FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
EGLĖ MOCKEVIČIŪTĖ
SĖJAMOJO GRIKIO (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH)
ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR JŲ ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
lekt. dr. Vilma Pukelevičienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis
Data:
SĖJAMOJO GRIKIO (FAGOPYRUM ESCULENTUM MOENCH)
ŽOLĖS FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR JŲ ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
lekt. dr. Vilma Pukelevičienė
Data:
Recenzentas
Darbą atliko
Magistrantė
Data:
Eglė Mockevičiūtė
Data:
TURINYS
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.1. Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench), jo paplitimas ir morfologiniai požymiai10 1.2. Sėjamųjų grikių žolės fitocheminė sudėtis ... 11
1.3. Sėjamųjų grikių biologinio poveikio tyrimai ir panaudojimas ... 11
1.4. Flavonoidų ir fenolinių rūgščių apžvalga ... 14
1.5. Sėjamųjų grikių žolėje kaupiamų junginių: rutino, kvercitrino, kvercetino, chlorogeno ir neochlorogeno rūgščių, apžvalga ... 15
1.6. Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės analizės metodai... 17
1.7. Laisvieji radikalai ir antioksidantai ... 21
1.8. Antioksidantų aktyvumo nustatymas ESC pokolonėliniais metodais ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 24
2.1. Tyrimo objektas ... 24
2.2. Naudoti reagentai ir aparatūra ... 24
2.3. Tyrimo metodai ... 25
2.3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio nustatymas ... 25
2.3.2. Grikių žolės ekstraktų paruošimas ... 25
2.3.3. Standartų tirpalų paruošimas ... 26
2.3.4. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė ... 26
2.3.5. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymas ... 27
2.4. Duomenų statistinis įvertinimas ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis... 29
3.2. ESC ir ESC-ABTS pokolonėlinio metodų validacijos parametrų patikrinimas ... 29
3.2.1. Specifiškumas ... 30
3.2.2. Glaudumas ... 30
3.2.3. Aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos ... 32
3.2.4. Tiesiškumas ... 33
3.4. Kiekybinis fenolinių junginių nustatymas sėjamųjų grikių žolėje ... 35
3.4.1. Flavonoidų (rutino, kvercitrino ir kvercetino) kiekio įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje ... 35
3.4.2. Fenolinių rūgščių (chlorogeno ir neochlorogeno) kiekio įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje ... 38
3.4.3. Suminio fenolinių junginių kiekio įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje ... 40
3.5. Sėjamųjų grikių žolės ekstraktuose nustatytų fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ... 41
3.5.1. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų ekologinės žemdirbystės sąlygomis, žolėje ... 42
3.5.2. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų intensyvios žemdirbystės sąlygomis, žolėje ... 44
3.5.3. Suminio fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo įvairavimas sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje ... 45
4. IŠVADOS ... 48
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 50
7. MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO REZULTATŲ MOKSLINĖ SKLAIDA ... 58
E. Mockevičiūtės magistro baigiamasis darbas „Sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) žolės fenolinių junginių ir jų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas“; mokslinė vadovė lekt. dr. V. Pukelevičienė; Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Farmacijos fakultetas, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas.
Tyrimo tikslas: nustatyti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų šešių
sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) veislių žolėje kaupiamų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei jų antioksidantinį aktyvumą.
Uždaviniai: 1) Įvertinti ESC ir ESC-ABTS pokolonėlinio tyrimų metodų fenolinių junginių
analizei grikių žolės mėginiuose tinkamumą, patikrinant validacijos parametrus; 2) Nustatyti fenolinių junginių kokybinę sudėtį ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų šešių sėjamųjų grikių veislių žolėje; 3) Ištirti identifikuotų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje; 4) Įvertinti nustatytų fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą ir jo įvairavimą sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje.
Tyrimo objektas: Lietuvoje ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų šešių
sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) veislių žolė.
Tyrimo metodai: grikių žolės fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta ESC
metodu, fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas įvertintas ESC-ABTS pokolonėliniu metodu.
Išvados: 1) Pagal gautus specifiškumo, glaudumo, aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribų bei
tiesiškumo parametrų įverčius ESC ir ESC-ABTS pokolonėlinis tyrimų metodai yra tinkami ir patikimi fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei bei antioksidantinio aktyvumo įvertinimui grikių žolės mėginiuose; 2) Visų tirtų grikių veislių žolėje ESC metodu identifikuoti penki fenoliniai junginiai: rutinas, kvercitrinas, kvercetinas, chlorogeno ir neochlorogeno rūgštys; 3) ESC metodu nustatyta, kad rutinas visų tirtų grikių veislių žolėje – vyraujantis fenolinis junginys, nustatyti kvercetino kiekiai – mažiausi iš visų vertintų fenolinių junginių. Didžiausias suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas „Žniajarka“ ir „Žaleika“ grikių veislių, augintų ekologinės žemdirbystės sąlygomis, žolėje (atitinkamai 23,52 proc. ir 28,48 proc. daugiau, lyginant su intensyvia žemdirbystės sistema (p<0,05)); 4) ESC-ABTS pokolonėliniu metodu nustatyta, kad rutinas pasižymėjo didžiausiu, o kvercetinas – mažiausiu antioksidantiniu aktyvumu tarp grikių žolėje nustatytų fenolinių junginių. Didžiausias suminis antioksidantinis aktyvumas nustatytas „Žniajarka“ ir „Žaleika“ grikių veislių, augintų ekologinės žemdirbystės sąlygomis, žolėje (atitinkamai 29,60 proc. ir 31,32 proc. didesnis, lyginant su intensyvia žemdirbystės sistema (p<0,05)).
Master thesis of E. Mockevičiūtė “Evaluation of phenolic compounds and their antioxidant activity in common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) herbˮ; scientific supervisor lect. dr. V. Pukelevičienė; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas.
The aim: To determine qualitative and quantitative composition of phenolic compounds in herb
of six common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) varieties grown under organic and conventional farming conditions and to evaluate their antioxidant activity.
Tasks: 1) To verify validation parameters of HPLC and HPLC-ABTS methods for analysis of
phenolic compounds in buckwheat herb; 2) To determine qualitative composition of phenolic compounds in herb of six common buckweat varieties grown under organic and conventional farming conditions; 3) To quantitate amounts of phenolic compounds in herb of different common buckweat varieties grown under different farming conditions; 4) To evaluate antioxidant activity of phenolic compounds in herb of different common buckweat varieties grown under different farming conditions.
Research object: herb of six common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) varieties
organically and conventionally grown under Lithuanian agro-climatic conditions.
Methods: HPLC was used for the qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds
in plant material. HPLC-ABTS post-column assay was used to evaluate antioxidant activity of phenolic compounds.
Conclusions: 1) Results of specificity, precision, detection and quantitation limits show that
HPLC and HPLC-ABTS post-column methods are suitable and reliable for qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds and evaluation of antioxidant activity in buckwheat herb; 2) Five phenolic compounds were identified in herb of all common buckwheat varieties’ by using HPLC method: rutin, quercitrin, quercetin, chlorogenic and neochlorogenic acids; 3) HPLC analysis showed that rutin was the dominant phenolic compound in herb of all common buckwheat varieties’ herb while quercetin levels were the lowest of all evaluated phenolic compounds. Highest total amount of phenolic compounds was determined in herb of “Žniajarkaˮ and “Žaleikaˮ varieties grown under organic farming conditions (23.52% ir 28.48% higher compared to conventional farming system, respectively (p<0.05)); 4) HPLC-ABTS post-column analysis showed that rutin had the highest antioxidant activity and quercetin had the lowest antioxidant activity of all evaluated phenolic compounds. Highest total antioxidant activity was determined in herb of “Žniajarkaˮ and “Žaleikaˮ varieties grown under organic farming conditions (29.60% and 31.32% higher compared to conventional farming system, respectively (p<0.05)).
SANTRUMPOS
ABAP – 2,2'-azobis-(2-amidino-propano) hidrochloridas;
ABTS – 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (angl. ABTS –
2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid);
AV – absorbcijos vienetai; BD-2 – Belaruskij determinant-2; DNR – deoksiribonukleorūgštys; DPPH – 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas;
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. HPLC – high performance liquid chromatography); JAV – Jungtinės Amerikos Valstijos;
IL – interleukinas;
LPS – lipopolisacharidai; SN – standartinis nuokrypis;
SSN – santykinis standartinis nuokrypis; TE – trolokso ekvivalentai;
ĮVADAS
Pastaruoju metu didėja mokslininkų susidomėjimas augalinėmis žaliavomis: atliekami tyrimai, siekiant nustatyti biologiškai aktyvius junginius įvairiose augalinėse žaliavose, junginių susikaupimą veikiančius veiksnius bei šių junginių antioksidantinį aktyvumą. Žemės ūkio ir farmacijos pramonėje nuolat ieškoma natūralių žaliavų, kaupiančių fenolinius junginius ir pasižyminčių dideliu antioksidantiniu aktyvumu [1]. Pagrindinė šio susidomėjimo priežastis yra fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas ir jų teigiamas vaidmuo įvairių ligų, susijusių su oksidaciniu stresu, prevencijai: vėžio, širdies ir kraujagyslių, neurodegeneracinių ir kitų ligų [2].
Sėjamųjų grikių vaistinė augalinė žaliava (žolė) kaupia fenolinius junginius: flavonoidus ir fenolines rūgštis [1]. Sėjamieji grikiai – grūdinių javų kultūra, kuri gali būti auginama tiek intensyvios, tiek ir ekologinės žemdirbystės sąlygomis. Lietuvos agroklimatinėmis sąlygomis augintų grikių žolėje fenoliniai junginiai yra mažai ištirti, todėl tikslinga įvertinti fenolinių junginių pasiskirstymą ir jų antioksidantinį aktyvumą bei, atsižvelgiant į tai, atlikti perspektyviausių veislių atranką. Atlikti tyrimai leis nustatyti grikių auginimui tinkamiausią žemdirbystės sistemą ir veisles, išsiskiriančias biologine verte. Taip pat pagal gautus duomenis bus galima įvertinti skirtingų grikių veislių žaliavos potencialų panaudojimą vaistinių preparatų, maisto papildų ar kosmetikos gaminių, praturtintų grikių žolės ekstraktu, Lietuvoje gamybai.
