MĖLYNŢIEDŢIŲ VIKIŲ (VICIA CRACCA L.) AUGALINIŲ ŢALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

FARMACIJOS FAKULTETAS VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

GRETA VAITOŠKAITĖ

MĖLYNŢIEDŢIŲ VIKIŲ (VICIA CRACCA L.) AUGALINIŲ

ŢALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO

AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Doc. dr. Raimondas Benetis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis parašas Data

MĖLYNŢIEDŢIŲ VIKIŲ (VICIA CRACCA L.) AUGALINIŲ

ŢALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO

AKTYVUMO ĮVERTINIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas Darbą atliko

Doc. dr. Raimondas Benetis Magistrantė

Data Greta Vaitoškaitė, parašas

Data

Recenzentas

Prof. dr. Robertas Laţauskas

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 6

1. SANTRUMPOS ... 7

ĮVADAS ... 8

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 10

2. LITERATŪROS APŢVALGA ... 11

2.1. Oksidacinis stresas, laisvųjų radikalų poveikis ... 11

2.2. Laisvųjų radikalų susidarymo mechanizmai ... 12

2.3. Antioksidantai ... 13

2.4. Fenoliniai junginiai, jų antioksidacinės savybės ... 14

2.5. Fenolinių junginių ekstrakcija, suminio kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose ... 18

3. MĖLYNŢIEDŢIŲ VIKIŲ (Vicia cracca L.) BENDROJI CHARAKTERISTIKA ... 23

4. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 26

4.1. Tyrimų objektas ... 26

4.2. Medţiagos ir reagentai ... 27

4.3. Naudota aparatūra ... 28

4.4. Tyrimų metodai ... 28

4.4.1. Mėlynţiedţių vikių ţaliavų ekstraktų paruošimas ... 28

4.4.2. Reagentų paruošimas ... 28

4.5. V. cracca ţaliavų ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 29

4.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 29

4.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas ... 30

4.5.3. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį Fe2+ jonų sujungimo metodą ... 31

4.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį DPPH radikalų surišimo metodą ... 32

4.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS˙+ metodu ... 32

4.6. Duomenų analizė ... 33

5. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34

5.1 Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 34

5.1.1. Ekstrahento poliškumo nustatymas ... 34

5.1.3. Ekstrakcijos temperatūros parinkimas naudojant ultragarso vonelę ... 36

5.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas V. cracca ţaliavose ... 37

5.3. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas V. cracca ţaliavose ... 40

5.4. V. cracca ţaliavų antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ... 42

5.4.1. Chelatinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo metodu V. cracca ţaliavų ekstraktuose ... 43

5.4.2. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu V. cracca ţaliavų ekstraktuose ... 45

5.4.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS radikalų surišimo metodu V. cracca ţaliavų ekstraktuose ... 49

5.5. Koreliacinių ryšių įvertinimas V. cracca ţaliavų, rinktų skirtingose cenopopuliacijose, tarp suminio flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio ir antioksidacinio aktyvumo ... 51

6. IŠVADOS ... 52

7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 54

SANTRAUKA

Gretos Vaitoškaitės magistro baigiamasis darbas/mokslinis, vadovas doc. dr. Raimondas Benetis, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra, Kaunas. Mėlynţiedţių vikių (Vicia cracca L.) augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.

Darbo tikslas: ištirti natūraliai Lietuvoje augančių mėlynţiedţių vikių (Vicia cracca L.) skirtingų cenopopuliacijų augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį, nustatyti antioksidacinį aktyvumą.

Uţdaviniai: 1) Parinkti optimalias ekstakcijos sąlygas fenolinių junginių ekstrakcijai iš V. cracca ţaliavų. 2) Spektrofotometriniu metodu nustatyti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį, jos įvairavimą natūraliose augimvietėse skirtingose cenopopuliacijose bei skirtingu fenologiniu tarpsniu surinktose, V. cracca augalinėse ţaliavose. 3) Įvertinti V. cracca ţaliavų ekstraktuose kaupiamų biologiškai aktyvių junginių antioksidacinį aktyvumą FIC, DPPH ir ABTS metodais. 4) Palyginti fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinę sudėtį su ekstraktų antioksidaciniu aktyvumu, įvertinti koreliacinius ryšius.

Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti buvo naudojamos natūraliai Lietuvoje augančių mėlynţiedţių vikių (V. cracca) augalinės ţaliavos (ţiedai, lapai, stiebai), surinktos įvairiuose Lietuvos ir Latvijos regionuose iš 20 augimviečių, masinio ţydėjimo metu, 2015 – 2016 metais bei antţeminė augalo dalis surinkta skirtingais fenologiniais tarpsniais, Miliūnų miško pamiškėje, 2015 metais. Ekstrakcijos metodas – ekstrakcija ultragarsu, ekstrahentas - 70 % (V/V) etanolis, ekstrakcijos laikas – 10 min, temperatūra - 40°C. Suminiam fenolinių junginių kiekiui nustatyti taikytas spektrofotometrinis Folin-Ciocalteu metodas, duomenys išreikšti galo rūgšties ekvivalentu (mg/g). Suminiam flavonoidų kiekiui nustatyti taikyta reakcija su AlCl3, rezultatai išreikšti rutino ekvivalentu (mg/g). Antioksidacinis aktyvumas įvertintas tokiais metodais: FIC - rezultatai išreikšti trolokso ekvivalentais (TE, µmol/g) bei DPPH ir ABTS - rezultatai apskaičiuoti procentais.

Rezultatai ir išvados: Tyrimo metu nustatyta, kad V. cracca ţiedų ţaliavose sukaupiami reikšmingi fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai, o jų įvairavimas priklauso nuo fenologinio tarpsnio bei morfologinių augalo dalių. Diţiausias fenolinių junginių ir flavonoidų kiekis nustatytas V. cracca ţiedų ţaliavoje, atitinkamai vidutiniškai 19,014 mg/g ir 12,35 mg/g. Nustatyta, kad V. cracca ţiedų ţaliavų ekstraktai pasiţymi reikšmingu antioksidaciniu aktyvumu. Didţiausias antiradikalinis aktyvumas nustatytas V. cracca ţiedų ţaliavų ekstraktuose, atitinkamai vidutiniškai 33,31 % taikant DPPH ir 19,678 µmol/g taikant ABTS radikalų surišimo metodus. Tiriant FIC metodu, didţiausiu chelatiniu aktyvumu pasiţymi V. cracca ţiedų ţaliavų ekstraktai, vidutiniškai 52,77 %.

SUMMARY

Vaitoškaitė G. Master thesis. Supervisor dr. Raimondas Benetis, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of pharmacy, Departament of Drug Chemistry, Kaunas

The evaluation of phenolic compounds and antioxidant activity of tufted vetch (Vicia cracca L.) raw materials.

The aim of the thesis: to find out the quantitative composition of Vicia Cracca (growing in Lithuania) different cenopopulations raw material phenolic compounds and flavanoids, determine the antioxdidant activity.

The objectives of study: 1) To choose optimal extraction conditions for extraction of phenolic compounds from V. cracca raw material. 2) To determine quantitative composition of phenolic compounds and flavanoids and its„ variety in natural growing sites using spectrophotometry method by using Vicia cracca raw material samples collected in different in cenopopulations and in different phenological phase. 3) To evaluate biological active compounds antioxidant activy, stored in V. cracca raw material, by applying FIC, DPPH and ABTS methods. 4 ) To compare quantitative content of phenolic compounds and flavanoids with extracts antoxidant activity; evaluate correlation.

The methods of the research: for the research were used the raw material of V. cracca (blossoms, leaf and stems) collected from 20 different areas in Lithuania and Latvia, during the phase of mass flowering, in the period of 2015-2016. The ground part of the plant was collected during different phenological phases in the are nearby Miliūnai forest, in 2015. Extraction method – extraction by ultrasound, extrahent – 70 % (V/V) ethanol, the time of extraction – 10 minutes, temperature – 40°C. The method of spectrophotometry Floin-Ciocalteu was applied to determine the total amount of phenolic compounds, the data were defined by gallic acid equivalent (mg/g). To determine the total amount of flavanoids was applied reaction with AlCl3, results were defined by equivalent of rutin (mg/g). The antioxidant activity was evaluated by these methods: FIC – results expressed by trolox equivalent (TE, µmol/g) and DPPH and ABTS - results calculated by percents. Results and conclusions: The research shows that in V. cracca blossoms material are accumulated meaningful amounts of phenolic compounds and flavanoids and their variety depends on phenological phase and on morphological parts of the plant. The biggest amount of phenolic compounds and flavanoids have been detected in the blossoms material of V. cracca, respectively - on average 19,014 mg/g and 12,35 mg/g. There was detected that the extracts of V. cracca blossoms material are known for their significant antioxidant activity. The highest antiradical activity was detected in V. cracca blossoms material, respectively on average – 33, 31%, applying DPPH method and 19,678 µmol/g, applying ABTS radical binding method. The highest chelating activity, applying FIC method, was found in the extracts of V. cracca blossoms material, in average – 52,77 %.

1. SANTRUMPOS

ROS - reaktyviosios deguonies formos RNS - reaktyviosios azoto rūšys Ph. Eur. - Europos farmakopėja

USP - Jungtinių Amerikos Valstijų Farmakopėja V/V - tūrio procentai

NADP - nikotinamido adenino dinukleotido fosfatas ATP - adenozintrifosfatas

FIC - geleţies (II) jonų sujungimo metodas

DPPH - 2,2-difenil-1-pikrikhidrazilo laisvasis radikalas

ABTS - 2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono) rūgšties radikalas. GAE - galo rūgšties ekvivalentai

TE - trolokso ekvivalentai DNR - deoksiribonukleorūgštis

ĮVADAS

Oksidacinis stresas, tai biocheminės pusiausvyros sutrikimas, kuris atsiranda, kai nėra pusiausvyros tarp laisvųjų radikalų ir antioksidantų. Ilgainiui tokio proceso pasekmė gali būti ilgos grandininės reakcijos, kurių metu atsiranda ląstelinės paţaidos, o dėl to gali prasidėti raumenų, jungiamojo ir kitų audinių uţdegimai, pagreitėti organizmo senėjimo procesai, atsirasti degeneraciniai pakitimai, gali pradėti vystytis aterosklerozė bei daugelis kitų ligų [1,2].

