KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS
Sonata Šalomskaitė - Davalgienė
Biologiškai aktyvių molekulių elektropernašos į ląsteles in
vitro ir į navikinius audinius efektyvumo tyrimas
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biofizika (02 B)
Disertacija rengta 2000 – 2005 metais Vytauto Didžiojo universitete, Kauno medicinos universitete ir Gustave - Roussy institute, Prancūzijoje.
Mokslinis vadovas:
doc. dr. M. S. Venslauskas (Vytauto Didžiojo universitetas, biomedicinos mokslai, biofizika – 02 B)
Konsultantas:
TURINYS
1.Naudotų simbolių ir sutrumpinimų sąrašas
...52. Įvadas
...63. Mokslinis darbo naujumas
...84. Darbo tikslas ir uždaviniai
...95. Literatūros apžvalga
...105.1 Elektroporacijos teorija...10
5.2 Elektroporacijos metodo taikymas...……...…...………....14
5.2.1 Mažų molekulių elektropernaša į ląsteles...14
5.2.2 Genų elektropernaša ir elektrogenoterapija...15
5.2.3 Ląstelių elektrosuliejimas...16
5.3 Navikų morfologija...16
5.3.1 Bendra navikų charakteristika...16
5.3.2 Navikų ultrastruktūra...18
5.3.2.1 Epidermoidinės plaučių karcinomos (EPK) ultrastruktūra...18
5.3.2.2 Melaniną gaminančio audinio struktūra...19
5.4 Elektrochemoterapija...21
5.4.1 Gydomų navikų morfologiniai pakitimai...22
5.4.2 Morfometrinė analizė………...………...25
6. Tyrimo medžiaga ir metodai
...286.1 Elektroporacija in vitro...28
6.1.1 Ląstelių kultūrų auginimas...28
6.1.2 Elektroporacijos eksperimento eiga...28
6.2 Elektroporacija in vivo...31
6.2.1 Histologinės medžiagos paruošimas...34
7. Rezultatai
...367.1 Mažų molekulių elektropernaša į ląsteles in vitro...36
7.1.1 Ląstelių elektroporacijos efektyvumo vertinimas, naudojant liuciferio geltonąjį...36
7.1.2 Ląstelių elektroporacijos (elektropermeabilizacijos) nustatymas, naudojant bleomiciną...40
7.1.3 Ląstelių elektrosusiliejimo fenomenas stiprių elektrinių impulsų poveikyje...42
7.2.1 Plazmidinės DNR pernašos į ląsteles įvertinimas, taikant skirtingo elektrinio lauko stiprio
trumpų ir ilgų impulsų derinius...45
7.3 Navikų elektrochemoterapinio poveikio tyrimas...52
7.3.1 EPK elektrochemoterapinio poveikio histologinis - morfometrinis tyrimas, taikant antinavikinį preparatą – bleomiciną...52
7.3.2 EPK elektrochemoterapinio poveikio histologinis-morfometrinis tyrimas, taikant antinavikinį preparatą –ciklofosfamidą...62
7.3.2.1 EPK elektrochemoterapinio poveikio efektyvumo tyrimas prklausomai nuo elektroporacijos laiko po ciklofosfamido injekcijos...62
7.3.3 EPK elektrochemoterapinio poveikio citologinis-fluorescentinis tyrimas, taikant antinavikinius preparatus – bleomiciną ir ciklofosfamidą...65
7.3.4 B16 melanomos elektrochemoterapinio poveikio histologinis-morfometrinis tyrimas, taikant antinavikinį preparatą – bleomiciną...68
7.3.5 B16 melanomos elektrochemoterapinio poveikio tyrimas, naudojant antinavikinį preparatą – ciklofosfamidą...70
8. Aptarimas
...749. Išvados
...7910. Literatūros sąrašas
...801. NAUDOTŲ SIMBOLIŲ IR SUTRUMPINIMŲ SĄRAŠAS
f – geometrinis faktorius (sferinės formos ląstelėms f = 1.5) E- išorinio elektrinio lauko stipris
∆Φ0 - ląstelės ramybės potencialas
r – ląstelės spindulys
ν - lipidinių molekulių lateralinių fliuktuacijų dažnumas a – lipidinės molekulės plotas
∆Wf (0) – hidrofilinės poros susidarymo energetinis barjeras
r* - spindulys, atitinkantis energetinio barjero ∆Wf (0) viršūnę
k – Bolcmano konstanta T – absoliuti temperatūra
θ – kampas tarp normalės į ląstelės paviršių ir elektrinio lauko krypties Cm – specifinė membranos talpa
εw – santykinė poros viduje esančio vandens dielektrinė skvarba
εm – santykinė membranos dielektrinė skvarba
∆Φmax – transmembraninis potencialas
kf0 - pradinis poros susidarymo ląstelėje greitis
Fp - ląstelių dalies elektroporacijos tikimybė
DT - didelės amplitudės, trumpieji impulsai MI - mažos amplitudės, ilgieji impulsai EPK - epidermoidinė plaučių karcinoma ECT – elektrochemoterapija
BLM – bleomicinas CPA – ciklofosfamidas V – naviko tūris
a – naviko ilgis, b – naviko plotis LG – liuciferio geltonasis
2. ĮVADAS
Ląstelių eletroporacija – reiškinys, kada taikant elektrinius impulsus, lipidinėse ir lipidinėse - baltyminėse membranose atsiranda mikroporos, todėl padidėja membranos laidumas įvairiems cheminiams junginiams. Išorinio lauko parametrai įtakoja šio proceso grįžtamumą arba negrįžtamumą. Išorinis elektrinis laukas ląstelės membranoje sukelia membraninį potencialų skirtumą, priklausantį nuo padėties, t. y. ląstelės elektroporacija įvyksta tik toje ląstelės membranos vietoje, kurioje membraninis potencialų skirtumas pasiekia kritinę vertę [Bernhardt ir Pauly, 1973]. Šio proceso molekulinis mechanizmas nėra paaiškintas, iki šiol nėra įrodytas fizikinių porų egzistavimas lipidiniame matrikse. Todėl kai kurie autoriai šį procesą vadina elektropermeabilizacija. Šio proceso egzistavimą įrodo viduląstelinių komponentų ištekėjimas arba mažų [Kotnik ir kt., 2000; Puc ir kt., 2003; Pucihar ir kt., 2001; Mir ir kt., 1996] bei didelių molekulių [Sukharev ir kt., 1992; Zaharoff ir Yuan, 2004] patekimas iš aplinkos į ląstelės vidų. Membranos elektropermeabilizacija įvairioms molekulėms priklauso nuo kelių pagrindinių fizikinių parametrų: impulso intensyvumo, trukmės ir impulsų skaičiaus. Vykstant procesui, svarbus parametras yra elektrinio lauko stipris. Jis sukelia staigų transmembraninio potencialo padidėjimą. Kiti impulsų parametrai - trukmė ir skaičius - keičia laidumo efektyvumą. Nustatyti aiškūs skirtumai tarp procesų, kuriuose skirtingo dydžio molekulės praeina pro paveiktą membraną. Mažos molekulės pro laidžią (elektropermeabilizuotą – elektroporuotą) membraną laisvai patenka tada, kai laikas yra ilgesnis už taikyto elektrinio impulso trukmę. Manoma, kad makromolekulių patekimas į citoplazmą įvyksta tada, kai jos naudojamos impulsų taikymo metu. Taikant elektrinį lauką, patekimo mechanizmas yra daug sudėtingesnis negu paprasta mažų molekulių difuzija per laidžią plazminę membraną [Kinosita ir Tsong, 1977; Rols ir Teissie, 1990] ir apima svarbius makromolekulių sąveikos su membrana etapus.
Taikant elektroporaciją, į ląstelės vidų sėkmingai galima įvesti svetimas molekules: mažas ir dideles. Priklausomai nuo taikomų impulsų parametrų (lauko stiprio, impulso trukmės ir skaičiaus), galima išsaugoti ląstelių gyvybingumą. Reikėtų pažymėti, kad elektroporacijos metodas šiuo metu plačiai taikomas. Norint pasiekti terapinį efektą, elektropermeabilizacija naudojama tirti vaistų, oligonukleotidų, plazmidžių įvedimui in vitro ir in vivo. Žinoma, kad vienas seniausių gerybinių ir piktybinių navikų gydymo būdų yra chirurginis, t.y. radikalus naviko pašalinimas. Tačiau pavėluotai diagnozuotų piktybinių navikų chirurginis gydymas dažnai būna neefektyvus, kada jie išplinta į sritinius limfmazgius ir net į kitus organus. Tokie ligoniai gydomi jonizuojančiais spinduliais, jiems taikoma chemoterapija, imunoterapija. Šie gydymo būdai taikomi atskirai arba juos kombinuojant, pavyzdžiui: chirurginis gydymas kombinuojamas su spinduliniu gydymu ir
gyvenimo trukmė didėja 5 ar daugiau metų, tačiau gydymas dažniausiai turi nepageidaujamą šalutinį poveikį paciento sveikatai.
Siekiant sukurti geresnį gydymo būdą, bandomi nauji efektyvūs vaistai arba taikomi kombinuotų terapijų metodai. Pastebėta, kad naudojant elektropermeabilizaciją (elektroporaciją) vaistai, patekę į ląstelės vidų, yra efektyvesni. Todėl sukurtas naujas navikų gydymo metodas, pavadintas elektrochemoterapija (ECT). Šis metodas įrodo, kad kombinuojant elektroporaciją ir chemoterapiją galima padidinti chemoterapinių medžiagų, patenkančių į vėžines ląsteles, kiekį. Dirbdami su eksperimentiniais gyvūnais pirmieji ECT gydymo efektyvumą įrodė Okino ir kt. (1987) ir Mir ir kt. (1991).
Pastaraisias metais elektrochemoterapinis gydymas, pasižymintis naviko augimo slopinimo efektu, pradėtas taikyti žmonėms, gydant plokščialąstelinę galvos ir kaklo odos karcinomą, piktybinę melanomą, adenokarcinomą [Heller ir kt., 1995; Mir ir kt., 1998].
Elektrogenoterapija – biomedicinos kryptis intensyviai tiriama ir vystoma šiuo metu. Čia permeabilizacijos metodas taikomas DNR įvedimui į ląsteles in vitro ar in vivo. Elektrogenoterapija gali būti pritaikyta raumenų distrofijos, eritropoetinės anemijos bei kitų ligų gydymui [Mir ir kt., 1999]. Be to elektroporacija naudojama hibridinių ląstelių, gaminančių specifinius antikūnus, gavimui, norint sukelti ląstelių suliejimą [Zimmermann, 1982; Rols ir Teissie, 1989]. Ląstelių elektrosuliejimas gali būti naudojamas suliejant tos pačios ar kitos rūšies ląsteles, taip pat suliejant jas su audiniais ar liposomomis [Graso, 1989].
