LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
ROKAS MACIJAUSKAS
Ultragarsiniu tyrimu fiksuojami pokyčiai karvės
kiaušidėse prostaglandinų analogų poveikyje
Impact of prostaglandins on dairy cow's ovaries using
ultrasound imaging data
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: Prof. dr. Vytuolis Žilaitis
2 DARBAS ATLIKTAS STAMBIŲJŲ GYVŪNŲ KATEDROJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Ultragarsiniu tyrimu fiksuojami pokyčiai karvės kiaušidėse prostaglandinų analogų poveikyje“.
1. Yra atliktas mano paties.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)
MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)
(parašas)
Magistro baigiamojo darbo recenzentai
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:
3
TURINYS
TURINYS ... 3 SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 91.1. Ultragarso aparato naudojimas pieninių karvių reprodukcijos vertinime ...9
1.2. Hormoninis lytinio ciklo reguliavimas ...10
1.3. Prostaglandino vaidmuo lytinio ciklo reguliavime ...11
1.4. Kiaušidžių darinių pokyčiai postpartum periodu ir lytinio ciklo metu ...12
1.4.1. Folikulų augimo bangos ... 12
1.4.2. Geltonkūnis ... 13
1.5. Karvių vaisingumo sutrikimai dėl kiaušidžių veiklos nepakankamumo ...13
1.5.1. Persistuojantis geltonkūnis ... 13
1.5.2. Folikulinės ir liuteininės folikulo cistos ... 14
1.5.3. Kiaušidžių hipoplazija ... 14
1.6. Karvių reprodukcijos stimuliacija hormonais ...14
1.6.1. Stimuliacija gonadotropinais ... 14
1.6.2. Stimuliacija GnRH ... 15
1.6.3. Stimuliacija progesteronais ... 15
1.7. Galvijų rujos sinchronizavimo schemos, kuriose naudojamas prostaglandinas ...15
1.7.1. Ovsynch protokolas ... 15
1.7.2. Sinchronizavimas intravaginaliniu progesteronu ... 16
1.7.3. Vienos prostaglandino injekcijos protokolas... 16
1.7.4. Dviejų prostaglandino injekcijų protokolas ... 17
4
2.1. Pagrindinė bandymų schema ...18
2.2. Trumpa ūkio charakteristika ...19
2.3. Tyrimus reglamentuojantys įstatymai ...20
2.4. Tyrimo objektas ...20
2.5. Tyrimo eiga ...20
2.6. Duomenų statistinė analizė ...24
3. TYRIMO REZULTATAI... 25
3.1. Kiaušidžių pokyčiai lytinio ciklo eigoje ...25
3.2. Stimuliuotų kiaušidžių pokyčiai ...26
3.3. Veršingų ir neveršingų stimuliuotų karvių kiaušidžių pokyčiai ...28
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 31
IŠVADOS ... 33
REKOMENDACIJOS ... 34
5
ULTRAGARSINIU TYRIMU FIKSUOJAMI POKYČIAI KARVĖS KIAUŠIDĖSE
PROSTAGLANDINŲ ANALOGŲ POVEIKYJE
Rokas Macijauskas
Magistro baigiamasis darbas
SANTRAUKA
Pieninių karvių ūkiai susiduria su reprodukcijos problemomis dėl kiaušidžių veiklos sutrikimų. Šio darbo tikslas – nustatyti, kaip kinta kiaušidžių dydis ir jų funkcionalumas stimuliuojant jas prostaglandinų analogais. Atrinktos kliniškai sveikos 23 karvės, Lietuvos juodmargės veislės, 2-4 laktacijos, per metus duodančios nuo 8000 kg. iki 10000 kg. pieno. Karvės suskirstytos į dvi grupes: kontrolinę grupę – nesėklintos surujojusios karvės po 80 pp, tiriamąją grupę - nesurujojusios po 80
pp. Jei tiriant ultragarsu kiaušidėje randamas geltonkūnis, tai karvė stimuliuojama prostaglandino
analogu. Visų karvių kiaušidės tiriamos ultragarso aparatu kas tris paras ir matuojamas kiaušidžių plotas ir nustatomi dariniai. Kontrolinė grupė matuojama nuo rujos iki sekančios rujos. Tiriamoji grupė - nuo prostaglandino injekcijos paros iki veršingumo nustatymo - 32 paros.
Nustatyta, kad lytinio ciklo eigoje kiaušidės buvo 2,84 proc. didesnės už stimuliuotas (p>0,05). Stimuliuotose kiaušidėse geltonkūnis nustatytas 2,83 proc. dažniau nei lytinio ciklo eigoje (p>0,05). Veršingų karvių kiaušidės po prostaglandino injekcijos buvo 9,55 proc. didesnės nei neveršingų karvių kiaušides (p<0,05). Veršingų karvių kiaušidėse po prostaglandino injekcijos buvo nustatoma 3,65 proc. daugiau geltonkūnių nei neveršingų karvių (p>0,05). Veršingų karvių kiaušidės yra didesnės ir jų funkcionalumą lemia geltonkūnio buvimas.
6
IMPACT OF PROSTAGLANDINS ON DAIRY COW'S OVARIES USING
ULTRASOUND IMAGING DATA
Rokas Macijauskas
Master‘s Thesis
SUMMARY
Changes in the ovaries cause disorders in reproductive system of dairy cows farm. The main purpose is to analyze the size and function of ovaries after stimulation with prostaglandins. There were chosen 23 dairy cows in their 2nd – 4th lactations, which provide from 8000 to 10000 kg milk per year. All of them were Lithuanian black and white breed. Cows were classified into 2 groups: a control group – cows in estrus, 80 days pp, not inseminated; an experimentation group – not in estrus 80 days pp. The stimulation with prostaglandins analogues is performed in case the corpus luteum is found in ovary during a scan of ultrasound. The ultrasound is used every third day of the research, the area of ovary is measured, corpus luteum, follicles are identified as well. The control group is examined from one estrus to another. The intervention group is examined from a day of prostaglandin injection to pregnancy recognition – 32nd day.
After the analysis of the research data was performed, it was noticed that the size of ovary during cycle was 2,84% bigger than the ovary after stimulation (p>0,05). The corpus luteum was 2,83% more frequently found in stimulated ovaries than during the period of estrus cycle (p>0,05). After prostaglandin injection, pregnant cows ovaries were 9,55% bigger than non-pregnant cows ovaries (p<0,05). After prostaglandin injection, corpus luteum was 3,65% more frequently found in pregnant cows ovaries than in non-pregnant cows ovaries (p>0,05). While the ovaries of the pregnant cow are larger it results in ovarian activity.
7
SANTRUMPOS
CL – (angl. corpus luteum) geltonkūnis;
FSH – (angl. follicle stimulating hormone) folikulus stimuliuojantis hormonas; GnRH – (angl. gonadotropin-releasing hormon) gonadotropinų faktorius; LH – (angl. luteinizing hormone) liuteinizuojantis hormonas;
8
ĮVADAS
Per paskutiniuosius 100 metų pieninių galvijų genetinės savybės pakito taip, kad atitiktų tiek pramonės, tiek visuomenės poreikius. XX a. pieninių galvijų ūkių savininkai buvo suinteresuoti didinti pieno gamybą, deja, sistemingos atrankos strategijos nebuvo. XX amžiaus viduryje metodiniai pasiekimai tiek genetikoje, tiek statistinių duomenų analizėje, technologinės naujovės skaičiavimo srityje atvėrė kelią galingoms daugiapakopėms analizėms. Nauji analizės metodai padėjo sparčiai augti ir vystytis pieninių galvijų genetinėms savybėms. Praeito šimtmečio pabaigoje selekcininkų dėmesys buvo nukreiptas nuo produkcijos didinimo. Persiorientuota į labiau subalansuotą veisimo tikslą. Šis pokytis atsirado dėl didėjančių sveikatos ir vaisingumo problemų, ir bent jau iš dalies dėl visuomenės požiūrio kitimo gyvūnų gerovės klausimais. Ilgaamžiškumas, vaisingumas, veršiavimasis, sveikatingumas ir tinkamumas įtraukti į atrankos rodiklius. Dabartiniai moksliniai tyrimai skirti fizinei būklei, sveikatai, gerovei, reprodukcijai, pieno kokybei ir galvijų aplinkos atsparumui gerinti (1).
