FENOLKARBOKSIRŪGŠČIŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS PAPRASTOSIOS KRAUJAŽOLĖS (Achillea millefolium L.) ŽALIAVOSE

RASA LIPINAITĖ

FENOLKARBOKSI

RŪGŠČIŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS

PAPRASTOSIOS KRAUJAŽOLĖS (Achillea millefolium L.)

ŽALIAVOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

doc. dr. Raimondas Benetis

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

FARMACIJOS FAKULTETAS

VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanas

prof.dr.

Vitalis Briedis, parašas

Data

FENOLKARBOKSI

RŪGŠČIŲ SUDĖTIES ĮVERTINIMAS

PAPRASTOSIOS KRAUJAŽOLĖS (Achillea millefolium L.)

ŽALIAVOSE

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Darbą atliko

doc.dr.Raimondas Benetis

,

parašas

Magistrantė

Data

Rasa Lipinaitė, parašas

Data

Recenzentas

TURINYS

SANTRAUKA ... 5

SUMMARY ... 5

1.SANTRUMPOS ... 8

2.ĮVADAS ... 9

3.DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

4.LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

4.1. Paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) apibūdinimas, panaudojimas medicinoje ir cheminė sudėtis ... 12

4.1.1. Paprastosios kraujažolės morfologiniai požymiai ir paplitimas ... 12

4.1.2. Paprastosios kraujažolės cheminė sudėtis ... 13

4.1.3. Panaudojimas medicinoje ... 15

4.1.4. Paprastosios kraujažolės saugumas ... 17

4.2. Fenoliniai junginiai ... 17

4.2.1. Bendra apžvalga ir paplitimas augaliniame pasaulyje ... 17

4.2.2. Struktūros ypatumai ... 18

4.2.3. Poveikis žmogaus organizmui ... 20

4.2.4. Biologinis pasisavinimas ir metabolizmas ... 25

4.3. Fenolinių junginių analizė ... 25

5.TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 29

5.1. Tyrimų objektas ... 29

5.2. Medžiagos ir reagentai ... 30

5.3. Naudota aparatūra ... 30

5.4. Tyrimų metodai ... 30

6.REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 33

6.2. Bendrojo fenolkarboksirūgščių kiekio įvairavimas skirtingose gamtinėse cenopopuliacijose surinktuose A. millefolium žolės ėminiuose ... 33

6.3. Bendrojo fenolkarboksirūgščių kiekio įvairavimas A. millefolium augalo organuose ... 37

6.3.1. Fenolkarboksirūgščių kiekio įvairavimas A. millefolium žieduose ... 38

6.3.2. Fenolkarboksirūgščių kiekio įvairavimas A. millefolium lapuose ... 40

6.3.3. Fenolkarboksirūgščių kiekio įvairavimas A. millefolium stiebuose ... 42

6.4. Rezultatų apibendrinimas ... 45

7. IŠVADOS ... 47

8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 48

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 49

SANTRAUKA

Rasos Lipinaitės magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.

Fenolkarboksirūgščių sudėties įvertinimas paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) žaliavose.

Tikslas: ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium

L.) augalinių žaliavių fenolkarboksirūgščių kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą.

Uždaviniai: 1) Iš surinktų ir išdžiovintų A. millefolium augalinių žaliavų (optimizuotomis

ekstrakcijos sąlygomis) paruošti bandinius analizei. 2) Spektrofotometriniu metodu ištirti fenolkarboksirūgščių kiekybinę sudėtį natūraliose augavietėse surinktuose A. millefolium vaistinės augalinės žaliavos ėminiuose bei jos įvairavimą skirtingose cenopopuliacijose. 3) Įvertinti fenolkarboksirūgščių kiekybinę sudėtį bei jos rodmenų pokyčius A. millefolium stiebų, lapų ir žiedų augalinėse žaliavose.

Tyrimo metodika: Tyrimui atlikti buvo naudojamos natūraliai augančių paprastosios

kraujažolės augalų augalinės žaliavos (žolė, žiedai, lapai, stiebai), surinktos iš įvairiuose Lietuvos regionuose esančių 23 natūralių augaviečių, masinio žydėjimo metu, 2013 metų liepos - rugpjūčio mėnesiais. Suminis fenolinių rūgščių kiekis žaliavose nustatytas spektrofotometriniu metodu, panaudojant Arnow reagentą.

Rezultatai ir išvados: Pirmą kartą Lietuvoje nustatytas bendras fenolkarboksirūgščių kiekis

Achillea millefolium L. vaistinėje augalinėje žaliavoje. Taip pat pirmą kartą nustatytas populiacinis bei

morfologinis kiekybinės rūgščių sudėties kintamumas Lietuvos natūraliose augavietėse augančių kraujažolių augaluose. Nustatytas bendras fenolkarboksirūgščių kiekis žolės 70 proc. etanoliniuose ekstraktuose vidutiniškai siekė 58,690±4,279 mg/g. Taip pat nustatyta, kad A. millefolium augalinėms žaliavoms būdingas ženklus fenolkarboksirūgščių sudėties rodiklių kintamumas, tiesiogiai priklausantis nuo augalo morfologinės dalies. Bendras fenolkarboksirūgščių kiekis žiedų žaliavose vidutiniškai siekė 58,029±3,492 mg/g. Lapų žaliavose vidutiniškai sukaupiama 102,150±7,50 mg/g, tai yra beveik du kartus daugiau nei žiedų ir žolės žaliavose, stiebuose - 22,722±2,928 mg/g. Nustatytas ženklus fenolkarboksirūgščių kiekinės sudėties įvairavimas tarp tirtų kraujažolių cenopopuliacijų. Vaistinės žaliavos bandinių grupėje bendras rūgščių kiekis skirtingose cenopopuliacijose kito nuo 33,490 iki 86,474 mg/g, žieduose - nuo 40,240 iki 73,022 mg/g, lapuose - nuo 74,110 iki 150,176 mg/g, stiebuose - nuo 15,605 iki 43,381 mg/g. Atlikus statistinę analizę norint palyginti tirtų bandinių grupių vidurkius, tirtose žaliavose nustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų. Eksperimentinių duomenų sklaidai apibūdinti apskaičiuoti bandinių grupių variacijos koeficientai (žolės – 26,29 proc.,

žiedų – 19,03 proc., lapų – 23,25 proc., stiebų – 40,74 proc.) parodė, kad bendro fenolkarboksirūgščių kiekio sklaida didžiausia stiebuose, žolės ir lapų bandiniuose – didelė, o žieduose – vidutinė.

SUMMARY

Rasa Lipinaitė’s final master’s thesis/research supervisor assoc. prof. PhD. Raimondas Benetis; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. – Kaunas.

The assessment of the phenolcarboxylic acid content in the raw materials of yarrow (Achillea

millefolium L.).

Goal: to analyze the quantitative composition of the phenolcarboxylic acids in the raw plant

material of yarrow (Achillea millefolium L.) occurring naturally in Lithuania.

Tasks: 1) To prepare extracts for analysis (under the optimized extraction conditions) from

the collected and air-dried A. millefolium raw plant material. 2) To analyze, using a spectrophotometric method, the quantitative composition of phenolcarboxylic acids in the samples of A. millefolium medicinal raw plant material samples collected in the natural habitats and its variation among different cenopopulations. 3) To assess the quantitative composition of phenolcarboxylic acids and the variation in its values in A. millefolium stems, leaves and flower raw plant material.

Research methodology: The study used samples of the raw plant material of naturally

occurring yarrow (herbs, flowers, leaves and stems) collected from 23 natural habitats in different Lithuanian regions during the flowering time in the months of July and August 2013. The total amount of phenolic acids in the raw material was measured using a spectrophotometric method and Arnow’s reagent.

Results and conclusions: For the first time ever in Lithuania, the general amount of

phenolcarboxylic acids was measured in the raw plant material of Achillea millefolium L. medicinal plants. The population and morphological variance of the quantitative content of the acids in yarrow plants growing in the natural habitats of Lithuania was also determined for the first time. The overall amount of phenolcarboxylic acids was determined to be 58,690±4.279 mg/g in 70 percent ethanol extracts of the herb. It was also determined that significant variability exists in indicators of the phenolcarboxylic acid content of A. millefolium plants. This is directly dependent on the morphological part of the plant. The total average of the phenolcarboxylic acids content in flowers was 58,029±3,492 mg/g. The total average in leaves was 102,150±7,50 mg/g, almost two times higher the content found in the flowers and herbs. The average acids content accumulated in stems was 22,722 ±

2,928 mg/g. Determinated sign variability of the content of phenolcarboxylic acids in the investigated cenopopulations of yarrow. The total acids content of different cenopopulations in the raw plant materials of yarrow ranged from 33,490 to 86,474 mg/g, in flowers - from 40,240 to 73,022 mg /g, in leaves - from 74,110 to 150,176 mg/g, in stems - from 15,605 to 43,381 mg/g. Statistical comparison of sample group averages found statistically significant differences between sample group averages. The dispersion of the experimental data was described by calculating the variation coefficients of sample groups (herbs – 26,29 percent, flowers – 19,03 percent, leaves – 23,25 percent, stems – 40,74 percent), which demonstrated that the dispersion of the general amount of phenolcarboxylic acids is greatest in the stems, great in the herbs and leaves, medium in the flowers.