Dėl šių prieţasčių šiuo metu atliekama vis daugiau augalų fitocheminės sudėties tyrimų. Taip ieškoma naujų augalinių šaltinių, kurie galėtų kaupti reikšmingus vienų iš svarbiausių antioksidantų grupių – polifenolių kiekius. Šie junginiai gali neutralizuoti laisvųjų radikalų poveikį, slopinti jų susidarymą bei geba sujungti pereinamųjų metalų jonus, kurie katalizuoja laisvųjų radikalų susidarymą [9].

Mėlynţiedis vikis (Vicia cracca L.) – tai Lietuvoje natūraliai augantis, dėl gebėjimo prisitaikyti prie aplinkos sąlygų plačiai paplitęs, pupinių šeimos augalas [31,50]. Tikėtina, kad augalo adaptacija gali būti susijusi su dideliu biosintezuojamų antrinių metabolitų kiekiu. Duomenų apie V. cracca augalinių ţaliavų cheminės sudėties tyrimus rasta nedaug, tačiau kitų pupinių šeimai priklausiančių genčių rūšių augalinėse ţaliavose nustatomi reikšmingi fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai, o jų ekstraktai pasiţymi stipriu antioksidaciniu aktyvumu [37].

Nustatyta, kad augalai, pasiţymintys azotą fiksuojančiomis savybėmis, paprastai kaupia reikšmingus kiekius fenolinių junginių bei flavonoidų [29,31]. V. cracca augalai taip pat pasiţymi azotą fiksuojančiomis savybėmis, todėl tikslinga ištirti fenolinių junginių ir flavonoidų kaupimosi dėsningumus šio augalo ţaliavose [33,36].

Tiriant vikių genties augalo, sėjamojo vikio (Vicia Sativa L.), ţaliavų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą 4-iomis modelinėmis sistemomis, buvo nustatytas stiprus ekstraktų antioksidacinis, priešuţdegiminis, antibakterinis bei antinociceptinis poveikis [48]. Tikėtina, kad V. cracca augalinių ţaliavų ekstraktai taip pat gali pasiţymėti šiomis savybėmis.

Bandymais įrodyta, kad vikių genties augalo Pupos (Vicia faba L.) daigų ekstraktai pasiţymi stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, o daigų ţaliavoje yra L-dihidroksi fenilalanino (L-DOPA), kuris yra dopamino pirmtakas, dėl to yra tiriamos šio augalo panaudojimo galimybės gydant Parkinsono ligą. Nustatyta, kad didėjant fenolinių junginių kiekiui daigų ţaliavoje ir stiprėjant ekstraktų antioksidaciniam aktyvumui, didėja ir L-DOPA kiekis. Manoma, kad Vicia genties augalų ţaliavų ekstraktai, kurie pasiţymi antioksidacinėmis savybėmis, gali būti panaudojami Parkinsono ligos bei degeneracinių ligų gydymui [49]. Kadangi V. cracca augalinių ţaliavų ekstraktų antioksidacinis aktyvumas nėra gerai ištirtas, gali būti tikslinga nustatyti jo fitocheminius rodiklius ir

ekstraktų antiradikalinį aktyvumą in vitro įvertinant jų gebėjimą surišti laisvuosius radikalus bei chelatuoti metalų jonus.

Darbo tikslas: ištirti natūraliai Lietuvoje ir Latvijoje augančių mėlynţiedţių vikių (Vicia cracca L.) augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį ir, nustatyti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas: ištirti natūraliai Lietuvoje ir Latvijoje augančių mėlynţiedţių vikių (Vicia cracca L.) augalinių ţaliavų fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį ir nustatyti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.

Darbo uţdaviniai:

1. Parinkti tinkamiausias fenolinių junginių ekstrakcijos sąlygas iš mėlynţiedţių vikių ţaliavų. 2. Įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinės sudėties rodmenis ir jų įvairavimą V. cracca

augalinėse ţaliavose.

3. Nustatyti V. cracca augalinių ţaliavų ekstraktų antiradikalinį aktyvumą DPPH ir ABTS metodais.

4. Išanalizuoti V. cracca augalinių ţaliavų ekstraktų chelatinį aktyvumą ir jo kitimo dėsningumus fotometriniu geleţies jonų sujungimo metodu.

5. Nustatyti V. cracca augalinių ţaliavų fenolinių junginių bei flavonoidų kiekybinės sudėties ir jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo koreliacinius ryšius.

2. LITERATŪROS APŢVALGA

2.1. Oksidacinis stresas, laisvųjų radikalų poveikis

Oksidacinis stresas – tai ţalingas laisvųjų radikalų poveikis, sukeliantis potencialią biologinę ţalą [2]. Oksidacija yra procesas, kuris mūsų organizme vyksta natūraliai, arba ji gali būti dėl aplinkos poveikio: cigarečių dūmų, ultravioletinių spindulių, radiacijos [1,2]. Oksidacinį stresą sukelia laisvųjų radikalų formavimasis (ROS/RNS gamybos padidėjimas), taip pat fermentinių ir nefermentinių antioksidantų trūkumas [7]. Oksidacinis stresas atsiranda dėl vykstančių metabolinių reakcijų, kurių metu sunaudojamas deguonis ir taip gyvuosiuose organizmuose atsiranda oksidantų (laisvųjų radikalų)/prooksidantų pusiausvyros sutrikimai [2,7].

Laisvieji radikalai – tai molekulės ar molekulių dalys, turinčios vieną ar kelis nesuporuotus elektronus atome ar molekulinėje orbitalėje. Dėl nesuporuotų elektronų, laisvieji radikalai yra labai reaktyvūs [2]. Normaliomis sąlygomis ROS sintetinimo procesas vyksta reguliariai ir kontroliuojamai, o susidariusi ROS koncentracija būna maţa - vidutinė, tuomet sukeliamas teigiamas poveikis organizmo funkcijoms [7]. ROS gamyba yra svarbi fiziologiniams procesams, pavyzdţiui, ląstelių adaptacijai, jie dalyvauja ląstelinio atsako reguliavime esant ląstelių paţeidimui, generuoja gynybinį atsaką veikiant infekcijai, atlieka ląstelių signalinių sistemų funkciją. Vienas iš naudingiausių ROS poveikių yra mitogeninio atsako sukėlimas [1,4,7]. Nustatyta, kad ROS signalai yra svarbus faktorius, atsakingas uţ daugelį procesų, katalizuojamų proteinkinazių, fosfatazių ir daug kitų fermentinių reakcijų, nors tai ir nėra tiesioginiai laisvųjų radikalų poveikiu paremti procesai [6]. Pastebėta, kad ląsteliniame lygyje ROS reguliuoja augimą, apoptozę ir kitus signalus, o sistemos lygmeniu jie prisideda prie sudėtingų funkcijų, tokių kaip kraujo spaudimo reguliavimas, kognityvinė, imuninė organizmo funkcijos [1,4,6]. Širdies – kraujagyslių sistemoje ROS yra būtini normaliai fiziologinei veiklai tiek endotelio homeostazės palaikymui, tiek lygiųjų raumenų susitraukimui. ROS skatina Ca2+ jonų atsipalaidavimą iš sarkoplazminio tinklo, o tai yra pagrindinis veiksnys raumenų susitraukimui. Nikotinamido adenino dinukleotido fosfato (NADPH) oksidazės (fermentai, reikalingi ROS susidarymui) dalyvauja skeleto raumenų ląstelių proliferacijos procese [1,4].

Tuo tarpu padidėjusi nekontroliuojama ROS gamyba, koncentracijos reguliavimo fermentais sutrikimai, esant antioksidantų trūkumui, lemia ROS gamybos ir pašalinimo disbalansą, sutrikusią jų neutralizaciją, o tokių veiksnių rezultatas yra oksidacinis stresas, ląstelių struktūriniai ir funkciniai pakitimai [1,2,5].

Dėl ROS pertekliaus poveikio vystosi kraujagyslių sienelių paţeidimai, daugėja uţdegimo paveiktų ląstelių, vyksta lipidų peroksidacija, ekstraląstelinio matrikso pakitimai – tokie veiksniai sukelia kraujagyslių pakitimus. Atliktų tyrimų duomenys rodo, kad ROS ir oksidacinis stresas yra veiksniai dalyvaujantys kraujagyslių ligų, tokių kaip arterinės hipertenzijos, aterosklerozės, restenozės,

pilvo aortos aneurizmos atsiradime ir progresavime [4]. ROS yra kenksmingi ne tik ląstelių DNR, bet ir ląsteliniams komponentams, įskaitant fosfolipidų polinesočiąsias rūgštis, kurios yra labai jautrios oksidacijai [7].

