Baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimas

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

ANTANAS BALČIŪNAS

Baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių ir

antioksidantinio aktyvumo įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė: Lekt. Dr. Vilma Pukelevičienė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis

Baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių ir

antioksidantinio aktyvumo įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovė

Lekt. Dr. Vilma Pukelevičienė Data: Recenzentas: Data: Darbą atliko Magistrantas Antanas Balčiūnas Data: Kaunas 2016

TURINYS

1.1 Arbata, jos rūšys ir panaudojimas ... 11

1.2 Baltosios arbatos paruošos ... 13

1.3 Baltosios arbatos cheminė sudėtis ... 13

1.4 Baltosios arbatos poveikis žmogaus organizmui, antioksidantinės savybės, aktualumas medicininėje praktikoje ... 14

1.5 Baltosios arbatos flavonoidai, jų struktūra ir jų analizės metodai ... 15

1.6 Laisvųjų radikalų poveikis organizmui, antioksidantai, antioksidantinis aktyvumas... 18

1.7 Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 20

2 EKSPERIMENTINĖ DALIS ... 22

2.1. Tyrimo objektas ... 22

2.2 Naudotos medžiagos ir reagentai ... 22

2.3. Mėginių paruošimas ... 22

2.4 Etaloninių tirpalų paruošimas ... 23

2.5 Baltosios arbatos žaliavos cheminės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo nustatymas, naudojant ESC–DPPH pokolonėlinį metodą ... 23

2.6 Antioksidantinio aktyvumo nustatymas, jo apskaičiavimas ... 24

3 TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 26

3.1 ESC metodo optimizavimas ... 26

3.1.1. Specifiškumas ... 26

3.1.2. Ribos ... 27

3.1.3. Glaudumas (preciziškumas) ... 28

3.1.4. Tiesiškumas ... 29

3.2 Baltosios arbatos žaliavos fenolinių junginių kiekybinis įvertinimas ESC metodu ... 32

3.2.1. Baltosios arbatos žaliavų fenolinių junginių kiekybinis įvertinimas ... 33

3.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ESC DPPH pokolonėliniu metodu ... 38

3.3.1. Baltosios arbatos žaliavų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ... 39

3.3.2. Baltosios arbatos rūšių bendro antioksidantinio aktyvumo palyginimas ... 42

4. IŠVADOS ... 45

SANTRAUKA

Antano Balčiūno magistro baigiamasis darbas „Baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimas“, mokslinis vadovas Lekt. Dr. Vilma Pukelevičienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.

Raktiniai žodžiai: Camellia sinensis, baltoji arbata, flavonoidai, fenoliniai junginiai, ESC – DPPH, antioksidantinis aktyvumas

Tyrimo objektas: Camellia sinensis L. (baltosios arbatos) žaliavos ekstraktai. Tyrimo metu kokybiniam ir kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui ir antioksidantinio aktyvumo įvertinimui naudotas ESC – DPPH metodas.

Darbo tikslas: įvertinti baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį ir jų antioksidantinį aktyvumą.

Uždaviniai:

1. Surinkti ir susisteminti literatūros duomenis apie baltosios arbatos fenolinių komponentų kokybinę ir kiekybinę sudėtį, šių junginių antoksidantines savybes.

2. Išanalizuoti šiuolaikinės instrumentinės analizės metodikas, naudojamas baltosios arbatos fenolinių junginių ir jų antioksidantinių savybių tyrimui.

3. Optimizuoti baltosios arbatos žaliavų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Optimizuoti baltosios arbatos žaliavų fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

4. Apibendrinti tyrimo rezultatus ir įvertinti baltosios arbatos žaliavų fenolinų junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei jų antioksidantinį aktyvumą.

Išvados: naudojant ESC DPPH metodą pasirinkus tinkamas sąlygas tyrimui atlikti, identifikuoti ir nustatyti fenoliniai junginiai trijose baltosios arbatos rūšyse ir jų antioksidantinis aktyvumas. Nustatytas toks bendras fenolinių junginių kiekis: Pai Mu Tan baltojoje arbatoje - 103,2 ± 5,16 μg/g, Bai Hao Yin Zhen nustatyta 138,96 ± 6,948 μg/g, o Peony baltojoje arbatoje – 64,18 ± 3,209 μg/g. Didžiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas Bai Hao Yin Zhen baltojoje arbatoje (83,38 ± 4,169 μmol/g TE/g), panašiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo Pai Mu Tan (34,58 ± 1,729 μmol/g TE/g) ir Peony ( 35,64 ± 1,782 μmol/g TE/g) baltosios arbatos rūšys. Atsižvelgiant į auginimo regioną didžiausias kiekis fenolinių junginių (138,96 ± 6,948 μg/g) buvo rastas arbatoje iš Kinijos Yin Zhen regiono, taip pat šio regiono arbatos rūšis pasižymėjo didžiausiu antioksidantiniu poveikiu (86,37 ± 4,318 μmol/g).

SUMMARY

Antanas Balčiūnas master’s thesis “Evaluation of phenolic compounds and antioxidant activity of white tea extracts”, supervisor Lect. Dr. Vilma Pukelevičienė; Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry – Kaunas.

Keywords: white tea, Camellia sinensis L., flavonoids, phenolic compounds, HPLC – DPPH, antioxidant activity.

Object: extracts of Camellia sinensis L. (white tea) as a raw material. HPLC – DPPH method was used for the qualitative and quantitative determination of phenolics and antioxidant activity.

The aim: to assess the qualitative and quantitative composition of phenolics and their antioxidant activity in white tea extracts,

Tasks:

1. To collect and organize literature data about the phenolic compounds in white tea, their qualitative and quantitative composition and antioxidant properties.

2. To investigate analytical methodologies used for the analysis of henolic compounds and antioxidative properties in white tea.

3. To optimize the qualitative and quantitative high liquid performance analysis method for phenolic compounds in white tea. To optimize antioxidative activity analysis of the white tea phenolics with high – performance liquid chromatography.

4. To summarize the results of the investigation and to assess the qualitative and quantitative composition and the antioxidant activity of phenolic compounds in white tea.

Results: while using the ESC DPPH method and after selection of proper conditions for analysis, phenolic compounds in white tea and their antioxidant activity were evaluated. The total quantity of phenolics in Pai Mu Tan white tea, was 103,2 ± 5,16 µg/g, Bai Hao Yin Zhen - 138,96 ± 6,948 µg/g, and white tea Peony – 64,18 ± 3,209 µg/g respectively. Maximal antioxidant activity was determined in Bai Hao Yin Zhen white tea (83,38 ± 4,169 μmol/g TE/g). Similar antioxidant activity was induced by Pai Mu Tan (34,58 ± 1,729 μmol/g TE/g) and Peony (35,64 ± 1,782 μmol/g TE/g) white teas. Taking into account the region of cultivation, maximum phenolic compounds (138,96 ± 6,948 μg/g) were found in tea from China, Yin Zhen the region. This tea also exhibited the largest functioning antioxidant activity in tea (86,37 ± 4,318 µmol/g).

PADĖKA

Už suteiktas darbo sąlygas ir materialinę bazę, atliekant mokslinį tiriamąjį darbą „Baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių ir antioksidantinio ir aktyvumo įvertinimas“, dėkoju LSMU MA, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedros vedėjui prof. Liudui Ivanauskui, asistentui Mindaugui Marksai bei visam kolektyvui.

SANTRUMPOS

ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis); ACR – acetonitrilas;

AŽ – augalinė žaliava;

CuPRAC – vario jonų redukcijos antioksidantinė galia (angl. Cupric ion reducing antioxidant capacity);

DNR – deoksiribonukleorūgštis;

DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas; ECG – epigalokatechinai;

ESC – efektyvioji skysčių chromatografija;

FRAP – geležies redukcijos antioksidacinė galia (angl.Ferric reducing antioxidant power); GC – galokatechinai;

IR – infraraudonoji spinduliuotė; r. – rūgštis;

R2 – koreliacijos koeficientas;

ROS – reaktyvios deguonies formos; RNS – reaktyvios azoto formos;

SSN – santykinis standartinis nuokrypis;

TEAC – trolokso ekvivalento antioksidacinė geba; TFR – trifluoracto rūgštis;

ĮVADAS

Kininis arbatmedis ( lot. Camellia sinensis L.) – tai daugiametis arbatmedinių šeimos visžalis augalas, daugiausiai paplitęs pietų ir pietryčių Azijos šalyse. Arbatmedžio augalinė žaliava yra antžeminė dalis: lapai, žiedai ir sėklos. Arbata yra vienas populiariausių gėrimų visame pasaulyje, ji vartojama kasdien net po kelis kartus. Arbatos gamyboje naudojami lapai, kuriuose kaupiami biologiškai aktyvūs komponentai, iš jų svarbiausi yra fenoliniai junginiai. Naujausiais tyrimų duomenimis arbatoje kaupiami biologiškai aktyvūs junginiai pasižymi teigiamu poveikiu žmogaus organizmui: antioksidantiniu, antibakteriniu, kardioprotekciniu, hepatoprotekciniu, priešuždegiminiu, suriša laisvuosius radikalus, padeda apsisaugoti nuo oksidacinio streso [5,12,16].

