FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
GABRIELĖ VILKICKYTĖ
INDIVIDUALIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai Doc. dr. Raimondas Raudonis 2017 – 2018 m. Prof. dr. Lina Raudonė 2019 m.
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė Data
INDIVIDUALIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO TYRIMAI
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovai
Doc. dr. Raimondas Raudonis 2017 – 2018 m. Prof. dr. Lina Raudonė 2019 m.
Data
Darbą atliko
Recenzentas Magistrantė
Doc. dr. Konradas Vitkevičius Gabrielė Vilkickytė
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas ir antioksidantai ... 11
1.2. Fenolinių junginių apžvalga ... 12
1.2.1. Fenolinių junginių paplitimas, funkcija augaluose ir bendra struktūra ... 12
1.2.2. Flavonoidai ... 13
1.2.3. Fenolinės rūgštys ... 16
1.2.4. Kiti neflavonoidiniai fenoliniai junginiai ... 17
1.3. Fenolinių junginių antioksidantinio poveikio mechanizmai ... 18
1.4. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai... 20
1.5. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimų apžvalga ... 23
2. TYRIMO OBJEKTAS, METODIKA IR METODAI ... 26
2.1. Tyrimo objektas ir metodika ... 26
2.2. Tyrimo metodai ... 27
2.2.1. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 27
2.2.2. Redukcinio aktyvumo įvertinimas FRAP metodu ... 28
2.2.3. Chelatinio aktyvumo nustatymas FIC metodu ... 28
2.2.4. Tyrimo duomenų analizės metodai ... 30
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 31
3.1. Fenolinių junginių antiradikalinis aktyvumas ... 31
3.2. Fenolinių junginių redukcinis aktyvumas ... 33
3.3. Fenolinių junginių chelatinis aktyvumas ... 36
3.4. Fenolinių junginių antiradikalinio, redukcinio ir chelatinio aktyvumo apibendrinimas ... 39
3.5. Fenolinių junginių dominuojančių savybių analizė ... 39
3.5.1. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp skirtingų tyrimo metodų rezultatų ... 39
3.5.2. Skirtingų antioksidantinio poveikio mechanizmų palyginimas ... 40
3.6. Fenolinių junginių struktūros – antioksidantinio aktyvumo ryšio analizė ... 42
3.6.1. Flavonoidų struktūros – aktyvumo ryšys ... 42
IŠVADOS ... 49
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50
LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 51
G. Vilkickytės magistro baigiamasis darbas „Individualių fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimai“. Moksliniai vadovai: doc. dr. R. Raudonis, prof. dr. L. Raudonė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra. Kaunas, 2019.
Darbo tikslas: įvertinti individualių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: 1. Nustatyti individualių fenolinių junginių antiradikalinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu. 2. Nustatyti individualių fenolinių junginių redukcinį aktyvumą FRAP spektrofotometriniu metodu. 3. Įvertinti individualių fenolinių junginių chelatinį aktyvumą, naudojant FIC spektrofotometrinį metodą. 4. Nustatyti individualių fenolinių junginių dominuojantį antioksidantinio poveikio mechanizmą. 5. Teoriškai pagrįsti individualių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą, remiantis jų struktūros ypatumais.
Tyrimo objektas ir metodai. Tiriamų 46 individualių fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas įvertintas spektrofotometriniais ABTS, FRAP ir FIC metodais. Pagal ABTS ir FRAP metodais gautus fenolinių junginių ir standartinio antioksidanto – trolokso kalibracinių kreivių regresijos lygties nuolydžius, apskaičiuotos santykinės troloksui ekvivalentinės antioksidantinės galios (TEACABTS ir TEACFRAP) reikšmės, kurios rodo, kiek kartų tiriamas junginys yra aktyvesnis už troloksą. FIC metodu nustatytas chelatinis aktyvumas išreikštas procentais ir palygintas su standartinio chelanto – EDTA aktyvumu. Nustatyti koreliaciniai ryšiai tarp skirtingų analizės metodų rezultatų, apskaičiuoti TEACABTS/TEACFRAP santykiai ir įvertintas tirtų junginių struktūros – antioksidantinio aktyvumo ryšys.
Rezultatai ir išvados. ABTS, FRAP ir FIC spektrofotometriniais metodais nustatyta, kad didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu iš visų tirtų fenolinių junginių išsiskyrė dikafeoilchino rūgštys, procianidinai C1 ir A2, epigalokatechingalatas, kvercetinas ir miricetinas. Nustatyti stiprūs koreliaciniai ryšiai (p<0,05) tarp metodų rezultatų atskleidžia, kad tie patys fenolinių junginių struktūros fragmentai dalyvauja skirtinguose antioksidantinio poveikio mechanizmuose. Apskaičiuota, kad daugumos tirtų individualių fenolinių junginių TEACABTS/TEACFRAP > 1, o tai rodo, kad fenoliniai junginiai pasižymi dominuojančiomis antiradikalinėmis savybėmis. Tirtų fenolinių junginių struktūros – antioksidantinio aktyvumo analizės metu nustatyta, kad didžiausią įtaką aktyvumui turi laisvos fenolinės hidroksilo grupės, jų skaičius ir išsidėstymas žiedų sistemoje, katecholio fragmentas.
Praktinės rekomendacijos. Nustatyti aktyviausieji junginiai gali būti naudojami kaip antioksidantinio aktyvumo žymenys. Gauti antioksidantinio aktyvumo rezultatai gali būti panaudoti vertinant individualių fenolinių junginių indėlį į bendrą augalinės žaliavos antioksidantinį aktyvumą.
Raktiniai žodžiai: fenoliniai junginiai; antioksidantinis aktyvumas; ABTS; FRAP; FIC; struktūros – aktyvumo ryšys.
G. Vilkickytė Master Thesis “Studies on the antioxidant activity of individual phenolic compounds”. Scientific supervisors: assoc. prof. dr. R. Raudonis, prof. dr. L. Raudonė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. Kaunas, 2019.
The aim: to evaluate the antioxidant activity of individual phenolic compounds.
The objectives: 1. To determine the radical scavenging activity of individual phenolic compounds by the spectrophotometric ABTS method. 2. To determine the reducing activity of individual phenolic compounds by the spectrophotometric FRAP method. 3. To evaluate the chelating activity of individual phenolic compounds by the spectrophotometric FIC method. 4. To determine the predominant mechanism of action of individual phenolic compounds. 5. To perform a theoretical study on the structure – antioxidant activity relationship of tested phenolic compounds.
Object and methods. The antioxidant activity of 46 individual phenolic compounds was evaluated by spectrophotometric ABTS, FRAP and FIC methods. Results of the ABTS and FRAP assays were expressed as relative Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC) values, which indicate how many times the tested compound is more active than standard antioxidant – Trolox. Results of the FIC assay were expressed as percentage of the total chelation of ferrous ions and compared with results of the standard chelating agent – EDTA. Pearson's correlation coefficients between the results of different methods and the TEACABTS/TEACFRAP ratios were calculated. Furthermore, the structure – antioxidant activity relationship of tested phenolic compounds was determined.
Results and conclusions. Results of the ABTS, FRAP and FIC assays showed that dicaffeoylquinic acids, procyanidins C1 and A2, epigallocatechin gallate, quercetin and myricetin surpassed all others tested phenolic compounds by antioxidant activity. Strong correlations (p<0.05) between the results of methods evaluating different mechanisms of antioxidant activity were found. This indicates that there is a relationship between the mechanism of action of phenolic compounds, and the same structural fragments may be responsible for different antioxidant properties. The assessed TEACABTS/TEACFRAP ratios of the majority of tested phenolic compounds were more than 1. Therefore, phenolic compounds have predominant radical scavenging properties. The analysis of structure – activity relationship revealed that the number and position of free phenolic hydroxyl groups, especially presence of the catechol moiety, play a major role in antioxidant activity.
Practical recommendations. The most active compounds can be used as chemical markers of the antioxidant properties. The obtained antioxidant activity results can be applied for evaluation of contribution of individual phenolic compounds to antioxidant activity in herbal raw materials.
Keywords: phenolic compounds; antioxidant activity; ABTS; FRAP; FIC; structure – activity relationship.
SANTRUMPOS
ABTS 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonrūgštis)
CUPRAC vario (II) jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. cupric reducing antioxidant
capacity)
DPPH 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas EDTA etilendiamintetraacto rūgštis
EP elektrono perdavimas
ESC efektyvioji skysčių chromatografija
FIC geležies (II) jonų surišimas (angl. ferrous ions chelating)
FRAP geležies (III) jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. ferric reducing antioxidant
power)
RAF reaktyviosios azoto formos RDF reaktyviosios deguonies formos
TEAC troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia (angl. Trolox equivalent antioxidant
capacity)
TPTZ 2,4,6-tripiridil-s-triazinas
UV ultravioletinis
ĮVADAS
Didėjantis sergamumas lėtinėmis neinfekcinėmis ligomis yra viena aktualiausių šių dienų problemų [1]. Remiantis naujausiais Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, su lėtinėmis ligomis yra susiję apie 71 proc. visų mirties atvejų pasaulyje ir dėl šių ligų kasmet miršta net apie 41 mln. žmonių [2]. Lėtinės ligos lemia negalios pakoreguotų gyvenimo metų dalies padidėjimą – trumpėja sergančiųjų gyvenimo trukmė, blogėja gyvenimo kokybė, daugelis jų nebegali dirbti, o tai turi įtakos ir bendro vidaus produkto sumažėjimui, šalių ekonomikai [3]. Dėl didelio lėtinių ligų poveikio, ieškoma kuo efektyvesnių priemonių, kurios palengvintų šių ligų eigą ir mirštamumą nuo jų. Vis daugiau dėmesio skiriama augaliniams ekstraktams, natūraliems išgrynintiems junginiams, nes manoma, kad natūralios medžiagos yra ne tik saugesnės, bet dėl gebėjimo veikti skirtingais mechanizmais, plataus gydomųjų savybių spektro, gali būti netgi efektyvesnės už sintetines. Didelis natūralių antioksidantų poreikis yra ne tik farmacijos srityje – natūralių augalinės kilmės antioksidantų vartojimas maisto ir kosmetikos pramonėse gali padaryti produktus saugesniais ir priimtinesniais vartotojams [4 – 6].