PADĖKA

Nuoširdžiai dėkoju magistrinio darbo vadovui doc. dr. Raimondui Benečiui už visokeriopą pagalbą rašant baigiamąjį magistrinių studijų darbą. Taip pat dėkoju už rūpestį, patarimus, išsakytas mokslines idėjas ir mintis ir už tai, kad sunkiais darbo rašymo etapais iš konsultacijų išeidavau vėl motyvuota.

Noriu padėkoti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Analizinės ir toksikologinės katedros vedėjui prof. dr. Liudui Ivanauskui už suteiktą materialinę bazę (aparatūrą) tyrimams reikalingų ekstraktų gamybai.

Dėkoju savo draugui ir šeimos nariams už pagalbą renkant tyrimams reikalingas paprastosios kraujažolės augalines žaliavas ir palaikymą.

1. SANTRUMPOS

DCQA O,O- dikafeilchino rūgštys (angl. O,O-dicaffeoylquinic acids) DNR deoksiribonukleorūgštis

ESC efektyvioji skysčių chromatografija G2/M mitozės fazė

HNE žmogaus neutrofilo elastazė (angl. human neutrophil elastase) KOMT katechol-O- metiltransferazė

MCF-7 krūties vėžio ląstelių linijos

MMP -2 ir -9 matrikso metaloproteinazės (angl. matrix metalloproteinases) n imties tūris

proc. procentai

RNS aktyvieji azoto junginiai (angl. reactive nitrogen species) ROS aktyvieji deguonies junginiai (angl. reactive oxygen species) TNF auglių nekrozės faktorius

UV/VIS ultravioletinis regimosios šviesos detektorius

2.

ĮVADAS

Plačiai liaudies medicinoje vartoti vaistiniai augalai vis intensyviau tyrinėjami ir naudojami šiuolaikinės farmacijos srityje [31]. Daugelyje kultūrų dėl savo gydančių savybių Achillea L. genties augalai yra vartojami jau šimtus metų. Paprastoji kraujažolė yra viena iš svarbiausių ir seniausiai vartojamų vaistinių augalų Lietuvos liaudies ir įprastinėje medicinoje [4].

Susidomėjimas vaistiniais augaliniais preparatais vis didėja, todėl ypatingas dėmesys skiriamas juose esančių biologiškai aktyvių junginių tyrimams. Biologiškai aktyvių junginių, esančių vaistiniuose augaluose kokybiniai ir kiekybiniai tyrimai yra svarbūs norint užtikrinti vaistinių preparatų kokybę, kuri įtakoja preparatų efektyvumą ir saugumą.

Paprastoji kraujažolė (Achillea millefolium L.) yra Astrinių šeimos augalas [65]. Fenoliniai junginiai yra labai svarbūs augalinės žaliavos sudėtyje esantys komponentai. Tai flavonoidai ir fenolinės rūgštys [14], be to jie vertinami kaip vieni iš svarbiausių farmakologiškai aktyvių junginių esančių Achillea genties rūšyse [4; 56]. Moksliškai įrodyta, kad šie junginiai pasižymi priešuždegiminiu [13; 17], antioksidantiniu [36; 61], choleretiniu [13; 15], spazmolitiniu [4; 15] poveikiu. Dėl sudėtyje esančio eterinio aliejaus ir seskviterpeninių laktonų kraujažolei būdingas antimikrobinis, priešgrybelinis poveikis [9; 61]. Pastaruoju metu ypatingas dėmesys skiriamas į paprastojoje kraujažolėje esančias dikafeilchino rūgštis, kadangi buvo įrodyta, kad šios fenolinės rūgštys apsprendžia choleretinį paprastosios kraujažolės veikimą, pasižymi stipriu antioksidantiniu poveikiu, būdingas priešuždegiminis, priešvėžinis veikimas [4; 17; 53; 56].

Paprastosios kraujažolės augalai plačiai paplitę tiek Lietuvoje, tiek visame pasaulyje, ypač šiauriniame pusrutulyje [65]. Įvairiose Lietuvos gamtinėse cenopopuliacijose augančių paprastosios kraujažolės augalinių žaliavų sudėtyje esančios fenolinės rūgštys vis dar nėra plačiai ištyrinėtos. Siekiant nustatyti kokiose Lietuvos vietovėse augantys augalai sukaupia didžiausius rūgščių kiekius tikslinga įvertinti šių rūgščių kiekybinius parametrus bei jų variaciją skirtingose gamtinėse cenopopuliacijose rinktose augalinėse žaliavose, taip pat įvertinti kaip šie parametrai varijuoja tarp skirtingų augalo morfologinių dalių. Įvertinus populiacinį rūgščių kintamumą, gauti duomenys gali būti panaudojami pasirenkant racionalesnes vaistinių augalinių žaliavų rinkimo vietas gamtoje, o įvertinus morfologinį rūgščių kintamumą galima spręsti apie atitinkamų augalo morfologinių dalių potencialų panaudojimą kryptingu biologiniu poveikiu pasižyminčių vaistinių preparatų gamybai.

Mokslinio darbo naujumas. Pirmą kartą Lietuvoje nustatytas bendras fenolkarboksirūgščių

kiekis Achillea millefolium vaistinėje augalinėje žaliavoje. Taip pat pirmą kartą nustatytas populiacinis bei morfologinis kiekybinės rūgščių sudėties kintamumas Lietuvos natūraliose augavietėse augančių kraujažolių augaluose.

Darbo tikslas - ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea

3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas - ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea

millefolium L.) augalinių žaliavų fenolkarboksirūgščių kiekybinę sudėtį ir jos įvairavimą.

Darbo uždaviniai :

1) Iš surinktų ir išdžiovintų A. millefolium augalinių žaliavų (optimizuotomis ekstrakcijos sąlygomis) paruošti bandinius analizei.

2) Spektrofotometriniu metodu ištirti fenolkarboksirūgščių kiekybinę sudėtį natūraliose augavietėse surinktuose A. millefolium vaistinės augalinės žaliavos ėminiuose bei jos įvairavimą skirtingose cenopopuliacijose.

3)

4.

LITERATŪROS APŽVALGA

4

.1. Paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) apibūdinimas,

panaudojimas medicinoje ir cheminė sudėtis

Karalystė: Augalai (-Plantae-)

Skyrius: Magnolijūnai (-Magnoliophyta-) Klasė: Magnolijainiai (-Magnoliopsida-) Poklasis: Astražiedžiai (-Asteridae-) Šeima: Astriniai (-Asteraceae Dumort.) Gentis: Kraujažolė (-Achillea L.-)

Rūšis: Paprastoji kraujažolė (-Achillea millefolium L.-)

4

.1.1. Paprastosios kraujažolės morfologiniai požymiai ir paplitimas

Paprastoji kraujažolė yra Astrinių - didžiausios induočių augalų šeimos, plačiai paplitęs vaistinis augalas, augantis šiauriniame pusrutulyje (1 pav.)

1 pav. Paprastoji kraujažolė (-Achillea millefolium L.-)

Genties vardui pradžią davė Trojos didvyris Achilas, kuris šį augalą kaip vaistinę priemonę naudojo žaizdų gydymui, tuo tarpu lot. millefolium siejasi su labai susiskaldžiusiais lapais [15; 65].

Paprastoji kraujažolė yra labai polimorfinės šeimos, susidedančios iš keletos taksonų, kurie skiriasi morfologija ir chemine sudėtimi atstovas [14; 15] Išskiriama apie 100 Achillea genties rūšių, plačiai paplitusių šiauriniame pusrutulyje [4].

Paprastoji kraujažolė (-Achillea millefolium L.-) - daugiametis žolinis augalas, užaugantis iki 70 cm aukščio, su būdingais pailgais ir lancetiškais, daugiariopai plunksniškais lapais [72]. Lapai žali ar pilkšvai žali, viršutinis lapo paviršius turi šiek tiek plaukelių, o apatinis paviršius plaukelių turi daugiau, lapai 2 arba 3 kartus plunksniškai suskaldyti į linijiškas skiltis [35], pakaitiniai, bekočiai [57]. Pagrindiniai (baziniai) lapai apie 25 cm ilgio, viršutiniai iki 10 cm ilgio ir 3 cm pločio [57].