Lietuvoje elektropermeabilizacijos (elektroporacijos) metodas buvo sukurtas ir įdiegtas Vytauto Didžiojo universiteto Biofizikos laboratorijoje. Atlikta nemažai darbų in vitro ir in vivo, tiriant elektropermeabilizacijos mechanizmą ir jo taikymą elektrochemoterapijoje. Tyrimais buvo siekiama įvertinti elektrochemoterapijoje taikomo elektrinio lauko parametrus bei elektroporacijos sąlygas. Stebint navikų vystymosi slopinimą veikiant juos antinavikiniais vaistais, būtina ištirti navikų vystymosi dinamiką kiekybiškai. Todėl tyrėme modelines navikų ląsteles, matuodami fluorescuojančių molekulių patekimą in vitro ir atlikdami navikų vystymosi in vivo histologinę analizę.
3. MOKSLINIS DARBO NAUJUMAS
Elektroporacijos metodas mūsų laboratorijoje pradėtas vystyti ir tiriamas daugiau kaip dešimtmetį. Išvystyta elektroporacijos teorija, metodas pritaikytas mažų molekulių pernašai į ląsteles bei modelinių navikų gydymui. Navikų tūrių matavimas iki šiol buvo naudojamas elektrochemoterapinio (ECT) gydymo vertinimui. Šiuo darbu mes parodome, kas vyksta navikiniuose audiniuose, kintant elektrinio lauko parametrams. Eksperimentuose naudojome dviejų tipų perskiepijamus pelių navikus ir atlikome negydytų ir gydytų navikų histologinę – morfometrinę analizę. Be to pastebėjome, kad histologiniuose epidermoidinės plaučių karcinomos preparatuose po elektrochemoterapinio gydymo buvo matyti didelės daugiabranduolės ląstelės, kurių kiekis buvo didesnis tuose navikuose, kuriems taikyti elektriniai lauko parametrai buvo stipresni ir nekrozės kiekis juose buvo didesnis. Yra žinoma, kad tokios didelės daugiabranduolės ląstelės nesidalija ir žūsta, todėl intensyvus ląstelių susiliejimas dėl elektroporacijos galėtų dar paspartinti navikinio audinio irimą. Mūsų turimomis žiniomis ląstelių susiliejimo tyrimai po poveikio elektriniais laukais, daugiausiai buvo atliekami in vitro.
Elektrochemoterapijos efektyvumą tyrėme, dirbdami ne tik su dviem navikų modeliais, bet ir naudodami du skirtingus antinavikinius vaistus jiems gydyti. Tyrimų su navikų modeliais duomenys gali būti naudingi elektrochemoterapijos metodą įdiegiant klinikoje. Nustatėme, kad gydymo efektyvumas priklauso nuo navikų tipo. Taip pat parodėme, kad tyrimų rezultatai priklauso nuo ląstelių linijos. Šį teiginį patvirtina mūsų atlikti eksperimentai in vitro. Skirtingos kilmės ląstelės, taikant to paties elektrinio lauko stiprį, susilieja nevienodai. Mūsų nuomone šį reiškinį galima paaiškinti tuo, kad ląstelių susiliejimo intensyvumas priklauso nuo ląstelių ar audinio ekstraląstelinio matrikso struktūros.
Pirmą kartą atlikome eksperimentus, kuriuose išbandėme įvairias aukštų, bet trumpų ir žemų, bet ilgų impulsų derinius DNR įvedimui. Mūsų tyrimai patvirtino hipotezę, kad DNR elektropernaša yra dviejų stadijų procesas, todėl turime naudoti dviejų impulsų kombinacijas, nes vieni impulsai reikalingi ląstelėms elektroporuoti, o kiti, kad įstumti DNR į ląsteles. Paskutiniais tyrimais parodėme, kad pagrindinį vaidmenį genų elektropernašos efektyvumui kaip tik ir vaidina impulsai, sukeliantys DNR elektroforezę. Nepaisant to, optimalūs elektriniai parametrai, sąlygojantys terapinį efektą, iki šiol nenustatyti.
4. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – ištirti elektropermeabilizacijos (elektroporacijos) metodo efektyvumą,
įvedant mažas bei dideles molekules į ląsteles in vitro ir į navikius audinius in vivo, priklausomai nuo elektrinio lauko parametrų.
Norint įgyvendinti šį tikslą, iškelti uždaviniai:
1. Įvertinti ląstelių elektroporacijos efektyvumą mažų biologiškai aktyvių molekulių (liuciferio geltonojo ir bleomicino) pernašai į modelines ląsteles suspensijoje ir monosluoksnyje, kintant elektrinio lauko stipriui ir trukmei.
2. Įvertinti didelių molekulių (pDNR) elektropernašos į ląsteles in vitro efektyvumą, kai kinta taikomo elektrinio lauko parametrai bei jų deriniai.
3. Įvertinti elektrochemoterapinį poveikį navikams, kai kinta taikomo elektrinio lauko parametrai, atliekant gydytų ir negydytų navikų histologinę – morfometrinę analizę.
4. Įvertinti ląstelių susiliejimo intensyvumą in vitro ir in vivo, priklausomai nuo elektrinio lauko parametrų ir ląstelių linijos.
5. LITERATŪROS APŽVALGA
5.1 Elektroporacijos teorija
Ląstelės membranos elektropermeabilizacijos reiškinys - ryškus membraninio laidumo padidėjimas, sukeliamas naudojant trumpą ir intensyvų išorinį elektrinį lauką. Šis laukas membranoje sukelia potencialų skirtumą (1) [Jaroszeski ir kt., 2000]. Dėl ∆ΨM susidaro
elektroporos [Bernhardt ir Pauly, 1973].
∆ΨM = f E r cos θ (1),
Čia f – geometrinis faktorius (sferinės formos ląstelėms f = 1.5); E- išorinio elektrinio lauko stipris; r- ląstelės spindulys; θ - kampas tarp elektrinio lauko krypties ir ląstelės normalės (5.1 pav.).
5.1 pav. Elektrinio lauko įtaka ląstelės transmembraninio potencialo pokyčiui (Teissie ir Rols, 1993).
Po membranos elektropermeabilizacijos į ląstelę gali patekti jonai, vaistai, dažai ir makromolekulės. Ląstelių pralaidumas kinta dėl ryškaus membranos struktūros pokyčio [Zimmermann ir kt., 1974; Zimmermann ir Neil, 1996; Saulis ir Šatkauskas, 2004]. Atlikti teoriniai ir eksperimentiniai tyrimai nenustatė detalaus elektropermeabilizacijos mechanizmo [Orlowski ir Mir, 1993]. Pabrėžiama, kad lauko sukelti struktūriniai membranos pokyčiai ryškėja laikinais jos laidumo kitimais, kurie apibūdinami kaip laidžios sritys, kanalai ar poros [Weaver ir Chizmadzhev, 1996]. Terminai elektroporacija ir elektropermeabilizacija dažniausiai naudojami kaip sinonimai [Mir, 2001].
Svarbūs tyrimai, nustatant elektroporų susidarymo mechanizmą, atlikti su bisluoksninėmis lipidinėmis membranomis. Duomenys rodo, kad elektroporų susidarymas yra vieno energetinio barjero stochastinis procesas [Glaser ir kt., 1988]. Dėl lipidų molekulių šiluminio judesio, membranoje susidaro hidrofobinės poros, kurios dėl membraninio potencialo virsta hidrofilinėmis
5.2 pav. Lipidinės membranos poros kraštuose esančių lipidų molekulinių persitvarkymų schema. Būsena C parodo uždarą dvisluoksnę būseną. Em=Eind yra indukuotas membranoje laukas, kurio įtakoje pro
membraną patenka vanduo, sudarydamas poras (P): cilindrines hidrofobines (HO) ir invertuotas hidrofilines (HI) poras (Neumann E. ir kt., 2000).
Elektroporacija – tikimybinis procesas. Kai fiksuotas elektrinio lauko stipris, didėjant impulso trukmei, didėja ir elektroporuotų ląstelių dalis. Šio augimo greitis apibrėžiamas pradiniu poros susidarymo ląstelėje greičiu kf0. Ląstelių dalies elektroporacijos tikimybė, priklausoma nuo
elektrinio lauko parametrų, aprašoma lygtimi (2): Fp (E, τ i) = 1 -
∑
= = 1 0 cr n n [ k f0( E ) τi ] n exp [- k f0 ( E) τ i ] / n ! (2),kurioje pradinis poros susidarymo greitis k f0 (E),priklausantis nuo elektrinio lauko stiprio, yra:
k f0 (E)= C
∫
− 1 1 exp [G (∆ Φmax y - ∆Φ0) 2] d y (3), kur C = 2 πνr2 exp [- ∆W f (0) / kT ] / a, G = 0.5πCm ( εw /εm - 1 ) r*2/kT, ∆Φmax= 1,5 E r, y=cos θ.Čia ∆Φ0 - ląstelės ramybės potencialas; r – ląstelės spindulys; ν - lipidinių molekulių
lateralinių fliuktuacijų dažnumas; a – lipidinės molekulės plotas; ∆Wf (0) – hidrofilinės poros
susidarymo energetinis barjeras (5.4 pav.); kai transmembraninis potencialas lygus 0; r* - spindulys,
atitinkantis energetinio barjero ∆Wf (0) viršūnę; k – Bolcmano konstanta; T – absoliuti temperatūra;
E – elektrinio lauko stipris; τ i – impulso trukmė; n – porų skaičius ląstelėje; θ – kampas tarp
normalės į ląstelės paviršių ir elektrinio lauko krypties (5.1 pav.); Cm – specifinė membranos talpa;
εw – santykinė poros viduje esančio vandens dielektrinė skvarba; εm – santykinė membranos
Pateikta (2) lygtis apibūdina a) ląstelės elektroporacijos tikimybės Fp priklausomybę nuo
impulso trukmės τi, kai fiksuotas elektrinio lauko stipris E0 (Fp(τi)) ir b) elektroporacijos tikimybės
Fp priklausomybę nuo elektrinio lauko stiprio E0, kai fiksuota impulso trukmė τi (Fp(E0)). Pastarąją
priklausomybę pagal lygtį (2), kai impulso trukmė 10 ir 100 µs bei ncr = 1 ir 3, iliustruoja 5.3 pav.
[Saulis ir Venslauskas, 1993].
5.3 pav. Teorinė elektroporuotų ląstelių dalies priklausomybė nuo elektrinio lauko stiprio E0
apskaičiuota pagal (2) ir (3) lygybes „standartinei ląstelei“, kai τI = 10 (1 ir 1‘kreivės) ir 100 µs
(ir2‘ kreivės). 1 ir 2 kreivės gautos, kai ncr=1, o 1‘ ir 2‘, kai ncr=3 [Saulis ir Venslauskas, 1993].