Fenoliniai junginiai yra viena iš pagrindinių augalų antrinių metabolitų grupių. Šie junginiai dideliais kiekiais randami įvairiuose grūdiniuose produktuose, daržovėse, vaisiuose ir gėrimuose [5 – 9]. Daugybės tyrimų metu buvo įrodytas fenolinių junginių farmakologinis poveikis ir nauda žmogaus organizmui [9 – 13]. Manoma, kad išgrynintų fenolinių junginių ar augalinių ekstraktų su fenolinių junginių kompleksu panaudojimas medicinoje gali padėti išvengti degeneracinių ir lėtinių ligų, tokių kaip neurologinių, endokrininių sutrikimų, kvėpavimo, širdies ir kraujagyslių sistemos, onkologinių ligų išsivystymo ir progresavimo [1, 5, 14 – 16]. Fenolinių junginių panaudojimas minėtų ligų valdyme aiškinamas šių junginių antioksidantiniu aktyvumu – gebėjimu išvengti žalingo laisvųjų radikalų poveikio ir oksidacinių biologinių molekulių pažeidimų [7, 8, 14]. Fenoliniai junginiai gali perduoti elektroną ar vandenilio atomą nuo struktūroje esančių fenolinių grupių laisviesiems radikalams ir taip juos inaktyvuoti. Taip pat jie gali suformuoti σ ryšius su pereinamųjų metalų jonais ir sustabdyti šių metalų katalizuojamas oksidacijos reakcijas. Dėl skirtingų antioksidantinio poveikio mechanizmų fenoliniai junginiai padeda apsaugoti organizmo ląsteles nuo oksidacinio streso [17 – 20]. Todėl fenolinių junginių – natūralių augalinių antioksidantų aktyvumo nustatymas yra aktuali tyrimų sritis.
Nepaisant to, kad visi fenoliniai junginiai turi aromatinį žiedą ir vieną ar kelias hidroksilo grupes, jie skiriasi savo chemine struktūra – yra žinoma daugiau nei 8000 skirtingos struktūros fenolinių junginių, ir šis skaičius kiekvienais metais vis auga [6, 16, 21]. Dėl įvairių struktūros skirtumų fenoliniai junginiai skiriasi savo savybėmis, antioksidantiniu aktyvumu, reaktyvumu, reakcijų kinetikos ypatumais ir dominuojančiu poveikio mechanizmu [17, 19, 22, 23]. Dauguma augalinių žaliavų ekstraktų tyrimų įvertina tik bendrą antioksidantinį aktyvumą, kuris yra nulemtas visų sudėtiniame mišinyje esančių junginių ir yra sąlygojamas sinergistinių ir antagonistinių sąveikų tarp jų. Analitiškai yra sunku
identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti visus augalinėje žaliavoje esančius fenolinius junginius, todėl individualių medžiagų efektyvumas, net ir taikant pokolonėlinius metodus, ne visada yra žinomas ar tiksliai įvertinamas dėl kai kurių junginių lėtos reakcijų kinetikos [18, 22, 24].
Mokslinio darbo naujumas. Remiantis mokslinės literatūros šaltinių analize, pirmą kartą vienodomis eksperimentinėmis sąlygomis, in vitro spektrofotometriniais analizės metodais, galutinai įvykus reakcijai tarp junginio ir reagento, atlikti išsamūs, net 46 individualių fenolinių junginių skirtingų antioksidantinio poveikio mechanizmų nustatymo tyrimai, kurie leidžia palyginti junginių, priklausančių skirtingiems pogrupiams ar besiskiriančių įvairiomis funkcinėmis grupėmis, aktyvumą. Gauti rezultatai suteikia naujų mokslinių žinių apie individualių fenolinių junginių antiradikalines, redukcines ir chelatines savybes, dominuojantį veikimo mechanizmą, patvirtina ir apibendrina daugelio mokslinės literatūros šaltinių duomenis apie fenolinių junginių struktūros – aktyvumo ryšį.
Teorinė ir praktinė reikšmė. Individualių fenolinių junginių, priklausančių skirtingiems pogrupiams, antiradikalinio, redukcinio, chelatinio aktyvumo nustatymas ABTS, FRAP ir FIC spektrofotometriniais metodais padeda geriau suprasti fenolinių junginių antioksidantines savybes, veikimo mechanizmą ir suteikia galimybę įvertinti atskirų struktūros fragmentų įtaką aktyvumui. Gauti rezultatai gali būti panaudoti augalinių žaliavų analizėje – nustatyti aktyviausi fenoliniai junginiai gali būti naudojami kaip antioksidantinio aktyvumo žymenys, vertinant augalinių žaliavų antioksidantinį aktyvumą, o žinant tikslius individualių fenolinių junginių kiekius tiriamoje augalinėje žaliavoje, remiantis mūsų rezultatais, galima apskaičiuoti ir konkrečių junginių indėlį į bendrą žaliavos antioksidantinį aktyvumą. In vitro atliktų tyrimų duomenys atskleidžia aktyviausių junginių tolesnių in
vivo tyrimų poreikį ir padeda prognozuoti šių junginių panaudojimo perspektyvas išgrynintų preparatų,
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti individualių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą. Darbo uždaviniai:
1. Nustatyti individualių fenolinių junginių antiradikalinį aktyvumą ABTS spektrofotometriniu metodu.
2. Nustatyti individualių fenolinių junginių redukcinį aktyvumą FRAP spektrofotometriniu metodu. 3. Įvertinti individualių fenolinių junginių chelatinį aktyvumą naudojant FIC spektrofotometrinį
metodą.
4. Nustatyti individualių fenolinių junginių dominuojantį antioksidantinio poveikio mechanizmą. 5. Teoriškai pagrįsti individualių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą, remiantis jų struktūros
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Laisvieji radikalai, oksidacinis stresas ir antioksidantai
Laisvieji radikalai – tai molekulių dalys, turinčios vieną ar daugiau neporinių išorinio sluoksnio elektronų. Dėl neporinio elektrono laisvieji radikalai yra labai nestabilūs, reaktyvūs ir linkę reaguoti su kitomis organizmo ląstelėmis – atiduoti arba prisijungti trūkstamą elektroną iš kitų molekulių, taip jas pažeisti, sukelti grandininę reakciją, o patys įgauti stabilesnę būseną [15, 25, 26]. Be laisvųjų radikalų yra ir neradikalinės formos, kurios yra stabilesnės ir mažiau aktyvios chemiškai nei radikalinės, tačiau taip pat gali sukelti laisviesiems radikalams būdingas reakcijas gyvuose organizmuose [15, 27, 28]. Reaktyviosios formos pagal kilmę dažniausiai skirstomi į dvi pagrindines grupes – reaktyviąsias deguonies formas (RDF) ir reaktyviąsias azoto formas (RAF) (1 pav.). Šios reaktyviosios formos skiriasi savo veikimo mechanizmu, gyvavimo trukme, cheminiu reaktyvumu ir paplitimu. Esant fiziologinėms sąlygoms, labiausiai paplitę ir pavojingiausi yra superoksido anijono radikalas (O2•-), hidroksilo radikalas (OH•), azoto oksido radikalas (NO•) ir vandenilio peroksidas (H2O2) [29, 30].
1 pav. Reaktyviosios deguonies ir azoto formos [sudaryta pagal 15]
Laisvieji radikalai arba neradikalinės formos organizme gali susidaryti vykstant oksidaciniam fosforilinimui, ksenobiotikų mikrosominiam metabolizmui, riebiųjų rūgščių oksidacijai ir biologinių molekulių autooksidacijai, katalizuojamai pereinamųjų metalų Fe2+ ar Cu2+. Natūraliai organizme susidariusios reaktyviosios deguonies ir azoto formos vadinamos endogeninėmis [27, 28, 30 – 33]. Išskiriamos ir egzogeninės formos, susidarančios dėl išorinių veiksnių – aplinkos taršos, toksinų, ultravioletinių (UV) spindulių, jonizuojančios spinduliuotės, elektromagnetinio lauko, ozono poveikio, nuolatinio streso, oksiduoto maisto – sočiųjų riebalų, kepto ir rūkyto maisto vartojimo [27 – 29, 34].
Sutrikus pusiausvyrai tarp laisvųjų radikalų ir juos inaktyvuojančių antioksidantų, dėl pastarųjų trūkumo ar dėl laisvųjų radikalų neįprastai didelės gamybos,pasireiškia oksidacinis stresas. Oksidacinis
stresas pažeidžia nukleorūgštis, baltymus, lipidus ir sąlygoja genų mutacijas, chromosomų sandaros ar rinkinio pakitimus bei lemia organizmo baltymų ir ląstelių membranų normalios funkcijos praradimą [7, 26, 29, 30]. Oksidacinis stresas atlieka svarbų vaidmenį daugelio ligų patofiziologijoje. Laisvųjų radikalų perteklius skatina senėjimo procesus, prisideda prie daugelio patologinių būklių išsivystymo ir progresavimo, įskaitant 2 tipo cukrinį diabetą, autoimunines ligas, aterosklerozę, miokardo infarktą, išemiją, smegenų insultą, hipertenziją, vėžį, Alzhaimerio, Parkinsono ligą, reumatoidinį artritą, vilkligę, alergines ligas, kataraktą, lėtinę obstrukcinę plaučių ligą, lėtinį inkstų pažeidimą, uždegimines žarnų ligas [7, 14, 21, 35]. Taigi, dėl oksidacinio streso atsiradę biologinių molekulių, ląstelių struktūrų pažeidimai sąlygoja pavojingų ligų išsivystymą ir progresavimą.