Maži žiedynai yra sudaryti iš penkių baltų ar rožinių liežuviškų žiedų ir kelių (3-20) geltonų vamzdiškų žiedų, kurie išsidėstę būdingame 3 - 5 cm skersmens skėtiškos šluotelės pavidalo žiedyne [72; 73]. Kapitula išsidėsčiusi skėtiškoje kekėje, stiebo viršūnėje. Žiedyno skraistė sudaryta iš 3 eilių žvyniškai lancetiškų, plaukuotų, žalių pažiedžių, rusvais ar balkšvais plėviškais kraštais. Žiedsostis šiek tiek išgaubtas. Plaukeliai žali. Dalinai rusvas ar violetinis stiebas išilgai vagotas, su šviesios spalvos šerdimi [35]. Kvapas šiek tiek aromatinis, skonis – kartus [72]. Vaisiai – lukštavaisiai [73].

Europos farmakopėjoje nurodoma, kad vaistinė augalinė žaliava yra paprastosios kraujažolės žolė (Millefolii herba) t.y. žydėjimo metu kirpti ir išdžiovinti ūgliai [35; 56; 58]. Augalo gimtinė Europa, Šiaurės Azija ir Šiaurės Amerika [9; 72]. Augalai paplitę visame pasaulyje, daugiausiai sausringuose ir pusiau sausringuose regionuose [55; 65], dažnai sutinkami kalnuotose pievose, pakelėse, laukų pasėliuose, soduose [31], žydi nuo birželio iki rugsėjo mėnesio [47].

4

.1.2. Paprastosios kraujažolės cheminė sudėtis

Paprastojoje kraujažolėje yra identifikuota apie 100 įvairių cheminių junginių.

Vaistinės augalinės žaliavos sudėtyje yra randami fenoliniai junginiai, tokie kaip flavonoidai ir fenolinės rūgštys. Flavonoidai randami apigenino, liuteolino ir kvercetino monoglikozidų ir diglikozidų pavidale. Išskiriami flavonoidų O ir C glikozidai. Dažniausiai aptinkamos glikozidų grupės paprastojoje kraujažolėje yra: flavon - 7 – O – glikozidai : apigenino - 7- O- glikozidai ir malonil - 7- O- glikozidai (pvz apigenino - 7- O- glikopiranozidas, apigenino - 7- O rutonosinas); liuteolino - 7- O- glikozidai (liuteolino - 7- O- glikopiranozidas, liuteolino – 7,4 – O – beta - digliukozidas). Flavonol – 3 – O glikozidai: kvercetino glikozidai (rutinas, kvercetino-ramnoglikozidas, kvercetagetinas, spinacetinas). Be flavonoidų glikozidų, dauguma paprastosios kraujažolės rūšių taip pat kaupia laisvus flavonoidų aglikonus. Iš paprastosios kraujažolės augalinių žaliavų taip pat išskirtos fenolinės rūgštys

– chlorogeno rūgštis ir įvairios O, O - dikafeilchino rūgštys (DCQA), iš kurių dažniausiai dominuoja 3,5-DCQA, rečiau randamos 1,5- DCQA, 3,4 – DCQA ir 4,5 – DCQA (2 pav.) [56].

2 pav. O,O-dikafeilchino rūgščių ir chlorogeno rūgšties struktūrinės formulės

Lyginamoji Centrinės Europos A. millefolium taksonų grupės analizė vertinant fenolinius junginius parodė minėtų taksonų chemotaksonominę svarbą, ypač diploidinių taksonų skirtumus. Be to, tiriant keturiasdešimt prekybinių paprastosios kraujažolės pavyzdžių nustatyta, kad fenolinių junginių kiekis augale gali vidutiniškai siekti iki 0,60 proc. (flavonoidų) ir 1,48 proc. (fenolinių rūgščių) [15; 56] .

A. millefolium augaluose nustatyti įvairūs alkaloidai: betonicinas, stachidrinas, trigonelinas,

achileinas, achiceinas [73]. Taip pat randamos bazės: betainas ir cholinas. Nustatyti kondensuoti ir hidrolizuojamieji taninai, amino rūgštys (alaninas, aspartamo, glutamo rūgštys, histidinas, leucinas, lizinas, prolinas, valinas), riebiosios rūgštys (oleino, miristino, linolo, palmitino, stearino), vitaminai (askorbo ir folio rūgštys, taip pat kavos, salicilo ir gintaro rūgštys), cukrai (arabinozė, galaktozė, dekstrozė, dulcitolis, gliukozė, inozitolis, maltozė, manitolis ir sacharozė) [12].

Kraujažolių žaliavose randama nuo 0,2 proc. iki daugiau nei 1 proc. eterinio aliejaus [12; 58; 72]. Jame randama 1,8 cineolio, sabineno, linalolio, askaridolio, eukaliptolio, limoneno, terpineolio ir α tujono, kariofileno, achilino, achilicino, milefino ir milefolido (seskviterpeno laktono), azuleno ir chamazuleno, izoartemisino ketono. Kiti būdingi komponentai yra α- ir β-pinenas, borneolis ir jo acetatas, kamfenas, terpinen-4–olis, ir kariofileno epoksidas [12; 72]. Eterinio aliejaus kiekiui ir kokybei įtakos turi genetinės, klimatinės ir dirvožemio sąlygos, augalo amžius ir vegetacijos fazė, anatominė augalo dalis [5].

Fenoliniai junginiai, tokie kaip flavonoidai ir fenolinės rūgštys yra labai svarbūs paprastosios kraujažolės sudėtyje esantys komponentai [14], ir jie yra vertinami kaip vieni iš svarbiausių farmakologiškai aktyvių junginių esančių Achillea rūšyse [4].

4.1.3. Panaudojimas medicinoje

Šiandien fitopreparatai užima svarbią vietą šiuolaikinėje medicinoje. Paprastosios kraujažolės augalinėse žaliavose yra įvairių biologiškai aktyvių junginių, kurie apsprendžia platų augalo farmakologinių poveikių spektrą, todėl paprastosios kraujažolės preparatai plačiai vartojami medicinoje. Daugelyje kultūrų dėl savo gydančių savybių Achillea genties augalai yra naudojami jau šimtus metų. Paprastoji kraujažolė yra viena iš svarbiausių ir seniausiai vartojamų vaistinių augalų Lietuvos liaudies ir įprastinėje medicinoje [4].

Vidurio Europoje (Vokietijoje, Vengrijoje, Italijoje), paprastoji kraujažolė yra viena iš dažniausiai naudojamų augalų rūšių esant kraujavimui, skrandžio susirgimams, menstruaciniams spazmams kaip infuzinė priemonė arba išoriškai – naudojama kaip šuteklis. Serbijoje, vietinės bendruomenės dažniausiai naudoja paprastosios kraujažolės infuzijas esant virškinamojo trakto susirgimams [56]. Paprastoji kraujažolė yra tarp aštuonių plačiausiai vartojamų augalų Austrijoje ir yra ypač taikoma nuo ginekologinių ir virškinamojo trakto sutrikimų [17]. Persijoje, kraujažolės genties augalai vadinami „bumadaran“, vartojami kaip priešuždegiminė, antispazminė priemonė, taip pat kraujavimų, pneumonijos, reumatinių skausmų ir žaizdų gydymui. Amerikiečiai paprastąją kraujažolę naudoja dėl jos sutraukiančiųjų savybių žaizdų gydymui, kraujavimo stabdymui. Turkijoje, žolelių arbatos, pagamintos iš kai kurių Achillea rūšių tradiciškai vartojamos pilvo skausmo ir vidurių pūtimo gydymui [65].

Brazilijos liaudies medicinoje, paprastoji kraujažolė plačiai naudojama įvairių ligų gydymui, taip pat esant uždegimui, skausmui, virškinamojo trakto sutrikimams. Tyrimais patvirtintas teigiamas skrandžio gleivinę saugantis poveikis esant ūmioms ir lėtinėms opoms virškinamajame trakte [22].

Tradiciškai paprastoji kraujažolė vartojama esant uždegimui ir spazminiams skrandžio – žarnyno sutrikimams bei kepenų – tulžies nusiskundimams gydyti. Be to, dėl savo kartaus skonio ji vartojama kaip apetitą skatinanti priemonė, žaizdoms gydyti, taip pat nuo odos uždegimų. Dažniausiai naudojami vandeniniai ir alkoholiniai ekstraktai [4; 14; 17]. Be tradicinio savarankiškai surinktos augalinės žaliavos naudojimo, kraujažolė yra įvairių pramoninių arbatų, kai kurių fitopreparatų sudėtyje [4].

Nustatyta, kad flavonoidai kasticinas ir centaureidinas, išskirti iš antžeminių A. millefolium ir

A. clavennae L. dalių sukelia citotoksinį poveikį, slopina vėžinių ląstelių proliferaciją [4].

Naujais tyrimais nustatyta, kad peroraliai vartojant hidroalkoholinį paprastosios kraujažolės ekstraktą sukeliamas anksiolitinis poveikis, be to trumpą laiką vartojant ekstraktas nesukelia priklausomybės [11]. Taip pat nustatyta, kad benzodiazepinai - tradiciniai anksiolitikai, gali sužadinti anterogradinę amneziją. Dėl šios priežasties, kaip alternatyva nerimui slopinti gali būti vartojamas

paprastosios kraujažolės ekstraktas, kuris pasižymi tik labai silpnu neigiamu poveikiu atminčiai, arba jos neigiamai visiškai neveikia [8].