Šiuolaikiniai galvijų ūkiai susiduria su rujos nustatymo problemomis. Karvės dažniausiai rujos požymius rodo vėlai vakare arba anksti ryte (2). Rujojančios karvės nueina didesnį atstumą nei nerujojančios. Taip pat rujojančios karvės suvartoja mažiau pašarų, duoda mažiau pieno, mažiau guli (3). Dažnai pasitaiko tyli ruja - rujos požymiai silpnai išreikšti. Saitinio laikymo sąlygomis rują pastebėti yra ypač sudėtinga. Dėl sunkumo pastebėti ir nustatyti rują, ji sinchronizuojama. Tačiau rezultatus yra sunku prognozuoti. Ūkyje priimtina nustatinėti kiaušidžių darinius ir plotą atliekant ultragarsinį tyrimą. Šie rodikliai siejami su kiaušidžių funkcionalumu. Žinant kiaušidžių fiziologinius duomenis - dydį, darinius ir jų skaičių - galima prognozuoti stimuliacijos rezultatų efektyvumą. Praktikoje nustačius bet kurioje kiaušidėje geltonkūnį dažnai naudojama stimuliacija prostaglandinais (2).
Darbo tikslas: nustatyti, kaip kinta kiaušidžių dydis ir jų funkcionalumas stimuliuojant jas prostaglandinų analogais.
Darbo uždaviniai:
Nustatyti kiaušidžių dydžio ir darinių pokyčius lytinio ciklo eigoje; Nustatyti kiaušidžių dydžio ir darinių pokyčius suleidus prostaglandino;
9
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Ultragarso aparato naudojimas pieninių karvių reprodukcijos vertinime
Ultragarsas padidino veterinarijos gydytojų ginekologinės diagnostikos galimybes, todėl tai tapo vienu vertingiausių veterinarinės medicinos įrankiu. Ultragarsinio tyrimo metu nustatomas vaisiaus amžius, jo gyvybingumas ankstyvuoju laikotarpiu, o tai padeda įvertinti bandos reprodukcijos padėtį, sumažinti intervalą tarp apsiveršiavimo ir apvaisinimo. Ankstyvas karvių dvynių nustatymas leidžia sumažinti neigiamas dvynių atsivedimo pasekmes. Taip pat galima identifikuoti gimdos kaklelio ir gimdos patologijas, kurios nėra tiksliai nustatomos palpuojant per tiesiąją žarną (rektiškai). Ankstyvas vaisiaus lyties nustatymas yra naudingas siekiant kuo anksčiau atsisakyti netinkamos spermos (4). Pieninio tipo galvijams ultragarsas dažniausiai naudojamas tiriant kiaušides, jų struktūras, tokias kaip folikulai ir geltonkūnis. Gauti duomenys padeda geriau diagnozuoti įvairias kiaušidžių ligas, pavyzdžiui, kiaušidės ar geltonkūnio cistas, užsitęsusius tarprujo laikotarpius. Ultragarso naudojimas ūkyje gerina galvijų reprodukciją ir bendrą ūkio charakteristiką (5).10
1.2. Hormoninis lytinio ciklo reguliavimas
Lytinio ciklo reguliavimas yra daugiafunkcinis procesas, priklausomas nuo daugelio veiksnių. Lytinio ciklo reguliavimo mechanizmas sudarytas iš pagumburio, hipofizės ir kiaušidžių tarpusavio sąveikos (1 pav.).
1 pav. Pagumburio, priekinės hipofizės, kiaušidžių ir gimdos hormonų veikla lytiniame cikle
(Modifikavo R. Macijauskas, pagal E. S. E. Hafez (2013)) (7).
Pirmiausiai, pagumburis išskiria gonadotropinius hormonus, kurie atsakingi už hipofizės aktyvinimą. Lytiniame cikle pagumburio išskiriamas hormonas gonadotropinis liberinas (GnRH) atpalaiduoja hipofizės išskiriamą folikulus stimuliuojantį hormoną (FSH) ir liuteinizuojantį hormoną (LH). LH tiesiogiai atsakingas už ovuliaciją ir geltonkūnio vystymąsi iš plyšusio Grafo folikulo. Hipofizės bazofilinės delta ląstelės išskiria LH. LH stimuliuoja geltonkūnio vystymąsi ir skatina progesterono išsiskyrimą kiaušidėje, kuris reikalingas pirmąsias savaites veršingumui palaikyti, kol progesteroną pradeda gaminti placenta (8). Buvo įrodyta, jog kiaušidėje liuteinizuojantis hormonas stimuliuoja progesteroną ir reguliuoja prostaglandino F2α apykaitą geltonkūnyje stimuliuodamas
ciklooksigenazės-2 išsikyrimą ir prostaglandino sintezę (9). FSH atsakingas už Grafo folikulo augimą ir estrogeno gamybą kiaušidėje. Folikulus stimuliuojančio hormono iškyrimas yra slopinamas progesterono, kurį išskiria geltonkūnis, arba estrogeno, kurį išskiria folikulo ląstelės ir folikulo skystis. Tai atsakas centrinei nervų sistemai ir pagumburiui, stabdantis FSH atpalaiduojančio faktoriaus išskyrimą (10). Noradrenalinas (norepinefrinas) taip pat dalyvauja šiame cikle: jis skatina
11 FSH ir LH išskyrimą, stabdo dopamino virtimą noradrenalinu, blokuoja estradiolio sukeltą LH išskyrimą, kuris yra atsakingas už ovuliaciją. FSH ir LH išsiskyrimą reguliuoja dvi skirtingos sistemos. Viena iš jų yra epizodinė/trumpalaikė sistema, kuri atsakinga už nuolatinę gonadotropino sekreciją ir stimuliuoja kiaušialąstės ir kiaušidžių endokrininių darinių vystymąsi. Kita sistema yra atsakinga už LH bangas. Ji kontroliuoja trumpalaikius, didelius gonadotropinų sekrecijos kiekius, ypač LH. Ne tik hipofizė turi tiesioginį efektą kiaušidės reguliavime. Šioje sistemoje tarpininkauja estradiolis, kuris išskiriamas dominuojančio folikulo. Epizodinė/trumpalaikė sistema yra papildomai veikiama, kai yra mažas progesterono kiekis. FSH taip pat yra kontroliuojamas keleto kiaušidėje sintetinamų peptidinių hormonų. Vienas iš jų inhibinas, kuris kartu su estradioliu veikia slopinančiai FSH. Inhibinas yra gaminamas visuose antriniuose folikuluose (11).
1.3. Prostaglandino vaidmuo lytinio ciklo reguliavime
1969 metais buvo padaryti svarbūs moksliniai tyrimai susiję su geltonkūnio regresiją. Buvo sutrumpinta pseudonėštumo trukmė suleidus PGF2α žiurkėms. Vėliau buvo įrodyta, jog šita medžiaga
stipriai aktyvina liuteolizę kitiems žemės ūkio gyvūnams, taip pat ir karvėms. Prostaglandino savybė ardyti geltonkūnį buvo įrodyta atrajotojams ir kiaulėms, tačiau tai buvo pritaikyta ir kitoms gyvūnų rūšims. Taip pat šiame tyrime buvo įrodyta, jog didėjant geltonkūnio regresijai didėja prostaglandinų koncentracija organizme. PGF2α yra sudaryta iš nesočiosios hidroksilinoleninės rūgšties ir
arachnoidinės rūgšties. Prostaglandino pavadinimą ši medžiaga gavo, nes pirma kartą buvo pagaminta iš šviežios spermos ir padaryta prielaida, jog gauta medžiaga yra būtent iš prostatos liaukos. (12).
Geltonkūnio regresija galima suskirstyti į du etapus: funkcinį ir fizinį. Abu etapai vyksta tuo pačiu metu. Funkcinė regresija yra greita, vadinasi, progesterono sekrecija greitai nutrūksta. Žvelgiant iš struktūrinės pusės, geltonkūnio funkcinis mažėjimas įvyksta greičiau nei struktūrinis. Regresijos proceso metu pirmiausiai mažėja didžiosios geltonkūnio ląstelės. Atrajotojams geltonkūnio regresija vyksta dėl PGF2α, kurį kas 5 valandas išskiria gimdos endometriumas. Šį
procesą skatina oksitocinas, kurį išskiria pats tirpstantis geltonkūnis. Be to, oksitociną išskiria ir pati kiaušidė. Geltonkūnių endotelio ląstelės veikia kartu su PGF2α ir praleidžia makrofagus, kurie naikina
patį geltonkūnį (13).
