktyvumas. Tikimybių vertinimas: 1. kai Pa => 0,7 numatoma didelė tikimybė, kad junginys eksperimentiniu keliu bus identifikuotas kaip aktyvus pagal nurodytą biologinio aktyvumo indikaciją, bet tuo pačiu turintis gana panašią struktūrą, lyginant su kitais jau esančiais farmaciniais preparatais.

2. kai 0,5 > Pa > 0,7 numatoma maţesnė tikimybė, kad junginys eksperimentiniu keliu bus identifikuotas kaip aktyvus pagal nurodytą biologinio aktyvumo indikaciją, bet tuo pačiu turintis maţiau panašią struktūrą, lyginant su kitais jau esančiais farmaciniais preparatais.

3. kai < 0,5 numatoma labai maţa tikimybė, kad junginys eksperimentiniu keliu bus identifikuotas kaip aktyvus pagal nurodytą biologinio aktyvumo indikaciją, kadangi struktūra labai skiriasi, lyginant su kitais jau esančiais farmaciniais preparatais.

Pasitelkiant PASSonline programą, reikia atsiţvelgti į tai, kad programa prognozuoja neatsiţvelgdama į literatūroje pateikiamą informaciją apie eksperimentiniu keliu įrodytą labai panašių, tačiau nepatvirtintų kaip farmaciniai preparatai, junginių biologinį aktyvumą.

4.3. 5-ariliden-4-tiazolidinon-N-aminorūgščių (D-triptofano ir leucino) sintezė.

Sintezės eiga buvo dalijama į šiuos etapus.

A. 4-tiazolidinono ţiedo formavimas iš atitinkamų aminorūgščių (D-triptofano ir leucino) aminogrupės.

Galutinių reakcijų metu sintezuoti junginiai: LZL-4 (2‐[(5Z)‐5‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐4‐metilpenta noinė rūgštis), LZL-5 (2‐[(5Z)‐5‐[(2E)‐1,3‐difenilprop‐2‐en‐1‐iliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐4‐metilpenta noinė rūgštis), LZL-6 (2‐[(5Z)‐5‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐2‐(1H‐indol‐ 3‐il) acto rūgštis),

LZL-7 (2‐[(5Z)‐5‐(1,3‐difenilpropiliden)‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐2‐(1H‐indol‐3‐il) acto rūgštis), LZL-10 (2‐[(5Z)‐5‐[1‐(4‐aminofenil)etiliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐4‐methilpentanoinė rūgštis), LZL-15 (4‐metil‐2‐[5‐(2‐nitro‐9H‐fluoren‐9‐iliden)‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]pentanoinė rūgštis), LZL-16 (2‐[(5Z)‐5‐[1‐(4‐bromfenil)etiliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐2‐(1H‐indol‐3‐il) acto rūgštis), LZL-17 (2‐[(5E)‐5‐(furan‐2‐ilmetiliden)‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐2‐(1H‐indol‐3‐il) acto rūgštis), LZL-18 (2‐(1H‐indol‐3‐il)‐2‐[(5E)‐5‐[(5‐nitrofuran‐2‐il) metiliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐ tiazolidin‐3‐il] acto rūgštis),

LZL-19

(2‐(1H‐indol‐3‐il)‐2‐[(5E)‐5‐[(2E)‐3‐(5‐nitrofuran‐2‐il)prop‐2‐en‐1‐iliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐t iazolidin‐3‐il]acto rūgštis),

LZL-X

(2‐{5‐[(1E,4E)‐1,5‐difenilpenta‐1,4‐dien‐3‐ilidene]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il}‐2‐(1H‐in dol‐3‐il) acto rūgštis).

LZL-Y (2‐{5‐[(1E,4E)‐1,5‐difenylpenta‐1,4‐dien‐3‐iliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il}‐4‐metilpe ntanoinė rūgštis), LZL-LL (2‐[(5Z)‐5‐[1‐(4‐{[(4‐chlorfenil)metil]amino}fenil)etiliden]‐4‐okso‐2‐sulfaniliden‐1,3‐tiazolidin‐3‐il]‐4 ‐metilpentanoinė rūgštis).

