FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
JUDITA MORKYTĖ
BRUKNIŲ (VACCINIUM VITIS – IDAEA L.) VAISIŲ FENOLINIŲ
JUNGINIŲ SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO
TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas: Doc. Deividas Burdulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė Ramunė Morkūnienė Data:
BRUKNIŲ (VACCINIUM VITIS – IDAEA L.) VAISIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ SUDĖTIES IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. Deividas Burdulis Data:
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė Judita Morkytė
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 8 SANTRUMPOS ... 9 ĮVADAS ... 10DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11
1.LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
1.1. Bruknių (Vaccinium vitis–idaea L.) apibūdinimas ir morfologiniai požymiai... 12
1.2. Bruknių paplitimas ir kultivavimas ... 13
1.3. Vaistinių augalinių žaliavų paruošos ir laikymo sąlygos ... 14
1.4. Bruknių vaisių augalinės žaliavos cheminės sudėties tyrimai ... 14
1.5.Bruknių vaisių farmakologiniai poveikiai ... 15
1.5.1.Antioksidantinis poveikis ... 15
1.5.2.Antimikrobinis poveikis ... 16
1.5.3.Priešuždegiminis poveikis ... 17
1.5.4.Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai ... 17
1.6.Bruknių vaisiuose nustatytų svarbiausių biologiškai aktyvių junginių apžvalga ... 18
1.6.1.Fenolinių junginių charakteristika ... 18
1.6.2.Flavonoidai ... 20
2.TYRIMŲ METODIKA... 24
2.5.Tyrimo objektas ... 24
2.6.Naudoti reagentai ir medžiagos ... 25
2.7.Naudota aparatūra ir priemonės ... 26
2.8.Tyrimų metodai ... 26
2.8.1.Nuodžiūvio nustatymas bruknių vaisių žaliavoje ... 26
2.8.2.Ekstraktų ruošimo metodika ... 26
2.8.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 27
2.8.4.Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 28
2.8.5. Antocianinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 30
2.8.6.Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu ... 30
2.8.7. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu ... 31
2.9.Tyrimo duomenų analizė ... 33
3.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 35
3.5.Ekstrakcijos metodo optimizavimas ... 35
3.6.Biologiškai aktyvių junginių kiekinės sudėties įvairavimas bruknių vaisių ėminiuose, rinktuose skirtingose cenopopuliacijose ... 40
3.6.1. Fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimas bruknių vaisių mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų ... 40
3.6.2. Flavonoidų kiekinės sudėties įvairavimas bruknių vaisių mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų taikant ESC metodą... 41
3.6.3. Proantocianidinų kiekio įvairavimas bruknių vaisių mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų ... 42
3.6.4. Antocianinų kiekio įvairavimas bruknių vaisių mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų ... 43
3.7.Biologiškai aktyvių junginių sudėties kitimo dinamika bruknių vaisių nokimo metu ... 46
3.8.Bruknių vaisių mėginių antioksidantinio aktyvumo įvertinimas ... 48
3.8.1.Antioksidantinio aktyvumo priklausomybės nuo fenolinių junginių kiekio įvertinimas .... 50
4.IŠVADOS ... 53
5.PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 53
6.LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 55
SANTRAUKA
J. Morkytės magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas Doc. Deividas Burdulis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Medicinos akademijos, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra – Kaunas.
Darbo pavadinimas: Bruknių (Vaccinium vitis – idaea L.) vaisių fenolinių junginių sudėties ir antioksidantinio aktyvumo tyrimas.
Darbo tikslas - ištirti Lietuvos klimato sąlygomis augančių bruknių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą bei sudėties kitimo dinamiką vaisių nokimo metu, įvertinti ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai: parinkti optimaliausias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių (antocianinų ir proantocianidinų) sudėties nustatymui; ištirti fenolinių junginių, antocianinų ir proantocianidinų kiekinės sudėties įvairavimą bruknių vaisių ėminiuose, rinktuose skirtingose cenopopuliacijose, esančiose Lietuvos teritorijoje; ištirti fenolinių junginių, antocianinų ir proantocianidinų sudėties kitimo dinamiką bruknių vaisių ėminiuose, rinktuose vaisių nokimo metu; įvertinti Lietuvoje natūraliai augančių bruknių (V. Vitis-idaea L.) vaisių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Tyrimo objektas ir metodai: iš įvairių Lietuvos cenopopuliacijų, skirtingu nokimo metu surinkti bruknių vaisių mėginiai. Bendras fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinų kiekis bei antioksidantinis aktyvumas tirtas UV-regimosios šviesos spektrofotometriniu analizės metodu. Pritaikius ESC metodą, nustatyta kokybinė ir kiekinė flavonoidų ir antocianinų sudėtis.
Tyrimo rezultatai ir išvados: Bendras fenolinių junginių kiekis bruknių vaisių mėginiuose iš skirtingų cenopopuliacijų rinktų bandinių buvo nuo 18,23±0,79 mg/g iki 41,42±0,49 mg/g. Bendras proantocianidinų kiekis kito nuo 2,98±0,10 mg/g iki 13,49±0,34 mg/g, tuo tarpu antocianinų kiekis bruknių vaisių ėminiuose iš skirtingų Lietuvos cenopopuliacijų svyravo nuo 0,29±0,01 mg/g iki 1,79±0,04 mg/g (p<0,05). Atlikti biologiškai aktyvių junginių sudėties kitimo dinamikos tyrimai parodė, jog biologiškai aktyvių junginių kiekis didėja nokstant bruknių vaisiams. Didžiausi fenolinių junginių (40,77±0,75 mg/g), proantocianidinų (12,99±0,54 mg/g) ir antocianinų (1,25±0,06 mg/g) kiekiai aptikti V.vitis-idaea L. vaisių mėginiuose rinktuose vaisių nokimo pabaigoje. Atlikus bruknių vaisių ėminių ESC kokybinę analizę identifikuoti 3 flavonoidai: hiperozidas, avikuliarinas, kvercitrinas ir antocianinas - cianidin–3–galaktozidas, taip pat nustatyta jų kiekinė sudėtis. Vidutinė FRAP laisvųjų radikalų surišimo geba bruknių vaisių mėginiuose buvo 543,03±15,89 µmol/g (r=0.420), o vidutinis antioksidantinis aktyvumas ABTS metodu - 1929,10±71,80 µmol/g (r=0.725).
SUMMARY
J. Morkytė. Master thesis. Supervisor Assoc. Prof. Deividas Burdulis; Lithuanian University of Health Sciences, Medical academy, Faculty of Pharmacy, Department of Pharmacognosy. Kaunas.
Title: Composition and antioxidant activity research of phenolic compounds in lingonberry (Vaccinium vitis – idaea L.) fruits.
Aim: to evaluate the variation of qualitative and quantitative composition of phenolic compounds as well as the dynamics of change in their composition during the ripening period, to evaluate the antioxidant activity of extracts from samples of lingonberry fruits growing in Lithuanian climatic conditions.
Objectives: to choose the optimal extraction conditions in order to determine the composition of phenolic compounds (proanthocyanidins and anthocyanins); to examine the variation of quantitative composition of phenolic compounds, proanthocyanidins and anthocyanins in the samples of lingonberry fruits collected from different cenopopulations in Lithuania; to analyse the dynamics of change in the composition of phenolic compounds, anthocyanins and proanthocyanidins in the lingonberry fruit samples collected during ripening period; to evaluate the antioxidant activity in the samples of lingonberries that are naturally growing in Lithuania.
Object: samples of lingonberry fruits collected from different cenopopulations in Lithuania during different ripening periods.
Methods of research: the total quantity and antioxidant activity of phenolic compounds, proanthocyanidins and anthocyanins in lingonberry fruits collected from different cenopopulation in Lithuania during different ripening periods, was evaluated using the UV-VIS spectrophotometric analysis method. The qualitative and quantitative composition of flavonoids as well as anthocyanins was determined by HPLC method.
Results and conclusions: the total quantity of phenolic compounds in the samples of lingonberries collected from different cenopopulations ranged from 18,23±0,79 mg/g to 41,42±0,49 mg/g. The total quantity of proanthocyanidins varied from 2,98±0,10 mg/g to 13,49±0,34 mg/g, while the quantity of anthocyanins in lingonberry samples from different cenopopulations in Lithuania ranged from 0,29±0,01 mg/g to 1,79±0,04 mg/g. Research on the dynamics of change in the composition of biologically active compounds revealed that the quantity of biologically active compounds increases throughout the ripening of lingonberry fruits. The largest quantity of phenolic compounds (40,77±0,75 mg/g), proanthocyanidins (12,99±0,54 mg/g) andanthocyanins (1,25±0,06 mg/g) was found in the samples of V. vitis – idaea L. fruits collected at the end of the ripening period. Having carried out the HPLC qualitative analysis of lingonberry samples three flavonoids (hyperoside, avicularin, quercitrin) and one anthocyanin (cyanidin–3–O–galactoside) were identified and their
quantitative composition was determined. FRAP showed averege free radical scavenging capacity in lingonberry fruit samples as 543,03±15,89 µmol/g (r=0.420), while average antioxidant activity using ABTS method was 1929,10±71,80 µmol/g (r=0.725).
PADĖKA
Norėčiau padėkoti savo darbo vadovui Doc. Deividui Burduliui už pasitikėjimą, suteiktus patarimus ir pasiūlymus rengiant baigiamąjį darbą. Be to, esu dėkinga prof. Linai Raudonei už konsultacijas, farmakognozijos katedros dėstytojams ir darbuotojams už pagalbą atliekant eksperimentinius tyrimus.