Fenolinių junginių kokybinei ir kiekybinei analizei atlikti pasirinktas efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas, fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymui – ESC metodas su pokolonėline 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalo reakcijos detekcija (ESC-ABTS pokolonėlinis metodas). Šie metodai suteikia galimybę įvertinti atskirų junginių kokybinius ir kiekybinius parametrus bei jų antioksidantinį aktyvumą.
Tyrimą finansavo Lietuvos mokslo taryba (sutarties Nr. SVE-02/2014).
Tyrimo rezultatai pristatyti Lietuvoje vykusiose trijose tarptautinėse mokslinėse konferencijose.
Darbo tikslas: nustatyti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų šešių
sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) veislių žolėje kaupiamų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei jų antioksidantinį aktyvumą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: nustatyti ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų šešių
sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) veislių žolėje kaupiamų fenolinių junginių kokybinę ir kiekybinę sudėtį bei jų antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti ESC ir ESC-ABTS pokolonėlinio tyrimų metodų fenolinių junginių kokybiniam, kiekybiniam ir antioksidantiniam nustatymui grikių žolės mėginiuose tinkamumą, patikrinant validacijos parametrus.
2. ESC metodu nustatyti fenolinių junginių kokybinę sudėtį ekologinės ir intensyvios žemdirbystės sąlygomis užaugintų šešių sėjamųjų grikių veislių žolėje.
3. ESC metodu ištirti identifikuotų fenolinių junginių kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje.
4. ESC-ABTS pokolonėliniu metodu įvertinti sėjamųjų grikių žolėje nustatytų fenolinių junginių antioksidantinį aktyvumą ir jo įvairavimą sėjamųjų grikių veislių, augintų skirtingomis žemdirbystės sąlygomis, žolėje.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1.
Sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench), jo paplitimas ir
morfologiniai požymiai
Grikių gentis (lot. Fagopyrum), kurią sudaro 19 rūšių, priklauso rūgtinių (lot. Polygonaceae) šeimai [3]. Grikių rūšys skirstomos į vienmečius (Fagopyrum esculentum Moench, Fagopyrum tataricum L., Fagopyrum giganteum Krotov.) ir daugiamečius (Fagopyrum cymosum Meissn, Fagopyrum suffruticosum Fr. Schmidt, Fagopyrum ciliatum Jaegt) augalus [4]; pasaulyje kultivuojamos dvi grikių rūšys – sėjamasis grikis (Fagopyrum esculentum Moench) ir totorinis grikis (Fagopyrum tataricum L.) [3,4].
Sėjamasis grikis (lot. Fagopyrum esculentum Moench; sinonimai: Polygonum fagopyrum L., Fagopyrum fagopyrum (L.) Karst., Fagopyrum vulgare Hill, Fagopyrum sagittatum Gilib. [5]) – iš Centrinės Azijos kilęs vienmetis žolinis augalas, paplitęs Europoje, Rusijoje, netropikinėje Azijoje, Šiaurės Amerikoje, Rytų Azijoje. Manoma, kad sėjamuosius grikius pirmieji pradėjo auginti rytų Azijos stepių gyventojai. Iš ten X a. grikiai išplito Kinijoje, viduramžių pabaigoje jie pradėti auginti Rytų Europoje, o dar vėliau – Vidurio ir Vakarų Europoje. Augaliniai archeologiniai radiniai rodo, kad Lietuvoje grikiai paplito apie XII–XIII a. [6].
Jungtinių Tautų maisto ir žemės ūkio organizacijos (angl. United Nations Food and Agriculture Organization, FAO) 2013 metų duomenimis didžiausi nuimamo derliaus plotai (ha) buvo Rusijoje, Kinijoje, Kazachstane ir Ukrainoje [7]. Lietuvoje sėjamieji grikiai auginami sausuose smėlio dirvožemiuose, laukuose rytinėje ir pietrytinėje Lietuvos dalyje. Kartais pasitaiko pakelėse, dykvietėse, ant geležinkelio pylimų [6]. Žemės ūkio informacijos ir kaimo verslo centro duomenimis grikių Lietuvoje auginama vis daugiau: 1999 m. deklaruotas grikių pasėlių plotas buvo 16261,20 ha, o 2015 m. – 36901,80 ha [8].
Sėjamasis grikis – trumpo vegetacijos periodo (70–90 dienų) augalas, užaugantis iki 60–80 cm aukščio, turintis liemeninę šaknį, žydintis birželio–rugpjūčio mėnesiais [6,9]. Augalo stiebas stačias, mažai šakotas, plikas, vagotas, rausvas (vaisiams bręstant, stiebas paraudonuoja), tuščiaviduris, žemiau bamblių šiek tiek plaukuotas. Lapai – 2–8 cm ilgio, širdiškai trikampiški arba širdiškai strėliški, beveik penkiakampiai, turintys nusmailėjusias viršūnes. Apatiniai lapai yra ilgakočiai, o viršutiniai – mažesni ir bekočiai. Žiedai stiebo viršūnėse yra sukrauti skėtiškose kekėse. Apyžiedį, kuris būna rožinės arba baltos spalvos, sudaro kiaušiniški 3–4 mm ilgio lapeliai. Vaisiai – 6–7 mm ilgio, matiniai, su trimis lygiomis aštriomis briaunomis ir smailiais galais grūdai [6]. Grūdai gali būti nuo sidabriškai pilkos iki rudos ar juodos spalvos [10]. Sėjamųjų grikių žolė ir žiedynai vaizduojami 1-ame paveiksle.
11
1 pav. Sėjamųjų grikių žolė (a) ir žiedynai (b) [11,12]
1.2.
Sėjamųjų grikių žolės fitocheminė sudėtis
Sėjamųjų grikių žolė yra vartojama kaip vaistinė augalinė žaliava [13]. Atlikus sėjamųjų grikių žolės fitocheminės sudėties tyrimus, nustatyta, kad žolė kaupia įvairias veikliąsias medžiagas: flavonoidus: kvercetiną (0,01–0,05 proc.), rutiną (kvercetino-3-rutinozidą) (5,35–5,50 proc.) [14,15], hiperozidą (kvercetino-3-O-β-D-galaktozidą) (0,18–0,37 proc.) [16], kvercitriną (kvercetino-3-O-α-L-ramnozidą) [1], epikatechiną [17], fenolinės rūgštis: chlorogeno [16], neochlorogeno, p-hidroksibenzoinę [10], ferulo, trans-ferulo, vanilino, p-kumarino, p-anyžinę, salicilo, metoksicinamono [18], galo, kavos, protokatecho (3,4-dihidroksibenzoinę) [6]. Augalų antžeminėje dalyje taip pat nustatytos organinės rūgštys (askorbo, folio), proteinai (11–12 proc.) [6], vitaminas E (α-tokoferolis), skvalenas [17], taninai [19], fagopirinai – fotosensibilizaciją galintys sukelti junginiai [20]. Apibendrinus sėjamųjų grikių augalinės žaliavos fitocheminės sudėties tyrimų rezultatus, galima teigti, kad sėjamųjų grikių žolė yra svarbus fenolinių junginių šaltinis.
1.3.
Sėjamųjų grikių biologinio poveikio tyrimai ir panaudojimas
Iš sėjamųjų grikių žaliavos išskirtas rutinas veikia kaip vitaminas P. Rutinas su askorbo rūgštimi vartojamas kraujagyslių sienelėms stiprinti, išsiliejus kraujui akies tinklainėje, sergant kai kuriomis infekcinėmis ligomis, reumatu bei profilaktiškai nuo spindulinės ligos [6].
Moksliniais tyrimais įrodytas įvairiose augalo dalyse kaupiamų junginių uždegimo slopinamasis [21], gliukozės kiekį kraujyje mažinantis [22,23], hipolipideminis [24–26], kraujospūdį mažinantis [27,28], antihipertrofinis ir antiproliferacinis [29], antioksidantinis poveikiai [30]. Manoma, kad grikyje kaupiamos bioaktyvios medžiagos, tokios kaip d-chiroinozitolis, proteinai ir flavonoidai, nulemia šiuos poveikius [31].
Uždegimo slopinamasis poveikis. Naudojant žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelių liniją,
a
b
įrodytas etanolinių grikių daigų ekstraktų uždegimo slopinamasis poveikis. Ląstelės 16 valandų buvo laikomos terpėje su lipopolisacharidais (LPS) (100 ng/ml LPS). LPS padidino prouždegiminio citokino – interleukino 8 (IL-8) gamybą 2,7 karto. Pridėjus į terpę skirtingų koncentracijų grikių daigų ekstraktų (0,5 mg/ml arba 1 mg/ml), IL-8 gamyba LPS aktyvuotose žmogaus storosios žarnos vėžio ląstelėse reikšmingai sumažėjo. Toksiškumas ląstelėms nepasireiškė ir jos išliko gyvybingos. Siekiant papildomų įrodymų buvo panaudotas laboratorinių pelių modelis. Pelėms per zondą buvo sušerta 2 mg LPS. LPS sukėlė IL-6 ir audinių nekrozės faktoriaus (angl. tumor necrosis factor, TNF-α) gamybos padidėjimą blužnyje ir kepenyse. Lyginant su kontroline grupe grikių daigų ekstraktai (10 mg pelei) sumažino šių citokinų gamybą atitinkamai 8 ir 3,8 karto. Taip pat šio tyrimo metu, naudojant pelių kepenų ūmaus pažeidimo modelį, buvo įrodyta, kad etanolinio grikių daigų ekstrakto vartojimas apsaugo nuo D-galaktozamino bei LPS sukeliamo kepenų pažeidimo [21].