4.3.1. 4-tiazolidinon-N-triptofano sintezė

Į konusinę kolbutę su 30 ml distiliuoto vandens, įberiama 9,7 g (0,0475 mol) D-triptofano pilkšvų kristalinių miltelių. D-D-triptofano milteliai ištirpinami vandenyje. Į tirpalą įberiamas dvigubas ekvivalentinis kiekis - 5,3 g (0,094 mol) KOH. Tirpalas maišomas kol ištirpsta KOH. Reakcijos eigoje tirpalo spalvinės savybės nepakinta. Atliekama jonų mainų reakcija tarp D-triptofano karboksigrupės vandenilio ir KOH K+ jonų (10 pav.).

Antrasis sintezės etapas. Į D-triptofano ir KOH reakcijos tirpalą įpilama 3 ml (0,0475 mol) anglies disulfido (CS2). Anglies disulfidas pasiskirsto ant tirpalo paviršiaus maţais gelsvais

lašeliais. Kolbutė uţkemšama ir įstatoma į elektrinį suktuvą. Sukimas vykdomas iki 5 valandų, kol nebelieka anglies disulfido lašelių, o tirpalas tampa oranţiniu (11 pav.).

11 pav.: 4-tiazolidinon-N-triptofano sintezės antras etapas

Trečiasis sintezės etapas. Į kolbutę su tirpalu įdedamas magnetukas bei įpilamas monochloracto rūgšties (4,49 g (0,0475mol)) ir kalio karbonato (6,56 g (0,0475 mol)) vandeninis tirpalas. Kolbutė perkeliama ant kaitlentės ir įjungiamas magnetinis maišytuvas. Reakcijos metu laikoma 90 oC temperatūra. Reakcijos metu stebimas skaidraus tirpalo spalvos pokytis iš oranţinės iki ţalios. Į kolbutę lašinama praskiesta druskos rūgštis, kol pasiekiama pH=2. Iki kol pasiekiamas reikiamas rūgštingumas stebimas drebučių iškritimas, kurie vėlesnėje 30 minučių eigoje ištirpsta. Reakcijos metu būtina išlaikyti rūgštingumą pH=2. Reakcijos metu kolbutėje esantis tirpalas virinamas kol jame atsiranda aliejus (12 a ir b pav.).

12 b. pav.: 4-tiazolidinon-N-triptofano sintezės trečias etapas

Aliejus paliekamas nusistovėti, o nusistovėjus nuolat dekantuojamas vandeninio tirpalo sluoksnis iš kolbutės. Dekantavimas gali trukti ir iki kelėtos parų, kadangi aliejus ,,atpalaiduoja“ vis daugiau vandeninio tirpalo. Dekantavimas baigiamas, kai aliejus kietos konsistencijos ţalsvai gintarinės spalvos medţiaga. Gautas produktas iškrapštomas iš kolbutės ir porą kartų perkristalinamas iš vandens prieš tai virinant maţiausiame kiekyje ledinės acto rūgšties kartu su aktyvuota anglimi 5-10 minučių. Virintas mišinys filtruojamas per kuo smulkesnį stiklo filtrą į dvigubą distiliuoto vandens kiekį, lyginant su naudotos ledinės acto rūgšties kiekiu. Galutiniai susidarę kristalai nufiltruojami per popierinį filtrą Biuchnerio piltuvo ir vakuumavimo sistemos principu. Kristaluose gali likti dalis naudotos ledinės acto rūgšties, todėl jie dţiovinami. Dţiovinimas atliekamas 40 o_{C dţiovinimo}

spintoje. Gautų kristalų grynumas dėl priemaišų nustatytas plonasluoksnės chromatografijos metodu. Naudota tirpiklių sistema - acetonas:chloroformas (1:10). Nustatyta lydymosi temperatūra – 183 o

C. Galutinė produkto masė: 11,58 g. Išeiga: 76,094 %.

4.3.2. 4-tiazolidinon-N-leucino sintezė

Į konusinę kolbutę su 30 ml distiliuoto vandens įberiama 47,7 g (0,363 mol) leucino balkšvų kristalinių miltelių. Leucino milteliai ištirpinami vandenyje. Į tirpalą įberiamas dvigubas ekvivalentinis kiekis – 40,93 g (0,726 mol) KOH. Tirpalas maišomas kol ištirpsta KOH. Reakcijos eigoje tirpalo

spalvinės savybės nepakinta. Atliekama jonų mainų reakcija tarp leucino karboksigrupės vandenilio ir KOH K+ jonų (13 pav.).