Žalingas laisvųjų radikalų poveikis gali būti sumažintas, slopinant per daug intensyvią jų gamybą arba sustiprinant antioksidantines sistemas – taip užtikrinant saugią pusiausvyrą tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų [25, 30]. Antioksidantai apibrėžiami kaip svarbios cheminės medžiagos, kurios inaktyvuoja laisvuosius radikalus, slopina oksidacijos procesus ir apsaugo ląsteles nuo potencialiai žalingų oksidacijos procesų. Šie biologiškai aktyvūs junginiai nutraukia laisvųjų radikalų sukeltas grandinines reakcijas [35 – 38]. Tokiu būdu antioksidantai dalyvauja organizmo gynybos mechanizme ir apsaugo nuo oksidacinio streso pažeidimų.
Iš visų antioksidantų ypatingas dėmesys skiriamas natūraliems augaliniams antioksidantams – fenoliniams junginiams. Šie natūralūs egzogeniniai antioksidantai gali veikti skirtingais mechanizmais, taip užtikrindami efektyvų laisvųjų radikalų inaktyvavimą ir tolesnių grandininių reakcijų, oksidacinių pažeidimų sustabdymą. Dėl šių savybių jie gali būti naudojami ne tik maisto, kosmetikos pramonės srityse, bet ir farmacijos pramonėje [1, 37, 39].
1.2. Fenolinių junginių apžvalga
1.2.1. Fenolinių junginių paplitimas, funkcija augaluose ir bendra struktūra
Fenoliniai junginiai yra biologiškai aktyvios medžiagos, plačiai paplitę augalų karalystėje. Tik labai maži kiekiai fenolinių junginių nustatyti bakterijose, grybuose ir dumbliuose [6, 19, 36]. Dauguma fenolinių junginių kaupiasi augalų ląstelių vakuolėse, didžiausi jų kiekiai nustatyti išorinėse vaisių ir daržovių dalyse [6, 7, 16, 40]. Visi fenoliniai junginiai turi bendrą kilmę – yra kilę iš aminorūgščių fenilalanino, tirozino arba triptofano. Sintezė vyksta šikimato – fenilpropanoidiniu keliu, o pagrindinis biosintezės etapas yra vienos ar daugiau hidroksilo grupių įvedimas į fenilo žiedą [6, 23, 41, 42].
Fenoliniai junginiai gaminasi augaluose kaip antriniai metabolitai [36, 43]. Nors jie nėra būtini augalų gyvybiniams procesams, tačiau atlieka svarbią adaptogeninę, signalinę ir apsauginę funkciją. Jie kaip fitoaleksinai – saugo nuo žolėdžių gyvūnų ir kenkėjų, kenksmingų UV spindulių, o kai kurie iš jų
suteikia augalams spalvą ir skonį – todėl gali pritraukti apdulkintojus [14, 43, 44]. Fenolinių junginių gamyba augaluose priklauso nuo augalo genotipo ir nuo išorinių veiksnių – šviesos, kritulių, temperatūros, sezono, augimo vietovės, dirvožemio tipo, derlingumo [6 – 8, 14].
Terminu „fenoliniai junginiai“ apibrėžiamos medžiagos, turinčios fenolinį fragmentą – aromatinį žiedą su prijungtomis viena ar daugiau hidroksilo grupių [8, 36, 45]. Fenoliniai junginiai gali egzistuoti laisvi kaip aglikonai arba prisijungę cukrinę dalį – glikozidų pavidalu. Dauguma fenolinių junginių yra esterifikuoti, jiems būdingos įvairios funkcinės grupės. Jie gali būti monomerai, oligomerai ir polimerai, egzistuoti kaip sulfatuoti, gliukuroninti ar metilinti dariniai, kompleksiniai junginiai su oligosacharidais, lipidais, aminais ir organinėmis rūgštimis. Priklausomai nuo struktūros, molekulinės masės, tirpumo ir kitų savybių, jie skiriasi savo veikimo mechanizmu ir poveikiu [6, 14, 46].
Dėl didelės fenolinių junginių įvairovės, jų klasifikacija yra gana sudėtinga. Paprastai jie skirstomi priklausomai nuo struktūroje esančių fenolinių žiedų skaičiaus ir prijungtų funkcinių grupių [8, 45]. Galima išskirti tris pagrindines fenolinių junginių grupes – flavonoidus, fenolines rūgštis ir kitus neflavonoidinius fenolinius junginius, kurie gali būti suskirstyti į dar smulkesnius pogrupius [44, 47].
1.2.2. Flavonoidai
Flavonoidai yra didžiausia ir labiausiai ištirta fenolinių junginių grupė, kuriai priklauso daugiau nei 5000 junginių – tai yra maždaug du trečdaliai visų fenolinių junginių [40, 45]. Flavonoidų struktūros pagrindą sudaro flavano (benzo-γ-pirono) branduolys – C6 – C3 – C6 žiedų sistema, sudaryta iš dviejų šešianarių aromatinių žiedų – žymimų A ir B, kurie sujungti trijų anglies atomų tilteliu. Anglies atomų grandinėlei prisijungus prie hidroksilo grupės susidaro naujas šešianaris heterociklinis žiedas – žymimas raide C (2 pav.) [6, 7, 23, 32]. Šie junginiai gali būti hidroksilinti C3, C5, C6, C7, C3', C4' ir C5' padėtyse ar oksiduoti, dažniausiai C3 padėtyje, be to, jiems būdingos metilo, metoksi ir acetilo grupės [19, 48, 49]. Dauguma flavonoidų augaluose randami glikozidų pavidale. Prisijungę cukrūs skiriasi savo struktūra, skaičiumi ir prisijungimo vieta. O-glikoziduose cukrus yra prisijungęs per hidroksilo grupę, dažniausiai esančią C3 arba C7 padėtyje, o C-glikoziduose – per aglikono anglies atomą C6 arba C8 padėtyje. Dažniausi cukrūs – gliukozė, ramnozė, galaktozė, ksilozė ir arabinozė [8, 19, 23, 40, 48, 49].
Flavonoidai klasifikuojami į skirtingus pogrupius, atsižvelgiant į aglikono pobūdį, prisijungusius pakaitus, jų prisijungimo padėtis prie A ir B žiedų, C žiedo hidroksilinimo, oksidacijos ir prisotinimo laipsnį [19, 40]. Skirtingi flavonoidų pogrupiai būdingi tam tikroms augalų šeimoms ar gentims. Dažnai individualus flavonoidų derinys gali būti kaip chemotaksonominis žymuo fitocheminiame profilyje. Išskiriami 6 pagrindiniai flavonoidų pogrupiai: flavonai, flavonoliai, flavanonai, izoflavonai, flavanoliai ir antocianidinai (3 pav.) [8, 16, 19, 45, 50].
3 pav. Pagrindinių flavonoidų pogrupių struktūros pagrindai [sudaryta pagal 23]
Flavonai – tai vienas iš didžiausių flavonoidų pogrupių, kuriam priklauso labiausiai iš visų flavonoidų oksiduoti junginiai. Šiems benzopirano dariniams būdinga dviguba jungtis tarp C2 ir C3 bei karbonilinė grupė C4 padėtyje – pirono žiedas [23, 51]. Labiausiai paplitę flavonai – aglikonai – apigeninas, luteolinas, tangeretinas, baikaleinas, chrizinas ir glikozidai – viteksinas, orientinas, diosminas [7, 19, 51]. Flavonų deriniai būdingi notrelinių (Lamiaceae Martinov) ir astrinių (Asteraceae Bercht. & J. Presl) šeimai priklausančių augalų žaliavoms, pavyzdžiui, vaistinių čiobrelių (Thymus
vulgaris L.) žolei ir vaistinių ramunių (Matricaria chamomilla L.) žiedams [47, 52].
Benzopirano dariniams priskiriami ir flavonoliai – kitas didelis flavonoidų pogrupis. Flavonoliai kaip ir flavonai yra gelsvos spalvos junginiai ir jų struktūra labai panaši, tik flavonoliams būdinga hidroksilo grupė C3 padėtyje, kuri gali būti glikozilinta [19, 23, 51]. Flavonolių pavyzdžiai – kvercetinas, kemferolis, miricetinas, izoramnetinas, kvercitrinas, hiperozidas, rutinas, avikuliarinas, reinotrinas [7, 47, 48, 52]. Izoramnetinas ir kvercetinas laikomi beržinių (Betulaceae Gray) šeimos augalų chemotaksonominiais žymenimis [53]. Flavonolių gausu ir erškėtinių (Rosaceae Juss.) šeimai priklausančių augalų žaliavose, pavyzdžiui, daržinių braškių (Fragaria × ananassa Duch.), paprastųjų abrikosų (Prunus armeniaca L.) ir dygiųjų slyvų (Prunus spinosa L.) vaisiuose [45, 47, 52, 54]. Mokslinės literatūros šaltiniuose pabrėžiama rutino – svarbiausio komponento, lemiančio sėjamųjų grikių (Fagopyrum esculentum Moench) žolės aktyvumą, svarba žmogaus organizmui [55]. Rutinas kartu su vitaminu C veikia sinergistiškai, stiprina kraujagyslių sieneles ir padeda sumažinti kapiliarų pralaidumą. Dėl šios priežasties su minėtu veikliųjų medžiagų deriniu kuriami sudėtiniai maisto papildai ir vaistiniai preparatai [56].