Gliukozės kiekį kraujyje mažinantis poveikis. Tyrimai su žiurkėmis įrodė, kad grikių kaupiamas d-chiroinozitolis pasižymi gliukozės kiekį kraujyje mažinančiu poveikiu. Mokslinio tyrimo metu streptozotocinu pelėms buvo sukelta hiperglikemija ir po to per os sugirdyta grikių ekstrakto, kuriame buvo 10 arba 20 mg/kg d-chiroinozitolio. Nustatyta, kad abiejų koncentracijų ekstraktai veiksmingi: po 1,5 ir 2 valandų gliukozės koncentracija kraujo serume sumažėjo 12–19 proc. [22]. Kitame tyrime, naudojant tetraoksipirimidiną, žiurkėms sukeltas antro tipo cukrinis diabetas ir stebėtas grikių žieduose ir lapuose kaupiamų flavonų poveikis. Po 4 savaičių pastebėtas flavonų gliukozės kiekį kraujyje mažinantis ir jautrumą insulinui didinantis poveikis [23].
Hipolipideminis poveikis. Eksperimentinėse studijose su pelėmis, kurios buvo šeriamos riebiu maistu, nustatyta, kad kartu vartojant grikių lapų ir žiedų mišinį ryškiai sumažėja svorio augimas, plazmos lipidų koncentracija bei aterogeninis indeksas [24]. Kito su žiurkėmis atlikto tyrimo metu įrodytas daug baltymų turinčių grikių miltų cholesterolio kiekį mažinantis poveikis. Tyrimo metu žiurkėms taikyta daug cholesterolio turinti dieta, į ją įtraukiant grikių miltų. Praėjus dešimt dienų nuo tyrimo pradžios, cholesterolio kiekis žiurkių kraujyje sumažėjo 33 proc., lyginant su kontrole (kazeiną vartojusia grupe), taip pat sumažėjo cholesterolio kiekis kepenyse. Praėjus 27 dienoms, pastebėtas tulžies akmenų formavimąsi slopinantis poveikis, kuris pasireiškia dėl padidėjusio rūgštinių steroidų išsiskyrimo su išmatomis. Tuo tarpu žiurkėms dešimt dienų taikant cholesterolio neturinčią dietą ir vartojant grikių lapų ir žiedų mišinį, sumažėjo riebalinio audinio ir riebalų rūgščių sintazės aktyvumas, lyginant su kontrole [25]. Hipolipideminis poveikis įrodytas su laboratorinėmis pelėmis, žiurkėmis ir triušiais. Dvylika savaičių triušiams taikyta įprastinė laboratorinė dieta, į ją įtraukiant cholesterolį, hidrintą kokosų aliejų, cholio rūgštį ir per os papildomai skiriant sėjamųjų grikių žolės ekstrakto (0,25 g/kg/24 val.). Eksperimento pabaigoje gyvūnų kepenyse reikšmingai sumažėjo bendrojo cholesterolio ir trigliceridų bei malondialdehido, kuris yra lipidų peroksidacijos rodiklis [26].
daigų, fermentuotų Lactobacillus plantarum, kraujospūdį mažinantis poveikis. Vienai žiurkių grupei duota 0,010 mg/kg, kitai 0,10 mg/kg kūno svorio vandeninio tirpalo, pagaminto iš liofilizuotų fermentuotų grikių daigų. Teigiamai kontrolei naudotas vandeninis kaptoprilio tirpalas (1,0 mg/kg kūno svorio), neigiamai – išgrynintas vanduo. Po 3 val. abiejose grupėse ryškiai sumažėjo sistolinis ir diastolinis kraujo spaudimas, lyginant su neigiama kontrole. Didžiausias efektas pastebėtas praėjus 9 val. po fermentuotų daigų pavartojimo: sistolinis ir diastolinis kraujo spaudimas sumažėjo atitinkamai 31,3 ir 23,9 mmHg (0,10 mg/kg vartojusi grupė) ir 22,2 ir 14,2 mmHg (0,010 mg/kg vartojusi grupė). Abi produkto dozės buvo veiksmingesnės nei kaptoprilis. Tai įrodo produkto potencialą terapiniam vartojimui. Nustatyta, kad kraujospūdį mažinantis poveikis pasireiškė per du mechanizmus: angiotenziną konvertuojančio fermento inhibavimą bei kraujagyslių vazodilataciją [27].
Kito tyrimo metu žiurkės, kurioms padidėjęs sistolinis kraujo spaudimas (180 mmHg ir didesnis), buvo padalintos į šešias grupes po dešimt. Pirmajai grupei penkias savaites kiekvieną dieną buvo skiriamas vanduo, antrajai – 300 mg/kg vandeninio grikių ekstrakto, trečiajai – 600 mg/kg vandeninio grikių ekstrakto, ketvirtajai – 300 mg/kg vandeninio daigintų grikių ekstrakto, penktajai – 600 mg/kg vandeninio daigintų grikių ekstrakto, šeštajai – 2,5 mg/kg kaptoprilio (kaip teigiama kontrolė). Vartojant 300 mg/kg vandeninio grikių ekstrakto ir 300 mg/kg vandeninio daigintų grikių ekstrakto reikšmingų kraujospūdžio pokyčių neužfiksuota. Grupėse, kurios vartojo 600 mg/kg vandeninio grikių ekstrakto ir 600 mg/kg vandeninio daigintų grikių ekstrakto, kraujospūdis pradėjo mažėti po keturių savaičių nuo eksperimento pradžios ir po penkių savaičių sistolinis kraujo spaudimas sumažėjo atitinkamai 44 mmHg ir 53 mmHg. Tuo tarpu kaptoprilį vartojusioje grupėje sistolinis kraujo spaudimas po penkių savaičių sumažėjo 41 mmHg [28].
Antihipertrofinis ir antiproliferacinis poveikiai. Naudodami žiurkės širdies ląsteles, Kinijos mokslininkai įrodė iš sėjamųjų grikių lapų ir žiedų išekstrahuoto rutino apsauginį poveikį širdies hipertrofijai. Naudojant angiotenziną II, buvo sukelta širdies miocitų hipertrofija ir fibroblastų proliferacija. Ląsteles veikiant rutinu, reikšmingai sumažintas miocitų paviršius, baltymų sintezė ir inhibuota fibroblastų proliferacija. Taigi įrodyta, kad rutinas gali inhibuoti angiotenzino II sukeltą širdies hipertrofiją [29].
Antioksidantinis poveikis. Antioksidantinis grikių luobelių aktyvumas įrodytas, naudojant laboratorinių pelių modelį. Pelės buvo suskirstytos į tris grupes po 5–6. 14 dienų pelėms buvo skiriama 0,75 proc. grikių luobelių ekstrakto arba vitamino E kartu su standartine dieta arba taikyta tik standartinė dieta. Grikių ekstraktą vartojusių pelių kraujyje, kepenyse bei smegenyse reikšmingai sumažėjo tiobarbitūro rūgšties reaktyvių formų (angl. thiobarbituric acid reactive substances), kurių buvimas rodo, kad vyksta mažo tankio lipoproteinų oksidacija. Ypač tiobarbitūro rūgšties reaktyvių formų sumažėjo smegenyse, labiau nei vitamino E grupėje. Taip pat reikšmingai padidėjo fermentinio antioksidanto – superoksido dismutazės aktyvumas kraujo serume [30].
1.4.
Flavonoidų ir fenolinių rūgščių apžvalga
Flavonoidai – didžiausia fenolinių junginių grupė [32].Šiuo metu žinoma virš 6500 flavonoidų [33]. Tai mažos molekulinės masės junginiai, turintys benzo-γ-pirono struktūrą [34]. Flavonoidų pagrindą sudaro 15 anglies atomų skeletas (C6-C3-C6), sudarytas iš heterociklinio benzopirano žiedo C, prie kurio prijungtas aromatinis žiedas A ir fenilo pakaitas (žiedas B) (2a pav.) [35]. Pagal C žiedo struktūros skirtumus (skirtingas oksidacijos laipsnis ir pakaitai) išskiriami flavonoidų poklasiai: flavonai, izoflavonai, flavanoliai,flavonoliai, flavononai, chalkonai ir kt. [33]. Flavonoidai dažniausiai būna hidroksilinti 3, 5, 7, 3', 4' ir (ar) 5' padėtyse. Dažniausiai viena arba kelios hidroksilo grupės būna metilintos, acetilintos ar sulfatuotos [34].
2 pav. Pagrindinė flavonoidų (a) ir fenolinių rūgščių (b) struktūra [36]
Flavonoidai augaluose dažniausiai aptinkami O-glikozidų pavidalo, rečiau – kaip C-glikozidai, rečiausiai – aglikonų pavidalo [37]. O-glikoziduose cukrus dažniausiai būna prisijungęs prie 3-oje ar 7-oje aglikono padėtyje esančios hidroksilo grupės, tuo tarpu C-glikoziduose cukrus dažniausiai prisijungęs prie aglikono 6 ar 8 anglies atomo. Dažniausiai būna prisijungę šie angliavandeniai: ramnozė, gliukozė, galaktozė ir arabinozė. Dažnai aptinkami ir flavonoidų diglikozidai, kurių disacharidai dažniausiai sudaryti iš gliukozės ar ramnozės ir prijungtos neohesperidozės ar rutinozės. Cukrūs dažnai būna acilinti malonatu ar acetatu [34].