Nustatyta, kad kraujažolė turi prakaitavimą skatinančių, karščiavimą mažinančių, hipotenzinių, kraujavimą stabdančių, diuretinių ir šlapimo antiseptinių (mikroorganizmus naikinančių) savybių [12]. Peroraliai vartojant etanolinį paprastosios kraujažolės ekstraktą ir dichlormetaninę augalo subfrakiją skatinamas šlapimo išsiskyrimas, taip pat padidėja ir natrio bei kalio jonų išsskyrimas iš organizmo, [30] be to vartojant ekstraktus sumažėja kraujospūdis [30; 47; 62]. Poveikio pasireškimas siejamas su pagrindiniu flavonoidu – artemetinu [30; 62], taip pat pastebėtas bronchodilatacinis ir vazodilatacinis paprastosios kraujažolės poveikis [47].

Tradiciškai ji buvo vartojama esant sumušimams, patinimams, karščiavimui, dažnai pasitaikančiam peršalimui, hipertenzijai, amenorėjai, dizenterijai, viduriavimui, ir specifiškai trombozių ligų su hipertenzija įskaitant cerebrinę ir vainikinių kraujagyslių trombozę gydymui. Eterinis aliejus pasižymi centrinę nervų sistemą slopinančiu poveikiu. Karščiavimą mažinantis ir hipotenzinis poveikiai priskiriami alkaloidų ir jų bazių frakcijai [12].

Priešuždegiminis kraujažolių poveikis yra sąlygojamas seskviterpenų, flavonoidų, taip pat flavonoidai suteikia ir antispazminių savybių, choleretinį poveikį sukelia dikafeilchino rūgštys [4; 13; 14; 15; 17; 71]. Flavonoidai taip pat turi antialerginių, antivirusinių, antikancerogeninių savybių [30; 49]. Fenoliniams junginiams būdingas ženklus antioksidantinis poveikis [7; 36; 61; 70] , buvo įrodyta, kad jie stipresni antioksidantai nei vitaminai C ir E [28; 36]. Dėl sudėtyje esančio eterinio aliejaus ir seskviterpenų laktonų kraujažolei būdingas antimikrobinis, priešgrybelinis poveikis [9; 17; 61; 72]. Eterinis aliejus išskirtas iš paprastosios kraujažolės žiedų vartojamas kvėpavimo infekcijų, karščiavimo ir reumatinių skausmų gydymui [29].

Išoriškai paprastosios kraujažolės žaliava vartojama kompresams, skalavimams ir vonioms, bet dažniausiai alkoholiniai preparatai vartojami odos ir gleivinės uždegimams gydyti [72]. Alkoholiniai ir vandeniniai paprastosios kraujažolės lapų ekstraktai pasižymi žaizdų gijimą gerinančiu poveikiu, skatina gijimo procesus [57].

Manoma, kad Achimilinės rūgšties metilo esteriai A, B ir C pasižymi antinavikiniu veikimu, už kurį atsakinga α – β – neprisotinto ketono struktūra ir (ar) enantiomerinė esterinė grupė [72].

Dėl ypatingo susidomėjimo augaliniais preparatais, farmakologiškai aktyvių junginių, esančių vaistiniuose augaluose tyrimai yra esminė svarstoma problema racionalioje fitoterapijoje, nes vaistinių žolinių preparatų kokybė, veiksmingumas ir saugumas yra labai svarbūs. Fenoliniai junginiai, tokie kaip flavonoidai ir fenolkarboninės rūgštys yra vertinami kaip vieni iš svarbiausių farmakologiškai aktyvių junginių esančių Achillea genties rūšyse. Pastaruoju metu ypatingas dėmesys skiriamas į paprastojoje kraujažolėje esančias dikafeilchino rūgštis, kadangi buvo įrodyta, kad šios fenolinės

rūgštys apsprendžia choleretinį veikimą [4; 17; 56]. Paprastoji kraujažolė savo sudėtyje turi fenolinių junginių, kurie apsprendžia daugelį farmakologinių poveikių, todėl šių junginių tyrimai yra labai svarbūs.

4

.1.4. Paprastosios kraujažolės saugumas

Paprastoji kraujažolė yra vertinama kaip palyginti saugus vaistinis augalas nors jautriems žmonėms, taip pat tiems, kurie alergiški kitiems Asteraceae šeimos augalams yra nustatytos alerginės reakcijos [12; 72]. Alergijas gali sukelti kai kurių seskviterpenų laktonai, turintys α-metileno γ-laktono žiedą, imonulogiškai svarbų struktūrinį elementą, atsakingą už kontakto su alergenu aktyvumą. Manoma, kad pagrindinis alergenas kraujažolėje yra α-peroksiachifolidas [9; 56; 63; 72]. Pasireiškus alergijai gali atsirasti uždegiminės odos pūslelės, niežulys (paprastosios kraujažolės dermatitas), tokiais atvejais paprastosios kraujažolės vartojimas turi būti tuoj pat nutrauktas [72]. Taip pat galimas rinitas, astmos paūmėjimas, kontaktinis dermatitas [29].

Eterinis aliejus kontraindikuotinas nėštumo metu ir dėl informacijos apie saugumą trūkumo, reikėtų vengti vartoti maitinant krūtimi. Dėl toksiško junginio tujono, esančio augalo eterinio aliejaus sudėtyje, galimas persileidimo pavojus ar neigiamas poveikis menstruacijų ciklui [12].

4.2. Fenoliniai junginiai

4.2.1. Bendra apžvalga ir paplitimas augaliniame pasaulyje

Fenoliniai junginiai yra didelė fitocheminių junginių grupė, plačiai paplitusi augalų karalystėje [21]. Fenoliniai junginiai yra vaisių, daržovių, riešutų, augalinės kilmės gėrimų, tokių kaip arbata ir vynas, sudedamoji dalis [41]. Augalai fenolinius junginius gamina kaip antrinius metabolitus, kurie svarbūs augalo fiziologijai, dalyvauja įvairiuose procesuose, tokiuose kaip augimas, pigmentacija, ap(si)dulkinimas, taip pat atsparumo mechanizmuose prieš patogenus, prėšrūnus, ligų sukėlėjus, aplinkos stresą [44; 49; 68; 70], saugo nuo UV šviesos kenksmingo poveikio [43; 54]. Fenoliniai junginiai daugiau nei šimtmetį buvo žinomi kaip audinių pigmentai ir priklauso didžiajai antrinių metabolitų grupei, kuri plačiai paplitusi visuose augalinės kilmės maisto produktuose [49]. Šie junginiai turi įtakos vaisių ir žiedų spalvai, kvapui [44; 68; 70].

Fenoliniai junginiai kaupiasi įvairiuose augalų audiniuose ir ląstelėse ontogenezės metu priklausomai nuo įvairių aplinkos sąlygų ir augalų vystymosi stadijos [44; 60; 67]. Augalų audiniuose ir ląstelėse šie junginiai pasiskirstę nevienodai, netirpūs fenoliniai junginiai išsidėsę ląstelių sienelėse, o tirpūs augalo ląstelių vakuolėse [54; 67]. Jie taip pat gali lokalizuotis vienaskilčių ir dviskilčių augalų lapuose. Fenilpropanoidai (hidroksicinamatai) ir flavonoidai paprastai kaupiasi apsauginių ląstelių centrinėse vakuolėse ir epiderminėse lapo ląstelėse bei ūgliuose [60], taip pat lokalizacijos vieta priklauso nuo augalo rūšies, audinio ir vystymosi etapo. Ląstelių sienelių fenoliai, tokie kaip lignanai ir hidroksicinamono rūgštys yra prisijungę prie kitų ląstelės komponentų. Šie junginiai svarbūs mechaniniam ląstelės sienelės atsparumui, svarbūs augalo augimo procesams, morfogenezei, taip pat ląsteliniam atsakui į stresą ir patogenus [54]. Fenolinių junginių biosintezė vyksta citozolyje [10].

4.2.2.

Struktūros ypatumai

Fenolinių junginių struktūroje yra aromatinis žiedas, turintis vieną ar keletą hidroksilo grupių ir šie junginiai gali egzistuoti pavienių fenolinių molekulių pavidalu arba sudėtingos didelės molekulinės masės polimerų pavidalu. Nepaisant struktūrinės įvairovės šių junginių grupė dažnai vadinama – polifenoliais [10; 43; 50]. Dauguma natūralių fenolinių junginių randami susijungę su mono- ir polisacharidais, prisijungusiais prie vienos ar kelių fenolinių grupių, taip pat fenoliniai junginiai gali būti randami funkcinių junginių, tokių kaip esteriai ar metilesteriai pavidale. Remiantis fenolinių junginių struktūrine įvairove jie gali būti skirstomi į keletą grupių, iš jų svarbiausios yra flavonoidai ir fenolinės rūgštys [10].