Didelė ir išskirtinė grupė –izoflavonai, kurių struktūroje fenilo radikalas prijungtas ne C2, o C3 padėtyje [50]. Jų struktūra panaši į estrogenų, tai lemia jų specifinę biologinę funkciją – fitoestrogenines savybes, todėl jie kartais dar vadinami fitoestrogenais. Geriausiai žinomi izoflavonai – genisteinas, daidzeinas, ononinas, gliciteinas. Izoflavonų deriniai būdingi pupinių (Fabaceae Lindl.) šeimai priklausančių augalų žaliavoms, pavyzdžiui, gauruotųjų sojų (Glycine max (L.) Merr.) sėkloms ir raudonųjų dobilų (Trifolium pratense L.) žiedams, o genisteinas laikomas šios šeimos chemotaksonominiu žymeniu [16, 19, 36, 51, 53].
Dar vienas svarbus flavonoidų pogrupis – flavanonai. Tai bespalviai junginiai, suteikiantys augalamskartų skonį. Didžiausi jų kiekiai nustatyti rūtinių (Rutaceae Juss.) šeimos atstovų – citrusinių vaisių žievelėje (Exocarpium Citrii). Flavanonai skiriasi nuo prieš tai minėtų junginių tuo, kad neturi dvigubos jungties tarp C2 ir C3, vietoj pirono žiedo yra nepatvarus dihidropirono žiedas ir jiems nebūdinga hidroksilo grupė C3 padėtyje [6, 57, 58]. Šiam pogrupiui priklauso – naringeninas, naringinas, taksifolinas, hesperidinas, eriodiktiolis, likviritinas [7, 47, 48, 52].
Labiausiai redukuoti iš visų flavonoidų junginiai, C3 padėtyje turintys hidroksilo grupę ir katecholio fragmentą B žiede – (+)-katechinas, (–)-epikatechinas, epikatechingalatas, epigalokatechinas ir epigalokatechingalatas. Šie junginiai priskiriami flavanolių (katechinų) pogrupiui [19, 51]. Dėl asimetrinių anglies atomų – C2 ir C3, katechinai pasižymi optiniu aktyvumu ir jiems būdinga erdvinė konfiguracija – optiniai izomerai. Šie junginiai dideliais kiekiais randami aglikonų pavidalu kininių arbatmedžių (Camellia sinensis (L.) Kuntze) lapuose, tikrųjų kakavmedžių (Theobroma
cacao L.) sėklose ir tikrųjų vynmedžių (Vitis vinifera L.) vaisiuose [7, 45, 47, 59].
Kitas reduktazių paveiktas pogrupis – antocianidinai. Šie junginiai kaip ir flavanoliai neturi karbonilinės grupės C4 padėtyje [19]. Antocianidinams priskiriami cianidinas, apigenidinas, delfinidinas, malvidinas, pelargonidinas, petunidinas, peonidinas. Antocianidinai dažnai yra glikozilinti C3 padėtyje ir egzistuoja kaip glikozidai – antocianinai [52, 60]. Šie junginiai yra svarbūs augalų pigmentai, suteikiantys augalams raudoną, mėlyną ar violetinę spalvą, kuri priklauso nuo struktūroje esančių hidroksilo ir metilo grupių skaičiaus bei ląstelės sulčių pH. Antocianinų gausu Asteraceae šeimai priklausančių augalų ryškiaspalviuose žieduose bei gervuogės (Rubus L.) ir šilauogės (Vaccinium L.) gentims priklausančių augalų vaisiuose [16, 23, 47, 61]. Be to, antocianinai gali būti tuopos (Populus L.) genties augalų chemotaksonominiais žymenimis [62].
Išskiriami ir kiti, mažesni flavonoidų pogrupiai (4 pav.). Iš jų galima pabrėžti chalkonus, kurie laikomi flavonoidų pirmtakais – jie yra daugelio flavonoidų biosintezės tarpiniai produktai. Šių junginių struktūrai būdingi du aromatiniai žiedai, sujungti trijų anglies atomų grandinėle su α, β dviguba jungtimi. Kadangi jų pirano žiedas yra atidarytas, jie dar vadinami atviros grandinės flavonoidais. Chalkonų pavyzdžiai – 2',4'-dihidroksi-3'-metoksichalkonas, 2',4'-dihidroksichalkonas, 3,4-dihidroksichalkonas, chalkonaringeninas, izolikviritinas [19, 23, 61]. Prie chalkono darinių priskiriamas ir hidrochinono
glikozidas – arbutinas, pasižymintis šlapimo takus dezinfekuojančiomis savybėmis. Dideli šio junginio kiekiai nustatyti erikinių (Ericaceae Juss.) ir uolaskėlinių (Saxifragaceae Juss.) šeimų augaluose [61, 63]. Chalkonai su hidrinta trijų anglies atomų grandinėle – aspalatinas, floretinas ir floridzinas, vadinami dihidrochalkonais [47, 51, 64]. Floridzinas, nepaisant nedidelio antioksidantinio aktyvumo, yra vienas iš svarbiausių obels (Malus Mill.) genties chemotaksonominių žymenų [65].
4 pav. Mažesnių flavonoidų pogrupių struktūros pagrindai [sudaryta pagal 23, 66]
Prie flavan-3,4-diolių pogrupio priskiriami junginiai – leukocianidinas, leukodelfinidinas, leukoantocianidinas, leukopianidinas. Kaip ir flavanoliai, jie retai randami glikozidų pavidale. Flavan-3,4-dioliai yra bespalviai, monomeriniai junginiai, turintys prisotintą C žiedą ir hidroksilo grupę C3 padėtyje. Jų struktūroje yra net 3 asimetriniai anglies atomai – C2, C3 ir C4 [7, 49].
Neoflavonoidai – grupė, kuriai priklauso nedidelis kiekis junginių. Skirtingai nuo daugumos flavonoidų, kurie turi 2-fenilchromano struktūrą, neoflavonoidai turi 4-fenilchromano pagrindą su karboniline grupe C2 padėtyje [48]. Flavonoidams būdingo skeleto neturi ir junginiai su penkianariu furano žiedu – 2-benzofuranono dariniai – auronai, o flavonoidų kondensacijos produktai biflavonoidai – bilobetinas, ginkgetinas, randami dviskiaučių ginkmedžių (Ginkgo biloba L.) lapuose, turi net du C6 – C3 – C6 struktūrinius fragmentus [23, 40].
1.2.3. Fenolinės rūgštys
Fenolinės rūgštys – tai organinės rūgštys, turinčios aromatinį benzeno žiedą su karboksirūgšties grupe, kuri suteikia junginiui rūgštinių savybių [36, 44, 45]. Fenolinės rūgštys gali egzistuoti tiek glikozidų, tiek aglikonų forma, dažnai jos būna esterifikuotos su kitais natūraliais junginiais, tokiais kaip organinės rūgštys, steroliai, alkoholiai. Šie junginiai, augalams suteikiantys išskirtinį skonį ir kvapą, dideliais kiekiais randami daržovėse ir vaisiuose [8, 16, 60, 67]. Atsižvelgiant į kilmę ir struktūrą – šoninę grandinėlę prijungtą prie aromatinio žiedo, išskiriami du fenolinių rūgščių pogrupiai – hidroksibenzenkarboksirūgštys ir hidroksicinamono rūgštys [6, 16, 44, 45, 60].
Hidroksibenzenkarboksirūgštys – tai benzenkarboksirūgšties dariniai, kuriems būdingas iš septynių anglies atomų sudarytas C6 – C1 struktūros pagrindas (5 pav.) [6]. Hidroksibenzenkarboksirūgštys viena nuo kitos skiriasi hidroksilo ir metoksi grupių skaičiumi bei padėtimi aromatiniame žiede [50]. Labiausiai ištirtos šios fenolinės rūgštys – po vieną hidroksilo grupę turinčios – salicilo rūgštis ir p-benzenkarboksirūgštis, dvi hidroksilo grupes turinčios – protokatecho ir gentizo rūgštys, hidroksilo ir metoksi grupę turinčios vanilino ir alyvų rūgštys bei tris hidroksilo grupes turinti galo rūgštis. Pastarosios rūgšties gausu rūgtinių (Polygonaceae Juss.) šeimai priklausančių augalų žaliavose, o hidroksibenzenkarboksirūgščių deriniai būdingi Rosaceae šeimos augalams [42, 44, 45, 47]. Prie benzenkarboksirūgšties darinių gali būti priskiriamas ir taninų hidrolizės produktas – elago rūgštis, būdingas sidabražolės (Potentilla L.) genties augalams [47, 68].
5 pav. Hidroksibenzenkarboksirūgščių struktūros pagrindas [44]
Kitas fenolinių rūgščių pogrupis – hidroksicinamono rūgštys – cinamono rūgšties dariniai, kuriems būdingas iš devynių anglies atomų sudarytas C6 – C3 struktūros pagrindas (6 pav.). Jį sudaro benzeno žiedas ir trijų anglies atomų šoninė grandinėlė su dviguba jungtimi ir karboksilo grupe [6, 42, 45, 60]. Augaluose dažniausiai randami šie cinamono rūgšties dariniai – o-, m- arba p-kumaro rūgštys, kurios skiriasi hidroksilo grupės padėtimi benzeno žiede, taip pat dvi hidroksilo grupes turinti – kavos rūgštis ir metoksi grupes turinčios ferulo ir sinapo rūgštys. Augaluose gausu ir hidroksicinamono rūgšties esterių, pavyzdžiui, chlorogeno, neochlorogeno, rozmarino, kafeoilchino rūgščių [6, 16, 36, 45, 60]. Cinamono rūgšties dariniai randami cinamono (Cinnamomum Schaeff.) genties medžių žievėje, kavos ir kafeoilchino rūgštys būdingos kavamedžio (Coffea L.) genties augalams, ferulo rūgštis – miglinių (Poaceae Barnhart), o rozmarino rūgštis – Lamiaceae šeimų augalams [45, 47, 60].