PGF2α veikimą skatina PGF2α receptorius, esantis ant geltonkūnio paviršiaus. PGF2α atlieka
svarbų vaidmenį reguliuojant azoto monoksido gamybą. Azoto monoksido gamyba ir sintezė yra stimuliuojama PGF2α iš geltonkūnio endotelio ląstelių. Be to, reaktyviosios deguonies dalelės slopina
progesterono sekreciją geltonkūnyje ir sukelia apoptozę. PGF2α ir reaktyviosios deguonies dalelės
12
1.4. Kiaušidžių darinių pokyčiai postpartum periodu ir lytinio ciklo metu
Po apsiveršiavimo ateina kiaušidžių neveiklumo ir lytinės ramybės laikotarpis. Tai natūralus organizmo procesas, vykstantis tam, kad karvės organizmas sustiprėtų po veršiavimosi. Šis periodas yra kintantis ir jį veikia pieno gamyba, mityba, paveldėjimas, sezoniškumas (15). Kiaušidžių lytinis ciklas sudarytas iš kelių etapų: ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir transformacijo. Šių etapų metu vyksta geltonkūnio vystymasis ir regresija. Hipofizės gaminami gonadotropinai ir augimo hormonai yra folikulų ir geltonkūnio funkcijos reguliatoriai. Kiaušidės veikla gali keisti atsaką į šiuos hormonus arba turėti tiesioginių specifinių funkcijų. Geltonkūnio formavimasis prasideda nuo ląstelių morfologinių ir biocheminių pokyčių, vykstančių ovuliavusio folikulo liekanose. Pagrindinė CL funkcija yra išskirti progesteroną lytinio ciklo ir nėštumo metu. CL yra vienas iš nedaugelio suaugusio galvijo patelės organizmo darinių, kurie reguliariai vystosi. (16).
1.4.1. Folikulų augimo bangos
Kiaušidės folikule bręsta kiaušialąstė. Pieninių karvių lytinio ciklo metu dažniausiai būna trys folikulų augimo bangos, kiek rečiau dvi ir tai sudaro daugiau nei 95 proc. visų augimo bangų. Paprastai pirma folikulinė banga įvyksta per 2-3 paras nuo ovuliacijos ir jos metu susidaro 20-50 mažų folikulų. Pradžioje visa folikulų grupė didėja, vėliau išsiskiria vienas dominuojantis folikulas, o kiti folikulai nustoja augti ir regresuoja. Karvėms, kurių rujos ciklą sudaro trys bangos, per pirmąsias dvi bangas susidarę dominuojantys folikulai taip pat regresuoja. Dviejų bangų cikle regresuoja pirmosios bangos dominuojantis folikulas. Regresuojant folikului mažėja jo dydis ir fiziologinis, hormoninis aktyvumas. Regresuojančio folikulo fiziologinis ir hormoninis veikimas pradeda mažėti, tačiau morfologinis dominavimas vis dar išlieka. Dažniausiai sunku jį atskirti nuo kitų iki tol, kol nykstantis folikulas pasiekia mažiau nei 10 mm skersmenį. Šiuo atveju, norint atskirti augantį ir regresuojantį folikulą, reikalingas daugiau nei vienas tyrimas. Veislė, mityba, produktyvumas ir laktacijos skaičius yra keletas veiksnių, turintys įtakos folikulinių bangų skaičiui per vieną lytinį ciklą (15).
13 1.4.2. Geltonkūnis
Geltonkūnis yra heterogeninis (nevienalytis) audinys, kurį sudaro endotelio ląstelės, didelės ir mažos steroidogeninės ląstelės, fibroblastai, lygiųjų raumenų ir imuninės ląstelės (18). Formuojantis geltonkūniui vystosi naujos kraujagyslės (angiogenezė). Po angiogenezės geltonkūnis tampa vienu iš labiausiai vaskuliarizuotų organų ir gauna didžiausią kraujotaką (19). Greitas geltonkūnio kraujo tėkmės sumažėjimas yra vienas iš pagrindinių geltonkūnio lizės veiksnių. Jo nykimas atrajotojams ir kitiems dideliems naminiams gyvūnams ciklo pabaigoje sukelia PGF2α padidėjimą, kuris, išsiskyręs
iš gimdos, geltonkūnį pasiekia per gimdos veną ir kiaušidės arteriją. Įprastai ciklo metu progesteronas stabdo endometriumo gaminamą prostaglandino išskyrimą. Ciklo pabaigoje endometriumas praranda savo jautrumą progesteronui ir PGF2α sekrecija nebėra stabdoma. (16)
1.5. Karvių vaisingumo sutrikimai dėl kiaušidžių veiklos nepakankamumo
1.5.1. Persistuojantis geltonkūnisKiaušidės atlieka svarbiausią vaidmenį reprodukcijoje ir yra kiaušialąsčių ir steroidinių hormonų šaltinis. Estrogenai ir progestinai lemia karvių elgseną ir fiziologinius aspektus, susijusius su folikulų vystymusi, ovuliacija, geltonkūnio formavimusi, veršingumu, atsivedimu ir laktacija. Bet kuris hormoninis reprodukcinio proceso sutrikdymas gali sukelti ūmias arba lėtines reprodukcines ligas (20).
Persistuojantis geltonasis kūnas sutrikdo laikotarpį po apsiveršiavimo ir neleidžia vystytis įprastam lytinam ciklui. Dėl sutrikusios progesterono sekrecijos, pernelyg aukštas progesterono kiekis lieka kraujyje po apsiveršiavimo. Progesteroną gamina geltonasis kūnas. Dėl to šis geltonkūnis vadinamas persistuojančiu, iš anglų kalbos verčiamas kaip užsilaikęs, nuolatinis. Jis gali būti susidaręs iš ciklinio geltonkūnio arba iš nėštuminio. Persistuojantis geltonkūnis gamina neįprastai didelį progesterono kiekį, todėl pradeda veikti neigiamas hipofizės grįžtamojo ryšio mechanizmas: FSH ir LH hormonų sekrecija yra blokuojama, kiaušidėse nevyksta naujų folikulų augimas. Nesusidarant naujiems folikulams nevyksta estrogeno gamyba - dėl to atsiranda užsitęsęs ramybės periodas. Persistuojantis geltonasis kūnas dažniausiai atsiranda po veršiavimosi ar po ankstyvo embriono mirties (21).
14 1.5.2. Folikulinės ir liuteininės folikulo cistos
Kiaušidžių cistos gali būti klasifikuojamos į dvi grupes: folikulines ir liuteinines cistas. Folikulinės ir liuteinės cistos pasireiškia atitinkamai 30-85% ir 15-70% atvejų (23). Folikulinė cista atsiranda dėl nuolatinio dominuojančio folikulo. Nors etiologija nėra gerai žinoma, tačiau manoma, jog tai sukelia LH hormono trūkumas. Folikulinė cista yra neovuliuotas subrendęs folikulas, kurio vidus yra užpildytas skysčiu. Dažniausiai cista būna didesnė nei 24 mm skersmens, išlieka ilgiau nei 7-10 paras. Cista yra plonasienė ir palpuojant gali lengvai plyšti (24). Nuolatinė folikulinė cista po 60 parų gali progresuoti ir tapti liuteinine cista liuteinizacijos proceso eigoje (25). Liuteininė cista dažnai būna mažesnė nei folikulinė, jos sienelė yra storesnė, o tai galima nesunkiai aptikti ultragarso pagalba. Liuteininės cistos sienelė gali būti nuo lygios, storos iki netaisyklingos formos. Taip pat šios cistos neplyšta (24). Karvių serume su folikulinėmis cistomis paprastai yra mažiau nei 0,5 ng / ml progesterono, priešingai nei karvėms su liuteinėmis cistomis - progesterono yra daugiau nei 0,5 ng / ml (25).
1.5.3. Kiaušidžių hipoplazija
Hipoplazija, kartu su kiaušidžių cistomis yra dažniausiai pasitaikanti, įgimta kiaušidžių patologija karvėms. Karvėms su šia kiaušidžių patologija būdingas sulėtėjęs kiaušidžių augimas, vystymasis ir sumažėjęs dydis. Hipoplazija gali pasireikšti tiek vienoje, tiek abejose kiaušidėse. Tačiau, pasireiškus vienos kiaušidės hipoplazija, dažnai vėliau ši būsena pasireiškia ir kitoje kiaušidėje (26). Tiriant mikroskopiškai yra randama mažai pirminių folikulų arba jie neaptinkami visai. Ši būsena būdinga tam tikrose pieninių ir mėsinių galvijų veislėse (27). Telyčių kiaušidės dėl hipolazijos gali būti tokios mažos, kad jas sunku rasti rektinio tyrimo metu. Kiaušidės gali būti jaučiamos kaip plonos, siauros, storos virvelės formos. Diagnozė dažniausiai nustatoma rektinio tyrimo metu, palpuojant (24). Kiaušidės hipoplazija gali būti dalinė arba pilna ir ją sukelia vienas autosominis recesyvinis genas. Esant abiejų kiaušidžių pilnai hipoplazijai, telyčia išlieka nevaisinga ir negali susilaukti palikuonių. Dalinės hipoplazijos atveju telyčia gali rujoti ir susilaukti gyvybingų, sveikų palikuonių, tačiau šis nepageidaujamas genas bus perduotas kitai kartai, todėl reikėtų vengti tokių patelių veisimo (28).
1.6. Karvių reprodukcijos stimuliacija hormonais
1.6.1. Stimuliacija gonadotropinais15 jog pieninėms karvėms naudojant žmogaus chorioninį gonadotropiną progesterono koncentracija padidėja, tačiau neturi įtakos veršingumo rodiklio padidinimui (30).
