FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
KARINA PETROSIAN
GELTONŽIEDŽIŲ BARKŪNŲ (Melilotus officinalis L.) AUGALINIŲ
ŽALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Raimondas Benetis
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė
prof. dr. Ramunė Morkūnienė, parašas,
Data
GELTONŽIEDŽIŲ BARKŪNŲ (Melilotus officinalis L.) AUGALINIŲ
ŽALIAVŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR ANTIOKSIDACINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovas Darbą atliko
doc. dr. Raimondas Benetis, parašas Magistrantė
Data Karina Petrosian, parašas
Data
Recenzentas
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 8
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Geltonžiedžiai barkūnai (Melilotus officinalis L.) ... 11
1.1.1 M.officinalis bendroji charakteristika ... 11
1.1.2 M.officinalis fitocheminė sudėtis ... 12
1.1.3 M.officinalis panaudojimas ... 13
1.2. Oksidacinis stresas ir jo žala ... 14
1.3 Laisvųjų radikalų klasifikacija... 15
1.3.1 Laisvųjų radikalų susidarymo mechanizmas ... 16
1.4 Antioksidantai ir jų poveikis... 17
1.4.1 Antioksidantų klasifikacija ir veikimo lygmenys ... 18
1.5 Fenoliniai junginiai ... 19
1.5.1 Fenolinių junginių klasifikacija ... 20
1.5.2 Fenolinių junginių antiradikalinės ir chelatinės savybės ... 21
1.5.3 Fenolinių junginių ekstrakcija, jų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 25
2.1. Tyrimų objektas ... 25
2.2. Medžiagos ir reagentai ... 25
2.3. Naudota aparatūra ... 26
2.4. Tyrimų metodai ... 26
2.5. M.officinalis žaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė ... 27
2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas ... 27
2.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas ... 28
2.5.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas ... 29
2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe2+ jonų sujungimo metodu . 30 2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų sujungimo metodu ... 30
2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS˙+ radikalų surišimo metodu ... 31
2.6. Duomenų analizė ... 32
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33
3.1. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas ... 33
3.1.1. Ekstrahento poliškumo įvertinimas ... 33
3.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės nustatymas ... 34
3.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros nustatymas ... 35
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas M. officinalis žaliavose ... 36
3.3. Bendro fenolio rūgščių kiekio nustatymas M. officinalis žaliavose ... 38
3.4. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas M. officinalis žaliavose ... 39
3.5. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas Fe2+ jonų surišimo (FIC) metodu M. officinalis žaliavose ... 41
3.6. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas DPPH radikalų surišimo metodu M. officinalis žaliavose ... 42
3.7. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas ABTS surišimo metodu M. officinalis žaliavose ... 44
3.8. Koreliacinių ryšių įvertinimas tarp bendro flavonoidų ir fenolinių junginių kiekio bei antioksidacinio aktyvumo M. officinalis žaliavose ... 46
4. IŠVADOS ... 48
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 49
Karinos Petrosian magistro baigiamasis darbas/mokslinis, vadovas doc. dr. Raimondas Benetis, Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra . Kaunas, 2018.
Geltonžiedžių barkūnų (Melilotus officinalis L.) augalinių žaliavų fenolinių junginių ir antioksidacinio aktyvumo įvertinimas.
Tikslas: Ištirti iš skirtingų Lietuvos regionų surinktų geltonžiedžių barkūnų (Melilotus officinalis L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį ir įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Uždaviniai: 1) Parinkti tinkamiausias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš geltonžiedžių barkūnų augalinių žaliavų. 2) Spektrofotometriniu metodu įvertinti bendrąjį fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose M. officinalis žaliavose bei nustatyti jų įvairavimą skirtingose augalo morfologinėse dalyse . 3) Įvertinti geltonžiedžių barkūnų (Melilotus officinalis L.) augalinių žaliavų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą modelinėse DPPH, ABTS ir FIC sistemose. 4) Nustatyti koreliacinius ryšius tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių geltonžiedžių barkūnų žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti naudotos M. officinalis augalinės žaliavos. Ekstraktų ruošimo metodas – ekstrakcija ultragarsu, ekstrahentas – 70% (V/V) etanolis, ekstrakcijos laikas – 10 min, temperatūra – 50oC. Bendram fenolinių junginių kiekio nustatymui buvo taikomas
Folin-Ciocalteu metodas, rezultatai išreikšti galo rūgšties ekvivalentais (GE) (mg/g). Bendram flavonoidų kiekiui ištirti buvo taikoma reakcija su AlCl3 ir metenaminu. Rezultatai išreikšti
rutino ekvivalentais (RE) (mg/g). Suminiam fenolio rūgščių kiekiui nustatyti naudotas Arnow reagentas. Bendras fenolio rūgščių kiekis išreikštas chlorogeno rūgštimi (mg/g). Ekstraktų antioksidacinis aktyvumas buvo vertinamas DPPH, ABTS ir FIC spektrofotometriniais metodais. Rezultatai ir išvados: Nustatyta, jog didesni fenolinių junginių ir flavonoidų kiekiai randami M. officinalis žiedų žaliavose, tuo tarpu fenolio rūgščių lapų žaliavose yra mažiau. Didžiausi šių BAM kiekiai nustatyti M. officinalis žaliavose surinktose iš Karklės, Salininkų ir Ukmergės gamtinių cenopopuliacijų. Antiradikalinių savybių tyrimai atskleidė, kad geltonžiedžių barkūnų lapų ekstraktai pasižymėjo didžiausiu aktyvumu abiejose in vitro sistemose (DPPH ir ABTS). Tuo tarpu didžiausi chelatinių savybių rodmenys yra charakteringi M. officinalis žiedų ekstraktams. Gautų rezultatų statistinė analizė atskleidė stip rius ir statistiškai reikšmingus (p<0,05) koreliacinius ryšius tarp bendrų fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių M. officinalis žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio poveikio rodiklių.
The Master‘s thesis of Karina Petrosian, scientific adviser doc. dr. Raimondas Benetis, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Chemistry. Kaunas, 2018.
The evaluation of phenolic compounds and antioxidant activity in the raw materials of yellow sweet clover (Melilotus officinalis L.).
The aim: to investigate the quantitative composition of phenolic compounds, flavonoids and the antioxidant activity of yellow sweet clover (Melilotus officinalis L.) collected from the different Lithuanian cenopopulations.
Objectives: 1) To pick out optimal extraction conditions for the extraction of the phenolic compounds from M.officinalis raw materials. 2) Using spectrophotometric method to execute quantitative analysis of the phenolic compounds, phenolic acids and flavonoids of M.officinalis raw materials, collected from different cenopopulations. 3) To evaluate the ability of M.officinalis prepared ethanolic extracts from raw materials to scavenge free radicals by applying DPPH, ABTS and FIC modelling systems. 4) To evaluate the correlation among phenolic compounds, phenolic acids, flavonoids and the antioxidant activity of ethanolic extracts prepared from M.officinalis raw materials.
Research methodology: The raw materials of yellow sweet clovers were collected from 13 different Lithuanian natural cenopopulations and were used during this investigation. Extration method – ultrasound agitation, extrahent – 70% (V/V) ethanol, extraction time – 10 min, extraction temperature – 50 oC. The Folin-Ciocalteu method was used to determine the total amount of phenolic compounds and the results were expressed as gallic acid equivalent (GE) (mg/g). The reaction with aluminium chloride (AlCl3) was used to evaluate the total quantity of flavonoids; the results were
expressed as rutin equivalent (RE) (mg/g). Arnow reagent was employed to estimate the total quantity of phenolic acids in the ethanolic extracts; the results were expressed as chlorogenic acid (mg/g). The spectrophotometric methods DPPH, ABTS and FIC were used to evaluate antioxidant activity of the prepared samples.
Results and conclusions: The largest amounts of phenolic compounds and flavonoids were found in M. officinalis flowers, whereas the leaves had more phenolic acids. M. officinalis collected from Karklė, Salininkai and Ukmergė natural cenopopulations had the biggest amounts of biologically active compounds. The highest antiradical activity was estimated in leaves extracts by both in vitro model systems (DPPH and ABTS). Meanwhile the strongest chelating activity was estimated in flowers. The statistical analysis exposed strong and statisticaly significant (p<0,05) correlation among total phenolic compounds, flavonoids and phenolic acids in M. officinalis raw materials and antioxidant activity of their extracts.
SANTRUMPOS
ATP – adenozino trifosfatasBHT – dibutilhidroksitoluenas CAT – katalazė (angl.catalase) DNR – deoksiribonukleorūgštis DPPH – 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil EPG – elektronų pernašos grandinė GE – galo rūgšties ekvivalentai GPx – gliutationo peroksidazė GRx – gliutationo reduktazė
NADH - nikotinamido adenino dinukleotidas NO – azoto monoksidas
RE – rutino ekvivalentai RF – reaktyviosios formos
ROS/RNS – reaktyviosios deguonies/azoto formos (angl. Reactive oxygen/nitrogen species) SOD – superoksido dismutazė
TE – trolokso ekvivalentai V/V - tūrio procentai
XD – ksantino dehidrogenazė (angl. xanthine dehydrogenase) XO – ksantino oksidazė (angl. xanthine oxidase)
ĮVADAS
Oksidacinio streso būklė atsiranda, kai biologinėse sistemose sutrinka biocheminė pusiausvyra. Šio proceso metu susidaro laisvieji radikalai, kurie sukelia negrįžtamus ląstelės pakitimus, dėl ko gali būti slopinamas apoptozės procesas, mažėja ląstelinė ATP energija ar nekrozuoja audiniai. Ląstelėje susidarantys laisvieji radikalai, turintys deguonies ar azoto, vadinami deguonies ar azoto reaktyviosios formos [21,45,64].