SANTRUMPOS
ABTS - 2,2‘–azinodi[3–etilbenztiazolino]–6–sulfoninė rūgštis COX – ciklooksigenazėCRB - C reaktyvus baltymas
DMCA - 4-dimetilaminocinamaldehidas DNR - deoksiribonukleorūgštis
FRAP - trivalentės geležies jonų redukcijos jėga GAE – galo rūgšties ekvivalentai
IL-6 - interleukinas -6 (imuninės sistemos baltymas) NO - azoto oksidas
ROS - reaktyvios deguonies formos RNS - reaktyvios azoto formos
TE – troloksui ekvivalentiška antioksidantinė galia TNF–α – vėžio nekrozės faktorius α
ĮVADAS
Oksidacinis stresas – tai procesas, kurio metu susidarę laisvieji radikalai atakuoja ląsteles ir sukelia dažnai negrįžtamus pakitimus, įtakojančius lėtinių ligų vystymąsį. [1] Biologiškai aktyvūs junginiai, tokie kaip fenoliniai junginiai (flavonoidai,proantocianidinai ir kiti) aptinkami daržovėse ir vaisiuose, pasižymi antioksidantinėmis savybėms ir yra vadinami natūraliais antioksidantais. Antioksidantai yra potencialūs laisvūjų radikalų naikintojai. Jie apsaugo organizmą nuo reaktyvios deguonies dalelių perprodukcijos. [2,3] Pastarųjų metų, mokslinių tyrimų duomenimis, Vaccinium rūšių vaisių vartojimas gali pagerinti žmonių sveikatos būklę, sumažinti širdies ir kraujagyslių, vėžinių susirgimų ir neurodegeneracinių ligų riziką, dėl sudėtyje esančių biologiškai aktyvių junginių.[4]
Pasaulio sveikatos organizacija (PSO) rekomenduoja vaisius ir daržoves vartoti ne mažiau kaip penkis kartus per dieną ir vienam asmeniui per dieną jų suvartoti bent 400 gramų. Deja, daugelio Europos šalių gyventojų, daržovių ir vaisių suvartojimas nesiekia šių rekomendacijų, be to, vaisių bei daržovių suvartojimas ne tik nedidėja, bet daugelyje šalių net ir mažėja. Biologiškai aktyvūs junginiai esantys vaisiuose ir daržovėse gali padėti palaikyti tinkamą sveikatos būklę ir išvengti lėtinių ligų vystymosi, todėl vertėtų juos įtraukti į kasdieninį maisto racioną ir maisto papildų gamybą. [2,3,4]
Šio darbo tiriamasis objektas – bruknių (Vaccinium vitis-idaea L.) vaisiai surinkti skirtingu nokimo metu, iš įvairių cenopopuliacijų, esančių Lietuvos teritorijoje. Tai erikinių (Ericaceae) šeimos visžalis, daugiametis augalas, kaupiantis fenolinius junginius (flavonoidus, proantocianidinus) organines rūgštis ir vitaminus. Bruknių vaisiai pasižymi antibakteriniu poveikiu, dėl to vartojami šlapimo takų ligų gydyme. Taip pat bruknių vaisiuose esantys fenoliniai junginiai pasižymi stipriomis antioksidantinėmis savybėmis, todėl natūralių produktų turinčių didelį kiekį fenolinių junginių vartojimas gali apsaugoti organizmą nuo oksidacinio streso žalos [5]
Mokslinio darbo naujumas. Atliktas optimalių ekstrakcijos parametrų bruknių vaisių ekstrakcijai parinkimas. Pirmą kartą atlikti išsamūs bruknių vaisių, surinktų iš įvairių Lietuvos cenopopuliacijų fenolinių junginių (flavonoidų, antocianinų ir proantocianidinų) sudėties įvairavimo bei sudėties kitimo dinamikos tyrimai vaisių nokimo metu, įvertintas antioksidantinis aktyvumas.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas - ištirti Lietuvos klimato sąlygomis augančių bruknių vaisių ėminių fenolinių junginių kokybinės ir kiekinės sudėties įvairavimą bei sudėties kitimo dinamiką vaisių nokimo metu, įvertinti ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti optimaliausias ekstrakcijos sąlygas fenolinių junginių sudėties nustatymui. 2. Ištirti fenolinių junginių kiekinės sudėties įvairavimą bruknių vaisių ėminiuose,
rinktuose skirtingose cenopopuliacijose, esančiose Lietuvos teritorijoje.
3. Ištirti fenolinių junginių sudėties kitimo dinamiką bruknių vaisių nokimo metu
4. Įvertinti Lietuvoje natūraliai augančių bruknių (V. Vitis-idaea L.) vaisių ekstraktų antioksidantinį aktyvumą.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Bruknių (Vaccinium vitis–idaea L.) apibūdinimas ir morfologiniai
požymiai
Karalystė – augalų (Plantae), eilė – erikiečių (Ericales), šeima – erikinių (Ericaceae), gentis – šilauogių (Vaccinium), rūšis – bruknė (Vaccinium vitis – idaea L). [5]
Bruknė yra visžalis daugiametis 10-30 cm aukščio krūmokšnis su plonu, 2-4 mm skersmens, ilgu, iki 6 m ilgio, šakotu šakniastiebiu. Atvirose buveinėse bruknė gali būti ir žemesnė 6-8 cm, aukščiausių krūmokšnių iki 21 cm rasta drėgnose smarkiai užtemdytose buveinėse. Stiebai ir šakutės 3-7 cm ilgio, apvalūs, jauni, pūkuoti ir žali, vėliau nuplinka, sukietėja bei paruduoja. Išaugusios per vienus metus yra ilgos ir tiesios, baigiantis augimui susidaro nukarusi viršūnėlė. Šakutės išlinkusios, paprastai išauga iš susiformavusių ūglių 1-3 viršutinių pumpurų. [5,6] Lapai pražanginiai, 1,1-2,7 cm ilgio ir 0,6-1,1 cm pločio, elipsiški, buki, lygiakraščiai, stori, odiški, tamsiai žalia viršutine ir šviesiai žalia, gausiai taškuota (nusėta rudomis
liaukutėmis, išskiriančiomis raugines medžiagas) apatine puse, žemyn užsirietusiais kraštais, su trumpu 0,5-3 mm lapkočiu. Vidutinis lapo plotas 1,5 cm2. Žiedai susitelkę po 3-16 nusvirusiose kekėse
šakelių viršūnėse, kartais pavieniai, nemalonaus kvapo. Vainikėlis baltas arba baltai rausvas, varpiškas, dažniausiai su 4 bukomis skiautėmis. Bruknės gali turėti du žydėjimo laikotarpius per metus, iš kurių vienas yra nuo balandžio iki birželio, o kitas – nuo liepos pabaigos iki lapkričio. [5,7] Vaisiai užauga per 21-24 dienas, skaičiuojant nuo užuomazgų formavimosi pradžios, prinoksta ne vienu laiku, pirmosios prinoksta rugpjūčio pradžioje. Bruknės vaisius – raudona, dažniausiai apvali, blizganti, viršūnėje su taurelės liekana, sultinga, iki 8-10 mm skersmens, apie 0,3 g svorio. Vaisiai auga kekėmis dažniausiai po 5-6. Sėklos smulkios, tinkliškai duobėtos, blizgančios, rausvai rudos. Vaisių spalva nokstant kinta nuo žalios iki įvairių atspalvių raudonos. [6]
1.2. Bruknių paplitimas ir kultivavimas
Bruknių vaisiai jau buvo naudojami bronzos amžiuje. Vaisiais daugiausiai maitinosi vargingi žmonės, ypač nederlingais metais. Plačiau bruknės pradėtos tyrinėti XIX amžiaus pabaigoje – XX amžiaus pradžioje. XX amžiaus šeštajame dešimtmetyje pasirodė nemažai darbų, skirtų bruknių cheminės sudėties tyrimams. [6,8]
Bruknės aptinkamos daugiau nei 24 šalyse. [9] Labiausiai paplitusios visoje Šiaurės pusrutulio vidutinio klimato zonoje, daugiausiai rūgščiuose dirvožemiuose, taip pat tundroje, o atskirų jos paplitimo sričių randama ir labiau į pietus esančių kalnų priekalnėse ir kalnuose iki 2500-3000 m virš jūros lygio. Ji auga beveik visoje Europoje, Islandijoje, Skandinavijoje, Šiaurės Prancūzijoje, Centrinės Prancūzijos kalnuotose vietovėse, Lietuvoje, Latvijoje, taip pat Didžiojoje Britanijoje. Rusijos teritorijose bruknės auga visoje šiaurinėje dalyje. Be to bruknės paplitusios Šiaurės Amerikoje, dažniausiai aptinkamos Oregone, Vašingtone, Britų Kolumbijoje (apie 17 ha produkcijos), rečiau Viskonsine, Vermonte ir Meine. Bruknių vaisiai nokti pradeda rugpjūčio pradžioje ir noksta iki šalnų. [6,10]
Augalui reikalingas gerai nusausintas, tačiau purus dirvožemis, toks kaip smėlis, priesmėlis, durpės, be to, saulėta augimo vieta. Kultivuojant bruknes, tinkamesnis yra rūgštus dirvožemis (pH 4,3-5,5). Dideli kalcio, druskų kiekiai dirvožemyje gali būti toksiški augalui. Prieš sodinimą dirvos tręšti nepatartina, nes per didelis veikliųjų medžiagų kiekis slopina bruknių šaknijimąsi. Iš cheminių medžiagų rekomenduojama siera, kuri būtina fotosintezės procesams bei chlorofilo gamybai. Atlikti stebėjimai teigia, jog bruknės išgyvena šaltuoju ir vėjuotu metų laiku, tačiau reikalinga uždanga nuo sniego. [6,11] Gamtoje bruknės dauginasi sėklomis ar vegetatyviniu būdu iš ūglių ar šakniastiebių. Dauginimasis šakniastiebiais leidžia bruknėms išgyventi gaisrus, nes išauginti nauji ūgliai toliau auga ir plečiasi. Šakniastiebiai auga maždaug 10 cm greičiu per metus ir gali gyventi ilgiau nei dvidešimt metų. [7]
Komerciniai uogynai įvesti ir eksploatuojami daugelyje Europos šalių. Juose daugiausiai auginamos tokios veislės: Koralle, Erntesegen, Sanna, Sussi ir Masovia, kurių vaisius galima rinkti mechaniniu būdu. Lietuvoje bruknių veislių auginami tik nedideli ploteliai Botanikos institutuose. [6,12,13]
1.3. Vaistinių augalinių žaliavų paruošos ir laikymo sąlygos
Medicinoje vartojami bruknių vaisiai (Vitis-idaea fructus) ir lapai (Vitis-idaea folium). Vaisiai gali būti vartojami švieži, šaldyti ar džiovinti.