Baltoji arbata gaminama iš arbatmedžio Camellia sinensis L. lapų, kurio didžioji dalis pasaulio rinkai eksportuojama iš Kinijos regionų, nedidelė dalis iš Indijos regionų. Baltosios arbatos pasaulyje pagaminama sąlyginai mažai, tačiau ji nenusileidžia naudingumu kitoms arbatos rūšims arba jas net lenkia. Nors atlikta nemažai tyrimų apie fenolinius junginius ir jų antioksidantinį aktyvumą, jų išvados ir rezultatai rodo teigiamą šių medžiagų poveikį žmogaus organizmui, tačiau šių junginių tyrimai baltojoje arbatoje vis dar nėra gausūs [4,8,11].

Dažnai fenoliniai junginiai ir flavonoidai bei jų antioksidantinės savybės yra medicininių tyrimų objektas, šis poveikis svarbus apsaugai ar profilaktikai nuo oksidacinio streso sukeliamų reiškinių, tokių kaip lėtinės degeneracinės nervų ir judėjimo sistemos ligos, širdies ir kraujagyslių sistemos pažeidimai ir pan. [21,25]. Šio tyrimo metu baltojoje arbatoje nustatyti fenoliniai junginiai, pasižymintys antioksidantiniu aktyvumu. Antioksidantinis poveikis buvo susietas su baltojoje arbatoje kaupiamais fenoliniais junginiais, kurie gebėjo surišti laisvuosius radikalus. Fenolinių junginų identifikavimui, kiekybiniam nustatymui ir antioksidantiniam aktyvumui įvertinti naudojami įvairūs cheminės analizės metodai. ESC taikymas yra patikimas metodas daugiakomponenčių mėginių tyrimui. Naudojant standartų mėginius, buvo aptiktos ir kiekybiškai įvertintos šios medžiagos: epikatechinas, epigalokatechinas, epikatechino galatas, katechinas bei fenolinė rūgštis (galo rūgštis).

Tyrimo objektas Camellia sinensis L. (baltosios arbatos) žaliavos ištraukos. Tyrimui atlikti pasirinktos trys baltosios arbatos rūšys: Pai Mu Tan (Kinija), Bai Hao Yin Zhen (Kinija), Peony (Kinija)

Tyrimo tikslas – įvertinti baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį ir jų antioksidacinį aktyvumą, naudojant ESC–DPPH metodą.

Tyrimo uždaviniai:

1. Surinkti ir susisteminti literatūros duomenis apie baltosios arbatos fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį, šių junginių antoksidantines savybes.

2. Išanalizuoti šiuolaikinės instrumentinės analizės metodikas, naudojamas baltosios arbatos biologiškai aktyviųjų komponentų ir antioksidantinių savybių tyrimui.

3. Optimizuoti baltosios arbatos ištraukų fenolinių kokybinę ir kiekybinę analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu. Optimizuoti baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo analizę efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

4. Apibendrinti tyrimo rezultatus ir įvertinti baltosios arbatos ištraukų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei jų antioksidantinį aktyvumą.

1 pav. Tyrimo objektas: baltosios arbatos rūšys naudotos tyrimui atlikti 1) Pai Mu Tan; 2) Bai Hao Yin Zhen; 3) Peony

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Arbata, jos rūšys ir panaudojimas

Arbata – tai stimuliuojantis gėrimas, kuris ruošiamas džiovintus augalo, vadinamo kininiu arbatmedžiu – lot. Camelia sinensis L. – arba jo analogų ar hibridų lapus ar pumpurus, veikiant karštu vandeniu [1]. Tai antras pagal populiarumą gėrimas po vandens pasaulyje [2]. Apie gydomąsias arbatmedžio lapų savybes užsiminta prieš maždaug 2700 metų prieš mūsų erą [3]. Visos arbatos rūšys yra gaminamos iš kininio arbatmedžio Camellia sinensis L. Jo lapai renkami maždaug devyni metai po sėklos išauginimo, kada krūmas visiškai susiformuoja, jis auga rūgštingesnėse dirvose, maždaug 1500 metrų virš jūros lygio. Augalas auga pakankamai lėtai (maždaug apie 30 centimetrų per metus). Namų sąlygomis gaminamos arbatmedžio lapų vandeninės ištraukos. Arbatmedis turi du pagrindinius porūšius: sinensis, kuris daugiau kultivuojamas Kinijos regionuose ir assamica, kuris daugiau paplitęs Indijos regionuose [9].

A B

2 pav. Arbatmedžio porūšiai A – Camelia sinensis L. [61], B – Camellia assamica L. [62]. Priklausomai nuo žaliavos tolimesnio apdorojimo, skiriamos kelios arbatos rūšys. Atsižvelgiant į fermentaciją, arba tiksliau oksidaciją, skiriamos keturios arbatos rūšys: a) Ulongo arbata – tai fermentuota arba oksiduota arbata, jos gamybinis procesas yra sudėtingesnis, nes sudėtyje yra

dviejų tipų – mažiau oksiduotos ir daugiau oksiduotos – žaliavos; b) žalioji arbata – gaminama garinant arba kaitinant lapus, vengiant veikliųjų medžiagų suirimo; c) juodoji arbata – fermentuota arba oksiduota; d) baltoji arbata – tai ta pati žalioji arbata, tačiau visiškai nefermentuota ir yra mažiausiai termiškai apdorota, daugiausiai jos pagaminama Kinijos Fujiano provincijoje [5]. Mažiausiai apdorotos yra žalioji ir baltoji arbatos. Dėl minimalaus oksidacinių procesų vyksmo, išsaugojamas didesnis kiekis aktyviųjų fenolinių junginių [4]. Detalesnė arbatos gamybos stadijų proceso apžvalga pateikta 3 paveiksle.

3 pav. Įvairių arbatos rūšių gamybos etapai

Pastaraisiais metais susidomėjimas baltąja arbata auga tiek Amerikoje, tiek Europoje. Kinijoje ši arbata labai vertinama, jos pagaminama sąlyginai mažai. Ši arbatos rūšis auginama ir renkama mažuose Kinijos regionuose. Žaliavai renkami dar jauni, neprasiskleidę ir švelniausi lapeliai, procesas vykdomas anksti pavasarį [8]. Baltosios arbatos pavadinimas yra susijęs su arbatos lapų išvaizda. Jos gamybos procesą sudaro tik viena stadija, todėl arbatos lapeliai būna mažiausiai pažeisti, jie susisukę ir turi mažus baltus plaukelius išorėje. Šios arbatos gamybos stadija yra viena – tai yra džiovinimas, ši arbatos rūšis nefermentuojama, negarinama kaip kitos. Nors baltojoje arbatoje yra mažiau kofeino lyginant su žaliąja arbata, tačiau baltoji arbata pasižymi didesnėmis antioksidantinėmis savybėmis [9]. Gamybos procesas leidžia išsaugot aktyviuosius fenolinius junginius baltojoje arbatoje [4].

1.2 Baltosios arbatos paruošos

Baltoji arbata – tai nefermentuota arbatos žaliava, kuri gaminama iš jauniausių, švelniausių, dar neprasiskleidusių arbatos lapelių bei pumpurų, kurie renkami kartą metuose, anksti pavasarį. Lapai vytinami ir džiovinami, norint išvengti oksidacijos ir apimant kuo mažiau gamybos stadijų [13].

Arbatos gamybos etapai :

 Skynimas/rinkimas/valymas  Vytinimas  Susukimas  Oksidavimas (fermentacija)  Džiovinimas  Pakavimas

Arbatos rinkimas gali būti atliekamas keliais būdais: rankiniu arba mechaniniu. Pastarasis plačiau taikomas arbatos gamybos pramonėje, tačiau jo metu arbatos lapeliai yra labiau pažeidžiami, tačiau renkant rankomis didėja arbatos gamybos kaštai.

Vytinimo tikslas – sumažinti arbatos lapuose drėgmės kiekį iki 70 % (drėgmės kiekis skiriasi priklausomai nuo regiono, kuriame auginami arbatmedžiai). Džiovinimo metu arbata pažeriama ant metalinio sieto, pastoviai pučiamas oras pro arbatą pašalina iš jos drėgmę. Šis procesas trunka apie 14–18 valandų, jo metu drėgmės kiekis sumažėja pusiau [9]. Jo pabaigoje lapai tampa minkšti ir lankstūs, todėl gerai susisuka. Siekiant sustabdyti oksidacijos procesą, arbata praleidžiama pro karšto oro džiovintuvus. Tai sumažina absoliučios drėgmės kiekį iki 3 % ir sustabdo fermentų veiklą. Šiuo procesu baigiama oksidacija ir arbata paruošiama rūšiavimui bei pakavimui.