Laisvieji radikalai sukelia oksidacinę pažaidą ko pasėkoje neigiamai įtakojami įvairūs biocheminiai procesai. Dėl to jau kurį laiką manoma, jog būtent oksidacinis stresas atsakingas už tam tikrų ligų atsiradimą. Svarbiausi iš jų yra neurodegeneraciniai organizmo sutrikimai, tokie kaip Alzheimerio, Parkinsono ligos, kurių metu neuronai nustoja normaliai funkcionuoti ir laikui bėgant apmiršta. Manoma, jog širdies ir kraujagyslių sistemos disfunkcija taip pat gali atsirasti dėl oksidacinės pažaidos, kurią sukelia azoto monoksido oksidacijos produktai. Tokiu būdu aktyvuojami prouždegiminiai ir proaterosklerotiniai keliai [26,27,46].
Siekiant išvengti oksidacinės organizmo pažaidos vartojamos antioksidacinės medžiagos, kurios neutralizuoja toksinius radikalus ir slopina oksidacinius procesus [29]. Dėl šios priežasties intensyviai atliekami fitocheminiai tyrimai, kurie padėtų atrasti natūralių, augalinės kilmės antioksidantų. Moksliniuose tyrimuose vertinant fitocheminę sudėtį vis labiau koncentruojamasi į fenolinius junginius, nes jie pasižymi daugiaveiksmiu antioksidaciniu poveikiu (pvz., geba surišti laisvuosius radikalus ir chelatuoti pereinamųjų metalų jonų). Tokiu būdu siekiama atrasti galimai saugesnių antioksidantų, kuriuos galima būtų pritaikyti medicinoje, farmacijoje bei maisto pramonėje [1,17,44,54].
Geltonžiedžiai barkūnai (Melilotus officinalis L.) priklauso pupinių augalų šeimai (Fabaceae). Jų žaliavos kaupia kumarinus, hidroksicinamono rūgšties darinius, triterpeninius saponinus, flavonoidus, fenolinius ir lakiuosius junginius [10,37,80]. Geltonžiedžių barkūnų žolė (Ph. Eur. 07/2012:2120) [25] dėka turimų kumarinų pasižymi antikoaguliaciniu, priešuždegiminiu poveikiu [71] veikia kaip vitamino K antagonistas [38]. Tradicinėje medicinoje augalo žaliavos vartojamos skausmo malšinimui, veikia raminančiai esant nemigai, bei naudojamos augalo paruošų vonelės esant podagrai ir sąnarių reumatiniams patinimams [79].
Siekiant ištirti augalo žaliavų antioksidacines savybes ir įvertinti jų įtaką oksidaciniam stresui, didesnis dėmesys skiriamas daugiafunkciniams fenoliniams dariniams ir flavonoidams. Atlikti moksliniai tyrimai rodo, kad šio augalo žaliavų etanoliniai ekstraktai pasižymi 4 kartus didesniu gebėjimu surišti laisvuosius radikalus negu sintetinis antioksidantas BHT [57].
Darbo aktualumas. Siekiant detaliau įvertinti M. officinalis panaudojimo perspektyvas, bei praplėsti jo indikacijas, tikslinga kompleksiškai įvertinti žaliavų kokybines charakteristikas ir antioksidacinį potencialą.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti iš skirtingų Lietuvos regionų surinktų geltonžiedžių barkūnų (Melilotus officinalis L.) augalinių žaliavų bendrąjį fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį ir įvertinti jų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausias fenolinių junginių ekstrahavimo sąlygas iš geltonžiedžių barkūnų augalinių žaliavų.
2. Spektrofotometriniu metodu įvertinti bendrąjį fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį gamtinėse cenopopuliacijose surinktose M. officinalis žaliavose bei nustatyti jų
įvairavimą skirtingose augalo morfologinėse dalyse.
3. Įvertinti geltonžiedžių barkūnų (Melilotus officinalis L.) augalinių žaliavų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą modelinėse DPPH, ABTS ir FIC sistemose.
4. Nustatyti koreliacinius ryšius tarp bendro fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekių geltonžiedžių barkūnų žaliavose bei jų ekstraktų antioksidacinio aktyvumo.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Geltonžiedžiai barkūnai (Melilotus officinalis L.)
1.1.1 M.officinalis bendroji charakteristika
Geltonžiedžiai barkūnai (Melilotus officinalis L.) yra dvimečiai, rečiau vienmečiai vaistiniai augalai (07/2012:2120) [25], kurie priklauso pupinių šeimai (Fabaceae) [77].
Barkūnų (Melilotus) genčiai priskiriama apie 20 augalo rūšių. Iš jų Lietuvoje augančios ir plačiai aptinkamos yra geltonžiedžiai barkūnai (Melilotus officinalis L.), baltažiedžiai barkūnai (Melilotus albus L.) ir stambiašakniai barkūnai (Melilotus altissimus L.) [77]. Atskirti šias tris rūšis Lietuvos gamtoje nėra sunku, o tai galima padaryti net pagal skirtingas šių augalų augavietes. M. altissimus auga vietose, tokiose kaip pievos su aukšta žole, ganyklose, kur yra didesnė tikimybė susikaupti drėgmei, nes šis augalas nemėgsta sausų vietovių. Dėl šios priežasties stambiašaknius barkūnus nesunku atskirti nuo geltonžiedžių barkūnų, kurie auga pakelėse, arčiau kelio, prie žvyrkelio, sausose vietose, taip pat dažniau galima juos sutikti prie geležinkelio, rečiau sutinkami laukuose [78].
M. officinalis yra apie 30-140 cm aukščio žolinis augalas. Jo stiebas (vienas ar keli) status, šakotas, prie pamato rausvas [39]. Žiedai yra geltoni, kurie susitelkę kekėmis lapų pažastyse. Prielapiai yliški, plačiais, dantytais pamatais. Lapai pražanginiai, trilapiai, kotuoti [65]. Dauguma sėklų yra kietalukštės. Vienas augalas gali jų subrandinti net iki 1700. Dirvoje sėklos ilgai išlieka daigios [30].
1.1.2 M.officinalis fitocheminė sudėtis
Pagal Europos Farmakopėją naudojama M. officinalis žolė (07/2012:2120). Augalo žaliavose kaupiamos skirtingų grupių cheminės medžiagos, tiek įvairūs tų medžiagų dariniai. Žaliavų kokybė nustatoma pagal kumarinų kiekį, kurių turi būti nemažiau 0,3 proc. [25].
Kumarinai. Kumarinų šio augalo žaliavose aptinkama apie 0,3-0,8%, įskaitant kumarinų darinių (tokius kaip 3,4-dihidrokumarinas, skopoletinas ir umbeliferonas). Šviežioje barkūnų žolėje nėra nustatomi dideli kumarino kiekiai, tačiau ląstelių vakuolėse yra kaupiami cis- ir trans-o-hidroksicinamono rūgšties gliukozidai. Veikiant augalą išoriniais dirgikliais specifiniai cis-o-hidroksicinamono rūgšties gliukozidui fermentai β-gliukozidazės hidrolizuoja rūgšties gliukozidą iki nestabilios laisvosios kumaro rūgšties. β-gliukozidazė yra aktyvi ir išdžiovintoje žaliavoje, vykstant dehidratacijos procesams kambario temperatūroje cis-o-hidroksicinamono rūgšties gliukozidas yra pilnai konvertuojamas į kumariną. Tuo tarpu trans-o-hidroksicinamono rūgšties gliukozidas (meliliotozidas) minėtomis sąlygomis lieka nepakitęs [10].
2 pav. Cis-o-hidroksicinamo rūgšties gliukozido hidrolizė
Cinamono rūgšties junginiams priklauso trans-2-hidroksicinamono rūgšties gliukozidas (jo augalo žaliavoje randama iki 0,4%), melilioto rūgštis (t.y. dihidro-o-kumaro rūgštis, kurios yra maždaug 0,2%), kavos rūgštis (0,1%), mažiau ferulo, o- ir p- kumaro rūgščių.
Triterpeniniai saponinai. Augalo žolės žaliavoje randami oleaneno saponinai, tokie kaip sojasaponinai I, astragalozidai VIII, azukisaponinai II, azukisaponino V karboksilatai.
Lakieji junginiai. Dujų chromatografijos metodu identifikuota apie 80 junginių. Tarp jų paprastai vyrauja monoterpenai ir kiti alifatinės struktūros junginiai. [10].
Flavonoidai. Augalo žolė kaupia (+)-katechiną, miricetiną, kvercetiną, genisteiną (kuris ypač būdingas pupinių šeimos augalams), pinocembriną ir moriną. Taip pat fitocheminėje žaliavos sudėtyje rasta robinino.
Fenolio rūgštys. M. officinalis žaliavose nustatomos įvairios fenolio rūgštys: galo r., 4- ir 3-hidroksibenzoinės rūgštys, kavos r., p-kumaro r., ferulo r., rozmarino r., elago r. [37].
Kiti junginiai. Augalo žolės fitocheminėje sudėtyje yra kitų junginių, tokių kaip purino dariniai, riebalinės medžiagos (iki 4,3%), baltyminės medžiagos (iki 17,6%), eteriniai aliejai (iki 0,01%). Augalo sėklose rasta: iki 41,9% baltymų, apie 8,3% riebalų aliejaus ir apie 9% krakmolo [80].