Bruknių vaisių paruošos atliekamos jiems sunokus rugpjūčio - spalio mėn., natūraliose augimvietėse. Surinktos nunokusios uogos džiovinamos krosnyje arba džiovykloje 50–60 ºC temperatūroje. Nedidelius vaisių kiekius galima džiovinti gerai vėdinamoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje patalpoje, kambario temperatūroje. [6] Vaisiai pramoniniu būdu 1 val. džiovinami 100–105 ºC temperatūroje džiovyklose. [16] Išdžiovinti vaisiai turi būti minkšti ir lankstūs. Derėtų vengti aukštesnių džiovinimo temperatūrų, nes antocianinai yra termolabilūs. Džiovinti vaisiai laikomi orui laidžiose pakuotėse, apsaugoti nuo šviesos, drėgmės, 18–25 ºC temperatūros patalpoje. Laikoma 1 metus, sausoje vietoje. Sibire bruknių vaisiai merkiami į vandenį ir išsilaiko visus metus, nes savo sudėtyje turi natūralų konservantą – benzenkarboksirūgštį (benzoinę rūgštį). [5,9,14,15]
Bruknių vaisiai turėtų būti transportuojami atsargiai, kadangi pažeidus vaisiaus vientisumą, prasideda antocianinų oksidacijos procesai ir žaliava greičiau sugenda. Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, jog bendras antocianinų kiekis gali kisti priklausomai nuo laikymo sąlygų, tačiau antioksidantiniam aktyvumui didelės įtakos neturi. Pastebėtas antocianinų kiekio sumažėjimas džiovinant vaisius aukštesnėse temperatūrose bei šaldant vaisius liofilizacijos metodu. [16,17] Bruknių ekstraktus rekomenduojama laikyti šaldytuve žemiau 4 °C. Kitus produktus – vėsioje, sausoje ir tamsioje vietoje. [18]
1.4. Bruknių vaisių augalinės žaliavos cheminės sudėties tyrimai
Moksliniuose tyrimuose teigiama, kad bruknės jau nuo senų laikų turėjo svarbų vaidmenį natūralių sveikatos priemonių gamyboje, dėl to, jog turi daug biologiškai aktyvių junginių. Didžiają dalį sudaro fenoliniai junginiai, kuriems priskiriami: flavonoidai, fenolinės rūgštys, kumarinai, stilbenai, lignanai. [19,20] Mokslininkų Kylli P., et al., 2011 metais atlikti tyrimai teigia, jog pagrindiniai fenoliniai junginiai bruknių vaisiuose yra proantocianidinai, kurie sudaro apie 71% visų junginių. [21] Proantocianidinai priklauso fenolinių junginių grupei ir pasižymi antimikrobiniu ir antioksidantiniu poveikiu. Taip pat bruknių vaisiuose nustatyta apie 15% antocianinų. [22] Antocianinai – tai augaliniai pigmentai priklausantys flavonoidams. Šie pigmentai nudažo vaisius, uogas, lapus ir žiedus įvairiausiomis spalvomis ir atspalviais: nuo rožinio iki juodai violetinio. Taip pat jie pasižymi dideliu biocheminiu ir farmakologiniu aktyvumu, o dauguma farmakologinių savybių
susijusios su antioksidantiniu poveikiu. Koks pigmentas nudažo bruknių vaisius, vienos nuomonės nėra. Vienų autorių duomenimis – tai ideinas, kitų – delfinidinas arba – cianidinas, dar kitų – visi pigmentai. [5,23]
Prinokusiuose vaisiuose aptinkama iki 84–88 % vandens, 5–8 % cukrų: gliukozės (3,6–4 %), fruktozės (4,3–4,6 %), sacharozės (0,4–0,6 %). Cukrų kiekis vaisiuose priklauso nuo gamtinių sąlygų ir prinokimo laipsnio – daugiausiai cukrų sukaupiama vaisiams visiškai sunokus. Taip pat nustatyta apie 0,20 % pektinų, rauginių medžiagų, gliukozido vakcinino, riebalų rūgščių (daugiausiai sėklose apie 30 %), arbutino apie 0,93%, iki 3 % organinių rūgščių: daugausiai citrinų ir obuolių, taip pat oksalo, vyno, chinino ir kitų. Randama ir benzoinės rūgšties iki 0,15 %, kuri naikina puvimą ir rūgimą sukeliančius mikrobus. Vaisiuose randama vitaminų: C apie 21 %, B1 ir B2 po 0,02 mg%, E – 1,0 mg%, karotino – 0,07 mg%. [3,4]
Mineralinės medžiagos randamos šviežiuose bruknių vaisiuose: fosforas, manganas, kalis, natris, kalcis, geležis, magnis, varis, sidabras, aliuminis, baris ir jodas. [4,5]
1.5. Bruknių vaisių farmakologiniai poveikiai
Bruknių vaisiai, kaip tyrimo objektas plačiai naudojami naujausiuose moksliniuose tyrimuose Šiaurės Amerikoje dėl biologiškai aktyvių fenolinių junginių. [24] Fenolinių junginių svarba žmogaus mitybai ir ligų profilaktikai patvirtinta įvairiais moksliniais tyrimais. Nustatyta, jog bruknių vaisiai pasižymi antioksidantiniu, [25,26] priešvėžiniu, [27,28] antimikrobiniu, priešgrybeliniu [29,30] ir priešuždegiminiu [21] poveikiu, taip pat bruknių vaisiai naudingi sergant medžiagų apykaitos, degeneracinėmis, širdies ir kraujagyslių ligomis, mažina išeminės širdies ligos riziką. [30] Bruknių vaisiai rekomenduojami dietiniam maitinimui ir avitaminozei mažinti. Mirkytus, virtus ir neperdirbtus bruknių vaisius patartina vartoti sergant gastritu, kai sumažėja skrandžio sulčių rūgštingumas. [4,5,30]
1.5.1. Antioksidantinis poveikis
Įvairių laisvų radikalų, pvz: reaktyvių deguonies formų (ROS), reaktyvių azoto formų (RNS) perprodukcija gali sukelti ląstelių oksidacinį stresą. Didėjant pasaulio gyventojų senėjimui ir tuo pačiu instensyvėjant gyvenimo būdui, oksidacinio streso atsiradimas ląstelėse dėl minėtų radikalų taip pat aktyvėja. Dėl šios priežasties žmonės dažniau serga širdies ir kraujagyslių ligomis, ateroskleroze,
diabetu, įvairiomis vėžio formomis, nervų (Alzheimerio ir Parkinsono ligos) ir imuninės sistemos sutrikimais. [31,32]
Fenoliai, aptinkami daugelyje daržovių ir vaisių, tarp jų ir bruknių vaisiuose yra natūralių junginių grupė pasižyminti dideliu antioksidantiniu, priešuždegiminiu, priešvėžiniu, antimikrobiniu poveikiu. Jie geba tiesiogiai surišti biologinėse sistemose aptinkamus žalingus O2•-, HO•, ROO• ir NO• ir kitos prigimties radikalus, dėl to jie vadinami antioksidantais. Antioksidantai – tai medžiagos, kurios efektyviai redukuoja prooksidantą sudarydamos netoksiškus arba mažai toksiškus junginius, užtikrina reaktyvių deguonies formų ir reaktyvių azoto formų radikalų ir neradikalų sujungimą, slopinimą arba ardymą. [31]
Atlikti moksliniai tyrimai patvirtina, jog fenoliniai junginiai esantys bruknių vaisiuose sumažina laisvųjų radikalų poveikį apie 68,89%. Dėl to, mokslininkai siūlo į racionalią gyventojų mitybą įtraukti daugiau antioksidantinį poveikį turinčių vaisių ir daržovių. [20,25,31]
1.5.2. Antimikrobinis poveikis
Mus supančioje aplinkoje yra daugybė mirkoorganizmų, bakterijų ir grybelių, kurie ne tik užteršia maistą ir aplinką, bet gali sukelti įvairias ligas ar pabloginti gyvenimo kokybę. [33]
Antimikrobiniai tyrimai atlikti su įvairiais bruknių ekstraktais parodė, jog fenoliniai junginiai pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš Staphylococcus epidermidis, Salmonella typhimurium,
Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enterica, Lactobacillus rhamnosus ir Listeria monocytogenes bakterijas. [26] Antibakterinėmis
savybėmis pasižymi įvairūs flavonoliai (kvercetinas ir jo glikozidai, kemferolis), flavonai (apigeninas, galanginas), flavononai (naringeninas), flavan-3-oliai,chalkonai ir jų glikozidai bei fenolinės rūgštys, taninai. Fenolinių junginių antimikrobinio poveikio mechanizmai yra nukleino rūgšties sintezės slopinimas, citoplazmos membranos funkcijos slopinimas ir bakterijų metabolizmo slopinimas. [34]
Mokslininkų Tian Y., et. al., teigimu, bruknių lapų ekstraktai pasižymi stipresniu antimikrobiniu poveikiu prieš Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes nei bruknių vaisių ekstraktai, dėl didesnio fenolinių junginių kiekio lapuose. Taip pat, antimikrobinių tyrimų rezultatai parodė, jog fenoliniai junginiai turi stipresnį jautrumą prieš gramteigiamų bakterijų padermes nei prieš gramneigiamų bakterijų padermes.[26]
Stebėtas fenolinių junginių antimikrobinis poveikis prieš periodontinius patogenus
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis ir Prevotella intermedia. Rezultatai
Intermedia, bet ne A. actinomycetemcomitans. Dėl to galima teigti, jog fenoliniai junginiai gali būti
naudojami tam tikrų periodonto ligų prevencijoje. [29]
1.5.3. Priešuždegiminis poveikis