Apskaičiuotos teorinės priklausomybės Fp(τi)ir Fp(E0) yra labai panašios į eksperimentines
elektroporuotų ląstelių priklausomybes nuo elektrinio lauko parametrų [Kinosita ir Tsong, 1977; Saulis ir kt., 1991].
Membrana elektroporuojama, kai jos transmembraninis potencialas pasiekia slenkstinę ribą, kuri yra nuo kelių šimtų mV iki 1 - 2 V. Slenkstinė įtampa priklauso nuo impulsų trukmės. Kad įvyktų elektroporacija pastovioje transmembraninėje įtampoje reikalinga impulso trukmė susijusi su temperatūros pakilimu. Aktyvacijos energija, reikalinga elektroporacijai, yra 15 kcal/mol (5.4 pav.). Kada transmembraninė įtampa pasiekia kritinę ribą, poros atsiranda per kelias mikrosekundes. Tai - hidrofobinės poros. Ilgesni elektriniai impulsai suformuoja didesnes poras. Po elektroporacijos membrana atsistato po kelių milisekundžių, o galutinis atsistatymas gali trukti kelias sekundes, minutes ar net valandas.
Jei porų dydis ir skaičius membranoje viršija tam tikrą kritinį dydį, ląstelės membrana yra mechaniškai suardoma. Elektriniam laukui veikiant membraną, joje susiformuoja įvairių tipų poros. Tai gali būti hidrofobinės poros, hidrofilinės, poros tarp baltymų ir lipidų ar tik tarp baltymų.
Vadinasi, tinkamai nustačius eksperimentines sąlygas, membranos elektroporacija yra grįžtamasis reiškinys. Elektrinio lauko poveikio metu atsiradusios poros pradeda mažėti, o po kurio laiko išnyksta visai. Šiam reiškiniui įtakos turi temperatūra. Kuo ji aukštesnė, tuo sparčiau poros užsiveria. Kuo didesnė pora, tuo ilgiau trunka jos išnykimas. Atsižvelgiant į porų dydį, skiriami trys užsivėrimo etapai: staigus poros užsidarymas (< 1 s), lėtas poros užsidarymas (∼ 2-10 min), pilnas poros užsidarymas (>10 min) [Weaver ir Chizmadzhev, 1996; Saulis ir kt., 1991; Saulis 1997]. Nustatyta, kad porų mažėjimas priklauso nuo suspensinės terpės joninės jėgos, osmosinio slėgio, membranoje esančių struktūrų, citoskeleto, tačiau nepriklauso nuo elektrinio lauko parametrų.
5.4 pav. Poros energijos (W) priklausomybė nuo poros spindulio nesant (1 kreivė) ir esant (2 kreivė) transmembraninio potencialo pokyčiui. Sritis, kai poros spindulys (r) yra mažesnis už kritinę poros spindulio reikšmę (r < r∗) - nurodo hidrofobines poras, kai r > r∗ - hidrofilines poras. Iš hidrofobinių porų susiformuoja
hidrofilinės poros, kurias nuo užsidarymo apsaugo energijos barjeras ∆Wr (∆фm). Transmembraninio potencialo pokytis
(∆фm) sumažina porų formavimosi barjerą ∆Wf (∆фm) bei padidina porų užsidarymo barjerą ∆Wr (∆фm). Kai ∆фm didesnis,
poros spindulys, atitinkantis lokalios energijos minimumą, (rm (∆фm) didėja [Saulis ir Venslauskas, 1993a].
Elektropermeabilizacija plačiai naudojama medicinoje, biologijoje, imunologijoje, pritaikoma vaistų įvedimui, genų perkėlimui, ir t.t [Jaroszeski ir kt., 2000; Zimmermann ir kt., 2000; Neumann ir kt., 1993; Dimitrov, 1995]. Elektroporacijos efektyvumas priklauso nuo įvairių parametrų: elektrinio lauko stiprio [Lebar ir Miklavčič, 2001], įvedamų molekulių kiekio, jų dydžio. Ieškant optimalių parametrų sujungimo, atliekami bandymai, pritaikant teorines ir eksperimentines žinias [Šel irk t., 2005; Pavšelj irk t., 2005].
Įvairiems tikslams naudojant elektroporaciją, turi būti nustatomi impulsų parametrai: impulsų amplitudė, forma, skaičius [Kotnik ir kt., 2001 a, 2001 b; Kotnik ir kt., 2003]. Kada impulsų amplitudė per maža, tuomet elektroporacija nevyksta, o kai ji per didelė - sukeliama
amplitudė ir užtikrintas geriausias medžiagų patekimas elektroporuojant, naudojami dažai: propidžio jodidas, tripano mėlis, liuciferio geltonasis ir daugelis kt.
5.2 Elektroporacijos metodo taikymas
5.2.1 Mažų molekulių elektropernaša į ląsteles
Buvo atlikta daug bandymų su ląstelėmis in vitro įvedant įvairias medžiagas [Zimmermann ir kt., 2000]. Rezultatai rodo, kad elektroporuojant galima įvesti į ląstelę mažos ir didelės molekulinės masės medžiagas, kurios įprastomis sąlygomis ten negali patekti [Jaroszeski ir kt., 2000; Wegener ir kt., 2002; Šatkauskas ir Saulis, 2004]. Vėliau pabandyta įvairius vaistus įvesti į piktybines ląsteles. Buvo nustatyta ir kokie vaistai tinka elektrochemoterapijai. Plačiausiai išnagrinėtas – bleomicinas [Jaroszeski ir kt., 2000; Mekid ir kt., 2003; Pron ir kt., 1999] Tai hidrofilinė medžiaga, kuri sunkiai prasiskverbia per ląstelės plazminę membraną, bet yra stipriai citotoksiška [Poddevin ir kt., 1991; Mir ir kt., 1996]. Jos poveikis išauga labiau (net iki 1000 kartų), kada ląstelė yra elektroporuojama [Tounekti ir kt., 1993]. Šis vaistas efektyvus gydant odos karcinomos ir melanomos ląsteles. Bleomicinas yra alkilinanti medžiaga, suardanti viengubą ar dvigubą DNR. Pirmiausia šis vaistas buvo išbandytas ląstelėms in vitro. Pastebėjus teigiamą poveikį, vėliau atlikti bandymai su ląstelėmis in vivo. Pirmiausia bandymai atlikti su įvairiais gyvūnais: pelėmis, žiurkėmis, jūros kiaulytėmis, triušiais, katėmis, šunimis ir arkliais. Buvo gydomi įvairūs augliai raumenyse, kepenyse ir smegenyse (sarkomos, karcinomos, melanomos ar neuroblastomos). Nustatyta, kad vaistai pasisavinami geriausiai, kada elektroporuojama praėjus 3 min. po vaisto injekcijos į auglį, o elektroporavus prieš suleidžiant vaistus, efektyvumas labai mažas. Geram priešnavikiniam gydymui svarbu ir kokie elektrodai naudojami. Efektyvūs elektrodai yra plokštelių pavidalo, tarp kurių yra nuo 4 iki 8 mm tarpas, optimaliausias impulsų skaičius – 8 impulsai, amplitudė nuo 1100 iki 1300 V/cm, impulsų trukmė 100 µs ir dažnis 1 Hz [Čemažar ir kt., 1995; Miklavčič ir kt., 1998; Serša ir kt., 1996]. Elektrochemoterapijoje efektyvūs ir adatų pavidalo elektrodai, tačiau jie generuoja mažesnio intensyvumo elektros impulsus.
Rezultatai rodo, kad elektroporacija yra efektyvi priemonė elektrochemoterapijoje, gydant navikines ląsteles. Elektrochemoterapija galėtų būti apibūdinama kaip sudėtinis navikų gydymas, susidedantis iš vaistų injekcijos (pvz., bleomicino) į naviką ir elektrinio lauko poveikio [Gothelf ir kt., 2003]. Veikiant naviką stipriais elektriniais laukais, jo plazminėje membranoje susidaro mikroporos. Į ląstelę pro šias poras gali patekti citotoksinio preparato molekulės, kurios normaliomis sąlygomis neprasiskverbia. Preparatas, patekęs į vidų, veikia stipriau. Pagrindiniai
derinių parinkimas [Lebar ir kt., 2001; Pucihar ir kt., 2002]. Elektrochemoterapijos dėka pagrindiniai tyrimai šiuo metu atliekami parenkant mažesnes vaistų dozes, siekiant maksimalaus antinavikinio gydymo efekto.
5.2.2 Genų elektropernaša ir elektrogenoterapija
Elektroporacija tapo itin populiari kaip efektyvi priemonė [Jaroszeski ir kt., 2000], įvedant per membraną genetinę medžiagą į ląsteles ir audinius, pvz., panaudojant įvairias žinduolių rūšis, vabzdžių [Mann ir King, 1989], pirmuonių [Laban ir Wirth, 1989] ir augalų ląsteles [Shillito ir kt., 1985], sveikas bakterijas [Satoh ir kt., 1990], mieles [Meilhoc ir kt., 1990]. Toks įvedimo būdas pavadintas elektrogenoterapija. Pirmasis, pritaikęs šį įvedimo būdą, su ląstelėmis in vitro yra Neumann (1982). Nuo tada elektroporacija tapo populiaria ir efektyvia technologija, įvedant svetimą DNR į bet kokių organų ląsteles ir audinius in vivo, pvz., į raumenis [Mir ir kt., 1999; Mathiesen, 1999], navikus [Rols ir kt.,1998; Heller ir kt., 2000; Lucas ir kt., 2002], kepenis [Heller ir kt., 1996; Liu ir Huang, 2002], odą [Zhang ir kt., 2002], blužnį [Tupin ir kt., 2003], pelės sėklides [Muramatsu ir kt., 1997], arterijas [Young ir kt., 2003] ir į nervinį audinį [Haas ir kt., 2002; Kolle ir kt., 2003; Martinez ir Hollenbeck, 2003]. DNR įvedimas į raumeninį audinį tyrinėjamas labiausiai, nes plazmidę lengva įšvirkšti tiesiai į raumenį ir dėl jo sugebėjimo sintetinti baltymus [Sun ir kt., 2003; Wang ir kt., 2003]. Tiesioginis genų įvedimas gali būti pritaikytas įvairių ligų gydymui: raumenų distrofijos [Vilquin ir kt., 2001], vakcinacijai [Bachy ir kt., 2001], hemofilijai B [Fewell ir kt., 2001], eritropoetinės anemijos [Maruyama ir kt., 2001], virusiniam miokarditui [Nakano ir kt., 2001], diabetui [Yin ir kt., 2001], glomerulonefritui [Nakamura ir kt., 2001] ir navikų gydymui [Hanna ir kt., 2001; Li ir kt., 2001]. Elektrinio lauko parametrai efektyviai genų elektropernašai pasiekti yra labai skirtingi. Elektroporuojant raumenis taikytas elektrinis laukas, kurio stipris 200, 900 V/cm, o impulso trukmė τ – 50 ms, 100 µs, kepenys elektroporuotos, kai E – apie 100 V/cm, trukmė – 50 ms [Yamashita ir kt., 2001]. B16 melanomos elektrogenoterapiniuose tyrimuose taikytas E – 100, 170 V/cm, τ – 100, 50 ms, impulsų skaičius, n – 6 [Kishida ir kt., 2001; Lohr ir kt., 2001], o storosios žarnos karcinomos E – 66 V/cm, τ – 5 ms, impulsų skaičius, n – 8 [Tamura ir kt., 2001].