6 pav. Hidroksicinamono rūgščių struktūros pagrindas [44]
1.2.4. Kiti neflavonoidiniai fenoliniai junginiai
Taninai – tai gana didelės molekulinės masės (500 – 3000 Da) junginiai. Dauguma jų yra tirpūs vandenyje ir gali sudaryti kompleksinius junginius su baltymais, alkaloidais, polisacharidais,
nukleorūgštimis, saponinais, steroidais ir mineralais [6, 60]. Taninai klasifikuojami į du pogrupius – hidrolizuojamus ir kondensuotus taninus. Hidrolizuojamiems taninams būdinga centre esanti gliukozės ar polihidrinto alkoholio molekulė, kuri esterifikuota galo arba elago rūgštimis, susidarant galo ir elago taninams, atitinkamai [16, 43, 60]. Hidrolizuojamieji taninai gali būti laikomi Rosaceae šeimos chemotaksonominiais žymenimis [69]. Kondensuoti taninai, dar kitaip vadinami proantocianidinais, yra flavan-3,4-diolių arba flavanolių monomerų – epikatechino ir katechino, polimerai. Šie junginiai vaisiams ir daržovėms suteikia sutraukiantį skonį [16, 43, 60]. Proantocianidinai yra pagrindinė fenolinių junginių grupė randama V. vinifera sėklose ir vaisiuose [45].
Polimeriniams junginiams priklauso ir lignanai – enterodiolis, enterolaktonas, sezaminas, sekoizolaricirezinolis. Šie junginiai sudaryti iš fenilpropano – C6 – C3 fragmentų, kurie sujungti per šoninės grandinės C8 ir C8' anglies atomus. Tai vienas iš svarbiausių fitoestrogenų – augalinių hormonų pogrupių. Didžiausi kiekiai lignanų randami glikozidų pavidalu sėjamųjų linų (Linum usitatissimum L.) ir indinių sezamų (Sesamum indicum L.) sėklose [16, 45, 47, 70].
Dar viena svarbi fenolinių junginių grupė – stilbenai. Tai fenilpropanoidų dariniai, turintys 1,2-difeniletileno, C6 – C2 – C6 pagrindą su prijungtomis hidroksilo grupėmis. Stilbenai gali egzistuoti kaip monomerai arba oligomerai [16, 45, 60]. Geriausiai žinomas stilbenas – fitoaleksinas resveratrolis, kurio gausu V. vinifera vaisiuose ir Fabaceae šeimai priklausančių augalų žaliavose, pavyzdžiui, valgomųjų arachių (Arachis hypogaea L.) sėklose [6, 45, 47].
Išskiriami ir kiti, mažesni fenolinių junginių pogrupiai, neturintys flavonoidinio pagrindo, tokie kaip paprastieji fenoliai, turintys tik vieną fenolinį žiedą, kumarinai, turintys benzopirono pagrindą bei kurkuminoidai – difenilheptanoidai ir naftochinonai [7, 43, 44, 47].
Atlikta fenolinių junginių struktūrų ir paplitimo augaluose apžvalga atskleidžia, kad fenoliniai junginiai, be visoms grupėms būdingo fenolinio žiedo, labai skiriasi savo struktūra ir paplitimu – skirtingoms augalų šeimoms ar gentims būdingi specifiniai fenolinių junginių profiliai. Nepaisant didelės struktūrų įvairovės, visi fenoliniai junginiai yra svarbūs ir priklausomai nuo struktūros pagrindo, prie jo prisijungusių funkcinių grupių, pasižymi skirtingomis savybėmis, veikimo mechanizmu, poveikiu ir pritaikomumu medicinoje ar kosmetikos ir maisto pramonėse.
1.3. Fenolinių junginių antioksidantinio poveikio mechanizmai
Fenoliniai junginiai dalyvauja procesuose su RDF ir RAF, geba neutralizuoti žalingą laisvųjų radikalų poveikį ir taip apsaugo ląsteles nuo oksidacinio streso – pasižymi antioksidantiniu aktyvumu [14, 37, 71]. Priklausomai nuo vykstančių procesų, sąveikos pobūdžio su laisvaisiais radikalais, galima
išskirti keletą veikimo mechanizmų. Kuriuo mechanizmu bus inaktyvuojami radikalai priklauso tik nuo konkrečių fenolinių junginių tipo ir jų koncentracijos [8, 36, 37, 50].
Vienas iš galimų antioksidantinio poveikio mechanizmų yra gebėjimas sumažinti fermentų, susijusių su RDF ir RAF gamyba, aktyvumą – veikti kaip fermentų inhibitoriai [7, 52]. Fenoliniai junginiai, sąveikaudami su azoto oksido sintazėmis, gali keisti azoto oksido radikalų sintezę, o fermento ksantino oksidazės slopinimas lemia sumažėjusią superoksido radikalų gamybą. Šio fermento aktyvumą geba slopinti dauguma flavonoidų, tokių kaip kvercetinas ar silibinas [50, 61]. Fenolinių junginių antioksidantinis poveikis susijęs ir su kitų oksidazių – lipooksigenazės, ciklooksigenazės, mieloperoksidazės, redukuoto nikotinamido adenino dinukleotido fosfato oksidazės, taip pat fermentų, kurie netiesiogiai dalyvauja oksidacijos procesuose, pavyzdžiui, fosfolipazės A2, slopinimu. Flavonoidai, ypač flavonai, gali slopinti neutrofilų aktyvavimą α1-antitripsinu ir laisvųjų radikalų atpalaidavimą iš neutrofilų [14, 36, 72]. Tokiu būdu fenoliniai junginiai netiesiogiai slopina laisvųjų radikalų susidarymą ir užkerta kelią žalingam jų poveikiui.
Įrodyta, kad fenoliniai junginiai gali padidinti kitų endogeninių antioksidantų koncentraciją. Jie stimuliuojamai veikia endogeninius antioksidantus, įskaitant katalazes ir superoksido dismutazę. Flavonoidai gali aktyvuoti ir detoksikuojančius fermentus, tokius kaip redukuoto nikotinamido adenino dinukleotido fosfato – chinono oksidoreduktazę, glutationo S-transferazę ar gliukuronoziltransferazę [32, 52, 72]. Taip fenoliniai junginiai padidina plazmos antioksidantinę galią ir padeda atstatyti normalią pusiausvyrą tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų.
Fenoliniai junginiai pasižymi chelatinėmis savybėmis – geba chelatuoti pereinamųjų metalų jonus, tokius kaip Fe2+, Cu2+, kurie yra oksidacinio proceso katalizatoriai ir yra svarbūs susidarant laisviesiems radikalams [36, 50, 52, 73]. Pereinamųjų metalų jonų chelatavimas padeda išvengti katalizinio vandenilio peroksido skilimo Fentono reakcijos metu, nutraukia šią reakciją, taip sumažina laisvųjų radikalų, ypač hidroksilo radikalo, susidarymą ir slopina oksidacinius procesus [32, 33, 74].
Fenoliniai junginiai, priklausomai nuo junginio tipo, laisvuosius radikalus gali inaktyvuoti dviem būdais – pasižymėti dominuojančiu antiradikaliniu arba redukciniu aktyvumu. Struktūroje esančios fenolinės hidroksilo grupės suteikia stiprių vandenilio (elektronų) donorinių savybių – todėl fenoliniai junginiai geba laisviesiems radikalams atiduoti trūkstamą elektroną, veikti kaip reduktoriai arba perduoti vandenilio atomą ir taip surišti laisvuosius radikalus [4, 7, 71, 72]. Fenoliniai junginiai, veikdami šiais mechanizmais, stabilizuoja, inaktyvuoja laisvuosius radikalus ir sustabdo laisvųjų radikalų grandinines reakcijas.
Fenoliniai junginiai žmogaus organizme atlieka ir kitas svarbias funkcijas: susilpnina patogeninius mikroorganizmus, stabdo trigliceridų nusėdimą, pasižymi uždegimą slopinančiu, širdies ir kraujagyslių sistemą bei neuronų ląsteles apsaugančiu, antimutageniniu, antinavikiniu ir senėjimo procesus lėtinančiu poveikiu. Visos šios funkcijos iš dalies yra nulemtos antioksidantinio aktyvumo ir
yra susiję su gebėjimu apsaugoti ląstelių komponentus nuo oksidacinės žalos – neuronų degeneracijos, endotelio pažeidimo, vėžio ląstelių proliferacijos, nenormalios ląstelių apoptozės, baltymų oksidacijos metu išsilaisvinančių uždegimo mediatorių ir citokinų, kurie lemia uždegiminį procesą, išsiskyrimo [9, 14, 15, 41, 60, 72].
Taigi, fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas gali būti suprantamas kaip skirtingų poveikių, įskaitant antiradikalinį, redukcinį ir chelatinį, derinys, užtikrinantis laisvųjų radikalų grandininių reakcijų sustabdymą. Šios savybės nulemia fenolinių junginių galimą panaudojimą daugelio lėtinių ligų gydyme ar sveikatinimo, organizmo stiprinimo tikslais.
1.4. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai
Biologiniai in vivo antioksidantinio aktyvumo metodai padeda nustatyti fenolinių junginių įtaką oksidaciniams pažeidimams ląstelėse, o biocheminiai in vitro – fermentinėms sistemoms [34, 75]. Tačiau dažniausiai taikomi cheminiai analizės metodai in vitro, kuriais antioksidantinis aktyvumas įvertinamas naudojant tam tikrus reagentus, kurie imituoja organizme susidarančius laisvuosius radikalus. Pagal veikimo mechanizmą išskiriamos dvi pagrindinės cheminių metodų grupės – laisvo elektrono perdavimu (EP) arba vandenilio atomo perdavimu (VAP) pagrįsti metodai [5, 35, 76].