Uždegimas – tai sudėtinga organizmo reakcija į žalingus veiksnius, pasireiškianti audinių ir kraujagyslių funkciniais ir struktūriniais pakitimais. Imuninės ląstelės migruoją į uždegimo vietą, atpažįsta infekciją ir su ja kovoja. [35]
Žmogaus organizme, metabolizmo metu, kaip šalutiniai produktai yra išskiriami laisvieji radikalai, kurie gali sukelti įvairius DNR, baltymų ir lipidų oksidacinius pažeidimus. Tai padidina su amžiumi susijusių sutrikimų, vėžio, aterosklerozės, neurodegeneracinių ligų ir uždegimo tikimybę. [35] Kaip alternatyva lėtinių uždegiminių ligų profilaktikai ir gydymui siūlomi fenoliniai junginiai, kurie pasižymi uždegimą slopinančiu veikimu. [36]
Klinikiniuose ir eksperimentiniuose tyrimuose pastebėta, jog bruknių bei kitų augalų vaisiai, kaupiantys fenolinius junginius, ypač proantocianidinus, pasižymi teigiamu poveikiu sveikatai. Maistinių flavonoidų vartojimas mažina širdies ir kraujagyslių ligų bei uždegiminių procesų riziką. Fenoliniai junginiai moduliuoja ciklooksigenazės (COX) veikimą, azoto oksidą (NO) gaminančio fermento veiklą. Šių fermentų slopinimas mažina uždegimo mediatorių – arachidono rūgšties sintezę ir azoto oksido kiekį.[37]
Atlikti in vivo tyrimai su žiurkėmis parodė, jog šaltai spaustos bruknių vaisių sultys slopina COX–2, CRB hiperekspresiją, dėl to bruknės pasižymi antiuždegiminiu poveikiu. Be to, ilgiau vartojant bruknių vaisių sultis pagerėja endotelio vazodilatacija, kuri priklauso nuo NO veikimo. [37]
Mokslinės literatūros šaltiniuose teigiama, jog bruknių ekstraktas slopina citokinų IL–6 ir TNF–α gamybą, esant 100 μg/ml koncentracijai, todėl fenolinius junginius kaupiančius vaisius rekomenduoja įtraukti į racionalią mitybą. [21]
1.5.4. Poveikis širdies ir kraujagyslių sistemai
Oksidacinis stresas gali sukelti įvairius širdies ir kraujagyslių sistemos pežeidimus, pavyzdžiui: ląstelių apoptozę, išemiją ar padidinti riziką susirgti miokardo infarktu. Tyrimais patvirtinta, kad bruknių vaisių antioksidantinis aktyvumas yra didesnis nei mėlynių, spanguolių, aviečių ar braškių. Bruknėse esantys antocianinai ne tik suteikia vaisiams ryškiai raudoną spalvą, bet ir pasižymi stipriu antioksidantiniu poveikiu. Mokslininkai Isaak C,K., et al., nustatė, jog bruknių
vaisiuose daugiausiai yra cianidin–3–galaktozido, katechinų, kvercetino ir kemferolio, delfinidino bei malvidino galaktozidų. [30] Dauguma flavanoidų apsaugo kraujagyslių endotelio ląsteles, mažina kraujospūdį, pagerina arterijų standumą bei didina azoto oksido išsiskyrimą. [37]
Kanadoje atliktas tyrimas su žiurkėmis parodė, jog bruknių ekstraktas sustiprino raudonujų kraujo kūnelių apsaugą nuo oksidacinio poveikio, taip pat pagerino nuo endotelio priklausomą vazodilataciją ir sumažino kraujo spaudimą arterine hipertenzija sergančiųjų žiurkių tarpe. Epidemiologiniai tyrimai įrodė, jog bruknių vaisių vartojimas sumažino mirtingumo, širdies ir kraujagyslių ligų riziką bei vėžio riziką. [30]
Amerikos medicinos žurnale aprašyti epidemiologinai tyrimai taip pat rodo, jog vaisių ir daržovių, kaupiančių fenolinius junginius, vartojimas sumažina širdies ir kraujagyslių ligų, insulto, infarkto ir koronarinės širdies ligos riziką. Taip pat atlikta daugiau nei 200 tyrimų nustatyti biologiškai aktyvių junginių poveikį vėžiui. Duomenys rodo, jog fenoliniai junginiai gali slopinti krūties, prostatos, plaučių ir storosios žarnos navikinių ląstelių dauginimąsį. [27]
1.6. Bruknių vaisiuose nustatytų svarbiausių biologiškai aktyvių junginių
apžvalga
1.6.1. Fenolinių junginių charakteristika
Fenoliniai junginiai yra augalų antriniai metabolitai turintys bioaktyvių savybių. Dažniausiai randami vaisiuose, daržovėse, žolėse, šaknyse, lapuose ir sėklose, taip pat šie bioaktyvūs junginiai atlieka svarbų fiziologinį vaidmenį daugelyje gyvybinių funkcijų, pavyzdžiui: veikia kaip gynybinė ir reprodukcinė sistema (suteikia augalams spalvą ir skonį, traukia vabzdžius). Augalų fitocheminė sudėtis priklauso nuo įvairių aplinkos veiksnių, tokių kaip auginimo būdo, veislės, kultivavimo ir laikymo sąlygų. Taip pat fenolinių junginių kiekis gali padidėti esant intensyviai UV spinduliuotei, ligų sukėlėjams ar parazitams, žaizdoms, oro taršai ir ekstremalių temperatūrų poveikiui. [38]
Mokslinių tyrimų duomenimis, fenoliniai junginiai iš įvairių šaltinių yra naudingi žmonių sveikatai dėl jų antioksidantinio poveikio. Ląstelės yra nuolatos veikiamos oksidantų iš endogeninių ir egzogeninių šaltinių, o laisvųjų radikalų gamyba yra metabolizmo dalis. Dėl laisvųjų radikalų sukelto oksidacinio streso gali būti sutrikdytos normalios organizmo funkcijos. [39]
Fenoliniai junginiai savo struktūroje turi vieną ar kelis aromatinius žiedus bei vieną ar daugiau hidroksilo pakaitų. Paprastai jie randami kaip esteriai, metilesteriai arba glikozidai, o ne kaip laisvi junginiai. Pagrindinės dvi biologiškai aktyvių junginių grupės yra paprastieji fenoliai ir
polifenoliniai junginiai. Mokslinėje literatūroje aprašoma daugiau nei 8000 fenolinių junginių struktūrų. Pagrindinės biologiškai aktyvių junginių grupės ir jų atstovai pateikti 1 paveikslėlyje.[40]
FENOLINIAI
JUNGINIAI
Paprastieji fenoliai Fenolinės rūgštys Umbeliferonas Eskuletinas Skopoletinas Kumarinai p-kumaro rūgštis Kavos rūgštis Ferulinė rūgštis Hikdroksicinamono rūgštys Galo rūgštis Gentisino rūgštis Alyvų rūgštis Hidroksibenzoinės rūgštys Polifenoliai Flavonoidai Stilbenai Resveratrolis Piceidas Pinosilvinas Lignanai Sekoizolaricirezinolis Matairezinolis, Pinorezinolis Taninai Proantocianidinai Galotaninai Elagitaninai Flavonoliai Kemferolis Kvercetinas Mircetinas Avikuliarinas Flavonai Luteolinas Apigeninas Tangeretinas Izoflavonai Daidzeinas Genisteinas Flavanonai Naringeninas Hesperetinas Flavan-3-oliai Katechinas Epikatecihinas Epigalokatechinas Galokatechinas Antocianinai Delfinidinas Cianidinas Malvidinas Chalkonai Arbutinas Floretinas Floridzinas1.6.2. Flavonoidai
Flavonoidai yra didžiausia polifenolinių junginių grupė, pasižyminti antioksidantiniu, antiuždegiminiu, neurodegeneraciniu poveikiu, slopina endotelio žalą ir gerina vazodilataciją. [41] Struktūrą sudaro 15 anglies atomų C6 – C3 – C6, kurioje A ir B yra benzolo žiedai (2 paveikslas). Flavonoidai gali būti suskirstyti į skirtingus pogrupius priklausomai nuo C žiedo modifikacijų: flavonai, flavanonai, flavonoliai, flavan-3-oliai izoflavonai, antocianinai ir chalkonai. Flavonoidai suteikia augalams skonį, spalvą ar aromatą. [40]
Flavonai. Tai viena svarbiausių flavonoidų pogrupių. Jie turi dvigubą ryšį tarp C2 ir C3 anglies atomų, ketono grupę C žiedo 4–toje padėtyje ir A grupės žiedo 5–toje padėtyje turi hidroksilo grupę. Flavonai dažniausiai aptinkami lapuose, gėlėse ir vaisiuose gliukozidų forma. Flavonų atstovai: luteolinas, apigeninas ir tangeritinas. [41,42] Ikiklinikiniai tyrimai su žiurkėmis įrodė, jog luteolinas pagerina kognityvinės disfunkcijos (dar vadinamo smegenų rūko) simptomus, kurie yra susiję su trumpalaikės ar ilgalaikės atminties sutrikimais. Taip pat mažina akių gleivinių perštėjimą ir ašorijmą. Apigeninas pasižymi antiuždegiminiu poveikiu. [40]
Flavanonai. Tai pat vadinami dihidroflavonais, dažniausiai aptinkami citrusiniuose vaisiuose. Nuo kitų flavonoidų pogrupių skiriasi tuo, kad neturi dvigubo ryšio tarp 2–os ir 3–ios padėties C žiede. Flavanonų atstovai: hesperitinas, naringeninas, pinokembrinas. Tyrimais įrodyta, jog flavanonai (pavyzdžiui pinokembrinas) pagerina pažinimo sutrikimo simptomus ir energijos apykaitą. [41,42] Greipfrutų sultys, gausios naringenino, gali slopinti CYP 3A4 metabolizuojamų vaistų klirensą. [44]
Flavonoliai. Struktūriškai flavonoliai panašūs į flavonus, nes turi dvigubą jungtį tarp 2–os ir 3–ios padėties. Flavonoliai C žiedo 3–ioje padėtyje turi hidroksilo grupę, o 4–oje ketono grupę. Labiausiai paplitę junginiai yra glikozilinti kvercetino ir kemferolio dariniai. Flavonoliai mažina cholesterolio kiekį kraujyje ir plečia kraujagysles. Kvercetinas pasižymi stipriu antioksidantiniu ir