1.6.2. Stimuliacija GnRH
Galvijams GnRH injekcija sukelia tiek LH, tiek FSH išsiskyrimą. Buvo bandoma paskatinti ovuliaciją vienkartinėmis injekcijomis į raumenį po 100-500 mg GnRH, ir tai sukėlė įvairius rezultatus. Esant tokioms dozėms, kaip nurodyta anksčiau, GnRH sukelia LH bangą, kuri įprastai pasibaigia ovuliacija. Visa tai priklauso nuo hipofizės reakcijos. Tačiau dažniausiai reikia dviejų ar trijų parų, kad subręstų kiaušidėje esantis folikulas ir galėtų įvykti ovuliacija. Tai reiškia, jog GnRH sukels ovuliaciją, jei kiaušidėje bus pakankamai išsivystęs folikulas. GnRH taip pat gali sukelti priešlaikinę geltonkūnio lizę, kurios pakaks inicijuoti naują lytinį ciklą. Yra pasitaikę atvejų, kai karvėms, kurioms buvo naudotas GnRH, ovuliacija smarkiai sumažėjo palyginus su kontroline grupe. LH koncentracija didėja laipsniškai, tad galima naudoti kelias labai mažas GnRH dozes ir taip sukelti ovuliaciją arba stimuliuoti naudojant egzogeninį LH. Leidžiant GnRH karvėms po 5mg po veršiavimosi praėjus 48 valandoms, buvo sukeltas pilnavertiškas ciklas (31).
1.6.3. Stimuliacija progesteronais
Progesteronas slopina LH išsiskyrimą. Progesterono pagrindu stimuliuota ruja yra įvertinta dviprasmiškai: kai kurie rezultatai siekė aukštus rodiklius, kai kurie mažus. Viena iš neigiamų progesterono savybių tai, jog progesteronas dažnai nesukelia pakankamo folikulų augimo. Dažnai šios medžiagos naudojimas yra prastesnis nei kitų medžiagų (32). Servis periode (vidutinis neveršingų parų skaičius) apie 24 proc. melžiamų karvių neturi išsivysčiusio CL - yra per maža cirkuliuojančio progesterono koncentracija. Naudojant progesteroną pavyksta sumažinti bandos servis periodą. Taip pat pastebima, jog ši stimuliacija padeda pagerinti embrionų išgyvenamumą (33). Maždaug trečdalis galvijų embrionų žūva per pirmąjį nėštumo trečdalį. Šios embrionų žūtys gali būti siejamos su progesterono trūkumu. Progesterono šaltinis lytinio ciklo metu ir veršingumo laikotarpyje yra geltonasis kūnas (34). Taip pat karvės, kurių progesterono koncentracija kraujyje didesnė, pastebimas geresnis apvaisinimas (33).
1.7. Galvijų rujos sinchronizavimo schemos, kuriose naudojamas
prostaglandinas
1.7.1. Ovsynch protokolas
Galvijų sinchronizacija tapo viena iš labiausiai reprodukcijoje naudojamų technologijų, sukurtų per pastaruosius 45 metus. Šiuo metu visame pasaulyje plačiai naudojamos įvairios sinchronizacijos schemos mėsiniams ir pieniniams galvijams. 1995 m. tarptautiniame žurnale "Theriogenology" buvo pristatyta schema, pavadinta "Ovsynch", kuri pagrįsta GnRH ir PGF2α hormonų stimuliacija. Ši
16 ūkių visame pasaulyje. Nors yra atlikta daug tyrimų, paremtų šiuo protokolu, bet vis dar yra didelis mokslinių tyrimų poreikis, siekiant pagerinti šio protokolo efektyvumą, paprastumą ir praktinį pritaikymą (35).
„Ovsynch“ ptotokolo privalumas yra protokolo taikymas bet kuriuo lytinio ciklo metu. Taip pat išvengiama tylių rujų, šiai sinchronizacijai nereikalingas rujų stebėjimas. Sinhronizacija pradedama GnRH injekcija, kurios rezultate prasideda nauja folikulinė banga. Po septynių parų yra susiformavęs geltonkūnis ir prostaglandino pagalba yra sukeliama jo regresija. Po 56 val. yra pakartojama GnRH injekcija, kas paskatina dominuojančio folikulo augimą. Po antrosios GnRH injekcijos praėjus 16 val. vykdomas dirbtinis apvaisinimas. Dirbtinis apvaisinimas galimas net nesant rujos požymiams. Tačiau ši schema dažnai kritikuojama dėl dažnų injekcijų, tikslaus leidimo laiko, įvykstančios ovuliacija po pirmos GnRH injekcijos (36). Šiais laikais be „Ovsynch“ naudojama daug sudėtingesnės sinchronizacijos schemos, pavyzdžiui, „Presynchronization-Ovsynch-Resynch“. Jos trunka ne vieną savaitę. Paprastai naudojamos tik didžiuosiuose ūkiuose (35).
1.7.2. Sinchronizavimas intravaginaliniu progesteronu
Progesteroną išskiriantys prietaisai yra naudojami dešimtmečius, siekiant sėkmingai kontroliuoti galvijų lytinį ciklą. Vienas iš tokių prietaisų yra CIDR, kuriame yra 1,38 g. progesterono. CIDR yra naudojamas laktuojančioms pieninėms karvėms, kurių kiaušidėse nėra geltonkūnio. Jis progesteroną išskiria, kad blokuotų LH hormono padidėjimą. Tačiau telyčioms ir nelaktuojančioms pieninėms karvėms CIDR gali turėti per daug progesterono, kad išsilaikytų pakankami LH impulsai (37). Naudojant šį metodą reikia CIDR naudoti su PGF2α, kuris yra suleidžiamas praėjus 6 ar 7 paroms
nuo CIDR įdėjimo į makštį. Po vienos paros ar tą pačią parą yra išimamas CIDR. Dirbtinis apvaisinimas atliekamas po 56 valandų (38).
1.7.3. Vienos prostaglandino injekcijos protokolas
Prostaglandinai yra naudojami keliose skirtingose sinchronizacijos schemose. Viena iš dažniausiai naudojamų sinchronizacijos schemų dėl savo paprastumo ir pigumo yra vienkartinė prostaglandinų indukcija, kai vienoje ar abejose kiaušidėse yra geltonkūnis. Po vienkartinės injekcijos ovuliacija įvyksta per 3-5 paras. Geltonkūnį galima nustatyti rektiškai tiriant palpacijos metodu. Tačiau šis metodas turi trūkumų: rektinis tyrimas užima daug laiko ir jam atlikti reikia įgudusio specialisto. Rezultatai taip pat priklauso nuo rektinio tyrimo tikslumo. Tikslumas padidėja, jei ūkyje naudojamas ultragarso aparatas, tačiau neišnyksta žmogiškasis faktorius (39).
17 apsiveršiavimo, techniniai nesklandumai, dėl kurių sutriko dirbtinio apvaisinimo darbas ir kt.), prostaglandino injekcija taikoma viduryje lytinio ciklo, tai yra 8-11 ciklo parą (40).
1.7.4. Dviejų prostaglandino injekcijų protokolas
Dviejų prostaglandino injekcijų technika buvo sukurta tam, kad būtų galima sinchronizuoti karvių lytinį ciklą, nežinant tikslios kiaušidės stadijos. Visoms karvėms yra suleidžiama progesterono injekcija nepriklausomai nuo rujos ciklo ar kiaušidės būklės. Pakartotinė injekcija leidžiama po 11 parų. Dirbtinis apvaisinimas atliekamas po 3-4 parų suleidus pakartotinę injekciją. Teoriškai visoms karvėms geltonkūnio lizė įvyksta po 8-15 parų. Šis protokolas yra populiarus ir gana sėkmingas pasirinkimas telyčių rujos sinchronizavime, tačiau karvėms laktacijos metu ne visąlaik pasitvirtina. Siekiant gauti geresnių rezultatų karvėms laktacijos metu buvo sukurta šio protokolo modifikacija. Karvėms suleidžiama pirmoji prostaglandino injekcija, po 3-4 parų galima stebėti galviją, ar pasireiškė rujos požymiai ir pasireiškus rujos požymiams, nebereikia tęsti dvigubo protokolo. Tokiu atveju karvė yra apvaisinama. Jei neapsėklinama, protokolas tęsiamas. Nors toks būdas reikalauja daugiau darbo, ši modifikacija padeda pasiekti geresnių rezultatų nei su įprastu dviejų prostaglandino injekcijų protokolu (41).