1.3 Baltosios arbatos cheminė sudėtis

Arbatos sudėtyje yra platus spektras fenolinių medžiagų, tai yra: flavonoliai, flavonoidai, fenolinės rūgštys, kurie gali sudaryti iki 30 % aktyviųjų komponentų arbatos sudėtyje.[9] Arbatos lapuose yra trys stambios fenolinių junginių grupės, tai – katechinai, teaflavinai ir galokatechinai, kurių baltoji ir žalioji arbata gali turėti panašų kiekį. Dėl juodosios arbatos gamybos specifikos – atliekamos fermentacijos – arbatos sudėtyje esančios medžiagos gali virsti į sudėtingesnės struktūros junginius, tokius kaip taninai. Katechinai yra flavonoidų deriniai, pasižymintys

aukščiausiu oksidacijos laipsniu heterocikliniam žiede ir geru tirpumu vandenyje. Proantocianų arbatos sudėtyje yra iki dešimt kartų mažiau nei katechinų. Veikliųjų medžiagų kiekiai priklauso nuo ištraukos kokybės ir nuo arbatos rūšies. Taip pat pastebėta, kad didžiausiu kiekiu katechinų pasižymėjo ištraukos iš jauniausių arbatos lapelių [7].

Baltosios arbatos veikliosios medžiagos suklasifikuotos taip:

 Purino grupės alkaloidai 4 %. Pagrindinis iš jų – kofeinas (iki 4 %), teobrominas (0,2 %), teofilinas (0,4 %);

 Fenoliniai junginiai 2,5 – 5 %. Jiems priskiriami flavonoidai, fenolinės rūgštys, katechinai;

 Flavonoidai (iš jų gausiausia katechinų grupė):

galokatechinai (GC); epigalokatechinai (ECG); epigalokatechin-3-galatai; galokatechingalatai; epikatechingalatai

 Fenolinės rūgštys (galo r. (rūgštis), chlorogeninė r., kavos r.) ;

 Aminorūgštys 1 %;

 Eteriniai aliejai iki 0,02 %;

 Mineralinės medžiagos (kalio jonai, chloridai);

 Rauginės medžiagos 10 – 20 % (suteikia sutraukiantį skonį).

1.4 Baltosios arbatos poveikis žmogaus organizmui, antioksidantinės savybės,

aktualumas medicininėje praktikoje

Įvairūs augalai pasižymi skirtingu antioksidantiniu aktyvumu, nes kiekvienas augalas kaupia skirtingas medžiagas, juose skiriasi aktyviųjų junginių kiekiai, nuo kurių priklauso šių medžiagų sukeliami poveikiai žmogaus organizmui. Atsižvelgiant į baltosios arbatos cheminę sudėtį, svarbiausi teigiami poveikiai pasireiškia širdies ir kraujagyslių sistemai, dėl joje esančių fenolinių junginių [29,33,50].

Vieni pagrindinių teigiamų baltosios arbatos poveikių žmogaus organizmui iš yra šie:

 Arbata padeda kaip profilaktinė priemonė sergant širdies ir kraujagyslių ligomis, gali būti vartojama miokardo infarkto prevencijai ir esant padidintam kraujo spaudimui. Suvartojant bent 400 mililitrų arbatos per parą, nustatyta, kad ji mažina aterosklerozinių plokštelių formavimąsi, cholesterolio ir lipidų absorbciją virškinamajame trakte, taip pat skatina jų ekskreciją [15]. Taip pat buvo atliktas 11 metų trukmės tyrimas apėmęs apie

40 000 žmonių, kurie kasdien išgerdavo po penkis puodelius arbatos. Tikimybė mirti nuo infarkto jiems buvo 21 % mažesnė, nei tiems, kurie šio gėrimo išvis nevartojo [15].

 Gali turėti įtakos kontroliuojant kūno svorį, mažinti antsvorį. Ilgalaikis arbatos vartojimas mažina riebalų kaupimąsi organizme, taip pat skatina jų metabolizmą. Šis poveikis nulemtas kofeino, kuris didina energetinį žmogaus aktyvumą, skatina noradrenalino sekreciją [12].

 Arbata pasižymi antioksidantinėmis ir antivirusinėmis savybėmis. Dėl fenolinių junginių ir katechinų, esančių arbatos sudėtyje, in vivo tyrimai parodė, kad nefermentuotos Camellia sinensis L. ekstraktas sumažino Helicobacter pylori kolonizaciją skrandžio sienelės gleivinėje [12].

 Arbatoje esantys antioksidantai gali apsaugoti odą nuo UV spindulių ir laisvųjų radikalų poveikio, kurie gali turėti įtakos tam tikriems DNR pakitimams, sukelti baltymų, angliavandenių ar lipidų pažeidimus [12].

 Arbatos fenoliniai junginiai taip pat gali turėti antimutageninį ir priešvėžinį poveikį žmogaus organizmui [12]. Arbatos ištraukos vartojimas turėjo įtakos vėžinių ląstelių proliferacijai virškinamajame trakte, taip pat silpnai slopino ir tokių ląstelių augimą. Atliktų tyrimų duomenimis, bent po tris puodelius per dieną arbatą geriančioms moterims, rizika susirgti kasos vėžiu sumažėjo 50 %, lyginant su tomis, kurios negėrė baltosios arbatos. Kitų tyrimų duomenimis, baltoji arbata galėjo padėti sumažinti riziką susirgti ir kitų rūšių, tokių kaip prostatos, krūties, storosios žarnos, kiaušidžių, stemplės, odos, plaučių vėžiu [4].

 Arbatos užpilai pasižymi antidiabetiniu poveikiu, jie sumažina gliukozės koncentraciją kraujyje, nekeičiant insulino lygio jame [15]. Penkerius metus trukusiame tyrime, kurio imtis buvo apie 17000 vyrų ir moterų (nuo 40 ik 65 metų), nustatyta, kad žmonėms sergantiems antro tipo diabetu, išgeriantiems šešis puodelis arbatos per dieną, gliukozės koncentracija kraujyje kontroliuojama efektyviau, negu tiems, kurie išgeria tik vieną puodelį kasdien [4].

1.5 Baltosios arbatos flavonoidai, jų struktūra ir jų analizės metodai

Flavonoidai yra didžiausia fenolinių, metabolitinių junginių grupė (kurių struktūra apima C6– C3–C6 konfigūracijas). Šiuo metu žinoma daugiau nei 9000 tokių junginių, kurie atsirado dėl

vykstančių modifikacijų flavonoidų biosintezės metu. Tai viena svarbiausių augaluose aptinkamų junginių grupių. Jų daug aptinkama vaisiuose, daržovėse, sėklose, žieduose, vaistažolėse, meduje, grūdinės kilmės produktuose, arbatoje. Flavonoidų struktūros pagrindas yra du aromatiniai žiedai (A ir B), sujungti anglies atomų tilteliu su heterocikliniu fenilbenzopirono oksiduotu žiedu (C). Jie gali būti laisvoje arba glikozidinėje formoje, dažniausiai aptinkami glikozido pavidalu. Aglikonai yra aktyvesni už glikozidus, jų antioksidantinis poveikis yra glaudžiai susijęs su chemine molekulių struktūra. Aktyvumas susijęs su B žiedo struktūros pozicija ir hidrolizacijos laipsniu (3‘ ir 4‘ pozicijos, turinčios OH grupes – pakaitalus). C grandinė priklauso nuo B grandinės pozicijos, kurių pagrindinį subpogrupį sudaro flavonoidų grupės: antocianinai, flavonai, izoflavonai ir katechinai. Šie pakaitai gali būti metilinti, acetilinti, prenilinti ar sulfatuoti. Vykstant redukcijai, glikolizinimui, ar sąveikaujant su laisvaisiais radikalais molekulė tampa tirpi vandenyje, tačiau mažiau aktyvi. Flavonoidai dalyvauja įvairiuose mechanizmuose augaluose: fotosintezėje, energijos perdavime augimo reguliacijoje, lyties formavimosi procese, taip pat pasižymi farmakologiniu veikimu žmogaus organizmui. Šiuo metu intensyviai analizuojamas antioksidantinis flavonoidų poveikis [16,20,43].

4 pav. Pagrindinė flavonoidų struktūra:

Fermentacijos metu arbatos lapuose sumažėja aktyviųjų komponentų kiekiai dėl fermentų poveikio, daugiau randama įvairios struktūros junginių, iš katechinų, flavonoidų pasiketę į didesnės molekulinės masės junginius. Flavonoidų klasifikacijos pagrindas yra pakaitų reakcijos. Atitinkamai nuo hidorksilintos formos ir C2 – C3 dvigubos jungties padėties pirono žiede flavonoidai skirstomi i šešias pagrindines grupes:

 Flavonai (flavopiridolinas, apigeninas, luteolinas);

 Flavonoliai (kvercetinas, kamferolis, miricetinas);

 Flavononai (narigeninas, hesperitinas);

 Flavanonoliai (taksifolinas);

 Flavanoliai (katechinas, epikatechinas, epigalokatechinas);

Fermentacijos proceso metu katechinų kiekis mažėja, nors galo rūgšties po fermentacijos žaliavoje rasta daugiau, negu prieš fermentaciją. Nustatyta, kad katechinų kiekis tiesiogiai priklauso nuo ekstrakcijos (tirpiklio), temperatūros ir laiko. Žaliavą kaitinant 120 laipsnių temperatūroje ir po to ekstrahuojant veikliąsias medžiagas iš paruošos 80 laipsnių temperatūros vandeniu, buvo nustatyta daugiau katechinų epimerų: galokatechino galato, galokatechino, katechin galato. To paties tyrimo metu buvo pastebėta ir katechinų migracija į ištrauką: lengviau į ištrauką perėjo mažos molekulinės masės flavonolių molekulės [7,20,45].