antiuždegiminiu, neuroprotekciniu poveikiu, taip pat gali sumažinti smegenų kraujagyslių pažeidimus. [41,42]
Flavan-3-oliai. Tai flavanonų 3-hidroksi dariniai, dar vadinami katechinais. Skirtingai nuo daugelio flavonoidų, flavanoliai neturi dvigubo ryšio tarp C2 ir C3 anglies atomų. C3 padėtyje visada yra hidroksilo grupė. Šiems junginiams priskiriami katechinas, epikatechinas, epikatechino galatas, epigalokatechinas, epigalokatechino galatas ir proantocianidinai. [40,42] Katechinas ir epikatechinas yra stiprūs antioksidantai, taip pat pagerina endotelio funkciją, smegenų kraujotaką ir mažina trombocitų agregaciją bei mažo tankio lipoproteinų oksidaciją. [41]
Izoflavonai. Tai flavonoidų pogrupis, kuris dažniausiai aptinkamas sojos pupelėse ar kituose ankštiniuose augaluose. Skirtingai nuo flavonų, aromatinis B žiedas su C žiedu sujungtas 3–ioje padėtyje. Pagrindiniai atstovai: daidzeinas, genisteinas. Mokslininkų Bonetti F., et al., tyrimų duomenimis izoflavonai yra natūralūs fitoestrogenai, kurie gali palengvinti menopauzės sukeltus simptomus. [41]
Chalkonai. Dar vadinami atviros grandinės flavonoidais arba aromatiniais ketonais. Nuo įprastos flavonoidų struktūros skiriasi tuo, jog neturi C žiedo. Chalkonai pasižymi antimikrobiniu, antiuždegiminiu ir priešvėžniu poveikiu. [42,45]
Antocianinai. Tai augalinių pigmentų grupė, kuri priklauso flavonoidams. Šie pigmentai, atsakingi už augalų, gėlių ir vaisių spalvas – nuo rausvos iki tamsiai violetinės, be to, pasižymi farmakologiniu poveikiu. Dažniausiai antocianinai aptinkami gėlėse ir vaisiuose glikozidų forma, rečiau lapuose ir stiebuose. Cianidinas, delfinidinas, malvidinas, pelargonidinas ir peonidinas yra dažniausiai aptinkami ir tiriami antocianinai. Jie būna įvairių vaisių, pvz., spanguolių, juodųjų serbentų, raudonųjų vynuogių, braškių, mėlynių ar bruknių išoriniuose ląstelių sluoksniuose. Augaluose aglikonai, kitaip vadinami antocianidinais, sutinkami gana retai. Moksliniais tyrimais įrodyta, jog Vaccinium rūšys pasižymi dideliu antocianinų kiekiu. [46] Šie biologiškai aktyvūs junginiai pasižymi antiuždegiminiu, antioksidantiniu, antidiabetiniu, antivėžiniu bei medžiagų ir energijos apykaitą gerinančiu poveikiu. Be to, tyrimais įrodyta, jog antocianinai turi teigiamą poveikį kognityvinėms smegenų funkcijoms sergant Alzhaimerio ir Parkinsono ligomis. [39]
Antocianinų struktūra pavaizduota 3 paveiksle. C3 padėtyje dažniausiai būna prisijungusi cukraus molekulė, kuri lemia junginio poliškumą bei antioksidantinį poveikį. Mokslininkų Khoo E. H., et al., teigimu, papildomas aglikono prijungimas prie C žeido 3–ios padėties sumažina antocianino antioksidantinį poveikį. [47] Antocianino spalva priklauso nuo pH, taip pat nuo metilinimo arba acilinimo prie A ir B žiedų hidroksilo grupių. Pavyzdžiu, esant rūgštinėms sąlygoms antocianinas
pasireiškia raudonu pigmentu – cianidinas, o esant šarminei terpei matomas mėlynas pigmentas – delfinidinas. [40]
1.6.3 Proantocianidinai.
Dar kitaip vadinami kondensuotais taninais arba leukocianidinais. Tai oligomeriniai ir polimeriniai flavan–3–oliai, antriniai augalų metabolitai, dažniausiai aptinkami daržovėse, vaisiuose ir lapuose. Struktūriškai skiriasi hidroksilo grupių skaičiumi abiejuose aromatiniuose žieduose ir chiralinių centrų padėtimi. Priklausomai nuo ryšių tarp monomerų, proantocianidinai gali turėti B-tipo (C-C jungtis tarp C4 ir C8 arba C6) ir A-tipo (dvigubai susietas, C-C ir C2-O-C7) cheminę struktūrą. (4;5 pav.) Dažniausi dimerai yra B tipo proantocianidai: B1-B8, kuriuos sudaro katechinas arba epikatechinas. [48]
3 pav. Antocianinų struktūrinė formulė
4 pav. B-tipo proantocianidino struktūrinė
Moksliniais tyrimais įrodyta, jog proantocianidinai apsaugo organizmą nuo oksidacinio streso ir gali sumažinti laisvųjų radikalų daromą žalą. Taip pat proantocianidinai pasižymi antivėžiniu, antimikrobiniu poveikiu, mažina kraujospūdį ir pagerina riebalų apykaitą gali užkirsti kelią širdies ir kraujagyslių ligų vystymuisi sumažindami riziką, susijusią su aukštu cholesterolio kiekiu kraujyje. [49]
Mokslinių tyrimų duomenimis, bruknių (Vaccinium vitis-idaea L.) vaisiai pasižymi įvairiomis gydomosiomis savybėmis, dėl sudėtyje esančių fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinių. Šie biologiškai aktyvūs junginiai veikia kaip antioksidantai ir apsaugo organizmą nuo kenksmingo laisvųjų radikalų poveikio bei sumažina oksidacinio streso žalą. Dėl šių priežaščių tikslinga ištirti Lietuvos teritorijoje augančių bruknių vaisių biologiškai aktyvių junginių kokybinę ir kiekinę sudėtį bei įvertinti antioksidantinį aktyvumą.
2. TYRIMŲ METODIKA
2.5. Tyrimo objektas
Tyrimo objektas – bruknių (Vaccinium Vitis–idaea L.) vaisiai. Tiriami natūraliose Lietuvos augimvietėse skirtingu nokimo laikotarpiu surinkti bruknių vaisiai. Tyrimams naudota liofilizuota augalinė žaliava. Iš įvairių cenopopuliacijų surinktų bruknių vaisių duomenys pateikiami 1 lentelėje.
Eilės Nr. Augavietės pavadinimas Rinkimo data
1 Druskininkų miškas (Druskininkų miesto savivaldybės teritorija) 2017-08-02
2 Marcinkonių miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-05
3 Marcinkonių miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-12
4 Marcinkonių miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-26
5 Vežionių miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-05
6 Ūtos miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-05
7 Ūtos miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-12
8 Ūtos miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-19
9 Ūtos miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-26
10 Juodlės miškas (Kelmės rajonas) 2017-08-12
11 Juodlės miškas (Kelmės rajonas) 2017-08-21
12 Juodlės miškas (Kelmės rajonas) 2017-09-13
13 Juodlės miškas (Kelmės rajonas) 2017-09-26
14 Šilainės miškas (Druskininkų miesto savivaldybės teritorija) 2017-08-12
15 Varėnos miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-26
16 Varčios draustinis (Alytaus rajonas) 2017-08-19
17 Jurašiškės miškas (Druskininkų miesto savivaldybės teritorija) 2017-08-26
18 Šatos draustinis (Skuodo rajonas) 2017-08-26
19 Miškas Dūdiškės (Varėnos rajonas) 2017-08-26
20 Miškas Dūdiškės (Varėnos rajonas) 2017-09-02
21 Snaigupės miškas (Druskininkų miesto savivaldybės teritorija) 2017-08-26
22 Gudžių miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-26
23 Gudžių miškas (Varėnos rajonas) 2017-09-02
24 Valkininkų miškas (Varėnos rajonas) 2017-08-26
25 Valkininkų miškas (Varėnos rajonas) 2017-09-02
26 Aukštadvario draustinis (Trakų rajonas) 2017-09-02
27 Mikalčiūnų miškas (Varėnos rajonas) 2017-09-02
2.6. Naudoti reagentai ir medžiagos
Rektifikuotas etilo alkoholis, 96,3 proc. V/V („Stumbras”, Lietuva); distiliuotas vanduo; natrio karbonatas (Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe, Vokietija); Folin-Ciocalteu reagentas (,,Sigma Aldrich“, St. Louis, JAV); galo rūgšties monohidratas (,,Sigma Aldrich“, St. Louis, JAV); 6-hidroksi-2,5,7,8-tetrametilchroman-2-karbokslinės rūgšties standartas - troloksas (,,Sigma Aldrich“ St. Louis, JAV); epikatechinas („Sigma Aldrich“, Vokietija); 4-dimetilaminocinamaldehidas („Sigma Aldrich“, Vokietija); natrio karbonatas (Na2CO3) 99,5% (Merck, Vokietija); vandenilio chlorido rūgštis („Sigma Aldrich, Vokietija); ABTS (2,2-azinobis (etil-2,3-dihidrobenzotiazolin)-6-sulfoninė rūgštis) (,,Alfa Aesar“, JAV); kalio persulfatas („Alfa Aesar GmbH & Co“, Vokietija); TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazinas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija); geležies (III) chlorido heksahidratas („Sigma Aldrich“, Vokietija).