Nuolatinė genetinės medţiagos modifikacija vyksta dėl oksidantų sukeliamos ţalos, o tai formuoja mutageninį, kancerogeninį ir senėjimą skatinantį poveikį [3,5]. Daugelį navikinių susirgimų charakterizuoja suaktyvėjusi ROS gamyba vėţinėse ląstelėse. ROS vėţinėse ląstelėse sintetina tiek NADPH oksidazės, tiek mitochondrijos. Nustatyta, kad dėl branduolio ar mitochondrijų genų mutacijos, atkoduojami mitochondrijų elektronų transporto grandinės komponentai, kurie gali stimuliuoti superoksido gamybą. Pavyzdţiui, ROS hipersekrecija buvo nustatyta prostatos, kasos, melanomos ir gliomos ląstelėse, taip pat krūties, kepenų, šlapimo pūslės, storosios ţarnos, kiaušidţių vėţio ląstelėse. Nuo NADPH įvairių izoformų priklausoma ROS gamyba yra atsakinga uţ piktybinių auglių išsivystymą, progresą, antiapoptozinį aktyvumą. Remiantis moksliniais šaltiniais, tai gali būti viena iš prieţasčių, kodėl kai kurios vėţio rūšys yra tokios agresyvios ir atsparios chemoterapijai [5]. Senėjimo procesas taip pat visada yra charakterizuojamas ţalingu ROS hiperprodukcijos poveikiu [4,5]. Panašus ROS poveikis yra siejamas ir su kitų patologijų, tokių kaip cukrinis diabetas vystymusi [6,7]. Naujausių tyrimų rodmenys pripaţįsta teoriją, kad mitochondrijų disfunkcija nėra insulino rezistentiškumo vystymosi pasekmė – tai ROS gamybos skeleto raumenyse sukeltos hiperlipidemijos komplikacija, kuri gali skatinti mitochondrijų pakitimus, lipidų kaupimąsi ir insulino poveikio slopinimą. Skirtingi keliai lemiantys atsparumą insulinui gali veikti sinergistiškai, nes suaktyvėjusi ROS gamyba mitochondrijose gali sukelti mitochondrijų disfunkciją, kas dar labiau padidina ROS produkciją dėl kurios nustatomas ţalingas grįţtamasis ryšys [6].

Iš ROS gaunamas malondialdehidas (MDA), kuris yra mutageniškas bakterijoms, ţinduolių ląstelėms, taip pat ištirtas MDA karcinogeninis poveikis ţiurkėms [7]. ROS oksiduojantis poveikis baltymams buvo įrodytas tyrimo metu juos paveikus jonizuojančia spinduliuote, suformavus hidroksilo arba hidroksilo/peroksilo radikalų mišinį. Rezultatai vertinti matuojant karbonilo grupių koncentraciją. Tyrimas parodė, kad visos baltymo aminorūgštys, ypač cisteino ir metionino, yra jautrios oksidacijai [7,8].

2.2. Laisvųjų radikalų susidarymo mechanizmai

Svarbiausia radikalų klasė egzistuojanti gyvuosiuose organizmuose yra radikalai gauti iš deguonies – reaktyvieji deguonies radikalai (minėti ROS). Molekulinis deguonis turi unikalią elektronų konfigūraciją ir pats yra kaip radikalas. Deguonies papildymas elektronu formuoja superoksido anijoninį radikalą (O2 −) . Superoksido radikalas sukelia metabolinius procesus ir kaip pirminis radikalas lemia antrinių radikalų susidarymą tiesioginiu keliu ar dalyvaujant fermentams arba

metalų katijonams [2, 7]. Iš superoksido radikalo susidaro hidroksilo radikalas (HO•), peroksilo radikalas (RO2•), alkoksilo radikalas (RO•), ir neradikalinės formos - vandenilio peroksidas (H2O2), peroksinitritas (ONOO-) [7,8,9]. Hidroksilo radikalas yra labiausiai reaktyvus, jo gyvavimo pusperiodis yra 10−9 s [3]. Hidroksilo radikalas gali būti gaunamas vykstant H2O2 reakcijai su geleţimi arba variu (Fentono reakcija). Prieš tai O2 − yra verčiamas fermento superoksido dismutazės į H2O2. Taigi O2

−

yra laikomas H2O2 prekursoriumi, o pats H2O2 veikia kaip signalo perdaviklis [7,8]. Hidroksilo radikalas gali atakuoti ir paţeisti polinesočiąsias riebalų rūgštis, suardant membranų vientisumą, proteinus ir fermentus, paţeidţiant funkcines savybes ir nukleino rūgštis, sudarant sąlygas mutacijų atsiradimui ir galiausiai ląstelę privedant iki senėjimo ir mirties [8].

Ţinduolių ląstelėse iš L-arginino dalyvaujant NO sintazei (NOS) sintetinamas radikalas (NO•). Šis radikalas santykinai nereaktyvus, tačiau iš jo gaminasi keletas reaktyvių azoto radikalų, vadinamų reaktyviosiomis azoto formomis (RNS). Esant uţdegimui ir suaktyvėjus imuninei sistemai gaminasi tiek superoksido anijonas, tiek azoto oksidas, tuomet jie gali veikti kartu ir dėl to sintetinami dideli peroksinitrito anijono (ONOO-) kiekiai, o šis oksidatorius yra labai reaktyvus ir gali sukelti DNR grandinės ardymą ir lipidų oksidaciją. Taip pat peroksinitritas (ONOO-) suirdamas išlaisvina nedidelius kiekius labai reaktyvaus •OH [2,8,9].

Laisvųjų radikalų susidarymo procesas aktyviausias ląstelių mitochondrijose. Mitochondrijose vykstančios elektronų transporto grandininės reakcijos yra pagrindinis energetinės medţiagos adenozintrifosfato (ATP) šaltinis ląstelėse. Energijos perdavimo metu, dalis elektronų panaudojami laisvųjų radikalų formavimui, o ne vandens susidarymui. Pagal susidariusių radikalų kiekį, galima spręsti, kad mitochondrijose 1-3% bendro elektronų kiekio yra panaudojama laisvųjų radikalų gamybai [2,9].

Laisvieji radikalai sintetinami dalyvaujant fermentui NADPH oksidazei [1,4]. NADPH oksidazės dalyvauja ROS sintezėje mitochondrijose, citozolyje, endoplazminiame tinkle, lizosomose. Dėl suaktyvėjusių NADPH oksidazių poveikio, gauti ROS gali dar padidinti laisvųjų radikalų formavimąsi mitochondrijose ir atvirkščiai [3].

2.3. Antioksidantai

Antioksidantai – tai medţiagos, kurios organizme sudaro gynybos sistemas, apsaugodami ląsteles nuo laisvųjų radikalų poveikio. Antioksidantai neutralizuoja deguonies ir azoto laisvuosius radikalus, verčia juos neaktyviomis molekulėmis ir taip apsaugo ląsteles nuo paţaidos. Taip pat jie dalyvauja jau ROS/RNS paveiktų ląstelių atkūrimo mechanizmuose, bei apsaugo dar nepaţeistas ląsteles. Antioksidantai skiriami į fermentinius ir nefermentinius, skiriasi ir jų gavimo šaltiniai.

Duomenys pateikti 1 lent. Normaliomis sąlygomis organizmo ląstelėse yra šių radikalų pusiausvyra [2,7,9].

1 lentelė. Antioksidantų tipai: [7,9]

Antioksidantų tipai Pavyzdţiai Gavimo šaltiniai

Fermentiniai

Superoksido dismutazė (SOD) Gaminami organizme (citoplazma, mitochondrijos) - endogeniniai Glutationo peroksidazė (GPx)

Katalazė (CAT) Nefermentiniai

Vitaminas C Gaunami su maistu - egzogeniniai

Vitaminas E Glutationas (GSH) Karotinoidai Flavonoidai Fenoliniai junginiai Antocianai Kiti

Vienas iš pagrindinių antioksidantų yra GSH. Jis ląstelės branduolyje yra svarbus DNR grandinės ekspresijai, būtiniausių baltymų gamybai. Oksiduotas glutationas kaupiasi ląstelėse, normaliomis sąlygomis jo santykis yra tinkamas apsaugai nuo oksidacinio streso [8]. Glutationas apsaugo organizmą nuo oksidacinio streso per kelis mechanizmus: jis yra fermentų, katalizuojančių laisvųjų radikalų detoksikaciją, kofaktorius; dalyvauja amino rūgščių pernešime per plazminę membraną; neutralizuoja hidroksilo radikalą, detoksikuoja vandenilio peroksidą ir lipidų peroksidus katalizuodamas glutationperoskidazę, jis gali regeneruoti svarbiausius radikalus: vitaminus C ir E, paversdamas juos į vėl aktyvias formas [7,8].

Antioksidantų biologinis poveikis įvardijamas jų gebėjimu neutralizuoti laisvųjų radikalų poveikį, o taip pat ir gebėjimu reguliuoti signalinius kelius tarp ląstelių. Ląstelinių signalinių kelių reguliavimas gali padėti išvengti įvairių ligų, pavyzdţiui, vėţio, atsiradimo, išlaikant normalų ląstelės ciklo reguliavimą, slopinant proliferaciją ir sukeliant apoptozę, slopinant naviko augimą, uţdegimą ir skatinant detoksikaciją per fermentines sistemas [7,9]. Antioksidantų veikimą galima pavaizduoti tokia schema [27]:

ROO· + AH → ROOH + A·

2.4. Fenoliniai junginiai, jų antioksidacinės savybės

Fenoliniai junginiai – vieni iš labiausiai augaluose paplitusių fitocheminių grupių, svarbūs tiek augalų morfologijai, tiek fiziologijai. Jie gali veikti kaip fitoaleksinai; junginiai, priviliojantys apdulkintojus ir lemiantys augalų pigmentaciją; antioksidantai ir medţiagos, apsaugančios nuo

ultravioletinių saulės spindulių. Jie turi svarbų vaidmenį augalų augimui ir dauginimuisi, saugo juos nuo ligų sukėlėjų [14].