Fenolinės rūgštys – aromatinės struktūros antriniai augalų metabolitai, pagal struktūrą skirstomi į dvi klases: benzoinės rūgšties darinius (pagrindas C6-C1) ir cinamono rūgšties darinius (pagrindas C6 -C3) (2b pav.) [36,38]. Pagrindinis struktūros skirtumas – benzoinė rūgštis turi –COOH grupę, tuo tarpu cinamono rūgštyje ši grupė pakeista –CH=CH–COOH grupe, kuri fenoliniam žiedui suteikia didesnį stabilumą [39]. Hidroksi- grupių skaičiaus ir prisijungimo vietų skirtumai prie aromatinio žiedo sukuria didelę fenolinių rūgščių įvairovę [36]. Augalų ląstelėse fenolinės rūgštys dažnai aptinkamos esterių, amidų pavidalo, rečiau – glikozidų (dažniau hidroksicinamono rūgštys). Hidroksibenzoinės rūgštys yra pagrindinis struktūrinis hidrolizuojamų taninų ir lignino komponentas [40].
Dėl skirtingos cheminės struktūros ir skirtingų pakaitų flavonoidai atlieka daug svarbių funkcijų augaluose [41]. Žieduose esantys flavonoidai, suteikdami jiems spalvą, pritraukia apdulkintojus [42].
a) b)
Flavonoidai dalyvauja apsaugant augalą nuo biotinių (žolėdžių, patogenų) ir abiotinių (ultravioletinės (UV) spinduliuotės, karščio) stresinių veiksnių. Kadangi flavonoidai pasižymi antioksidantinėmis savybėmis, jie yra svarbūs palaikant redokso būklę ląstelėse. Antioksidantinis flavonoidų aktyvumas siejamas su molekulės struktūra: konjuguotų dvigubų ryšių ir funkcinių grupių žieduose buvimu [41].
Flavonoidai sumažina reaktyvių deguonies formų (angl. reactive oxygen species) gamybą ir jas neutralizuoja šiais būdais:
1. Singletinio deguonies nuslopinimas;
2. Fermentų, kurie gamina reaktyvias deguonies formas, inhibavimas (ciklooksigenazės, lipooksigenazės, monooksigenazės, ksantino oksidazės);
3. Chelatų sudarymas su metalų jonais, kurie gali katalizuoti reaktyvių deguonies formų gamybą;
4. Lipidų peroksidacijos metu vykstančios laisvųjų radikalų reakcijų kaskados slopinimas; 5. Kitų antioksidantų „perdirbimas“ [41].
Dėl mažo flavonoidų redokso potencialo jie gali slopinti stiprius laisvuosius radikalus (superoksido, alkilo, hidroksilo radikalus) [41]. Flavonoidai taip pat dalyvauja tokiuose procesuose kaip energijos perdavimas, augimo hormonų ir augimo reguliatorių veikimas, kvėpavimo ir fotosintezės reguliavimas, morfogenezė. Fenolinės rūgštys svarbios tokiems procesams kaip baltymų sintezė, fermentų aktyvumas, fotosintezė, aleopatija [42].
Daug dėmesio skiriama flavonoidų ir fenolinių rūgščių antioksidantinio aktyvumo tyrimams, siekiant įrodyti jų, kaip natūralių antioksidantų, gebėjimą apsaugoti nuo oksidacinės pažaidos, kuri yra daugelio lėtinių ligų priežastis [42]. Flavonoidai ir fenolinės rūgštys pasižymi profilaktiniu poveikiu karcinogenezei, uždegimui, aterosklerozei, trombozei, daugeliui degeneracinių ligų. Taip pat atlikti tyrimai rodo, kad flavonoidai yra aldozės reduktazės inhibitoriai ir geba blokuoti sorbitolio kelią, kuris lemia įvairias sveikatos problemas diabetu sergantiems pacientams [43–48]. Flavonoidų gebėjimas inhibuoti ciklooksigenazės ir lipooksigenazės fermentus mažina trombocitų aktyvaciją ir agregaciją, apsaugo nuo širdies ir kraujagyslių ligų. Taip pat flavonoidai ir fenolinės rūgštys pasižymi įvairiais kitais biologiniais poveikiais: priešvirusiniu, antimikrobiniu, antihepatotoksiniu, antiosteoporotiniu, priešopiniu, imunomoduliaciniu, antiproliferaciniu ir apoptoziniu[49].
1.5.
Sėjamųjų grikių žolėje kaupiamų junginių: rutino, kvercitrino, kvercetino,
chlorogeno ir neochlorogeno rūgščių, apžvalga
Pagrindinių flavonoidų, aptinkamų grikių žolėje, cheminė struktūra vaizduojama 3-ame paveiksle.
3 pav. Pagrindinių flavonoidų, aptinkamų grikių žolėje, cheminė struktūra [1]
Rutinas. Rutinas (kvercetin-3-rutinozidas) – geriausiai žinomas flavonolio kvercetino
glikozidas [50], sudarytas iš kvercetino ir disacharido rutinozės, randamas daugelyje vaistingųjų augalų. Rutinas – pagrindinis grikių kaupiamas flavonoidas. In vitro ir su gyvūnais atliktų tyrimų metu įrodytas rutino uždegimo slopinamasis ir kraujagysles veikiantis poveikis, gebėjimas mažinti kapiliarų pralaidumą ir aterosklerozės riziką. Be to, atlikti tyrimai įrodo rutino gebėjimą slopinti mažo tankio lipoproteinų peroksidaciją, jo antioksidantinį aktyvumą Fenton reakcijos metu. Taip pat rutinas pasižymi apsauginiu poveikiu etanolio sukeltiems skrandžio pažeidimams, deoksiribonukleorūgščių (DNR) pažeidimams, karcinogenezei [4].
Kvercitrinas. Kvercitrinas – glikozidas, sudarytas iš flavonolio kvercetino ir ramnozės [31]. Tai
bioflavonoidas, pasižymintis antioksidantinėmis savybėmis, absorbuojamas geriau nei kitos glikozilintos kvercetino formos [51]. Atlikti tyrimai įrodo kvercitrino, kaip antioksidanto, gebėjimą inhibuoti UVB spinduliuotės (280–320 nm) odai sukeltą oksidacinę pažaidą [52]. Kvercitrinas geba apsaugoti ir atkurti dantenų audinius, todėl galėtų būti naudojamas periodonto ligos gydymui [53]. Kvercitrinui taip pat būdingas antibakterinis [54] ir priešalerginis [55] poveikiai.
Kvercetinas. Kvercetinas – flavonolių poklasiui priskiriamas flavonoidas, savo struktūroje
turintis penkias hidroksilo grupes, randamas obuoliuose, svogūnuose, riešutuose, uogose, kopūstuose ir kitur [56]. Dažniausiai kvercetinas būna sujungtas su cukrumi, pavyzdžiui, gliukoze (izokvercitrinas) arba rutinoze (rutinas), tačiau dėl burnos ir žarnyno fermentų poveikio vyksta kvercetino glikozidų hidrolizė iki aglikono [57,58]. Kvercetinas pasižymi plačiu terapiniu poveikiu: antioksidantiniu, priešvėžiniu, uždegimo slopinamuoju, priešalerginiu, antibakteriniu ir kt. [56,59].
Chlorogeno rūgštis. Chlorogeno rūgštis – esteris, sudarytas iš kofeino rūgšties ir kvininės
rūgšties [60]. Pagrindiniai chlorogeno rūgšties šaltiniai yra daržovės, vaisiai ir kava [61]. Atlikti moksliniai tyrimai įrodo chlorogeno rūgšties antioksidantinį, uždegimo slopinamąjį ir analgezinį poveikius [62]. Taip pat chlorogeno rūgščiai būdingas stiprus antimikrobinis aktyvumas [63]. Su antioksidantiniu ir uždegimo slopinamuoju aktyvumu siejami chlorogeno rūgšties nervų sistemą apsaugantis [64] ir širdį apsaugantis [65] poveikiai.
Flavonoidas R1 R2 R3 R4
Rutinas OH Rutinozė H H
Kvercetinas OH OH H H
Tyrimai su gyvūnais įrodo chlorogeno rūgšties kraujospūdį mažinantį poveikį [66]. Taip pat kraujospūdį mažinantis poveikis pastebėtas ir klinikiniuose tyrimuose su žmonėmis: suvartojant 140 mg per dieną chlorogeno rūgšties reikšmingai sumažėja sistolinis ir diastolinis kraujospūdis pacientams, kuriems jis padidėjęs [67]. Taip pat žinomas selektyvus priešvėžinis chlorogeno rūgšties poveikis, kuris pasireiškia indukuojant apoptozę žmogaus vėžinėse ląstelėse (leukemija [68], plaučių vėžys [69]).
Neochlorogeno rūgštis. Neochlorogeno rūgštis – chlorogeno rūgšties izomeras [70]. Pasižymi
antioksidantiniu [71], uždegimo slopinamuoju [72], nervų sistemą apsaugančiu poveikiais [73]. Neochlorogeno rūgštis geba inhibuoti nuo estrogenų nepriklausomą krūties vėžio ląstelių liniją ir pasižymi mažu toksiškumu normalioms ląstelėms [74].
1.6.
Fenolinių junginių kokybinės ir kiekybinės analizės metodai
Atvirkštinių fazių ESC, sujungta su diodų matricos detektoriumi ir/ar masių spektrometrijos detektoriumi, yra dažniausiai naudojamas metodas kiekybinei fenolinių junginių analizei. Kartais fenoliniai junginiai (pavyzdžiui, izoflavonai) yra paverčiami į metilo esterius ir analizuojami dujų chromatografijos metodu [48]. Kiti fenolinių junginių nustatymui naudojami metodai: plonasluoksnė chromatografija, kapiliarinė elektroforezė, spektrofotometriniai metodai [75].