2.7. Naudota aparatūra ir priemonės
Elektrinis malūnėlis (Coffee grinder, “First”, Austrija); vakuuminė džiovinimo spinta „SPT-200 Vacuum Drier“ (Krakow, Lenkija); analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija); mechaninė purtyklė („Laboratory shaker 358S”, Lenkija); ultragarsinė vonelė („Bandelin Sonorex Digital 10 P“, Vokietija); mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV); popieriniai filtrai („ODR – 9303”, Vokietija); spektrofotometras („CamSpec – M550“, Jungtinė Karalystė); ESC Waters 2695 chomatografas (Milford, JAV).
2.8. Tyrimų metodai
2.8.1. Nuodžiūvio nustatymas bruknių vaisių žaliavoje
Nuodžiūvis vertinamas remiantis Europos farmakopėjos (Ph. Eur. 01/2005:1419) reikalavimus atitinkančiu metodu. [50] Tiriamosios žaliavos mėginys smulkinamas elektriniu malūnėliu. Atsveriama po 1 g (±0,01 g tikslumu) žaliavos. Žaliava džiovinama 100-105 °C temperatūroje iki pastovios masės ir nustatoma jos drėgmė.
Nuodžiūvis skaičiuojamas, remiantis formule:
𝑿 =(𝒎 − 𝒎𝟏)
𝒎 × 𝟏𝟎𝟎%
m – žaliavos masė prieš džiovinimą (g); m1 - žaliavos masė po džiovinimo (g).
Nuodžiūvis išreiškiamas procentais. Galutinis rezultatas – trijų svėrimų aritmetinis vidurkis. Nustatomų mėginių leidžiamieji nuokrypiai turi būti ne didesni kaip ± 5%.
2.8.2. Ekstraktų ruošimo metodika
Žaliavos paruošimas. Tyrimams surinkti bruknių vaisiai su luobele buvo užšaldyti (-35 °C) šaldytuve, kuriame įrengta oro cirkuliacija ir laikomi 24 valandas. Vėliau ruošinys perkeltas į sublimacinę džiovyklą, kurioje palaikomas 0,01 mbar slėgis esant -85 °C kondensatoriaus
temperatūrai. Po liofilizacijos vaisiai buvo laikomi sandariai uždarytuose induose, tamsioje sausoje vietoje.
Ekstraktų paruošimas. Liofilizuoti bruknių vaisiai susmulkinami elektriniu malūnėliu į miltelius. Gaminami bruknių vaisių surinktų skirtingose augimvietėse, skirtingu nokimu metu etanoliniai ekstraktai. Žaliavos ir etanolio santykis 1:10. Augalinės vaistinės žaliavos atsveriama po 2 g (±0,01 tikslumu) ir dedama į 25 ml talpos buteliukus. Užpilama 20 ml (±0,1 tikslumu) 70 proc. V/V etanoliu. Pamaišoma, kad ekstrahentas sudrėkintų ir apsemtų augalinę žaliavą. Ekstrahuojama ultragarso vonelėje 15 minučių, uždaruose rudo stiklo buteliukuose.
Gauti ekstraktai nufiltruojami per distiliuotu vandeniu sudrėkintą filtrą. Išpilstomi į švarius tamsaus stiklo buteliukus, gerai uždaromi ir laikomi kambario temperatūroje, apsaugoti nuo šviesos.
2.8.3. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu
Suminis fenolinių junginių kiekis etanoliniuose bruknių vaisių žaliavos ekstraktuose nustatytas remiantis Folin – Ciocalteu (FC) kolorimetriniu metodu.
Motininis Folin-Ciocalteu reagentas 10 kartų praskiedžiamas distiliuotu vandeniu (1 dalis reagento ir 9 dalys distiliuoto vandens) ir gaunamas darbinis FC reagentas. Paruošiamas 7,5 proc., natrio karbonato tirpalas. Atsveriama 15 g natrio karbonato, tirpinama 200 ml matavimo kolboje ir pripilama distiliuoto vandens iki žymės. Tiriamasis tirpalas paruošiamas 1 ml ekstrakto sumaišant su 5 ml darbiniu FC reagentu ir 4 ml 7,5 proc. natrio karbonato tirpalu. Gautas mišinys laikomas tamsoje, kambario temperatūroje 1 valandą. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip ir tiriamasis tirpalas, tik 1 ml skiesto bruknių vaisių ekstrakto pakeičiama į 1 ml 70 proc. V/V etanolio.
Spektrofotometru mišinio absorbcija matuojama prie 765 nm bangos ilgio. Jei tiriamųjų mėginių absorbcija didesnė nei etaloninių galo rūgšties tirpalų kalibracinio grafiko absorbcijos reikšmės, ekstraktai yra skiedžiami. Matavimai kartojami tris kartus.
Suminis fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) gramui žaliavos ir apskaičiuojamas pagal formulę:
𝑮𝑹𝑬 =𝑪 × 𝑽 × 𝒂
C- galo rūgšties koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml);
m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g) a -skiedimo faktorius
Paruošti standartiniai etaloniniai galo rūgšties tirpalai skirtingomis koncentracijomis (0,0125 mg/ml; 0,025 mg/ml; 0,05 mg/ml; 0,075 mg/ml; 0,1 mg/ml). Suminis fenolinių junginių kiekis vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono galo rūgšties kalibracinę kreivę. Galo rūgšties kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas ir tiesinė regresijos lygtis pavaizduoti 6 paveiksle.
2.8.4. Bendro proantocianidinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu
Bendras proantocianidinų kiekis nustatomas panaudojant vandenilio chlorido rūgštimi parūgštintą 4–dimetilaminocinamaldehido tirpalą (DMAC).
Paruošiamas parūgštintas etanolis: 12,5 ml koncentruotos (36 proc.) vandenilio chlorido rūgšties sumaišoma su 12,5 ml distiliuotu vandeniu ir 75 ml etanoliu (93 proc.). Tirpalas stabilus kambario temperatūroje maždaug metus. Gaminamas DMAC reagentas (0,1 proc.) ištirpinant 0,05 g DMAC miltelių su 50 ml parūgštinto etanolio. DMAC reagentas turi būti šviežiai pagamintas, nes jis yra jautrus šviesai.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas 2 ml 0,1 proc., DMAC reagento sumaišant su 20 μl tiriamuoju bruknių vaisių ekstraktu. Tirpalas laikomas 15 minučių kambario temperatūroje. Palyginamasis
y = 9,342x - 0,020 R² = 0,998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 Abs or b cij os d yd is
Galo rūgšties koncentracija mg/ml
tirpalas gaminamas tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamasis tirpalas tik 20 μl skiesto bruknių vaisių ekstrakto pakeičiama į 20 μl distiliuoto vandens. Spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija prie 640 nm bangos ilgio. Bendras proantocianidinų kiekis išreiškiamas epikatechino ekvivalentais gramui žaliavos (EE) ir apskaičiuojamas pagal formulę:
𝑬𝑬 =𝑪 × 𝑽 × 𝒂
𝒎 ; 𝒎𝒈/𝒈
C- epikatechino koncentracija (mg/ml), nustatyta iš kalibracinės kreivės; V- ekstrakto tūris (ml);
m – vaistinės augalinės žaliavos atsvertas kiekis (g) a -skiedimo faktorius
Epikatechino kalibracinei kreivei gauti buvo paruošti 5 žinomų skirtingų koncentracijų epikatechino tirpalai (0,0125 mg/ml; 0,025 mg/ml,; 0,05 mg/ml; 0,1mg/ml) 96 proc. V/V etanolyje. Standartiniai epikatechino tirpalai buvo ruošiami tokiomis pačiomis sąlygomis kaip ir tiriamieji tirpalai, tik vietoj 20 μl vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto buvo pilama 20 μl minėtų koncentracijų tirpalų. Kalibracinė epikatechino kreivė, tiesinė regresijos lygtis ir koreliacijos koeficientas pavaizduoti 7 paveiksle. y = 1,879x + 0,017 R² = 0,999 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 Abs or b cij os d yd is Epikatechino koncentracija mg/ml
2.8.5. Antocianinų kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu
Bruknių ekstraktai ruošiami remiantis Ph. Eur. 01/2008:1602. Grūstuvėje sutrinama 50 g liofilizuotų bruknių vaisių. Atsveriama apie 1 g sutrintų vaisių (tiksli masė), užpilama 20 ml 70 proc. etanoliu, parūgštintu 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi ir ekstrahuojama 15 min. purtyklėje. Gautas ekstraktas filtruojamas per popierinį filtrą į tamsaus stiklo buteliuką. Gautas ekstraktas naudojamas analizei. [50]
Antocianinų kiekis bruknių vaisiuose buvo tiriamas spektrofotometriškai. Analizei imta 1 ml paruošto ekstrakto, kuris praskiedžiamas etanoliu, parūgštintu 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi, iki 50 ml matavimo kolboje. Naudota 1 cm storio kiuvetė, optinis tankis matuotas prie 528 nm bangos ilgio, palyginamasis tirpalas – 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštis etanolyje. Rezultatai apskaičiuoti pagal Ph. Eur. 01/2008:1602, 2.2.32 formulę [50]:
𝑿 =𝑨 × 𝟏𝟎𝟎𝟎 𝟕𝟏𝟖 × 𝒎
718 – cianidin – 3 gliukozido absorbcija prie 528 nm bangos ilgio; A – absorbcija prie 528 nm bangos ilgio;
m – žaliavos masė, g.
2.8.6. Antioksidantinio aktyvumo nustatymas ABTS metodu
Bruknių vaisių antioksidantinis aktyvumas nustatomas ABTS metodu, kurio esmė 2,2‘– azinodi [3–etilbenztiazolino]–6–sulfoninės rūgšties (ABTS) laisvųjų radikalų - katijonų surišimas.