Kokybiniam flavonoidų nustatymui gali būti naudojami šie metodai: plonasluoksnė chromatografija, UV spektroskopija, IR spektroskopija, masių spektroskopija, branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija. Kiekybiniam flavonoidų nustatymui naudojama efektyvioji skysčių chromatografija, dujų chromatografija, kapiliarinė elektroforezė ir spektrofotometrija [17,21,47].

Efektyvioji skysčių chromatografija – tai pirmo pasirinkimo metodas tiek kokybiniam, tiek kiekybiniam flavonoidų nustatymui. Dažniausiai atliekama atvirkštinių fazių chromatografija, naudojant C8 ar C18 kolonėles. Gradientiniam eliuavimui naudojamos dviejų tirpiklių sistemos: acetonitrilo – vandens arba metanolio – vandens mišiniai. Kartais naudojami ir kiti tirpikliai, tokie kaip tetrahidrofuranas, izopropanolis, n – propanolis. Gali būti pridedama rūgščių, kurios slopina fenolinių hidroksilo grupių jonizaciją ir taip leidžia gauti ryškesnes smailes. Efektyvioji skysčių chromatografija dažniausiai atliekama kambario temperatūros aplinkoje arba temperatūra gali būti pakeliama iki 40° C, norint sutrumpinti analizės laiką [18,21,49].

ESC–DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodu matuojama tiek antioksidanto geba atiduoti savo vandenilio atomą, tiek prisijungti nesuporuotą elektroną. Šis metodas plačiai naudojamas ne tik dėl savo stabilumo ar greitumo, bet ir paprastos greito analizės, kuriai atlikti reikalingas UV spektrofotometras, jo pagalba galima lengvai įvertinti antioksidantinį poveikį. Remiantis naujausiais duomenimis, DPPH radikalai organiniuose tirpikliuose ar vandeniniuose tirpaluose tirpinami panaudojant miceles ar surfaktantus. Taip gaunama didesnė DPPH radikalų surišimo galimybė, o tai nulemia didesnį rezultatų tikslumą [35,38,51,56].

1.6 Laisvųjų radikalų poveikis organizmui, antioksidantai, antioksidantinis

aktyvumas

Laisvieji radikalai – tai dalelės (atomai arba atomų grupės) turinčios neporinį elektronų skaičių, kuris lemia didelį jų reaktyvumą ir nestabilumą. Tai aktyvios deguonies arba azoto formos, chemiškai aktyvūs junginiai, galintys transformuotis. Jie dažniausiai susidaro įprastų organizmo funkcijų ir reakcijų metu, kaip metabolizmo produktas arba veikiant egzogeniniams veiksniams, tokiems, kaip ultravioletiniai saulės spinduliai, radiacija, jonizuojanti spinduliuotė, stresas, įvairūs kancerogenai, herbicidai, pesticidai ir kt., kai deguonies molekulės reaguoja su kitų medžiagų molekulėmis. Šis procesas silpnina žmogaus imuninės sistemos antioksidantus, todėl pasireiškia žalingas poveikis organizmui [23,24,53]. Didelis kiekis laisvųjų radikalų žmogaus organizmui yra kenksmingas, gali sukelti baltymų, angliavandenių, lipidų, o svarbiausia – DNR pakitimus ir įvairius patologinius sutrikimus. Laisvieji radikalai reaguoja su sveikomis organizmo ląstelėmis, norėdami stabilizuotis, paima iš jų reikiamą elektroną. Organizmui nespėjant tokių reiškinių slopinti, gali didėti žalojantis laisvųjų radikalų poveikis, kuris būtų susijęs su tam tikromis organizmo funkcijų problemomis bei ligomis, tokiomis kaip: imunosupresija, infekcinės ligos, autoimuninės ligos, lėtinės degeneracinės nervų sistemos ligos, kvėpavimo takų funkcijos pablogėjimas ar ligos [24].

Laisvieji radikalai yra labai dažna chroninių ir degeneracinių ligų priežastis. Jie sukelia ląstelių pažeidimus bei riebiųjų rūgščių peroksidaciją ląstelių membranose, jie gali reaguoti su visomis DNR sudedamosiomis dalimis, taip pakenkdami bazėms ir dezoksiribozės pagrindui. Grandininės reakcijos, kuriose dalyvauja laisvieji radikalai, sukelia organizmo senėjimą, jungiamojo audinio uždegimą. Oksidacinis stresas – tai antioksidantų ir laisvųjų radikalų sutrikusios pusiausvyros rezultatas, kurių patogenezės rezultatas – uždegiminės ir degeneracinės ligos, išemija, aterosklerozė, vėžys dėl sukeltų mutacijų, organizmo senėjimas. Stiprus oksidacinis stresas sukelia ląstelės mirtį. Tokias fizines ir ląstelines būkles, gali sukelti mineralų, antioksidantų stoka maiste. Nuo oksidacinio streso sukeliamų pažeidimų ląstelės apsisaugo naudodamos fermentiniais ir su fermentais nesusijusias antioksidantines sistemas. Ląstelė gali apsisaugoti nuo švelnaus oksidacinio streso, didinant antioksidantinės apsaugos fermentų sintezės greitį. Tačiau kartais organizmas nėra pajėgus kovoti su didesniais kiekiais žalojančių veiksnių, organizmo apsaugos mechanizmai būna nepakankamai efektyvūs. Todėl žmogaus organizmas turi gauti papildomus antioksidantų kiekius, kad būtų išvengta žalojančio laisvųjų radikalų poveikio. Laisvieji radikalai reikalingi imuninei

sistemai, norint užtikrinti efektyvų atsaką esant tam tikroms bakterinėms ar virusinėms infekcijoms, nors jų perteklius organizmui gali būti žalingas [25,26,54].

Antioksidantai – tai molekulės, kurios geba surišti laisvuosius radikalus, atiduodami savo elektronus ar vandenilį, inaktyvuoja juos. Taip neutralizuodami ir apsaugodami ląsteles nuo kenksmingos žalos organizmui, jie saugo nuo žalingų oksidacinių reakcijų poveikio ir stabdo jų susidarymą. Laisvieji radikalai surišami dviem etapais: pirmiausiai atiduodamas vandenilio atomas, o po to prijungiamas laisvas elektronas. Jų surišimo geba priklauso nuo flavonoido molekulės struktūros ir pakaitų skaičiaus bei jų išsidėstymo [27,42].

Medžiagos turinčios antioksidantinių savybių gebėjimą surišti laisvuosius radikalus lemia šios savybės:

 Struktūrinis suderinamumas tarp antioksidanto bei laisvojo radikalo molekulių;

 Laisvų radikalų ir antioksidantų koncentracija

 Organizmo metabolizmas, pasiskirstymas bei absorbcija

 Galima sąveika su kitais antioksidantais [28,30].

Antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo antioksidanto patvarumo bei tirpumo, oksidacijos – redukcijos potencialo ir aktyvacijos energijos. Organizme yra dvi viena kitą papildančiai veikiančios antioksidantinės sistemos:

 fermentinė – tai antioksidantinė sistema, paremta fermento katalazės, kuri superoksidą verčia vandenilio peroksidu, katalizuojant šį procesą, neutralizuojami laisvieji radikalai, organizmas apsaugomas nuo žalingo radikalų poveikio;

 nefermentinė – šiai sistemai priklauso mažo dydžio molekulės, kurios nutraukia grandinines reakcijas, priimdamos elektroną iš radikalo ir taip sudarant stabilius tarpinius produktus, kurie lengviau pašalinami iš organizmo [29,30].

Antioksidantai taip pat gali būti egzogeninės arba endogeninės kilmės, t.y. sintezuojami paties organizmo ir gaunami su maistu arba maisto papildais. Veikiant išoriniam veiksniams, endogeninių veiksnių ne visada pakanka norint užtikrinti homeostazę ir išvengti organizmą žalojančio poveikio, todėl papildomai reikalingi ir egzogeniniai antioksidantai [26,30].

Antioksidantai taip pat gali būti klasifikuojami ir į sintetinius ir natūralius. Maisto pramonėje dažnai yra naudojami sintetiniai antioksidantai, siekiant prailginti maisto galiojimo terminą, sulėtinti greitą produktų gedimą, dėl tam tikrų skonio ar kvapo savybių gerinimo. Šios grupės antioksidantai, patekę į organizmą yra kaupiami riebaliniame audinyje, slopina imuninę sistemą. Saugesnė alternatyva yra natūralūs antioksidantai, kurių yra gausu augaluose. Augalai tai vienas svarbiausių šių medžiagų šaltinių. Jų vartojimas gali lėtinti organizmo senėjimo procesus bei

mažinti tikimybę sirgti kai kuriomis lėtinėmis ligomis bei saugoti nuo oksidacinio streso [29,30,39]. Arbatos flavonoidai yra aktyvesni už tuos, kuriuos gauname vartojant kitos rūšies miastą, remiantis atliktų tyrimų duomenimis, arbata didina antioksidantinį aktyvumą kraujo serume, o taip pat, gali didinti ir kaip kurių antioksidantų, tokių kaip vitamino E, vitamino C, koncentraciją organizme, taigi didėja ir antioksidantinis aktyvumas [31,32].