1.1.3 M.officinalis panaudojimas
Geltonžiedžių barkūnų žolė, jos pagamintos tinktūros, nuovirai, nuo seno yra vartojami tradicinėje medicinoje esant įvairiems sveikatos negalavimams. XX amžiaus pradžioje JAV buvo užfiksuotas įvykis, kai gyvuliams, kurie ganėsi pievoje, pasireiškė vaskulinė hemoraginė diatezė. Įvykio metu buvo permainingos oro sąlygos, dėl ko veikiant aplinkos veiksniams iš augalo žaliavose esančių kumarinų susidarė dikumarinai, kurie ir buvo atsakingi už kraujavimą [71]. Po kurio laiko mokslininkams pavyko išskirti antikoaguliacinę medžiagą ir ją panaudoti terapiniams tikslams. Pagrindinė terapinė jos indikacija yra slopinti kraujo krešėjimą, kad kraujagyslėse nesusidarytų trombų [38]. M.officinalis žaliavos naudojamos gydant flebitą, siekiant užkirsti venų trombozei ir kraujagyslių trapumui. Taip pat augalų etanoliniai ekstraktai naudojami venų varikozei bei hemorojui gydyti [14].
Remiantis eksperimentiniais duomenimis nustatyta, kad šio augalo kaupiami kumarinai slopina centrinę nervų sistemą, be to jiems būdingas antiepilepsinis ir silpnas narkotinis poveikiai. Dėka M. officinalis žaliavose nustatomų reikšmingų kumarinų kiekio, iš jų pagaminti fitopreparatai gali būti naudojami kaip skausmą malšinanti ir raminamoji priemonė esant nemigai. Tradicinėje medicinoje augalo teikiamos žaliavos yra vartojamos kaip atsikosėjimą lengvinanti priemonė, esant kvėpavimo takų uždegimui. Barkūnų preparatai gali būti vartojami ne tik išoriškai, bet ir į vidų. Šių augalų žaliavų nuoviras bei jo garai yra vartojami kaip minkštinamoji priemonė esant pūliams, furunkulams, vidurinės ausies uždegimui. Esant podagrai ir sąnarių reumatiniams patinimams rekomenduojamos šiltos geltonžiedžių barkūnų vonelės [79].
Buvo atlikti randomizuoti ir dvigubai koduoti klinikiniai tyrimai su M.officinalis žolės ekstraktu, siekiant išsiaiškinti jo veiksmingumą esant edemai. Tyrimuose naudotas standartizuotas augalo ekstraktas (turintis 1% kumarino). Pacientams jis buvo skiriamas po atliktos kosmetinės chirurginės operacijos septynias dienas iš eilės, po 300 mg ekstrakto per dieną. Gauti rezultatai parodė, kad jo veiksmingumas, siekiant sumažinti akies vokų ir paranazalinę edemas, buvo panašus į peroraliai vartotą deksometazoną. Be to M.officinalis ekstraktas buvo efektyvesnis negu deksometazonas siekiant sumažinti mėlynių, susidariusių po chirurginių intervencijų, riziką bei buvo veiksmingesnis už placebą tiek siekiant sumažinti mėlynes, tiek pooperacines edemas [74].
Atsižvelgiant į M.officinalis savybes, jo žaliavos gali būti panaudojamos siekiant sumažinti smegenų kraujagyslių trombozę, tokiu būdu išvengiant smegenų ląstelių apoptozės, taip pat slopinant uždegimo mediatorius esant smegenų išemijai [76]. Esant šiai būklei vystosi hipoksija, dėl ko gali
ištikti infarktas. To pasėkoje didėja neuroninių ląstelių apoptozės tikimybė [33]. Kita priežastis, dėl kurios gali išsivystyti smegenų išemija, tai sutrikęs mitochondrijų funkcionalumas, sąlygojantis laisvųjų radikalų susidarymą. Todėl siekiant sumažinti oksidacinę pažaidą bei išemijos pasireiškimo tikimybę yra vartojami antioksidantai [48]. Atliktas tyrimas su žiurkėmis parodė, jog M.officinalis preparatai, kuriais buvo šeriami gyvūnėliai, efektyviai mažino citokinų ir reaktyvaus deguonies kiekį, nes pagamintos augalo žaliavų paruošos pasižymėjo antioksidacinėmis savybėmis [76].
M.officinalis dėl turimų fitocheminėje sudėtyje flavonoidų ir fenolinių darinių pasižymi antioksidaciniu poveikiu. Atlikti in vitro tyrimai modelinėje DPPH sistemoje atskleidė, kad M. officinalis etanoliniai ekstraktai pasižymi 4 kartus didesniu gebėjimu surišti laisvuosius radikalus, negu sintetinė antioksidacinėmis savybėmis pasižyminti medžiaga butilhidroksitoluenas (BHT). Dėka antioksidacinių savybių barkūnų fitopreparatai galėtų būti naudingi siekiant sumažinti oksidacinio streso pasireiškimo tikimybę [57].
Vartojant geltonžiedžių barkūnų preparatus ilgą laiką gali pasireikšti rimti, nepageidaujami poveikiai – pykinimas, vėmimas, galvos skausmas, mieguistumas. Manoma, kad tai gali sąlygoti kumarinų grupės junginiai. Ypač sunkūs apsinuodijimai gali išsivystyti netinkamai ruošiant geltonžiedžių barkūnų žaliavas ar neteisingai jas laikant. Priežastis yra ta, jog augalo puvimo metu gali susidaryti dikumarinas. Ši medžiaga slopina protrombino ir kitų krešėjimo faktorių gamybą organizme, dėl ko gali padidėti kraujavimo rizika [69,79].
1.2. Oksidacinis stresas ir jo žala
Oksidacinis stresas – tai disbalansas tarp laisvųjų radikalų ir reaktyviųjų metabolitų, vadinamų oksidatoriais arba reaktyviosiomis deguonies ar azoto formomis, susidarymo ir jų nukenksminimo mechanizmų, už kuriuos yra atsakingi antioksidantai. Šios pusiausvyros pažeidimas daro neigiamą įtaką organizmui, nes yra pažeidžiamos įvairios biomolekulės ir ląstelės [21].
Esant oksidacinio streso būklei organizme gali vystytis ląstelių ir audinių nekrozė, sutrinka energijos ATP pavidalu gamyba bei yra užkertamas kelias apoptozei. Bet koks pusiausvyros nebuvimas normaliuose oksidacijos-redukcijos procesuose gyvuosiuose audiniuose sąlygoja intoksikaciją susidariusiais laisvaisiais radikalais (reaktyviomis deguonies ir (ar) azoto formomis), kurie pažeidžia baltymus, lipidus ir ląstelių DNR [64]. Paprastai yra išskiriamos kelios pagrindinės oksidacinio streso išsivystymo priežastys: padidėjęs endogeninių ar egzogeninių medžiagų lygis, kurios gali autooksiduotis bei susidaryti ROS; mažos molekulinės masės antioksidantų atsargų sumažėjimas; antioksidantinių fermentų inaktivacija; endogeninių antioksidantų bei antioksidantinių fermentų gamybos sumažėjimas; vienu metu galimos kelių priežasčių kombinacijos [45].
Pastaruoju metu yra manoma, jog oksidacinis stresas atsakingas už kai kurių ligų atsiradimą. Šioms ligoms priklauso neurodegeneracinės ligos. Buvo nustatyta, jog žmogaus organizmo senėjimo procesas yra svarbus rizikos faktorius Alzheimerio ir Parkinsono ligoms išsivystyti. Didelės dalies tam tikrų ligų išsivystymo procesų tyrinėjimų rodo, kad tai yra susiję su besikaupiančiomis oksidacinio streso pažaidomis, dėl ko atsiranda įvairios mitochondrijų mutacijos ir disfunkcijos [46]. Neuronai ir astrocitai yra dvi svarbiausios smegenų ląstelių grupės, kurios yra atsakingos už didžiausią deguonies ir gliukozės suvartojimą. Įdomu pažymėti, kad smegenys sudaro tik ~2% viso žmogaus kūno svorio, tačiau deguonies suvartoja ~20% daugiau, negu visas organizmas [2]. Dėl savo didelio reaktyvumo deguonies turintieji laisvieji radikalai reaguoja su biologinėmis molekulėmis, dėl ko pakinta normalios ląstelių funkcijos ir jos gali žūti [27].
Oksidacinis stresas susijęs taip pat su širdies ir kraujagyslių ligų išsivystymu, kas glaudžiai yra susiję su ligų rizikos faktoriais, t.y. hipertenzija, cukriniu diabetu, hipercholesterolemija ir rūkymu. Oksidacinio streso metu aktyvuojama organizmo fermentų sistema, kuri atsakinga už reaktyviųjų deguonies ir azoto formų susidarymą, ir „viršija“ sistemą, kuri atsakinga už organizmo apsaugą nuo oksidacinio streso. Dėl šios priežasties dominuojanti fermentų sistema skatina bioaktyvaus azoto oksido (NO) oksidaciją ir susidaro NO oksidacijos produktai, turintys neigiamą įtaką. Dėl šių procesų NO praranda savo apsaugines funkcijas ir yra aktyvuojami prouždegiminiai ir proaterosklerotiniai keliai – endotelio disfunkcijos pagrindas [26].
1.3 Laisvųjų radikalų klasifikacija
Manoma, kad apie 5% deguonies, dalyvaujančio gyvybiškai svarbiuose aerobinių organizmų biocheminiuose procesuose, yra konvertuojama į reaktyvias deguonies formas. Deguonies turintys laisvieji radikalai yra superoksido anijonas (O•‾2), hidroksilo radikalai (OH•), alkoksilo radikalai (RO•),
peroksilų radikalai (ROO•) ir lipidų peroksilų radikalai (LOO•). Citotoksinės neradikalinės deguonies
formos yra vandenilio peroksidas (H2O2), singletinis deguonis (1O2), lipidų peroksidas (LOOH) [2].