18
2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA
2.1. Pagrindinė bandymų schema
Atrinktos karvės 2-4 laktacijos, per metus duodančios nuo 8000 kg. iki 10000 kg. pieno. Lietuvos juodmargės veislės. Kliniškai sveikos, nesėklintos.
n=104
Tiriamoji grupė. Po apsiveršiavimo praėjus 80 parų, nesurujojusios karvės. Tiriant ultragarsu aptiktas geltonkūnis.
n=23 Kontrolinė grupė. Po apsiveršiavimo
praėjus 80 parų, surujojusios ir nesėklintos.
n=18
Kiaušidės tiriamos ultragarso aparatu, matuojamas kiaušidės plotas ir darinių skaičius. Suleidžiamas prostaglandino
analogas.
Apsėklintos karvės tiriamos kas 3 paras iki veršingumo nustatymo
datos - 31 parą po apsėklinimo. Duomenys statistiškai apdoroti ir
statistiškai patikima, kai p<0,05. n=11
Nesėklintos karvės tiriamos nuo rujos iki sekančios rujos kas 3 paras.
Duomenys statistiškai apdoroti ir statistiškai patikima, kai p<0,05.
19
2.2. Trumpa ūkio charakteristika
Tyrimas buvo atliktas Marijampolės rajone, Kazlų Rūdos savivaldybėje esančiame X ūkyje. Ūkis užsiima pieninių galvijų auginimu. Ūkis turi apie 1200 ha dirbamos žemės. X ūkyje laikoma ~ 1200 galvijų, iš jų ~ 750 melžiamų karvių. Šiame ūkyje daugiausiai laikomi šios veislės galvijai: Lietuvos juodmargiai ~560, Holšteinų ~ 430, Vokietijos juodmargiai ~ 80, Juodmargiai x Mėsiniai ~ 40. Per 2017 metus pieno supirkėjams pardavė 5507 tonas pieno. Karvės yra laikomos palaido tipo tvartuose, ant gilaus kraiko. Ūkyje naudojama bandos valdymo programa „Dairy Plan C21“ (2 pav.). Bendras bandos servis periodas yra 102 paros. Karvės melžiamos 2 kartus per parą, „eglutės“ tipo melžimo aikštelėje. Šiuo metu yra vykdomi statybos darbai, kurių metu bus pastatyta nauja 60 vietų „karuselės“ tipo melžimo aikštelė. Taip pat bus praplėstas tvartas ir sudarytos sąlygos auginti per 1000 melžiamų karvių. Karvės šeriamos 2 kartus per parą. Pagal laktacijos stadiją karvės suskirstytos į šviežiapienes ir melžiamąsias karves iki 250 paros, karvės nuo 250 paros iki užtrūkinimo, užtrūkintos ir tranzite esančios karvės. Racionas sudaromas atsižvelgiant į laktacijos stadiją. Šviežiapienėms karvėms skiriamas pašaras turi didžiausią energinę vertę. Mažiausią energinę vertę turi užtrūkusių karvių pašaras. Raciono didžiąją dalį sudaro kukurūzų silosas, šienainis, koncentruotieji pašarai (miltai, melasa). Naudojami mineraliniai priedai.
2 pav. Bandos valdymo programos titulinis puslapis „Dairy Plan C21“, kurios pagalba buvo
20
2.3. Tyrimus reglamentuojantys įstatymai
Mokslinis tyrimas atliktas laikantis 1997 11 06 Lietuvos Respublikos gyvūnų globos, laikymo ir naudojimo įstatymo Nr. 8 – 500 („Valstybės žinios“, 1997 11 28, Nr. 108) ir poįstatyminiais aktais – LR valstybinės tarnybos įsakymų „Dėl laboratorinių gyvūnų veisimo, dauginimo, priežiūros ir transportavimo veterinarinių reikalavimų“ (1998 12 31, Nr. 4 – 361), „Dėl laboratorinių gyvūnų naudojimo moksliniams bandymams“ (1999 01 18, Nr. 4 – 16); mokslinis tyrimas atitinka ES Direktyvą 86/609/EEC ir EK rekomendacijas 2007/526 EC „Gyvūnų naudojimas ir laikymas eksperimentiniais ir kitais tikslais“.
2.4. Tyrimo objektas
Moksliniame tyrime buvo parinktos 23 karvės. Visos karvės yra 2 – 4 laktacijos, Lietuvos juodmargės veislės, per metus duodančios nuo 8000 kg. iki 10000 kg. pieno. Buvo atrenkamos kliniškai sveikos karvės. Joms per einamąją laktaciją nebuvo leisti jokie vaistiniai preparatai ir nebuvo atliekama jokia hormonų terapija. Tiesa, karvėms pirmąją savaitę po apsiveršiavimo kasdien matuojama temperatūra dėl metritų, endometritų profilaktikos tikslų. Kontrolinę grupę sudarė nesėklintos karvės, kurių rujos pradžia buvo po apsiveršiavimo praėjus 80 parų. Tiriamajai grupei buvo atrinktos karvės, kurioms per 80 parų nebuvo pastebėti rujos požymiai ir dėl šios priežasties nebuvo sėklintos.
2.5. Tyrimo eiga
21
3 pav. Rujos metu iš makšties išsiskiriančios stygos formos gleivės (aut.: R. Macijauskas).
4 pav. Kiaušidėje esantis geltonkūnis su ertme (11-12 paros nuo lytinio ciklo pradžios),
22
5 pav. Kiaušidėje esantis dominuojantis folikulas, pažymėtas plačia raudona rodykle. Šalia
maži folikulai, pažymėti siauromis raudonomis rodyklėmis (aut.: R. Macijauskas).
Buvo tiriamos kiaušidės ultragarso aparato pagalba. Naudotas ultragarsas - „Caresono HD 9300 Vet“ 6,5 MHz dažniu (6 pav.). Matuotas buvo kiaušidžių plotas ir darinių skaičius. Kiaušidžių plotas matuojamas „area“ funkcijos pagalba (7 pav.). Kontrolinėje grupėje 12 atrinktų karvių buvo tiriama nuo ciklo 0 paros iki sekančio ciklo 0 paros. Matavimai buvo atlikti kas 3 paras. Visos kontrolinės grupės karvės buvo matuojamos iki 21 paros.
23
7 pav. Matuojamas kiaušidės plotas, naudojant „area“ funkcija (aut.: R. Macijauskas).
Tiriamojoje grupėje buvo atrinkta 11 karvių, kurioms buvo aptiktas geltonkūnis. Joms buvo suleista vienkartinė prostaglandino injekcija. Už 3 parų, jei karvė surujojo, buvo atliekamas apsėklinimas ir tiriama kas 3 paras. Tiriamosios grupės karvės po rujos matavimai atlikti iki 27 paros. Po 31 paros nuo sėklinimo paros, buvo nustatomas veršingumas, duomenys fiksuojami (8 pav., 9 pav.).
24
9 pav. Neveršingos karvės gimda, gimdos spindžiai pažymėti raudonomis rodyklėmis (aut.: R.
Macijauskas).
Kaip prostaglandino analogas buvo pasirinktas Enzaprost 5 mg/ml (Ceva Sante Animale, Z.I. La Ballastiѐre, 33500 Libourne, PRANCŪZIJA) injekcinis tirpalas galvijams 30,0 ml. but.. Preparato 1,0 ml yra 5 mg veikliosios medžiagos (dinoprosto (trometamolio)), 16,5 mg pagalbinės medžiagos (benzilo alkoholio (E1519)). Kaklo sritis, kurioje buvo suleidžiamas preparatas, nuvalomas vata su dezinfekcine medžiaga (“Cutasept” (Bode Chemie Hamburg)). Preparatas leistas vienkartiniu 5.0 ml. švirkštu po 5,0 ml, i.m..
2.6. Duomenų statistinė analizė
25
3. TYRIMO REZULTATAI
3.1.
Kiaušidžių pokyčiai lytinio ciklo eigoje
Trečią parą po rujos kairė kiaušidė buvo mažiausia per visą lytinį ciklą. Dešinė kiaušidė rujos parą buvo didžiausia.
10 pav. Kiaušidžių ploto pokyčiai lytinio ciklo eigoje.
Rujos metu dešinė kiaušidė buvo 19 proc. didesnė nei kairė kiaušidė (p<0,05). Po 3 parų nuo lytinio ciklo pradžios dešinė kiaušidė liko didesnė 4 proc., o 6 parą kairė kiaušidė yra 4 proc. didesnė už dešinę (p>0,05). Devintą lytinio ciklo parą kairė kiaušidė yra 8 proc. didesnė už dešinę (p>0,05). Iki 15 ciklo paros kairės ir dešinės kiaušidės skirtumas išliko panašus, kairė 2 proc. didesnė už dešinę (p>0,05). Lytinio ciklo 18 parą kairė kiaušidė buvo 11 proc. didesnė už dešinę (p>0,05). Lytiniam ciklui artėjant į pabaigą, tai yra 21 parą, kairė kiaušidė didesnė už dešinę 5 proc. (p<0,05).