Didelės DNR molekulės perkėlimo mechanizmas per elektropermeabilizuotą membraną yra skirtingas negu smulkių hidrofilinių molekulių patekimas paprastos difuzijos būdu. Norint geriau suprasti šį mechanizmą, buvo nuspręsta, kad DNR elektroperkėlimas yra efektyvesnis, kada panaudojami ilgesni elektriniai impulsai [Golzio ir kt., 2002; Müller ir kt., 2003]. Kadangi DNR yra daugiaanijoninė molekulė, tikėtina, kad ilgi impulsai gali paveikti membraną ir sukelti DNR elektroforezę. Šis dvigubas efektas buvo pademonstruotas in vivo ląstelėse bei
eksperimentuose, panaudojant dviejų tipų elektrinius impulsus: DT (didelės amplitudės, trumpuosius impulsus) ir MI (mažos amplitudės, ilguosius impulsus). Zaharoff (2002) naudodamas ilguosius impulsus, įrodė, kad DNR judrumas pradinėje būsenoje stipriai pasikeičia dėl elektroporacijos elektriniais impulsais sukeliamų jėgų. Buvo nustatyta, kad DNR perkėlimo mechanizmas į raumenis in vivo yra daugiapakopis procesas:
1. Injekcija ir DNR pasiskirstymas audinyje. 2. Ląstelių permeabilizacija.
3. Tikėtinas geresnis DNR pasiskirstymas permeabilizuotame audinyje.
4. Elektroforeze pasiekiamas DNR perkėlimas audinyje [Šatkauskas ir kt., 2002].
5.2.3 Ląstelių elektrosuliejimas
Ląstelių susiliejimas. Ląstelių plazminė membrana apsaugo ląstelės turinį nuo išorinių
molekulių patekimo ir neleidžia spontaniškai susilieti dviem skirtingoms ląstelėms. Po tam tikrų procedūrų ląstelės paviršiuje ši riba gali būti apeita [Heller, 1993; Velizarov ir kt., 1998; Grasso ir kt., 1989; Ramos ir kt., 2002; Raffy ir Teissie, 1997].
Dviejų ar daugiau ląstelių susiliejimas gali būti sukeltas tų pačių elektrinių impulsų, kurie naudojami elektroporacijoje [Heller ir Grasso, 1990; Dimitrov, 1995; Zimmermann ir Neil, 1996]. Buvo atlikti tyrimai ir pastebėta, kad elektriniai impulsai sukelia ir ląstelių susiliejimą [Senda ir kt., 1979].
Ląstelių susiliejimas gali įvykti tada, kai liečiasi ląstelių membranos [Heller ir Grasso, 1990; Haritou ir kt., 1996]. Molekulinis mechanizmas, sukeliantis ląstelių susiliejimą, nėra žinomas. Manoma, kad ląstelė tampa pralaidi, kai membranos potencialų skirtumas pasiekia 200 mV kritinę ribą [Teissie ir Rols, 1993]. Tačiau nėra aišku, ar šie procesai (ląstelės membranos pralaidumas ir gebėjimas kelioms ląstelėms susilieti) yra susiję tarpusavyje.
Ląstelių susiliejimas gali būti panaudotas suliejant skirtingas ląsteles, t.y. sukuriant hibridomas, imunoterapijoje ir kituose tyrimuose.
5.3 Navikų morfologija 5.3.1 Bendra navikų charakteristika
Navikas (blastoma) – tai pakitusių ląstelių darinys, kurio pagrindinis požymis yra vieno ar kito organo ląstelių dauginimasis. Šis procesas pasižymi morfologiniu ir biocheminiu atipizmu (netvarkingumu).
Navikų augimas gali būti įvairių cheminių ir fizikinių faktorių, virusų, traumų poveikio organizmui rezultatas. Navikas susiformuoja po ilgai trukusių uždegiminių, opinių (skrandžio opa), dishormoninių ir kt. procesų, vadinamų ikivėžiniais (ikinavikiniais). Stiprūs pažeidimai audiniuose - normalių ląstelių virtimo vėžinėmis priežastis. Šie pažeidimai sąlygoja biologinius ir paveldimų savybių pokyčius tam tikros grupės ląstelėse, kurios formuoja blastomatinį židinį, kuriame vėliau išsivysto navikas. Taigi, blastomų susidarymo šaltinis - proliferuojantys augimo centrai, įtraukiantys retikulines ir perivaskuliarines įvairių organų ir audinių ląsteles, osteoblastus, chondroblastus, ištekamųjų liaukų epitelį ir kitus elementus, kuriuose pažeisti (užlaikyti, iškraipyti, apsunkinti) specifinės diferenciacijos procesai.
Naviką sudaro parenchima ir stroma. Parenchimą sudaro naujo darinio specifiniai elementai, o stromą – jungiamasis audinys su kraujagyslėmis ir nervais.
Gerybinių navikų parenchima sudaryta iš pakankamai diferencijuotų ląstelių. Pagal struktūrą šie navikai panašūs į pradinį audinį (homologiški, homotipiški navikai) [Rubin, Farber, 1988].
Piktybiniai navikai yra tie navikai, kurių parenchima sudaryta iš mažai arba visai nediferencijuotų ląstelinių elementų. Jie turi labai nedidelį panašumą į “motininį” audinį. Piktybiniuose navikuose ypač ryškus audinio ir ląstelių atipizmas.
Ląstelinis atipizmas dažnai charakterizuojamas formos pakitimu, ląstelių branduolių ir parenchimos ląstelių padidėjimu, ląstelės elementų polimorfizmu ir kartais pasitaikančiomis gigantinėmis ląstelėmis su vienu ar keliais išsigimusiais hiperchrominiais branduoliais. Be to, piktybinių darinių parenchimoje matoma daugybė mitozių [Rubin ir Farber, 1988].
Navikai, ypatingai piktybiniai, išsiskiria ne tik audinio organizacijos atipizmu ir parenchimos ląstelių morfologija, bet ir ultrastruktūros ypatumais ir histocheminiais savitumais [Stalioraitytė ir kt., 1986, 2001].
Piktybinių darinių ląstelėse išsiskiria mitochondrijų polimorfizmas, ER granuliuotų membranų apimties sumažėjimas, laisvų ribosomų ir poliribosomų padidėjimas hialoplazmoje. Piktybinių darinių ultrastruktūra rodo šių darinių žymų morfologijos supaprastėjimą. Tada gali susidaryti naujos ląstelinių elementų populiacijos ir navikas progresuoja [Rubin ir Farber, 1988].
Kada naviko ląstelėse specifinių baltymų sintezė sumažėja, tada ląstelėse padidėja struktūrinių baltymų, naudojamų ląstelių masės padidinimui. Tai paaiškina ląstelių ultrastruktūros pasikeitimą, kai ER tinklas ir GA sunyksta [Stalioraitytė ir kt., 1986, 2001].
Augant pradiniam navikui, išryškėja jo ląstelių morfologinis ir biocheminis atipizmas. Tai nulemia naviko "savarankiškumą", jo progresiją.
Navikuose žymūs ir antriniai pokyčiai: distrofijos, nekrobiozė, nekrozė, pūliavimas, susilydimas, kraujosrūvos ir kt. Antrinių pokyčių priežastys skirtingos. Dažnai jie įvyksta dėl spindulinės terapijos, chemoterapijos ir kt.
5.3.2 Navikų ultrastruktūra
Histologiškai navikai primena tuos audinius, iš kurių yra susidarę. Navikinis audinys skiriasi nuo normalaus – jis būna atipiškas (netvarkinga audinio struktūra). Piktybiniuose navikuose ląstelių atipizmas ypač ryškus. Kitas būdingas navikų ląstelių bruožas yra anaplazija: ląstelės nebesugeba pakankamai subręsti ir diferencijuotis, yra praradusios struktūros specifiškumą, funkcines atitinkamo audinio ypatybes.
Morfologinę anaplaziją atspindi ląstelių polimorfizmas: ląstelės būna nevienodo dydžio ir formos, didesniais negu įprastai ir įvairiai besidažančiais branduoliais. Navikiniame audinyje mitozių daug, jos dažnai vyksta netaisyklingai [Stalioraitytė ir kt., 1986, 2001; Stevens ir kt., 2002]. Chromosomų skaičius vėžinėse ląstelėse skiriasi nuo normalių ląstelių skaičiaus: vienose jis didesnis, kitose mažesnis.
Piktybinio naviko ląstelių citoplazmoje nebelieka specifinių struktūrų arba jos pakinta. Beveik visuomet sumažėja mitochondrijų, jos būna įvairios: pabrinkusios, susitraukusios, vakuolizuotos. Šie mitochondrijų pakitimai būdingi ne vien navikui [Stalioraitytė ir kt., 1986; Ghadially, 1988].
Fizinėmis ir cheminėmis savybėmis navikinių ląstelių apvalkalai skiriasi nuo normalių. Todėl navikinės ląstelės nėra taip glaudžiai tarpusavyje susijusios kaip normalios, jos nesudaro įprastinių struktūrų ir greitai išsilaisvina iš kompleksų. Visų navikinių ląstelių membranos yra pralaidesnės negu normalių ląstelių [Stalioraitytė ir kt., 1986; Stevens ir kt., 2002].
Navikai parazituoja organizme, o augimui reikalingas medžiagas pasisavina iš sveikų ląstelių. Degeneracija ir nekrozė prasideda naviko centrinėje dalyje pasiekus tam tikrą dydį, kadangi trūksta maisto medžiagų ir deguonies. Nepilnavertės kraujagyslės nebesugeba naviko aprūpinti šiais produktais.
5.3.2.1 Epidermoidinės plaučių karcinomos (EPK) ultrastruktūra
EPK – C57Bl linijos pelėse spontaniškai kilęs navikas, kuris buvo palaikomas sėkmingos transplantacijos dėka. Šis navikas buvo apibūdintas kaip anaplastinė epidermoidinė karcinoma. Kadangi EP karcinoma spontaniškai metastazuoja į plaučius ir yra atspari daugeliui chemoterapinių preparatų, ji naudojama kaip eksperimentinių tyrimų medžiaga.
Naviko metastazes į plaučius galima paaiškinti šiais naviko periferinei zonai būdingais požymiais:
2. Mažai mikrogaurelių, daug citoplazmos išaugų. 3. Silpnai išvystyti citoplazmos organoidai. 4. Menki tarpląsteliniai ryšiai.