Fenolinės rūgštys augaluose gali būti randamos laisvos arba konjuguotos [43]. Šios rūgštys pagal struktūrą skirstomos į du pogrupius: hidroksibenzoinės ir hidroksicinamono rūgštys. Hidroksibenzoinėms rūgštims priklauso galo, p-hidroksibenzoinė, protokatecho, vanilino ir siringo rūgštys, kurioms būdinga bendra C6 - C1 struktūra [10; 68], o skirtumus šioje grupėje sąlygoja papildomas aromatinio žiedo hidroksilinimas ar metilinimas [1]. Šių rūgščių kiekiai augaluose nedideli [24]. Hidroksicinamono rūgštys yra vienos svarbiausių ir dažniausiai sutinkamų fenilpropanoidų [40; 50]. Tai yra aromatiniai junginiai, kuriems būdinga C6 – C3 struktūra -, labiausiai paplitusios yra kavos, ferulo, p-kumaro ir sinapo rūgštys (3 pav.) [10; 43; 68].

Hidroksibenzoinės rūgštys Hidroksicinamono rūgštys

R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 p-hidroksibenzoinė H H OH H p-kumaro H H OH H

Galo H OH OH OH Ferulo H OCH3 OH H

Protokatecho H OH OH H Sinapo H OCH3 OH OCH3

Siringo H OCH3 OH OCH3 Kavos H OH OH H

3 pav. Dažniausiai gamtoje sutinkamos fenolinės rūgštys [67]

(Stalikas CD. 2007)

Hidroksicinamono rūgščių dariniai dažniausiai pasitaiko kaip paprastieji esteriai su hidroksi-karboksirūgštimis ar gliukoze, o hidroksibenzoinės rūgšties dariniai daugiausiai egzistuoja glikozidų pavidale. Be to, fenolinės rūgštys augalinės kilmės maiste gali būti kaip esteriai ar glikozidai konjuguoti su kitais natūraliais junginiais tokiais kaip flavonoidai, alkoholiai, hidroksi riebiosios rūgštys, steroliai ar gliukozidai [68].

Flavonoidai sudaro didžiausią augalų fenolinių junginių dalį - daugiau nei pusę iš 8000 natūraliai susidarančių fenolinių junginių [10]. Šie junginiai plačiai paplitę augalų karalystėje, tačiau neaptinkami dumbliuose ir grybeliuose [50].

Flavonoidai yra mažos molekulinės masės junginiai sudaryti iš penkiolikos anglies atomų, sudarančių C6–C3–C6 struktūrinį pagrindą. Jį sudaro du aromatiniai A ir B žiedai, sujungti trijų anglies atomų tilteliu, dažniausiai suformuojančiu deguonies heteroatomą turintį heterociklinį žiedą C [26; 33; 49; 59; 67; 74]. Flavonoidų aglikono bendroji struktūrinė formulė pateikta 4 pav.

4 pav. Flavonoidų aglikono bendroji struktūrinė formulė [67]

(Stalikas CD. 2007)

Flavonoidai augaluose sutinkamai aglikonų arba dažniau - glikozidų pavidale [50; 66; 69]. Randami flavonoidų O- ir C- glikozidai. Pastarieji yra retesni nei O- glikozidai. O- glikozidų struktūroje cukrinė dalis yra prijungta prie aglikono per hidroksi grupę dažniausiai 3- ar 7 – oje padėtyse, o C glikoziduose cukrinė dalis tiesiogiai prijungta prie aglikono anglies atomų, paprastai prie 6 ar 8 anglies atomo. Glikozidų struktūroje gali būti įvairios angliavandenių molekulės, tačiau dažniausiai pasitaiko gliukozė, ramnozė, arabinozė ir galaktozė [64].

Priklausomai nuo įvairių heterociklinio žiedo C struktūrinių modifikacijų skiriamos pagrindinės flavonoidų klasės: flavonoliai, flavonai, flavanonai, flavanoliai (arba katechinai), izoflavonai, flavanonoliai, ir antocianidinai. Pakeitimai A ir B žiede (oksidacija, alkilinimas, acilinimas, glikozilinimas, sulfonimas) padidina junginių įvairovę kiekvienoje flavonoidų klasėje [10; 43; 49; 68].

4.2.3. Poveikis žmogaus organizmui

Piešuždegiminis poveikis. Šis poveikis pasireiškia dėl sudėtyje esančių flavonoidų ir

seskviterpenų laktonų, slopinant arachidono rūgšties metabolizmą [16; 56]. Priešuždegiminis veikimas taip pat būdingas alkamidams [63]. Polinesotieji alkamidai išskirti iš augalo slopina ciklooksigenazę ir 5 lipoksigenazę in vitro. Alkamidai yra struktūriškai panašūs į arachidono rūgštį ir veikia kaip jos analogai konkurenciniu būdu inhibuodami fermentus. Jų aktyvumas in vivo priklauso nuo tikrųjų molekulių struktūros. Paprastoji kraujažolė gali būti vartojama kaip priešuždegiminė priemonė gydant

Candida albicans sukeltą makšties uždegimą, priešmentruacinę įtampą, nereguliarias menstruacijas

[56].

Priešuždegiminiam paprastosios kraujažolės poveikiui labai svarbu fermentų - serino proteazės žmogaus neutrofilo elastazės (HNE) ir metaloproteinazių (MMP -2 ir -9) slopinimas [56]. Šis nuo dozės priklausomas fermentų slopinamasis poveikis būdingas augalo ekstraktams ir

frakcijoms, kurie yra praturtinti flavonoidais ir dikafeilchino rūgštimis [15; 56]. Serino proteazė žmogaus neutrofilo elastazė ir metaloproteinazės MMP-2 ir -9 dalyvauja uždegiminiame procese, ypač esant chroniškam (įsisenėjusiam) uždegimui. Todėl šių fermentų slopinimas ir yra svarbus prisidedant prie priešuždegiminio paprastosios kraujažolės veikimo [4; 15; 16].

In vitro buvo ištirtas žaliavos slopinantysis poveikis abiems fermentams. Tyrimo metu buvo

naudojamas 20 proc. metanolinis paprastosios kraujažolės ekstraktas, dikafeilchino rūgščių frakcija, turinti 48,8 proc. šių rūgščių ir flavonoidų frakcija, turinti 11,1 proc. flavonoidų su apigenino-7-O-glikozidu, rutinu ir liuteolino-7-O-glikozidu kaip pagrindiniais junginiais. Nustatytas nuo dozės priklausomas HNE slopinimas tirtose koncentracijų nuo 3 iki 100 μg/ml ribose. Buvo nustatyta, kad flavonoidai ir dikafeilchino rūgštys yra stiprūs HNE inhibitoriai, bet HNE slopina stipriau nei MMP-2 ir -9 [16].

Šios proteazės dalyvauja lėtinių uždegiminių odos ligų procesuose, tokiuose kaip psoriazė ar atopinis dermatitas, taip pat esant uždegiminėms žarnų ligoms, tokioms kaip Krono liga ar opinis kolitas. Be to, šių proteazių kiekis padidėja esant lėtiniam išorinės ausies uždegimui, kuris gali būti malšinamas naudojant šių proteazių inhibitorius. Hirota et al. (2005) tyrė kolito ir HNE tarpusavio ryšį ir rado gerokai padidėjusį HNE kiekį opų srityse. Gydymas peroraliais aktyviais HNE inhibitoriais sumažino uždegimą ir opų progresavimą. Taigi kraujažolių ekstraktų gebėjimas slopinti HNE ir MMP iš tiesų gali būti svarbus priešuždegiminiam augalo veikimui [16].

Spazmolitinis poveikis. Šis poveikis būdingas flavonoidais praturtintai paprastosios

kraujažolės frakcijai izoliuotoje jūros kiaulytės klubinėje žarnoje ir izoliuotoje triušio žarnoje [4; 15]. Dėl flavonoidų frakcijos pastebėtas nuo dozės priklausomas susitraukimų sumažėjimas. Didžiausias antispazminis poveikis nustatytas veikiant flavonoidų aglikonams, šiek tiek mažesniu aktyvumu pasižymi monoglikozidai, tuo tarpu diglikozidas rutinas ir flavonoidų metabolitas - homovanilino rūgštis šiuo poveikiu nepasižymi. Be to, tyrimų metu nustatyta, kad flavonoidų frakcijos sukeliamas antispazminis poveikis labiausiai susijęs su vidinės kalcio srovės blokada, taip pat dėl antagonistinio poveikio mediatoriams [15].

Choleretinis poveikis. Šį poveikį apsprendžia paprastosios kraujažolės sudėtyje randamos

dikafeilchino rūgštys. Taip pat nustatytas šiomis rūgštimis praturtintos frakcijos choleretinis poveikis izoliuotose perfuzuotose žiurkių kepenyse [13; 15]. Įdomu tai, kad frakcijos choleretinis poveikis yra 2-3 kartus didesnis nei cinarino (1,3 – DCQA) – choleretiškai aktyvios artišoko sudedamosios dalies, kuri pasižymi tulžies sekreciją skatinančiu poveikiu [15].