Antioksidantai žmogaus organizme atlieka svarbų vaidmenį kovojant su reaktyviomis deguonies formomis(ROS) ir taip pat su reaktyviomis azoto formomis(RNS), kurios gali sukelti įvairius organų ar organų sistemų patologinius pakitimus. Antioksidantai šiuos radikalus gali slopinti, modifikuoti, ardyti ar sujungti, jie inaktyvina ROS ir RNS radikalus keliais būdais [31,33,40]:

1) Prisijungiant ir suporuojant laisvojo radikalo elektroną; 2) Atiduodant vandenilio atomą laisvajam radikalui.

Antioksidantinį aktyvumą nulemia – OH grupių buvimas ir jų padėtis molekulėje. Šį aktyvumą didina metoksi ir hidroksilo grupių buvimas molekulėje orto ar para padėtyse. Flavanoiduose antioksidantinį aktyvumą lemia ir didina dvigubasis ryšys, esantis tarp 2 ir 3 anglies atomo, hidroksilo ir karbonilo grupės bei jų padėtis molekulėje, o tarp flavonoidų labiausiai antioksidantiniu aktyvumu pasižymi flavonai ir katechinai. Šios medžiagos žmogaus organizmui nėra toksiškos, todėl jie yra vieni svarbiausių, aktyvių ir natūralių antioksidantų [31,33,34].

1.7 Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai

Tiriant antioksidantinį aktyvumą, dažnai naudojamos modelinės sistemos su įvairiais radikalais. Metodai, kuriuos galima priskirti antioksidanto vandenilio atomo atidavimu laisvajam radikalui gali būti tokie, kaip: mažo tankio lipoproteinų oksidacijos, fotochemiliuminescescinis, β-karotino blukinimo metodai ir pan. Metodai, kuriuos galima priskirti laisvojo radikalo nesuporuoto elektrono prisijungimu prie antioksidanto, priskiriami geležies jonų redukcijos antioksidantinės galios tyrimas (FRAP), jis atliekamas rūgštinėje terpėje, esant pH 3,6 ir vario jonų redukcijos antioksidantinės galios tyrimas(CUPRAC), kuris paremtas dvivalenčio vario ir neokuprino komplekso redukcija antioksidantu į chromogeninį vario kompleksą. Kitas metodas, kuris gali būti naudojamas antioksidantiniam aktyvumui įvertinti ir jis naudojamas pakankamai plačiai, tai yra jonų redukcijos antioksidantinės galios tyrimas, kuris vyksta dvivalenčiam vario jonui redukuojantis iki vienvalenčio jono (ABTS), naudojant spalvotą tirpalą su medžiaga, kuri būna oksiduojama. Šio metodo metu tirpalas praranda spalvą, o medžiaga nusidažo kita spalva, naudojamas 2,2–azino– bis3–etilbenztiazolin–6–sulfono rūgšties radikalas, terpė turi būti neutrali – 7,4 pH [33,34,44,48].

Naudojant modifikuotus efektyviosios skysčių chromatografijos metodus, siekiama išsiaiškinti atskirų junginių antioksidantinį poveikį esančių ekstraktuose, nurodyti ir įvertinti pagrindinį komponentą, kurį išskyrus turėtų būti kreipiamas didžiausias dėmesys. Po chromatografinio junginių išskyrimo ir nustatymo UV – matomos šviesos detektoriumi įvedama DPPH radikalo į eliuento tėkmę, abu tirpalai susimaišo, užtikrinamas tinkamas sulaikymo laikas, kad įvyktų reakcija, redukuojant laisvus DPPH radikalus, automatiškai keičiasi ir jo spalva, tuo tarpu ir jo absorbcija, tai fiksuoja detektorius ir chromatogramoje duomenys fiksuojami kaip neigiamos smailės [34,38,52]. Kokybės kontrolei reikalingi efektyvūs, šiuolaikiški ir jautrūs analizės metodai, kurie leistų efektyviai jį pritaikyti.

2 EKSPERIMENTINĖ DALIS

2.1. Tyrimo objektas

Tyrimui naudota baltosios arbatos žaliava, pirkta įprastinėje prekybvietėje. Buvo naudotos trys baltosios arbatos rūšys:

1) Pai Mu Tan – tai kiniška baltoji arbata, jos lapeliai sidabriškai balto atspalvio, renkama Fujian provincijoje;

2) Bai Hao Yin Zhen – ši arbatos rūšis renkama Kinijoje iš Yin Zhen arbatos sodo, jos lapeliai taip pat sidabriškai baltos spalvos;

3) Baltoji arbata Peony – ji renkama Kinijoje, Fujian provincijoje.

2.2 Naudotos medžiagos ir reagentai

 Išgrynintas vanduo, buvo ruošiamas vandens valymo sistema MILLIPORE (Bedfordas, JAV);

 Etanolis – C2H5OH buvo gautas iš AB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva);  Metanolis – CH3OH, 99,5 % (BARTA a CIHLAR, Čekija);

 trifluoracto rūgštis – TFR, 98 % (Merck, Vokietija);

 acetonitrilas – ACN „Sigma – Aldrich Chemie GmbH“ (Steinheim, Vokietija)  etilacetatas – (Merck, Vokietija).

2.3. Mėginių paruošimas

Ruošiant mėginius buvo naudojama ekstrakcija (maceracija) optimaliu tirpiklių mišiniu. Buvo sveriama po 0,6 g baltosios arbatos žaliavos kiekvienam mėginiui (n=3). Atsverta žaliava smulkinama elektrine smulkintuve, dedama į 20 ml tūrio mėgintuvėlius, ekstrahavimui naudojamas tirpiklių mišinys buvo sudarytas iš 89 ml vandens, 6 ml acetonitrilo, 1 ml metanolio, 3 ml etilacetato ir 1 ml ledinės acto rūgšties. Mišiniai buvo veikiami ultragarsu 5 minutes kambario temperatūroje ultragarso vonelėje „Bio Sonic UC – 300“ (JAV). Ekstrakcija buvo vykdoma

ultragarso vonelėje, kad garso bangos, prasiskverbdamos į gilesnius ląstelės sluoksnius, suardytų ląstelių sieneles, ir palengvintų pernašą ir į tirpiklį (lengviau išsiskirtų veikliosios medžiagos). Po to mėginiai buvo 10 minučių centrifuguojami esant 400 aps/min. Gautas tirpalas buvo filtruojamas pro membraninį filtrą, kurio porų dydis buvo 0,22 μm („Carl Roth & Co“, Karlsruhe, Vokietija).

2.4 Etaloninių tirpalų paruošimas

Etaloniniai tirpalai buvo ruošiami iš standartinių junginių, gautų iš Fluka (Buchs, Šveicarija) kurių grynumas: epikatechino galato – 97,7 %, epikatechino – 97,8 %, epigalokatechino – 99,4 %, katechino – 99,2 %, galo rūgšties – 97,3 %. Kalibraciniams grafikams sudaryti buvo naudojami skirtingos koncentracijos standartiniai junginiai, juos skiedžiant tirpalu, kurio sudėtis identiška ekstrahentui. Visoms kalibracijoms sudaryti buvo panaudota bent po 5 koncentracijas 5-500 µg/ml intervale.

2.5 Baltosios arbatos žaliavos cheminės sudėties ir antioksidantinio aktyvumo

nustatymas, naudojant ESC–DPPH pokolonėlinį metodą

Baltosios arbatos veikliųjų medžiagų skirstymas atliktas taikant pokolonėlinį efektyviosios skysčių chromatografijos DPPH radikalų surišimo nustatymo metodą. Taikytas gradientinis skirstymas. Medžiagų atskyrimui, naudota 4,6 x 250 mm, 5 μm C18 kolonėlė (Advanced Chromatography Technologies, Škotija) su 5 μm C18 prieškolone. Judrios fazės greitis – 1 ml/min, injekcijos tūris – 10 μl. Eliuentų sistema: A – vanduo / acetonitrilas / metanolis/ etilacetatas / ledinė acto rūgštis (89:6:1:3:1 v/v/v/v/v), B – acetonitrilas. Gradiento sistema: 0–10 min. – 100 % A ir 0 % B, 30 min. – 85 % A ir 15 % B, 40 – 45 min. – 20 % A ir 80 % B, 46 min. – 100 % A ir 0 % B. Absorbcija matuota esant 360 nm bangos ilgiui. Pagal analičių ir etaloninių mėginių eliucijos trukmės sutapimą, identifikuojamos chromatografinės smailės.