VAP pagrįsti metodai parodo antioksidantų – fenolinių junginių (ArOH) gebėjimą atiduoti vandenilio atomą laisviesiems radikalams (X•), taip susidarant ariloksi radikalui (ArO•), kuris vėliau stabilizuojamas rezonanso energijos. Tokiu būdu nutraukiama laisvųjų radikalų grandininė reakcija. Gebėjimas atiduoti vandenilio atomą priklauso nuo vandenilio donorinės grupės disociacijos energijos ir jonizacijos potencialo. Teigiama, kad tie junginiai, kurie geba dalyvauti VAP ir surišti laisvuosius radikalus, pasižymi antiradikaliniu aktyvumu [37, 76, 77, 78]. Vandenilio atomo perdavimas laisviesiems radikalams gali būti išreikštas šia lygtimi:
ArOH + X• → ArO• + XH [35]
Dažnai naudojamas spektrofotometrinis 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonrūgšties) (ABTS) radikalų – katijonų surišimo metodas, paremtas ABTS•+ radikalo inaktyvavimu. Vienas iš galimų inaktyvavimo mechanizmų yra vandenilio atomo perdavimo reakcija [37, 77 – 79]. Į pagamintą ABTS•+ radikalo tirpalą pridėjus fenolinio junginio stebimas mėlynai žalios spalvos nykimas, o optinio tankio sumažėjimas išmatuojamas spektrofotometru esant 600 – 750 nm bangos ilgiui [33, 35, 37, 78]. Absorbcijos sumažėjimas proporcingas antioksidantų aktyvumui ir mėginio koncentracijai – tai suteikia galimybę sudaryti individualių fenolinių junginių kalibracines kreives. ABTS metodas yra paprastas, jam atlikti nereikia sudėtingos įrangos ir aparatūros, be to, jis gali būti taikomas tiek hidrofilinių, tiek lipofilinių antioksidantų nustatymui [33, 75, 78]. VAP metodams priskiriami ir kiti – deguonies radikalų
absorbcinės gebos nustatymo, bendrojo radikalų gaudyklės parametro nustatymo, bendrosios oksiradikalų surišimo gebos įvertinimo metodai ir autooksidacija paremti krocino ir β-karoteno blukinimo metodai [33, 35, 37, 75, 77].
EP pagrįstais metodais galima nustatyti fenolinių junginių gebėjimą atiduoti elektroną laisviesiems radikalams ar kitiems junginiams, pavyzdžiui, metalams, ir taip juos redukuoti. Taigi, EP pagrįsti metodai parodo redukcinį aktyvumą. Teigiama, kad antioksidantų redukcinis aktyvumas priklauso nuo jonizacijos potencialo ir pH. Didėjant pH, mažėja jonizacijos potencialas ir dėl deprotonizacijos stiprėja elektronų donorinės savybės – intensyviau vyksta elektronų perdavimas [35, 37, 76]. Elektrono perdavimas laisviesiems radikalams gali būti išreikštas šia lygtimi:
ArOH + X• → ArOH•+ + X- [35]
Populiariausi metodai, pagrįsti elektronų perdavimo mechanizmu, yra geležies (III) ir vario (II) jonų redukcijos antioksidantinės galios (FRAP ir CUPRAC, atitinkamai) nustatymo metodai. Gebėjimas redukuoti metalų jonus prilyginamas gebėjimui redukuoti laisvuosius radikalus [33]. FRAP metode, kaip geležį sujungiantis ligandas, dažniausiai naudojamas 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ), kuris sudaro spalvotus kompleksus su geležimi. Reakcijos metu vyksta gelsvos spalvos Fe3+ – TPTZ komplekso redukcija iki mėlynai violetinės spalvos Fe2+ – TPTZ komplekso, taip padidėjant tirpalo absorbcijai, kuri išmatuojama spektrofotometru, esant 593 nm bangos ilgiui [33, 37, 75]. Tiek FRAP, tiek CUPRAC metodai parodo tiriamų junginių redukcinį aktyvumą, kuris koreliuoja su antioksidantų koncentracija. Kaip standartinis antioksidantas, su kuriuo lyginamas tiriamų junginių aktyvumas, dažniausiai naudojamas troloksas arba askorbo rūgštis [33, 35, 75, 76, 80]. FRAP ir CUPRAC metodai yra greitai atliekami, nesudėtingi, patikimi ir jiems nereikalinga speciali įranga [35, 37, 78].
Vandenilio atomo ir elektronų perdavimas yra susijęs ir gali vykti kartu, o kuris mechanizmas yra dominuojantis priklauso tik nuo konkretaus junginio, jo struktūros ir tirpumo [76]. Būtent todėl yra naudingi metodai, kurie apjungia vandenilio atomo ir elektrono perdavimo reakcijas. Tokio metodo pavyzdys – dažnai naudojamas 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalų surišimo metodas. Šis metodas pagrįstas VAP/EP mechanizmu – greitai vykstančiu elektrono atidavimu ir po jo einančiu lėtu vandenilio atomo perdavimu laisviesiems radikalams [35, 76, 77].
Spektrofotometrinių analizės metodų rezultatai dažniausiai išreiškiami standartinio antioksidanto ekvivalentais, kurie parodo, kokia standartinio antioksidanto koncentracija (mM) turi tokį patį antioksidantinį aktyvumą kaip 1 mM tiriamojo bandinio. Standartinio antioksidanto ekvivalentai suteikia galimybę palyginti skirtingų augalinių žaliavų antioksidantines savybes ar įvertinti individualaus junginio indėlį į suminį žaliavos ekstrakto ar fitopreparato antioksidantinį aktyvumą [33, 75]. Vis dėlto, vertinant atskirų junginių aktyvumą yra tikslinga aktyvumą išreikšti santykine troloksui ekvivalentiška antioksidantine galia (TEAC). TEAC reikšmės (bedimensis dydis) apskaičiuojamos pagal individualių junginių ir trolokso kalibracinių kreivių regresijos lygties nuolydžių santykius ir
parodo, kiek kartų tiriamas junginys yra aktyvesnis už troloksą [81]. Kuo didesnis antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodais gautas individualaus fenolinio junginio kalibracinės kreivės nuolydis, tuo stipresnės junginio antioksidantinės savybės [67, 82]. TEAC, lyginant su TE, atskleidžia ne tik antioksidantines savybes, bet ir leidžia palyginti tiriamojo aktyvumą su standartiniu antioksidantu.
Vienu iš stipriausių prooksidantų, kuris dalyvauja Fentono reakcijoje, laikomas Fe2+. Todėl norint įvertinti fenolinių junginių chelatinį aktyvumą metalo jonams, dažnai naudojamas geležies (II) jonų surišimo (FIC) metodas. Reakcijai inicijuoti naudojamas chelantas ferozinas, kuris su Fe2+ sudaro raudonai violetinės spalvos kompleksą. Pridėjus antioksidantų gali būti kiekybiškai įvertinamas jų chelatinis aktyvumas metalo jonams, remiantis Fe2+ – ferozino komplekso absorbcijos sumažėjimu, esant 562 nm bangos ilgiui. Kaip teigiama kontrolė naudojama etilendiamintetraacto rūgštis (EDTA) arba citrinų rūgštis, o chelatinis aktyvumas išreiškiamas procentais arba EDTA ekvivalentais [33, 35, 75, 83]. Didėjant fenolinių junginių koncentracijai, chelatinis aktyvumas geležies (II) jonams taip pat didėja [39, 84]. Tačiau ši priklausomybė galima tik esant tam tikram koncentracijų intervalui, kuris labai varijuoja priklausomai nuo individualaus junginio ir jo aktyvumo, todėl jį surasti gali būti sudėtinga, ypač tiriant daug junginių. Khokhar ir Owusu-Apenten, nustatė, kad (+)-katechino ir (–)-epikatechino chelatinis aktyvumas metalo jonams nepriklauso nuo koncentracijos 50 – 400 µg/ml intervale, ir didėjant koncentracijai aktyvumas gali net mažėti. Šis reiškinys aiškinamas tarpmolekuline sąveika – molekulių dimerizacija esant tam tikrai fenolinių junginių koncentracijai [85]. FIC metodas reikalauja didelio analitinio kruopštumo, yra labai jautrus, patikimas ir gali padėti įvertinti antioksidantų gebėjimą sudaryti chelatinius junginius su Fe2+, taip nutraukiant šio metalo katalizuojamas oksidacijos reakcijas [33, 75]. Todėl FIC metodu galima įvertinti netiesioginį antioksidantinį aktyvumą.
Fenolinių junginių analizei taikomi ir chromatografiniai metodai – dujų, skysčių ir pluonasluoksnė chromatografija [16]. Daugelis spektrofotometrinių tyrimų gali būti suderinti su chromatografiniais, ypač efektyviąja skysčių chromatografija (ESC). Po detekcijos iš chromatografinės sistemos surenkamos mėginio frakcijos ir iš karto nustatomas frakcijų antioksidantinis aktyvumas. Pavyzdžiui, plačiai taikomi ESC – DPPH arba ESC – ABTS pokolonėliniai metodai. Šie metodai suteikia galimybę greitai atskirti junginius ir nustatyti atskirų antioksidantų aktyvumą sudėtinguose mišiniuose [35, 37]. Tačiau taikant pokolonėlinius metodus, priklausomai nuo reakcijos kilpos tūrio ir eliuento tėkmės greičio, reakcijos mišinys reakcijos kilpoje išbūna ribotą laiką – reakcija tarp reagento ir junginio trunka mažiau nei minutę [86]. Atsižvelgiant į skirtingą fenolinių junginių reakcijų kinetiką, kai kurių junginių ilgą reakcijos su reagentu laiką, galima daryti prielaidą, kad indvidualių fenolinių junginių aktyvumas taikant pokolonėlinius metodus gali būti įvertintas netiksliai.