13 pav.: 4-tiazolidinon-N-leucino sintezės pirmas etapas

Antrasis sintezės etapas. Į leucino ir KOH reakcijos tirpalą įpilama 21,84 ml (0,363 mol) anglies disulfido (CS2). Anglies disulfidas pasiskirsto ant tirpalo paviršiaus maţais gelsvais lašeliais.

Kolbutė uţkemšama ir įstatoma į elektrinį suktuvą. Sukimas vykdomas iki 5 valandų, kol nebelieka anglies disulfido lašelių, o tirpalas tampa oranţiniu (14 pav.).

14 pav.: 4-tiazolidinon-N-leucino sintezės antras etapas

Trečiasis sintezės etapas. Į kolbutę su tirpalu įdedamas magnetukas bei įpilamas monochloracto rūgšties (34,303 g (0,363 mol)) ir kalio karbonato (50,166 g (0,363 mol)) vandeninis tirpalas. Kolbutė perkeliama ant kaitlentės ir įjungiamas magnetinis maišytuvas. Reakcijos metu laikoma 90 oC temperatūra. Reakcijos metu stebimas skaidraus tirpalo spalvos pokytis iš oranţinės iki ţalios. Į kolbutę lašinama praskiesta druskos rūgštis, kol pasiekiama pH=2. Iki kol pasiekiamas reikiamas rūgštingumas stebimas drebučių iškritimas, kurie vėlesnėje 30 minučių eigoje ištirpsta. Reakcijos metu būtina išlaikyti rūgštingumą pH=2. Reakcijos metu kolbutėje esantis tirpalas virinamas kol jame atsiranda aliejus (15 pav.).

15 pav.: 4-tiazolidinon-N-leucino sintezės trečias etapas

Aliejus paliekamas nusistovėti, o nusistovėjus nuolat dekantuojamas vandeninio tirpalo sluoksnis iš kolbutės. Dekantavimas gali trukti ir iki keletos parų, kadangi aliejus ,,atpalaiduoja“ vis daugiau vandeninio tirpalo. Dekantavimas baigiamas, kai aliejus kietos konsistencijos gintarinės spalvos medţiaga. Gautas produktas išimamas iš kolbutės ir porą kartų perkristalinamas iš vandens prieš tai virinant maţiausiame kiekyje ledinės acto rūgšties kartu su aktyvuota anglimi 5-10 minučių. Virintas mišinys filtruojamas per kuo smulkesnį stiklo filtrą į dvigubą distiliuoto vandens kiekį, lyginant su naudotos ledinės acto rūgšties kiekiu. Galutiniai susidarę kristalai nufiltruojami per popierinį filtrą Biuchnerio piltuvo ir vakuumavimo sistemos principu. Kristalai dţiovinami dėl ledinės acto rūgšties likučio. Dţiovinimas atliekamas 40 o_{C dţiovinimo spintoje. Gautų kristalų grynumas dėl}

priemaišų nustatytas plonasluoksnės chromatografijos metodu. Naudota tirpiklių sistema- ortoksilolas:butilo acetatas (1:1). Nustatyta lydymosi temperatūra – 89-87 oC. Galutinė produkto masė: 73,679 g. Išeiga: 81,5 %.

4.3.3. Ketonų/aldehidų įvedimas į 5 padėtį junginių

4-tiazolidinon-N-(tiprofano/leucino) struktūrą

Sintezuoti junginiai: : LZL-4, LZL-5, LZL-6, LZL-7, LZL-10, LZL-15, LZL-16, LZL-19, LZL-Y, LZL-LL.

4-tiazolidinon-N-triptofano išgryninti kristaliniai milteliai atsveriami po 1 g (0,0049 mol), o 4-tiazolidinon-N-leucino 1,14 g (0,0049 mol) ir kolbutėje tirpinami 5 ml toluene. Kolbutė perkeliama į glicerolio vonelę ir montuojama prie grįţtamojo šaldytuvo. Vonelės temperatūra nustatoma elektrinėje kaitlentėje 60 o_{C. Pasveriama po vieną ketoną/aldehidą (2 lentelė), kuris bus}

naudojamas reakcijos eigoje pagal ekvivalentinį 4-tiazolidinon-N-triptofano molių kiekį, sudarant perteklių lygų 125 % (t.y. po 0,0061 mol).

