LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGIJOS CHEMIJOS KATEDRA
AGNĖ BANELYTĖ
FENOLINIŲ JUNGINIŲ, FLAVONOIDŲ IR ANTIOKSIDANTINIO
AKTYVUMO ĮVERTINIMAS PAPRASTŲJŲ KMYNŲ
(Carum carvi L.) AUGALINĖJE ŽALIAVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc., dr. Rūta Marksienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGIJOS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Prof., dr. Vitalis Briedis 2015 m. Birželis
FENOLINIŲ JUNGINIŲ, FLAVONOIDŲ IR ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS PAPRASTŲJŲ KMYNŲ (Carum carvi L.) AUGALINĖJE ŽALIAVOJE
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Doc., dr. Rūta Marksienė
2015 m.
Recenzentas Darbą atliko Vardas Pavardė Magistrantė Agnė Banelytė
2015 m. 2015 m. gegužės 29 d.
TURINYS
SANTRAUKA... 5 SUMMARY... 6 PADĖKA ... 7 SANTRUMPOS ... 8 ĮVADAS ... 9DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 10
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
1.1. Paprastasis kmynas (Carum carvi L.) ... 11
1.1.1. Paprastojo kmyno apibūdinimas ... 11
1.1.2. Carum carvi L. morfologiniai požymiai ... 12
1.1.3. Paprastojo kmyno rinkimas, džiovinimas ir laikymas ... 12
1.1.4. Carum carvi L. biologiškai aktyvios medžiagos ... 12
1.1.5. Paprastojo kmyno farmakologinė reikšmė ... 13
1.2. Fenoliniai junginiai ... 15
1.2.1. Flavonoidai ... 15
1.2.2. Flavonoidų reikšmė medicinos praktikoje ... 17
1.2.3. Fenolinių junginių ir flavonoidų bendrojo kiekio nustatymo metodai ... 18
1.3. Antioksidantai ... 19
1.3.1. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai ... 20
1.4. Literatūros apžvalgos apibendrinimas ... 22
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 23
2.1. Tyrimo objektas ... 23
2.2. Naudoti reagentai ... 23
2.3. Naudota aparatūra ... 24
2.3. Duomenų statistinis vertinimas ... 24
2.4. Tyrimo metodai ... 24
3. REZULTATAI ... 27
3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas kmyno žaliavos ekstraktuose Folin – Ciocalteu reagentu 27 3.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas Carum carvi L. augalinėje žaliavoje ... 31
3.3. Paprastojo kmyno ekstraktų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas lasivųjų radikalų surišimo metodu... 34
3.4. Koreliacinių ryšių įvertinimas... 38
5. IŠVADOS ... 41 6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 42 7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 43
SANTRAUKA
A. Banelytės magistro baigiamasis darbas/ mokslinė vadovė doc.dr. R. Marksienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Farmacijos fakulteto Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas.
Raktiniai žodžiai: kmynas, fenoliniai junginiai, flavonoidai, antioksidantinis aktyvumas Tyrimo tikslas: įvertinti Lietuvoje kultivuojamo „Gintaras“ veislės, natūraliai augančio laukinio, vaistinėje ir prekybos centre įsigytų skirtingų gamintojų paprastųjų kmynų (Carum carvi L.) augalinėse žaliavose bendrą fenolinių junginių, flavonoidų kiekius ir antioksidantinį aktyvumą;
Tyrimo uždaviniai: Naudojant regimojo spektro absorbcinę spektrofotometriją nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį paprastųjų kmynų augalinėse žaliavose; Įvertinti bendrą flavonoidų kiekį Carum carvi L. augalinėse žaliavose naudojant regimojo spektro absorbcinę spektrofotometriją; Naudojant 2,2-difenil-1-pikrazilo radikalo surišimo metodą įvertinti augalinės žaliavos antioksidantinį aktyvumą; Įvertinti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių, bei tarp fenolinių junginių ir antioksidantinių medžiagų kiekių
Metodai: kmyno žaliavos ekstrahuotos ultragarso vonelėje 20 min, ekstrahentą naudojant 80 proc. etanolį. Bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometru naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatus išreiškiant pagal galo rūgšties ekvivalentą mg/g. Nustatant bendrą flavonoidų kiekį ekstraktuose taikyta reakcija su AlCl3, rezultatai išreiškti pagal katechino ekvivalentą mg/g. Antioksidantinių medžiagų kiekiui nustatyti ekstraktuose naudotas DPPH˙ laisvųjų radikalų surišimo metodas, rezultatus išreiškiant pagal trolokso ekvivalentą mg/g.
Rezultatai: didžiausias fenolinių junginių kiekis nustatytas kmyno lapuose (128,767 ± 0,707 mg/g – 140,293 ± 1,284 mg/g). Suminis fenolinių junginių kiekis didesnis 2,786 proc. 2014 m. surinktuose Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės kmyno vaisiuose nei surinktuose 2013 m. Didžiausias suminis flavonoidų kiekis nustatytas kmyno žieduose (14,362 ± 0,313 mg/g – 16,493 ± 0,200 mg/g). 2014 m. surinktuose Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės kmyno vaisiuose flavonoidų daugiau 33,816 proc. nei surinktuose 2013 m. Antioksidantinių medžiagų daugiausiai nustatyta „Gintaras“ veislės kmyno vaisiuose (0,698 ± 0,005 mg/g), mažiausias kiekis – šaknyse (0,588 ± 0,009 mg/g). 2014 m. surinktuose Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės kmyno vaisiuose suminis antioksidantinių junginių kiekis yra 1,800 proc. didesnis nei surinktuose 2013 m. Antioksidantinių medžiagų ir flavonoidų kiekiai yra statistiškai priklausomi nuo fenolinių junginių kiekio.
SUMMARY
Master thesis by A. Banelytė, supervised by PhD., assoc. prof., R. Marksienė; Lithuania health sciences university Faculty of Farmacy department of Analytical and Toxicological Chemistry – Kaunas.
Keywords: caraway, phenolic compounds, flavonoids, antioxidant activity.
The aim: to evaluate total content of phenolic compounds, flavonoids and antioxidant activity in Lithuania cultivated „Gintaras“ species, wild naturally growing, acquired in pharmacy and supermarket caraway source materials.
Objective of the study: to determine total content of phenolic compounds in caraway raw plant materials using spectrophotometry; to determine total content of flavonoids in Carum carvi L. raw plant materials; to evaluate antioxidant activity of caraway raw plant materials, using DPPH free radical scavening method; to compute correlation between phenolic compound and flavonoids, and phenolic compounds and antioxidant substances.
Research methods: caraway samples were extracted using ultrasonic sound assisted extraction for 20 min with 80% ethanol as extractant. Total phenolic compounds determined using spectrophotometric Folin – Ciocalteu method, results expressed as galic acid equivalent mg/g. To determine total content of flavonoids expressed as katechin equivalent mg/g, was used reaction with AlCl3. Antioxidant content of extracts was determined using DPPH free radical scavenging method, expressed as trolox equivalent mg/g.
Results: the maximum quantity of phenolic compounds were determined in caraway leaves (128,767 ± 0,707 mg/g – 140,293 ± 1,284 mg/g). Total phenolic content 2,786% major in 2014 years Lithuania cultivated “Gintaras” species seeds than cultivated in 2013 years. The maximum total content of flavonoids determined in caraway flowers (14,362 ± 0,313 mg/g – 16,493 ± 0,200 mg/g). In 2014 years collected “Gintaras” specie caraway seed total content of flavonoids were 33,816 % major than in collected 2013 years. The maximum quantity of antioxidant substances is determined in “Gintaras” caraway specie seeds (0,698 ± 0,005 mg/g), the lowest – in roots (0,588 ± 0,009 mg/g). 2014 years cultivated in Lithuania “Gintaras”caraway specie seeds had 1,800% major antioxidant subjstances than in 2013 cultivated. Total content of antioxidant substances and flavonoids are statistical dependence on total phenolic compounds.
PADĖKA
Dėkoju magistro darbo vadovei doc., dr. Rūtai Marksienei už konsultacijas, analizinės ir toksikologinės chemijos katedros doktorantui Mindaugui Marksai už pagalbą atliekant tyrimus ir praktiškus patarimus.
Taip pat dėkoju už ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno žaliavą ūkininkams V. ir A. Ramanauskams.