Efektyvioji skysčių chromatografija. Tai vienas dažniausiai pasirenkamų fenolinių junginių
išskirstymo ir kiekybinio nustatymo metodų [75]. Šis metodas suteikia galimybę vienu metu išskirstyti visus tiriamo mėginio komponentus, įskaitant jų darinius bei skilimo produktus. Junginių nustatymas gali būti atliekamas esant mažoms analičių koncentracijoms ir mėginyje esant kitų junginių. ESC privalumai: didelė kolonėlių įvairovė, kolonėlės su naujos kartos sorbentais, galimybė sujungti dvi ir daugiau kolonėlių ir naudoti perjungimo režimą [36]. Tinkamai analizei ESC metodu svarbu mėginio išvalymas, judrios fazės, kolonėlės bei detektoriaus parinkimas [75].
Kolonėlės. Fenolinių junginių analizei dažniausiai naudojamos 10–30 cm ilgio, 3,9–4,6 mm vidinio diametro ir 3–10 µm dalelių dydžio normalių arba atvirkštinių fazių C18 (ligando alifatinės grandinės ilgis yra 18 anglies atomų) kolonėlės. Analizės laikas – 10–150 min. Dažniausiai fenolinių junginių analizė atliekama kambario temperatūroje [75]. Norint sutrumpinti analizės laiką, temperatūrą galima pakelti iki 40 °C. Be to, termostatuojant kolonėlę, pasiekiamas geresnis sulaikymo laikų atkuriamumas [76]. Efektyviam sėjamųjų grikių žolėje esančių fenolinių junginių išskirstymui ir kiekybinei analizei būtina pasirinkti tinkamą kolonėlę ir jos termostatavimo temperatūrą.
Judri fazė. Kiekybiniam fenolinių junginių nustatymui ESC metodu dažniausiai naudojamos judrios fazės yra acetonitrilas ir metanolis arba jų vandeninės formos. Kartais naudojamas etanolis, tetrahidrofuranas ir 2-propanolis. Siekiant išvengti fenolinių junginių jonizacijos, rekomenduojama
judrios fazės pH palaikyti intervale 2–4, todėl vandeninės parūgštintos judrios fazės savo sudėtyje dažniausiai turi acto rūgšties. Taip pat gali būti pridedama skruzdžių rūgšties, fosfato, citrato ar amonio acetato buferių [75]. Gali būti taikoma gradientinė ir izokratinė eliucija [77]. Judrios fazės ir gradiento parinkimas yra vienas svarbiausių uždavinių parenkant ESC metodiką augalinių ekstraktų analizei.
Detektoriai. Dėl konjuguotų dvigubųjų ryšių bei aromatinių struktūrų fenoliniai junginiai absorbuoja UV arba UV/regimąją šviesą. Dėl to fenolinių junginių detekcijai ESC metodas dažniausiai jungiamas su UV/regimosios šviesos, fotodiodų matricos ir UV-fluorescenciniais detektoriais. Labiausiai paplitęs fotodiodų matricos detektorius, kadangi jis geba skenuoti visų pro detektorių praeinančių analičių UV/regimosios šviesos spektrą, suteikdamas daugiau informacijos apie junginius sudėtiniuose mišiniuose, pavyzdžiui, augaliniuose ekstraktuose [77]. Dažniausiai spektras užrašomas 200–400 nm bangos ilgių intervale ir lyginamas su standarto spektru [76]. Struktūros patvirtinimui naudojami masių spektrometrijos ir branduolių magnetinio rezonanso detektoriai [75,77].
Nustatant fenolinius junginius sėjamųjų grikių ekstraktuose naudojamos įvairios ESC metodikos. Moksliniuose tyrimuose publikuojamų ESC sistemų pavyzdžiai pateikti 1-oje lentelėje.
1 lentelė. Sėjamųjų grikių kaupiamų flavonoidų nustatymui naudojamos ESC metodikos
ESC sąlygos Metodika
[1] [78] [79] [80] [81] ESC sistema Shimadzu ESC su diodų matricos detektoriumi - - Hewlett Packard 1050 - Siurblys Shimadzu LC-10 AD - - - Shimadzu LC-10AVP Injektorius, injekcijos tūris Shimadzu SIL-10 ADVP,20 μl 20 μl - 5 μl Rheodyne 7120 Kolonėlė Phenomenex Luna C18 (2) (5 μm, 200×4,6 mm) Lichrospher 100 RP 18 C18 (5 μm, 250×4,6 mm) Dikma diamonsil (5 μm, 250×4,6 mm) Phenomenex Luna C18 (2) (3 μm, 150×2 mm) (epikatechinui, katechinui ir rutinui); Phenomenex Kinetex C18 (2,6 μm, 100×4,6 mm) (epikatechino galatui) Waters C18 (5 μm, 75×4,6 mm) Kolonėlės temperatūra 35 °C 30 °C 25 °C - - Tėkmės
greitis 0,8 ml/min 0,7 ml/min 1,0 ml/min
0,25 ml/min (Luna C18 (2) kolonėlei); 0,6 ml/min (Kinetex
C18 kolonėlei)
1 ml/min 1 lentelės tęsinys kitame puslapyje
1 lentelės tęsinys
ESC sąlygos Metodika
[1] [78] [79] [80] [81] Eliuentai Eliuentas A: 4 proc. skruzdžių rūgštis; Eliuentas B: acetonitrilas + 4 proc. skruzdžių rūgštis Eliuentas A: acetonitrilas-vanduo (1:9); Eliuentas B: acetonitrilas-vanduo (9:1) (eliuentai A ir B, parūgštinti fosforo rūgštimi iki pH 2,6) Eliuentas A: acetonitrilas; Eliuentas B: 0,1 proc. fosforo rūgštis Eliuentas A: 0,1 proc. o-fosforo rūgštis + 5 proc.
acetonitrilas; Eliuentas B: 0,1 proc. o-fosforo rūgštis + 80 proc. acetonitrilas 2 proc. acto rūgštis: acetonitrilas: metanolis (75:15:10) Detektorius Shimadzu SPD-M10AVP diodų matricos detektorius - - Agilent G1315B diodų matricos detektorius Shimadzu SPD-M10AVP diodų matricos detektorius UV spektro bangos ilgis 330 nm 365 nm 260 nm 355 nm (rutinas), kiti flavonoidai – 220 nm 355 nm Nustatyti junginiai Rutinas, kvercetinas, kvercitrinas, orientinas, homoorientinas, viteksinas, izoviteksinas Rutinas, kvercetinas, hiperozidas Kvercetinas Rutinas, epikatechinas, katechinas, epikatechino galatas Rutinas
Plonasluoksnė chromatografija. Tai ekonomiškas ir lengvai atliekamas chromatografinis
junginių analizės metodas, plačiai naudojamas nuo 1960-ųjų [76,82]. Flavonoidų nustatymui kaip stacionari fazė dažniausiai naudojamas silikagelis, ryškinama naudojant difenilboro rūgšties aminoetilesterį ir polietilenglikolį arba aliuminio (III) chloridą. Identifikavimas atliekamas naudojant UV šviesą, esant 350–365 nm arba 250–260 nm bangų ilgiams, arba densitometriniu būdu, esant tokiems pat bangų ilgiams [76]. Plonasluoksnės chromatografijos privalumai: greitas junginių atskyrimas bei galimybė analizuoti keletą mėginių vienu metu. Plonasluoksnė chromatografija gali būti naudojama ne tik preliminariam augalinių ekstraktų tyrimui prieš ESC, bet taip pat kiekybinei fenolinių junginių analizei [83,84].
Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnyje aprašomas plonasluoksnės chromatografijos metodas, kurio metu rutino sėjamųjų grikių žolėje nustatymui naudojama silikagelinė plokštelė. Ant plokštelės užnešama 20 μl (arba 5 μl) tiriamųjų mėginių ir įdedama į kamerą su judria faze – bevandene skruzdžių rūgštimi, vandeniu, etilo acetatu (1:1:8, V/V/V). Plokštelė ryškinama su 10 g/l difenilboro rūgšties aminoetilesterio tirpalu metanolyje, po to 50 g/l makrogolio 400 tirpalu metanolyje. Plokštelė džiovinama ore 30 min. Rutino identifikavimas atliekamas naudojant UV šviesą, esant 365 nm bangos ilgiui. Rutinui būdinga oranžinė-geltona fluorescencinė zona [13]. Europos farmakopėjoje aprašytas plonasluoksnės chromatografijos metodas su keletu pakeitimų pritaikytas grikių luobelių ir miltų
flavonoidų kokybinei analizei prieš atliekant ESC. Identifikuoti šie flavonoidai: rutinas, kvercetinas, hiperozidas [78].
Kapiliarinė elektroforezė. Kapiliarinė elektroforezė – analitinis metodas, kuriuo galima
greitai ir efektyviai identifikuoti krūvį turinčius mažos ar vidutinės molekulinės masės junginius [75,83]. Metodo principas – mišinio komponentai atskiriami kapiliare, panaudojant elektros srovę [85]. Lyginant su ESC, kapiliarinė elektroforezė yra mažiau jautrus metodas, kuriam būdingas mažesnis kiekybinių duomenų atkuriamumas. Taip pat kyla pavojus dėl per didelio kapiliaro apkrovimo analizuojamu mėginiu. Kapiliarinės elektroforezės metodo optimizavimas užtrunka ilgiau nei ESC – atliekamas elektrolitų tipų, pH ir koncentracijų, paviršiui aktyvių medžiagų bei organinių modifikatorių tipų ir koncentracijų, temperatūros, taikomos įtampos parinkimas [83]. Galima išskirti tokius metodo privalumus, lyginant su ESC: greitesnis bei pigesnis metodas, mėginio ir reagentų sąnaudos yra mažos [16,75]. Flavonoidų tyrimams dažniausiai pasirenkama kapiliarinė zonų elektroforezė arba micelinė elektrokinetinė chromatografija, pritaikant šias sąlygas: fosfatinis ar boratinis buferis, 50–100 μm vidinio skersmens kapiliarai, 10–30 kV įtampa, injekuojama 10–50 nl tiriamo tirpalo, identifikavimui naudojami UV, fluorescenciniai, elektrocheminiai, masių spektrometrijos detektoriai [76]. Vokietijos mokslininkai kapiliarinės elektroforezės metodą panaudojo grikių žolės cheminės sudėties įvertinimui [16].