2 lentelė: LZL junginių sintezėje naudoti reagentai

Junginio kodinis numeris

Pakaitas Ketono/aldehido pavadinimas Aminorūgštis įeinanti į junginio struktūrą

LZL-4 2-acetil-1-naftolis Leucinas

LZL-5 chalkonas Leucinas

LZL-7 Chalkonas Triptofanas LZL-10 p-aminoacetofenonas Leucinas LZL-15 2-Nitro-9-fluorenonas Leucinas LZL-16 p-bromacetofenonas Triptofanas LZL-17 Furfuralis Triptofanas LZL-18 5-nitrofuraldehidas Triptofanas LZL-19 3-(5-Nitro-2-furil)-2-propenalis Triptofanas LZL-X Trans,trans-dibenzalacetonas Leucinas

LZL-Y Trans,trans-dibenzalacetonas Triptofanas

LZL-LL

1-[4-[(4-chlorofenil)-metilamino]fenil]etanonas

Leucinas

Reakcijos katalizatorius – amonio acetatas (AcONH4). Amonio acetato atsveriama 0,385 g (0,005 mol). Ketonas ir amonio acetatas yra supilami į vonelėje patalpintą 4-tiazolidinon-N-triptofano tolueninį tirpalą. Į kolbutę dėl papildomo maišymo įdedamas magnetukas. Įjungiamas nustatytas glicerolio vonelės šildymas ir magnetinis maišymas. Reakcijos metu ketono oksogrupė reaguoja su dviem vandenilio atomais esančiais 4-tiazolidinono ţiedo 5 padėtyje. Susidaręs vanduo atskyla, o ketono chiralinis anglies atomas jungiasi prie 4-tiazolidinono ţiede 5 padėtyje esančio anglies atomo (16 pav.). Reakcija vykdoma sekant susidariusio produkto kiekį plonasluoksnės chromatografijos principu. Plonasluoksnės chromatografijos sistemos – ortoksilolas:butiloacetatas (1:1), izopropanolis:toluenas:amonio hidroksidas (6:3:1). Vykdytos reakcijos vykdavo apie 24 valandas. Reakcijos metu buvo stebimas pradinių junginių ištirpimas iki skaidraus tirpalo, o vėliau pakitimą į tamsėjančius ir drumstumą įgaunančių tirpalus.

16 pav.: ketonų prijungimo prie 4-tiazolidinon-N-triptofano struktūroje esančio 4-tiazolidinono žiedo 5 padėties

Reakcijos pabaigoje, tirpiklis būdavo distiliuojamas distiliavimo aparatu iki sausų mišinių. Sausi mišiniai vėliau buvo apipilami 1-3 ml chloroformo, o gauti tirpalai gryninami preparatyvinės chromatografijos principu. Preparatyvinei chromatografijai atlikti buvo naudojama sistema ortoksilolas:butiloacetatas (1:1). Atlikus preparatyvinę chromatografiją buvo išskutamas reakcijos produkto prikauptas preparatyvinės plokštelės sluoksnis, o išskusti junginio, gipso ir silikagelio milteliai suberiami į izopropanolio pripiltą kolbutę. Kolbutė kaitinama ant kaitlentės iki

uţvirimo. Izopropanolis ima tirpinti reakcijos produktą ir įgauna įvairias spalvas. Karštas tirpalas atsargiai dekantuojamas ant stiklo filtro kuris montuotas vakuumavimo sistemoje. Nudekantavus izopropanolinį tirpalą, miltelių mišinys vėl uţpilamas izopropanoliu, uţvirinama ir dekantuojama. Taip kartojamas dekantavimas, kol silikagelio ir gipso mišinio milteliuose nebėra junginio, tai matyti iš to, kad karštas izopropanolis nebeįgyja junginio tirpalui būdingos spalvos ir išlieka bespalvis. Filtratas yra surenkamas ir iš jo yra nudistiliuojamas izopropanolis. Sausas junginio likutis daţniausiai kristalizuodavosi į neskaidrius kristalus. Kristalų švarumas nustatytas plonasluoksnės chromatografijos metodu. Radus priemaišų pėdsakų, kristalai buvo perkristalinami iš izo-propanolio.