5. Dideli tarpląsteliniai tarpai ir negausūs tarpląsteliniai komponentai. 6. Nepilnavertės kraujagyslės.
Navikinių ląstelių forma įvairi. Branduolių forma netaisyklinga, būdingos gilios invaginacijos ir vidiniai citoplazmos intarpai. Dažnai pastebimos ir daugiabranduolės didelės ląstelės. Daugiausia chromatinas būna susitelkęs periferijoje, ties branduolio membrana. Branduolėliai dideli, sudaryti iš "granulingų" komponentų. Gausu laisvų ribosomų [Sato ir kt., 1982].
Naviko periferijoje ląstelės išsisklaidžiusios laisvai ir yra pleomorfiškos. Ląstelių paviršiuje daug citoplazminių išaugų ir yra nedidelis kiekis trumpų ir bukų mikrogaurelių. Naviko centrinės srities link ląstelės yra arčiau viena kitos ir sudaro glaudžią struktūrą. Pastebima daugiau išaugų ir trumpų desmosomų tarp kaimyninių ląstelių. Augant navikui, nekrozės sričių daugėja, tačiau uždegiminių ląstelių reta. Tarp gyvybingų navikinių ląstelių dažnai stebimos ir išsigimusios ląstelės. Išnykusios kolageno skaidulos, nerasta ir elastinių skaidulų. Kraujagyslės nepilnavertės, kartais neturinčios endotelinių ląstelių sluoksnio. Būdingos ilgos ir vingiuotos citoplazminės invaginacijos. Raudonieji kraujo kūneliai pro nykstančias endotelio ląsteles patenka į ekstravaskuliarinę sritį. Kraujagyslės arti nekrozės sričių ne visada būna sunykusios. Limfagyslių nerasta [Sato ir kt., 1982; Hilario ir kt., 1991; Grunt ir kt., 1986].
Tiriant navikinių ląstelių ultrastruktūrą nustatyta, kad epidermoidinės karcinomos ląstelės turi gerai išvystytas desmosomas ir sudėtingas invaginacijas tarp ląstelių, daug tonofibrilių citoplazmoje ir silpnai išvystytus citoplazmos organoidus [Sato ir kt., 1982].
Aptartieji navikinių ląstelių požymiai paaiškina šių ląstelių sugebėjimą lengvai atsiskirti nuo naviko ir metastazuoti [Sato ir kt., 1982; Hilario ir kt., 1991].
5.3.2.2 Melaniną gaminančio audinio struktūra
Pigmentą gaminančios ląstelės odoje pasiskirsčiusios nevienodai. Jos išsidėsto didesnėmis ar mažesnėmis krūvelėmis.
Pigmentiniai apgamai (naevi pigmentosi) dažniausiai nedidėja ir nesukelia liguistų požymių. Tačiau juos dažnai traumuojant, o kartais ir dėl visai nesuprantamų priežasčių, jie gali virsti piktybiniais navikais – melanomomis (melanoma malignum, melanoblastoma, 5.5 pav.). Tada pigmentinis apgamas didėja, virsta mazgeliu, kartais opėja.
5.5 pav. Piktybinis melanocitų navikas – B16 melanoma. Ląstelės polimorfiškos, stambios, branduoliai atipiški, su dideliais branduolėliais, mitozių skaičius įvairus. (Mūsų tiriamojo objekto – B16 melanomos - fotografija).
Naviką sudaro šviesios daugiakampės ląstelės, kuriose yra tamsaus pigmento (melanino) grūdelių (pav. 5.5). Tamsaus pigmento būna ir tarp ląstelių. Mikroskopinė naviko struktūra kartais primena karcinomą, o kartais sarkomą. Labai retai pasitaiko nepigmentuotų melanomų. Pagrindinė melanomos ypatybė yra ta, kad ji labai anksti ir gausiai metastazuoja į visus organus [Stevens ir kt., 2002; Stalioraitytė ir kt., 1986].
B16 melanomos ląstelių diferenciacija (melanino sintezė), nekrozės laipsnis ir ekstraląstelinio matrikso kiekis, ląstelių dauginimosi greitis priklauso nuo aplinkos sąlygų audinyje.
Naviko (B16 melanomos) centrinėje dalyje, tarp navikinių ląstelių, yra daug mažų kraujagyslių. B16 melanomos ląstelės panašios į epitelines ląsteles, nelabai gausiai pigmentuotos ir pasižymi dideliu mitotiniu aktyvumu. Šios ląstelės išsidėsčiusios ne tik šalia kraujagyslių, bet ir ties jungiamuoju audiniu. Tarpląsteliniai tarpai tarp B16 melanomos ląstelių labai siauri arba jų iš viso nėra. Periferinėje dalyje navikinės ląstelės yra labiau pigmentuotos, daugiau ląstelių su citoplazminėmis išaugomis ir piknotizavusiais branduoliais. Tarp ląstelių pastebėti didesni tarpląsteliniai tarpai. Nustatyta, kad jei atstumas tarp kraujagyslių sienelių ir navikinių ląstelių yra maždaug 150 µm arba daugiau, navike pastebima nekrozė. Tačiau nekrozė gali įvykti, kai atstumas 30µm [Marie-Claire ir kt., 1988; Stevens ir kt., 2002; Turusov ir Mohr, 1994].
5.4 Elektrochemoterapija
Vienas pagrindinių piktybinių navikų bruožas tas, kad jie nelieka ten, kur pradėjo augti, o plinta po visą organizmą.
Navikų plitimą iš dalies nulemia tai, kad ląstelės tarpusavyje nėra glaudžiai susijusios. Jos judrios ir nepaklūsta kontaktinio slopinimo dėsniui. Navikas pradeda metastazuoti, kai navikinės ląstelės (pavienės ar grupelėmis) patenka į limfagysles ir kraujagysles, kai navikas perauga jų sieneles. Manoma, jog navikas neplinta, kol organizmas pajėgus gintis. Bet kuris navikas nuolat progresuoja piktybėjimo kryptimi, nes ląstelės tampa vis autonomiškesnės [Stalioraitytė ir kt., 1986]. Jeigu piktybinis navikas pašalinamas ne visai radikaliai arba jį ne visą sunaikina spinduliai ar vaistai, jis greitai recidyvuoja [Stalioraitytė ir kt., 1986, 2001].
Įvadinėje šio darbo dalyje buvo minėta, jog seniausias navikų gydymo būdas yra chirurginis. Vėlai diagnozuotiems piktybiniams navikams gydyti skiriama spindulinė terapija, priešnavikiniai vaistai. Tačiau vėžinės ląstelės nelinkusios lengvai absorbuoti vaistus, todėl reikia didelių dozių, kad gydymas būtų efektyvus.
Kuriami įvairūs navikų gydymo būdai, nes siekiama išvengti chemoterapinių vaistų šalutinio poveikio. Vienas iš metodų – tai elektrochemoterapija (ECT). Tai gydymas, kada elektriniai impulsai naudojami vaisto įvedimui į ląsteles. Tokiu būdu siekiama teigiamų gydymo rezultatų, vartojant mažesnes vaistų dozes. Moksliniais tyrimais įrodytas elektrochemoterapijos metodo efektyvumas [Gothelf ir kt., 2003; Mir ir Orlowski, 1999], kurį nulemia keletas veiksnių: elektrinio lauko stipris[Jaroszeski ir kt., 2001 a], impulso trukmė [Okino ir kt., 1992], impulsų skaičius [Šatkauskas ir kt., 1998 a]; vartojamas vaistas, jo injekcijos būdas ir laikas [Labanauskienė ir Šatkauskas, 2000]. Taip pat reikia nepamiršti ir biologinius veiksnius: audinio tipą, organizmo imuninę organizmo sistemą, kraujotakos sutrikimus po elektroporacijos [Čemažar ir kt., 2001 a; Gehl ir kt., 2002]
Trumpi ir intensyvūs elektriniai impulsai naudojami įvedant svetimas medžiagas į gyvą ląstelę. Veikiant gyvų ląstelių suspensiją ar ląsteles audinyje stipriais elektriniais laukais, ląstelių plazminėje membranoje susiformuoja mikroporos, per kurias gali vykti medžiagų transportas į ir iš ląstelės. Šis reiškinys buvo pavadintas elektroporacija [Belehradek ir kt., 1994].
Tokiu būdu pro ląstelių plazminę membraną gali patekti įvairios hidrofilinės medžiagos, kurioms intaktinės ląstelės plazminė membrana nelaidi arba mažai laidi [Mir ir kt., 1995; Mir ir kt, 1991; Kanesada, 1990; Jaroszeski ir kt., 2001 a, 2001 b]. Kombinuojant ląstelių elektroporaciją ir chemoterapiją, galima padidinti chemoterapinio preparato, pvz. bleomicino, patenkančio į navikines
ląsteles, kiekį. Šio metodo dėka gerokai padidėja priešvėžinių vaistų citotoksinis poveikis [Belehradek ir kt., 1994; Yabushita ir kt.,1997; Heller ir kt.,1995; Gothelf ir kt., 2003].
5.4.1 Gydomų navikų morfologiniai pakitimai
Yra navikų, kuriuos chirurgiškai gydyti nebūtina. Kai kurias karcinomas galima išgydyti jonizuojančiais spinduliais. Šiems spinduliams jautresnės greitai besidauginančios ląstelės. Apšvitinto naviko audinyje ląstelių branduoliai ir pačios ląstelės iš pradžių didėja, vėliau pamažu pažeidžiamos, kol masiškai pradeda nykti. Patologinis židinys randėja, vėliau hialinizuojasi. Atsižvelgiant į naviko jautrumą, šie procesai plėtojasi greičiau ar lėčiau, tačiau specifinių ląstelių pakitimų spinduliai nesukelia [Stalioraitytė ir kt., 1986, 2001].
Karcinomos chemoterapijai vartojami alkilinantys junginiai, antimetabolitai, antibiotikai, augalinės kilmės preparatai. Šios medžiagos veikia ne tik piktybinių navikų, bet ir kitų organų greitai besidauginančias ląsteles, ypač kraują gaminančių organų, žarnų ir kt. Cheminiais preparatais gydomų navikų morfologiniai pakitimai nėra specifiški: ląstelių žuvimo mechanizmas yra analogiškas natūraliam jų žuvimui. Šis procesas nuo natūralaus skiriasi kiekybiškai. Tačiau naviko irimas, vartojant chemoterapines priemones, gali turėti ir specifinių savybių [McRae ir kt., 1999].