Spektrofotometriniai metodai. Spektrofotometriniai metodai naudojami įvertinti bendrą
fenolinių junginių kiekį, bendrą flavonoidų kiekį ir bendrą antocianinų kiekį [48]. Denis ir Folin-Ciocalteu metodai yra plačiausiai naudojami spektrofotometriniai metodai bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti augalinėje žaliavoje. Abiejuose metoduose naudojami reagentai, turintys volframo ir molibdeno. Esant fenolinių junginių vyksta cheminė redukcija ir susidaro mėlynos spalvos produktai, kurie nustatomi, esant 760 nm bangos ilgiui. Šių metodų trūkumas tas, kad reagentai nėra specifiški fenoliniams junginiams, jie taip pat reaguoja su kitomis medžiagomis (askorbo rūgštimi, aromatiniais aminais) [75].
Bendri fenolinių junginių, flavonoidų, proantocianidinų (kondensuotų taninų) ir hidrolizuojamų taninų kiekiai taip pat gali būti nustatyti kolorimetriniais metodais. Metanoliniuose ar etanoliniuose augalinių fenolių ekstraktuose, sumaišytuose su aliuminio chlorido tirpalu (AlCl3), galima nustatyti bendrą flavonoidų kiekį 410–423 nm bangos ilgių intervale. Proantocianidinų kiekiui nustatyti naudojami vanilino ir dimetilaminocinamaldehido metodai [75].
Nors spektrofotometriniai metodai yra greiti ir paprasti, jiems trūksta specifiškumo individualiems junginiams. Kitų (ne fenolinių) junginių mėginyje buvimas gali lemti klaidingus rezultatus [48]. Dėl šios priežasties grikių žolės ekstraktų tyrimui šie metodai nebuvo pasirinkti.
1.7.
Laisvieji radikalai ir antioksidantai
Laisvasis radikalas – tai molekulė, kuri išorinėje orbitalėje turi vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų [86]. Laisvieji radikalai ir kitos reaktyvios deguonies formos susidaro vykstant įprastinėms metabolizmo reakcijoms arba dėl išorinių veiksnių poveikio: Rentgeno spindulių, ozono, cigarečių rūkymo, oro teršalų, pramonėje naudojamų chemikalų [87]. Laisvųjų radikalų pavyzdžiai: hidroksilo (OH•), superoksido (O2•–), azoto oksido (NO•), azoto dioksido (NO2•), peroksilo (ROO•), lipidų peroksilo (LOO•) radikalai. Nors oksidantais vadinami vandenilio peroksidas (H2O2), ozonas (O3), singletinis deguonis (1O
2), hipochloritinė rūgštis (HOCl), nitritinė rūgštis (HNO2), peroksinitritas (ONOO–), diazoto trioksidas (N2O3) ir lipidų peroksidas (LOOH) nėra laisvieji radikalai, tačiau gyvuose organizmuose lengvai gali vykti laisvųjų radikalų reakcijos [86]. Dauguma laisvųjų radikalų yra nestabilūs ir labai reaktyvūs. Jie gali atiduoti elektroną arba jį prisijungti iš kitų molekulių, todėl geba būti oksidatoriais ir reduktoriais. Laisvieji radikalai ląstelių branduoliuose ir membranose daro žalą DNR, baltymams, karbohidratams ir lipidams. Jie atakuoja svarbias makromolekules, pažeidžia ląsteles ir sutrikdo homeostazę [87].
Oksidacinis stresas – oksidacinės pažaidos būklė, kai pusiausvyra tarp laisvųjų radikalų gamybos ir antioksidantinės gynybos yra neigiama [88]. Oksidacinis stresas nulemia įvarių ligų ir būklių atsiradimą: aterosklerozės, uždegimo, vėžio, senėjimo. Manoma, kad oksidacinis stresas prisideda prie uždegiminių ligų (artrito, vaskulito, glomerulonefrito, sisteminės raudonosios vilkligės), išeminių ligų (širdies ligų, insulto, žarnyno išemijos), hemochromatozės, įgyto imunodeficito sindromo, emfizemos, skrandžio opų, hipertenzijos ir preeklampsijos, neurologinių (Alzeimerio ir Parkinsono ligų, raumenų distrofijos) ir daugelio kitų ligų atsiradimo [87].
Fenoliniai junginiai – stiprūs antioksidantai, kurie neutralizuoja laisvuosius radikalus, atiduodami elektroną arba vandenilio atomą. Antioksidantiniam aktyvumui svarbi stipriai konjuguota sistema ir tam tikras hidroksilinimo laipsnis (pavyzdžiui, flavonoliuose 3-hidroksi- grupė). Fenoliniai junginiai stabdo laisvųjų radikalų gamybą, inhibuodami gamybą arba deaktyvuodami aktyvius laisvuosius radikalus ar jų prekursorius. Dažniau jie elgiasi kaip tiesioginiai lipidų peroksidacijos grandinės reakcijų radikalų surišėjai („grandinės nutraukėjai“). „Grandinės nutraukėjai“ laisvajam radikalui atiduoda elektroną, laisvieji radikalai neutralizuojami, jie tampa stabilūs (mažiau reaktyvūs) ir dėl to sustabdomos grandinės reakcijos [89–91]. Fenoliniai junginiai taip pat gali veikti kaip metalų chelatoriai. Pereinamųjų metalų (pavyzdžiui, dvivalentės geležies (Fe2+)) chelacija gali tiesiogiai sumažinti Fenton reakcijos greitį ir tokiu būdu neleidžiama vykti oksidacijai, sukeliamai labai reaktyvių hidroksilo radikalų [90,92]. Nustatyta, kad fenoliniai junginiai gali veikti ne vieni, jie gali funkcionuoti kaip ko-antioksidantai ir yra įtraukiami į būtinųjų vitaminų regeneraciją [93].
1.8.
Antioksidantų aktyvumo nustatymas ESC pokolonėliniais metodais
ESC pokolonėliniai metodai naudojami augaliniuose ekstraktuose esančių antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių junginių tyrimams. Šie metodai klasifikuojami į tris tipus: 1) metodai, pagrįsti reakcijomis su stabiliu oksiduojančiu reagentu; 2) metodai, pagrįsti reakcija su reaktyviomis deguonies formomis; 3) metodai, pagrįsti elektrocheminiu nustatymu. Pirmojo tipo metoduose stabilaus oksiduojančio reagento reakcija su antioksidantu baigiasi išmatuojamu pokyčiu (absorbcijos sumažėjimu ar padidėjimu, esant tam tikram bangos ilgiui). Antrojo tipo metoduose naudojamas oksiduojantis agentas, kuris taip pat egzistuoja biologinėse sistemose (pavyzdžiui, superoksido radikalas ar vandenilio peroksidas). Reaktyvi deguonies forma geba oksiduoti substratą, kurio koncentracija gali būti išmatuojama (pavyzdžiui, chemiliuminescenciniu metodu). Jeigu antioksidantas neutralizuoja substrato oksidaciją, neoksiduoto substrato koncentracijos pokytis gali būti išmatuojamas. Trečio tipo metodai yra pagrįsti tiesioginiu antioksidanto elektrono perdavimu elektrodui [94].
Metodai, pagrįsti reakcijomis su stabiliu oksiduojančiu reagentu. Šie metodai paremti
elektrono perdavimo reakcija: reagentas prisijungia elektroną iš antioksidanto ir įvyksta reagento spalvos pokytis [95]. Dažniausiai naudojami 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) ir ABTS stabilūs radikalai. Antioksidantai suriša radikalus ir absorbcijos sumažėjimas yra registruojamas kaip neigiama smailė pokolonėlinėje chromatogramoje. Šie metodai yra paprastesni ir lengviau valdomi, lyginant su metodais, kai naudojamos reaktyvios deguonies formos [96]. Naudojamos aparatūros schema pateikta 4-ame paveiksle.
Pirmiausia atliekamas chromatografinis junginių atskyrimas ir nustatymas, naudojant pirmąjį detektorių. Tuomet išskirstyti junginiai patenka į reakcijos kilpą, į kurią tiekiamas reagentas. Reakcijos kilpoje vyksta reakcija tarp reagento ir antioksidanto ir antrasis detektorius išmatuoja absorbcijos sumažėjimą ar padidėjimą, esant tam tikram bangos ilgiui.
ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas. ABTS radikalas-katijonas turi kelias didžiausias
absobcijas: prie 415, 650, 728 ir 815 nm bangos ilgių [97]. Vykstant reakcijai tarp ABTS radikalo-katijono ir antioksidanto, radikalas prisijungia elektroną ir yra neutralizuojamas, ABTS
radikalų-4 pav. ESC pokolonėliniuose antioksidantų nustatymo metoduose naudojamos aparatūros schema; Det 1 – pirmasis detektorius, Det 2 – antrasis detektorius, R – reagentas, n – skaičius [96]
katijonų sumažėja ir detektorius fiksuoja absorbcijos sumažėjimą, esant tam tikram bangos ilgiui [98]. ABTS radikalai-katijonai gali būti gaunami cheminių (pavyzdžiui, kalio persulfatu, 2,2'-azobis-(2-amidinopropano) hidrochloridu (ABAP), mangano dioksidu) arba fermentinių reakcijų (pavyzdžiui, naudojant krienų peroksidazę, metmioglobiną) metu. Cheminių reakcijų trūkumai: sugeneruoti ABTS radikalą-katijoną kalio persulfatu užtrunka apie 16 valandų, atliekant mangano dioksido reakciją reikalingas filtravimas, naudojant ABAP reikia palaikyti aukštą temperatūrą (45–60 °C). Fermentinės reakcijos yra greitesnės [98]. ABTS radikalų-katijonų surišimo metodas gali būti naudojamas hidrofilinių ir lipofilinių antioksidantų nustatymui [99]. ABTS radikalų-katijonų surišimo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (TE), naudojantis sudarytomis kalibracinėmis kreivėmis [98].