SANTRUMPOS
ABTS – 2,2`azino-bis(3-etilenbenzotiazolin-6-sulfono rūgštis)
(2,2`-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))
CUPRAC - vario redukcijos antioksidantinė galia (angl. cupric reduction assay) DNPH – 2,4-dinitrofenilhidrazinas (2,4-dinitrophenylhydrazine)
DPPH – 2,2-difenil-1-pikrazilas (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
FRAP – geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. ferric reducing antioxidant power) HAT – vandenilio atomo perdavimas (angl. Hydrogen atom transfer)
ORAC – deguonies radikalų absorbcijos galia (angl. Oxygen radical absorbance capacity) RNS – reaktyvios azoto formos (angl. Reactive nitrogen species)
ROS – lasivieji deguonies radikalai (angl. Reactive oxygen species) SET – elektronų perdavimas (angl. Single electron transfer)
ĮVADAS
Laisvieji radikalai yra nestabilios molekulės, susidarančios žmogaus organizme ne tik savaiminių procesų tokių kaip maistinių medžiagų metabolizmas, energijos virsmai, bet ir dėl įvairių veiksnių susijusių su oro užterštumu, rūkymu, netinkama mityba ar fiziniu krūviu. [1] Šios mažos molekulės sukelia oksidacinį stresą, kuris siejamas su įvairių ligų atsiradimu ar senėjimo procesu. Ląstelių oksidacijos galima išvengti ar ją sulėtinti į mitybos racioną įtraukus medžiagas pasižyminčias antioksidantinėmis savybėmis. [2]
Vienas iš augalų, pasižyminčių antioksidantiniu aktyvumu, yra plačiai pasaulyje paplitęs paprastasis kmynas (Carum Carvi L.). Lietuvoje šio augalo vaisiai nuo seno vartojami ne tik kaip prieskonis maisto gamyboje, bet ir medicininiais tikslais. Cheminių komponentų visuma apsprendžia kmyno vartojimą esant virškinamojo trakto negalavimams susijusiems su dispepsija, pilvo pūtimu, vidurių užkietėjimu ar viduriavimu. [3, 4] Kmynas taip pat pasižymi antimikrobiniu, diuretiniu, žindančių moterų pieno laktaciją skatinančiu poveikiu. [5, 6, 7] Stebimas antioksidantinis poveikis lemia kepenis apsaugantį, svorį mažinantį poveikį. [8, 9, 10]
Ekologiškai kultivuojami „Gintaras“ veislės ir natūraliai augantys paprastieji kmynai kaip tiriamasis magistrinio darbo objektas pasirinkti neatsitiktinai. Tai nulėmė virškinimo sutrikimų aktualumas vaistinės pacientams, vis labiau populiarėjanti ekologijos tema ir per pastarąjį dešimtmetį padidėjęs mokslininkų susidomėjimas kmynu ne tik dėl eterinių aliejų, bet ir flavonoidų ir jų antioksidantinio aktyvumo. Lietuvoje atlikta vos keletas tyrimų susijusių su kmyno fenoliniais junginiais, flavonoidais ir antioksidantinėmis savybėmis, o palyginamųjų tyrimų tarp natūraliai augančio ir ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės, įsigytų skirtingų gamintojų vaistinėje ir prekybos centre paprastojo kmyno vaisių cheminės sudėties ar poveikio nėra. Tikimasi, jog atliekamas suminis fenolinių junginių, flavonoidų ir antioksidantinių medžiagų kiekio nustatymas natūraliai augančio, ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės ir skirtingų gamintojų vaistinėje ir prekybos centre įsigytose kmyno žaliavose, turės teorinės ir praktinės reikšmės tolimesniuose moksliniuose tyrimuose.
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: įvertinti Lietuvoje kultivuojamo „Gintaras“ veislės, natūraliai augančio laukinio, vaistinėje ir prekybos centre įsigytų skirtingų gamintojų paprastųjų kmynų (Carum carvi L.) augalinėse žaliavose bendrą fenolinių junginių, flavonoidų kiekius ir antioksidantinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Naudojant regimojo spektro absorbcinę spektrofotometriją nustatyti bendrą fenolinių junginių kiekį paprastųjų kmynų augalinėse žaliavose.
2. Įvertinti bendrą flavonoidų kiekį Carum carvi L. augalinėse žaliavose naudojant regimojo spektro absorbcinę spektrofotometriją.
3. Naudojant 2,2-difenil-1-pikrazilo radikalo surišimo metodą įvertinti augalinės žaliavos antioksidantinį aktyvumą.
4. Įvertinti koreliacinius ryšius tarp fenolinių junginių ir flavonoidų kiekių, bei tarp fenolinių junginių ir antioksidantinių medžiagų kiekių.
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Paprastasis kmynas (Carum carvi L.)
1.1.1. Paprastojo kmyno apibūdinimas
1 pav. Paprastasis kmynas [11] 2 pav. Paprastojo kmyno vaisiai
Paprastasis kmynas (lot. Carum carvi L.) priklauso skėtinių (Umbelliferae), kitaip vadinamų salierinių (Apiaceae Lindl.) šeimai. Tai plačiai pasaulyje paplitęs žolinis augalas, kuris savaime auga Šiaurės Amerikoje, Naujojoje Zelandijoje ir beveik visoje Eurazijoje, išskyrus šiauriausias vietas ir Pietų Azijos dalį. Lietuvoje augančios Carum L. genties paprastasis kmynas auga pievose, miškų aikštelėse, pakėlėse ar palaukėse. Paprastasis kmynas žydi gegužės – birželio mėnesiais, vaisius subrandina liepą – rugpjūtį. [12]
Kmynas gali būti ne tik savaime augantis, bet ir kultivuojamas, sėjant puveningose, nerūgštaus priemolio ar priesmėlio dirvožemiuose. Lietuvoje auginami „Kančevitstkij“, „Rekord“ veislių kmynai, tačiau intensyviausiai kultivuojamas – 1998 m. Lietuvos žemės ūkio universitete (nuo 2011 m. birželio 28 d. Aleksandro Stulginskio universitetas) išvestas ir registruotas „Gintaras“ veislės paprastasis kmynas. [13]
1.1.2. Carum carvi L. morfologiniai požymiai
Paprastasis kmynas – dvimetis, plikas, žolinis augalas, pirmaisiais metais išauginantis lapų skrotelę. Kmyno stiebas stačias, briaunotai vagotas, šakotas užauga 30 – 100 cm aukščio. Lapai pailgi, pražanginiai, 2 - 3 kartus smulkiai plunksniškai skaldyti su linijiškai smailiom skiltelėm. Apatiniai lapai kotuoti, o viršutiniai bekočiai prie pagrindo sudarantys lapamakštį. Šaknis liemeninė, cilindriška arba verpstiška, ilga ir mėsinga, mažai šakota. [12] Žiedyną sudaro 4 – 8 cm skersmens sudėtinis skėtis, kuriame žiedai smulkūs su beveik nepastebima taurele. Vainiklapiai dažniausiai būna 5, baltos arba rausvos spalvos, atvirkščiai širdiški su užlenktu į vidų liežuvėliu. Kuokeliai taip pat 5, mezginė apatinė, dvilizdė su dviem liemenėliais. Vaisiai – pailgi, elipsiški 3 – 6 mm ilgio, 1 – 1,5 mm pločio skeltavaisiai, pasižymintys charakteringu aromatingu kvapu ir karčiu skoniu. Vaisiukai penkiabriauniai, rudi su balkšvomis plonomis gyslomis briaunose. [12]
„Gintaras“ veislės paprastasis kmynas išsiskiria tuo, jog užauga 71 – 82 cm aukščio ir turi tolygiai subręstančias mažai išbyrančias sėklas. [13]
1.1.3. Paprastojo kmyno rinkimas, džiovinimas ir laikymas
Vaistinė, farmakopėjinė žaliava – kmynų merikarpiai, yra renkami pradėjus ruduoti vaisiams - liepos mėnesio gale ar rugpjūčio mėnesio pradžioje, kuomet paruduoja apie 30 proc. vaisių. Tinkamiausias laikas stiebų su vaisiais ant skėtelių pjovimui yra rytas arba vakaras, nes tuomet kmyno vaisiai mažiausiai byra. Vaisiai pjaunami su stiebais, kurie surišami į šluoteles ir baigiami nokinti kambario temperatūroje, po šluotele patiesiant patiesalą nukritusiems vaisiams surinkti. Sunokusius, iškultus ir išvalytus vaisius papildomai reikia džiovinti vėdinamoje patalpoje, paskleidus plonu sluoksniu, o po to supakuoti į tankaus audinio maišelius. Vaisiai tinkami vartoti 2 – 3 metus. [12] Vartojimo laiką riboja tai, jog laikymo metu kinta cheminė sudėtis.