Pirmieji ląstelių pakitimai nuo daugelio citostatikų yra branduolių ir mitochondrijų padidėjimas. Vėliau pradeda irti mitochondrijų kristos ir endoplazminis tinklas. Citoplazmoje atsiranda vakuolių ir riebalų lašelių, mažėja ribonukleino rūgštis. Kai kurie preparatai, pavyzdžiui, vinkaleukoblastinas, pirmiausia sutrikdo ląstelių mitozes. Chromosomos tampa amorfine mase. Tačiau greta irstančių ląstelių nemaža ir tokių, kurios tebesidaugina mitozės ar amitozės būdu, kuriam nebūdingas ryškesnis branduolio ir citoplazmos pakitimas. Dėl šios priežasties atsiranda nemaža stambių, gigantiškų ląstelių su keliais ar net daugeliu branduolių. Pažeistos ląstelės žūva. Jeigu žūva daug ląstelių, nekrozuoja kai kurie naviko plotai arba jis visas. Kartu pakinta ir naviko stroma. Suaktyvėja rezorbcinė makrofagų funkcija, navikas randėja. Taigi sėkmingo gydymo rezultatas - naviko nekrozė ir židinio surandėjimas.
Vienas navikų chemoterapijoje vartojamų antibiotikų yra bleomicinas. Bleomicinas (BLM) - tirpus vandenyje glikopeptidinis antibiotikas, pasižymintis antineoplastiniu citotoksiškumu ir vėžiui gydyti vartojamas vienas arba kombinuotoje chemoterapijoje. Mokslininkas Umezawa 1963 m. vaistą atrado Streptomyces verticillus grybų kultūroje. Šis vaistas vartojamas įvairiems vėžio tipams gydyti (Hodgkin'o ligai, plokščialąstelinei galvos ir kaklo odos karcinomai ir kt.) [Čemažar ir kt.,
Ląstelės viduje BLM yra labai citotoksiškas. Jis sukelia viengubos arba dvigubos DNR grandinės trūkius. Tačiau antibiotiko difuzija per intaktinės ląstelė plazminę membraną yra apsunkinta. Elektroporacijos metodo panaudojimas leidžia padidinti BLM kiekį, patenkantį į ląsteles. Tokiu būdu buvo padidintas antinavikinis vaisto efektyvumas. Elektrochemoterapijoje buvo vartojami ir kiti chemoterapiniai preparatai. Efektyvus buvo cisplatinos panaudojimas [Čemažar ir kt., 2001 a]. ECT tyrimuose pastebėtas žymus naviko augimo sustabdymas lyginant su navikais, gydytais chemoterapiškai. Elektrochemoterapijos efektyvumą įrodė pirmieji klinikiniai bandymai gydyti bazalinės ląstelės karcinomą, piktybinę melanomą, plokščialąstelinę galvos ir kaklo karcinomą bei krūties adenokarcinomą [Čemažar ir kt., 1998; Huang ir kt., 1996].
Atlikti histologiniai tyrimai rodo, kad pelių navikuose, kuriems taikyta ECT, pastebėtos didelės nekrozės sritys ir mažas kiekis sveikų navikinių ląstelių. Tuo tarpu negydytų ar tik iš dalies gydytų pelių navikai buvo nepakitę ir tebeaugo. Pritaikius vien tik elektrinius impulsus, po 2 - 3 dienų buvo pastebėti edemos (pabrinkimo) požymiai [Belehradek ir kt., 1994; Heller ir kt.,1995; McRae ir kt., 1997].
Elektrochemoterapiškai gydytų CaSKi (gimdos kaklelio plokščialąstelinė karcinoma) navikų histologinė analizė taip pat parodė navikinių ląstelių degeneraciją ir nekrozę. Po elektrochemoterapinio gydymo per elektroninį mikroskopą galima pamatyti branduolio membranos įtrūkimus ir jungčių tarp ląstelių praradimus. Gydymas tik bleomicinu ar elektriniais impulsais didelės įtakos naviko augimui (lyginta su kontrole) neturėjo. Po elektrinio šoko apie elektrodų buvimo vietą buvo pastebėta lokali trumpalaikė edema, kuri dingo per 6 val. [Yabushita ir kt., 1996].
Įskiepyto pelėms naviko Hep - 2 tyrimuose buvo pastebėtas ir elektroporacijos efektyvumas. Dėl šio poveikio buvo matoma naviko regresija: susidarė šašas, kuris sausėjo, po to nukrito, palikdamas nepažeistą odos dalį [Nanda ir kt., 1998].
ECT tyrimai atlikti ir su triušių kepenų navikais. Nustatyta, kad vien BLM, vartojant 0,5 mg/kg dozę, sveikame audinyje nesukėlė histologinių pakitimų. Navikiniame audinyje tokios pačios bleomicino dozės sukeltos nekrozės sritis sudarė 10 proc. naviko tūrio. Audiniuose, kuriems buvo taikyti tik elektriniai impulsai, pastebėta tiesioginė audinio spalvos pasikeitimo reakcija elektrinių impulsų veikimo srityje. Kituose organuose, kurie taip pat buvo veikti elektriniais impulsais, pastebėtas kraujotakos pažeidimas. Šis pažeidimas trumpalaikis, tetrukęs 15 - 20 min. Po to audiniai greitai atgaudavo savo tikrąją spalvą ir konsistensiją, o adatinių elektrodų įvedimo vietoje nebuvo matyti kraujosrūvų. Elektroporacija neturėjo šalutinio poveikio, išskyrus kartais pasitaikančius endotelinius pažeidimus paveiktoje srityje. Šie pažeidimai buvo židininiai. Po elektroporacijos
praėjus 9 paroms, navikuose nekrozė, priklausomai nuo impulsų skaičiaus, sudarė 10 – 20 – 25 proc. Negydytuose navikuose nekrozė sudarė 10 – 15 proc. [Ramirez ir kt., 1998].
Buvo minėta, kad BLM sukelia viengubos arba dvigubos DNR grandinės trūkius. DNR taip pat yra priešvėžinio preparato – cisplatinos – taikinys [Serša ir kt., 2002; Pron ir kt., 1994]. Tik šis preparatas formuoja DNR aduktus (DNR pažaidas - kovalentines modifikacijas). Tyrimais įrodyta, kad ląstelių elektroporacija in vitro bleomicino citotoksiškumą padidina 100 kartų [Poddevin ir kt., 1991], o cisplatinos iki 70 kartų [Serša ir kt., 1995]. Tačiau gydymas vien tik cisplatina (4 mg/kg) nebuvo labai efektyvus. Elektrinių impulsų panaudojimas buvo efektyvesnis, nes pastebėtas sulėtėjęs naviko augimas (lyginant su kontrole). ECT buvo efektyviausias gydymo būdas. Po gydymo praėjus 3 paroms, buvo stebimas naviko tūrio sumažėjimas [Čemažar ir kt., 1999].
Elektrinis laukas naudojamas po vaisto injekcijos, kai vaisto koncentracija navike yra maksimali. Vaisto patekimas į naviką elektrinio lauko veikimo įtakoje yra patvirtintas tiriant platinos [Čemažar ir kt., 1999], 57Co-Bleomicino [Belehradek ir kt., 1994] ir 111In-bleomicino [Ergstom ir kt., 1998] molekulių pasiskirstymą navikuose.
Visi kiti ECT in vivo ir klinikiniai eksperimentai buvo atlikti naudojant 3, 4, 6, 8, 22 arba 4+4 (dvi serijos po 4 impulsus, esant statmenai elektrodų padėčiai) stačiakampio formos impulsus, kai τ buvo 100 µs, impulsų pasikartojimo dažnis - 1 Hz. Pirmas toks eksperimentas atliktas tiriant trijų kamienų – KB burnos epidermoidinės karcinomos, LPB fibrosarkomos ir B16 melanomos – navikus. Keičiant E vertes nuo 900 iki 1500 V/cm minimalus elektrochemoterapinis efektas pastebėtas, kai E 1100 – 1200 V/cm. Naudojant 3 ir 8 impulsų seriją geresnis efektas nustatytas antruoju atveju [Mir ir kt., 1991]. 100 µs trukmės impulsai pasirinkti atsižvelgiant į eksperimentų in vitro rezultatus [Mir ir kt., 1988; Poddevin ir kt., 1991; Orlowski ir kt., 1988]. B16 melanomos bei hepatoląstelinės karcinomos navikams in vivo irgi buvo tirta elektrinio lauko stiprio įtaka [Heller ir kt., 1997; Jaroszeski ir kt., 2001 a]. Vėlesniuose ECT in vivo ir klinikiniuose eksperimentuose dažniausiai buvo naudota aštuonių stačiakampio formos impulsų serija, kurių E - 1300 V/cm, τ - 100 µs, impulsų pasikartojimo dažnis - 1 Hz. Kituose tyrimuose, kai stačiakampio formos impulsas yra 100 µs trukmės, naudoto E vertės buvo 850 - 1500 V/cm ribose, impulsų pasikartojimo dažnis - 1 Hz, išskyrus du atvejus, kai buvo naudotas 4 Hz impulsų pasikartojimo dažnis [Nanda ir kt., 1998].
Naviko atžvilgiu siekiant įvertinti elektrodų orientacijos svarbą, buvo atlikta eksperimentų serija su Ehrlicho ascito karcinoma, naudojant 4, 8 arba 4+4 impulsų serijas. Geriausi rezultatai gauti naudojant 4+4 impulsų seriją [Serša ir kt., 1996]. Tyrimus atliekant su B16 melanoma, stebimas toks pat rezultatas [Šatkauskas ir kt., 1998].
Pirmieji ECT eksperimentai buvo atlikti naudojant adatinius elektrodus. Vėlesniuose tyrimuose naudoti adatiniai ir plokšteliniai elektrodai. Adatiniai elektrodai buvo įterpiami tiesiogiai į naviką, plokšteliniai – dedami priešinguose naviko paviršiaus šonuose, prieš tai pašalinus naviko srityje esančius plaukelius. Tiriant ECT efekto priklausomybę nuo elektrodų tipo nustatyta, kad geresni rezultatai gaunami, naudojant plokštelinius elektrodus [Šatkauskas ir kt., 1998].
Lietuvoje VDU Biofizikinių tyrimų grupė dviejų dešimtmečių laikotarpiu daug dėmesio skyrė ląstelių elektroporacijos metodo teoriniam ir eksperimentiniam pagrindimui. Atlikti tyrimai įrodo šio metodo tinkamumą mažų molekulių (sacharidus, vaistus, fluorescuojančius indikatorius), genų (liuciferazės, GFP) pernašai į ląsteles in vitro ir į audinius in vivo. Bandymais įrodytas elektrochemoterapinio metodo efektyvumas gydant navikus, įskiepijamus į laboratorinių gyvūnų organizmus [Šatkauskas ir kt., 1998; Šalomskaitė-Davalgienė ir kt., 2002; Šatkauskas ir kt., 2005]. Didelė dalis tyrimų in vivo yra atlikta ir kitos tyrėjų grupės, dirbančios Lietuvos onkologijos centre[Labanauskienė ir Šatkauskas, 1999, 2000; Labanauskienė ir kt., 2006]. Nustatyta, kad geresnis ECT poveikis buvo tada, kai gydymas buvo kartojamas [Labanauskienė ir Šatkauskas, 1999]. Pastaruoju metu elektroporacijos metodą bandoma pritaikyti ir fotosensibilizatorių įvedimui į organizmą [Rotomskis ir kt., 2002; Tamošiūnas ir kt., 2004].