Apibendrinant taikomus metodus galima teigti, kad cheminiais analizės metodais galima įvertinti menamą antioksidantinį aktyvumą, kuris yra proporcingas aktyvumui in vivo. Dėl didelės
fenolinių junginių įvairovės, struktūros, tirpumo skirtumų yra tikslinga naudoti keletą antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodų, kurie atspindi skirtingą fenolinių junginių veikimo mechanizmą.
1.5. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimų apžvalga
Lietuvoje atlikta keletas tyrimų, atskleidžiančių individualių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą. Trihidroksiflavonų antioksidantinio aktyvumo įvertinimo DPPH metodu tyrimas parodė, kad net 6 iš 17 tirtų junginių pasižymėjo didesniu aktyvumu nei stiprus antioksidantas – tioredoksinas. Be to, nustatyta teigiama vidutinė priklausomybė (R=0,43 ir R=0,45) tarp antioksidantinio ir vėžio ląstelių proliferaciją slopinančio aktyvumo (U87 ir A549 ląstelių linijoms, atitinkamai), o tai rodo, kad fenolinių junginių antioksidantinės savybės gali būti susiję su antivėžiniu aktyvumu [87]. Slapšytė ir kt. įvertino fenolinio junginio – 5,8-dihidroksikumarino antioksidantinį aktyvumą ABTS, DPPH, FRAP ir kitais metodais. Tyrimo metu buvo nustatyta tiesinė koncentracijos – ABTSradikalo katijono irDPPH radikalo surišimo priklausomybė, o metodų, įvertinančių skirtingus antioksidantinio poveikio mechanizmus, rezultatai parodė, kad 5,8-dihidroksikumarinas pasižymėjo dominuojančiu antiradikaliniu aktyvumu [88]. Raudonis ir kt. pagal ESC – ABTS ir ESC – FRAP metodais gautus individualių fenolinių junginių ir trolokso kalibracinių kreivių regresijos lygties nuolydžius apskaičiavo TEAC reikšmes ir nustatė, kad iš 12 tirtų fenolinių junginių didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo flavanolių pogrupio atstovai – (+)-katechinas, epigalokatechingalatas ir flavonolis – kvercetinas [89]. Lietuvoje taip pat atliekami tam tikrų augalinių žaliavų ekstraktų fitocheminės sudėties tyrimai, pokolonėliniais metodais nustatomi aktyviausi fenoliniai komponentai ir įvertinamas individualių fenolinių junginių indėlis į bendrą žaliavos antioksidantinį aktyvumą [55, 65, 86].
Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimai populiarūs visame pasaulyje. Csepregi ir kt. in vitro cheminiais metodais įvertino 37 individualių fenolinių junginių, priklausančių skirtingiems pogrupiams, antioksidantinį aktyvumą ir nustatė, kad didelis antioksidantinis aktyvumas būdingas antocianidinams, flavanoliams ir kai kuriems flavonoliams [18]. Olennikov ir kt. individualių fenolinių junginių chelatinį aktyvumą įvertino remiantis ESC gautų chromatogramos smailių ploto sumažėjimu, įvykus ikikolonėlinei reakcijai su Fe2+ jonais. Didžiausias smailės ploto sumažėjimas – didžiausias aktyvumas, iš tirtų flavonų nustatytas baikaleinui, skutelareinui ir 6-hidroksiluteolinui, o iš flavanolių – miricetinui ir kvercetageninui [74]. Pereira ir kt. nustatė tiesioginį koncentracijos – antioksidantinio aktyvumo ryšį dešimčiai tirtų fenolinių junginių ir įrodė, kad natūralūs fenoliniai antioksidantai, tokie kaip miricetinas, kvercetinas, luteolinas, taksifolinas, (+)-katechinas veikdami kartu su endogeniniais antioksidantais pasižymi adityviu ar sinergistiniu poveikiu mažinant oksidacinį stresą [90]. Piazzon ir kt. įvertino fenolinių rūgščių aktyvumą pagal ABTS ir FRAP metodais gautus kalibracinių kreivių
nuolydžius ir nustatė, kad iš tirtų fenolinių rūgščių didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo galo, kavos, alyvų, sinapo ir ferulo rūgštys [67]. Dar vienas tyrimas įrodė didelį 3,4-dihidroksi-5-metilbenzenkarboksirūgšties antiradikalinį ir redukcinį aktyvumą, pelargonidino, malvino, fenolinių endokanabinoidų, indolo darinių chelatinį aktyvumą, ir atskleidė, kad troloksas pasižymi silpnomis chelatinėmis savybėmis, todėl yra netinkamas naudoti kaip standartinis chelantas [91].
Daug fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimų atlikta išskyrus fenolinius junginius iš tam tikrų augalinių ekstraktų. Pavyzdžiui, Lin ir kt. spektrofotometriniu DPPH metodu ištyrė 11 individualių flavonoidų, išskirtų iš puošniųjų skaistenių (Pyrethrum tatsienense (Bureau & Franch) Ling) žolės ir nustatė aktyviausius komponentus – luteoliną, 6-hidroksiluteolin-7-O-β-D-gliukozidą ir kvercetin-7-O-β-D-gliukozidą [92]. Sarian ir kt. išskyrę iš indinių raguonių (Tetracera indica (Christm. & Panz.) Merr.) ir vijoklinių raguonių (Tetracera scandens (L.) Merr.) lapų fenolinius junginius, nustatė jų antioksidantinį aktyvumą ATBS, FRAP, DPPH ir kitais analizės metodais. Tyrimo metu buvo įrodytas didelis kemferolio, izoskutelareino redukcinis aktyvumas ir hipoletino, kvercetino ir (–)-epikatechino antiradikalinis aktyvumas [93]. Akter ir kt. įvertino iš ciberžolės (Curcuma L.) genties įvairių rūšių ir veislių išskirtų junginių antioksidantinį aktyvumą. Rezultatai parodė, kad net 4 iš 9 išskirtų junginių pasižymėjo didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei troloksas, o aktyviausias iš jų buvo kurkuminas [94]. Tokie ir panašūs tyrimai atskleidžia augalų svarbiausius komponentus, lemiančius antioksidantinį aktyvumą, ir kartu suteikia svarbios informacijos apie individualių fenolinių junginių aktyvumą.
Kai kurių anksčiau atliktų tyrimų metu įvertintos ne tik fenolinių junginių antioksidantinės savybės, bet ir reakcijų kinetika. Ali ir kt. ištyrė anilino darinių ir fenolinių junginių antiradikalinį aktyvumą bei išanalizavo šių junginių reakcijų kinetikos ypatumus. Tyrimo metu buvo nustatyta, kad iš natūralių paprastųjų fenolių, didžiausiu antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo katecholis, hidrochinonas ir eugenolis, be to, apskaičiuota stipri teigiama koreliacija (R=0,937) tarp antiradikalinio aktyvumo ir reakcijos greičio konstantų [17]. Tian ir Schaich atliktas tyrimas atskleidė, kad fenoliniai junginiai nevienodu greičiu reaguoja su ABTS radikalo katijonu. Tyrimo metu nustatyta, kad kai kuriems fenoliniams junginiams, pavyzdžiui, p-kumaro, galo, kavos, ferulo rūgštims, (+)-katechinui, galokatechinui, katechingalatui, galokatechingalatui, rutinui, būdinga lėta reakcijų kinetika. Gautos kinetikos kreivės parodė, kad lėtos kinetikos junginiams didžiausias aktyvumas būdingas reakcijos pabaigoje, o greitai reaguojantiems junginiams aktyvumas mažai kinta visos reakcijos metu [22]. Tai įrodo spektrofotometrinių analizės metodų tinkamumą, vertinant individualių fenolinių junginių aktyvumą, galutinai įvykus reakcijai tarp junginio ir reagento. Naujausi antioksidantinio aktyvumo tyrimai atskleidžia reakcijų su laisvaisiais radikalais ar prooksidantais stechiometriją. Pavyzdžiui, Catapano ir kt. įvertino izokvercitrino ir pereinamųjų metalų kiekybinius santykius, vykstant chelatavimo reakcijai. Tyrimas parodė, kad izokvercitrinui būdingi 1:1 metalų kompleksai, tačiau jie nėra stabilūs, kintant aplinkos sąlygoms gali lengvai suirti ar susidaryti kitokie kompleksiniai junginiai
[95]. Tai rodo, kad individualių fenolinių junginių chelatinio aktyvumo rezultatams įtakos gali turėti aplinkos veiksniai, todėl chelatinio aktyvumo tyrimai reikalauja ypatingo kruopštumo ir atidumo.
Kadangi fenolinių junginių antioksidantinės savybės priklauso nuo jų struktūros ypatumų, norint detaliau išnagrinėti individualių fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą ir jį pagrįsti, atliekami teoriniai struktūros – antioksidantinio aktyvumo tyrimai. Antioksidantų struktūros – aktyvumo ryšys pradėtas tyrinėti jau XIX a., tačiau dėl aparatūros ir žinių stokos tyrimai buvo gana riboti [36]. Šiuo metu taikomi fenolinių junginių struktūros – antioksidantinio aktyvumo ryšio analizės tyrimai dažniausiai yra teoriniai ir remiasi individualių fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo rezultatais ir žiniomis apie junginių struktūrą, patvirtintomis spektroskopinės analizės (branduolių magnetinio rezonanso, UV, infraraudonojo spektro molekulinės absobcinės spektrinės analizės ar masių spektrometrinės analizės) tyrimais [18, 23, 92, 93, 96, 97].