Kepenis saugantis paprastosios kraujažolės poveikis buvo įrodytas atliekant keletą tyrimų. Prieš gydymą naudotas paprastosios kraujažolės ekstraktas sumažino pelių, kenčiančių nuo d-

galaktozamino ir lipopolisacharido sukelto hepatito, mirtingumą 60 proc. Optimali ekstrakto dozė 300 mg/kg neleido didėti plazmos alanino aminotransferazės ir aspartato aminotransferazės kiekiams, kurių didėjimą skatino toksinai. Taip pat buvo nustatyta pagerėjusi gyvūnų kepenų struktūra, sumažėjo ląstelių patinimas ir apoptozinių ląstelių kiekis [54]. Siekiant nustatyti ekstrakto kepenis saugančio poveikio mechanizmą in vitro buvo naudojama izoliuota triušio tuščioji žarna, ir buvo nustatyta, kad ekstraktas sukelia nuo koncentracijos priklausomą spontaninių ir kalio jonų sukeliamų susitraukimų atsipalaidavimą [46; 56].

Atsitiktinių imčių, dvigubai aklo, placebu kontroliuojamo klinikinio tyrimo metu, kuriame buvo tirti pacientai, sergantys kepenų ciroze buvo gydyti augaliniu preparatu „Liv-52“. Viena iš septynių vaisto sededamųjų dalių yra paprastosios kraujažolės ekstraktas (16 mg/tabletėje). Po 6 gydymo mėnesių pastebėta, kad sumažėjo plazmos alanino aminotranferazių ir aspartato aminotranferazių kiekiai, ascitas [42; 56].

Antioksidantinis poveikis. Vaisiai, daržovės, augalai, kuriuose yra fenolinių junginių

sumažina lėtinių ligų: vėžio, širdies ir kraujagyslių, degeneracinių ligų, lėtinių uždegimų išsivystymo riziką. Daugelis šių ligų susijusios su oksidaciniu stresu, atsirandančiu dėl aktyviųjų deguonies ir azoto junginių poveikio. Nustatyta, kad fenoliniai junginiai yra stiprūs antioksidantai, gebantys neutralizuoti laisvuosius radikalus atiduodami elektroną ar vandenilio atomą [25; 69].

Aktyvieji deguonies (ROS – reactive oxygen species) ir azoto junginiai (RNS – reactive

nitrogen species) vadinami laisvaisiais radikalais. Tai yra labai reaktyvios molekulės nuolat

gaminamos įvairių biologinių reakcijų metu - mitochondrijų kvėpavimo grandinėje. Dalis organizmo gynybinių mechanizmų yra makrofagų atpalaiduoti aktyvieji deguonies junginiai. Organizmas turi skirtingus antioksidacinės gynybos mechanizmus prieš ROS įskaitant daugelį fermentų (katalazes, superoksido dismutazes, glutationo reduktazes, glutationo peroksidazes), nedideles antioksidantų molekules (šlapimo rūgšties, glutationo, albumino, baltymų -SH grupes, bilirubino) ir tam tikrus vitaminus (askorbo rūgštį, α- tokoferolį), taip pat karotenoidų. Oksidatorių poveikyje, išsiekvojusi antioksidantinė apsauga gali sąlygoti oksidacinio streso atsiradimą, tai yra disbalansą tarp laisvųjų radikalų gamybos greičio ir atpalaidavimo kas padidina žalos tikimybę kitoms molekulėms [36].

OH• yra reaktyviausias ROS, galintis sukelti įvairių biomolekulių, tokių kaip fermentai, baltymai, lipidai ir DNR oksidaciją. Oksidacinis stresas yra svarbus plėtojantis įvairioms lėtinėms degeneracinėms, širdies vaikinikinių kraujagyslių ligoms, vėžiui ir degeneraciniams procesams susijusiems su senėjimu. Oksiduotos DNR bazės yra galimai mutageniškos ir todėl yra susijusios su kancerogeniniais procesais. Cukrinis diabetas yra taip pat susijęs su oksidaciniu biomolekulių pažeidimu. Todėl mitybiniu keliu gauti antioksidantai gali būti labai svarbūs saugant organizmą nuo lėtinių ligų [36].

Jei kvėpavimo grandinėje deguonies mažai tada jis gali būti nepilnai redukuojamas į superoksido radikalą, kuris pakinta į H2O2. Šis junginys savo ruožtu sutrikdo organelių antioksidantinę gynybą. Kai superoksido susidaro daugiau arba kai jis nėra pilnai pašalintas, H2O2 kaupiasi. Mitochondrijos yra svarbūs intraląsteliniai taikiniai junginiams, tokiems kaip flavonoidai, kurie saugo nuo nepageidaujamo ROS poveikio todėl, kad mitochondrijos yra svarbus ROS taikinys [33].

Fenoliniai junginiai pasižymi antioksidaciniu poveikiu, jie gali veikti kaip redukciniai veiksniai, kaip vandenilį ar elektroną atiduodantys antioksidantai, metalų chelatoriai [10; 43; 68]. Jie gali apsaugoti biologines molekules nuo oksidacijos, trikdo lipidų ir kitų molekulių oksidaciją, nes jų struktūroje esančios hidroksilinės grupės linkusios greitai atiduoti vandenilio atomą ar elektroną laisviems radikalams, ir radikalai nukenksminami [68].

Įdomu tai, kad kai kurie fenoliniai antioksidantai esant tam tikroms sąlygoms (esant dideliam pH, esant deguonies molekulėms, didelėms metalų jonų koncentracijoms) veikia kaip prooksidantai ir pradeda oksidacijos procesą. Mažos molekulinės masės fenoliai (pvz galo rūgštis) oksiduojasi ir gali veikti kaip prooksidantai [68].

Fenolinių junginių antioksidantinės savybės priklauso nuo jų struktūros, aromatinių hidroksilo grupių skaičiaus, išsidėstymo. Fenolinių rūgščių antioksidantinis potencialas priklauso nuo hidroksilo grupių skaičiaus molekulėje ir vietos atsižvelgiant į funkcinę karboksilo grupę [10; 36; 59; 68]. Fenolinių rūgščių antioksidantinis aktyvumas didėja didėjant hidroksilinimo laipsniui, pvz trihidroksilintai galo rūgščiai būdingas stiprus antioksidantinis aktyvumas. Aromatinio žiedo 3 ir 5–oje padėtyse OH grupes pakeitus metoksi grupėmis aktyvumas sumažėja (pvz siringo rūgštis). Hidroksicinamono rūgštys pasižymi didesniu antioksidantiniu aktyvumu lyginant su atitinkamomis hidroksibenzoinėmis rūgštimis. Šių rūgščių stipresnis aktyvumas gali būti sąlygojamas dvigubųjų CH ryšių buvimo jų struktūroje. Atstumas tarp CH–COOH grupių užtikrina greitesnį vandenilio atidavimą ir radikalų stabilizavimą nei -COOH grupė hidroksibenzoinėse rūgštyse [10; 28]. Monohidroksibenzoinės rūgštys, turinčios OH grupę orto ar para padėtyje –COOH grupės atžvilgiu nepasižymi antioksidantiniu aktyvumu [10].

Struktūros aktyvumo ryšys flavonoidų molekulėse paprastai sudėtingesnis nei fenolinėse rūgštyse, dėl jų struktūros sudėtingumo [10; 28]. Flavonoidų antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo struktūros, heterociklinio ir B žiedo pakaitų, ypač nuo o-di-OH grupės buvimo B žiede. Jie gali sinergistiškai veikti su kitais antioksidantais [33]. Kai kurie struktūriniai požymiai ir natūralūs pakeitimai B ir C žieduose lemia flavonoidų antioksidantinį aktyvumą: hidroksilinimo laipsnis ir OH grupių padėtis B žiede, ypač orto dihidroksilinta struktūra B žiede (katecholio grupė) suteikia didesnį aktyvumą ir stabilumą aroksiliniam radikalui perkeliant elektroną. Dvigubas ryšys tarp C2 ir C3 atomų, konjuguotas su 4 okso ar 3 hidroksi grupe C žiede svarbus flavonoidų gebėjimui sujungti

radikalus [10; 74], OH grupių keitimas metoksi grupėmis B žiede taip pat keičia gebėjimą sujungti radikalus [10]. 3- ir 5- hidroksi grupės, konjuguotos su 4 okso grupe A ir C žiede, būtinos maksimaliam laisvuosius radikalus surišančiam poveikiui. Antioksidantiniam flavonoidų aktyvumui taip pat svarbi 3- hidroksi grupė (dėl 3- glikozilinimo sumažėja junginio aktyvumas lyginant su atitinkamu aglikonu) [28].