5 pav. ESC pokolonėlinio metodo aparatūros schema baltosios arbatos antioksidantų

tyrimams [39].

Analizei naudotas chromatografas Waters 2695( Waters Corporation, Milfordas, JAV) su adsorbciniu UV/VIS detektoriumi Waters 2478 (Waters Corporation, Milfordas, JAV). Nuolatiniam DPPH tirpalo tiekimui naudotas ESC siurblys Gilson pump 305 (Waters, Mideltonas, JAV). Reakcijai panaudota 10 m, 0,5 mm vidinio diametro reakcijos kilpa (Waters Corporation, Milfordas, JAV), kuri buvo laikoma išoriniame termostate (Waters Corporation, Milfordas, JAV), esant 25º C temperatūrai. Šis iš politetrafluoretileno vamzdelis sujungtas su UV – absorbciniu detektoriumi Gilson 118 (Mideltonas, JAV), juo buvo matuojama pratekančio eliuento absorbcija [35,38,52].

Duomenys registruoti – kompiuteriu, duomenų registracijai buvo naudojami dveji kompiuteriai ir originali programinė įranga „Empower 2 Chromatography Data Software“ (Waters Corporation, Milford, JAV).

2.6 Antioksidantinio aktyvumo nustatymas, jo apskaičiavimas

ESC–DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas yra vienas dažniausiai taikomų antioksidantinio aktyvumo nustatymo analizėje. Tyrimui taikomas reagentas DPPH yra stabilus, kambario temperatūroje jis būna violetinės spalvos, turi vieną laisvą elektroną molekulėje. Vykstant reakcijai su tiriamais mėginiais, prisijungus vandenilio atomą gaunamas stabilus gelsvos spalvos DPPH produktas. Antioksidantinis aktyvumas po analizės išreiškiamas atitinkamo standarto ekvivalentais.

Augalinių žaliavų ekstraktų, farmacinių preparatų bei juose esančių junginių antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas pagal etaloninį antioksidantą troloksą. Antioksidantinis aktyvumas

išreiškiamas jam ekvivalentiška antioksidantine geba (TEAC). Jis atitinka trolokso kiekį miligramais, kuris turi tokį patį antioksidantinį aktyvumą esant toms pačioms sąlygoms, kaip ir tiriamas junginys viename grame augalinės žaliavos atitinkamai formuodamas laisvųjų DPPH radikalų surišimo aktyvumą. Šis rodiklis apskaičiuojamas pagal žemiau nurodytą lygtį:

TEAC= *

,(µg)

Čia Sjung. – antioksidantiškai aktyvaus junginio pokolonėlinėje chromatogramoje neigiamos smailės plotas DPPH chromatogramoje;

a – nuolydis iš trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties; Vtirp. –tiriamojo mėginio tūris (ml);

Mband. – tiriamojo augalinės žaliavos kiekis (g).

Antioksidantinis aktyvumas įvertinamas pagal kalibracinę trolokso kreivės lygtį y=1,95×107x+6,46×104;(R2 = 0,9973), tiesiškumo intervalas 0,02–0,12 mg/ml).

3 TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1 ESC metodo optimizavimas

Europos Farmakopėjoje Camelia sinensis L. augalinė žaliava nėra įtraukta, joje nėra reglamentuotas metodas veikliųjų komponentų nustatymui, todėl, prieš pradedant aktyviųjų junginių nustatymą, reikėjo pasirinkti atitinkamą analitinį metodą. Peržvelgus keletą publikacijų šia tema, buvo pasirinktas Astos Špadienės 2014 metų moksliniame straipsnyje publikuotas metodas kaip analizės pagrindas, kuris papildomai buvo optimizuotas ir pritaikytas turimai aparatūrai [55,57,58,59].

Optimizuojant kiekybinį nustatymo metodą, taikomas tiesinio kalibravimo gradavimo grafikas, kurio matematinė lygties išraiška yra tiesinė lygtis: y = a x + b, kurioje analitės smailės plotas – y, o jos kiekis – x.

Metodikos tinkamumui pagrįsti pasirinkta pagrindiniai validacijos kriterijai: tiesiškumas, glaudumas, specifiškumas ir ribos.

3.1.1.

Specifiškumas

Pasirinktos metodikos specifiškumas (angl. Specifity) – tai galimybė įvertinti analitės buvimą tiriamajame mėginyje ir ji visiškai atskiriama nuo priemaišų galimai esančių mišinyje. Šis parametras parodo, kad kiekviena smailė esanti chromatogramoje atitinka po vieną analitę ir yra pagrįsta analitės ir standartų chromatogramų palyginimu. Šiam atskyrimui naudojamas ESC metodas. Analitės fiksuojamos fotodiodų matricos detektoriumi. Tyrimo specifika grindžiama analitės ir standartų palyginimu, lyginant sulaikymo trukmę bei spektrinius sutapimus. Chromatogramos pateiktos 6 pav.

6 pav. Baltosios arbatos (Camellia sinensis L.) ekstrakto ESC chromatograma

1 – galo rūgštis (sulaikymo trukmė 4,2 min), 2 – epigalokatechinas (5,8 min), 3 – katechinas (8,3 min), 4 – epikatechinas (10,1 min), 5 – epikatechino galatas (25,2 min)

3.1.2.

Ribos

Ribos (angl. Range) nurodo tarpą, kuris yra tarp viršutinės ir apatinės koncentracijos, jos parodo analizinio metodo tinkamumą naudojimui, koncentracijos intervalą tiriamajame mėginyje tinkamą pasirinktos metodikos taikymui. Ribos įvertinamos kalibracinės kreivės sudarymo metodu. Mažiausias kiekis, kuris gali būti aptinkamas analitės mėginyje yra vadinamas aptikimo riba (angl. Detection limit), o mažiausias analitės kiekis, kuris gali būti kiekybiškai aptinkamas reikiamo tikslumo ribose vadinamas kiekybinio nustatymo riba (angl.Quantitation limit). Tyrimo metu buvo nustatytos kiekybinio nustatymo ribos pateiktos 1 lentelėje:

1 lentelė. Camellia sinensis L. tiriamųjų komponentų kiekybinio nustatymo ribos (angl.Quantitation limit).

Fenolinis junginys Kiekybinio nustatymo riba (μg/ml)

Epikatechinas 0,87

Epikatechino galatas 0,62

Epigalokatechinas 1,22

Katechinas 0,96

Galo rūgštis 0,46

Tyrimo metu buvo nustatyta aptikimo ribos, pateiktos 2 lentelėje:

2 lentelė. Camellia sinensis L. tiriamųjų komponentų aptikimo ribos (angl. Detection limit).

Fenolinis junginys Kiekybinio nustatymo riba (μg/ml)

Epikatechinas 0,32 Epikatechino galatas 0,25 Epigalokatechinas 0,65 Katechinas 0,51 Galo rūgštis 0,19

3.1.3.

Glaudumas (preciziškumas)

Šis parametras nustatomas atliekant matavimų seriją, 3 analizės pakartojimus, kurių metu naudojamas tas pats tiriamasis mėginys, jis išreiškiamas vertinant analitinės procedūros dispersiją, standartiniu nuokrypiu arba variacijos koeficientu iš matavimų imties. Pasirinktos metodikos glaudumas gali būti vertinamas trim aspektais: pakartojamumu, atkuriamumu bei tarpiniu preciziškumu. Gautų rezultatų glaudumas apskaičiuojamas pagal dominančių smailių sulaikymo laikus, smailių plotų vidurkius skaičiuojant standartinį nuokrypį SSN % (standartinio nuokrypio ir vidurkio reikšmės santykis), kuris kitaip vadinamas variacijos koeficientu (angl. RSD % ar CV %), kiekybiniam metodui šis parametras neturėtų viršyti 5 %.

Preciziškumui nustatyti buvo atliekama 3 analizės pakartojimai ir apskaičiuotas variacijos koeficientas. Gauti duomenys pateikti 3 lentelėje:

3 lentelė: Camellia sinensis L. tiriamųjų komponentų preciziškumo variacijos koeficientas

sulaikymo laikui

Fenolinis junginys Variacijos koeficientas sulaikymo laikui (%)

Epikatechinas 2,1

Epikatechino galatas 3,2

Epigalokatechinas 0,8

Katechinas 1,8

Galo rūgštis 3,6

Variacijos koeficientas sulaikymo laikui svyruoja nuo 0,8 iki 3,6 %. Apibendrinus gautus duomenis galima daryti išvadą, kad šis rodiklis neviršija rekomenduojamų 5 % ir atitinka analitiniams metodams keliamus reikalavimus, todėl metodas yra tinkamas kiekybiniam tirpalų nustatymui.

3.1.4.

Tiesiškumas

Tai yra geba gauti chromatogramose detektoriaus atsako įverčius, kurie yra proporcingi analitės kiekinei koncentracijai mėginyje [18]. Ribos, kurias pagrindžia tiesiškumas yra nuo 80 % iki 120 %. Tyrimo metu buvo sudaromos kalibracinės kreivės analizuojamoms medžiagoms, kurių lygtys tiesinės, sulaikymo laikas adekvatus etalonų sulaikymo laikui. Nustatomas koreliacijos koeficientas R2 yra artimas 1, todėl tai rodo stiprią tiesinę priklausomybę. Kalibracinės kreivės pavaizduotos 9–11 pav, o tiesiškumo duomenys – 3 lentelėje.