Žmogaus biologinėse sistemose taip pat susidaro reaktyviosios azoto turinčios formos. Reaktyviosios azoto (RNS) formos taip pat yra skirstomos į radikalines (azoto oksidas (NO•
), azoto dioksidas (NO•2))
3 pav. Laisvųjų radikalų klasifikacija [23]
1.3.1 Laisvųjų radikalų susidarymo mechanizmas
Laisvieji radikalai gali susidaryti normaliai organizme vykstančių metabolinių reakcijų metu arba veikiant išoriniams faktoriams, tokiems kaip jonizuojanti radiacija, ozonas, cigarečių dūmai, oro teršalai arba pramoniniai chemikalai. Laisvieji radikalai ląstelėse susidaro dviem būdais: fermentiniu ir nefermentiniu. Svarbiausi fermentiniai mechanizmai yra susiję su mitochondrijų kvėpavimo grandine, citochromo P-450 sistema, fagocitozės, prostaglandinų sintezės procesais. Taip pat laisvieji radikalai susidaro ir nefermentinių reakcijų metu dalyvaujant organiniams junginiams ir veikiant jonizuojančiai spinduliuotei [43].
1) Superoksido anijono susidarymas mitochodrijose. Manoma, jog vienas iš būdų šiems radikalams susidaryti yra elektronų „nutekėjimas“ jų pernašos mitochondrijų kvėpavimo grandinėje metu. Vykstant pagrindiniams metaboliniams procesams egzistuoja tikimybė vykti šalutinėms reakcijoms kvėpavimo grandinėje, dėl ko gali susidaryti laisvieji radikalai. Vykstant šioms reakcijoms molekulinis deguonis yra redukuojamas vienu elektronu iki O•‾2. Elektronų pernašos grandinė skatina
protonų transportą iš mitochondrijų matrikso į tarpmembraninę ertmę, iš kur jie gali tolygiai pasiskirstyti ląstelės citoplazmoje. Dėl šios priežasties matrikso pH didėja, o tarpmembraninėje erdvėje – mažėja. Kadangi O•‾
2 pKa yra 4,8, maža jo frakcija tarpmembraninėje erdvėje gali egzistuoti
protonuotoje formoje (HO•2). Tačiau bet kuris superoksido anijonas, generuotas vidinėje
mitochondrijos membranoje, liks neprotonuotas (O•‾2 formoje). O•‾2 ar HO•2 sąlygoja vandenilio
peroksido (H2O2) susidarymą. Pastarasis gali skilti dalyvaujant pereinamiesiems metalų katijonams,
dėl ko susidaro hidroksilo radikalas (•OH). Tai yra stipriausias oksidatorius susidarants biologinėse
sistemose [56,70].
2) Superoksido anijono susidarymas veikiant ksantino oksidazei. Laisvieji radikalai gali susidaryti veikiant fermentui ksantino oksidazei. Vykstant intensyviai organizmo metabolinei veiklai gali išsivystyti išemija ar hipoksija, dėl ko ATP konvertuojama į ADP, AMP, inoziną ar hipoksantiną.
Esant šioms išeminėms būklėms tarpląstelinė ksantino dehidrogenazė (XD), modifikuojant cisteino radikalą arba vykstant dalinei proteolizei, gali būti konvertuota į ksantino oksidazę (XO). Esant normalioms fiziologinėms sąlygoms, ksantino dehidrogenazė yra dominuojanti fermento forma, kuri oksiduoja tiek hipoksantiną, tiek ksantiną (iki šlapimo rūgšties) procesuose, kur tuo pat metu NAD+
redukuojamas iki NADH. Ksantino oksidazė negali naudoti NAD+ kaip elektronų akceptorių, todėl vietoj jo yra redukuojamas deguonis iki superperoksido anijono, o po to ir vandenilio peroksido [28,51].
Esant išeminei būklei deguonies koncentracija būna maža, todėl tarpląstelinė XO ir hipoksantino koncentracija gali padidėti. Kai deguonis galiausiai panaudojamas, iš jo generuojami O•‾
2
ir H2O2 [28,51].
3) Superoksido anijono susidarymas veikiant neutrofilams ir kitiems fagocitams. Ši hipotezė teigia, jog esant intensyviai organizmo veiklai dėka, neutrofilų ir kitų fagocitų, yra generuojami laisvieji radikalai. Taip yra dėl to, jog labai suaktyvėja antioksidacinės organizmo gynybinės funkcijos. Buvo atliktas tyrimas, kurio metu buvo analizuojamas imuninės sistemos atsakas ir fermentų aktyvumas po intensyvios fizinės veiklos. Suzuki kartu su tyrėjų komanda analizavo uždegiminius atsakus po to, kai organizmas būdavo paveiktas intensyvia fizine veikla. Nustatyta, jog reikšmingai padidėja neutrofilų kiekis priklausomai nuo fizinės veiklos trukmės ir intensyvumo. Taip pat mokslininkai nustatė padidėjusią HOCl gamybą, kuri yra mieloperoksidazės produktas bei stiprus oksidatorius [47,60].
Atlikus tyrimus nustatyta, jog endogeninis azoto oksido radikalas (NO.) augaluose dalyvauja
transdukciniuose keliuose, per kuriuos indukuojami gynybiniai atsakai siekiant užkirsti kelią patogenams ar ląstelių pažeidimui. Fermentas NO.-sintazė (NOS) katalizuoja deguonį ir nuo NADPH
priklausomą L-arginino oksidaciją iki NO. ir citrulino [19]. Gyvūnų raumenyse azoto oksidas yra
sintezuojamas taip pat iš aminorūgšties L-arginino panaudojant tris skirtingas azoto oksido sintazės izoformas (NOS1, NOS2 ir NOS3). Azoto oksidas turi įvairias signalines funkcijas ir gali lengvai reaguoti su superoksidu, ko pasėkoje susiformuoja stipri oksiduojanti medžiaga peroksinitritas, kas skatina tiolio grupių skilimą ląstelėse. Azoto radikalai susiformuoja ir randami tiek gyvūnų, tiek augalų peroksizomose [58].
1.4 Antioksidantai ir jų poveikis
Antioksidantai yra cheminės medžiagos, kurios, slopindamos oksidacinius procesus, geba apsaugoti ląsteles nuo laisvųjų radikalų sukeliamos pažaidos. Antioksidantai slopina oksidacinius procesus, DNR mutacijas, piktybines ląstelėje vykstančias transformacijas, tokiu būdu apsaugodami
ląsteles nuo pažaidos. Tyrimais įrodyta, jog šios cheminės medžiagos dezaktyvuoja laisvuosius radikalus, daro neigiamą įtaką vėžinėms ląstelėms bei slopina degeneracines ligas [29].
Tyrinėjant įvairias fiziologines būsenas buvo nustatyta, kad disbalansas tarp oksidatorių ir prooksidantų suteikia pirmenybę oksidatoriams, dėl ko sukeliamas oksidacinis stresas. Dėl šios priežasties "įsijungia" endogeninės antioksidacinės organizmo sistemos. Tačiau su amžiumi šios apsauginės sistemos praranda savo efektyvumą. Tokiu atveju naudojamos įvairios intervencinės sistemos, kitaip tariant, egzogeniniai antioksidantai, kurie gali slopinti ROS ir taip slopinti kai kurių ligų progresavimą [55].
1.4.1 Antioksidantų klasifikacija ir veikimo lygmenys
Mokslinėje literatūroje antioksidantai dažniausiai klasifikuojami į fermentinius ir nefermentinius (4 pav.).
4 pav. Antioksidantų klasifikacija [54]
Svarbiausi fermentai, kurie tiesiogiai dalyvauja ROS ir RNS nukenksminime yra: superoksido dismutazė (SOD), katalazė (CAT), glutationo peroksidazė (GPx) ir glutationo reduktazė (GRx). SOD yra pirmos eilės gynybinis fermentas katalizuojantis superoksido anijono (O2•–) dismutaciją verčiant jį
į vandenilio peroksidą (H2O2). Susiformavęs oksidatorius (H2O2) yra transformuojamas į vandenį ir
deguonį (O2) veikiant katalazei (CAT) ar glutationo peroksidazei (GPx). GPx pašalina H2O2
panaudodamas jį glutationo (GSH) oksidacijoje, susidarant oksiduotai glutationo formai (GSSG). Šie fermentai yra endogeniniai, t.y. organizmas juos biosintetina pats [20,54].
Nefermentiniai antioksidantai yra skirstomi į metabolinius ir egzogeninius, kurie gaunami su maistu. Metaboliniai (kitaip endogeniniai) antioksidantai, tokie kaip lipoinė rūgštis, glutationas, L-argininas, kofermentas Q10, melatoninas, šlapimo rūgštis, bilirubinas, metalus chelatuojantys baltymai, transferinas ir t.t., yra sintezuojami organizme vykstant metabolinėms reakcijoms [55]. Ekzogeniniai antioksidantai organizme negaminami, reikia pasirūpinti, kad pakankamas jų kiekis būtų
gautas su maistu. Šios medžiagos yra vitaminas E, vitaminas C, karotenoidai, mikroelementai (selenas, geležis, manganas, cinkas), flavonoidai, omega-3 ir omega-6 riebalų rūgštys ir pan. [38,39].
Antioksidantų gynybinė sistema gali funkcionuoti įvairiais mechanizmais, todėl jų poveikis gali būti skirstomas į kelis lygmenis [44].
1) Pirmos eilės gynybinė antioksidantų funkcija gali būti apibrėžiama kaip profilaktinis veikimas, kai antioksidantai slopina ar užkerta kelią susidaryti ląstelėje laisviesiems radikalams ir kitoms reaktyviosioms formoms. Šių antioksidantų poveikis paprastai yra greitas, todėl jie reaguoja į „įtartinas“ molekules, iš kurių ir gali susidaryti laisvieji radikalai. Pagrindiniai fermentai, kurie veikia panašiu principu yra superoksido dismutazė, katalazė ir glutationo peroksidazė. Jie suskaido vandenilio peroksidą į nekenksmingas molekules, pvz.,deguonis. Prie šių fermentų taip pat priskiriami metalus surišantys baltymai, tokie kaip transferinas, ceruloplazminas, kurie chelatuoja geležies, vario jonus ir pan. [35,44].