Pradinio tirpalo ruošimas. Į tamsaus stiklo buteliuką suberiama 0,0548 g atsvertų ABTS miltelių ir jie ištirpinami 50 ml distiliuoto vandens. Į gautą tirpalą pridedame 0,0095 g kalio persulfato. Paruoštas tirpalas laikomas tamsoje 16 valandų esant kambario temperatūrai.
Darbinio tirpalo paruošimas. Po 16 valandų pradinis ABTS tirpalas skiedžiamas distiliuotu vandeniu tiek, kad darbinio ABTS tirpalo absorbcija prie 734 nm bangos ilgio būtų 0,800 (±0,003). Kaip palyginamasis tirpalas yra naudojamas distiliuotas vanduo. Į mėgintuvėlį analizei imama 3 ml darbinio ABTS tirpalo ir įpilama 20 µl tiriamojo ekstrakto, gerai sumaišoma ir laikoma tamsoje 1 valandą. Nustatoma absorbcijos reikšmė prie 734 nm bangos ilgio.
𝑻𝑬(𝑨𝑩𝑻𝑺) = 𝒄 × 𝑽 × 𝒂
𝟏𝟎𝟎𝟎 × 𝒎, µ𝐦𝐨𝐥𝐓𝐄/𝐠
c – trolokso koncentracija pagal kalibracijos kreivę (µmol/l); V – paruošto ekstrakto tūris, ml;
m – atsvertas žaliavos kiekis, g; a -skiedimo faktorius;
Standartinio antioksidanto trolokso kalibracija sudaroma ruošiant penkių skirtingų koncentracijų trolokso tirpalus. Pirminio trolokso tirpalo gamyba. Atsveriama 25 mg trolokso miltelių ir juos ištirpiname 70 proc. etanolyje 25 ml kolbutėje. Iš pirminio tirpalo ruošiami 500-1600 μmol/l koncentracijų tirpalai, su kuriais atliekamas ABTS tyrimas. Tyrimo metodika lygiai tokia pati kaip ir anksčiau, tik vietoje 20 µl ekstrakto imama 20 µl tam tikros koncentracijos trolokso. Spektrofotometru išmatuojama absorbcijos dydis prie 734 nm bangos ilgio. Išmatavus absorbciją, brėžiama žinomų trolokso tirpalų koncentracijų kalibracinė kreivė (8 paveikslas).
2.8.7. Redukcinio aktyvumo nustatymas FRAP metodu
Bruknių vaisių etanolinių ekstraktų redukcinis aktyvumas nustatomas juos paveikus FRAP reagentu. y = 4E-05x + 0,023 R² = 0,998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Abs or b cij os d yd is
Trolokso koncentracija, µmol/l
Darbinis FRAP reagentas ruošiamas sumaišius acetatinį buferį, TPTZ tirpalą ir geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalą santykiu 10:1:1 (10 dalių acetatinio buferio, 1 dalis TPTZ tirpalo ir 1 dalis geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalo). Acetatinis buferis gaunamas 3,1 g natrio acetato ištirpinus 1000 ml matavimo kolboje, įpilama 16 ml ledinės acto rūgšties ir distiliuotu vandeniu skiedžiama iki žymės. 10 mM TPTZ tirpalas gaunamas 0,1695 ml koncentruotos druskos rūgšties įpylus į 50 ml distiliuoto vandens ir pridėjus 0,1562 g TPTZ miltelių. 20 nM geležies (III) chlorido heksahidrato tirpalas gaunams 0,2703 g geležies (III) chlorido heksahidrato ištirpinus 50 ml distiliuoto vandens.
Tiriamieji tirpalai ruošiami į 3 ml darbinio FRAP tirpalo įpilant 20 μl tiriamojo bruknių vaisių ekstrakto. Gauti tirpalai laikomi 1 val. tamsoje, kambario temperatūroje. Spektrofotometru išmatuojamos mišinių absorbcijos prie 593 nm bangos ilgio. Palyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat, tik vietoje tiriamojo ekstrakto įpilama 20 μl 70 proc. V/V etanolio.
Gauti duomenys palyginami su trolokso standartinių tirpalų kalibracine kreive. Tirpalų redukcinio aktyvumo galia išreiškiama standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentais (µmol TE/g) ir apskaičiuojama pagal šią formulę:
𝑻𝑬𝑭𝑹𝑨𝑷 =
𝑪 × 𝒂 × 𝑽
𝟏𝟎𝟎𝟎 × 𝒎, µ𝐦𝐨𝐥𝐓𝐄/𝐠
c – trolokso koncentracija nustatyta iš kalibracinės kreivės (µmol/l); V – ekstrakto tūris L;
m – tikslus atsvertas žaliavos kiekis g; a -skiedimo faktorius;
Pradinis trolokso tirpalas ruošiamas 25 mg trolokso ištirpinant 25 ml kolbutėje 70 proc. V/V etanolyje. Iš gauto pradinio trolokso tirpalo ruošiami 500-1600 μmol/l koncentracijos darbiniai tirpalai.
Trolokso kalibracinė kreivė sudaroma į mėgintuvėlius su 3 ml FRAP darbinio tirpalo pridėjus po 20 μl skirtingų koncentracijų trolokso darbinių tirpalų. Paruošti mišiniai laikomi 1 valandą tamsoje, kambario temperatūroje. Spektrofotometru išmatuojama absorbcija prie 593 nm bangos ilgio. Išmatavus absorbciją, brėžiama žinomų trolokso tirpalų koncentracijų kalibracinė kreivė (9 paveikslas).
2.8.8. Flavonoidų
ir antocianinų nustatymas efektyviąja skysčių
chromatografija
ESC analizė atlikta su Waters e2695 chomatografu (Milford, USA) su fotodiodų matricos detektoriumi Waters 2998 (Milford, USA). Bandiniai buvo injekuojami automatiniu injektoriumi. Chromatografinis skirstymas atliktas naudojant 3-μm ACE C18 analitinę kolonėlę (150 × 4.6 mm) kartu su 3-μm ACE C18 prieškolone 25 °C temperatūroje. Judri fazė sudaryta iš 0,05 proc. trifluoracto rūgšties tirpalo (eliuentas A) ir acetonitrilo (eliuentas B). Naudotas gradiento kitimas: 0-5 min., - 12 proc., tirpiklis B; 5-50 min., - 12-30 proc., tirpiklis B; 50-51 min., - 30-90 proc., tirpiklis B; 57 min., - 12 proc., tirpiklis B. Tirpiklio tėkmės greitis – 0,5 ml/min, injektuojamo pavyzdžio tūris - 10 μl. Chromatografinės smailės identifikuotos lyginant sulaikymo trukmes bei spektrus su standartinių junginių smailių sulaikymo trukmėmis ir spektrais.
2.9. Tyrimo duomenų analizė
Duomenų analizė atlikta naudojant kompiuterines programas „Microsoft Office Excel 2010“ (Microsoft, JAV) ir „SPSS Statistics 21“ („IBM“, JAV). Kiekvieno tyrimo etapo matavimai apskaičiuoti kaip trijų pakartojimų aritmetiniai vidurkiai ir standartiniai nuokrypiai (± SN). Taikant
9 pav. Trolokso kalibracinė kreivė (FRAP)
y = 7E-05x + 0,003 R² = 0,999 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 A bs or bcij os dyd is
vienfaktorinę dispersinę analizę ANOVA įvertinta ar skirtumai tarp lyginamųjų duomenų yra statistiškai reikšmingi (p<0,05).
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.5. Ekstrakcijos metodo optimizavimas
Siekiant išgauti didžiausią biologiškai aktyvių junginių kiekį, siekta įvertinti ekstrahento poliškumo, ekstrakcijos metodo ir ekspozicijos įtaką suminiai fenolinių junginių, proantocianidinų, antocianinų ekstrakcijos išeigai iš tiriamosios augalinės žaliavos. Tyrime naudoti ekstrahentai: vanduo, etanolis ir įvairaus poliškumo vandens ir etanolio mišiniai. Naudota etanolio koncentracija nuo 30 % iki 96 % V/V. Ekstrakcija vykdyta maceracijos purtyklėje ir maceracijos ultragarso vonelėje metodais, ekspozicijos trukmė nuo 5 min iki 60 min. Optimaliausiai antocianinų ekstrakcijos išeigai nustatyti tiriamieji ekstraktai buvo gaminami tomis pačiomis sąlygomis naudojant etanolį, parūgštintą vandenilio chlorido rūgštimi. HCl koncentracija buvo 0,1 proc., ir 1 proc. Optimaliausias ekstrakcijos metodas buvo parinktas atsižvelgiant į didžiausią fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinų kiekį, kuris nustatomas spektrofotometrijos metodais. [44]
Tinkamiausio poliškumo tirpiklio parinkimas. Ekstraktų gamybai dažniausiai naudojama šviežia, užšaldyta, džiovinta ar liofilizuota vaistinė augalinė žaliava. Naudojant sausą augalinę žaliavą, ji paprastai sumalama į miltelius. Dažniausiai naudojami tirpikliai yra etanolis, metanolis, vanduo ir įvairaus poliškumo vandens ir etanolio mišiniai. [43] Ekstrakcijoje naudoti tirpikliai: distiliuotas vanduo, 30 proc., 50 proc., 60 proc., 70 proc., 96 proc. V/V etanolio ir vandens mišiniai. Tiriamieji ekstraktai gaminti iš atsitiktinai parinktų sumaltų liofilizuotų bruknių vaisių. Gauti tiriamieji ekstraktai buvo filtruojami pro distiliuotu vandeniu sudrėkintą filtrą. Spektrofotometriškai nustatyta fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinų išeiga kiekviename mėginyje. (10 paveikslas).