Poveikis reprodukciniams organams. Vartojant etanolinį ir hidroalkoholinį paprastosios

kraujažolės ekstraktą po 2-300 mg/kg per dieną 20-30 dienų pastebėta, kad embrioniniame epitelyje padidėjo metafazių, sukeliančių embrioninių ląstelių nekrozę kiekis, padidėjo nesubrendusių ląstelių eksfoliacija (lupimasis sluoksniais) ir sėklinių kanalėlių vakuolizacija. Vartojant vandeninį ekstraktą Wistaro žiurkėms labai padaugėjo nenormalių spermatozoidų, o kitiems lytiniams organams jokių pokyčių nepastebėta [56].

Kita vertus yra nustatyta, kad šiame augale yra fitoestrogeninių junginių. Rekombinantinėms MCF-7 ląstelėms buvo nustatytas estrogenis kraujažolės metanolinio/vandeninio ekstrakto poveikis in

vitro. Svarbiausi estrogeniniai junginiai yra flavonoidai apigeninas ir liuteolinas [7; 45; 56] .Veiklioji

frakcija taip pat turi flavono darinių - apigenino- 7- O- β- D- gliukopiranozido, liuteolino - 7- O- β- D- gliukopiranozido, liuteolino – 4 – O - β- D- gliukopiranozido, rutino ir kavos rūgšties darinių- 3,5-dikafeilchino ir chlorogeno rūgščių [56; 45].

Priešvėžinis poveikis. Iš paprastosios kraujažolės išskirtas flavonoidas kasticinas, gali būti

svarbus veiksnys vėžio terapijoje. Manoma, kad jis turėtų citotoksiškai veikti navikus [39]. Tiriant priešvėžinį jo aktyvumą in vitro buvo nustatyta, kad jis stabdo G2/M ląstelių augimą ir skatina jų apoptozę. Tiriant priešvėžinius mechanizmus, nustatyta, kad kasticinas veikdamas kaip tubuliną rišančioji madžiaga, sužadina p21, kuris slopina Cdk1 [51; 56].

Priešvėžinis aktyvumas būdingas ne tik flavonoidams, bet ir eteriniam aliejui. Jis gali moduliuoti peritoninių makrofagų aktyvumą pelėse [51]. Eterinis aliejus stimuliuoja makrofagus, kad jie gamintų H2O2 ir TNF (auglių nekrozės faktorius). Taip pat priešvėžiškai veikia ir seskviterpenai [56].

Nustatyta, kad Achimilo rūgšties A, B, ir C metilo esteriai išskirti iš paprastosios kraujažolės žiedų veikia prieš P-388 leukemines ląsteles pelėse [56; 63].

Naujausiais tyrimais nustatyta, kad fenolinių cinamono rūgščių esteriai ir amidai citotoksiškai veikia žmogaus gimdos kaklelio adenokarcinomos (HeLa - human cervix adenocarcinoma), mieloleukemijos (K562), piktybinės melanomos, estrogeno receptorių teigiamas krūties vėžio (MCF-7) ląsteles. Ląstelės ciklo fazių išskirstymo tyrimai parodė, kad cinamono rūgščių dariniai slopindami ląstelių augimą skatina jų žūtį. Taigi šie dariniai gali būti svarbūs tolimesniame antinavikinių vaistų vystyme [53].

4.2.4. Biologinis pasisavinimas ir metabolizmas

Fenolinių junginių nauda sveikatai priklauso nuo jų absorbcijos ir metabolizmo. Pastarasis priklauso nuo jų struktūros, konjugacijos su kitais fenoliais, glikozilinimo/acilinimo laipsnio, molekulių dydžio ir tirpumo [10; 50].

Iš pradžių buvo manyta, kad jei žarnyne nėra glikozidą atskeliančių fermentų tai tik aglikonai gali pereiti per žarnyno sieneles, tačiau vėliau buvo nustatyta, kad glikozidų absorbcija žmogaus organizme irgi vyksta [10; 67]. Taip pat nustatyta, kad kvercetino glikozido absorbcija (54 proc.) buvo net didesnė nei jo aglikono (24 proc.). Taigi įrodyta, kad konjugacija su gliukoze didina biologinį pasisavinimą [10].

Fenolinių junginių biologiniam pasisavinimui taip pat gali turėti įtakos skirtingos ląstelių sienelių struktūros, glikozidų išsidėstymas ląstelėse. Palyginus su visu fenolinių junginių biologiniu pasisavinimu, manoma, kad apie 5-10 proc. jų yra absorbuojama plonojame žarnyne [10].

Tie fenoliniai junginiai, kurie nebuvo absorbuoti plonajame žarnyne, taip pat kaip ir absorbuoti junginiai yra metabolizuojami kepenyse ir su tulžimi patenka į gaubtinę žarną. Storosios žarnos mikrofloros išskirti fermentai hidrolizuoja neabsorbuotus glikozidus, nutraukia ryšius, suardo didesnius fenolinius junginius į paprastesnes molekules, tokias kaip fenolinės rūgštys arba padalina heterociklinį, deguonies turintį žiedą [10].

Fenoliniai junginiai gali būti metilinami, katalizuoja katechol-O-metiltransferazė (KOMT), sulfoninami, katalizuoja sulfotranferazės. Galima jų gliukuronizacija, katalizuojama UDP gliukuronoziltransferazės arba minėtų procesų kombinacija plonajame žarnyne, kepenyse ir inkstuose. Pirmoji metabolizmo vieta priklauso nuo dozės. Jei dozė mažesnė metabolizmas vyksta žarnyno gleivinėje, jei didesnė - kepenyse. Šių fermentinių biotransformacijų metu konjuguojamos OH grupės, susidaro metabolitai, kurie sumažina antioksidantinį aktyvumą [10].

4.3. Fenolinių junginių analizė

Dėl iš augalinių žaliavų gaminamų vaistinių preparatų cheminės sudėties įvairovės ir sudėtingumo, jų kokybiniams ir kiekybiniams tyrimams turi būti parenkami tikslūs, jautrūs, atrankūs ir efektyvūs analizės metodai, užtikrinantys gaunamų rezultatų patikimumą.

Analizuojant fenolinius junginius vienas iš svarbiausių analizės etapų yra bandinio paruošimas. Bandinių ruošimui gali būti naudojamas užšaldomasis džiovinimas, džiovinimas ore ar

džiovyklėje. Išdžiovinti bandiniai sumalami iki tam tikro dydžio dalelių [46], sutrinami ir homogenizuojami [28; 67].

Sekantis žingsnis yra biologiškai aktyvių junginių ekstrakcija. Junginiai gali būti ekstrahuojami iš šviežios, šaldytos ar džiovintos augalinės žaliavos [28]. Fenoliniai junginiai yra gana hidrofiliški [69], todėl jų ekstrakcijai naudojami įvairūs organiniai tirpikliai, tarp jų metanolis, etanolis, acetonas, etilacetatas ir įvairios jų kombinacijos bei mišiniai su vandeniu. Fenolinių junginių išeigą ekstrakcijos metu įtakoja įvairūs parametrai tokie kaip ekstrakcijos trukmė, temperatūra, ekstrahavimų skaičius, tirpiklio tipas, mėginio fizinės savybės [28; 48; 67; 69].

Bandinių ekstrakcijai gali būti naudojami įvairūs ekstrakcijos metodai.Įprastiniams fenolinių junginių ekstrakcijos iš kietafazių bandinių metodams priskiriama Soksleto ektrakcija, maceracija, kietafazių bandinių ekstrakcija grįžtamuoju šaldytuvu šildant. Šie metodai technologiškai nesunkiai atliekami, nereikalinga brangi aparatūra, taip pat pakankamai gera ekstrakcijos išeiga, tačiau sunaudojami dideli kiekiai organinių tirpiklių, kurie neigiamai veikia aplinką ir žmogaus sveikatą. Jiems būdinga ilga ekstrakcijos trukmė, veikiant šviesai, orui, aukštai temperatūrai gali suirti ekstrahuojami junginiai. Siekiant sutrumpinti ekstrakcijos trukmę, pagerinti ekstrakcijos efektyvumą, ekstrahuojamų junginių išeigą, sumažinti organinių tirpiklių sąnaudas gali būti taikoma ekstrakcija naudojant ultragarsą, mikrobangas, aukštą slėgį, superkritinių skysčių ekstrakciją [28; 48].

Ektrakcija ultragarsu (angl. ultrasound-assisted extraction) yra naudinga, efektyvi, paprasta technologija, nereikalaujanti sudėtingos, brangios aparatūros [28; 43]. Metodas plačiai taikomas įvairių fenolinių junginių išskyrimui iš įvairių augalo dalių: lapų, kotelių, vaisių, sėklų. Mikrobangų pritaikymas ekstrakcijoje sutrumpina ekstrakcijos trukmę, sunaudojama mažiau tirpiklių. Metodas gali būti naudojamas mažos molekulinės masės fenolinių junginių, tokių kaip fenolinės rūgštys (galo, elago rūgščių) ekstrakcijai. Tačiau jis nėra tinkamas junginių, kurie stuktūroje turi hidroksi pakaitų ar yra jautrūs aukštai temperatūrai, ekstrakcijai [28].