1.1.4. Carum carvi L. biologiškai aktyvios medžiagos
Cheminė kmyno sudėtis priklauso nuo kmyno veislės, dirvožemio sąlygų, organo, kuriame ji tiriama, meteorologinių veiksnių – drėgmės ir temperatūros bei jų santykio. [14, 15] Farmakopėjinėje
paprastojo kmyno žaliavoje – vaisiuose yra reglamentuojamas eterinių aliejų kiekis, kurio išdžiovintoje žaliavoje turi būti ne mažiau 30 mg/kg. [16] Merikarpiuose eterinio aliejaus kiekis paprastai svyruoja nuo 3 proc. (30 mg/kg) iki 7 proc. (70 mg/ kg). Jį sudaro (S)-(+)- karvonas (50 – 65 proc.), (R)-(+)-limonenas (iki 45 proc.), maži kiekiai α – pineno (5,21 proc.), ᵦ - pineno, cis – karveolio (5,01 proc.), ᵦ -mirceno (4,67 proc.), p – cimeno, terpineno, miristicino, elemicinas, linalolio, karvenono. [5, 17, 18, 19, 20, 21, 22] Be eterinių aliejų didelę fitocheminės sudėties dalį sudaro riebalinis aliejus (10 - 21 proc.), kuriame dominuoja palmitinas (3,6 proc.), oleinas (60,7 proc.), linoleinas (19,6 proc.), petroselinas (17 proc.), germakrenas. [15, 18, 23, 24] Kmyno vaisiuose baltymai sudaro apie 20 proc., angliavandeniai apie 15 proc., vanduo nuo 9 iki 13 proc. [25] Apie 25 mg/g išreikštų galo rūgšties ekvivalentu, kmyno vaisiuose sudaro fenoliniai junginiai. Flavanoidai sudaro apie 11,77 mg/g, išreikštų katechino ekvivalentu. [26] Dominuojantys flavonoidai – kvercetinas ir kemferolis. [18] Nustatomi ir kiti fenoliniai junginiai tokie kaip flavonolis izoramnetinas, furano kumarino dariniai - bergaptenas ir ksantotoksinas, bei fenolinės rūgštys - kavos, chlorogeno, neochlorogeno, kofeino, ferulo, protokatechnino, siringinė. [17, 18, 27]
Carum carvi L. lapuose nustatyti nedideli kiekiai kvercetino-3-gliukuronido, izokvercetino,
kvercetino 3-O-kofeino gliukozido bei izoramnetino glikozido. [28]
Žieduose – kemferolio, izokvercetrino, astragalino, hiperozido. [29]
Šaknyse flavonoidų kiekis labai mažas – apie 0,312 mg/g išdžiovintoje žaliavoje. [30]
1.1.5. Paprastojo kmyno farmakologinė reikšmė
Paprastasis kmynas (Carum carvi L.) yra vartojamas ne tik kaip prieskonis maisto ir gėrimų pramonėje, bet ir medicininiais tikslais. Cheminių komponentų visuma apsrendžia, jog kmynas vartojamas gydant virškinamojo trakto negalavimus tokius kaip dispepsija, pilvo pūtimas, viduriavimas, bei spazmolitiniai sutrikimai. [3, 4, 31] Kmynas yra žinomas kaip atsikosėjimą gerinantis, diurezę ir žindančių moterų pieno laktaciją skatinantis žolinis augalas, kuris pasižymi dar ir antimikrobiniu, antioksidantinu ir kepenis apsaugančiu poveikiu. [6, 8, 9, 32, 33] Nustatyta, kad kmynas mažina hiperglikemiją ir hiperlipidemiją, todėl tinkamas II tipo cukrinio diabeto gydymui bei širdies ir kraujasgyslių ligų profilaktikai. [26, 34] Paprastojo kmyno komponentai karvonas ir limonenas turi gleives apsaugantį poveikį skrandžio ir dvylikapiršės žarnos opų metu. [33, 35]
Diuretinis poveikis. Kmyno vandeninio ekstrakto poveikis yra tapatinamas su kilpinio diuretiko furozemido poveikiu, nes slopindamas natrio ir kalio jonų rezorbciją padidina jų ekskreciją su šlapimu, nekeičiant kraujo plazmoje esančio natrio ir kalio jonų kiekio. Šlapimo išsiskyrimą
didinančiu, skatinančiu natrio ir kalio ekskreciją poveikiu pasižymintis kmynų vandeninis ekstraktas neturi toksinio poveikio inkstams, kuris pagrįstas tiriant inkstų kreatinino klirensą. [6] Be to, kad kmyno ekstraktas nepasižymi toksiškumu inkstams, atlieka inkstus apsaugantį poveikį diabetinės nefropatijos metu. Manoma, jog tai gali būti karvono, limoneno antioksidantinio poveikio rezultatas. [32, 36]
Nesusijusios su opomis (funkcinės) dispepsijos mažinantis kmyno poveikis susijęs su vietiškai skrandyje ir dvylikapirštėje žarnoje lygiuosius raumenis atpalaiduojančiu veikimu, ko pasekoje sumažėja maudimas viršutinėje pilvo dalyje, jaučiamas pilnumo jausmas, pilvo pūtimas, pykinimas ar rėmens graužimas. [3, 4, 31]
Antimikrobinis poveikis nustatytas tiek prieš gram teigiamas tiek prieš gram neigiamas bakterijas. Didelis antimikrobinis aktyvumas yra prieš Clavibacter, Curtobacterium, Rhodococcus,
Erwinia, Xanthomonas, Ralstonia ir Agrobacterium, kuri sukelia augalų ir kultivuojamų grybų ligas,
genčių bakterijas. Mažesnis aktyvumas nustatytas prieš Pseudomonas genties bakterijas. Šis antibakterinis poveikis siejamas su eterinių aliejų komponentais: karvonu, limonenu, germakrenu. [24] Kmynų eterinis aliejus taip pat pasižymi antibakteriniu poveikiu prieš Staphylococcus aureus ir
Escherichia coli bakterijas, bei poveikiu mikroskopinio grybo Aspergillus flavus išskiramiems
mikotoksinams - aflatoksinui B1 ir aflatoksinui G1. [5, 7]
Antioksidantinis aktyvumas ir kepenis apsaugantis kmyno eterinio aliejaus poveikis stebimas tiek in vitro tiek in vivo. Antioksidantinės savybės grindžiamos ABTS˙+
(2,2`-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ir DPPH˙ (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) radikalų surišimu, superoksido radikalo neutralizavimu. Kepenis apsaugantis poveikis demonstruojamas naudojant anglies tetrachloridą kaip modelį atspindintį hepatoksiškumą, susijusį su riebalų degeneracija, fibroze, kancerogeniškumu. Anglies tetrachlrido (CCl4) reakcijos su deguonimi metu suformuojamas CCl3 -OO* radikalas. Šiam radikalui sąveikaujant su lipidais įvyksta lipidų peroksidacija. Lipidų peroksidacijai būdinga grandininė reakcija susidarant vis naujiems radikalams, kol neįvyksta baigmės reakcija. Viena peroksiduoto lipido molekulė gali sukelti kitų lipidų peroksidaciją, taip sukeliant daugelio molekulių pažaidą. Grandininė reakcija nutraukiama, jei du laisvieji radikalai susijungia ir sudaro produktą, kuris nėra radikalas. Nustatyta, jog kmyno sudėtyje esantys cheminiai komponentai geba nutraukti grandinines reakcijas ir taip apsaugoti ląsteles nuo peroksidacijos. [8, 9]
Svorį mažinantis poveikis siejamas su antimikrobinėmis, priešuždegiminėmis ir antioksidantinėmis kmyno savybėmis, kurias lemia cheminiai kmyno komponentai tokie kaip polifenoliai, karvakrolis, nesočiosios riebalų rūgštys. Šie biologiškai aktyvūs komponentai subalansuoja virškinamojo trakto mikroflorą taip pagerindami maistinių medžiagų virškinimą ir absorciją. Subalansuota mikroflora slopina makrofagų patekimą į riebalinius audinius taip
sutrikdydami ląstelių diferenciaciją, o nesočiosios riebalų rūgštys skatina riebalų rūgščių oksidaciją, ko pasekoje vyksta lipolizė. [10]
1.2. Fenoliniai junginiai
Fenoliniai junginiai arba polifenoliai – tai didelė grupė biologiškai aktyvių medžiagų, antriniai augalų metabolitai, esantys atsakingi už pagrindines augimo, apsaugines, bei organoleptines augalo savybes, dalyvaujantys ląsteliniuose ir tarpląsteliniuose fiziologiniuose procesuose. [37, 38] Tai junginiai savo struktūroje turintys vieną ar daugiau tiesogiai prie vieno ar kelių aromatinių žiedų prisijungusių hidroksilo (-OH) grupių. [38] Fenoliniai junginiai pagal molekulės struktūrą yra skirstomi į: flavonoidus, fenolines rūgštis, ligninus, stilbenus, chinonus, kumarinus, ksantonus ir chromonus. [39]
3 pav. Fenolinių junginių klasifikacija
1.2.1. Flavonoidai
Didžiausia fenolinių junginių grupė, kurioje identifikuota daugiau kaip 8000 skirtingos cheminės struktūros biologiškai aktyvių medžiagų – flavonoidai (lot. Flavus - geltonas). Jų struktūros pagrindą sudaro flavanas (γ pirono žiedas), charakteringa penkiolikos anglies atomų konfigūracija.
Fenoliniai junginiai
Flavonoidai Fenolinės
Natūraliai flavonoidai egzistuoja kaip aglikonai, monoglikozidai arba diglikozidai. Gamtoje flavonoidai labiausiai paplitę O-glikozidų, šiek tiek rečiau C-glikozidų forma. Dažniausiai flavonoiduose pasitaikantys cukrūs, kurie prisijungę C3 arba C7 padėtyje: L-ramnozė, D-gliukozė, gliukoramnozė, galaktozė ir arabinozė. [37]
4 pav. Flavonoido aglikono struktūros pagrindas
Flavonoidai gali būti klasifikuojami atsižvelgiant į cheminę struktūrą, heterociklo dydį, cukrų molekulių kiekį, šoninių radikalų padėtį ar propano fragmento oksidacijos laipsnį. [40] Klasifikuojant pagal cheminę sandarą ir propano fragmento oksidacijos laipsnį flavonoidai skirstomi į turinčius ir neturinčius C3 padėtyje hidroksilo grupę (-OH), bei kitus flavonoidus, kurie nepriskiriamai nei vienai iš šių grupių.
Flavonoidai, kurie turi hidroksilo grupę C3 padėtyje skirtomi į:
• Flavonolius – kvercetinas, kemferolis, galanginas, fisetinas, miricetinas, viteksikarpinas. • Flavanonus – taksifolinas.
• Flavan – 3 – olius (katechinus) – katechinas, epikatechinas, galokatechinas.
• Antocianidinus – pelargonidinas, malvidinas, cianidinas, cianinas, delfinidinas, peonidinas. Flavonoidai, neturintys hiroksilo grupės C3 padėtyje skirstomi į:
• Flavonus – apigeninas, liuteolinas, chrisinas, diosminas.
• Flavanonus – hesperidinas, naringeninas, naringinas, pinocembrinas, likviritigeninas, eriodicitolis.
Kiti flavonoidai:
• Flavonoidų kondensacijos produktai - biflavonoidai, poliflavonoidai.
• Auronai ir auronoliai, kurie aptinkami glikozidų pavidalu, turintys stuktūroje penkianarį furano žiedą (pavyzdžiui, gispidolis).
• Izoflavononai, kurių struktūroje benzeno žiedas prijungtas ne prie C2, o prie C3 (pavyzdžiui, ononinas).
Nustatyta, jog flavonoidai, turintys dvi funkcines –OH grupes B žiedo orto- padėtyje, C2 – C3 dvigubą jungtį konjuguotą su funkcine okso- grupe C žiedo 4- padėtyje, taip pat funkcines –OH grupes C žiedo 3- ir A žiedo 5- padėtyje, pasižymi stipriausiomis antioksidantinėmis savybėmis. [41]
1.2.2. Flavonoidų reikšmė medicinos praktikoje
Apie flavonoidus, kaip svarbią dalį žmogaus mitybos racione užimančius cheminius junginius, pradėta kalbėti tuomet, kai buvo nustatyta, jog viduržemio jūros regionuose, nepaisant didelio sočiųjų riebalų kiekio suvartojimo, sergamumas širdies ir kraujagyslių ligomis yra labai mažas, o tai lemia suvartojamas raudono vyno kiekis. [42] Ši sąsaja grindžiama tuo, jog raudonąjame vyne yra daug flavonoidų, iš kurių vyraujantis yra katechinas, taip pat kitų fenolinių junginių tokių kaip galo rūgštis, epikatechinas, malvidino-3-gliukozidas, miricetinas, kvercetinas, bei ne flavonoidinių junginių – resveratrolio ir jo glikozidų. Visi šie junginiai slopina ląstelėse vykstančius oksidacinius procesus, įtakojančius lėtinių ligų atsiradimo riziką. Be to, flavonoidai slopindami trombocitų agregaciją – mažina trombų susidarymo ar išemijos tikimybę.