6,50 5,92 6,93 7,58 7,08 7,75 6,17 6,40 7,42 6,75 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 R 3 6 9 12 15 18 21 P lot as cm 2
26
11 pav. Kiaušidžių darinių (geltonkūnių ir folikulų) skaičiaus pokyčiai lytinio ciklo eigoje.
Kuo arčiau „2“, tuo daugiau geltonkūnių, kuo skaičius arčiau „1“ tuo daugiau folikulų.
Lytinio ciklo metu tiek dešinėje, tiek kairėje kiaušidėje dominavo folikulai ir skirtumo tarp kiaušidžių nėra (p<0,05). Trečią lytinio ciklo parą dešinėje kiaušidėje dominavo 11 proc. daugiau geltonkūnių nei kairėje, panaši tendencija išlieka iki 18 lytinio ciklo paros (p>0,05). Lytinio ciklo 21 parą abiejuose kiaušidėse dominuoja folikulai ir kairėje kiaušidėje 8 proc. daugiau geltonkūnių (p<0,05).
3.2.
Stimuliuotų kiaušidžių pokyčiai
Praėjus 6 paroms po stimuliacijos dešinė kiaušidė buvo mažiausia. Dešinė kiaušidė prostaglandino injekcijos parą buvo didžiausia.
12 pav. Stimuliuotų kiaušidžių ploto pokyčiai.
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 R 3 6 9 12 15 18 21 Da rinių skaič ius
Lytinio ciklo para Kairė kiaušidė Dešinė kiaušidė
6,59 5,55 6,82 6,82 6,27 6,93 7,10 8,10 5,36 7,09 7,18 6,91 6,82 7,05 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 -3 R 3 6 9 12 15 18 21 24 27 P lot as cm2
Lytinio ciklo para
27 Stimuliacijos atlikimo parą dešinė kiaušidė buvo 23 proc. didesnė nei kairė kiaušidė (p>0,05). Rujos metu skirtumas lieka minimalus, o už trijų parų nuo naujo ciklo pradžios kairė kiaušidė yra didesnė už dešinę kiaušidę 3 proc. (p<0,05). Panašus skirtumas išlieka iki 9 paros (p<0,05). Dvyliktą parą nuo rujos, dešinė kiaušidė yra didesnė už kairę 9 proc. (p>0,05). Šis skirtumas sumažėja 15 ir 18 matavimo parą atitinkamai 5 proc. ir 6 proc. (p>0,05). Praėjus 21 parai nuo rujos dešinė kiaušidė didesnė už kairę 10 proc. (p>0,05). Paskutiniu 2 matavimus kiaušidžių dydis susilygina ir kairė kiaušidė didesnė atitinkamai 2 proc. ir 1 proc. (p>0,05).
13 pav. Stimuliuotų kiaušidžių darinių (geltonkūnių ir folikulų) skaičiaus pokyčiai . Kuo arčiau
„2“, tuo daugiau geltonkūnių, kuo skaičius arčiau „1“ tuo daugiau folikulų.
Stimuliacijos atlikimo metu dešinėje kiaušidėje dominuoja 6 proc. daugiau geltonkūnių nei kairėje (p>0,05). Rujos metu abejuose kiaušidėse dominuoja folikulai ir skirtumo tarp kiaušidžių nėra (p<0,05). Trečia ir šeštą parą po rujos yra panašus skaičius tarp folikulų ir geltonkūnio ir skirtumo tarp kiaušidžių nėra (p>0,05). Devintą parą po rujos kairėje kiaušidėje 6 proc. dažniau dominuoja geltonkūnis nei dešinėje (p>0,05). Kairėje kiaušidėje nustatytas dažnesnis geltonkūnis išlieka visuose likusiuose matavimuose ir ši tendencija didėja: 18 parą skirtumas yra 27 proc. (p<0,05). Dvidešimt pirmą parą po rujos, kairėje kiaušidėje 20 proc. dažniau nustatomas geltonkūnis nei dešinėje (p>0,05), o 27 parą skirtumas padidėja iki 33 proc. (p>0,05).
28
3.3.
Veršingų ir neveršingų stimuliuotų karvių kiaušidžių pokyčiai
Mažiausios kiaušidės buvo 3 parą po rujos. Didžiausios kiaušidės buvo prostaglandino leidimo parą ir 9 parą po rujos.14 pav. Stimuliuotų neveršingų karvių kiaušidžių ploto pokyčiai.
Stimuliacijos parą karvės, kurios liko neveršingos, kairė kiaušidė buvo 13 proc. didesnė nei dešinė kiaušidė (p>0,05). Trečią parą po naujo lytinio ciklo pradžios tiek kairė, tiek dešinė kiaušidė tapo vienodo dydžio (p<0,05). Kituose matavimuose dešinė kiaušidė buvo didesnė už kairę kiaušidę viso matavimo metu, didžiausias skirtumas buvo 12, 18 ir 21 parą nuo naujo ciklo pradžios, atitinkamai 28 proc., 29 proc. ir 27 proc. (p>0,05). Dvidešimt ketvirtą parą tarp kairės ir dešinės kiaušidės skirtumas liko 5 proc. (p>0,05). Paskutinę matavimo parą dešinė kiaušidė didesnė už kairę 10 proc. (p>0,05).
15 pav. Stimuliuotų karvių kiaušidžių ploto pokyčiai, kurios tapo veršingos.
7,33 5,17 6,50 6,00 5,50 6,67 6,50 5,17 7,50 7,33 7,00 7,33 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 3- R 3 6 9 12 15 18 21 24 27 P lot as cm 2 Paros po stimuliacijos Kairė kiaušidė Dešinė kiaušidė
29 Enzoprost leidimo metu kairė kiaušidė buvo 44 proc. mažesnė nei dešinė kiaušidė (p>0,05). Rujos ir praėjus 3 parom po rujos skirtumas tarp kiaušidžių buvo 6 ir 7 proc. (p>0,05). Praėjus 6 parom nuo rujos kairė kiaušidė buvo 13 proc. didesnė už dešinę, panaši tendencija išliko iki 15 paros (p>0,05). Praėjus 18 parų nuo rujos ir sėkmingo apvaisinimo skirtumas buvo 18 proc. ir kairė kiaušidė buvo didesnė už dešinę kiaušidę (p>0,05). Praėjus 21 ir 24 parai nuo rujos skirtumas sumažėjo iki 6 proc. (p<0,05). Paskutinę matavimo parą, skirtumas buvo 9 proc. (p<0,05).
16 pav. Stimuliuotų neveršingų karvių kiaušidžių darinių (geltonkūnių ir folikulų) skaičiaus
pokyčiai. Kuo arčiau „2“ tuo daugiau geltonkūnių, kuo skaičius arčiau „1“ tuo daugiau folikulų.
Stimuliacijos metu kairėje kiaušidėje buvo 25 proc. daugiau geltonkūnių nei dešinėje (p>0,05). Rujos metu abiejose kiaušidėse dominavo folikulai (p<0,05). Po rujos 3 ir 6 parą dešinėje kiaušidėje buvo 27 proc. daugiau geltonkūnių nei kairėje (p>0,05). Penkioliktą parą po rujos kairėje ir dešinėje kiaušidėje buvo vienodas skirtumas tarp geltonkūnių ir folikulų (p>0,05). Po rujos praėjus 27 parom, kairėje kiaušidėje buvo 18 proc. geltonkūnių nei dėšinėje.
30
17 pav. Stimuliuotų karvių kiaušidžių darinių (geltonkūnių ir folikulų) skaičiaus pokyčiai, kurios
tapo veršingos. Kuo arčiau „2“ tuo daugiau geltonkūnių, kuo skaičius arčiau „1“ tuo daugiau folikulų.
Stimuliacijos metu dešinėje kiaušidėje buvo 33 proc. daugiau geltonkūnių nei kairėje (p>0,05).
Rujos metu abiejose kiaušidėse dominavo folikulai (p<0,05). Nuo 3 iki 27 paros po apsėklinimo kairėje kiaušidėje 33 proc. daugiau dominavo geltonkūniai nei dešinėje kiaušidėje
31
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Šiuolaikiniuose ūkiuose pieninės karvės privalo turėti geras reprodukcijos savybes kartu su didėjančiu produktyvumu (42). Pieninių veislių karvėse laikotarpis po apsiveršiavimo yra natūralus ramybės periodas. Pirmoji ovuliacijos vidutiniškai įvyksta per 4-5 savaites, bet yra daug karvių kurioms šis laikotarpis užsitęsia ilgiau nei 60 parų. Užsitęsęs laikotarpis po apsiveršiavimo neigiamai veikia karvių produktyvumą ir vaisingumą (43). Įvairiais tyrimais nustatyta jog prostaglandino naudojimas gerina reprodukcines savybes (44).