Fenoliniai junginiai – tai medţiagos, veikiančios kaip antioksidantai. Jie dalyvauja oksidacijos – redukcijos reakcijose ir gali veikti kaip reduktorius, vandenilio atomo donoras, slopinti ROS susidarymą iš deguonies molekulės ir veikti kaip reagentas, sudarantis kompleksus su metalų jonais [11].

Polifenoliai apima tokias klases: fenoliai, fenolinės rūgštys, flavonoidai, taninai ir lignanai. Skirstymas į klases paremtas fenolinių ţiedų skaičiumi struktūroje bei struktūriniais elementais, jungiančiais šiuos ţiedus [11,19]. Polifenoliai yra natūralūs organiniai junginiai, turintys fenolių struktūrinius poţymius [11]. Skirtingi polifenolių pogrupiai gali skirtis stabilumu, biologiniu prieinamumu, fiziologinėmis funkcijomis ţmogaus organizme. Dauguma polifenolių egzistuoja kaip glikozidai su skirtingomis cukraus liekanomis, prisijungusiomis skirtingose vietose. Struktūros pagrindą sudaro aromatinių ţiedų sistema su viena ar keliomis prijungtomis hidroksilo grupėmis. Fenolinė hidroksilo grupė, šių grupių skaičius, išsidėstymas bei kiti molekulės pakaitai lemia antioksidacinį aktyvumą. Fenolinių junginių įvairovė tiek augaluose, tiek ţmogaus organizme papildo vienas kito poveikį, taip sustiprindami antioksidacinį poveikį [11,19].

Polifenoliai taip pat turi platų panaudojimą pramonėje: daţų, popieriaus, kosmetikos gamyboje. Maisto pramonėje jie gali būti ne tik kaip konservantai ir daţikliai, bet turėti pridėtinę vertę kaip natūralūs antioksidantai, teigiamai veikiantys organizmo funkcijas. Dėl šių prieţasčių dedamos didelės pastangos siekiant charakterizuoti fenolius įvairiuose augalo audiniuose [19].

Gausūs polifenolių šaltiniai yra vaisiai, darţovės, grūdai, šokoladas, arbata, vynas [11]. Dauguma polifenolių augaluose randami glikozidų pavidalu su skirtingomis angliavandenių liekanomis ir acilintu cukrumi skirtingose polifenolio molekulės vietose.

Polifenolinių junginių diţiausios grupės yra fenolinės rūgštys ir flavonoidai. Fenolinės rūgštys toliau skiriamos į benzoinės rūgšties ir cinamono rūgšties darinius, remiantis jų struktūros pagrindu, pavaizduotu 1 pav. [28]. Pagal aromatinio ţiedo funkcines hidroksilo (-OH) ir metoksi (CH3O-) grupes, benzoinės rūgšties dariniams priklauso vanilino, protokatechino, galo rūgštys, o cinamono rūgšties dariniams priskiriamos p-kumarino, ferulo, kavos, chlorogeno, kriptochlorogeno, neochlorogeno, sinapo rūgštys [11, 12].

Vaisiuose ir darţovėse randama daug laisvų fenolinių rūgščių, grūduose ir sėklose, ypač sėlenose, fenolinės rūgštys daţniausiai aptinkamos susijungusios su kitomis molekulėmis. Šios fenolinės rūgštys organizme pasisavinamos vykstant rūgštinei arba šarminei hidrolizei, arba fermentų pagalba [11]. Fenolinės rūgštys skiriasi aromatinio ţiedo hidroksilo grupėmis – jų skaičiumi ir pozicija. Tyrimais įrodyta kad ferulo rūgštis ir kitos hidroksicinamono rūgštys (kavos ir p-kumarino rūgšties dariniai), pasiţymi stipriu antioksidaciniu poveikiu. CH=CH-COOH (etenkarboksi) grupės buvimas hidroksicinamono rūgštyje suteikia stipresnį antioksidacinį poveikį nei COOH (karboksi) grupės buvimas hidroksibenzoinėje rūgštyje [18].

Flavonoidai yra biologiškai aktyvūs polifenoliniai junginiai, antriniai augalų metabolitai [9,10]. Jie sudaro didelę grupę polifenolinių junginių ir turi benzo – γ – pirono struktūrą, vadinamą flavanu [10,12]. Flavonoidus sudaro 15 anglies (C) atomų struktūra turinti du benzeno ţiedus (A,C) ir heterociklinį pirano ţiedą (B). Skirtingų klasių flavonoidai skiriasi oksidacijos lygiu ir pakaitais B ţiede, o tos pačios klasės skirtingi flavonoidai skiriasi pakaitais A ir C ţieduose [12]. Flavonoidai formuojasi kaip aglikonai, glikozidai ir metilinti dariniai. Kai suformuojami glikozidai, glikozidinis ryšys paprastai lokalizuojasi 3 arba 7 padėtyse, prisijungęs angliavandenis gali būti L-ramnozė, D-gliukozė, gliukoramnozė, galaktozė arba arabinozė. Cukraus prisijungimo vieta, struktūra, molekulių skaičius taip pat yra svarbu antioksidaciniam flavonoido aktyvumui. Aglikonai pasiţymi stipresniu antioksidaciniu poveikiu nei jų atitinkami glikozidai. Nors paprastai glikozidai yra silpnesni antioksidantai nei anglikonai, biologinis prieinamumas pagerinamas būtent dėl gliukozės fragmento. Flavonoidų glikozidų liekanos paprastai būna prisijungusios 3-oje, 7-oje padėtyse [12,14].

Flavonoidai, turintys nesočiąją jungtį prie 2-3 anglies atomų bei 4-okso radikalą yra aktyvesni antioksidantai negu flavonoidai, kurie neturi bent vienos iš šių savybių. Konjuguoti A ir B ţiedai suteikia flavonoido molekulei stabilumą. Aktyvumui būtina laisva 3-OH grupė [11,12].

Flavonoidų struktūros pagrindas pateiktas 2 pav. [10].

2 pav. Flavonoidų struktūros pagrindas: A;C – benzeno žiedai, B – pirano žiedas

Flavonoidams priskiriami flavonai (liuteolinas, apigeninas), flavonoliai (kvercetinas, kemferolis, galanginas), flavanonai (hesperidinas, naringeninas), flavanonoliai (taksifolinas), izoflavonai

(genisteinas, daidzeinas), flavan-3-oliai (katechinas, epikatechinas). Struktūrinės šių flavonoidų formulės pateiktos 3 pav. [10].

3 pav. Flavonoidų rūšių struktūrinės formulės: 1) Flavonai 2) Flavonoliai 3) Flavanonai 4) Flavanonoliai 5) Izoflavonai 6) Flavan-3-oliai.

Flavonoidų antioksidacinis veikimas priklauso nuo funkcinių grupių išsidėstymo molekulės struktūroje. Antioksidantų veikimo mechanizmams, tokiems kaip gebėjimas neutralizuoti laisvuosius radikalus ir chelatuoti metalų jonus, daro įtaką elektroninė konfigūracija, pakaitai ir bendras hidroksilo grupių skaičius [9,12]. C ţiede esanti hidroksilo grupės konfigūracija yra svarbiausias veiksnys ROS ir RNS neutralizavimui, nes ji panaudojama kaip vandenilio atomo donoras bei kaip elektrono donoras hidroksilo, peroksilo, peroksilnitrito radikalams, taip juos stabilizuojant [12]. Flavonoidų veikimas grindţiamas taip, kaip ir kitų antioksidantų. Kai kurie flavonoidų poveikiai gali būti keletos veikimo mechanizmų rezultatas: radikalų neutralizavimo bei fermentinių reakcijų. Flavonoidai slopina fermentų, dalyvaujančių ROS gamyboje, veiklą, t.y. mikrosomų monooksigenazės, glutationo S-transferazės, mitochondrijų sukcinooksidazės, NADH oksidazės ir kitų [7,12,14].

Flavonoidai apsaugo lipidus nuo oksidacinio paţeidimo [12,17]. Laisvi metalų jonai skatina ROS formavimąsi redukuojant vandenilio peroksidą, susidarant labai reaktyviam hidroksilo radikalui. Flavonoidai gali tapti vandenilio atomo donorais ir neutralizuoti susidariusius ROS. Flavonoidai taip pat slopina ROS susidarymą, nes geba chelatuoti metalų jonus (geleţį, varį). Metalus gali surišti tam tikri ţiedo pakaitai [13]. Reakcija pavaizduota 4 pav. [9]

4 pav. Flavonoido molekulės ryšiai su metalų (Fe2+, Cu2+) katijonais

Dauguma flavonoidų pasiţymi antioksidaciniu, laisvuosius radikalus surišančiu poveikiu, koronarinių širdies ligų prevencija, hepatoprotekciniu, antiuţdegiminiu ir priešvėţiniu poveikiu, kai kurie flavonoidai inaktyvuoja virusus. Flavonoidai turi gebėjimą skatinti organizmo apsaugines fermentų sistemas. Remiantis tyrimais, flavonoidai turi apsauginį poveikį prieš bakterines ir infekcines ligas, degeneracines ligas, tokias kaip širdies ir kraujagyslių ligos, vėţys ir kitos su amţiumi susijusios ligos [12].