2) Antros eilės gynybinė antioksidantų funkcija yra susijusi su laisvųjų radikalų surišimu, dėl to slopinamos grandininės oksidacijos reakcijos. Šie antioksidantai neutralizuoja reaktyvias formas atiduodami savo elektroną, dėl ko sumažėja oksidacinė pažaida. Šiai antioksidantų kategorijai priklauso L-askorbo rūgštis (vitaminas C), šlapimo rūgštis, glutationas, alfa-tokoferolis (vitaminas E). 3) Trečios eilės antioksidantinė gynyba. Šiuo principu funkcionuojantys antioksidantai yra de novo fermentai, kurie atkuria biomolekulių, ląstelių, DNR, lipidų funkcijas po jiems laisvųjų radikalų padarytos žalos. Taip pat šio tipo antioksidantai geba identifikuoti pakenktus (oksiduotus) DNR fragmentus, baltymus ar kitas medžiagas, jas sunaikina ir pašalina. Tokiu būdu išvengiama ROS ir RNS kaupimosi organizme. Šiam tipui priklauso atstatomieji DNR fermentai (polimerazės, glikozilazės, nukleazės), proteolitiniai fermentai (proteinazės, proteazės ir peptidazės), kurie randami ląstelių citozolyje, mitochondrijose [35,44].
1.5 Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai, kurie dar vadinami fenoliais, yra organiniai junginiai, kurie savo struktūroje turi hidroksilo (-OH) grupę tiesiogiai sujungtą su aromatinio žiedo anglies atomu [1]. Šie cheminiai dariniai natūraliai aptinkami augaluose bei yra fitocheminės sudėties dalis. Augalinės kilmės polifenoliniai junginiai atlieka augalo gynybinę funkciją, apsaugo nuo UV pažaidos, ar patogenų, tokių kaip parazitai ir plėšrūnai, o taip pat yra atsakingi už įvairių augalo organų spalvą. Juos galima aptikti daugelyje augalo organuose, todėl fenoliniai junginiai yra neatsiejama žmogaus mitybos raciono dalis. Kadangi šių medžiagų žmogaus organizmas pats nepasigamina, todėl rekomenduojama vartoti kuo daugiau daržovių, vaisių, žolinių prieskonių, nes juose yra gausu fenolinių junginių [17].
Fenoliniai junginiai pasižymi įvairialypiu biologiniu poveikiu. Manoma, kad jų vartojimas yra susijęs su mažesne širdies ir kraujagyslių ligų, uždegimo, cukriniu diabeto, vėžinių ligų rizika. Šie junginiai taip pat pasižymi reikšmingomis antioksidacinėmis savybėmis [41,63,72]. Mokslinėje literatūroje nurodoma, kad fenoliniams junginiams taip pat yra būdingas antivirusinis, antimikrobinis poveikiai. Taip pat jie gali surišti geležies jonus, slopinti tam tikrų fermentų veikimą, reguliuoti genų ekspresiją ir gerinti endotelio funkciją [67].
1.5.1 Fenolinių junginių klasifikacija
Fenoliai yra arenų dariniai, kuriuose hidroksigrupė yra sujungta su aromatinio žiedo sp2 hibridizuotu C atomu. Esant susijungus keliems fenolių struktūriniams vienetams tarpusavyje susidaro polifenoliai. Atsižvelgiant į fenolinių žiedų skaičių bei jų struktūrinius elementus, kurie yra prisijungę bendros struktūros, galima išskirti keletą klasių (5 pav.) [66].
5 pav. Bendra fenolinių junginių klasifikacija [13,18,52]
Dvi svarbiausios polifenolių junginių grupės yra flavonoidai ir fenolio rūgštys. Flavonoidai skirstomi į flavanonus, flavonus, dihidroflavonolius, flavonolius, flavan-3-olius, izoflavonus, antocianidinus, protoantocianidinus [42]. Fenolio rūgštys turi karboksilo grupę, kuri yra prijungta prie benzeno žiedo. Atsižvelgiant į struktūrą jos gali būti išskiriamos į dvi klases: benzoinės rūgšties dariniai (C6-C1) ir cinamono rūgšties dariniai (C6-C3) [32].
Fenolio rūgštys yra antriniai augalų metabolitai, kurie gausiai paplitę visuose augaluose ir jų organuose. Jos turi specifinį kvapą, skonį ir pasižymi gerinančiomis sveikatą savybėmis. Todėl kuo didesnis fenolinių rūgščių kiekis augaluose, tuo labiau didėja augalų kokybė ir vertė. Augaluose šie dariniai gali egzistuoti glikozidų pavidalu. Fenoliniai glikozidai sudaryti iš dviejų dalių: necukrinės (aglikono) dalies, kuriai priskiriamas fenolinis fragmentas ir prie jos prisijungusi cukrinė dalis [9].
Flavonoidai, kita fenolinių junginių klasė, augaluose dažniausiai egzistuojanti glikozidų pavidalu. Flavonoidų aglikonai augaluose gali egzistuoti ir be cukrinės dalies [61,68]. Šie junginiai yra svarbūs augalų pigmentacijoje, ypač jų žiedų. Jie atsakingi už geltoną, raudoną ir mėlyną vainiklapių spalvas, kurios padeda privilioti vabzdžius apdulkintojus. Aukštesniesiems augalams (besidauginantys sėklomis) priklausantys flavanoidai apsaugo augalus nuo UV, skatina azoto įsisavinimą ir atsakingi taipogi už žiedų spalvą. Šie junginiai svarbūs reguliuojant įvairias augalų fiziologines funkcijas: slopina ląstelės dalijimosi ciklus, esant DNR pakitimams, ir dalyvauja tarpląstelinių signalų perdavimo keliuose [12,61].
1.5.2 Fenolinių junginių antiradikalinės ir chelatinės savybės
Fenoliniai junginiai deguonies poveikyje lengvai oksiduojasi, dėl ko susidaro spalvoti chinonai. Fenolinių junginių oksidacijos metu įvyksta homolizinis -OH skilimas. Atskilęs vandenilis prisijungia prie laisvojo radikalo. Tuo tarpu fenolinis junginys virsta chinonu. Todėl dėka šios aktyviosios grupės fenoliniams junginiams būdingas antioksidacinis aktyvumas [62].
7 pav. Fenolinio junginio virtimas į chinoną [12]
Yra du pagrindiniai funkcionavimo mechanizmai, kuriais fenoliniai junginiai veikia kaip antioksidantai. Pirmu atveju laisvasis radikalas prisijungia vandenilio atomą iš antioksidanto (ArOH), kuris tampa radikalu:
Antioksidantui funkcionuojant šiuo mechanizmu O–H ryšio energija (RE) yra svarbus parametras siekiant įvertinti antioksidacinį potencialą, nes kuo silpnesnis OH ryšys, tuo lengviau bus inaktyvuoti laisvųjį radikalą.
Antras mechanizmas yra susijęs su vieno elektrono perdavimo procesu. Šiuo atveju antioksidantas atiduoda vieną elektroną laisvajam radikalui ir antioksidantas tampa katijonu.
Remiantis šiuo mechanizmu teigiama, jog kuo mažesnis jonizacijos potencialas (JP), tuo lengvesnis yra elektrono peršokimas [4].
Todėl vertinant JP bei RE parametrus galima prognozuoti fenolinių junginių antioksidacinį efektyvumą [12]. Polifenolių antiradikalinės savybės priklauso nuo jų redukcinių. Šių junginių gebėjimas surišti laisvuosius radikalus priklauso nuo fenolių vandenilio (donorinio elektrono), antioksidacinio reaktyvumo, o taip pat nuo metalus chelatuojančio potencialo [59].
Be antiradikalinių savybių fenoliniams junginiams taip pat būdingos chelatinės (8 pav.).
8 pav. Fenolių chelatinės savybės
Fenoliniai junginiai suriša metalus ir sudaro su jais kompleksą. Pavyzdžiui, reaguojant geležies jonams su ferozino reagentu susidaro kompleksinis junginys. Tačiau pridėjus prie šio komplekso fenolinių junginių, jie pradeda veikti kaip chelatuojančios medžiagos. Jos suardo šitą kompleksą, o atskilusį geležies joną prijungia prie savęs [49].
1.5.3 Fenolinių junginių ekstrakcija, jų kiekio ir antioksidacinio aktyvumo nustatymas augaliniuose ekstraktuose
Norint ištirti bioaktyvius augalų junginius prieš tai reikia tinkamai paruošti augalinę žaliavą. Dažniausiai žaliavos yra liofilizuojamos ar džiovinamos ore, o vėliau susmulkinamos iki miltelių. Tačiau liofilizacijos metu dalis aktyviųjų junginių gali suskilti. Todėl fitocheminiuose tyrimuose dažniausiai yra naudojama orasausė žaliava [17].
Sekantis žingsnis yra veikliųjų junginių ekstrakcijos metodo parinkimas iš išdžiovintos žaliavos. Tam reikia atsižvelgti į kelis parametrus siekiant gauti gerą flavonoidų ir fenolinių junginių išeigą: t.y. ekstrakcijos trukmė, temperatūra, tirpiklio ir žaliavos santykis, ekstrakcijų pakartojamumas bei tirpiklio rūšis. Pastarojo pasirinkimas priklauso nuo dviejų aplinkybių, ekstrakcijos trukmės ir
temperatūros. Įprasta, kad ilginant ekstrakcijos trukmę ir didinant temperatūrą, gerėja ir analičių tirpumas, tačiau yra didelė tikimybė, kad aktyvieji komponentai gali degraduoti arba dėl užtęstos ekstrakcijos būti paveikti fermentine oksidacija [6,17]. Tirpikliai, kurie dažniausiai naudojami fenolinių junginių ekstrakcijai, yra metanolis, etanolis, acetonas ir jų mišiniai su vandeniu. Etanolis yra plačiausiai naudojamas tirpiklis farmacijos pramonėje, nes pasižymi geromis ekstrakcinėmis savybėmis, o gauti ekstraktai yra saugūs vartoti žmonėms [40].