Lytinio ciklo metu kinta dariniai kiaušidėse ir tai lemia pačių kiaušidžių dydžio pokyčius. Kiaušidžių aktyvumas tiesiogiai siejamas su kiaušidžių dydžiu (45). Kiaušidės dydį labiausiai lemia dominuojančio folikulo augimas ir geltonkūnio augimas iki regresijos (46). Mūsų darytame tyrime kiaušidės turėjo didžiausią plotą, kuomet kiaušidėje rastas dominuojantis folikulas ir subrendęs geltonkūnis. Svarbiausias faktorius folikulų augimui yra FSH sekrecija. Aukštos produkcijos karvėms dažniausiai būdingos trys folikulinės bangos, kurias inicijuoja FSH išsiskyrimas. Kiekvienoje bangoje išsiskyręs FSH kiekis yra panašus, nepriklausomai ar tai pirma, antra ar trečia banga. Remiantis A. García-Guerra ir kt. (2017) gautais tyrimais, trečioje folikulinëje bangoje dominuojančio folikulo dydis yra apie 14 mm2 ir yra didžiausias folikulas palyginus su pirma ir antra
banga, atitinkamai 13 mm2, 12 mm2 (47). Geltonkūnyje per gyvavimo laikotarpį vyksta spartus steroidinių ląstelių augimas, diferenciacija, angiogenezė (48). Lytinio ciklo 15-17 parą nesant embriono prisitvirtinimui prie gimdos sienelės vyksta geltonkūnio regresija ir tai lemia kiaušidės dydžio sumažėjimą (49). Geltonkūnio regresija lytinio ciklo metu prasideda 17-18 parą po rujos, tačiau geltonkūnis pilnai išnyksta iki sekančios rujos (50). Tyrime gauti duomenys sutapo su autorių pastebėjimais apie geltonkūnį, 18 parą po lytinio ciklo pradžios geltonkūnis dar neišnykęs, bet 21 parą geltonkūnis būna pilnai išnykęs.
32 G. B. O. Borges ir kt. (2017) metais darytame tyrime teigia, jog dešinė kiaušidė yra didesnė už kairę ir tai yra fiziologinis reiškinys, tačiau tai nėra priežastis dešinei kiaušidei formuoti geresnes kiaušialąstes (54). Mūsų tyrimo metu tiriant likusių neveršingų karvių kiaušides nustatyta, kad naujo ciklo metu po stimuliacijos, išskyrus 3 paros po rujos, dešinė kiaušidė buvo didesnė.
R. Miura ir kt. (2018) metais darytame tyrime buvo tirtos kiaušidės prieš ovuliaciją ir nustatyta, kurioje kiaušidėje yra dominuojantis folikulas. Tyrimo rezultatai parodė, kai ovuliacija vyksta kairėje kiaušidėje, veršingumas siekia 60.1 proc., o jeigu ovuliacija vyksta dešinėje kiaušidėje veršingumas siekia 46,2 proc. (55). Panašius duomenis gavo ir H. Karamishabankareh ir kt. (2015) metais: prostaglandinas F2α sukelia rują geriau, kai geltonasis kūnas formuojasi dešinėje kiaušidėje, palyginus su kaire kiaušide, atitinkamai 62.0 proc. prieš 56.9 proc.. Tačiau geresnis karvių veršingumas siekia, kai geltonkūnis formuojasi kairėje kiaušidėje, 70,6 proc. prieš 68.4 proc. (56). Tiriant veršingas karves nustatyta vidutiniškai didesnis kairės kiaušidės aktyvumas nei dešinės.
T. Kubo (2018) metais teigia, jog karvei tapus veršingai, kiaušidėse atsiranda ramybės periodas, kuriuo metu kiaušidėse nesiformuoja nauji dariniai (57). Mūsų tyrimo metu nustatyta jog karvės, kurios tapo veršingos, kiaušidėse nauji dariniai nebesusidarė.
Lytiniame cikle kiaušidžių dydis keičiasi priklausomai nuo darinių veiklos. PGF2α injekcijos
poveikyje kiaušidės 3 paras mažėjo, vėliau dydis panašus kaip lytinio ciklo metu. Veršingumas apsprendžia kiaušidės dydį. Veršingų karvių didesnės kiaušidės siejamos su susiformavusiu nėštuminiu geltonkūniu.
33
IŠVADOS
1. Trečią lytinio ciklo parą kiaušidės mažiausios: 17,93 proc. mažesnės nei rujos metu (p<0,05). Penkioliktą parą kiaušidės didžiausios: 5,26 proc. didesnės nei rujos metu (p>0,05). Dešinėje kiaušidėje geltonkūnis nustatytas 11,11 proc. dažniau nei kairėje (p>0,05).
2. Šeštą parą po prostaglandino injekcijos kiaušidės mažiausios: 34,68 proc. mažesnės nei prostaglandino injekcijos parą (p<0,05). Aštuonioliktą parą kiaušidės mažesnės 4,94 proc. nei prostaglandino injekcijos parą (p>0,05). Kairėje kiaušidėje geltonkūnis nustatytas 12,43 proc. dažniau nei dešinėje (p>0,05).
34
REKOMENDACIJOS
1. Rekomenduojame matuoti kiaušidžių dydžius 12 ir 15 parą po prostaglandino injekcijos. Karvių, kurių kiaušidžių dydis 12 parą po prostaglandinų injekcijos didėjo iki 15 paros, turi didesnę tikimybę apsivaisinti.
35
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Miglior F, Fleming A, Malchiodi F, Brito LF, Martin P, Baes CF. A 100-Year Review: Identification and genetic selection of economically important traits in dairy cattle. J Dairy Sci 2017;100(12):10251-10271.
2. Jackson A. In this issue–August 2017: Urgent action needed to facilitate insecticides for screwworm infestation· Experimental footrot studies in sheep· Oestrus synchronisation programs in dairy cattle· Neuroendodermal cyst in a dog· Stability of morphine and methadone in non‐original packaging· Ameloblastoma in a filly. Aust Vet J 2017;95(8):263-264.
3. Zebari HM, Rutter SM, Bleach EC. Characterizing changes in activity and feeding behaviour of lactating dairy cows during behavioural and silent oestrus. Appl Anim Behav Sci 2018.
4. Fricke PM. Scanning the Future—Ultrasonography as a Reproductive Management Tool for Dairy Cattle1. Journal of Dairy Science 2002 August 2002;85(8):1918-1926.
5. Whitfield L. Ovarian ultrasound for fertility management in dairy cattle. Livestock 2018;23(4):154-160.
6. DesCôteaux L, Colloton J, Gnemmi G. Practical atlas of ruminant and camelid reproductive ultrasonography. : John Wiley & Sons; 2009; p. 3,7,8.
7. Hafez ESE, Hafez B. Reproduction in farm animals. : John Wiley & Sons; 2013; p. 46.
8. Abreu FM, Coutinho da Silva MA, Cruppe LH, Mussard ML, Bridges GA, Harstine BR, et al. Role of progesterone concentrations during early follicular development in beef cattle: I. Characteristics of LH secretion and oocyte quality. Animal Reproduction Science 2018 September 2018;196:59-68.
9. Behrouzi A, Colazo MG, Ambrose DJ. Alterations in bone morphogenetic protein 15, growth differentiation factor 9, and gene expression in granulosa cells in preovulatory follicles of dairy cows given porcine LH. Theriogenology 2016;85(7):1249-1257.
10. da Silva JCB, Ferreira RM, Maturana Filho M, Naves JdR, Santin T, Pugliesi G, et al. Use of FSH in two different regimens for ovarian superstimulation prior to ovum pick up and in vitro embryo production in Holstein cows. Theriogenology 2017 1 March 2017;90:65-73.
11. Noakes DE. Arthur's Veterinary Reproduction and Obstetrics E-Book. : Elsevier Health Sciences; 2009;9, p. 6-9.
12. Horton EW, Poyser NL. Uterine luteolytic hormone: a physiological role for prostaglandin F2alpha. Physiol Rev 1976 Oct;56(4):595-651.
36 14. Lee S, Yang B, Park C. Prostaglandin F2α Controls Reactive Oxygen Species in Bovine Corpus Luteum. Reproductive & developmental biology 2015;39(1):1-6.
15. García Guerra A, Tribulo A, Yapura J, Adams GP, Singh J, Mapletoft RJ. Lengthened superstimulatory treatment in cattle: Evidence for rescue of follicles within a wave rather than continuous recruitment of new follicles. Theriogenology 2015 August 2015;84(3):467-476.
16. Schams D, Berisha B. Regulation of corpus luteum function in cattle–an overview. Reproduction in domestic animals 2004;39(4):241-251.