Atlikus bruknių vaisių ėminių biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijos tyrimus, naudojant įvairaus poliškumo ekstrahentus, nustatyta, kad 70 proc. (v/v) etanolis užtikrina didžiausią suminę fenolinių junginių (26,63±0,05 mg/g) ir proantocianidinų (12,21±0,51 mg/g) išeigą. Statistiškai reikšmingas skirtumas (p<0,05) pastebimas tarp ekstrakcijos distiliuoju vandeniu ir 70 proc., (V/V) etanoliu. Didžiausia antocianinių (2,37±0,02 mg/g) išeiga gauta ekstrahentu taip pat naudojat 70 proc (V/V) etanolį. Gauti duomenys statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p>0,05) nuo rezultatų gautų ekstrakciją vykdant su 60 proc., (V/V) (2,13±0,04 mg/g) ir 96 proc., (V/V) (1,99±0,01 mg/g) etanoliu. Tam įtakos galėjo turėti ekstraktų gamybos sąlygos ar atsitiktinai parinktos augalinės žaliavos kokybė. Mažiausia fenolinių junginių (0,20±0,01 mg/g) ir proantocianidinų (0,02±0,001 mg/g) išeiga nustatyta kaip tirpiklį naudojant distiliuotą vandenį (p<0,05). Remiantis gautais tyrimo rezultatais, tolimesniems tyrimams buvo pasirinktas 70 proc. etanolis.
Ekstrakcijos metodo ir ekspozicijos trukmės parinkimas. Ekstrakcijos trukmė kaip ir tinkamai pasirinktas ekstrahentas turi įtakos biologiškai aktyvių junginių išeigai nustatyti. Moksliniuose tyrimuose dažniausiai taikomi maceracijos ir maceracijos ultragarso vonelėje metodai. Tai paprasti, efektyvūs, greiti ir nereikalaujantys sudėtingos įrangos metodai. [44] Dėl šių priežasčių buvo vertinamas ekstrakcijos efektyvumas naudojant abu metodus.
Maceracija. Gaminamai ekstraktai maceracijai mechaninėje purtyklėje pagal anksčiau
aprašytą metodiką. Pasirinktos ekspozicijos trukmės: 5 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min., kambario temperatūroje. Po maceracijos ekstraktai buvo filtruojami pro distiliuotu vandeniu sudrėkintą
A A A 0 5 10 15 20 25 30 Vand. 30% 50% 60% 70% 96% F en ol in ių j u n gin ių k iek is , m g/g Ekstrahentai
Proantocianidinai Fenoliniai junginiai Antocianinai
B B B C D B B B C D A A B B
10 pav. Suminė fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinų ekstrakcijos išeiga naudojant skirtingo poliškumo ekstrahentus; skirtingos raidės A,B,C,D žymi statistiškai reikšmingus
filtrą. Spektrofotometriškai nustatyta suminė fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinų išeiga kiekviename mėginyje. Gauti rezultatai pateikti 11 paveiksle.
Tyrimų duomenys parodė, jog ekstrahuojant maceracijos metodu, biologiškai aktyvių junginių kiekis didėja ilgėjant bruknių vaisių ekstrahavimo laikui. Didžiausia suminė suminė fenolinių junginių (25,81±0,73 mg/g) ir proantocianidinų (11,72±0,28 mg/g), išeiga gauta ekspozicijos trukmei esant 45 min. Ekstrakcija, kuri ilgesnė už 45 min., buvo jau nebe tokia efektyvi, nes nustatytas biologiškai aktyvių junginių kiekis mažėjo (p<0,05). Didžiausia antocianinų (2,13±0,04 mg/g) išeiga gauta ekstrahuojant 45 min, gauti rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 15 min, 30 min., ir 60 min., ekspozicijos trukmės. Gautus rezultatus įtakoti galėjo atsitikinai parinktos augalinės žaliavos kokybė ir kiekis bei ekstrakcijos sąlygos. Mažiausia fenolinių junginių (17,38±0,43 mg/g), proantocianidinų (0,37±0,03 mg/g) ir antocianinų (1,43±0,06 mg/g) išeiga gauta ekspozicijos trukmei esant 5 min (p<0,05). Atsižvelgiant į gautus rezultatus, 45 min., buvo pasirinktos kaip optimalus ekspozicijos laikas tolimesniuose tyrimuose.
Ekstrakcija ultragarsu. Tai efektyvesnis ekstrakcijos metodas, kurio metu ultragarso bangos
lemia didesnį tirpiklio įsiskverbimą į tiriamojo mėginio matricą, taip padidina paviršiaus plotą tarp skystos ir kietos fazės, dėl to tirpiklis greitai pasiskirsto tiriamajame mėginyje. [51] Ekstrakcijai ultragarso vonelėje tiriamieji ekstraktai buvo gaminami tomis pačiomis sąlygomis kaip ir maceracijai
A A A -5 0 5 10 15 20 25 30
5 min 15 min 30 min 45 min 60 min
B iol og išk a i a k tyvi ų ju n gi n ių k ie k is m g/ g
Ekspozicijos trukmė, min.
Proantocianidinai Fenoliniai junginiai Antocianinai
B B/C B C B B B A A B C
11 pav. Ekstrakcijos trukmė, atsižvelgiant į suminę fenolinių junginių, antocianinų ir proantocianidinų išeigą; skirtingos raidės A,B,C žymi statistiškai reikšmingus biologiškai
aktyvių junginių išeigos skirtumus (p<0,05)
machaninėje purtyklėje. Pasirinktos ekspozicijos trukmės ultragarso vonelėje: 5 min, 10 min., 15 min, 20 min., 25 min, 30 min, 60 min. Ekstrakcijos metodo ir ekspozicijos trukmės efektyvumo duomenys pateikti 12 paveiksle.
Atlikto tyrimo rezultatai parodė, jog suminis fenolinių junginių, proantocianidinų ir antocianinų kiekis, kaip ir maceracijos metodu, didėja ilgėjant ekstrakcijos trukmei. Ekstrahuojant bruknių vaisių ėminius 70 proc., (V/V) etanoliu, ultrgarso vonelėje, didžiausia suminė fenolinių junginių (28,81±0,98 mg/g), proantocianidinų (13,55±0,57 mg/g), antocianinų (2,21±0,17 mg/g) išeiga gauta ekspozicijos trukmei esant 15 min., (p<0,05). Ekstrakcija, kurios ekspozicijos trukmė ilgesnė už 15 min., buvo nebe tokia efektyvi, nes biologiškai aktyvių junginių kiekis mažėjo (p<0,05). Mažiausia fenolinių junginių išeiga (16,46±0,39 mg/g) nustatyta ekspozicijos trukmei esant 60 min. Mažiausia proantocianidinų (4,01±0,16 mg/g) ir antocianinų (1,10±0,23 mg/g ) išeiga gauta ekspozicijos trukmei taip pat esant 60 min, tačiau gauti rezultatai statistiškai reikšmingai nesiskyrė nuo 5 min., ekspozicijos trukmės (p>0,05). Gauti rezultatai galėjo skirtis dėl skirtingų tyrimo metodikų ar žaliavos kokybės ir kiekio. Atsižvelgiant į didžiausias biologiškai aktyvių junginių išeigas buvo pasirinktas būtent šis ekstrakcijos metodas ir ekspozicijos trukmė.
Ekstrahento pH įtaka antocianinų ekstrakcijos išeigai. Antocianinai neutralioje ar šarminėje terpėje yra nestabilūs, todėl siekiant pagerinti jų stabilumą pridedami nedideli vandenilio chlorido rūgšties kiekiai. Paprastai naudojama 1 proc., HCl ir 0,1 proc., HCl tirpiklyje. [41] Tiriamieji
A A A 0 5 10 15 20 25 30 35
5 min 10 min 15 min 20 min 25 min 30min 60min
B iol ogi šk ai a kt yvi ų ju ngin ių k ie ki s, m g/g
Ekspozicijos trukmė, min.
Proantocianidinai Fenoliniai junginiai Antocianinai
B B B B B/C C B B C C B A/B B B B C C
12 pav. Ekstrakcijos trukmė, atsižvelgiant į suminę fenolinių junginių, atocianinų ir proantocianidinų išeigą; skirtingos raidės A,B,C žymi statistiškai reikšmingus biologiškai
aktyvių junginių išeigos skirtumus (p<0,05) A/B
ekstraktai buvo gaminami tomis pačiomis sąlygomis naudojant etanolį, parūgštintą vandenilio chlorido rūgštimi. Ekstrahuojami 15 min., ultragarso vonelėje, kambario temperatūroje. Ekstraktai buvo filtruojami pro distiliuotu vandeniu sudrėkintą filtrą. Spektrofotometriškai nustatyta antocianinų išeiga kiekviename mėginyje ir gauti rezultatai pateikti 13 paveiksle.
Remiantis tyrimo duomenimis, ekstrahuojant bruknių vaisių pavyzdžius, didžiausia antocianinų (4,68±0,24 mg/g) ektrakcijos išeiga gauta naudojant 0,1 proc., HCl. Naudojant 1 proc., HCl gauta šiek tiek mažesnė (4,06±0,13 mg/g) antocianinų išeiga, todėl 0,1 proc., vandenilio chlorido rūgšties koncentracija buvo pasirinkta tolimesniems bruknių vaisių tyrimams atlikti.
Atliktais tyrimais nustatyta, jog didžiausi fenolinių junginių, proanatocianidinų kiekiai buvo gauti vykdant ekstrakciją ultragarso vonelėje, 15 min, ekstrahentu naudojant 70 % (V/V) etanolį (p<0,05). Didžiausia antocianinų išeiga gauta ekstrakciją vykdant ultragarso vonelėje, 15 min, ekstrahentu naudojant 70% (V/V) etanolį, parūgštintą 0,1% vandenilio chlorido rūgštimi. Įvertinus įvairių faktorių įtaką ekstrakcijos išeigai, tolimesniuose bruknių vaisių ėminių tyrimuose buvo naudoti atrinkti optimalūs metodai ir optimalaus poliškumo tirpikliai.
1 2 0 1 2 3 4 5 6 Antocianinų kiekis mg/g 0.1 % HCl 4.68 mg/g 1 % HCl 4.06 mg/g