Kadangi augaliniai ekstraktai yra sudėtiniai mišiniai, ne pokolonėliniuose ABTS metoduose pirmiausia reikia izoliuoti ir nustatyti antioksidantus, o šis žingsnis yra brangus ir neefektyvus. Šią problemą išsprendžia nuolat vystomas ESC-ABTS pokolonėlinis metodas, kuriuo galima greitai nustatyti radikalus surišančius junginius [95].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1.
Tyrimo objektas
Lietuvos agroklimatinėmis sąlygomis užaugintų šešių sėjamojo grikio (Fagopyrum esculentum Moench) veislių žolė, surinkta grikių žydėjimo metu 2014 metais liepos mėnesį Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Vokės filialo bandymų lauke (5 pav.). Tirtos šešios baltarusiškos kilmės grikių veislės: „Volma“, „Kvietka“, „Žaleika“, „Mara“, „Žniajarka“ ir „Belaruskij determinant-2“ („BD-2“). Grikiai buvo auginti pagal dvi skirtingas žemdirbystės sistemas: ekologinę ir intensyvią. Ekologinės žemdirbystės sistemoje auginti grikiai nebuvo tręšiami organinėmis ir mineralinėmis trąšomis, nebuvo naudota jokių papildomų augalų apsaugos priemonių. Intensyvios žemdirbystės sistemoje augynas prieš sėją tręštas mineralinėmis azoto, fosforo ir kalio trąšomis (N40P60K60). Sėjamųjų grikių augalinė žaliava išdžiovinta gerai vėdinamoje, sausoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje vietoje esant ne aukštesnei nei 50 °C temperatūrai. Visiškai išdžiūvusi žaliava buvo sufasuota į popierinius maišelius ir laikoma sausoje, tamsioje vietoje.
5 pav. Grikiai žydėjimo metu (2014-07-09)
2.2.
Naudoti reagentai ir aparatūra
Reagentai. Tyrimų metu naudoti gradientinio švarumo eliuentai: acetonitrilas (>99,9 proc.) ir
ledinė acto rūgštis (>99,8 proc.), įsigyti iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija). Išgrynintas dejonizuotas vanduo buvo paruoštas „Millipore“ (Jungtinės Amerikos Valstijos (JAV)) vandens valymo sistema. Metanolis (≥99,9 proc.) buvo gautas iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija). 96 proc. V/V etanolis buvo įsigytas iš „Vilniaus degtinė“ (Lietuva). ESC grynumo standartiniai junginiai: rutino trihidratas (≥96,37 proc.), chlorogeno rūgštis (≥95,33 proc.), kvercetinas (≥93,40 proc.), neochlorogeno rūgštis (≥95,00 proc.)ir kvercitrinas (≥99,89 proc.), buvo įsigyti iš „HWI Analytik GmbH“ (Vokietija), „ChromaDex“ (JAV), „Extrasynthese“ (Prancūzija) ir „Carl Roth GmbH + Co. KG“ (Vokietija).
Naudoti chemiškai švarūs reagentai: troloksas ((±)-6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karboksilo rūgštis) (≥98 proc.), įsigytas iš „Fluka Chemie AG“ (Šveicarija), kalio persulfatas (≥99 proc.), įsigytas iš „Carl Roth GmbH + Co. KG“ (Vokietija) ir ABTS amonio druska (≥98 proc.), kuri gauta iš „Sigma-Aldrich Chemie GmbH“ (Vokietija).
Aparatūra. Augalinė žaliava susmulkinta elektriniu smulkintuvu „BOSH MKM6003“
(„Bosch“, Vokietija), atsverta elektroninėmis svarstyklėmis „Shimadzu AUW120D“ („SHIMADZU EUROPA GmbH“, Vokietija). Žaliavos nuodžiūvis nustatytas laboratoriniu drėgmės analizatoriumi „Kern DBS 60-3“ („Kern & Sohn GmbH“, Vokietija). Vanduo tyrimams ir ekstraktų gamybai išvalytas „Millipore“ (JAV) vandens valymo sistema. Ekstrakcija vykdyta ultragarso vonelėje „Ultrasonic Cleaner Set WUC – A06H“ („Witeg Labortechnik GmbH“, Vokietija), centrifugavimas atliktas „Centurion Scientific C2006“ („Centurion Scientific Ltd“, Jungtinė Karalystė) centrifuga. Ekstraktų filtravimui naudoti membraniniai švirkštiniai 0,22 µm porų dydžio filtrai („Carl Roth GmbH + Co. KG“, Vokietija). Fenolinių junginių analizei naudotas chromatografas „Waters 2695“ su išoriniu termostatu („Waters“, JAV). Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 5 µm ACE C18 analitinę kolonėlę (150×4,6 mm) su prieškolone 5 µm ACE C18 (10×4,6 mm) („Waters“, JAV). Fenolinių junginių identifikavimui ir kiekybiniam nustatymui naudotas fotodiodų matricos detektorius „Waters 996 PDA“ („Waters“, JAV), antioksidantinio aktyvumo įvertinimui – UV-matomos šviesos tipo detektorius „Waters UV/VIS 2487“ („Waters“, JAV). ABTS radikalo-katijono tiekimui naudotas „Gilson pump 305“ siurblys („Gilson Inc“, JAV). Šviesos absorbcija matuota UV-regimojo spektro dvigubo spindulio „HALO DB-20 UV-VIS“ spektrofotometru („Dynamica GmbH“, Šveicarija). Chromatogramos užrašytos ir duomenys apdoroti „Empower 2 Chromatography Data Software“ programa („Waters“, JAV).
2.3.
Tyrimo metodai
2.3.1. Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvio nustatymas
Sėjamojo grikio žolės (lot. Fagopyri herba) nuodžiūvis nustatytas laboratoriniu drėgmės analizatoriumi, atsveriant 1,0 g susmulkintos grikių žolės ir džiovinant 120 °C temperatūroje iki pastovios masės. Atlikti trys matavimai (n=3) ir apskaičiuotas aritmetinis vidurkis.
2.3.2. Grikių žolės ekstraktų paruošimas
Fenolinių junginių ekstrakcija iš sėjamųjų grikių žolės atlikta pagal mokslinėje literatūroje nurodytą metodiką [100]. Augalinė žaliava susmulkinama elektriniu smulkintuvu iki ~0,45–0,125 mm
dydžio dalelių. Atsveriama 0,1 g (0,0001 g tikslumu) išdžiovintos susmulkintos žaliavos, užpilama 10 ml 60 proc. (V/V) etanoliu ir 15 min. laikoma ultragarso vonelėje, veikiant 40000 Hz dažniu, palaikant pastovią 45 °C temperatūrą. Gautas grikių žolės ekstraktas centrifuguojamas 10 min. 6000 apsisukimų/min. greičiu. Skaidrus viršutinis sluoksnis nupilamas nuo nuosėdų. Siekiant išekstrahuoti kuo didesnį kiekį fenolinių junginių, ekstrakcija ultragarsu, centrifugavimas bei nupylimas atliekami dar du kartus, prieš tai nuosėdas užpylus 5 ml 60 proc. etanoliu. Gautas ekstraktas filtruojamas membraniniu švirkštiniu 0,22 µm porų dydžio filtru. Kiekvienos veislės žaliavai paruošiami trys ekstraktai.
2.3.3. Standartų tirpalų paruošimas
Standartų tirpalai paruošti iš ESC grynumo standartinių junginių: rutino trihidrato (≥96,37 proc. grynumo), kvercitrino (≥99,89 proc.), kvercetino (≥93,40 proc.), chlorogeno rūgšties (≥95,33 proc.), neochlorogeno rūgšties (≥95,00 proc.) ir trolokso (≥98 proc.). Standartines medžiagas tirpinant ir skiedžiant ≥99,9 proc. metanoliu pagaminti skirtingų koncentracijų tirpalai ir nubraižytos kalibracinės kreivės.
2.3.4. Fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė
Tiriamajame darbe grikių žolės fenolinių junginių kokybinė ir kiekybinė analizė atlikta ESC metodu. ESC sąlygos pasirinktos remiantis mokslinės literatūros duomenimis [101], straipsnyje aprašytame tyrime naudotą UV-matomos šviesos tipo detektorių pakeičiant fotodiodų matricos detektoriumi, kuris vienu metu matuoja šviesos absorbciją, esant įvairiems bangos ilgiams. Tai yra labai naudinga, kai analičių didžiausios absorbcijos yra skirtingos [102]. Tyrimo metu naudota automatinė bandinio įleidimo sistema (autoinjektorius). Fenolinių junginių atskyrimui naudota 5 µm ACE C18 analitinė kolonėlė (150×4,6 mm), palaikant 25 °C temperatūrą. Injekcijos tūris – 10 µl bandinio tirpalo, judrios fazės tėkmės greitis – 1,0 ml/min. Eliuentų sistema: tirpalas A – 2 proc. acto rūgštis, tirpalas B – acetonitrilas. Eliucija atlikta, naudojant 2-oje lentelėje nurodytą tėkmės gradientą.
2 lentelė. Judrios fazės gradiento kitimas chromatografinio skirstymo metu
Laikas (min.) Tirpalas A (proc. V/V) Tirpalas B (proc. V/V)
0 100 0
0 → 30 85 15
30 → 50 50 50
50 → 55 0 100
Kokybinis fenolinių junginių tyrimas atliktas palyginant analičių ir injekuotų standartų tirpalų smailių eliucijos laikus, esant vienodoms chromatografinėms sąlygoms. Siekiant įsitikinti, kad smailė būdinga tik vienam junginiui, naudojant fotodiodų matricos detektorių, 200–600 nm bangos ilgių intervale buvo palyginti standartų ir analičių UV spinduliuotės absorbcijos spektrai. Chlorogeno ir neochlorogeno rūgštys nustatytos, esant 324 nm, kvercitrinas – 349 nm, rutinas – 354 nm, kvercetinas – 367 nm bangų ilgiams.