Ekstrakcijos metodo parinkimas yra svarbus veiksnys siekiant gauti didesnę fenolinių junginių išeigą. Konvencinės metodikos, tokios kaip maceracija ir Soksleto ekstrakcija, pasižymi ilgesne ekstrakcijos procesų trukme bei mažesniu efektyvumu. Tačiau pastaruoju metu augalinės kilmės fenolinių darinių ekstrakcijai plačiai naudojami nauji metodai: panaudojamos mikrobangos, ultragarsas, technologijas, kurios paremtos suslėgtais skysčiais, pvz., ekstrakcija subkritiniu vandeniu, superkritinė skysčių ekstrakcija, suslėgtų skysčių ekstrakcija [6,17].
Ekstrakcija ultragarsu nereikalauja sudėtingų instrumentų, įrangos bei yra santykinai nebrangi. Veikiant ultragarsui tirpale susidaro kavitaciniai burbuliukai, kurie sprogsta ir atsiranda šlyties jėga. Burbuliukų sprogimas žaliavos ląstelėms daro fizinį, cheminį ir mechaninį poveikius, ko pasėkoje suyra biologinės membranos. Tokiu būdu palengvinama ekstrakcinių medžiagų difuzija į tirpiklį. Naudojant ultragarsą vyksta mažesnė fenolinių junginių degradacija bei ekstrakcijos procesas yra greitesnis lyginant su kitais tradiciniais metodais. Dėl to pastaruoju metu šis metodas yra itin plačiai naudojamas įvairių fenolinių junginių ekstrahavimui iš skirtingų augalinių žaliavų [17,52].
Norint įvertinti bendrą fenolinių junginių, flavonoidų ir fenolio rūgščių kiekį dažnai moksliniuose tyrimuose yra naudojami UV spektrofotometriniai metodai. Jų metu matuojamos reakcijos mišinių absorbcijos, regimosios šviesos bangos ilgių diapazone. Šie metodai yra gana greiti, paprasti ir patikimi, tačiau lyginant su chromatografiniais metodais yra mažiau atrankūs [40].
Fenolinių junginių gausa ir botaninės matricos sudėtingumas sąlygoja platų kolorimetrinių metodų panaudojimą jų kiekybinei analizei. Vienas iš metodų yra vadinamas Foli-Ciocalteu, kurio metu naudojamas specifinis reagentas sudarytas iš kelių cheminių medžiagų komplekso (natrio molibdatas, natrio tungstatas ir kt.). Metodas remiasi elektronų perdavimo reakcijomis. Tačiau metodas reikalauja palyginamosios medžiagos (šiuo atveju galo rūgštis), kurios pagalba bus matuojamas bendras fenolinių junginių kiekis ekstrakte. Reaguojant ekstraktui su šiuo reagentu susidaro mėlynos spalvos kompleksas, kurio kiekis išmatuojamas spektrofotometriškai 760-765nm bango ilgio diapazone, o rezultatas išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais [7,8,15].
Bendro fenolio rūgščių kiekio įvertinimui augalinėse žaliavose taikomas spektrofotometrinis metodas su Arnow reagentu. Šis kompleksinis reagentas susideda iš vandenilio chlorido, natrio nitrito ir natrio molibdato. Jam reaguojant su ekstrakte esančiomis fenolio rūgštimis gaunamas spalvotas
tirpalas (nuo smėlio iki tamsiai raudonos spalvos). Tirpalų absorbcija matuojama esant 525 nm bangos ilgiui [5].
Bendram flavonoidų kiekiui ištirti naudojamas metodas su aliuminio chloridu (AlCl3). Šiuo
atveju susidaro chelatiniai aliuminio ir flavonoidų kompleksai. Tiriamųjų ekstraktų absorbcija matuojama esant 404-430 nm bangos ilgiui, o bendras flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais [34,53].
Preliminariam augalinių ekstraktų antioksidacinio aktyvumo nustatymui taip pat yra taikomi spektrofotometriniai metodai: DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas), ABTS (2,2′-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšti), FIC (geležies jonų sujungimas) [3].
DPPH metodas yra dažnai naudojamas nustatant antioksidacinės molekulės gebėjimą surišti laisvuosius radikalus. Tai yra kolorimetrinis metodas, kuris yra gana paprastas atlikti. DPPH yra stabilus radikalas, kurio violetinės spalvos etanolinis tirpalas absorbuoja 515nm bangas. Šis metodas pagrįstas DPPH. gebėjimu prisijungti vandenilio atomą iš donorinės molekulės, t.y. antioksidanto, dėl
ko įvyksta DPPH. redukcija iki DPPH2. Tirpalo spalva iš violetinės pasikeičia į geltoną, ko pasėkoje
mažėja absorbija 515nm [49].
ABTS metodikoje naudojamas ABTS•+ stabilus, mėlynos/žalios spalvos radikalas, kurio maksimali absorbcija yra esant 734nm bangos ilgiui. ABTS radikalinis katijonas (ABTS•+) susidaro reaguojant ABTS tirpalui su kalio persulfatu (K2S2O8), kuris prieš naudojimą paliekamas stovėti
tamsoje, kambario temperatūroje 12-16 val. Šis jonas reaguoja su fenoliniais junginiais, ko pasėkoje mėlyna spalva pasikeičia į žalsvą, arba visai išnyksta ir tirpalas tampa bespalvis. Gauti rezultatai išreiškiami Trolokso ekvivalentais [75].
Metodas, kuriuo matuojamas ekstraktų gebėjimas chelatuoti metalus, vadinamas FIC. Ferozino reagentas reaguodamas su Fe2+ sudaro kompleksinį junginį. Tačiau kompleksas skyla pridėjus chelatuojančių medžiagų, dėl ko tirpalo raudona spalva blunka. Priklausomai nuo to, ant kiek tirpalas išblunka, galima įvertinti pridėtos chelatuojančios medžiagos aktyvumą [22].
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimų objektas
Šio tyrimo objektas buvo geltonžiedžių barkūnų (Melilotus officinalis L.) augalinės žaliavos, surinktos iš natūralių Lietuvos augaviečių. Jos buvo rinktos iš 13 skirtingų vietovių. Žaliava buvo rinkta vasarą, masinio žydėjimo metu birželio – rugpjūčio mėnesiais, 2016 metais. Duomenys pateikti 1 lentelėje. Žaliava buvo rinkta pamiškėse, prie geležinkelio, žvyrkelio pakraštyje, augalui būdingų augimui vietų. Surinktų iš gamtinių cenopopuliacijų augalinės žaliavos mėginiai buvo suskirstyti į žiedus, lapus ir stiebus. Tokiu būdu buvo gauti trijų augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdžiai.
1 lentelė. M.officinalis žaliavų rinkimo vieta ir data
Eil. Nr. Rinkimo vieta Rinkimo data
1. Anykščiai 2016-07-15 2. Karklė 2016-07-03 3. Druskininkai 2016-08-01 4. Ukmergė 2016-07-21 5. Salininkai 2016-06-29 6. Šilutė 2016-07-13 7. Šalčininkai 2016-06-23 8. Šiauliai 2016-08-09 9. Pasvalio apyl. 2016-08-16 10. Jurbarkas 2016-07-12 11. Kauno raj. 2016-06-21 12. Nemenčinė 2016-07-29 13. Eišiškės 2016-08-07
Surinkta žaliava buvo džiovinama paskleidus ją plonu sluoksniu ant audinio ar popierinės medžiagos apsaugojant nuo drėgmės ir tiesioginių saulės spindulių. Jai išdžiūvus ji buvo susmulkinta, sijojama ir laikoma popieriniuose maišeliuose, tamsioje, sausoje vietoje.
2.2. Medžiagos ir reagentai
Tyrimams atlikti naudoti analitinio švarumo tirpikliai ir reagentai: išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2009:0008), maistinis rektifikuotas etilo alkoholis 96%, (gamintojas UAB “Stumbras”, Kaunas, Lietuva), 2M Folin-Ciocalteu fenolinis reagentas (,,Sigma –Aldrich“, Šveicarija), 99,5-100,5% natrio karbonatas (,,Sigma – Aldrich“, Prancūzija), ≥ 98% galo rūgšties monohidratas (,,Sigma
–Aldrich“, Kinija), 100% acto rūgštis (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 95% aliuminio chlorido heksahidratas (,,Carl Roth“, Vokietija), ≥ 94% rutino hidratas (,,Sigma – Aldrich“, Vokietija), ≥ 99,5% metenaminas (,,Sigma – Aldrich“, Rusija), ≥ 97% ferozinas (,,Sigma – Aldrich“, JAV), 99,5% bevandenis geležies (II) chloridas (,,Alfa Aesar“, Vokietija), 95% DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas) (,,Alfa Aesar“, Vokietija), ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfono)) rūgštis (,,Sigma-Aldrich“, Kanada), kalio persulfatas (,,SIAL“, Kanada), troloksas (,,Sigma-Aldrich Chemie GmbH“, Danija), analitinio švarumo natrio nitritas (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio molibdatas (≥ 99%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), vandenilio chlorido rūgštis (37%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija), natrio šarmas (99%) (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Vokietija).