Augaluose flavonoidai kaupiami visose jo morfologinėse dalyse, ypač tose, kurios vykdo fotosintezę. Augaluose jie veikia kaip antioksidantai – ląsteles apsaugo nuo ROS poveikio sukelto oksidacinio streso, taip pat kaip antimikrobinės medţiagos, maisto medţiagos, suteikia augalams spalvą ir kvapą. Flavonoidai padeda augalui aptikti saulės šviesą, kai išauga jų antţeminė dalis [14]. Flavonoidai reguliuoja auksino judėjimą ir metabolizmą, nuo to priklauso augalo morfologinės - anatominės savybės. Nuo flavonoidų priklauso augalo antimikrobinės, antivirusinės, antibakterinės savybės [12]. Maisto pramonėje flavonoidai naudojami kaip spalvą, kvapą suteikiantis komponentas, apsaugantis nuo riebalų oksidacijos bei saugantis vitaminus ir fermentus. Ţmonių ir gyvūnų organizmai nesintetina flavonoidų, jie gaunami su maistu. Didţiausi flavonoidų kiekiai randami arbatoje, vaisių ţievelėse, raudonajame vyne, grikiuose, raudonosiose paprikose, pomidorų odelėje, svogūnuose, alyvuogių aliejuje, uogose, greipfrutuose, citrusiniuose vaisiuose, izoflavonai genistinas ir daidzeinas – sojų pupelėse [12,15,16].

2.5. Fenolinių junginių ekstrakcija, suminio kiekio ir antioksidacinio aktyvumo

nustatymas augaliniuose ekstraktuose

Nors fenoliniai junginiai turi bendras fenolių savybes, dėl struktūrinės įvairovės skiriasi jų fizikocheminės savybės. Fenolinių junginių išskyrimas, identifikavimas ir analizė išlieka sudėtingi dėl

struktūrų sudėtingumo bei didelės fenolinių junginių įvairovės. Nėra bendros metodikos visiems fenoliniams junginiams, tačiau gavybos – analizės procesuose galima taikyti bendruosius principus [11].

Prieš ekstrakcijos procesą fenolinių junginių turintys augalai turi būti tinkamai paruošiami. Augalo antţeminė dalis renkama ir dţiovinama. Siekiant išvengti fenolinių junginių degradacijos, mėginiai turi būti dţiovinami tinkamomis sąlygomis, šaldomi arba liofilizuojami, nes drėgnoje ţaliavoje didėja fermentų aktyvumas. Dėl šilumos, saulės šviesos ir deguonies poveikio gali kisti polifenolių sudėtis augale, todėl dţiovinant reikia vengti aukštos temperatūros, tiesioginių saulės spindulių [11].

Ekstakcijos našumą reikalinga įvertinti keičiant proceso sąlygas. Komponentų koncentracija priklauso nuo parinkto tirpiklio, skysčio – ţaliavos santykio, temperatūros, dalelių dydţio, ekstrakcijos laiko (kontakto tarp ţaliavos ir skysčio trukmės) ir kitų veiksnių. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas priklauso nuo augalo rūšies, norimų išekstrahuoti junginių tipų [19].

Ekstrahentais naudojami parūgštinti metanolis, etanolis bei jų mišiniai su vandeniu atitinkamai (50-90%, V/V ir 10-90%, V/V), etilacetatas, chloroformas, dietilo eteris, karštas vanduo (80-100°C), natrio šarmas (2N-10N), acetonas ir kiti organiniai tirpikliai. Ekstrakcija metanoliu yra labai efektyvi lyginant su kitais ekstrahentais, tačiau dėl jo toksiškumo metanolis daţnai pakeičiamas etanolio ir vandens mišiniu (50-90%). Toks ekstrahentas yra tinkamas daugeliui fenolinių junginių, bei nėra pavojingas ţmogaus sveikatai [19].

Ekstrahavimo procesas gali būti vykdomas šildant, virinant, naudojant grįţtamąjį šaldytuvą. Tokių metodų trūkumai – polifenolių kiekio sumaţėjimas dėl jonizacijos, hidrolizės, oksidacijos reakcijų bei ilgas ekstrahavimo laikas. Ekstakcija daţnai vykdoma maceracijos metodu, Soksleto aparatu. Ekstakcijos sąlygoms pagerinti buvo pradėti naudoti tokie metodai kaip ekstrakcija ultragarsu, mikrobangomis, superkritiniais skysčiais bei aukštu hidrostatiniu slėgiu. Ekstrakcija ultragarsu yra efektyvi alternatyva kitoms ekstrakcijos technikoms, nes ši metodika nebrangi, paprasta, efektyvi. Metodas tinkamas nelakių/pusiaulakių organinių junginių gavimui. Ultragarsas uţtikrina glaudų kontaktą tarp mėginio ir tirpiklio. Metodas naudojamas siekiant pagerinti lipidų, baltymų, fenolinių junginių ekstrakciją. Šis ekstrakcijos metodas daug pranašesnis ir efektyvesnis nei ekstrakcija kaitinant, mikrobangomis ar fermentais [20].

Sukurti spektrofotometriniai metodai buvo pritaikyti ir vis dar plačiai naudojami bendro fenolinių junginių, bendro flavonoidų bei bendro antocianinų kiekio įvertinimui. Šie metodai yra greiti, paprasti ir tikslūs bendram kiekiui nustatyti. Atskirų junginių struktūros įvertinimui galima atlikti detalesnius tyrimus naudojant įvairias chromatografijos technikas: atvirkštinių fazių didelio slėgio skysčių chromatografija (HPLC) sujungta su diodų matricos detektoriumi (DAD) ar spektrofotometriniu masės detektoriumi (LC-MS). Taip pat gali būti naudojama dujų chromatografija

ar ultra didelio slėgio skysčių chromatografija, kuri yra labai efektyvi ir sumaţina analizės laiką. Siekiant identifikuoti junginį, daţniausiai lyginama standarto ir to junginio sulaikymo laikas. Šie identifikavimo metodai yra efektyvūs ir tikslūs, tačiau atlikimo technika yra sudėtinga ir brangi. Dėl bendrų fenolinių junginių savybių ir analizuojamo jų antioksidacinio poveikio, tikslinga įvertinti bendrą jų kiekį, kuris nurodo suminį antioksidacinį poveikį ir gebėjimą rišti laisvuosius radikalus [11]. Spektrofotometriniai tyrimai yra pagrįsti skirtingais principais ir yra naudojami įvairių fenolinių junginių struktūrinių grupių kiekybiniam nustatymui. Folin-Ciocalteu tyrimo metodika šiuo metu plačiausiai naudojama bendro fenolinių junginių kiekio nustatymui. Šis tyrimas gali būti naudojamas kaip standartizuota metodika maisto produktų kokybės kontrolei nustatant antioksidantų kiekį [23]. Metodas yra jautrus, pigus, paprastai atliekamas, tinkamas tirti plačiam fenolinių junginių koncentracijos reikšmių diapazonui [21]. Kai kurios molekulės, tokios kaip askorbo rūgštis, geleţies jonai, sieros dioksidas, cisteinas, fenolinės amino rūgštys gali trukdyti tyrimui ir šiek tiek keisti absorbcijos dydį [22]. Analizė Folin – Ciocalteu metodu paremta elektronų perdavimo reakcijomis šarminėje terpėje iš fenolinių junginių į fosfomolibdeną, suformuojant mėlynos spalvos kompleksus, kuriuos galima nustatyti spektrofotometru prie 760 nm bangos ilgio. Analizėje kaip standartas naudojama galo rūgštis [23]. Fenoliniai junginiai yra oksiduoti bazinėje terpėje, dėl to susidaro O2, kuris reaguoja su molibdatu ir sudaro molibdeno oksidą, turintį intensyvią absorbciją [28]:

Na2MoO4 + Fenolis → (Fenolis - Mo11O40)

4-Mo5+ (Geltona spalva) + e- → Mo4+ (Mėlyna spalva)

Bendram flavonoidų kiekiui nustatyti daţnai naudojamas kalorimetrinis metodas, pagrįstas komplekso susidarymu fenoliniams junginiams reaguojant su AlCl3 rūgščioje terpėje. Kaip standartas naudojamas rutinas. Bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas miligramais sausos augalo ţaliavos masėje gramais pagal rutino ekvivalentą. Absorbcija matuojama prie 407 nm bangos ilgio [19,24]. Flavonams ar flavonoliams turint laisvas C-3 arba C-5 hidroksilo grupes ar laisvą C-3 keto grupę, rūgščioje terpėje susidaro stabilūs jų kompleksai su AlCl3 [25] 5 pav.:

5 pav. Flavonoidų nustatymas su AlCl3

DPPH. Plačiausiai naudojami antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai yra naudojant ABTS reagentą (2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6- sulfono)) rūgštis bei DPPH reagentą

(2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) [26]. DPPH radikalų surišimo metodas yra tinkamesnis hidrofiliniams antioksidantams nustatyti. Šis radikalas yra vienas iš stabiliausių radikalų, jis pigus, paprasta atlikimo metodika – jo nereikia aktyvuoti papildomais reagentais [28]. Etanolinių ekstraktų gebėjimas atiduoti vandenilio atomą arba elektroną matuojamas DPPH radikalo violetinės spalvos pokyčiu – spalvos blankimas ir absorbcijos maţėjimas proporcingas stiprėjančiam antioksidaciniam aktyvumui [26,28,46]. Violetinis chromogeno radikalas (DPPH) yra redukuojamas radikalus surišančių junginių, reakcijos produktas – šviesiai geltonas hidrazinas [27] (6 pav.):

6 pav. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu

ABTS. Šioje metodikoje pirmiausia ABTS yra oksiduojamas oksidantais – kalio persulfato (K2S2O8) tirpalu, siekiant gauti ABTS• radikalą, kuris yra intensyvios, mėlynai ţalios spalvos. Antioksidantų kiekis nustatomas jų gebėjimu maţinti spalvos intensyvumą tiesiogiai reaguojant su ABTS radikalu. Analizė atliekama spektrofotometru prie 734 nm bangos ilgio. Šis metodas tinkamesnis siekiant nustatyti lipofilinius antioksidantus, tačiau taip pat tinka ir hidrofilinių junginių nustatymui. Metodas tinkamas tirti grynas medţiagas bei vandeninius mišinius [28] (7 pav.):

7 pav. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu

FIC. Fenolinių junginių antioksidacinės savybės gali būti vertinamos pagal jų gebėjimą sujungti pereinamųjų metalų jonus. Fe2+

jonai gali pagreitinti ROS gamybą, todėl antioksidantų gebėjimas sujungti geleţies jonus gali būti įvertintas kaip teigiamas antioksidacinis poveikis. Geleţis yra būtinas mineralas ţmogaus organizmui, bet jos perteklius gali sukelti ląstelinius paţeidimus – tai svarbiausias metalas lipidų oksidacijoje, taip pat ji dalyvauja DNR oksidacijoje [13,27].