Flavonoidų antioksidantinis poveikis siejamas su vėžio atsiradimo rizikos mažinimu. Tiek in
vivo tiek in vitro stebimas burnos gleivinės, krūtinės, žarnyno, prostatos vėžinių ląstelių dalijimosi
slopinimas. [2, 43]
Nustatytas priešuždegiminis sistemiškai vartojamų flavonoidų poveikis siejamas su ciklooksigenazės ir 5-lipooksigenazės slopinimu, kurios svarbios arachidono rūgšties metabolizme. Kaikurių uždegimo simptomų geresni slopinimo (pavyzdžiui, edemos) rodikliai stebimi flavonoidus vartojant ne sistemiškai, o vietiškai. Nustatyta, kad apigeninas ir kvercetinas teigiamai veikia fibroblastų gebėjimą dalytis, kuris yra svarbus faktorius žaizdų gijime.
Be šių pagrindinių flavonoidų savybių nustatytas izoflavonoido genisteino estrogeninis poveikis, susijęs su folikulus stimuliuojančiu hormonu, kuris yra svarbus moterims, ypač pomenopauziniu laikotarpiu. Be to, flavanoidų vartojimas arbatų ar maisto papildų pavidalu mažina osteoporozės riziką. [2]
Ištyrus, jog augalams nuo patogeninių grybų padeda apsisaugoti flavonoidai, buvo pradėti tyrimai prieš įvairius žmogui patogeniškus mikroorganizmus. Nustatytas Candida albicans,
Aspergillus flavus, Aspergillus tamarii, Cladosporium shaerospermum, Penicillinum digitatum ir Penicillinum italicum dauginimąsi slopinantis poveikis, susijęs su viruso dauginimosi ir prisijungimo
poveikis prieš Staphylococcus aureus, Stapyhylococcus epidermitis, Escherichia coli, Pseudomona
aeruginosa, Klebsiella Pneumoniae. [44]
1.2.3. Fenolinių junginių ir flavonoidų bendrojo kiekio nustatymo metodai
Vaistinės augalinės žaliavos analizė, nustatant veikliųjų medžiagų kokybinius bei kiekybinius rodmenis, yra svarbi, norint užtikrinti žaliavos veiksmingumą ir saugumą. Vienas iš būdų kiekybiškai nustatyti fenolinius junginius ir flavonoidus yra naudojant UV ir regimojo spektrų absorbcinę spektrofotometriją.
Dažniausiai fenolinių junginių bendrąjam kiekiui įvertinti yra naudojami kolorimetriniai metodai su Folin – Ciocalteu reagentu ir Berlyno mėlio susidarymo metodas, nes yra paprasti, greiti ir nereikalaujantys sudėtingos aparatūros
Berlyno mėlio susidarymo metodas yra naudojamas, nustatant fenolinių junginių bendrąjį kiekį augalinėje žaliavoje. Jis paremtas polifenolinių junginių reakcija rūgštinėje terpėje su kalioheksocianoferoatu ir geležies (III) chloridu. Polifenoliai reaguoja su geležies cianido jonu (Fe(CN)6)3-) ir oksiduojasi, kai tuo metu (Fe(CN)6)3- yra redukuojamas iki geležies cianido jonų Fe(CN)64-. Tuomet reguojant Fe(CN)64- su trivalentės geležies jonu (Fe3+) susidaro Fe4-[Fe(CN)6]3 kompleksas, kuris vadinamas Berlyno mėlynuoju. [45] Tirpalo absorbcija matuojama ties 720 nm šviesos bangos ilgiu UV-Vis spektrofotometru, koncentracija apskaičiuojama naudojant tanino rūgštį kaip standartą. [46, 47] Metodas nėra selektyvus tik polifenoliniams junginiams, nes Fe3+ redukuoti iki Fe2+ gali ir kitos medžiagos, esančios augalinėje žaliavoje ir turinčios oksidacinių – redukcinių savybių.
PP + 2 Fe(CN)63- → PP + 2 Fe(CN)64-
Polifenolis Geležies cianido jonas Oksiduotas polifenolis Redukuotas geležies cianido jonas
3 Fe(CN)64- + 4 Fe3+ → Fe4[Fe(CN)6]3 Berlyno mėlis
Reakcija su Folin – Ciocalteu reagentu. Fenoliniai junginiai šarminėje terpėje, kuri sukuriama natrio karbonato tirpalu, reaguoja su fosfomolibdato ir fosfovolframo rūgčių kompleksu, esančiu Folin – Ciocalteu reagente. Reakcijos metu geltona Folin – Ciocalteu reagento spalva tampa
mėlyna dėl fosfomolibdato - fosfovolframo rūgčių redukcijos. [48] Priklausomai nuo metodikoje naudojamos natrio karbonato koncentracijos, ekstrakto ir reagentų kiekio, absorbcija matuojama po 30-60 minučių 750 nm šviesos bangos ilgyje UV-Vis spektrofotometru. Bendras fenolinių junginių kiekis paprastai išreiškiamas galo rūgšies ekvivalentu. [17, 26, 49, 50] Šis metodas taip pat nepasižymi selektyvumu tik fenoliniams junginiams, nes su Folin – Ciocalteu reagentu reaguoja ir kitos medžiagos, kurios pasižymi oksidacinėmis - redukcinėmis savybėmis (pavyzdžiui, baltymai). [51] Tačiau nepaisant to šis metodas yra taikomas beveik visuose moksliniuose tyrimuose, kuriuose analizuojami fenoliniai junginiai.
Flavonoidų bendrojo kiekio augalinėje žaliavoje įvertinimui dažniausiai yra naudojama reakcija su aliuminio (III) chloridu ir reakcija su 2,4-dinitrofenilhidrazinu.
Reakcija su AlCl3 yra pagrįsta flavonoido – aliuminio komplekso susidarymu rūgščioje
aplinkoje. [52] Aliuminio (III) chloridas suformuoja stabilius kompleksus su C-4 keto grupe bei su C-3 ir C-5 hidroksilo grupėmis flavonuose ir flavonoliuose. [53, 54] Priklausomai nuo metodikos, absorbcija matuojama pasirinktame šviesos bangų intervale, koncentraciją išreiškiant rutino, kvercetino, galo rūgšties, katechino ar kitos pasirinktos medžiagos ekvivalentu. [17, 26, 49, 52, 55]
2,4-dinitrofenilhidrazinu (DNPH) kolorimetrinis metodas. Reakcija su DNPH tinkamesnė nustatant bendrąjį flavonoidų kiekį atsižvelgiant į flavonus ir flavanonolius. Metodas paremtas 2,4-dinitrofenilhidrazono susidarymu, reaguojant 2,4-dihidrofenilhidrazinui su ketoninėmis ir aldehidinėmis grupėmis. Reakcija atliekama rūgštinėje terpėje, tirpalą kaitinant 50ºC temperatūroje 50 min. Atvėsinto kambario temperatūroje tirpalo absorbcija matuojama 495 nm šviesos bangos ilgyje. [53] Nustatyta, jog šiek tiek modifikuojant metodiką – pakeliant temperatūrą iki 80ºC, reakciją galima vykdyti 15 min, o maksimali absorbcija po atvėsinimo stebima ties 486 nm šviesos bangos ilgiu. [56] Sudarant standartinę kreivę, koncentracijai apskaičiuoti, galima pasirinkti betkurį flavoną ar flavanolį.