4.3.3.1. Pasiruošimas preparatyvinei chromatografijai

Preparatyvinės chromatografijos metodikos atlikimo pasiruošimui buvo gaminamos 10x10 cm matmenų preparatyvinės plokštelės, kurių pagrindą sudaro stiklas. Stiklinės plokštelės kruopščiai nuvalomos lignino pluoštu, suvilgytu chloroformu. Ant nuvalytos plokštelės išpilama suryšėjo (gipso) ir sorbento (silikagelio) masė. Masė paruošiama maišant 45 g gipso, 15 g silikagelio ir 30 ml distiliuoto vandens. Silikagelio ir gipso masė buvo išpilama naudojant pylimo stakles, kurios suformuodavo 8 mm storio sluoksnį. Padengtos plokštelės buvo laikomos kambario temperatūroje apie 2 paras, kol iš jų pilnai išgaruodavo vanduo, o masė sustingdavo. Prieš pat atliekant preparatyvinę chromatografiją reikdavo aktyvuoti plokšteles (galutinis vandens išgarinimas iš sorbento) jas dedant į dţiovinimo spintą, kurios temperatūra 110 o_{C. Plokštelės paliekamos dţiovinimo spintoje 30 min.}

Išėmus jos ataušinamos iki kambario temperatūros. Ataušus plokštelėms, ant jų, 3 cm atstumu nuo tariamos plokštelės apačios, kapiliaru buvo uţnešama chloroforme ištirpinto junginio juosta, kuri būdavo 10 cm ilgio (horizontaliai) ir 1 cm pločio (vertikaliai). Junginiai nešami tirpiklių sistemos atsiskirdavo juostomis (17 pav.). Pastebėtas maksimalus galimas uţnešamų junginių kiekis ant vienos preparatyvinės chromatogramos plokštelės buvo iki 150 miligramų. Viršijus šią ribą buvo pastebėti blogesni junginio ir priemaišų atsiskyrimo rezultatai, pastebėtas junginių juostų persidengimas. Uţnešus junginį, plokštelės buvo dţiovinamos kambario temperatūroje, siekiant išgarinti likusį chloroformą. Nebelikus chloroformo kvapo, paruoštos plokštelės buvo sudedamos į chromatografavimo kamerą, kurioje buvo paruoštas ortoksilolo:butiloacetato (1:1) mišinys. Chromatografavimas trukdavo iki 50 minučių, kol tirpiklių sistema uţkildavo iki plokštelės viršaus. Plokštelė ištraukiama, ir dţiovinama paguldant ant švariosios stiklo pusės visu plotu traukos spintoje

tol, kol nebelieka tirpiklių kvapo. Nelikus tirpiklių kvapo plokšteles yra galima ruošti reakcijos produktų išskutimui [14].

17 pav.: Preparatyvinė chromatogramos vaizdas. A- junginių persidengimas. B- Rh-Leucino sluoksnis. C-sintezuoto junginio sluoksnis. D-pradinio ketono sluoksnis.

4.4. Šifo bazių sintezė iš 2-acetil-1-naftolio

Susintezuoti junginiai: ŠBL-1 (2‐[(1E)‐1‐{[3‐(morfolin‐4‐il)propil]imino}etil]nafthalen‐1‐olis), ŠBL-2 (2‐[(1E)‐1‐[(3‐hidroksipropil)imino]etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-3 (2‐[(1E)‐1‐[(2‐hidroksietil)imino]etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-4 (2‐[(1E)‐1‐({2‐[(E)‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]amino]etil}imino)etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-5 (2‐[(1E)‐1‐({6‐[(E)‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]amino]heksil}imino)etil]naftalen‐1‐ olis), ŠBL-6 (2‐[(1E)‐1‐(benzilimino)etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-7 (2‐[(2E)‐16‐amino‐7,10,13‐trioksa‐3‐azaheksadek‐2‐en‐2‐il]naftalen‐1‐olis), ŠBL-8 (2‐[(1E)‐1‐({3‐[4‐(3‐aminopropoksi)butoksi]propil}imino)etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-9 (2‐[(1E)‐1‐({[4‐(aminometil)fenil]metil}imino)etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-10 (2‐[(1E)‐1‐{[(4‐{[(E)‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]amino]metil}fenil)-