Geleţis dalyvauja Fentono tipo reakcijose, kuriose susidaro labai reaktyvus hidroksilo radikalas[13]:

Trivalentė geleţis taip pat dalyvauja hidroksilo susidarymo reakcijose, tačiau šiuo atveju tokio produkto išeiga 10 kartų maţesnė, nei dalyvaujant dvivalentės geleţies jonams. Reakcijai inicijuoti naudojamas ferozino tirpalas, kuris su Fe2+ jonais sudaro raudonos spalvos kompleksus. Tirpale esant antioksidantų, sutrinka šio komplekso formavimasis, todėl tirpalas blanksta. Spektrofotometru matuojant spalvos pasikeitimą galima įvertinti chelatuojančių junginių kiekį - maţėjanti absorbcija parodo šių junginių didėjantį aktyvumą [13,27].

Siekiant įvertinti augalinių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą yra naudinga atlikti keletą pripaţintų metodinių tyrimų. Gautus tyrimų rezultatus lyginant tarpusavyje galima tiksliau įvertinti augale esančių antioksidacinių junginių kiekį bei numatyti galimą naudą ţmogaus organizmui.

3. MĖLYNŢIEDŢIŲ VIKIŲ (Vicia cracca L.) BENDROJI

CHARAKTERISTIKA

Mėlynţiedţiai vikiai (Vicia cracca L.) yra daugiamečiai, pupinių šeimos augalai, kurių šaknys plinta po ţeme, stiebai išauga iki 2 metrų ilgio, šakojasi ant kitų augalų formuodami kilimėlį (paklotą). Lapų leidţia 5-10 porų, 1,5-3,0 centimetrų ilgio, linijiškus, siaurai pailgus. Ţiedai išsidėsto išilgai, į vieną pusę nuo ilgo ţiedkočio ţiedyno. Ţiedų daug, melsvai violetiniai, 9-13 mm ilgio. Ankštys šviesiai rudos, plokščios, 2-3 cm ilgio, subręsta, pasidalina į dvi susuktas puses; sėklos apvalios arba ovalo formos, 2,5-3,5 mm ilgio, rausvai rudos, kartais šiek tiek margos [29]. Augalas pavaizduotas 8 pav.

8 pav. Mėlynţiedţis vikis (Vicia cracca L.) [48]

Mėlynţiedţiai vikiai ţydi geguţės – rugpjūčio mėnesiais, sėklos noksta liepos – rugsėjo mėnesiais. Augalas yra hermafroditas, apdulkinamas bičių, vabzdţių. Dėl gebėjimo fiksuoti azotą, mėlynţiedţiai vikiai yra gerai prisitaikantys prie aplinkos sąlygų, gali būti naudojami kaip eroziją stabdantys augalai. Augimui tinkamas tiek smėlis, tiek priemolis, tiek dirvoţemis su gausiu mineralų kiekiu, tačiau gausiausiai auga drėgname dirvoţemyje. Gali augti pavėsyje ar maţai apšviestose

teritorijose (medţių šešėliuose). Augalas nejautrus dirvos pH, kuris gali būti rūgštus, neutralus ir bazinis [34].

Augalas tinkamas vartoti kaip maistingas pašaras gyvuliams bei kaip nektaro šaltinis vabzdţiams [34]. Atliktas bandymas mėlynţiedţių vikių ţole šeriant avis ir jaučius. Bandymo rezultatai parodė, kad gyvuliams po 3 savaičių padidėjo baltymų kiekis ir virškinamumo koeficientas, kuris apibūdina pašaro energetinę vertę [29]. Nustatyta, kad ţalia vikių ţolė kaupia 5,0 % baltymų, o vikių šienas – 18,6 % baltymų, kai dobilų ţalia ţolė ir šienas atitinkamai kaupia maţiau: 3,8 % ir 12,6 %. Taip pat nustatyta, kad ţydėjimo pradţioje augalas kaupia daugiau baltymų nei vaisių brandinimo pradţioje, atitinkamai 17,0 % ir 15,01 % [50].

Mėlynţiedţiai vikiai plačiai paplitę Šiaurės Amerikos ţemyne, Europoje (labiausiai centrinėje dalyje, kiek maţiau pietinėje dalyje), taip pat Azijos centrinėje bei pietrytinėje dalyse. Augalas randamas pakelėse, griūvėsiuose, gyvatvorėse, pievose, ganyklose [29,31]. Manoma, kad platus augalų paplitimas ir jų dominavimas gali būti paremtas gebėjimu prisitaikyti keičiantis aplinkos sąlygoms dėl didesnio alelių turtingumo, dėl jų atsparumo patogenams bei gebėjimo didesnę genų įvairovę perduoti palikuonims [31]. Mėlynţiedţiai vikiai yra augalai, gebantys pasisavinti atmosferoje esantį azotą. Augalų šaknyse yra gumbelinių bakterijų, diazotrofų, kurios suformuoja gumbelius, kuriuose vykdo azoto fiksaciją iš atmosferos. Gumbelinių bakterijų pagamintą amoniaką augalas naudoja augimo procesuose [33].

Manoma, kad augalo adaptacija įvairiomis aplinkos sąlygomis bei gebėjimas apsiginti nuo mikroorganizmų gali būti dėl kaupiamų flavonoidų [33]. Moksliniuse šaltiniuose duomenų apie mėlynţiedţių vikių ţiedų ţaliavoje nustatytą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekybinę sudėtį ir jos kitimus nepavyko rasti. Atliktų kitos Vicia genties rūšies Vicia sativa L. ţaliavų tyrimų metu identifikuoti flavanonai: likviritigeninas, naringeninas, hesperidinas bei chalkonas izolikviritigeninas. Šie junginiai identifikuojami augaluose, jeigu yra nustatomi augalo simbiotiniai ryšiai su azotą fiksuojančiomis bakterijomis. Todėl gali būti, kad mėlynţiedţiai vikiai, kurie taip pat sudaro ryšius su azotą fiksuojančiomis bakterijomis, gali kaupti kai kurių rūšių flavonoidus [36].

Buvo ištirta 8 Vicia genties rūšys, tarp jų ir mėlynţiedţiai vikiai. Tirta visų lipidų kiekis ir riebalų rūgštys. Nustatyta, kad įvairių rūšių vikių sėklose lipidų kiekis svyravo 2,30 – 3,91%, kai tuo tarpu mėlynţiedţio vikio lipidų kiekis siekė 3,64% . Vikių sėklų aliejų sudėtyje yra: palmitino ir stearino rūgštys kaip pagrindinis sočiųjų riebalų rūgščių komponentas, maţi kiekiai miristo, pentadekano, arachidono ir beheno rūgščių. Pagrindinės nesočiosios riebalų rūgštys sėklų aliejuje buvo oleino, linolo ir linoleno rūgščių. Mėlynţiedţių vikių rūšį lyginant su kitomis vikių genties rūšimis rasti didţiausi kiekiai maţo molekulio svorio riebalų rūgščių, tokių kaip lauro 2,73% bei miristo 5,07%. Taip pat rastas reikšmingas kiekis arachidono rūgšties (4,94%) [32]. Arachidono rūgštis yra svarbi fiziologiniam atsakui atsiradus uţdegimui, nes slopina lėtinius uţdegiminius procesus, dėl kurių

vystosi vėţys, astma, reumatoidinis artritas, autoimuniniai sutrikimai. Ji reikalinga skrandţio gleivinės apsaugai, slopina trombocitų agregaciją [47].

Atliekant DPPH tyrimą, mėlynţiedţio vikio sėklų ekstrakte nustatytas antioksidacinis aktyvumas (<50%). Tyrimo metu buvo pagrįsta, kad vikių genties rūšių ekstraktai geba sujungti geleţies jonus. Mėlynţiedţio vikio ţaliavų ekstraktų geleţį chelatuojantis poveikis ištirtas nebuvo [38].

Tirta 10 vikių genties augalų, tarp kurių buvo ir V. cracca rūšis. Ekstraktai buvo gaminami iš lapų ir stiebų ţaliavų. Visose rūšyse nustatyti tokie flavonoidai: mircetinas, kemferolis, naringeninas ir izoramnetinas. Bendras flavonoidų kiekis Vicia genties rūšių lapų ir stiebų ţaliavose nustatytas 0,03-5,42 mg/g. Nors V. cracca bendras flavonoidų kiekis lyginant su kitomis Vicia genties rūšimis buvo nedidelis, mėlynţiedţio vikio lapuose ir stiebuose rasta naringenino, taip pat nedideli kiekiai izoramnetino. Rastas naringenino kiekis reikšmingas lyginant su kitų augalų rūšimis. Naringeninas veikia antimikrobiškai, slopina kosulį bei gerina atsikosėjimą, turi antiaterogeninį, antifibrogeninį, neuroprotekcinį, antimutageninį, antioksidacinį, priešvėţinį, priešuţdegiminį poveikius, slopina astmos priepuolius bei ūminį plaučių uţdegimą [39].