1.3. Antioksidantai
Yra žinoma, jog laisvieji deguonies radikalai (ROS) tokie kaip superoksido anijonas (O2-), hidroksilo (˙OH), peroksido (RO2˙), hidroperoksido (HO2˙) radikalai, bei laisvieji azoto radikalai (RNS) – azoto oksido (˙NO) ir azoto dioksido (˙NO2) radikalai – gali pažeisti lipidus ar kitas molekules, sukelti oksidacinį stresą ir inicijuoti lėtines širdies - kraujagyslių sistemos ligas, vėžį ar ląstelių senėjimą. Todėl, norint išvengti radikalų žalojančio poveikio organizmui, yra labai svarbu juos
inaktyvuoti. Junginiai, kurie geba sulėtinti ar sustabyti molekulių oksidantinius procesus, surišant laisvuosius radikalus, yra vadinami antioksidantais. [55]
Antioksidantai gali būti skirstomi į fermentinius (superoksido dismutazė, katalazė ir kt.) ir neferminius (metabolinis kofermentas Q10). Nefermentiniams antioksidantams taip pat priskiriami egzogeniniai antioksidantai, kurių gaunama su maistu ar maisto papildais, tokie kaip vitaminas E, vitaminas C, selenas, karotinoidai, omega-3 ir omega-6 riebiosios rūgštys, bei flavonoidai. [57]
1.3.1. Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai
Antioksidantai reaktyvaus deguonies (ROS) ir reaktyvaus azoto (RNS) radikalus inaktyvina dviem pagrindiniai būdais: vandenilio atomo perdavimo (HAT, angl. Hydrogen atom transfer) ir elektronų perdavimo (SET, angl. Single electron transfer) mechanizmais. Labai dažnai atomo ir elektrono perdavimo reakcijos vyksta vienu metu, kuomet dominuojantis mechanizmas priklauso nuo pačio antioksidanto ir terpės savybių. Nepaisant skirtingų mechanizmų, metodikos salygų ar reagentų, yra pasiekiamas toks pat rezultatas – neutralizuotas prooksidantas, kuris suteikia galimybę nustatyti antioksidantinį aktyvumą. [58, 59]
Taikant vandenilio atomo perdavimu pagrįstu antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodą, antioksidantas suriša laisvąjį radikalą, sudarydamas stabilų junginį, atiduodant vandenilio atomą (AH+X˙→XH+A˙). Šios reakcijos vyksta labai greitai. Tačiau šiais mechanizmais paremtų nustatytų antioksidantinių savybių negalima vertinti vienareikšmiškai, nes esant redukuojančioms priemaišoms galimi klaidingi rezultatai, rodantys didesnį antioksidantinį aktyvumą. Iš visų žinomų HAT reakcijomis pagrįstų antiokidantinio aktyvumo nustatymo metodų, dažniausiai naudojama ORAC ir krocino ar ᵦ-karoteno blukinimo metodai. [58]
ORAC (angl. Oxygen radical absorbance capacity - deguonies radikalų absorbcijos galia) metodas yra paremtas peroksido radikalo gebėjimu reaguoti su fluorescuojančia medžiaga, ją oksiduojant paversti nefluorescuojančia. Deguonies radikalų absorbcijos galia yra įvertinama matuojant fluorescencijos pokytį ir jį išreiškiant trolokso ekvivalentu. Taigi šiuo metodu galima išmatuoti antioksidanto gebėjimą slopinti oksidacijos, kurią sukėlė peroksido radikalas, procesą. [60, 59] Šis automatizuotas procesas leidžia įvertinti tiek lipofilinius tiek hidrofilinius antioksidantus. [57]
Krocino ir ᵦ-karoteno blukinimo metodas yra plačiai taikomas metodas, norint nustatyti augalų ekstraktų antioksidantinį aktyvumą. Tai in vitro tyrimas, paremtas oksidacijos proceso nulemtu reagento spalvos pokyčiu. Antioksidantai perduodami vandenilio joną stabdo peroksidų lemiamą
krocino ar ᵦ-karoteno blukimą. Metodo metu, naudojant krociną, blukimas stebimas 470 nm šviesos bangos ilgyje , o naudojant ᵦ-karoteną – 443 nm šviesos bangos ilgyje. [52, 61]
Elektrono pernešimo reakcijomis pagrįstų metodų metu yra vertinamas antioksidanto gebėjimas atiduoti vieną elektroną ir redukuoti oksidantą. Rezultatatai taip pat gali būti netikslūs kaip ir naudojant HAT reakcijomis paremtus metodus dėl redukuojančių priemaišų, pavyzdžiui, metalo jonų. Dažniausi šiomis reakcijomis pagrįsti taikomi metodai yra FRAP, CUPRAC, DPPH˙ ir ABTS˙+ radikalų surišimo metodai.
FRAP (angl. ferric reducing antioxidant power - geležies redukcijos antioksidacinė galia) metodas suteikia galimybę įvertinti antioksidantų gebėjimą redukuoti geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ kompleksą į [Fe(II)-(TPTZ)2]2+ kompleksą. Norint išvengti susidarančių [Fe(III)-(TPTZ)2]3+ komplekso nuosėdų, reakcija yra vykdoma rūgštinėje terpėje (pH 3,6). [62] Absorbcijos padidėjimas, kuris susijęs su elektronų perdavimo reakcija, intensyviai mėlynos spalvos tirpale yra matuojama 593 nm šviesos bangos ilgyje. Gautos reikšmės lyginamos su standartinių antioksidantų tirpalais, dažniausiai trolokso ar askorbo rūgšties, arba etaloniniu dvivalentės geležies jonų tirpalu. Šiuo metodu junginių gebėjimas redukuoti Fe3+ į Fe2+ prilyginamas antioksidantiniam aktyvumui, nes dvivalentė geležis yra žinoma kaip prooksidantas, surišantis žalingus laisvuosius radikalus. Šis metodas gan plačiai taikomas antioksidantinio aktyvumo įvertinimui augalų ekstraktuose dėl paprastos metodikos, tačiau turi keletą trūkumų. Kaikurios medžiagos, kurios nėra antioksidantai, taip pat gali atiduoti elektronus trivalentės geležies jonams ir ją redukuoti, taip nulemiant didesnius FRAP metodu gautus rezultatus, kurie gali būti klaidingi. [17, 63]
CUPRAC (angl. cupric reduction assay - vario redukcijos antioksidantinė galia) metodas yra paremtas dvivalenčio vario – neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) komplekso redukcija į vienvalenčio vario – neokuproino kompleksą, kur reduktorius – antioksidantas. Po įvykdytos redukcijos absorbcijos maksimumas stebimas 490 nm šviesos bangos ilgyje. Tiriamo junginio antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas iš kalibracinių kreivių, kurios dažniausiai sudaromos naudojant trolokso ar šlapimo rūgšties tirpalą. [64] Metodas, atliekamas neutalioje (pH 7) terpėje, yra pakankamai selektyvus, nes medžiagos, kurios nėra tikrieji antioksidantai, pavyzdžiui, citrinos rūgštis ar paprastieji cukrūs, CUPRAC reagentu neoksiduojami. [65]
DPPH˙ (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radikalo surišimo metodas yra plačiai naudojamas antioksidantinio aktyvumo stebėjimui. Reaguojant radikalui su antiradikaliniu aktyvumu pasižyminčiu junginiu dėl DPPH redukcijos į hidraziną vyksta DPPH tirpalo spalvos pokytis – iš violetinės spalvos pereina į šviesiai gelsvą. Metodas yra paprastas, greitas, nereikalaujantis sudėtingos aparatūros ir atliekamas kambario temperatūroje, todėl pašalinama galima tiriamų junginių terminio skilimo rizika. Tirpalo absorbcija spektrofotometru matuojama 510 - 520 nm šviesos bangos ilgyje. DPPH yra
tirpinamas organiniuose tirpikliuose, dažniausiai etanolyje, todėl yra ribojamas hidrofilinių antioksidantų duomenų interpretavimas. [17, 26, 55]
ABTS˙+ (2,2`azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) radikalo katijono
surišimo metodas taip pat yra dažnai naudojamas antioksidantinio aktyvumo stebėjimui. ABTS˙ radikalo katijonas turi būti generuojamas cheminiais reagentais (pvz., kalio persulfatu) arba fermentinių reakcijų metu (pvz., naudojant krieno peroksidazę), todėl metodas yra šiek tiek sudėtingesnis ir ilgesnis nei DPPH˙ radikalo surišimo metodas. Tačiau ABTS˙ radikalo katijonas gali būti ištirpintas tiek organiniuose tirpikliuose tiek vandenyje, todėl antioksidantinis aktyvumas gali būti vertinamas ir hidrofilinių junginių. Tirpalo absorbcija, priklausomai nuo metodikos, spektrofotometru matuojama 600 - 750 nm šviesos bangos ilgyje. [17, 26, 66]
1.4. Literatūros apžvalgos apibendrinimas
Apžvelgti moksliniai straipsniai įrodo paprastojo kmyno, kaip mokslinio tiriamojo objekto, susidomėjimą dėl plataus farmakologinio pritaikymo, kurį lemia cheminių junginių įvairovė. Kmyno žaliavos ekstraktų antioksidantinį aktyvumą, jį įtakojančius fenolinių junginių, flavonoidų kiekius galima įvertinti naudojant spektrofotometriją.
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo objektas
Tyrimui naudoti laukinio paprastojo kmyno vaisiai surinkti Skuode ir Žagarėje 2014 metais, ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės kmyno vaisiai surinkti Skaistgiryje 2013 ir 2014 metų liepos pirmąją savaitę. Taip pat 2014 m. surinkti Žagarėje laukinio ir Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno žiedai – birželio mėnesį, šaknys ir pirmų metų žolė - liepos pirmąją savaitę.
Be šių augalinių žaliavų tiriami vaistinėje įsigyti trijų skirtingų įmonių tiekiami paprastojo kmyno vaisiai: UAB „Švenčionių vaistažolių fabrikas“ (toliau - gamintojas „A“), UAB „Acorus calamus“ (toliau – gamintojas „B“), UAB „Herba Humana“ (toliau – gamintojas „C“) ir prekybos centre įsigyti dviejų skirtingų įmonių kmynų vaisiai: UAB „Sauda“ (toliau – gamintojas „D“) ir „Kamile`s Farm“ (toliau – gamintojas „E“).
2.2. Naudoti reagentai
Žemės ūkio kilmės rektifikuotas 96 proc. etilo alkoholis („UAB Stumbras“, Lietuva); Folin – Ciocalteu fenolinis reagentas (2 N; SIGMA – ALDRICH, Vokietija);
Bevandenis natrio karbonatas (≥ 99,5 proc.; SIGMA – ALDRICH, Vokietija); Natrio nitritas (≥99,0 proc.; SIGMA ALDRICH);
Bevandenis aliuminio (III) chloridas (99,99 proc.; SIGMA – ALDRICH, Vokietija); Bevandenis natrio hidroksidas (≥98 proc.; SIGMA – ALDRICH, Vokietija);
Katechinas (≥99,0 proc.; Fluka, Lenkija);
Galo rūgšis (97,5 – 102,5 proc.; SIGMA, Vokietija);
DPPH laisvasis radikalas (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl; ALDRICH, Vokietija); Distiliuotas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV).
2.3. Naudota aparatūra
Augalinė žaliava smulkinta, naudojant buitinį smulkintuvą BOSCH MKM6003 (Gerlingen, Vokietija). Ekstrakcijai ultragarsu, naudota ultragarso vonelė Biosonic UC100 Ultrasonic Cleaner Set WUC-A06H (Witeg, Wertheim, Vokietija). Tiriamųjų mėginių absorbcija matuota Halo DB – 20 UV – Vis spektrofotometru (Dynamica GmbH, Šveicarija).