4 lentelė. Kalibracinių kreivių charakteristikos

Fenolinis junginys Koreliacijos koeficientas Kalibracinės kreivės lygtis Sulaikymo laikas (min.) Tiesiškumo ribos (µg/ml) Epikatechinas 0,999095 Y=5.89+103x+2.89+103 10,1 (5,13-200) Epikatechino galatas 0,999735 Y=2.20+104x+4.45+104 25,2 (7,23-200) Epigalokatechinas 0,990300 Y=1.43+103x-3.22+104 5,8 (6,89-200) Katechinas 0,999718 Y=6.75+103x+2.36+104 8,3 (10,3-500)

7 pav. Epikatechino galato kalibracinė kreivė, kurios koreliacijos koeficientas 0,999735

8 pav. Katechino kalibracinė kreivė, kurios koreliacijos koeficientas 0,999718

S m ail ės p lotas Koncentracija μg/ml Koncentracija μg/ml S m ail ės p lotas

9 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė, kurios koreliacijos koeficientas 0,999438

10pav. Epigalokatechino kalibracinė kreivė, kurios koreliacijos koeficientas 0,990300 Koncentracija μg/ml S m ail ės p lotas Koncentracija μg/ml S m ail ės p lotas

11 pav. Epikatechino kalibracinė kreivė, kurios koreliacijos koeficientas 0,999095

Remiantis kalibracinėmis kreivėmis, galima teigti, jog tiesiškumas tenkina kiekybinio tyrimo reikalavimus baltosios arbatos analizei, nes visų analičių koreliacijos koeficientai yra didesni negu 0,99, kalibracinės kreivės ir smailės ploto priklausomybės yra pakankamai stiprios, teisiškumas atitinka keliamus reikalavimus, todėl remiantis šiuo kriterijumi metodas yra tinkamas kiekybiniam tirpalų tyrimui atlikti.

3.2 Baltosios arbatos žaliavos fenolinių junginių kiekybinis įvertinimas ESC

metodu

Fenolinių junginių kiekybinė analizė tiriamojoje augalinėje baltosios arbatos žaliavoje buvo atlikta naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Buvo tirti trys baltosios arbatos ekstraktai. Identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti šie fenoliniai junginiai (epikatechinas, epigalokatechinas, epikatechino galatas, katechinas) bei fenolinė rūgštis (galo rūgštis). Trijų baltosios arbatos rūšių ekstraktų chromatogramos pateiktos 12,14,16 paveiksluose. Kiekybiniam nustatymui naudojami kalibracinių kreivių grafikai, chromatografinės smailės buvo identifikuojamos palyginant analičių sulaikymo laiką bei spektrą su standartais, tai yra analizuojant analičių smailių priklausomybę nuo analičių koncentracijos tiriamuosiuose tirpaluose. Epikatechino, epigalokatechino, epikatechino galato, katechino absorbcija buvo matuojama esant 275 nm bangos ilgiui, galo rūgšties (fenolinės rūgšties) buvo matuojama esant 270 nm bangos ilgiui. Su kiekvienu žaliavos mėginiu bandymai buvo atliekami tris kartus ir išvestas gautų rezultatų matematinis vidurkis. Koncentracija μg/ml S m ail ės p lotas

3.2.1.

Baltosios arbatos žaliavų fenolinių junginių kiekybinis įvertinimas

12 pav. Pai Mu Tan baltosios arbatos chromatogramos ESC metodu

1 – galo rūgštis, 2 – katechinas, 3 – epikatechinas, 4 – epigalokatechinas, 5 – epikatechino galatas.

Iš atlikto tyrimo chromatogramos apskaičiavus kiekybinę Pai Mu Tan arbatos rūšies sudėtį, daugiausiai varijavo epikatechino galatas (222,571 ± 11,128 μg/g), tuo tarpu mažiausiai buvo aptikta epikatechino. Detali šios arbatos rūšies kiekybinė sudėtis pavaizduotas 13 paveiksle.

13 pav. Pai Mu Tan arbatos veikliųjų medžiagų kiekybinė sudėtis. Galo r. Epigalokatechi

nas Katechinas Epikatechinas

Epikatechino galatas Konc. 16.381 177.234 89.588 10.197 222.571 0 50 100 150 200 250 K o n ce n tr ac ija μ g/ g

Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos detalus chromatografinis išskirstymas pavaizduotas 14 paveiksle.

14 pav. Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos chromatogramos A – ESC metodu, B –

naudojant ESC pokolonėlinį DPPH radikalų surišimo metodą

1 – galo rūgštis, 2 – katechinas, 3 – epikatechinas, 4 – epigalokatechinas, 5 – epikatechino galatas.

Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos rūšyje didžiausias kiekis buvo aptiktas epikatechino galato (364,204 ± 18,21 μg/g), šiek tiek mažesnis buvo epigalokatechino kiekis (203,361 ± 10,168 μg/g), o mažiausias kiekis iš nustatytų veikliųjų komponentų buvo aptiktas epikatechino (11, 83 ± 0,591 μg/g). Detalus šios arbatos veikliųjų medžiagų pasiskirstymas pateiktas 15 paveiksle.

15 pav. Bai Hao Yin Zhen arbatos veikliųjų medžiagų kiekybinė sudėtis Galo r. Epigalokatechi

nas Katechinas Epikatechinas

Epikatechino galatas Konc. 27.736 203.361 87.668 11.831 364.204 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 K o n ce n tr ac ija μ g/ g

Peony baltosios arbatos detalus chromatografinis išskirstymas pavaizduotas 16 paveiksle.

16 pav. Peony baltosios arbatos chromatogramos ESC metodu

1 – galo rūgštis, 2 – katechinas, 3 – epikatechinas, 4 – epigalokatechinas, 5 – epikatechino galatas.

Peony baltojoje arbatoje didžiausias kiekis iš komponentų buvo epigalokatechino (166,596 ± 8,33 μg/g), mažiausias – epikatechino (4,077 ± 0,204 μg/g), detalus fenolinių junginių pasiskirstymas pateiktas 17 paveiksle.

17 pav. Peony arbatos veikliųjų medžiagų kiekybinė sudėtis. Galo r. Epigalokatechi

nas Katechinas Epikatechinas

Epikatechino galatas Konc. 37.783 166.596 29.007 4.077 83.435 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 K o n ce n tr ac ija μ g/ g

3.2.2.

Baltosios arbatos rūšių fenolinių junginių kiekio palyginimas

18 paveiksle i pavaizduotas fenolinių junginių kiekis visose trijose baltosios arbatos rūšyse naudojant ESC metodą.

18 pav. Fenolinių junginių pasiskirstymas trijose baltosios arbatos rūšyse.

Pateiktam paveiksle matyti, kad nustatytų fenolinių junginių kiekiai yra gana panašūs šiose arbatos rūšyse. Mažiausią dalį iš identifikuotų medžiagų sudaro epikatechinas, didžiausias kiekis iš nustatytų fenolinių junginių visose arbatos rūšyse buvo epigalokatechino ir epikatechino galato.

Buvo palygintas trijų arbatos rūšių bendras fenolinių junginių kiekis, detalus arbatos rūšių fenolinių junginių palyginimas pateiktas 19 paveiksle.

16.4 27.7 37.8 177.2 203.4 166.6 89.6 87.7 29.0 10.2 11.8 _4.1 222.6 364.2 83.4 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0

Pai Mu Tan Bai Hao Yin Zhen Peony Galo r. Epigalokatechinas Katechinas Epikatechinas Epikatechino galatas Konc.

19 pav. Fenolinių junginių pasiskirstymas trijose baltosios arbatos rūšyse

Pateiktam paveiksle matyti, kad didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo identifikuotas Bai Hao Yin Zhen baltojoje arbatoje – 694,8 ± 34,74 μg/g, mažiausiu kiekiu pasižymėjo Peony baltoji arbata – 320,9 ± 16,045 μg/g, tuo tarpu Pai Mu Tan baltojoje arbatoje identifikuota – 516 ± 25,8 μg/g fenolinių junginių. Šis fenolinių junginių pasiskirstymas gali būti siejamas su skirtingu arbatmedžio kultivavimo regionu.

Tyrimo metu buvo lyginimas fenolinių junginių kiekis pagal augimvietės ir rinkimo regioną, baltoji arbata Peony ir Pai Mu Tan renkama ir gaminama Kinijos Fujian provincijoje, o Bai Hao Yin Zhen renkama ir gaminama Kinijos Yin Zhen regione. Palyginimui buvo įvertintas baltosios arbatos identifikuotų fenolinių junginių kiekis pagal regioną, detalus palyginimas pateiktas 20 paveiksle.