Kiekybinis fenolinių junginių nustatymas atliktas išorinio standarto metodu, naudojantis sudarytomis analitėms tapačių standartų kalibracinėmis kreivėmis. Fenolinių junginių kiekis apskaičiuotas remiantis formule (kiekiai perskaičiuoti visiškai sausai žaliavai):
𝑥 =𝑐 × 𝑉
𝑚 ×
100
100 − 𝑛𝑢𝑜𝑑ž𝑖ū𝑣𝑖𝑠, (mg/g) (1),
kur c – koncentracija, nustatyta iš kalibracinės kreivės (mg/ml); V – ekstrakto tūris (ml); m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g).
2.3.5. Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo nustatymas
Fenolinių junginių antioksidantinio aktyvumo įvertinimui pasirinktas ESC-ABTS pokolonėlinis metodas, atsižvelgiant į šiuos privalumus: paprastumą, trumpą analizės trukmę, naudojamą įprastą įrangą bei nebrangius reagentus. Be to, šis metodas yra jautresnis nei ESC-DPPH pokolonėlinis metodas [94]. Metodikos parametrai parinkti pagal Marksos ir kt. (2016) ESC-ABTS pokolonėliniu metodu atliktus augalinių ekstraktų antioksidantinio aktyvumo tyrimus [103].
ABTS radikalas-katijonas (ABTS∙+) gautas, naudojant cheminį reagentą – kalio persulfatą [104]. Pradinis ABTS tirpalas ruošiamas 0,05 g ABTS amonio druskos miltelių ištirpinant 50 ml išgryninto vandens. Ištirpus milteliams, pridedama 0,009 g kalio persulfato. Paruoštas tirpalas 16 valandų laikomas kambario temperatūroje tamsioje vietoje. Darbinis ABTS tirpalas ruošiamas praskiedžiant gautą ABTS radikalo-katijono tirpalą išgrynintu vandeniu tiek, kad jo absorbcija, esant 650 nm bangos ilgiui, būtų 0,9. Kaip palyginamasis tirpalas naudojamas išgrynintas vanduo.
Po fenolinių junginių detekcijos judri fazė su išskirstytais junginiais tiesiogiai sumaišoma su siurbliu tiekiamu ABTS radikalu-katijonu, kurio tėkmės greitis – 0,5 ml/min. Reakcija tarp ABTS radikalo-katijono ir atskirtos analitės vyksta reakcijos kilpoje (ilgis 3 m, vidinis skersmuo 0,25 mm, išorinis – 1,58 mm) 50 oC temperatūroje. Šios reakcijos metu sumažėja mėlynai žalios mišinio spalvos intensyvumas. UV-matomos šviesos tipo detektoriumi, esant 650 nm bangos ilgiui, registruojamas absorbcijos pokytis kaip neigiama smailė pokolonėlinėje chromatogramoje.
etaloninį antioksidantą – troloksą. ESC-ABTS pokolonėliniu metodu ištirta priklausomybė tarp trolokso koncentracijos ir jo sudaryto smailės ploto bei nubraižyta trolokso kalibracinė kreivė. Tiriamajame bandinyje esančių fenolinių junginių laisvųjų radikalų surišimo geba išreiškiama standartinio antioksidanto TE vienam gramui visiškai sausos žaliavos. TE atitinka trolokso kiekį (µmol), kuris tokiomis pačiomis tyrimo sąlygomis turi identišką antioksidantinį aktyvumą kaip ir tiriamas junginys viename grame augalinės žaliavos. Žinant TE reikšmę, galima atskirai įvertinti kiekvieno junginio indėlį į bendrą antioksidantinį aktyvumą ir nustatyti vyraujantį antioksidantą.
TE apskaičiuojamas pagal šią formulę:
𝑇𝐸 =𝑆𝑗𝑢𝑛𝑔.− 𝑏 𝑎 × 250 × 𝑉 𝑚 × 100 100 − 𝑛𝑢𝑜𝑑ž𝑖ū𝑣𝑖𝑠, (µmol/g) (2),
kur Sjung. – antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčio junginio smailės plotas pokolonėlinėje
chromatogramoje; a – nuolydis; b – nuokrypis iš trolokso kalibracinės kreivės regresijos lygties; V – ekstrakto tūris (ml); m – tiksli atsvertos žaliavos masė (g).
2.4.
Duomenų statistinis įvertinimas
Duomenų statistinis įvertinimas atliktas „MS Excel 2013“ („Microsoft“, JAV) programa ir „IBM SPSS Statistics 20“ („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenys įvertinti apskaičiuojant tyrimų duomenų aritmetinį vidurkį ir standartinį nuokrypį (SN). Koreliacinių ryšių stiprumui nustatyti taikytas Spirmeno koreliacijos koeficientas. Rezultatų statistinis patikimumas įvertintas taikant vienfaktorinę dispersinę analizę (ANOVA). Atskiroms grupėms įvertinti taikytas aposteriorinis Tukey kriterijus. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu p<0,05.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1.
Vaistinės augalinės žaliavos nuodžiūvis
Prieš atliekant sėjamųjų grikių žolės ekstraktų gamybą buvo įvertinta vaistinės augalinės žaliavos kokybė, nustatant nuodžiūvį. Laboratoriniu drėgmės analizatoriumi nustatytos sėjamųjų grikių žolės mėginių nuodžiūvio reikšmės pateiktos 6-ame paveiksle.
Ekologinės žemdirbystės sąlygomis užaugintų sėjamųjų grikių žaliavos nuodžiūvis kinta nuo 8,09±0,01 (veislė „Žaleika“) iki 8,64±0,03 proc. (veislė „Žniajarka“), o intensyvios – nuo 8,39±0,02 (veislė „Volma“) iki 9,42±0,02 proc. (veislė „Kvietka“). Tyrimui surinkta sėjamųjų grikių žaliava atitinka nuodžiūvio reikalavimus grikių žolei pagal Europos farmakopėjos 01/2008:2184 straipsnį, kuriame nurodyta, jog nuodžiūvis neturi viršyti 10 proc. [13].
3.2.
ESC ir ESC-ABTS pokolonėlinio metodų validacijos parametrų
patikrinimas
Pasirinktų ESC ir ESC-ABTS pokolonėlinio tyrimų metodų tinkamumo pagrindimui, remiantis Tarptautinės harmonizavimo konferencijos (angl. International Conference of Harmonisation, ICH) Q2 (R1) gairėmis, buvo patikrinti šie validacijos parametrai: specifiškumas, glaudumas, aptikimo ir kiekybinio nustatymo ribos bei tiesiškumas [105].
8,35 8,39 8,32 8,09 8,32 8,64 8,48 9,42 8,61 8,76 8,73 8,40 0 2 4 6 8 10
Volma Kvietka Žaleika Mara Žniajarka BD-2
Nuod žiū vis (pr oc .) Veislė
Ekologinė žemdirbystės sistema Intensyvi žemdirbystės sistema
3.2.1. Specifiškumas
Specifiškumas (angl. specificity) – tai gebėjimas vienareikšmiškai įvertinti analitės buvimą (užtikrinti jos identifikavimą) [105]. Šis validacijos parametras įrodo, kad viena chromatografinė smailė atitinka vieną junginį. Tiriamajame darbe specifiškumas įrodytas, vertinant tiriamo ekstrakto ir standartinio palyginamojo tirpalo chromatogramas: lyginant analičių ir standartų sulaikymo laikus bei UV spinduliuotės absorbcijos spektrus. 7-ame paveiksle pateiktos standartinio palyginamojo tirpalo (a), tiriamo grikių žolės ekstrakto (b) ir „tuščio“ mėginio (c) (injekuojamas atitinkamas kiekis tirpiklio, kuriame, gaminant standartų tirpalus, buvo tirpinti tiriamų junginių standartai) chromatogramos.
7-ame paveiksle pateiktos chromatogramos įrodo, kad analičių sulaikymo laikai sutampa su standartų sulaikymo laikais ir kad jų nustatymui netrukdo tirpiklis, nes pašalinių medžiagų tapatybę atspindinčių smailių nenustatyta.
3.2.2. Glaudumas
Glaudumas (angl. precision) parodo rezultatų artumą (išsibarstymo laipsnį) atliekant to paties mėginio matavimų seriją tokiomis pačiomis analizės sąlygomis [105]. Tiriamajame darbe glaudumas įvertintas dviem lygiais: pakartojamumu ir tarpiniu preciziškumu. Glaudumui įvertinti apskaičiuotas santykinis standartinis nuokrypis (SSN), kuris dar vadinamas variacijos koeficientu. SSN (standartinio nuokrypio ir vidurkio reikšmės santykis) apskaičiuotas sulaikymo laikui ir smailės plotui.
Pakartojamumas (angl. repeatability). Pakartojamumas išreiškia rezultatų tikslumą, atliekant analizę tokiomis pačiomis sąlygomis per trumpą laiko tarpą [105]. Pakartojamumas sulaikymo laikui ir smailės plotui įvertintas atlikus šešis analizės pakartojimus per vieną dieną, naudojant tiriamų fenolinių
7 pav. Standartinio palyginamojo tirpalo (a), tiriamo grikių žolės ekstrakto (b) ir „tuščio“ mėginio (c) chromatogramos, 1 – neochlorogeno rūgštis, 2 – chlorogeno rūgštis, 3 – rutinas,
4 – kvercitrinas, 5 – kvercetinas, AV – absorbcijos vienetai
c b a
1