2.3. Duomenų statistinis vertinimas
Duomenys statistiškai įvertinti, apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį, santykinį standartinį nuokrypį, naudojant „Microsof Office Excel 2007“. Pirsono tiesinės koreliacijos koeficientas apskaičiuotas naudojant „IBM SPSS Statisctic 20” programinę įrangą.
2.4. Tyrimo metodai
Tiriamųjų mėginių paruošimas. Paprastojo kmyno (Carum carvi L.) žaliavos džiovintos kambario temperatūroje nuo saulės šviesos apsaugotoje vietoje. Sausa žaliava smulkinta elektriniu smulkintuvu. Ekstraktai ruošti sveriant 0,5 g (0,001 g tikslumu) smulkintos augalinės žaliavos ir užpilant 10 ml ekstrakcijos tirpikliu – 80 proc. etanolio tirpalu. Ekstrakcija vykdyta 20 min ultragarso vonelėje. Atvėsintas kambarioje temperatūroje ekstraktas filtruojamas per filtrinį popierių. [27, 2]
Fenolinių junginių kiekio nustatymas. Paprastojo kmyno augalinės žaliavos ekstraktuose bendras fenolinių junginių kiekis nustatytas naudojant Folin – Ciocalteu reagentą, rezultatus apskaičiuojant remiantis galo rūgšties kalibraciniu grafiku.
Tiriamasis tirpalas ruošiamas 25 ml matavimo kolbutėje sumaišant 1 ml ekstrakto su 9 ml distiliuoto vandens, įpilant 1 ml Folin – Ciocalteu reagento ir suplakant. Po 5 min į tirpalą įpilama 10 ml 7 proc. natrio karbonato tirpalo ir praskiedžiama iki 25 ml. Tirpalo absorbcija po 90 min inkubacinio laikotarpio spektrofotometru matuojama 750 nm šviesos bangos ilgyje.
Lyginamasis tirpalas ruošiamas lygiai tomis pačiomis sąlygomis kaip tiriamasis tirpalas, tačiau vietoj kmyno augalinės žaliavos ekstrakto yra pilama 1 ml distiliuoto vandens.
Etaloniniai galo rūgšties tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamasis tirpalas, tik vietoje 1 ml ekstrakto imama 1 ml žinomų koncentracijų galo rūgšies tirpalai. [27] Naudojant galo rūgšties 80 proc. etanolinį tirpalą paruošti penkių koncentracijų galo rūgšties etaloniniai tirpalai: 02, 0,4, 0,6, 0,8 ir 1,0 mg/ml .
Pagal galo rūgšties kalibracinę kreivę, kurios determinacijos koeficentas R2 = 0,9950, apskaičiuotas fenolinių junginių kiekis mg/ml, taikant formulę:
Conc. = A1 * ABS + A0, kur A1 = 2,3144, A0 = 0,1023, ABS – tiriamo mėginio absorbcija. Rezultatai paversti į mg/g pagal galo rūgšties ekvivalentą (GAE).
Bendro flavonoidų kiekio nustatymas. Paruoštuose kmyno žaliavų ekstraktuose bendras flavonoidų kiekis nustatomas taikant reakciją su AlCl3, išreiškiant katechino ekvivalentu (KE).
Tiriamasis tirpalas ruošiamas 1 ml ekstrakto pilant į 10 ml matavimo kolbutę su 4 ml distiliuoto vandens. Tuomet į kolbutę pilama 0,3 ml 5 proc. natrio nitrito tirpalo, o po 5 minučių – 0,3 ml 10 proc. aliuminio (III) chlorido ir 2 ml 1 M natrio hidroksido. Tirpalą praskiedus distiliuotu vandeniu iki 10 ml ir sumaišius, absorbcija matuojama spektrofotometru 510 nm šviesos bangos ilgyje. Lyginamasis tirpalas ruošiamas taip pat kaip tiriamasis, tik vietoj 1 ml ekstrakto pilama 1 ml vandens.
Etaloniniai katechino tirpalai ruošiami taip pat kaip tiriamasis tirpalas, tačiau vietoj 1 ml ekstrakto pilama 1 ml atitinkamos koncentracijos katechino tirpalo. [27] Iš katechino DL 80 proc. etanolinio tirpalo ruošiami septynių koncentracijų tirpalai: 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 2,0 mg/ml.
Flavonoidų kiekis mg/ml ekstrakte apskaičiuojamas pagal katechino kalibracinę kreivę, kurios determinacijos koeficientas R2 = 0, 95460. Naudojama formulė:
Conc. = A1 * ABS + A0, kur A1 = 6,0891, A0 = -0,1218, ABS – tiriamo mėginio absorbcija. Rezultatai pervertsi į mg/g pagal katechino ekvivalentą.
DPPH laisvųjų radikalų surišimo gebos nustatymas spektrofotometriškai. Tiriamąjam mėginiui paruošti imama 0,5 ml ekstrakto ir pilama į kiuvetę, kurioje yra 2 ml 0,004 proc. DPPH tirpalas. Mėginiai laikomi 60 min tamsoje, kambarioje temperatūroje. Tuomet matuojama absorbcija spektrofotometru 517 nm šviesos bangos ilgyje.
Lyginamasis tirpalas – 0,004 proc. DPPH 96 proc. etanolyje tirpalas. [27]
Antioksidantinis aktyvumas mg/ml nustatomas pagal trolokso kalibracinę kreivę, kurios determinacijos koeficientas R2 = 0,9500. Naudojama formulė:
Conc. = A1 * ABS + A0, kur A1 = - 0,0533, A0 = 0,0394, ABS – tiriamo tirpalo absorbcija. Rezultatai išreikšti mg/g pagal trolokso ekvivalentą (TE).
3. REZULTATAI
3.1. Fenolinių junginių kiekio nustatymas kmyno žaliavos ekstraktuose Folin –
Ciocalteu reagentu
Nustatytas bendras fenolinių juginių kiekis Lietuvoje natūraliai Skuode ir Žagarėje augančio, Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno (Carum Carvi L.) bei skirtingų gamintojų, įsigytų vaistinėje ir prekybos centre, paprastojo kmyno žaliavų etanoliniuose ekstraktuose.
Tyrimo metu pirmiausiai buvo siekta palyginti skirtinguose augalo organuose esantį fenolinių junginių kiekį ir kaip kinta fenolinių juginių kiekis augalo organuose, atsižvelgiant į tai ar augalas yra natūraliai augantis ar ekologiškai kultivuojamas. Todėl pasirinktos Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno bei Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno šaknys, žiedai, vaisiai ir pirmais metais išauginama lapų skrotelė. Kadangi atitinkamos augalo dalys skirtingose vietose rinktos tą pačią dieną 2014m., tai galima atmesti augimo ar rinkimo faktorius, kurie galėtų daryti įtaką fenolinių junginių kiekiui lyginant tarp veislinio ir neveislinio paprastojo kmyno organo. Tačiau įtakos gali turėti geografinė padėtis, nes ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės kmyno žaliava rinkta Skaistgiryje, kuris yra apie 10 km nutolęs į pietryčius nuo Žagarės, kurioje rinkti laukinio (natūraliai augančio) paprastojo kmyno žaliava.
Taigi 5 paveikslėlyje pateiktoje diagramoje matoma, jog didžiausias suminis fenolinių juginių kiekis, pagal galo rūgšties ekvivalentą (GAE), tyrimo metu nustatytas Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno pirmais metais išauginamoje lapų skrotelėje (140,293 ± 1,284 mg/g). 8,216 proc. mažesnis kiekis nustatytas Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno pirmais metais išauginamoje lapų skrotelėje (128,767 ± 0,707 mg/g). Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno žiedų ekstrakte (124,231 ± 1,697 mg/g) fenolinių junginių 11,445 proc mažiau nei pirmais metais išauginamoje lapų skrotelėje, tačiau 24,579 proc. daugiau nei natūraliai Žagarėje augančio paprasto kmyno žieduose (93,696 ± 1,791 mg/g). Pastarojo šaknyse fenolinių junginių (34,494 ± 0,298 mg/g) nustatyta 4,786 proc. daugiau nei ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno šaknyse (32,843 ± 0,362 mg/g). Mažiausias kiekis nustatytas natūraliai Žagarėje augančio paprastojo kmyno vaisiuose (21,811 ± 0,324 mg/g). Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiuose fenolinių junginių kiekis (45,402 ± 0,350 mg/g ) didesnis 51,960 proc. nei laukiniuose paprastojo kmyno vaisiuose rinktuose Žagarėje (21,811 ± 0,324 mg/g).
Apibendrinant galima teigti, jog Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno pirmais metais išauginamoje lapų skrotelėje, žieduose ir vaisiuose suminis fenolinių junginių kiekis yra didesnis atitinkamai lygiant su Žagarėje surinktų natūraliai augančio paprastojo kmyno pirmais metais išauginama lapų skrotele, žiedais ir vaisiais. Tačiau šaknyse fenolinių junginių didesnis kiekis nustatomas Žagarėje natūraliai augančiame paprastąjame kmyne.
5 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis Žagarėje natūraliai augančio ir Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno organuose, surinktuose 2014 m.(n=3, SNN < 1,49 proc.)
Naudojant spektrofotometrinį Folin – Ciocalteu metodą 2014 m. gruodžio mėnesį nustatytas fenolinių junginių kiekis ir įvertintas skirtumas tarp skirtingais metais surinktų ekologiškai Skaistgiryje kultivuojamo kmyno vaisių. Vaisiai surinkti 2013 m. ir 2014 m. liepos pirmąją savaitę.
Iš 6 paveikslėlyje pateiktos diagramos matoma, jog bendras fenolinių junginių kiekis 2,786 proc. didesnis nustatytas paprastojo kmyno vaisiuose, kurie surinkti 2014 m. Surinktuose 2013 m. vaisiuose fenolinių junginių yra 44,137 ± 0,632 mg/g, o surinktuose 2014 m. – 45,402 ± 0,350 mg/g.