5.4.2 Morfometrinė analizė
Sergant onkologinėmis ligomis, tolesnei ligos prognozei yra svarbu įvertinti prognozinius faktorius. Tikslus šių faktorių charakterizavimas reikalingas paskiriant pacientui atitinkamą gydymą. Naujų prognozės faktorių paieškai skiriamas didelis dėmesys. Todėl navikų biologiniai parametrai tyrinėjami ne tik imunochemijos, flow-citometrijos metodais, bet ir izotopų žymėjimo, cito- ir molekulinės genetikos bei molekulinės biologijos pagalba [Ladekarl, 1998; Ma Kay ir Silva, 1980].
Papildomos prognozinės informacijos suteikia pirminio naviko histologinio piktybiškumo laipsnis, nustatomas atliekant histologinių pjūvių analizę. Pagal piktybiškumo laipsnį navikai gali būti žemo, vidutinio arba aukšto piktybiškumo laipsnio. Klasės išskiriamos remiantis šiais morfologiniais kriterijais: navikinių ląstelių diferenciacijos laipsniu, branduolio hiperchromatizmo apimtimi, mitotiniu aktyvumu ir branduolio pleomorfizmo laipsniu. Branduolio pleomorfizmo laipsnis nustatomas išmatavus su branduolio dydžiu susijusius parametrus. Paraleliai įvertinamas navikinių ląstelių mitotinis aktyvumas ir navikinio audinio struktūros atipiškumas [Ladekarl, 1998; Wills ir kt., 1987; Heilman ir kt., 1978].
Morfologinis piktybiškumo laipsnis dažniausiai nustatomas atsižvelgiant į navikinių ir mitotinių ląstelių tankumą navikiniame audinyje. Mitotinių ląstelių skaičiavimas kai kuriais vėžio atvejais priskiriamas prognostiniams tikslams. Mitotines ląsteles galima skaičiuoti įvairiais metodais. Pavyzdžiui, mitotinės ląstelės gali būti skaičiuojamos dešimtyje atskirų navikinio audinio plotelių (objektyvas x 40). Taip pat mitotinės ląstelės gali būti skaičiuojamos navikinio audinio 1mm2 [Zhang ir kt., 1998]. Atitinkamame plote suskaičiuotų mitotinių ląstelių kiekis išreiškiamas mitotiniu indeksu (MI). Gali būti išskiriamos kelios MI kategorijos, kurios charakterizuoja naviko augimą ir kuriomis remiantis prognozuojama tolesnė ligos eiga [Baak ir kt., 1985]. Pavyzdžiui, jei mitotinių ląstelių skaičius navikinio audinio 1mm2 bus > 0, tikimybė išgyti mažės, kadangi didelis mitotinių ląstelių skaičius rodo spartų naviko augimą [Rubin ir Farber, 1988].
Audinio supiktybėjimas pasireiškia nesugebėjimu diferencijuotis ir yra apibūdinamas navikinių ląstelių ir jų branduolių pleomorfizmu. Lyginant su normaliomis audinio ląstelėmis, pleomorfiškos ląstelės dažniausiai turi padidėjusį ir pakitusios formos branduolį. Daugelis sistemų, klasifikuojant navikus pagal piktybiškumo laipsnį, remiasi tam tikrais branduolio požymiais. Manoma, jog jie parodo agresyvų naviko vystymąsi [Baak ir kt., 1982].
Be mitotinio indekso histologinis piktybiškumo laipsnis nustatomas morfometriškai įvertinus branduolio atipiškumą. Morfometrinei branduolio analizei dažniausiai pasirenkami šie branduolio parametrai: vidutinis branduolio plotas, vidutinis branduolio perimetras, didysis ir mažasis branduolio diametrai. Šie dydžiai susiję su naviko piktybiškumo laipsniu [Narvaez ir kt., 1997].
Remiantis morfometrine branduolio savybių analize, histologine navikų struktūros analize ir MI skaičiavimu, galima daug tiksliau įvertinti navikų būseną, o gauti duomenys leidžia prognozuoti ligos eigą [Aaltomaa ir kt., 1991].
Elektrochemoterapijos efektyvumas in vivo buvo vertinamas stebint naviko tūrio dinamiką po poveikio. Naviko tūris - svarbus augimo dinamikos indikatorius. Jo įvertinimui buvo matuojami trys tarpusavyje statmeni naviko diametrai - ilgis, plotis, aukštis [Okino ir Esato, 1990; Steel, 1977]. Buvo atlikti tyrimai, kurių metu patikrintas literatūroje naudojamos navikų tūrio kitimo vertinimo formulės tikslumas. Eksperimentiškai išmatuotos EPK tūris ženkliai skyrėsi nuo tūrio, apskaičiuoto pagal literatūroje pateiktas formules. Buvo pateikta modifikuota navikų tūrių in vivo įvertinimo formulė [Venslauskas ir Batiuškaitė, 2003]:
V = 1/5 π × (a × b²) kur V – naviko tūris, a – naviko ilgis, b – naviko plotis.
Kartais ECT efektyvumas buvo vertinamas ir pagal navikų tūrių padvigubėjimo laiką [Serša ir kt., 1994; Čemažar ir kt., 1998] arba stebint gyvūnų išgyvenamumą po poveikio [Salford ir kt., 1993].
Taikant šiuos kriterijus, galima įvertinti naviko dydžio kitimą, tačiau negalima nustatyti morfologinių pakitimų naviko viduje.
Kai kurie autoriai, siekdami nustatyti morfologinius pakitimus po ECT poveikio navikiniame audinyje, atliko histologinę – morfometrinę navikinio audinio analizę. Trečią dieną po elektrochemoterapinio poveikio navikiniame audinyje buvo pastebėtos didesnės nekrozės sritys [Heller ir kt., 1995].
Mūsų laboratorijoje atlikti tyrimai su epidermoidinės plaučių karcinomos (EPK) ir B16 melanomos navikais parodė, kad atitinkamai parinkus elektrinio lauko parametrus, nekrozės zonos didėjo [Šalomskaitė-Davalgienė ir kt., 2002].
6. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
6.1 Elektroporacija in vitro 6.1.1 Ląstelių kultūrų auginimas
In vitro tyrimuose buvo naudota žiurkėno plaučių fibroblastocitų DC3F, melanomos B16F10, fibrosarkomos LBP ir hepatomos MH22A ląstelių linijos.
Ląstelių kultūros auginamos monosluoksniu steriliuose 25 ar 75 cm2 talpos flakonėliuose, kuriuose buvo 5 ml augimo terpės. Flakonėliai su ląstelių kultūra laikomi inkubatoriuje (Ir Autoflow Water Jacketed, JAV), kuriame buvo 37° C, drėgna ir 5 proc. CO2 prisotinta aplinka.
Flakonėlio dangtelis paliekamas prasuktas tam, kad į flakonėlio vidų galėtų patekti CO2 reikalingas
augimo terpės pH pusiausvyros palaikymui. Augimo terpė ruošiama iš: MEM (500 ml Minimum essential medium su L-glutaminu, Life Technologies) arba DMEM (500 ml Dulbecco‘s modifikuota Eagle‘s terpė, Sigma), 10 proc. FBS (50 ml jaučio embriono serumo, Sigma), 1 proc. L – Glutamino tirpalo (5 ml L – Glutamine, Life Technologies), 100 U/ml penicilino ir 100 µl streptomicino antibiotikų (5 ml, Sigma). Augimo terpė turi savo sudėtyje visas pagrindines medžiagas reikalingas ląstelių kultūros auginimui: amino rūgščių, vitaminų, druskų, hormonų ir augimo faktorių (serumas), energijos šaltinį (L – glutaminas) ir antibiotikų (penicilinas ir streptomicinas) infekcijos profilaktikai. Siekiant apsaugoti auginamą ląstelių kultūrą nuo infekcijos dirbama steriliomis sąlygomis vertikalaus srauto laminare (Bioair instruments, Aura vertical S.D.4, Italija), darbui naudojant sterilius antgalius.
Prieš persėjimą ar eksperimentą įvertinamas sėjimui skirtas ląstelių monosluoksnis, terpės spalva ir drumstumas. Augant ląstelių kultūrai stebimas terpės spalvos pasikeitimas iš rausvos į geltoną, nes reaguoja terpėje esantis indikatorius – fenolio raudonasis, kuris parodo terpės parūgštėjimą. Galimas terpės padrumstėjimas, kurį sukelia nuo substrato nuslenkančios ląstelės arba infekcija. Ląstelių monosluoksnis esantis flakonėlyje apžiūrimas invertuotu mikroskopu (Nikon elipse TS 100, Japonija).
6.1.2 Elektroporacijos eksperimento eiga
Ląstelių paruošimas elektroporacijos tyrimams. Ląstelių suspensija ruošiama iš sveikų ir
gyvybingų ląstelių monosluoksnio. Nupilama augimo terpė, o ląstelių monosluoksnis užpilamas 2 ml tripsino/EDTA tirpalu (Sigma). Tripsinuojama 2 – 5 min., kol ląstelės ima plaukioti tirpale. Po to ląstelių suspensija papildoma 2 ml (kitais atvejais 8 ml) augimo terpės tam, kad inaktyvuotų tripsino poveikį. Viskas perpilama į 15 ml talpos mėgintuvėlį ir centrifuguojama 5 min. 1000 aps./min. greičiu. Supernantantas nupilamas, o nusėdusios ląstelės praskiedžiamos nauja SMEM
Tokiu būdu paruošiama ląstelių suspensija, kurios tankis – 1 x 106 ląstelių/ml. Ląstelių tankis apskaičiuojamas hematocitometro (Neubauer, Vokietija) pagalba.
Ląstelių elektroporacija. Eksperimentuose naudojant elektroporaciją, vaistas (30 nM,
bleomicinas, Japonija), dažas (liuciferio geltonasis (LG), 2 mM) arba DNR (8 µg) į ląstelių suspensiją dedamas prieš elektrinių impulsų taikymą. 50 µl ląstelių suspensijos, tai yra 1 x 106 ląstelių su vaistu, dažu ar DNR, patalpinama tarp dviejų nerūdijančio plieno plokštelinių lygiagrečių elektrodų, tarp kurių yra 2 mm atstumas. Elektrodai sujungti su aukštos įtampos elektroporatoriumi. Ląstelių suspensija elektroporuojama stačiakampio formos elektriniais impulsais.
Po elektroporacijos suspensija supilama į ependorfinį mėgintuvėlį arba į Petri lėkštelę ir inkubuojama 5 min. (vaisto ir DNR įvedimo atveju) arba 20 min. (dažo įvedimo atveju) kambario temperatūroje.