-metil]imino}etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-11 ( 2‐[(1E)‐1‐[(E)‐2‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]hidrazin‐1‐iliden]etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-12 (2‐[(1E)‐1‐{[2‐(morfolin‐4‐il)etil]imino}etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-13 ( [(E)‐[1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]amino]tiošlapalas), ŠBL-14 (2‐[(1E)‐1‐(2‐etilhidrazin‐1‐iliden)etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-15 ( N'‐[(1E)‐1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]‐4‐nitrobenzohidrazidas), ŠBL-16 (z) (N'‐[(1E)‐1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]pentanhidrazidas), ŠBL-16 (g) (N'‐[(1E)‐1‐(1‐hidroksinaftalen‐2‐il)etiliden]pentanhidrazidas), ŠBL-17 (2‐[(1E)‐1‐[(naftalen‐2‐il)imino]etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-18 (2‐[(1E)‐1‐[(naftalen‐1‐il)imino]etil]naftalen‐1‐olis), ŠBL-19 (2‐[(1Z)‐1‐[2‐(2,4,6‐trichlorofenil)hidrazin‐1‐iliden]etil]naftalen‐1‐olis).

4.4.1. Sintezės ypatybės

Sintezės eiga susideda iš vieno etapo. Reakcijos atliktos keliais skirtingais būdais. Priklausomai nuo reakcijos vykimo lengvumo ir atlikimo laiko buvo pasirenkami skirtingi šildymo metodai. Įprastinis metodas – kai kaitinamos kolbutės su reakcijos mišiniu ant įprastinės kaitlentės. Kiti du būdai, kaitinimas mikrobangomis ir sulydymo metodu, kai reakcijos išeigos buvo nepakankamai didelės, o ir reakcijos laikas viršydavo 24 valandas. Nors iš pirmo ţvilgsnio Šifo bazių sintezė atrodo elementari ir paprasta, tačiau iš tiesų ji ţymiai labiau komplikuota. Sintezuoti junginiai yra sudaryti naudojant aminus arba diaminus ir 2-acetil-1-naftolį.

Daţniausiai Šifo bazės sintezuojamos iš aldehidų ir ketonų, o pastarieji, lyginant su aldehidais, jungiasi su amino grupėmis, kur kas sunkiau ir lėčiau. Pagrinde atliktos dviejų tipų reakcijos: alkil-imino-deokso bisubstitucijos ir hidrazono-deokso bisubstitucijos (18, 19 pav.) [36]. Pastebėta, kad aminai, kurių struktūroje yra aromatinių ţiedų arba kurie neturėjo alilo grupės taip pat reaguodavo ţymiai sunkiau. Literatūroje aprašyta Šifo bazių reakcijų atlikimo apţvalga, kurioje minima, jog kaitinimas mikrobangomis reakcijas, vykstančias nuo 1 iki 2 valandų įprastiniu būdu, sutrumpindavo iki keleto minučių [36]. Lengvai vykstančios reakcijos, įprasto šildymo ir maišymo metu turėtų įvykti nuo 30 minučių iki 2 valandų, tačiau net kaitinant mikrobangomis, sintezės metu sunkiau reaguojantys aminai sureaguodavo su 2-acetil-1-naftoliu tik per keletą valandų. Susintezuotų junginių švarumas nuo priemaišų buvo tiriamas pasitelkiant plonasluoksnės chromatografijos metodiką. Lengviau reagavę junginiai būdavo visiškai arba beveik visiškai gryni, o tuo tarpu sunkiau

reagavusieji – turėjo gana daug pradinių junginių priemaišų. Priemaišų turinčius junginius reikėdavo perkristalinami iš skirtingų organinių tirpiklių (metanolio, etanolio, izpropanolio) nuo 2 iki 3 kartų, norint juos išgryninti. Tikėtina, kad kai kurios reakcijos vykdavo ilgiau ir sunkiau dėl literatūroje minimo reakcijos metu išsiskiriančio vandens įtakos [3].

18 pav.: Alkil-imino-deokso bisubstitucijos reakcija

19 pav.: Hidrazono-deokso bisubstitucijos reakcija

Kalbant apie trečią minėtą šildymo būdą – sulydymą, būtina pastebėti, kad šiuo metodu reakcijos metu susidaręs vanduo buvo pilnai išgarinamas, tačiau didelio skirtumo tarp galutinės produkto išeigos nepastebėta. Sulydymas buvo vykdomas, pradinius reagentus sumaišius, dar kietoje konsistencijoje perkeliant ant kaitinamojo tiglio. Reakcijos metu nebuvo naudojami tirpikliai ar katalizatoriai. Tiglis kaitinamas ant kaitlentės iki tol kol pasiekiama abiejų medţiagų lydymosi temperatūra ir tęsiama, kol įvyksta sintezė. Sintezės pabaiga identifikuojama imant iš lydynio mėginį, kuris vėliau tirpinamas alkoholiniuose tirpikliuose kaip etanolis arba metanolis ir atliekama tokių tirpalų plonasluoksnė chromatograma. Būtina pastebėti, kad metodo negalima atlikti tada, kai reakcijos pradiniai reagentai nėra termo-stabilūs, tai reiškia, kad reagentai nesilydo, bet skyla. Tokiu atveju neįmanoma tikslinga sintezės eiga.