Šių rezultatų negalime vertinti vienareikšmiškai, sakant, jog 2014 m. surinkti vaisiai buvo labiau praturtinti fenoliniais junginiais, nes rezultatams galėjo turėti įtakos skirtingas laikymo intervalas skaičiuojant nuo žaliavos surinkimo iki tyrimo.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Pirmų metų lapų skrotelė
Šaknys Žiedai Vaisiai
F enol ini ų jung ini ų ki eki s, m g /g Laukinis (2014 m.) Ekologiškai kultivuojamas (2014 m.)
6 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis ekologiškai kultivuojamame “Gintaras” veislės paprastojo kmyno vaisiuose, surinktuose 2013 m. ir 2014 m. (n=3, SNN ≤ 1,434 proc.)
Siekiant įvertinti, kuriuose paprastojo kmyno vaisiuose daugiausiai fenolinių junginių, į tyrimą įtraukta ne tik surinkti vaisiai, bet ir įsigyti vaistinėje bei prekybos centre, pasirinkus skirtingus tiekėjus.
7 paveikslėlyje esančioje diagramoje matyti, jog iš vaistinėje įsigytų kmynų vaisių, daugiausiai fenolinių junginių nustatyta gamintojo „C“ tiekiamuose paprastojo kmyno vaisiuose (45,942 ± 0,815 mg/g). Juose fenolinių junginių 48,158 proc. daugiau nei gamintojo „B“ (23,817 ± 0,328 mg/g) ir 49,804 proc. daugiau nei gamintojo „A“ (23,061 ± 0,245 mg/g) paprastojo kmyno merikarpiuose. Prekybos centre įsigytuose gamintojo „D“ paprastojo kmyno vaisiuose bendras fenolinių junginių kiekis (22,089 ± 0,324 mg/g) 3,562 proc. didesnis nei prekybos centre įsigytuose gamintojo „E“ (21,302 ± 0,403 mg/g) paprastojo kmyno vaisiuose.
Diagramoje matyti, jog iš visų vaisių suminiu fenolinių junginių kiekiu išsiskiria ne tik vaistinėje įsigyto gamintojo „C“ kmyno vaisiai, bet ir Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės. Vaistinėje įsigytuose gamintojo „C“ kmyno vaisiuose nustatytas bendrasis fenolinių junginių kiekis (45,942 ± 0,815 mg/g) yra 3,929 proc. didesnis nei 2013 m. Skaistgiryje surinktų ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės Carum carvi L. vaisiuose (44,137 ± 0,632 mg/g) ir 1,175 proc. didesnis nei 2014 m. Skaistgiryje surinktų ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės kmynų vaisiuose ( 45,402 ± 0,350 mg/g). 4,909 proc. skirtumas yra tarp natūraliai augančių Skuode ir Žagarėje surinktų 2014 m. paprastojo kmyno vaisių. Skuode surinktuose vaisiuose fenolinių junginių kiekis (22,937 ± 0,228 mg/g) didesnis nei Žagarėje surinktų vaisių (21,811 ± 0,324 mg/g), nors atstumas tarp šių vietovių yra 120 km.
42.5 43 43.5 44 44.5 45 45.5 46 46.5 Vaisiai ( 2013 m.) Vaisiai ( 2014 m.) F enol ini ų jungi ni ų ki eki s, m g/ g
7 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis skirtingų gamintojų kmynų vaisiuose, įsigytuose vaistinėje ir prekybos centre, surinktuose Skuode, Žagarėje ir Skaistgiryje ekologiškame ūkyje (n=3, SNN ≤ 1,895 proc.)
Taigi suminis fenolinių junginių kiekis paprastojo kmyno vaisių etanoliniame ekstrakte didėja atitinkamai: prekybos centre įsigyti gamintojo „E“ paprastojo kmyno vaisiai (21,302 ± 0,404 mg/g) – 2014 m. surinkti natūraliai augančio Žagarėje paprastojo kmyno vaisiai (21,811 ± 0,324 mg/g) – prekybos centre įsigyti gamintojo „D“ paprastojo kmyno vaisiai (22,089 ± 0,324 mg/g) – 2014 m. surinkti natūraliai augantys Skuode paprastojo kmyno vasiai (22,937 ± 0,228 mg/g) – vaistinėje įsigyti gamintojo „A“ paprastojo kmyno vasiai (23,061 ± 0,245 mg/g) - vaistinėje įsigyti gamintojo „B“ paprastojo kmyno vaisiai (23,817 ± 0,328 mg/g ) – 2013 m. Surintki Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiai (44,137 ± 0,632 mg/g) – 2014 m. Skaistgiryje surinkti ekologiškai kultivuojami „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiai (45,402 ± 0,350 mg/g) – vaistinėje įsigyto gamintojo „C“ paprastojo kmyno vaisiai (45,942 ± 0,815 mg/g).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 F enol ini ų jung ini ų ki eki s, m g /g
3.2. Bendro flavonoidų kiekio nustatymas Carum carvi L. augalinėje žaliavoje
Bendras flavonoidų kiekis paprastojo kmyno (Carum carvi L.) žaliavų ekstraktuose nustatytas spektrofotometru regimojo spektro absorbcija. Reakcijos su aliuminio chlorido metu flavonoidai, sudarydami stabilius kompleksus, leidžia nustatyti bendrą flavonoidų kiekį. [53, 54] Tyrime naudoti tie patys kmyno žaliavų ekstraktai kaip ir nustatant bendrą fenolinių junginių kiekį.
8 paveikslėlyje esančioje diagramoje vaizduojamas bendras flavonoidų kiekis, nustatytas skirtinguose paprastojo kmyno organuose tiek Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės, tiek Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno. Diagramoje labiausiai išsiskiria žieduose nustatytas flavonoidų kiekis Žagarėje natūraliai augančiame (laukiniame) ir ekologiškai Skaistgiryje kultivuojamame „Gintaras“ veislės paprastąjame kmyne. Pastarąjame bendrasis flavonoidų kiekis (16,493 ± 0,200 mg/g) yra 12,921 proc. didesnis nei Žagarėje natūraliai augančiame (14,362 ± 0,313 mg/g). Tačiau lyginant flavonoidų kiekį pirmaisiais metais išaugintoje lapų skrotelėje nustatytas 7,610 proc. didesnis kiekis Žagarėje augančiame laukiniame kmyne (14,086 ± 0,182 mg/g) nei Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamame „Gintaras“ veislės (13,014 ± 0,304 mg/g). Žagarėje natūraliai augančio laukinio kmyno šaknyse flavonoidų kiekis (4,835 ± 0,158 mg/g) yra 31,231 proc. didesnis nei Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės (3,325 ± 0,076 mg/g), tačiau vaisiuose bendras kiekis (2,378 ± 0,078 mg/g) mažesnis 42,574 proc.
Suminis flavonoidų kiekis Žagarėje natūraliai augančio Carum carvi L. žaliavų etanoliniuose ekstraktuose atitinkamai mažėja : žiedai (14,362 ± 0,313 mg/g) - pirmais metais išauginama lapų skrotelė (14,086 ± 0,182 mg/g) – šaknys (4,835 ± 0,158 mg/g) - vaisiai (2,378 ± 0,078 mg/g), o Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastąjame kmyne atitinkamai mažėja: žiedai (16,493 ± 0,200 mg/g) – pirmais metais išauginama lapų skrotelė (13,014 ± 0,304 mg/g ) – vaisiai (4,141 ± 0,078 mg/g) – šaknys ( 3,325 ± 0,076 mg/g).
8 pav. Flavonoidų kiekis Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės ir Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno organuose, surinktuose 2014 m. (n=3, SNN ≤ 3,113 proc.)
Nustatytas flavonoidų bendro kiekio skirtumas tarp 2013 m. ir 2014 m. surinktų Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės kmyno vaisių. 2014 m. surinktuose vaisiuose flavonoidų kiekis (4,140 ± 0,1329 mg/g) 33,816 proc. didesnis nei surinktuose 2013 m. (2,740 ± 0,056 mg/g). Šis skirtumas matomas 9 paveikslėlyje esančioje diagramoje.
9 pav. 2013 m. ir 2014 m. surinktų Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno bendras flavonoidų kiekis (n = 3, SNN ≤ 3,113 proc.)
Tyrimo metu pasirinkta palyginti suminį flavonoidų kiekį vaisiuose, kurie surinkti 2013 m. ir 2014 m. Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės, 2014 m. Žagarėje ir Skuode natūraliai augančių, bei vaistinėje ir prekybos centre įsigytų skirtingų gamintojų.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Pirmų metų lapų skrotelė
Šaknys Žiedai Vaisiai
F la vonoi dų ki eki s, m g /g
Natūraliai augantis, Žagarė (2014 m.) Ekologiškai kultivuojamas, Skaistgirys (2014 m.) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 Vaisiai ( 2013 m.) Vaisiai ( 2014 m.) F la vonoi dų ki eki s, m g /g
Diagramoje, esančioje 10 paveikslėlyje matoma, jog daugiausiai flavonoidų nustatyta vaistinėje įsigyto gamintojo „C“ bei Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės 2014 m. surinktuose paprastojo kmyno vaisiuose. Gamintojo „B“ paprastojo kmynų vaisiuose bendras flavonoidų kiekis (3,372 ± 0,087 mg/g) yra 20,133 proc. mažesnis nei gamintojo „C“ paprastojo kmyno vaisiuose (4,222 ± 0,099 mg/g). Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo 2014 m. surinktuose „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiuose (4,141 ± 0,129 mg/g) suminis flavonoidų kiekis 1,919 proc. mažesnis nei gamintojo „C“ paprastojo kmyno vaisiuose. Vaistinėje įsigytame gamintojo „A“ paprastojo kmyno vaisiuose bendras flavonoidų kiekis (2,545 ± 0,064 mg/g) 24,526 proc. mažesnis lyginant su gamintojo „B“ ir 39,720 proc. mažesnis lyginant su gamintojo „C“ paprastojo kmyno vaisiuose nustatytu flavonoidų kiekiu. Prekybos centre įsigytose gamintojo „D“ kmyno vaisiuose flavonoidų kiekis (2,955 ± 0,086 mg/g) yra 16,110 proc. didesnis nei vaistinėje įsigyto gamintojo „A“ paprastojo kmyno vaisiuose ir 41,218 proc. didesnis nei prekybos centre įsigyto gamintojo „E“ (1,737 ± 0,031 mg/g) paprastojo kmyno merikarpiuose. Lyginant flavonoidų kiekybę natūraliai augančiuose Žagarėje (2,379 ± 0,078 mg/g) ir Skuode (3,126 ± 0,095 mg/g) 2014 m. surinktose paprastojo kmyno sėklose matomas 23,896 proc. skirtumas.