Bleomicino įvedimo į ląsteles protokolas.
1. Po 5 min. inkubacijos elektroporuotų ląstelių suspensija praskiedžiama 1 ml augimo terpės.
2. Papildomai įpilama 9 ml augimo terpės. Iš 10 ml paimam 0,5 ml terpės ir į ją įpilame 9,5 ml augimo terpės.
3. Ląstelės skaičiuojamos hematocitometro pagalba.
4. Po skaičiavimo mėgintuvėlyje pasiruošiama ląstelių suspensija, kurioje būtų 2000 ląstelių.
5. Paruošta ląstelių suspensija švelniai sumaišoma ir išpilstoma po 5 ml į 3 Petri lėkšteles (60 mm Ø, Falcon).
6. Ląstelės Petri lėkštelėse auginamos inkubatoriuje 5 dienas.
7. Po 5 dienų terpė nupilama. Įpilama 2 ml 5 proc. formalino. Fiksuojama 20 min kambario temperatūroje.
8. Po fiksacijos lėkštelės su užfiksuotomis ląstelėmis plaunamos tekančiu vandentiekio vandeniu ir įpilama 2 ml 1 proc. kristalo violeto. Dažoma 15 min. Vėliau dažai nupilami, o indeliai plaunami tekančiu vandentiekio vandeniu, išdžiovinama ir skaičiuojama ląstelių kolonijos.
Liuciferio geltonojo įvedimo į ląsteles protokolas.
1. Po elektroporacijos su liuciferio geltonojo dažu, 15 ml mėgintuvėliuose ląstelės inkubuojamos 20 min.
2. Po inkubacijos įpilama 5 ml elektroporavimo terpės ir centrifuguojama 5 min.
3. Po centrifugavimo supernatantas nupilamas, vėl įpilama 5 ml elektroporavimo terpės ir centrifuguojama 5 min.
4. Po antrojo plovimo, supernatantas nupilamas, paliekant apytiksliai 60 µl tirpalo, kuriame ląstelės švelniai resuspenduojamos.
5. Analizuojama fluorescenciniu mikroskopu, iš kiekvienos tiriamos grupės fotografuojant po 4 imtis. Kiekviena imtis nufotografuojama paprastoje ir fluorescentinėje šviesoje.
6. Kiekvienoje imtyje suskaičiuojamos visos ir švytinčios ląstelės.
Ląstelių elektrosuliejimo protokolas.
1. Ląstelės pasėjamos Petri lėkštelėse (40 mm Ø) ant dengiamųjų stiklelių.
2. Elektroporacija vykdoma elektrodus (tarp kurių yra 8 mm atstumas) pridėjus statmenai stiklelio plokštumai.
3. Po elektroporacijos ląstelės inkubuojamos 5 min.
4. Vėliau stikleliai su ląstelėmis perkeliami į naujas lėkšteles su augimo terpe ir dar inkubuojama inkubatoriuje apytiksliai 2 val.
5. Po inkubacijos ląstelės analizuojamos invertuotu šviesiniu mikroskopu.
DNR įvedimo į ląsteles protokolas.
1. Po inkubacijos į 10 ml Petri lėkštelę su elektroporuota ląstelių suspensiją įpilama 10 ml augimo terpės, švelniai sumaišoma ir inkubuojama 48 val.
2. Po 48 val. inkubacijos ląstelės tripsinuojamos, centrifuguojamos ir suardomos panaudojus liuciferazės reagentų rinkinį.
3. Vėliau matuojamas liuciferazės aktyvumas, naudojant jau minėtą liuciferazės reagentų rinkinį (PROMEGA, JAV).
4. Kiekviename tiriamajame mėginyje išmatuojamas ir bendras baltymų kiekis ląstelėse, naudojant Micro BCATM (PIERCE, Rockford) baltymų nustatymo reagentų rinkinį.
6.2 Elektroporacija in vivo
Gyvūnai ir naviko įskiepijimas. Eksperimentuose buvo naudotos 8 - 12 savaičių amžiaus
C57Bl pelių patelės (Imunologijos institutas, Lietuvos Mokslų Akademija, Vilnius). Gyvūnai buvo laikomi Gamtos mokslų fakulteto vivariume (VDU), esant pastoviai temperatūrai (22o C), natūraliam dienos - nakties ciklui. Eksperimentinės C57Bl pelių patelės buvo šeriamos visaverčiais pašarais pelėms ir žiurkėms (AB ‘Kėdainių grūdai’, Kėdainiai). Eksperimentai atlikti, remiantis Valstybinės Maisto ir Veterinarijos tarnybos leidimu, atlikti laboratorinius bandymus su gyvūnais (Nr. 0070).
Tyrimuose naudoti du modeliniai navikai – epidermoidinė plaučių karcinoma (EPK) ir B16 melanoma. Navikų įskiepijimui navikinio audinio gabaliukai buvo paimti iš pelių, turinčių epidermoidinės plaučių karcinomos (EPK) ir B16 melanomos navikus (iš gyvūno į gyvūną). Šiai procedūrai atlikti gyvūnas “užmigdomas” CO2 dujų kameroje ir maždaug savaitę laiko pelytėje
augęs navikas išpreparuojamas. Nesuiręs navikinis audinys susmulkinamas, naudojant chirurgines žirklutes, ir gauta navikinių ląstelių masė skiedžiama steriliu 0,9 proc. NaCl tirpalu (santykiu 5 ml tirpalo 1 g naviko masės). Tada 0,2 ml paruošto mišinio buvo suleista po oda į pelės dešinę užpakalinę koją. Kai naviko diametras buvo mažiausiai 4 - 6 mm, pelės buvo suskirstytos į eksperimentines grupes.
Eksperimento eiga. Eksperimente naudotos 8 - 12 savaičių amžiaus C57Bl pelių patelės. Kiekvienoje grupėje – po 4 individus. In vivo tyrimuose viso panaudota 175 gyvūnai. Navikų srityje depiliaciniu kremu pelėms buvo pašalinti plaukeliai. Eksperimentinių grupių gyvūnai, kuriems taikyti elektriniai impulsai, buvo anestezuojami ketamino (Ketalar, Panpharma, Prancūzija) ir 2 proc. xylazino (Rompun, Bayer, Prancūzija) mišiniu. Šių vaistų mišinio po 200 µl buvo suleista į pilvo ertmę kiekvienam eksperimentiniam gyvūnui (išskyrus kontrolinės grupės gyvūnus). Anestezuotoms pelytėms į retroorbitalinį sinusą suleistas antinavikinis vaistas. Eksperimentuose naudoti priešnavikiniai preparatai: bleomicinas (100 µl BLM, Nypon Kayaku Ltd., Japonija) ir ciklofosfamidas (100 µl CPA, ASTA Medica AG, Vokietija). Vaistai ištirpinti 0,9 proc. NaCl arba injekciniame vandenyje.
Elektropermeabilizacijos atlikimas: navikai elektriniu lauku buvo veikti praėjus 3 min. po vaisto injekcijos, kuomet vaisto koncentracija, po i.v. injekcijos, navikiniame audinyje didžiausia [Mir ir Orlowski, 1999]. Kontaktui tarp elektrodų ir naviko pagerinti buvo naudojama kardiografinė pasta, kuri buvo tepama po naviko srityje esančių plaukelių pašalinimo. Navikų elektropermeabilizacijai buvo naudojami VDU Biologijos katedroje, Biofizikos laboratorijoje sukonstruoti plokšteliniai elektrodai. Tai - 20 mm ilgio, 8 mm pločio nerūdijančio plieno plokštelės,
tarp kurių atstumas gali būti keičiamas atsižvelgiant į naviko dydį [Šatkauskas ir kt., 1998a, Šatkauskas ir kt., 1998b] (6.1 pav.). Jie buvo dedami prie priešingų naviko šonų.
6.1 pav. Nerūdijančio plieno plokšti elektrodai, naudojami navikų elektrochemoterapijoje.
Eksperimentams buvo naudojamas VDU Biologijos katedroje, Biofizikos laboratorijoje sukonstruotas ir pagamintas elektroporatorius (6.2 pav.). Jis suformuoja stačiakampio formos impulsus, kurių parametrus galima keisti tam tikrose ribose: τ - nuo100 µs iki 10 ms; E - iki 1.2 kV,
impulsų skaičių 1 - 1000 ir impulsų pasikartojimo dažnį
0.1 – 1.2 Hz. Visais atvejais buvo naudojami 8
stačiakampio formos impulsai pasikartojantys 1 Hz
dažniu.
6.2 pav. VDU Biologijos katedroje, Biofizikos laboratorijoje sukonstruotas ir pagamintas elektroporatorius.
Elektrochemoterapinio efekto įvertinimas, naudojant fluorescentinį metodą. Elektrochemoterapinio gydymo poveikis lig šiol tirtas matuojant gydytų navikų tūrį bei analizuodami histologinius navikų preparatus. Paruoštos EPK navikinių ląstelių suspensijos dažymas fluorescentiniais dažais, mūsų darbo praktikoje panaudotas pirmą kartą. Navikai išoperuoti
1. Išpjaunamas navikas.
2. Navikas supjaustomas į 1 mm3 gabalėlius.
3. Gabalėliai nuplaunami PBS, supernatantas nupilamas. 4. Pipetuojama 5 ml PBS.
5. Pipetavimas tęsiamas tol, kol lieka tik jungiamojo audinio gabalėliai. 6. Perfiltruojama per 35 µm tinklelį.
7. Centrifuguojama 1000 aps/min 5 min.
8. Resuspenduojama 1 ml PBS. [Ormerod. Flow Cytometry. Oxford University Press, 2000]. Iš paruoštos ląstelių suspensijos paimama 25 µl ir dedama ant objektinio stiklelio. Pridedama 1 µl dažų mišinio (akridino oranžo ir etidžio bromido) ir švelniai sumaišoma. 10 µl dažyto mišinio užlašinama ant objektinio stiklelio, uždengiama dengiamuoju stikleliu ir tiriama fluorescentiniu mikroskopu [Tolomeo ir kt., 1990]. Šiuo metodu nudažius ląsteles gyvos ląstelės švyti žaliai, o negyvos bei mirštančios – oranžine spalva (6.3 pav.). Iš kiekvienos grupės EPK ląstelių suspensijos buvo paruošta po penkis preparatus, kuriuose nufotografuota po penkias atsitiktinai pasirinktas sritis. Skaitmeninis fotoaparatas “Canon” buvo pritaisytas prie fluorescentinio mikroskopo taip kaip ir prie optinio mikroskopo. Nufotografuotų vaizdų analizė buvo atliekama kompiuteriu (6.4 pav.).
6.3 pav. Epidermoidinės plaučių karcinomos kontrolinės grupės ląstelių suspensijos vaizdas. Dažyta akridino oranžu (gyvos ląstelės švyti žaliai) ir etidžio bromidu (žuvusios ląstelės švyti oranžine spalva).