Tyrimo metu buvo atliekamas antioksidacinio aktyvumo vertinimas iš 28 Vicia rūšių sėklų metanolinių ekstraktų. Polifenolių koncentracija sėklose svyravo nuo 1,9 iki 21,3 mg/g, atitinkamai nenatūraliai augusių augalų sėklų polifenolinių junginių koncentracija buvo ţemesnė nei natūraliai augusių rūšių. Analizuojant gautus tyrimo rezultatus galima manyti, kad gausus vikių rūšių paplitimas, lengvas augimas ir atsparumas aplinkos veiksniams gali būti dėl jų kaupiamų natūralių polifenolių su dideliu antioksidaciniu aktyvumu [37]. Įvertinus didelį mėlynţiedţio vikio rūšies paplitimą įvairiuose ţemynuose ir tai, kad natūraliai augantys augalai (kaip ir mėlynţiedis vikis) pasiţymėjo didesniu antioksidaciniu aktyvumu, gali būti naudinga atlikti bendro fenolinių junginių, bendro flavonoidų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo tyrimus.

4. TYRIMO METODIKA IR METODAI

4.1. Tyrimų objektas

Siekiant įvertinti bendrą fenolinių junginių ir flavonoidų kiekį bei antioksidacinį aktyvumą, rinktos natūraliai gamtoje augančių mėlynţiedţių vikių (Vicia cracca L.) ţaliavos. Augalinės ţaliavos rinktos iš 15 Lietuvos bei 5 Latvijos augaviečių iš skirtingų Lietuvos ir Latvijos regionų. Ţaliava rinkta masinio ţydėjimo metu birţelio – rugpjūčio mėnesiais, 2015-2016 metais. Skirtingose cenopopuliacijose surinkti augalinių ţaliavų mėginiai buvo suskirstyti į ţiedus, lapus ir stiebus. Taip paruošti augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdţiai. Duomenys pateikti 2 lentelėje. Ţaliavos rinktos pievose, pamiškėse, toliau nuo eismo zonų bei pramoninių objektų.

Taip pat, siekiant įvertinti fenolinių junginių ir flavonoidų kiekio dinamiką ţaliavose bei ekstraktų antioksidacinio aktyvumo kitimą skirtingais fenologiniais tarpsniais, antţeminės mėlynţiedţių vikių dalys (apie 20 cm ilgio ūglių viršūnės) rinktos trijų fenologinių tarpsnių metu, tai yra butonizacijos (2015-05-02), masinio ţydėjimo (2015-07-05) ir vaisių brandinimo (2015-08-25) fazėmis [42]. Ţaliava rinkta Rokiškio rajone, Miliūnų miško pamiškėje, apie 12 km atstumu nuo Rokiškio miesto.

9; 10 pav. raudonais apskritimais nurodytos augavietės, kuriose rinkti V. cracca ţaliavų mėginiai siekiant įvertinti BAM pasiskirstymą skirtingose teritorijose, o trikampiu – augavietė, kurioje rinkta V. cracca ţaliava, naudota BAM dinamikai įvertinti skirtingais fenologiniais tarpsniais.

2 lentelė. V. cracca žaliavų rinkimo duomenys

Augim-vietės nr.

Rinkimo laikas Valstybė Rinkimo vieta Regionas

1. 2015-06-24 Lietuva Ramučiai, Kauno r. sav. Centrinė Lietuva 2. 2015-06-28 Lietuva Rinkuškiai, Birţų raj. sav. Šiaurės Lietuva 3. 2015-06-30 Lietuva Miliūnai, Rokiškio raj. sav. Šiaurės rytų Lietuva 4. 2015-07-08 Lietuva Paliūniškis, Panevėţio raj.

sav.

Šiaurės Lietuva 5. 2015-07-08 Lietuva Ginkūnai, Šiaulių raj. sav. Šiaurės Lietuva 6. 2015-07-12 Lietuva Trakai, Trakų raj. Sav. Pietryčių Lietuva 7. 2015-07-12 Lietuva Tauragnai, Utenos r. sav. Šiaurės Lietuva 8. 2015-07-23 Lietuva Aţuoţeriai, Utenos r. sav. Šiaurės rytų Lietuva 9. 2015-07-27 Lietuva Šeduva, Radviliškio raj. sav. Šiaurės Lietuva 10. 2015-07-31 Lietuva Kudirkos Naumiestis, Šakių

raj. sav.

Pietvakarių Lietuva 11. 2016-07-15 Lietuva Ariogala, Raseinių raj. sav. Centrinė Lietuva 12. 2016-07-22 Lietuva Taurai, Tauragės raj. sav. Vakarų Lietuva 13. 2016-07-26 Lietuva Lazdijai, Lazdijų raj. sav. Pietų Lietuva 14. 2016-08-10 Lietuva Karklė, Klaipėdos raj. sav. Vakarų Lietuva 15. 2016-08-12 Lietuva Geruliai, Telšių raj. sav. Šiaurės vakarų

Lietuva

17. 2015-07-22 Latvija Dobele, Duobelės sav. Pietvakarių Latvija 18. 2015-07-22 Latvija Kolka, Dundagos sav. Šiaurės Latvija

19. 2016-08-01 Latvija Talsi, Talsų sav. Šiaurės vakarų Latvija 20. 2016-08-02 Latvija Engure, Engures sav. Centrinė Latvija

9 pav. Lietuvos augavietės, kuriose rinkti 10 pav. Latvijos augavietės, kuriose rinkti V. cracca žaliavų bandiniai. V. cracca žaliavų bandiniai.

Surinktos ţaliavos dţiovintos apsaugotoje, nuo drėgmės bei tiesioginių saulės spindulių, vietoje, laikytos kartoninėse dėţėse, kuriose buvo sudarytos sąlygos cirkuliuoti orui. Ţaliavoms išdţiuvus jos buvo susmulkinamos ir sijojamos. Skirtingų augalo fenologinių tarpsnių tyrimui smulkinta ir sijota visa antţeminė augalo dalis.

4.2. Medţiagos ir reagentai

Tyrimuose naudota: išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2009:0008), maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96 %, gamintojas UAB “Stumbras” (Kaunas, Lietuva), Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas 2M, gamintojas Sigma –Aldrich (Šveicarija), Natrio karbonatas 99,5-100,5 %, gamintojas Sigma – Aldrich (Prancūzija), galo rūgšties monohidratas, grynumas ≥ 98 %, gamintojas Sigma –Aldrich (Kinija), DPPH reagentas (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas), grynumas 95 %, gamintojas Alfa Aesar (Vokietija), Rutino hidratas ≥ 94 %, gamintojas Sigma – Aldrich (Vokietija), Acto rūgštis 100 %, gamintojas Carl Roth (Vokietija), Aliuminio chlorido heksahidratas, grynumas ≥ 95 %, gamintojas Carl Roth (Vokietija), Heksametilentetraminas, grynumas ≥ 99,5 %, gamintojas Sigma – Aldrich (Rusija), Ferozinas, grynumas ≥ 97 %, gamintojas Sigma – Aldrich (JAV), Bevandenis geleţies (II) chloridas, grynumas 99,5 %, gamintojas Alfa Aesar (Vokietija), ABTS

(2,2„-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6- sulfono)) rūgštis, gamintojas Sigma-Aldrich (Kanada), Kalio persulfatas, gamintojas SIAL (Kanada).

4.3. Naudota aparatūra

Ekstrakcijai naudota ultragarso vonelė – „ElmaSonic S40H“ (U=230V), gamintojas Elma Schmidbauer (Vokietija), automatinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic, gamintojas (IKA-WERKE, Vokietija). Spektrofotometrinei analizei naudoti 2 spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) ir „Agilent Technologies“ (Cary –60, JAV).

4.4. Tyrimų metodai

4.4.1. Mėlynţiedţių vikių ţaliavų ekstraktų paruošimas

Augalo ekstraktai ruošti atsvertą tikslų kiekį 0,100 g ţaliavos uţpilant 10 ml 70% (V/V) etanoliniu tirpalu (1:100) ir veikiami ultragarso vonelėje 10 min, 40°C temperatūroje. Gauti ekstraktai filtruoti pro popierinį filtrą į matavimo cilindrą, likutis esantis ant filtro praplaunamas 70% (V/V) etanoliu iki 10 ml. Gauti ekstraktai perpilami į tamsaus stiklo buteliukus, sandariai uţdaromi. Kiekvienos morfologinės dalies ţaliavos ruošiama po 2 mėginius, taip pagaminta 120 ekstraktų. Analogiškai ruošti V. cracca augalinės ţaliavos mėginiai skirtingų fenologinių fazių tyrimui, ţaliava – nesuskirstytos į morfologines dalis augalų 20 cm viršūninės dalys. Paruošti 6 etanoliniai ekstraktai (1:100).

4.4.2. Reagentų paruošimas

70 % (V/V) etanolio tirpalas ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui paruošti 665 ml 96 % (V/V) etanolio praskiedţiama 335 ml išgryninto vandens.

0,2 N Folin-Ciocalteu reagentas paruošiamas 10 ml Folin-Ciocalteu fenolinio reagento matavimo kolboje skiedţiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

7,5 % (W/V) Na2CO3 tirpalas ruošiamas 7,5 g bevandenio Na2CO3 pašildţius ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

10 % aliuminio chlorido tirpalas ruošiamas 5,0 g reagento ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. 5 % metenamino tirpalas ruošiamas 2,5 g metenamino reagento ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.

33 % acto rūgšties tirpalas ruošiamas 33 ml 99,8 % ledinę acto rūgštį matavimo kolboje skiedţiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

Etanolinis rutino tirpalas ruošiamas matavimo kolboje 0,05 g (tikslus svėrinys) 99 % grynumo rutino tirpinant 100 ml 70 % (V/V) etanolio tirpalo.