17. Gobikrushanth M, Dutra PA, Bruinjé TC, Colazo MG, Butler ST, Ambrose DJ. Repeatability of antral follicle counts and anti-Müllerian hormone and their associations determined at an unknown stage of follicular growth and an expected day of follicular wave emergence in dairy cows. Theriogenology 2017 1 April 2017;92:90-94.
18. O'Shea JD, Rodgers RJ, D'Occhio MJ. Cellular composition of the cyclic corpus luteum of the cow. J Reprod Fertil 1989 Mar;85(2):483-487.
19. Wiltbank MC, Dysko RC, Gallagher KP, Keyes PL. Relationship between blood flow and steroidogenesis in the rabbit corpus luteum. J Reprod Fertil 1988 Nov;84(2):513-520.
20. Rodríguez FM, Gareis NC, Hein GJ, Salvetti NR, Amweg AN, Huber E, et al. Role of Components of the Insulin-like Growth Factor System in the Early Stages of Ovarian Follicular Persistence in Cattle. Journal of Comparative Pathology 2017 August–October 2017;157(2):201-214. 21. Magata F, Shirasuna K, Strueve K, Herzog K, Shimizu T, Bollwein H, et al. Gene expressions in the persistent corpus luteum of postpartum dairy cows: distinct profiles from the corpora lutea of the estrous cycle and pregnancy. Journal of Reproduction and Development 2012;58(4):445-452. 22. Mwaanga E, Janowski T. Anoestrus in dairy cows: causes, prevalence and clinical forms. Reproduction in domestic animals 2000;35(5):193-200.
23. Farin PW, Estill CT. Infertility due to abnormalities of the ovaries in cattle. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice 1993;9(2):291-308.
24. Peter AT, Levine H, Drost M, Bergfelt DR. Compilation of classical and contemporary terminology used to describe morphological aspects of ovarian dynamics in cattle. Theriogenology 2009 June 2009;71(9):1343-1357
25. Carroll DJ, Pierson RA, Hauser ER, Grummer RR, Combs DK. Variability of ovarian structures and plasma progesterone profiles in dairy cows with ovarian cysts. Theriogenology. 1990;34(2): 349-370.
37 27. Akkoyunlu G, Tepekoy F, Bebiş A, Uysal F. Bilateral total ovarian hypoplasia in a Holstein Friesian heifer. Acta Histochemica 2014 October 2014;116(8):1519-1521.
28. Wodaje HB, Mekuria TA. Risk Factors of Repeat Breeding in Dairy Cattle. Advances in Biological Research 2016;10(4):213-221.
29. Canadas ER, Lonergan P, Butler ST. Effect of equine chorionic gonadotropin administration on day 8 post-partum on ovarian follicular development, uterine health and uterine involution in lactating dairy cows. Theriogenology. 2019;123:54–61.
30. Niles A, Fricke H, Carvalho P, Hernandez L, Fricke P. 383 Effect of Treatment with Human Chorionic Gonadotropin (hCG) on Day 7 of the Estrous Cycle on Pregnancy Outcomes and Pregnancy Losses in Holstein Dairy Heifers Receiving Artificial Insemination or IVF Embryo Transfer. J Anim Sci 2018;96(suppl_2):206-206.
31. Batista EOS, Vieira LM, Sá Filho MF, Dias EAR, Bayeux BM, Accorsi MF, et al. Ovarian follicular growth suppression by long-term treatment with a GnRH agonist and impact on small follicle number, oocyte yield, and in vitro embryo production in Zebu beef cows. Theriogenology 2016 June 2016;85(9):1680-1687.
32. Melo L, Monteiro Jr P, Nascimento A, Drum J, Spies C, Prata A, et al. Follicular dynamics, circulating progesterone, and fertility in Holstein cows synchronized with reused intravaginal progesterone implants that were sanitized by autoclave or chemical disinfection. J Dairy Sci 2018;101(4):3554-3567.
33. Pereira MHC, Sanches CP, Guida TG, Wiltbank MC, Vasconcelos JLM. Comparison of fertility following use of one versus two intravaginal progesterone inserts in dairy cows without a CL during a synchronization protocol before timed AI or timed embryo transfer. Theriogenology 2017 February 2017;89:72-78.
34. Weems CW, Weems YS, Randel RD. Prostaglandins and reproduction in female farm animals. Vet J 2006;171(2):206–28.
35. Wiltbank MC, Pursley JR. The cow as an induced ovulator: Timed AI after synchronization of ovulation. Theriogenology 2014 1 January 2014;81(1):170-185.
36. Dirandeh E. Starting Ovsynch protocol on day 6 of first postpartum estrous cycle increased fertility in dairy cows by affecting ovarian response during heat stress. Animal Reproduction Science 2014 October 2014;149(3):135-140.
37. Channa AA, Martins JPN, Jimenez-Krassel F, Pursley JR. Inducing sub-luteal circulating concentrations of progesterone and persistent follicles in Holstein heifers and non-lactating cows using a modified CIDR device. Livestock Science 2017;198:191-194.9
38 39. Dirandeh E, Roodbari AR, Gholizadeh M, Deldar H, Masoumi R, Kazemifard M, et al. Administration of prostaglandin F2α 14 d before initiating a G6G or a G7G timed artificial insemination protocol increased circulating progesterone prior to artificial insemination and reduced pregnancy loss in multiparous Holstein cows. Journal of Dairy Science 2015 August 2015;98(8):5414-5421.
40. Nascimento AB, Souza AH, Keskin A, Sartori R, Wiltbank MC. Lack of complete regression of the Day 5 corpus luteum after one or two doses of PGF2α in nonlactating Holstein cows.
Theriogenology 2014 February 2014;81(3):389-395.
41. Ball PJ, Peters AR. Reproduction in cattle. : John Wiley & Sons; 2008; p. 111-114.
42. Van Eetvelde M, Heras S, Leroy J, Van Soom A, Opsomer G. The importance of the periconception period: immediate effects in cattle breeding and in assisted reproduction such as artificial insemination and embryo transfer. Periconception in Physiology and Medicine: Springer; 2017. p. 41-68.
43. Santos J, Wiltbank M, Ribeiro E, Bisinotto R. Aspects and mechanisms of low fertility in anovulatory dairy cows. Anim.Reprod 2016;13(3):290-299.
44. Ambrose DJ, Gobikrushanth M, Zuidhof S, Kastelic JP. Low-dose natural prostaglandin F2α (dinoprost) at timed insemination improves conception rate in dairy cattle. Theriogenology 2015 1 March 2015;83(4):529-534.
45. López-Gatius F, Garcia-Ispierto I, Serrano-Pérez B, Hunter RHF. The presence of two ovulatory follicles at timed artificial insemination influences the ovulatory response to GnRH in high-producing dairy cows. Theriogenology 2018 15 October 2018;120:91-97.
46. Berisha B, Schams D, Rodler D, Pfaffl MW. Angiogenesis in the ovary–the most important regulatory event for follicle and corpus luteum development and function in cow–An overview. Anat Histol Embryol 2016;45(2):124-130.
47. García-Guerra A, Kirkpatrick BW, Wiltbank MC. Follicular waves and hormonal profiles during the estrous cycle of carriers and non-carriers of the Trio allele, a major bovine gene for high ovulation and fecundity. Theriogenology 2017 15 September 2017;100:100-113.
48. Berisha B, Schams D, Rodler D, Pfaffl MW. Angiogenesis in the ovary–the most important regulatory event for follicle and corpus luteum development and function in cow–An overview. Anat Histol Embryol 2016;45(2):124-130.
49. Niswender GD, Juengel JL, Silva PJ, Rollyson MK, McIntush EW. Mechanisms controlling the function and life span of the corpus luteum. Physiol Rev 2000;80(1):1-29.
39 51. Whitfield L. The response of the corpus luteum to prostaglandin F2α injection and why it could pay to wait. Livestock 2016;21(1):25-29.
52. Souza AH, Ayres H, Ferreira RM, Wiltbank MC. A new presynchronization system (Double-Ovsynch) increases fertility at first postpartum timed AI in lactating dairy cows. Theriogenology 2008 15 July 2008;70(2):208-215.
53. Noseir WM. Ovarian follicular activity and hormonal profile during estrous cycle in cows: the development of 2 versus 3 waves. Reproductive Biology and Endocrinology 2003;1(1):50.
54. Borges GBO, Oliveira RA, Pivato I. Transuterine embryo migration, distribution of sexes within uterine horns, and fetometry in Nellore (Bos indicus) cattle. Theriogenology 2017 1 March 2017;90:49-53.
55. Miura R, Izumi T. Relationship of the conception rate and the side (left or right) of preovulatory follicle location at artificial insemination in dairy heifers. Animal Science Journal 2018;89(2):328-331.
56. Karamishabankareh H, Hajarian H, Shahsavari M, Moradinejad R. In vivo and in vitro study of the function of the left and right bovine ovaries. Theriogenology 2015 15 September 2015;84(5):724-731.