Įprastinių reakcijos katalizavimui buvo naudojama ledinė acto rūgštis, kadangi ji atlikdavo protono donoro funkciją. Ledinė acto rūgštis pasirinkta todėl, kad nors ir kai kur literatūroje minimas katalizatorius – koncentruota sulfato rūgštis buvo išbandyta, tačiau ji su ketonais sudarydavo druskas ir taip sustabdydavo visą reakciją. Ledinės acto rūgšties naudojimas maţais kiekiais pagreitindavo vykstančias reakcijas, tačiau neţymiai. Didesni ledinės acto rūgšties kiekiai labai įtakodavo reakcijos produktų išgryninimo darbus. Ledinė acto rūgštis gerai tirpina reakcijos produktus, todėl kartais nebuvo pastebimas Šifo bazės susidarymas reakcijos metu.

4.4.2. Atliktos sintezės principas

Kiekvienai reakcijai buvo atsveriama po 1 gramą (0,00537 mol) 2-acetyl-1-naftolio kristalų. Projekto metu sintezėje naudoti aminai (3 lentelė) buvo sveriami arba matuojami, priklausomai nuo norimo susintezuoti junginio charakteristikos. Aminai, kurie turėjo jungtis tik viena jungtimi, t.y. buvo siekiama susintetinti ,,mono“ junginį, buvo atsveriami pagal ekvivalentiškumo principą, tačiau padarant amino perteklių. Pastaruoju atveju aminų buvo naudojama po 125-150 % (0,00671-0,00805 mol). 150% ekvivalento kiekio buvo naudojamas tais atvejais, kai reakcija vykdavo lėčiau, o naudojami aminai – skysčiai. Šiuo būdu reakcija vykdavo greičiau, o perteklius ketono būdavo lengvai išplaunamas tirpikliais, junginio filtravimo metu. Minint atvejus, kai buvo siekiama susintetinti ,,bis“ junginius, t.y. prie amino buvo stengiamasi prijungti dvi 2-acetil-1-naftolio molekules, naudojamas aminų kiekis buvo atvirkščiai proporcingas ,,mono” junginiams. ,,Bis” junginiams gauti aminų buvo sunaudojama po pusę ir maţiau ekvivalentaus 2-acetil-1-naftolio kiekio (0,00215-0,00268 mol.), taip sudarant dvigubą ekvivalentų, o kartais ir didesnį perteklinį 2-acetil-1-naftolio molekulių kiekį. Sintezuojant ,,mono“ junginius iš diaminų, buvo svarbu atsargiai sulašinti ištirpintą tirpiklyje aminą į ištirpinto 2-acetil-1-naftolio tirpalą, kadangi buvo tikėtina, jog supylus paskaičiuotą didelį kiekį amino, iš karto jo molekulės jungsis prie dviejų 2-acetil-1-naftolio molekulių ir sudarys ne ,,mono„„, bet ,,bis“ junginius. Lėtas diaminų lašinimas į tirpalą leido išvengti šitokio jungimosi ir tuo pačiu leisdavo diaminams vienodai pasiskirstyti tirpale, bei prisijungti tik prie vienos ketono molekulės.

3 lentelė:ŠBL junginių sintezėje naudoti reagentai

Junginio kodinis numeris Pakaitas Amino pavadinimas

ŠBL-1 3-morfolinpropilaminas

ŠBL-2 Propanolaminas

ŠBL-4 Etilendiaminas ŠBL-5 Heksametilendiaminas ŠBL-6 Benzilaminas ŠBL-7 4,7,10-trioksa-1,13-tridekandiaminas ŠBL-8 4,9-dioksa-1,12-dodekandiaminas ŠBL-9 m-ksilidendiaminas ŠBL-10 m-ksilidendiaminas ŠBL-11 Hidrazinas ŠBL-12 2-morfolinetilaminas ŠBL-13 Tiosemikarbazidas ŠBL-14 Etilhidrazinas