2.3. Naudota aparatūra
Tyrimams atlikti buvo naudota ultragarso vonelė – „ElmaSonic S40H“ (U=230V) (gamintojas Elma Schmidbauer, Vokietija), orbitalinė purtyklė „IKA®KS“ 130 Basic (gamintojas IKA-WERKE, Vokietija) ir spektrofotometrai – „Genesys 2“ (Thermo Spectronic, JAV) bei „Agilent Technologies“ (Cary 60, JAV).
2.4. Tyrimų metodai
2.4.1. M. officinalis žaliavų ekstraktų paruošimas
Tiksliai atsveriama 0,100 g M.officinalis žaliavos (žiedų, lapų ar stiebų) ir užpilama 10 ml 70 % (V/V) etanoliu. Ekstraktus ruošiame tamsaus stiklo buteliukuose. Ruošiama po 2 mėginius iš kiekvienos morfologinės žaliavos dalies (žiedų, lapų, stiebų). Mėginiai 10 min. veikiami ultragarsu esant 50 °C temperatūrai. Pagaminti etanoliniai ekstraktai filtruojami pro popierinius filtrus į matavimo cilindrą. Ant filtro esantis žaliavos likutis praplaunamas 70 % (V/V) etanoliu iki 10 ml. Iš viso buvo paruošta 78 M.officinalis etanolinių ekstraktų (1:100).
2.4.2. Reagentų paruošimas
70 % (V/V) etanolio - vandens mišinys ruošiamas remiantis alkoholimetrine lentele. 1 litrui pagaminti reikia 665 ml 96% (V/V) etanolio ir 335 ml išgryninto vandens.
0,2 N Ciocalteu reagentas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 10 ml 2 M Folin-Ciocalteu fenolinio reagento praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
7,5 % (W/V) natrio karbonato (Na2CO3) tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 7,5 g bevandenio natrio karbonato tirpinama 100 ml išgryninto vandens.
5% metenamino tirpalas gaminamas 2,5 g heksametilentetramino tirpinant 50 ml išgryninto vandens.
33 % acto rūgšties tirpalas ruošiamas 100 ml matavimo kolboje. 33 ml 99,8% ledinės acto rūgšties skiedžiama vandeniu iki 100 ml žymos.
10 % aliuminio chlorido (AlCl3) tirpalas ruošiamas stiklinėje kolboje 5,0 g aliuminio chlorido ištirpinant 50 ml išgryninto vandens.
Rutino etanolinis tirpalas gaminamas 0,025 g (tikslus svėrinys) 99% grynumo rutino tirpinant 25 ml 70 % (V/V) etanolio.
2 mM geležies (II) chlorido (FeCl2) tirpalas ruošiamas 0,0063g (tikslus svėrinys) bevandenio FeCl2 tirpinant 25 ml išgryninto vandens. Kiekvieną kartą ruošiamas naujas tirpalas.
5 mM ferozino tirpalas gaminamas 0,0616 g ferozino (tikslus svėrinys) tirpinant 25 ml išgryninto vandens.
6×10-5 M DPPH (2,2-difenil-1-pikrikhidrazilas) tirpalas gaminamas ir laikomas tamsaus stiklo buteliuke, apsaugančiame nuo šviesos. 0,00118g (tikslus svėrinys) DPPH reagento ištirpinama 50 ml 96% (V/V) etanolyje. DPPH tirpalas kiekvieną dieną ruošiamas naujas.
ABTS tirpalas ruošiamas tamsaus stiklo buteliuke. Tikslus svėrinys 0,0548 g ABTS miltelių tirpinamas 50 ml išgryninto vandens, pridedama kelis lašus 70 mM kalio persulfato tirpalo. Mišinys 15 – 16 val. laikomas kambario temperatūroje, tamsioje vietoje. Motininis ABTS tirpalas skiedžiamas išgrynintu vandeniu, siekiant pagaminti darbinį ABTS•+
tirpalą.
0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas gaminamas išmatuojant 42 ml 37% vandenilio chlorido rūgšties ir ją maišant su išgrynintu vandeniu iki 1 litro.
NaOH praskiestas tirpalas gaminamas pasveriant tikslų 8,500 g natrio šarmo kiekį, ištirpinus jį išgrynintame vandenyje ir praskiedžiant iki 100 ml.
Arnow reagentas gaminamas pasveriant tikslų 10,000 g natrio molibdato kiekį, ištirpinant jį 70-80 ml išgryninto vandens. Sveriamas tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris ištirpinamas gautame tirpale ir praskiedžiamas išgrynintu vandeniu iki 100 ml.
2.5. M.officinalis žaliavų etanolinių ekstraktų spektrofotometrinė analizė
2.5.1. Bendrojo fenolinių junginių kiekio nustatymas
Nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį etanoliniuose M. officinalis ekstraktuose, atliekama spektrofotometrinė analizė panaudojant Folin-Ciocalteu reagentą. Analizei imamas 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:100) ir sumaišoma su 5 ml 0,2 N Folin-Ciocalteu reagentu. Po 4 min. įpilama 4
ml 7,5 % (W/V) Na2CO3 tirpalo, sumaišoma. Pagamintas tirpalas paliekamas stovėti 60 min. Gauto
tirpalo optinis tankis matuojamas esant 765 nm šviesos bangos ilgiui, palyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo.
9 pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė (n=3)
Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas galo rūgšties ekvivalentais (GRE) remiantis kalibracinę kreive (9 pav.) bei naudojant formulę:
c – galo rūgšties koncentracija (mg/ml); V – pagaminto ekstrakto kiekis (ml); m – atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.5.2. Bendrojo flavonoidų kiekio nustatymas
Bendras flavonoidų kiekis augaliniuose etanoliniuose ekstraktuose nustatomas veikiant aliuminio chlorido (AlCl3) su metenamino tirpalais parūgštintoje (CH3COOH) aplinkoje. Atskirose 25
ml matavimo kolbutėse gaminami tiriamasis ir palyginamasis tirpalai. Ruošiant tiriamąjį tirpalą imamas 1 ml geltonžiedžių barkūnų paruošto ekstrakto (1:100), įpilama 10 ml 96 % etanolio, 0,5 ml 33 % CH3COOH, 1,5 ml 10 % AlCl3 ir 2 ml 5 % metenamino tirpalo. Gautas kolbutės mišinys
skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25 ml žymės ir gerai išmaišoma. Pagamintas tirpalas paliekamas pastovėti 30 min.
Palyginamajam tirpalui imamas 1 ml tiriamojo etanolinio ekstrakto (1:100), pridedama 10 ml 96 % etanolio ir 0,5 ml 33 % CH3COOH tirpalo. Mišinys skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki 25 ml
ir lyginamas su palyginamuoju tirpalu. Kiekvienas etanolinis ekstraktas matuojamas mažiausiai po du kartus. Bendras flavonoidų kiekis vertinamas gautą absorbcijos dydį lyginant su etaloninio tirpalo absorbcijos dydžiu. Etaloninis ir palyginamasis rutino tirpalai gaminami vietoj 1 ml ekstrakto pilant 1 ml etaloninio rutino tirpalo. Suminis flavonoidų kiekis išreiškiamas rutino ekvivalentais (RE) (mg rutino/ml ekstrakto) pagal formulę:
mR – rutino masė etaloniniam rutino tirpalui ruošti (g);
A – tiriamojo tirpalo absorbcijos dydis; V – ekstrakto tūris (ml);
m – atsvertas žaliavos kiekis (g);
AR – etaloninio rutino tirpalo absorbcijos dydis;
VR – etaloninio rutino tirpalo tūris (ml).
2.5.3. Bendrojo fenolio rūgščių kiekio nustatymas
Kiekvienam analizės bandymui iš kiekvieno ekstrakto gaminama po du tirpalus – tiriamasis ir palyginamasis. Tiriamajam tirpalui pagaminti imamaas 1 ml tiriamojo ekstrakto, toliau pridedama į kolbutę 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo ir skiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml, sumaišoma. Tiriamojo tirpalo absorbcija matuojama esant 525 nm bangos ilgiui.
Palyginamasis tirpalas gaminamas taip pat kolbutėje imant 1 ml tiriamojo ekstrakto, pridedant 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml praskiesto natrio šarmo ir skiedžiant išgrynintu vandeniu iki 10 ml, sumaišoma.
Bendras fenolio rūgščių kiekis ekstrakte skaičiuojamas chlorogeno rūgštimi remiantis formule:
A – tiriamojo tirpalo absorbcija; m – atsvertas žaliavos kiekis (g).
2.5.4. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu Fe2+ jonų sujungimo
metodu
Fenolinių junginių chelatinis aktyvumas nustatomas remiantis spektrofotometriniu Fe2+ jonų
surišimo metodu. Šių junginių antioksidacinės savybės priklauso nuo jų gebėjimo surišti pereinamųjų metalų (Fe2+, Cu2+) jonus. Šiuo metodu chelatinės savybės vertinamos matuojant Fe (II) ir ferozino
komplekso absorbcijos sumažėjimą esant 562 nm bangos ilgiui. Tiriamasis tirpalas gaminamas paimant 1 ml tiriamojo ekstrakto (1:100), pridedant 50 µl 2mM FeCl2 ir 0,2 5mM ferozino tirpalų.
Gautas tirpalas gerai sumaišomas ir paliekamas pastovėti 10 min kambario temperatūroje. Tuščiajam bandiniui pagaminti imamas 1 ml 70 % (V/V) etanolio ir sumaišomi 50 µl 2mM FeCl2 ir 0,2 5mM
ferozino tirpalais. Palyginamasis tirpalas yra 70 % (V/V) etanolis.