6×10-5 M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas ruošiamas sveriant 0,00118 g (tikslus svėrinys) chemiškai švaraus DPPH reagento matavimo kolboje tirpinant 50 ml 96 % (V/V) etanolio. Tirpalas tinkamas vartoti tik gaminimo dieną, todėl kiekvieną dieną ruošiamas švieţias ir laikomas tamsaus stiklo butelyje, apsaugančiame nuo saulės šviesos.

2 mM FeCl2 tirpalas ruošiama 0,0063 g (tikslus svėrinys) chemiškai gryno FeCl2 ištirpinant 25 ml išgryninto vandens. Tirpalas tinkamas tik gaminimo dieną, todėl vis ruošiamas švieţias.

5 mM ferozino tirpalas ruošiams 0,0616 g (tikslus svėrinys) ferozino ištirpinant 25 ml išgryninto vandens.

ABTS (2,2„-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono rūgštis) tirpalas ruošiamas 0,0548 g (tikslus svėrinys) chemiškai gryno ABTS reagento tirpinant 50 ml išgryninto vandens ir įdedant 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys laikomas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugotas nuo šviesos, kambario temperatūroje 15-16 valandų, kol pasiekiama reakcijos pusiausvyra. Gautas motininis tirpalas skiedţiamas išgrynintuoju vandeniu, kol gaunama tiksli darbinio tirpalo absorbcija, kuri lygi 0,800±0,030 esant 734 nm bangos ilgiui.

4.5. V. cracca ţaliavų ekstraktų spektrofotometrinė analizė

4.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas

Siekiant nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį etanoliniuose V. cracca ekstraktuose, atlikta spektrofotometrinė analizė naudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Analizei imama 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:100) ir sumaišoma su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagento. Po 4 min. įpilama 4 ml 7,5 % (W/V) Na2CO3 tirpalo, sumaišoma, paliekama stovėti 60 min. Gauto tirpalo optinis tankis matuojamas esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.

11 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)

Bendrasis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentu (GRE), remiantis galo rūgšties kalibracine kreive (11 pav.), skaičiavimams naudojant formulę:

GRE (mg/g) = c × V/m; c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml);

v – pagaminto ekstrakto tūris (ml); m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

4.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas

Bendras flavonoidų kiekis buvo nustatomas tiriamąjį ekstraktą veikiant aliuminio chlorido ir metenamino tirpalais parūgštinus ekstraktą acto rūgštimi. Iš kiekvieno ekstrakto gaminti 2 analizės bandiniaiKiekvienam iš jų ruošiami tirpalai: tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamasis tirpalas gaminamas 25 ml matavimo kolbutėje 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100) sumaišius su 10 ml 96 % (V/V) etanolio, 0,5 ml 33 % acto rūgšties tirpalo, 1,5 ml 10 % aliuminio chlorido tirpalo, 2 ml 5 % metenamino tirpalo, gautas mišinys skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki 25 ml ţymos, sumaišoma. Po 30 min. matuojamas tirpalo absorbcijos dydis ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu esant 475 nm bangos ilgiui.

Palyginamasis tirpalas ruošiamas į 25 ml matavimo kolbutę įpilant 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100), 10 ml 96 % etanolio (V/V), 0,5 ml 33 % acto rūgšties tirpalo. Mišinys skiedţiamas išgrynintu vandeniu iki ţymos, sumaišomas. Kiekvienas bandinys matuojamas po 2 kartus.

Duomenys vertinami gautą tirpalo absorbciją lyginant su etaloninio rutino tirpalo absorbcija. Etanolinio tiriamojo ir palyginamojo rutino tirpalas ruošiamas vietoj 1 ml etanolinio ekstrakto įpilant 1 ml etanolinio rutino tirpalo.

Bendras flavonoidų kiekis apskaičiuojamas rutinu ir išreiškiamas mg/g remiantis formule:

;

mR

m

A

A

V

V

4.5.3. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį Fe

jonų

sujungimo metodą

Fenolinių junginių antioksidacinis aktyvumas priklauso nuo jų gebėjimo sujungti pereinamųjų metalų, tokių kaip Fe2+

, Cu2+, jonus, todėl chelatines ekstraktų savybes galima įvertinti matuojant Fe(II) ir ferozino komplekso absorbcijos sumaţėjimą. Analizėje naudojamas 562 nm bangos ilgis. Kiekvienam ekstraktui ruošiami 2 mėginiai. Į 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:400) įpilama 50 µl 2 mM FeCl2 tirpalo ir gerai sumaišoma. Reakcija inicijuojama įpylus 0,2 ml 5 nM ferozino tirpalo, dar kartą sumaišoma ir paliekama stovėti kambario temperatūroje 10 min. Matuojama gauto mišinio absorbcija esant 562 nm bangos ilgiui. Tuščias bandinys ruošiamas vietoj 1 ml etanolinio ekstrakto įpilant 1 ml 70 % (V/V) etanolio ir sumaišant su tais pačiais reagentais. Palyginamasis tirpalas – 70 % (V/V) etanolis.

Ekstrakto gebėjimas sujungti Fe2+ jonus išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamos pagal formulę:

Fe2+ sujungimas = [(Ab – Aa)/Ab] × 100 %;

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis;

4.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas naudojant fotometrinį DPPH

radikalų surišimo metodą

Tiriamųjų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo įvertinimui atliekamas elektronų perdavimo reakcijomis pagrįstas DPPH (2,2 – difenil – 1 – pikrilhidrazilo) radikalų surišimo metodas. Kiekvienam ekstraktui ruošiama po 2 mėginius. Kvarcinėje kiuvetėje 50 µl tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:400), sumaišoma su 2 ml 6×10-5

M DPPH tirpalo. Kartu ruošiamas tuščias bandinys vietoj tiriamojo etanolinio ekstrakto naudojant 50 µl 70 % (V/V) etanolio – vandens mišinį ir sumaišant su 2 ml 6×10-5

M DPPH tirpalo. Spektrofotometru matuojama ţiedų, lapų ir stiebų ekstraktų mėginių absorbcijos dydţio maţėjimas esant 515 nm bangos ilgiui kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (po 30 min).

Antiradikalinis ekstraktų aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH procentais:

DPPH = [(Ab – Aa)/Ab] × 100 %;

Aa – bandinio su tiriamuoju ekstraktu absorbcijos dydis (po 30 min.).

Ab – tuščio bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min.).

4.5.5. Antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ABTS˙

metodu

Antiradikalinio aktyvumo įvertinimui ţaliavų ekstraktuose taikytas 2,2„-azino-bis-(3-etilbenzotiazolino-6-sulfono) rūgšties radikalo surišimo metodas. Iš pradţių pagaminamas 2mM motininis ABTS tirpalas tiksliai sveriant 0,0548 g ABTS reagento ir tirpinant 50 ml išgryninto vandens. Tirpalas gaminamas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugotas nuo saulės šviesos. Gautas motininis ABTS tirpalas aktyvuojamas įpylus 70 mM kalio persulfato tirpalo, sumaišomas ir paliekamas tamsioje vietoje. Aktyvuotas ABTS reagentas veikia kaip vandenilio radikalo donoras, vykstant elektronų perdavimo reakcijoms ABTS radikalai yra sujungiami. Pagamintas ABTS˙+

tirpalas tinkamas naudoti po 15-16 val. Su šiuo reagentu reaguoja augalinės ţaliavos ekstraktuose esančios biologiškai aktyvios medţiagos, kurios pasiţymi antiradikaliniu aktyvumu.

Po aktyvacijos gautas pradinis ABTS˙+ tirpalas skiedţiamas išgrynintu vandeniu, kol gaunama tiksli tirpalo absorbcija (0,800±0,03), esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamuoju tirpalu naudojamas išgrynintas vanduo. Tiriamųjų etanolinių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas matuojamas į 3,0 ml darbinio ABTS˙+ tirpalo įlašinant 30 µl tiriamojo ekstrakto. Iš kiekvieno ekstrakto gaminti 2 mėginiai, kurie laikomi kambario temperatūroje, 60 min, po to jų absorbcija matuojama esant 734 nm bangos ilgiui.

Laisvųjų radikalų surišimo geba įvertinama remiantis trolokso kalibracine kreive ir išreiškiama trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui ţaliavos:

TE(ABTS) = c × V/m; µmol/g

c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (µmol/g); V – pagaminto ekstrakto tūris (ml);

m – atsvertas žaliavos kiekis (g).

Etaloninio antioksidanto trolokso kalibracinė kreivė sudaroma ruošiant 7 skirtingų koncentracijų trolokso tirpalus. Pirminis trolokso tirpalas ruošiamas sveriant tikslų trolokso kiekį ir tirpinant jį 70 % (V/V) etanolyje. Iš šio tirpalo gaminami 6 skirtingų koncentracijų (250 – 6000 µmol/l) tirpalai, su kuriais atliekamas ABTS tyrimas. Išmatavus pasigamintų koncentracijų trolokso tirpalų absorbcijos reikšmes, sudaroma kalibracinė kreivė (12 pav.)

12 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų – katijonų sujungimo metodu (n=3)

4.6. Duomenų analizė

Gautų rezultatų statistinė duomenų analizė ir duomenų grafinis vaizdavimas atlikti su ,,Microsoft Excel 2010„„ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa bei SPSS 20 (IBM, JAV) statistiniu paketu. Statistiniam įvertinimui apskaičiuotas duomenų matematinis vidurkis, standartinis nuokrypis, standartinė paklaida, variacijos koeficientas. Tiesinės regresijos modelio tinkamumui apskaičiuoti determinacijos koeficientai R2. Parinktas reikšmingumo lygmuo 0,05, vadinasi, rezultatai bus laikomi statistiškai reikšmingais, kai p<0,05. Atliktas koreliacinių ryšių įvertinimas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą. [35]