Pai Mu Tan Bai Hao Yin Zhen Peony

μg/g 516 694.8 320.9 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Fen o lin ių ju n gi n ių ki e ki s μ g/ g

20 pav. Baltosios arbatos fenolinių junginių kiekis skirtingtuose augimvietės regionuose Pateiktam paveiksle matyti, kad Yin Zhen regione auginama arbata pasižymi didesniu fenolinių junginių kiekiu, tuo tarpu Fujian provincijoje auginamos ir kultivuojamos arbatos rūšys pasižymi mažesniu fenolinių junginių kiekiu, galima manyti, kad fenolinių junginių kiekis priklauso nuo regiono ar augimvietės, tą veikti gali skirtingos sąlygos regionuose, drėgmės ir kritulių kiekis, lygmens virš jūros lygio skirtumai, dirvožemio mineralų kiekis ar dirvos rūgštingumas, tačiau šių klimatinių ir dirvožemio sąlygų nežinome, taigi negalime daryti tokių apibendrinačių išvadų.

3.3. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ESC DPPH pokolonėliniu

metodu

Šis metodas plačiai naudojamas fenolinių junginių antioksidantiniam aktyvumo nustatymui, radikaliniam surišimui buvo naudojamas DPPH reagentas. Reakcijos metu antioksidantai esantys baltosios arbatos žaliavoje reaguoja su DPPH ir jis atiduoda vieną vandenilio atomą ir pereina į redukuotą formą. Tyrimo metu geriausiai baltojoje arbatoje esantys junginiai matėsi esant 270 nm bangos ilgiui, todėl jis buvo naudojamas ir tolesnei analizei. Antioksidantinis aktyvumas išreiškiamas trolokso ekvivalentais grame AŽ. Pateikiama antioksidantinio aktyvumo chromatograma prie kiekvienos arbatos rūšies naudojant DPPH radikalų surišimo metodą.

21 paveiksle pateiktas Pai Mu Tan baltosios arbatos rūšies detalus antiradikalinio aktyvumo skirstymas.

Fujian Yin Zhen

μg/g 418.45 694.8 0 100 200 300 400 500 600 700 800 Fen o lin ių ju n gi n ių ki e ki s μ g/ g

3.3.1.

Baltosios arbatos žaliavų antioksidantinio aktyvumo

įvertinimas

21 pav. Pai Mu Tan baltosios arbatos ESC chromatograma naudojant pokolonėlinį DPPH

radikalų surišimo metodą.

1 – galo rūgštis, 2 – katechinas, 3 – epikatechinas, 4 – epigalokatechinas, 5 – epikatechino galatas.

22 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas Pai Mu Tan baltosios arbatos žaliavoje

Pai Mu Tan baltojoje arbatoje atlikus tyrimą ESC–DPPH radikalų surišimo metodu antiradikalinis aktyvumas atlikus skaičiavimus svyravo nuo 15,4 ± 0,77 μmol/g iki 86,02 ± 4,301 μmol/g. Didžiausia antioksidantine geba pasižymėjo epikatechino galatas, mažiausia – katechinas. Vidutinis antioksidantinis aktyvumas šioje arbatos rūšyje buvo nustatytas 34,565 ± 1,728 μmol/g.

Galo r. Epigalokatechi

nas Katechinas Epikatechinas

Epikatechino galatas Kiekis 18.252 31.104 15.4 22.05 86.02 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 An tir ad ika lin is ak tyvy m as TE µ m o l/ g

21 pav. Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos ESC chromatograma naudojant pokolonėlinį DPPH

radikalų surišimo metodą.

22 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos žaliavoje Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos rūšies metanolinio ekstrakto antiradikalinis aktyvumas kito nuo 28,97 ± 1,455 μmol/g iki 138,508 ± 6,925 μmol/g, mažiausia antioksidantine geba pasižymėjo galo rūgštis, didžiausia – katechinas, panašiu antioksidantiniu aktyvumu šioje arbatos rūšyje veikė epigalokatechinas (109,143 ± 5,547 μmol/g) ir epikatechino galatas (104,46 ± 5,223 μmol/g). Vidutinis antioksidantinis aktyvumas šioje arbatos rūšyje buvo nustatytas 86,368 ± 4,318 μmol/g.

Galo r. Epigalokatechi

nas Katechinas Epikatechinas

Epikatechino galatas Kiekis 28.97 109.143 138.508 35.759 104.46 0 20 40 60 80 100 120 140 160 A n tir ad ikal in is akt yv u m as TE μ m o l/ g

23 pav. Peony baltosios arbatos ESC chromatograma naudojant pokolonėlinį DPPH radikalų

surišimo metodą.

24 pav. Antiradikalinio aktyvumo įvairavimas Peony baltosios arbatos žaliavoje

Peony baltojoje arbatoje visi junginiai pasižymėjo pakankamai panašiu antioksidantiniu aktyvumu, išskyrus epikatechiną, kurio redukcinis aktyvumas buvo mažiausias (13,213 ± 0,661 μmol/g), o didžiausia antiradikaliniu aktyvumu pasižymėjo epigalokatechinas (50,257 ± 2,513 μmol/g). Vidutinis antioksidantinis aktyvumas šioje arbatos rūšyje buvo nustatytas 35,627 ±1,781 μmol/g. Galo r. Epigalokatechin as Katechinas Epikatechinas Epikatechino galatas Kiekis 35.678 50.257 45.217 13.213 33.772 0 10 20 30 40 50 60 A n tir ad ikl ai n is akt yv u m as TE μ m o l/ g

3.3.2.

Baltosios arbatos rūšių bendro antioksidantinio aktyvumo

palyginimas

Apibendrinus rezultatus buvo nustatyta, kad didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos rūšis, atlikto tyrimo antioksidantinio aktyvumo rezultatams įtaką turėjo nusatytas bendras fenolinių junginių kiekis, daugiausiai jų varijavo būtent šioje arbatos rūšyje. 25 paveiksle pavaizduotas antioksidantinio aktyvumo pasiskirstymas trijose baltosios arbatos rūšyse.

25 pav. Bendras fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas naudojant ESC-DPPH

radikalų surišimo metodą

Iš pateikto paveikslo matyti, kad panašiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymi Pai Mu Tan ir Peony baltosios arbatos rūšys, kadangi jų bendras fenolinių junginių kiekis atliktus tyrimą buvo identifikuotas panašus. Didžiausiu kiekiu fenolinių junginių, kaip ir antioksidantiniu aktyvumu atlikus tyrimą ir skaičiavimus pasižymėjo Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos rūšis, todėl galima teigti, kad bendras fenolinių junginių kiekis turi įtakos antioksidantiniam aktyvumui, didėjant bendram jų kiekiui, atitinkamai didėja ir antioksidantinis aktyvumas.

Išanalizuotas trijų baltosios arbatos rūšių bendro fenolinių junginių kiekio antioksidantinis aktyvumas. Detalus antioksidacinio aktyvumo vidurkis kiekvienai baltosios arbatos rūšiai pateiktas 26 paveiksle. 18.3 29.0 35.7 31.1 109.1 50.3 15.4 138.5 45.2 22.1 35.8 13.2 86.0 104.5 33.8 0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 140.0 160.0

Pai Mu Tan Bai Hao Yin Zhen Peony

Galo r. Epigalokatechinas Katechinas Epikatechinas Epikatechino galatas Konc.

26 pav. Fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas trijose baltosios arbatos rūšyse

Pateiktam paveiksle matyti, kad didžiausias antioksidantinis aktyvumas pasireiškė Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos rūšyje – 86,37 ± 4,318 μmol/g, panašiu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo Pai Mu Tan (34,57 ± 1,729 μmol/g) ir Peony ( 35,63 ± 1,782 μmol/g) baltosios arbatos rūšys. Šį skirtumą galima taip pat susieti su skirtingu arbatos auginimo ir kultivavimo regionu.

Tyrimo metu buvo lyginamas arbatos fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas pagal auginimo regioną, 27 paveiksle pateiktas palyginimas tarp Pai Mu Tan ir Peony baltosios arbatos rūšių, kurios kultivuojamos Kinijoje, Fujian provincijoje bei Bai Hao Yin Zhen baltosios arbatos, kuri auginama Kinijoje, Yin Zhen regione.

Pai Mu Tan Bai Hao Yin Zhen Peony

Konc. TE μmol/g 34.57 86.37 35.63 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00 80.00 90.00 100.00 Fen o lin ių ju n ig n ių an tiok si d ac in is akt yv u m as TE μ m o l/ g

27 pav. Baltosios arbatos fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas skirtinguose

auginimo regionuose

Pateiktam paveiksle baltosios arbatos rūšis, auginama Yin Zhen regione pasižymi daugiau nei 1,5 karto didesniu antioksidantiniu aktyvumu, nei baltosios arbatos rūšys, kurios auginamos Fujian provincijoje, todėl galima daryti išvadą, kad antioksidantinis aktyvumas priklauso ne tik nuo fenolinių junginių kiekio, bet ir nuo auginimo regiono.

Fujian Yin Zhen

Konc TE μmol/g 35.1 86.37 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Fen o lin ių ju n gi n ių an tiok si d an tinis akt yv u m as TE μ m o l/ g