Gali būti atliekami ir matematiniai kiekybiniai struktūros – aktyvumo priklausomybės ryšių tyrimai, kurių metu naudojami elektroniniai, steriniai ir hidrofobiniai parametrai – molekuliniai deskriptoriai. Tokie tyrimai grindžiami žiniomis apie funkcinių grupių disociacijos entalpijas, junginio jonizacijos potencialą, lipofiliškumą ir padeda nuspėti junginių fizikochemines, biologines savybes, kartu ir antioksidantinį aktyvumą [36, 98 – 100].
Nors taikomi fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai skiriasi, tačiau galima įžvelgti bendrus struktūros – antioksidantinio aktyvumo principus, kurie patvirtinti daugelyje tyrimų. Manoma, kad fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas iš esmės priklauso nuo junginio gebėjimo atiduoti vandenilio atomą ar elektroną – nuo junginio vandenilio (elektronų) donorinių grupių buvimo ir jų išsidėstymo žiedų sistemoje [14, 17, 83, 88, 92]. Funkcinės grupės keičia elektronų delokalizaciją aromatiniuose žieduose, molekulės plokštumą ir gali sukelti erdvinius trukdymus, kurie sumažina junginio reaktyvumą arba, atvirkščiai, dėl elektronų delokalizacijos gali būti sustiprinamos elektronų donorinių grupių savybės ir stipriau stabilizuojami susidarę oksidacijos produktai – ariloksi radikalai [17, 19, 23, 90]. Kuo mažesnė fenolinio hidroksilo disociacijos energija, tuo junginys reaktyvesnis, stipresnės elektronų donorinės savybės ir didesnis antioksidantinis aktyvumas [17, 92].
Mokslinės literatūros šaltinių analizė atskleidė, kad fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas ir jo ryšys su fenolinių junginių struktūra kelia susidomėjimą daugeliui tyrėjų ir yra dažnas tyrimo objektas visame pasaulyje. Tai įrodo individualių fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo tyrimų aktualumą ir skirtingų struktūrų junginių analizės svarbą. Įvertinus visas funkcines grupes, jų skaičių, išsidėstymą, sąveiką, struktūros fragmentų įtaką skirtingiems antioksidantinio poveikio mechanizmams, galima prognozuoti bendrą fenolinio junginio antioksidantinį aktyvumą. Norint kuo geriau suprasti atskirų struktūros fragmentų įtaką antioksidantiniam aktyvumui, antioksidantinio aktyvumo tyrimai turėtų būti atliekami su kuo įvairesnės struktūros fenoliniais junginiais, g tam tikromis funkcinėmis grupėmis.
2. TYRIMO OBJEKTAS, METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas ir metodika
Tyrimo objektas – ESC grynumo fenoliniai junginiai: (+)-katechinas, (–)-epikatechinas, epigalokatechinas, epigalokatechingalatas, epikatechingalatas, miricetinas, tilirozidas, apigeninas, arbutinas ir protokatecho, elago rūgštys įsigyti iš „Fluka“ (Buchsas, Šveicarija), kemferol-3-O-gliukuronidas, kvercetinas, procianidinas A2, reinotrinas, orientinas, kemferolis ir rozmarino, alyvų, sinapo, p-kumaro, galo, chlorogeno, ferulo, salicilo, vanilino, kavos, 4-kafeoilchino, 4,5-dikafeoilchino, 3,4-dikafeoilchino, 3,5-dikafeoilchino rūgštys iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija), procianidinas C1 ir avikuliarinas iš „ChromaDex“ (Irvinas, Kalifornija, JAV), izokvercitrinas iš „Roth“ (Karlsrūhė, Vokietija), rutinas, astragalinas, izoramnetin-3-O-gliukozidas, izoramnetin-3-O-rutinozidas, floretinas, hiperozidas, floridzinas, kvercitrinas, eupatorin-5-metileteris, sinensetinas, luteolin-7-O-gliukozidas ir luteolin-4'-O-gliukozidas iš „Extrasynthese“ (Genay, Prancūzija). Šių junginių cheminės struktūros pateiktos 1 ir 2 prieduose.
Naudoti tirpikliai, reagentai ir standartinės medžiagos. Tyrimams naudoti tirpikliai – 96 proc. (v/v) etanolis, įsigytas iš „Vilniaus degtinė“ (Vilnius, Lietuva), išgrynintas dejonizuotas vanduo paruoštas naudojant Milli – Q („Millipore“, Bedforfas, JAV) vandens gryninimo sistemą, ledinė acto rūgštis (99,8 proc.) ir koncentruota druskos rūgštis (37 proc.) įsigytos iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija). Naudoti reagentai – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonrūgštis) (ABTS), geležies (III) chlorido heksahidratas (FeCl3 × 6 H2O), natrio acetatatas (CH3COONa), 2,4,6-tripiridil-s-triazinas (TPTZ), ferozinas įsigyti iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija), kalio persulfatas (K2S2O8), bevandenis geležies (II) chloridas (FeCl2) iš „Alfa Aesar“ (Karlsrūhė, Vokietija). Kaip standartinės medžiagos naudotos etilendiamintetraacto rūgštis (EDTA) ir troloksas (6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchromano-2-karboksilinė rūgštis) iš „Sigma – Aldrich“ (Buchsas, Šveicarija). Visi reagentai ir standartinės medžiagos buvo analitinio grynumo.
Naudota aparatūra. Svėrimui naudotos analitinės svarstyklės („Sartorius CP64 – OCE“, Getingenas, Vokietija). Antiradikalinio, redukcinio ir chelatinio poveikio nustatymui naudotas UV – regimosios šviesos spektrofotometras („Spectronic CamSpec M550“, Garfortas, Jungtinė Karalystė).
Tyrimo objekto paruošimas tyrimams. ABTS ir FRAP tyrimams naudoti įvairių koncentracijų fenolinių junginių tirpalai, kurie buvo skiedžiami 96 proc. (v/v) etanoliu keturis kartus, taip gaunant penkis skirtingų koncentracijų tirpalus. Kiekvienam junginiui nustatytas individualus koncentracijų intervalas, kuriame pasiekta tiesinė koncentracijos priklausomybė nuo absorbcijos. Naudotų individualių fenolinių junginių ir trolokso tirpalų koncentracijų intervalai (tiesiškumo ribos, mM) pateikti 3 priede. Kadangi FIC metodu daugumai tirtų individualių fenolinių junginių
nepavyko nustatyti tiesinės koncentracijos (išbandytas koncentracijų intervalas 5 – 80 µg/ml) priklausomybės nuo absorbcijos (p>0,05 tiesinės regresijos koeficientams), fenolinių junginių gebėjimas chelatuoti Fe2+ jonus buvo įvertintas ir palygintas tarp junginių, esant vienodai koncentracijai. Ankstesni fenolinių junginių chelatinio aktyvumo tyrimai įrodo, kad toks chelatinio aktyvumo išreiškimas taip pat atspindi junginių gebėjimą chelatuoti pereinamųjų metalų jonus [91, 101]. Remiantis kituose chelatinio aktyvumo tyrimuose naudotais fenolinių junginių kiekiais, atsižvelgiant į tyrimui atlikti reikalingą didelį tiriamo junginio tirpalo kiekį ir siekiant optimalaus naudos ir sąnaudų santykio, FIC metodui buvo pagaminti individualių fenolinių junginių 20 µg/ml etanoliniai tirpalai [39, 91, 102].
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Antiradikalinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu
Individualių fenolinių junginių antiradikalinis aktyvumas buvo įvertintas pagal Re ir kt. aprašytą ABTS radikalų – katijonų surišimo metodiką su nežymiais pakeitimais [103]. Pirmiausia paruošiamas 2 mM ABTS motininis tirpalas – 0,0548 g ABTS miltelių ištirpinama 50 ml išgryninto vandens ir į gautą tirpalą pridedama stiprios oksiduojančios medžiagos – 0,0095 g K2S2O8. Gautas mišinys gerai sumaišomas ir laikomas kambario temperatūroje, tamsaus stiklo buteliuke 16 valandų. Darbinis tirpalas pagaminamas skiedžiant motininį ABTS tirpalą išgrynintu vandeniu iki 1,0 absorbcijos vienetų esant 734 nm bangos ilgiui. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.
Į 3 ml paruošto darbinio tirpalo pridedama 20 µl tiriamo individualaus fenolinio junginio arba trolokso tirpalo (viena iš penkių koncentracijų). Atsižvelgiant į nevienodą fenolinių junginių reakcijos greitį ir siekiant, kad reakcija įvyktų iki galo, gautas tirpalas laikomas tamsioje vietoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Praėjus šiam laikui, spektrofotometru esant 734 nm bangos ilgiui išmatuojama tiriamo tirpalo absorbcija ir apskaičiuojamas absorbcijos pokytis. Tyrimai su visų junginių penkiomis skirtingomis koncentracijomis kartojami po tris kartus.
Gauti rezultatai naudojami individualių fenolinių junginių ir trolokso kalibracinių kreivių (absorbcijos pokyčio priklausomybės nuo koncentracijos, mM) sudarymui. ABTS metodu tirtų fenolinių junginių ir trolokso gautų kalibracinių kreivių duomenys pateikti 3 priede. Antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas pagal Koleva ir kt. pasiūlytas TEACABTS reikšmes, kurios parodo, kiek kartų tiriamojo fenolinio junginio antiradikalinis aktyvumas yra didesnis nei trolokso [81]. TEACABTS apskaičiuojamas:
TEACABTS=
ajunginio
atrolokso ,
Čia: ajunginio – tiriamojo junginio kalibracinės kreivės regresijos lygties nuolydis, gautas ABTS metodu; atrolokso – trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties nuolydis, gautas ABTS metodu.