ŠBL-15 p-nitrobenzhidrazidas ŠBL-16 (z) Valeriono r. hidrazidas ŠBL-16 (g) Valeriono r. hidrazidas ŠBL-17 2-naftilaminas ŠBL-18 1-naftilaminas ŠBL-19 2,4,6-trichlorfenilhidrazinas

4.4.3. ,,Mono“ Šifo bazių sintezė iš monoaminų

Šios sintezės metu buvo gauti junginiai: 1, 2, 3, 6, 5, ŠBL-12, ŠBL-13, ŠBL-14, ŠBL-15, ŠBL-16 (z), ŠBL-16 (g); ŠBL-17, ŠBL-18, ŠBL-19.

4.4.3.1. Reakcija, atliekama kaitinant ant kaitlentės su grįţtamuoju šaldytuvu

Gauti junginiai: ŠBL-1, ŠBL-2, ŠBL-3, ŠBL-6, ŠBL-5, ŠBL-12, ŠBL-13, ŠBL-14.

Atsveriama po 1 gramą (0,00537 mol) 2-acetyl-1-naftolio kristalų. Kristalai patalpinami į konusinę kolbutę, kurioje įpilta 2 ml metanolio arba izo-propanolio. Kristalai ištirpinami maišant arba greitinant tirpimą, kolbutę šildant. Į kolbutę su tirpalu įlašinami 2 lašai ledinės acto rūgšties ir įdedamas maišymo sistemoje naudojamas magnetukas. Įjungiama kaitlentė, ant kurios uţdedama kolbutė, nustatoma 80-90 o_{C temperatūra ir įjungiamas magnetinis maišytuvas. Į kaistantį tirpalą}

suberiama/supilamas, atsvertas/pamatuotas 0,00671-0,00805 mol amino kiekis. Patalpinus į tirpalą aminą, prie kolbutės montuojamas grįţtamasis šaldytuvas. Reakcija atliekama nuo 30 minučių iki 2 valandų, priklausomai nuo reakcijos stadijos, kuri sekama iki reakcijos pabaigos, kas 10 minučių tikrinant iš kolbutės imamą mėginį. Mėginys tiriamas plonasluoksnės chromatografijos metodu, uţnešant maţą alkoholiniu tirpikliu skiesto mėginio lašelį. Plonasluoksnei chromatografijai buvo naudojamos kelios skirtingos tirpiklių sistemos, uţtikrinančios objektyvius reakcijos stebėjimo rezultatus ir mėginyje esančių junginių atsiskyrimo gebą. Sistemos - acetonas:toluenas (1:3), acetonas:ortoksilolas (1:5); izopropanolis:toluenas:amonio hidroksidas (6:3:1). Reakcija buvo laikoma baigta, ultravioletinėje apšvietoje esančioje chromatogramoje įţiūrint tik junginį, arba regint dvigubai didesnę floresuojančio junginio dėmės nei pradinių junginių, kartu sudėjus plotus. Reakcijos metu sintezuojami junginiai iškrisdavo į citrininės spalvos, gelsvas, oranţines arba ţalias nuosėdas. Pasibaigus reakcijai, šildymas nutraukiamas ir tirpalas šiek tiek atvėsinamas. Atvėsinus nuosėdų pagausėdavo, o karštas tirpalas su junginio nuosėdomis filtruojamas per stiklo filtrus. Nufiltruotos nuosėdos buvo perplaunamos izo-propanoliu arba metanoliu. Perplautos nuosėdos dţiovinamos traukos spintoje arba dţiovinimo spintoje ne daugiau nei 40 o_{C temperatūroje, kadangi galimas ledinės}

acto rūgšties likutis gali ištirpinti susidariusį junginį ir taip pailginti dţiovinimo trukmę. Dţiovinimas baigiamas, kai nejaučiamas nuo kristalų sklindantis ledinės acto rūgšties arba naudotų tirpiklių kvapas. Pakartotinai atliekama plonasluoksnė chromatografija, įrodanti susidariusio junginio grynumą ir priemaišų nebuvimą. Kitu atveju atliekamas perkristalinimas iš izopropanolio arba metanolio. Nustatoma kristalų lydymosi temperatūra ir suberiami į laikymo indelius tolimesniems tyrimams.