Ekstrakto gebėjimas chelatuoti Fe2+ jonus išreiškiamas procentais ir apskaičiuojamas pagal
formulę:
Aa – tiriamojo bandinio absorbcijos dydis;
Ab – tuščiojo bandinio absorbcijos dydis (t = 0 min).
2.5.5. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas spektrofotometriniu DPPH radikalų sujungimo metodu
Antioksidaciniam aktyvumui vertinti naudojamas DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil) radikalų surišimo metodas pagrįstas elektronų perdavimo reakcijomis. Tiriamajam bandiniui pagaminti imamas 50µL M. officinalis ekstrakto (1:100) ir sumaišoma 1 cm kvarcinėje kiuvetėje su 2 ml 6×10-5 M DPPH paruoštu tirpalu. Tuščias bandinys ruošiamas imant 50µL 70 % (V/V) etanolio ir pridedant 2 ml 6×10-5
M DPPH tirpalo. Mišinių absorbcijos dydžiai matuojami spektrofotometriškai esant 515 nm šviesos bangos ilgiui iki tol, kol pasiekiama absorbcijos pusiausvyra (~po 30 min.)
Tiriamųjų ekstraktų antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas surišto DPPH (%) ir skaičiuojama pagal formulę:
Aa – tiriamojo bandinio absorbcijos dydis (t = 30 min);
2.5.6. Antioksidacinio aktyvumo įvertinimas ABTS˙+ radikalų surišimo metodu
Antiradikaliniam aktyvumui nustatyti taikomas ABTS (2,2‘-azino-bis-(3-etibenzotiazolino-6-sulfono) rūgštis) radikalo surišimo metodas. Reagentas gaminamas sveriant 0,0548 g (tikslus svėrinys), kuris tirpinamas 50 ml išgryninto vandens. Motininis tirpalas aktyvuojamas 70 mM kalio persulfato tirpalu. Sumaišoma ir paliekama tamsioje vietoje 15-16 val. Pasiekus reakcijos pusiausvyrai gaminamas darbinis ABTS˙+ tirpalas skiedžiant jį išgrynintu vandeniu, kol gaunama tiksli tirpalo
absorbcija (0,800 ± 0,03), esant 734 nm bangos ilgiui. Palyginamasis tirpalas yra išgrynintas vanduo. M. officinalis etanolinių ekstraktų gebėjimas surišti radikalus matuojamas į 3,0 ml darbinio ABTS˙+ tirpalo įpilant 30 µL tiriamojo ekstrakto. Gautas mišinys laikomas 1val. kambario
temperatūroje. Absorbcija matuojama esant 734 nm bangos ilgiui.
Antiradikalinis M. officinalis ekstraktų aktyvumas skaičiuojamas išreiškiant trolokso ekvivalentais (TE) 1 gramui žaliavos:
c – trolokso koncentracija remiantis kalibracijos kreive (µmol/l); V – paruošto ekstrakto tūris (ml);
M – atsvertas žaliavos kiekis (g).
10 pav. Trolokso kalibracinė kreivė ABTS radikalų – katijonų surišimo metodu (n=3)
Antioksidanto trolokso kalibracinė kreivė sudaroma iš paruoštų penkių skirtingų trolokso koncentracijų tirpalų. Motininis trolokso tirpalas paruošiamas sveriant tikslų trolokso kiekį (g) ir
ištirpinant jį 70% etanolyje. Ruošiami 400-8000 µmol/l koncentracijų tirpalai, su kuriais toliau atliekamas ABTS tyrimas. Sudaroma kalibracinė kreivė pagal skirtingų koncentracijų trolokso tirpalų gautas absorbcija (10 pav.).
2.6. Duomenų analizė
Statistinė duomenų analizė bei grafinis rezultatų pavaizdavimas buvo atliktas su „MS Excel 2016“ (Microsoft, JAV) ir SPSS 20 (SPSS Inc., JAV) kompiuterinėmis programomis. Visi atlikti tyrimai buvo kartoti mažiausiai po tris kartus ir vėliau išvestas matematinis duomenų vidurkis, standartinė paklaida ir variacijos koeficientas. Tiesinės regresijos modelio tinkamumui apskaičiuotas determinacijos koeficientas R2. Parinktas reikšmingumo lygmuo 0,05, todėl rezultatai bus laikomi statistiškai reikšmingi, jei p<0,05. Koreliacinių ryšių įvertinimas buvo atliktas pagal Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientą.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Optimalių ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Norint teisingai ir tinkamai atlikti tyrimą, reikia optimaliai parinkti augalinių žaliavų ekstrahavimo sąlygas. Tinkamai parinkus ekstrahavimo sąlygas, bus didesnė bioaktyviųjų junginių išeiga bei mažesnė tikimybė jų degradacijai. Todėl reikia įvertinti tokių faktorių, kaip tirpiklio poliškumas, temperatūra, ekstrahavimo laikas, tirpiklio ir augalinės žaliavos santykio įtaką fenolinių junginių kiekybinei sudėčiai [4,72].
Norint tinkamai parinkti ekstrahentą reikia atsižvelgti ne tik į jo poliškumą, bet ir į prigimtį. Moksliniuose tyrimuose augalinių žaliavų ekstraktams ruošti dažnai kaip ekstrahentas yra naudojamas metanolis. Tačiau šis tirpiklis yra toksiškas, todėl šiame tyrime buvo naudojamas jo homologinės eilės narys etanolis, kuris yra labiau priimtinesnis. Parinkus tirpiklį toliau bus parenkama tinkamiausia temperatūra ir laikas, kurie bus taikomi visiems ekstraktams gaminti [7,22,72].
3.1.1. Ekstrahento poliškumo įvertinimas
Ekstrahento poliškumo vertinimui M. officinalis augalinių žaliavų ekstraktams gaminti buvo taikytas paprastosios maceracijos metodas. Ekstraktai buvo ruošiami panaudojant 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80% (V/V) koncentracijų etanolio ir vandens mišinius. Siekiant nustatyti optimaliausias ekstrahavimo sąlygas buvo naudoti M. officinalis lapai, surinkti Ukmergėje.
Gaminant ekstraktus buvo sveriama 0,100 g (tikslus svėrinys) susmulkintų geltonžiedžių barkūnų lapų bei buvo užpilama 10 ml tam tikros koncentracijos etanoliu. Todėl žaliavos ir esktrahento santykis buvo 1:100. Pagaminti mišiniai buvo purtomi 1val. automatinėje kratyklėje. Valandai praėjus ekstraktai buvo laikomi 24val. tamsioje vietoje, o vėliau vėl purtomi 1val. Toliau pro popierinį filtrą ekstraktai filtruojami į tamsaus stiklo buteliuką. Biologiškai aktyvių medžiagų kiekiui nustatyti buvo naudotas Folin-Ciocalteu metodas. Tyrimo rezultatai išreiškiami GRE ekvivalentais ir pateikiami paveiksle (11 pav.).
11 pav. Ekstrahento poliškumo vertinimas M. officinalis lapų žaliavos mėginiuose paprastosios maceracijos būdu. GRE – galo rūgšties ekvivalentai. (n=3)
Iš pateikto grafiko matoma, jog didėjant etanolio koncentracijai iki 70 %, didėja išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis. Didžiausias fenolinių junginių kiekis buvo gautas su 70 % etanoliu (15,427 ± 0,421 mg/g). Esant didesnei etanolio koncentracijai biologiškai aktyviųjų junginių kiekis mažėjo. Vadovaujantis gautais duomenimis tolimesniems tyrimams M. officinalis žaliavų ekstraktai buvo gaminami panaudojant 70 % etanolio-vandens mišinį siekiant išgauti didžiausią fenolinių junginių išeigą.
3.1.2. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės nustatymas
Ekstrahavimo trukmei nustatyti buvo naudojamas ultragarso metodas panaudojant ultragarso vonelę. Paruošti augalinės žaliavos ekstraktai tokiu pačiu santykiu, kaip kad buvo vertinamas tirpiklio poliškumas (1:100). Šiuo atveju buvo naudojamas 70 % (V/V) etanolis, kuris prieš tai parodė didžiausią bioaktyviųjų junginių išeigą. Paruošti bandiniai buvo veikiami ultragarsu 5, 10, 15, 20 min, esant 30 ± 5oC temperatūrai. Pagamintų ekstraktų fenolinių junginių kiekis buvo vertinamas naudojant Folin – Ciocalteu metodiką. Rezultatai pateikti paveiksle (12 pav.).
12 pav. Ekstrakcijos ultragarsu trukmės vertinimas M. officinalis lapų bandiniuose. Esktrahentas 70% (V/V) etanolis. GRE – galo rūgšties ekvivalentai. (n=2)
Bandymo rezultatai parodė, jog didžiausia fenolinių junginių kiekio išeiga yra ekstrahuojant ultragarsu 10 min (16,815 ± 0,251 mg/g). Tačiau ekspozicijos ultragarsu trukmei ilgėjant biologiškai aktyviųjų junginių kiekis mažėja, kadangi gali vykti įvairūs jų degradacijos procesai. Tolimesniems tyrimams parinkta ekstrakcija ultragarsu, nes jau po 10 min yra gaunama didesnė fenolinių junginių išeiga palyginus su jų kiekiu taikant maceracijos metodą.
3.1.3. Ekstrakcijos ultragarsu temperatūros nustatymas
Nustatant optimalią temperatūrą, kurioje išekstrahuotų fenolinių junginių kiekis būtų didžiausias, atliekamas tyrimas panaudojant 70 % (V/V) etanolio ir vandens mišinį, bei veikiami bandiniai ultragarsu 10 min. Norint parinkti tinkamą temperatūrą, paruošiami mėginiai ekstrakcijos procesui, kuris vyks esant 30 oC, 40 oC, 50 oC, 60 oC. Gauti rezultatai pateikiami paveiksle (13 pav.).