10 pav. Bendras flavonoidų kiekis paprastojo kmyno vaisiuose, įsigytuose vaistinėje ir prekybos centre, surinktuose Žagarėje ir Skuode, bei ekologiškai Skaistgiryje kultivuojamų „Gintaras“ veislės (n=3, SNN ≤ 3,30 proc.) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 F la vonoi dų ki eki s, m g /g
Taigi vaisiuose esantis bendras flavonoidų kiekis didėja atitinkamai: prekybos centre įsigyti gamintojo „E“ paprastojo kmyno vaisiai (1,737 ± 0,031 mg/g) – 2014 m. Žagarėje surinkti natūraliai augantys paprastojo kmyno vaisiai (2,379 ± 0,078 mg/g) – vaistinėje įsigyti gamintojo „A“ paprastojo kmyno vasiai (2,545 ± 0,064 mg/g) – 2013 m. Skaistgiryje ekologiškai kultivuojami „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiai (2,740 ± 0,056 mg/g) – prekybos centre įsigyti gamintojo „D“ paprastojo kmyno vaisiai (2,955 ± 0,086 mg/g) – 2014 m. Skuode surinkti natūraliai augantys paprastojo kmyno vaisiai (3,126 ± 0,095 mg/g) – vaistinėje įsigyti gamintojo „B“ paprastojo kmyno vaisiai (3,372 ± 0,087 mg/g) - 2014 m. Skaistgiryje ekologiškai kultivuojami „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiai (4,141 ± 0,129 mg/g) – vaistinėje įsigyti gamintojo „C“ paprastojo kmyno (4,222 ± 0,099 mg/g).
3.3. Paprastojo kmyno ekstraktų antioksidantinio aktyvumo įvertinimas lasivųjų
radikalų surišimo metodu
Antioksidantiniam kmyno žaliavos ekstrakto aktyvumui įvertinti naudotas DPPH laisvųjų radikalų surišimo metodas. Absorbcijos matavimo metu stebimas pokytis tarp skirtingų mėginių. Tai atsispindi ir galutiniuose rezultatuose, antioksidanto kiekį išreiškus mg/g pagal trolokso ekvivalentą (TE).
Žemiau pateiktame 11 paveikslėlyje vaizduojamas nustatytas bendras antioksidantinių medžiagų kiekis mg/g pagal trolokso ekvivalentą (TE) skirtinguose kmyno organuose, surinktuose 2014 m. Skaistgiryje ekologiškai kultivuoto „Gintaras“ veislės ir Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno. Grafike matosi, jog labiausiai antioksidantiniu aktyvumu pasižymi Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiai (0,698 ± 0,006 mg/g), 5,731 proc. mažesniu – Žagarėje surinkti natūraliai augančio paprastojo kmyno vaisiai. Pastarojo šaknyse antioksidantinių medžiagų (0,609 ± 0,006 mg/g) 3,448 proc. daugiau nei ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės šaknyse. Tačiau žiedų ir pirmais metais išauginamos lapų skrotelės ekstraktuose antioksidantinių medžiagų daugiau nustatyta Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno žaliavose. Žieduose skirtumas 3,359 proc, o pirmais metais išauginamoje lapų skrotelėje – 1,654 proc. Nustatytas 15,759 proc. skirtumas tarp daugiausiai antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių junginių nustatytų Skaistgiryje ekologiškai kultvuojamo „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisių ir mažiausiai antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių junginių nustatytų šaknyse.
Antioksidantinių medžiagų kiekis mg/g pagal trolokso ekvivalentą Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno organų žaliavų ekstraktuose atitinkamai didėja: šaknys (0,609 ± 0,006
mg/g) – žiedai (0,633 ± 0,007 mg/g) – pirmais metais išauginama lapų skrotelė (0,654 ± 0,005 mg/g) – vaisiai (0,658 ± 0,006 mg/g). Taip pat didėja ir Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamame „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno organų žaliavų ekstraktuose: šaknys (0,588 ± 0,009 mg/g) – žiedai (0,655 ± 0,007 mg/g) – pirmais metais išauginama lapų skrotelė (0,665 ± 0,007 mg/g) – vaisiai (0,698 ± 0,006 mg/g).
11 pav. Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo “Gintaras” veislės ir Žagarėje natūraliai augančio paprastojo kmyno organuose nustatytas antioksidantinių medžiagų kiekis, pagal DPPH laisvųjų radikalų surišimą (n=3, SNN ≤ 1,335 proc.)
Grafike, pavaizduotame 12 paveikslėlyje, demonstruojamas suminis antioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių junginių kiekis, atsižvelgiant į skirtingais metais surinktus vaisius. Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamo „Gintaras“ veislės Carum carvi L. antioksidantinių medžiagų yra 1,433 proc. daugiau 2014 m. surinktuose (0,698 ± 0,005 mg/g) nei 2013 m. (0,688 ± 0,004 mg/g) paprastojo kmyno vaisiuose. Tačiau negalime vienareikšmiškai teigti, jog 2014 m. surinktuose vaisiuose buvo daugiau antioksidantinėmis savybėmis pasižyminčių junginių, nes 2013 m. ir 2014 m. surinkti vaisiai tirti vienu metu. Rezultatams įtakos galėjo turėti buvęs nevienodas laikymo laikas iki tyrimo. 0.000 0.100 0.200 0.300 0.400 0.500 0.600 0.700 0.800 Pirmų metų lapų skrotelė
Žiedai Šaknys Vaisiai
A nt ioks ida nt ų ki eki s, m g /g
Natūraliai augantis, Žagarė ( 2014 m.)
Ekologiškai kultivuojamas, Skaistgirys ( 2014 m.)
12 pav. Antioksidantinių medžiagų kiekis 2013 m. ir 2014 m. Surinktuose Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamų „Gintaras“ veislės tirtuose paprastojo kmyno vaisiuose, atsižvelgiant į DPPH laisvųjų radikalų surišimą (n=3, SNN ≤ 0,689 proc.)
Vertinant antioksidantinį aktyvumą vaistinėje ir prekybos centre įsigytuose skirtingų gamintojų kmynų vaisiuose, nustatyta, jog didžiausias antioksidantinis aktyvumas yra vaistinėje įsigyto gamintojo „C“ (0,692 ± 0,008 mg/g), mažesnis 1,734 proc. – vaistinėje įsigyto gamintojo „B“ (0,680 ± 0,004 mg/g). Negalime teigti, jog visi vaistinėje įsigytų kmynų vaisiai pasžymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu nei įsigyti prekybos centre, nes nors parduotuvėje įsigyto gamintojo „E“ paprastojo kmyno vaisiuose (0,674 ± 0,012 mg/g) antioksidantinių medžiagų nustatyta mažiau 0,882 proc. už vaistinėje įsigyto gamintojo „B“, tačiau daugiau 0,890 proc. už vaistinėje įsigyto gamintojo „A“ ( 0,668 ± 0,003 mg/g). Mažiausiai antioksidantinių medžiagų yra prekybos centre įsigyto gamintojo „D“ (0,661 ± 0,002 mg/g) paprastojo kmyno merikarpiuose. Rezultatai demonstruojami 13 paveikslėlyje pateiktoje diagramoje.
0.67 0.675 0.68 0.685 0.69 0.695 0.7 0.705 Vaisiai ( 2013 m.) Vaisiai ( 2014 m.) A nt iok si da nt ų k ie k is , m g /g
13 pav. Antioksidanto kiekis vaistinėje ir prekybos centre įsigytuose skirtingų gamintojų paprastojo kmyno vaisiuose, pagal DPPH laisvųjų radikalų surišimą (n=3, SNN ≤ 1,826 proc.)
Vertinant suminį antioksidantinių medžiagų kiekį visuose tirtuose kmynų vaisių ekstraktuose, 14 paveikslėlyje pateiktoje diagramoje matoma, jog didžiausias antioksidantinių medžiagų kiekis yra Skaistgiryje ekologiškai kultivuojamame ir 2014 m. surinktuose „Gintaras“ veislės paprastojo kmyno vaisiuose (0,698 ± 0,005 mg/g), o mažiausias kiekis – Žagarėje natūraliai augančio Carum carvi L. vaisiuose (0,658 ± 0,005 mg/g). Skirtumas tarp daugiausiai antioksidantinių medžiagų ir mažiausiai antioksidantinių medžiagų turinčių vaisių yra 0,040 mg/g ( 6,070 proc). Skuode 2014 m. surinktuose paprastojo kmyno vaisiuose antioksidantinių medžiagų ( 0,670 ± 0,010 mg/g) yra 1,791 proc. daugiau nei surinktuose 2014 m. Žagarėje (0,658 ± 0,005 mg/g).
0.630 0.640 0.650 0.660 0.670 0.680 0.690 0.700 0.710 Gamintojas "A", vaistinė Gamintojas "B", vaistinė Gamintojas "C", vaistinė Gamintojas "D", prekybos centras Gamintojas "E", prekybos centras A nt ioks ida nt ų ki eki s, m g /g