Pagreitinta ekstrakcija tirpikliais (angl. pressurized liquid extraction) yra santykinai nauja technologija, atliekama naudojant aukštą slėgį ir temperatūrą, kurių pagalba galima greitesnė ekstrakcija, proceso metu sunaudojama mažiau tirpiklių. Jei tirpikliu naudojamas vanduo - atliekama taip vadinamoji ekstrakcija suslėgtu karštu vandeniu (angl. subcritical water extraction). Vanduo pašildomas iki 200 °C, temperatūros sąlygota vandens dielektrinės konstantos kaita leidžia jam elgtis kaip organiniam tirpikliui (pvz. esant 200 °C, vandens dielektrinė konstanta yra lygi 36, tai yra artima metanolio). Kadangi fenoliniai junginiai aukštoje temperatūroje lengvai oksiduojasi, svarbu įrodyti, kad junginiai nesuirs esant pasirinktoms suslėgto skysčio ekstrakcijos sąlygoms [28].

Pagreitinta ekstrakcija tirpikliais yra automatizuotas metodas. Ekstrakcijos metu naudojama aukšta temperatūra ir slėgis padeda tirpikliui prasiskverbti gilyn į augalo ląsteles, be to fenoliniai

junginiai apsaugomi nuo suirimo. Lyginant su tradiciniais ekstrakcijos metodais, sunaudojama gerokai mažiau tirpiklių, trumpesnė ekstrakcijos trukmė [48].

Superkritinių skysčių ekstrakcija (angl. supercritical fluid extraction) yra saugesnis, selektyvesnis metodas, taikant jį sutrumpėja ekstrakcijos trukmė, be to galima išvengti išekstrahuotų junginių suirimo, oksidacijos veikiant šviesai, orui [28; 48; 67]. Tai dažnai naudojamas metodas biologiškai aktyvių junginių ekstrakcijai iš vaistinių augalų [23]. Šiam metodui nereikalingi dideli kiekiai toksiškų tirpiklių [43]. Ekstrahuojančiu tirpikliu naudojamas superkritinis anglies dioksidas. Apskritai visi šie metodai yra mažiau kenksmingi aplinkai, sunaudojama mažiau organinių tirpiklių (pvz. pagreitinta ekstrakcija tirpikliais), galima atlikti ekstrakciją taikant netoksiškus, nekenksmingus tirpiklius, pvz. vandenį (pvz. ekstrakcija suslėgtu karštu vandeniu), superkritinį anglies dioksido skystį (pvz. superkritinio skysčio ekstrakcija) [28].

Kietafazė ekstrakcija (angl. solid phase extraction) – taikoma analičių išskyrimui iš išvalytų augalinių ekstraktų. Šis metodas turi daug privalumų: analičių koncentravimo galimybė, gaunami maksimaliai išvalyti ekstraktai, lengva automatizuoti, suderinamumas su kitais instrumentinės analizės metodais, mažai sunaudojama organinių tirpiklių [23].

Fenolinių junginių kiekybiniams tyrimams reikalingi jautrūs ir selektyvūs metodai [43]. Tam tikslui taikomi įvairūs chromatografiniai analizės metodai, taip pat spektrofotometrija, kapiliarinės eletroforezės metodai [48].

Spektrofotometrija - vienas iš sąlyginai paprastesnių, augalų fenolinių junginių kiekybiniam įvertinimui taikomų metodų. Bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti ilgą laiką buvo naudojami du pagrindiniai spektrofotometriniai Folin-Denis (FD) ir Folin-Ciocalteu (FC) metodai. Abu metodai pagrįsti cheminės redukcijos procesu, kuris įvyksta naudojant reagentus, turinčius sudėtyje volframo ir molibdeno. Redukcijos reakcijos metu esant fenoliniams junginiams susidaro mėlynos spalvos reakcijos produktai, turintys platų absorbcijos spektrą esant apie 760, 765 nm bangos ilgiui [28; 52; 54; 67]. Tačiau taikant šiuos metodus, naudojami reagentai gali reaguoti ne tik su fenoliniais junginiais, o taip pat ir su kai kuriose augalinėse žaliavose esančiais aminais, cukrais, askorbo rūgštimi, todėl gali pasunkėti analizė [48; 54; 69]. Bendras flavonoidų kiekis gali būti nustatomas su NaNO2 ir AlCl3 reagentais. Mišinio absorbcija matuojama esant 510, 430 nm bangos ilgiui [18; 20; 52]. Taip pat gali būti nustatoma su oksaloboratiniu reagentu (boro rūgštis, natrio molibdatas, bevandenė skruzdžių rūgštis), absorbcijos dydis matuojamas esant 401 nm bangos ilgiui [37]. Bendras hidroksicinamono rūgščių kiekis nustatomas su Arnow reagentu (NaNO2 ir natrio molibdatu). Tiriamųjų mėginių absorbcijos dydis matuojamas esant 525, 500 nm bangos ilgiui [18; 37]. Šis metodas plačiai taikomas fenolinių rūgščių kiekybiniam nustatymui įvairių Asteraceae šeimos augalų žaliavose (kalninėje arnikoje, vaistinėje medetkoje, paprastajame kietyje, vaistinėje ramunėje ir kituose) [37].

Spektrofotometriniais metodais galima įvertinti bendrą junginių kiekį įvairiose augalinėse matricose, tačiau individualių junginių kiekybiniam įvertinimui šie metodai netinkami [43].

Fenolinių rūgščių, individualių flavonoidų atskyrimui, identifikavimui ir kiekybiniam įvertinimui gali būti naudojama dujų chromatografija. Metodo taikymą riboja mažas fenolinių junginių lakumas [28; 48; 67]. Farmakologiškai aktyvių junginių detekcijai dažniausiai taikomas liepsnos jonizacinis detektorius, plačiai taikomi ir masių spektrometrai. Kombinuojant dujų chromatografiją su masių spektroskopija pasiekiamas didesnis metodo jautrumas ir selektyvumas [48].

Efektyvioji skysčių chromatografija (ESC) yra dažniausiai pasirenkamas, patikimiausias ir populiariausias metodas fenolinių junginių atskyrimui ir kiekybiniam įvertinimui. Taikant šį metodą, fenolinių junginių analizei įtakos turi bandinio išvalymas, detektoriai, kolonėlės tipas, judri fazė. Nustatymui dažniausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija su įvairiais detekcijos variantais. Atvirkštinių fazių ESC judria faze naudojami acetonitrilas, metanolis arba jų vandeniniai tirpalai. Fenoliniai junginiai dažniausiai identifikuojami naudojant UV/VIS ir diodų matricos detektorius. Įvairių fenolinių junginių klasių struktūrai charakterizuoti ir patvirtinti gali būti naudojami masių spektrofotometriniai detektoriai, kuriuos kombinuojant su ESC metodas tampa labai jautrus [48; 54; 67; 69]. Šis metodas leidžia vienu kartu analizuoti visus dominančius junginius, kartu su jų galimais dariniais ar skilimo produktais [28]. Galima nustatyti analitę net esant mažai jos koncentracijai, kai mišinyje yra kitų, analizei trukdančių biologiškai aktyvių junginių [67].

Taip pat gali būti taikoma plonasluoksnė chromatografija – tai gana dažnas metodas, taikomas augalinių ekstraktų analizėje [23; 24], kokybinėje polifenolinių junginių analizėje [37]. Šis metodas yra naudingas norint greitai nustatyti fenolinius junginius bandinyje [48; 64; 67]. Jo privalumas yra analizės atlikimo paprastumas [48]. Metodas yra gana senas, ir palyginus su kitais analitiniais metodais, mažiau modernus, todėl šį analizės metodą rekomenduojama pakeisti kitais chromatografiniais metodais, tokiais kaip ESC [24].

Kapiliarinė elektroforezė yra šiuolaikinis analizės metodas taikomas greitam ir efektyviam mažos ir vidutinės molekulinės masės junginių atskyrimui ir kiekybiniam nustatymui. Dėl junginių išskirstymo efektyvumo, didelės skiriamosios gebos, trumpos analizės trukmės ir mažų bandinio ir reagentų sąnaudų, šis metodas yra įvairiapusiškas analitinis metodas, taikomas įvairių fenolinių junginių, įvairiuose bandiniuose analizei. Kita vertus lyginant su dujų ar skysčių chromatografija, šiam metodui būdingas gana prastas duomenų atkuriamumas [43; 48].

5.TYRIMO METODIKA IR METODAI

5.1. Tyrimų objektas

Fenolkarboksirūgščių sudėties įvertinimui naudotos natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) augalų augalinės žaliavos, surinktos iš įvairiuose Lietuvos regionuose esančių augaviečių, masinio žydėjimo metu, 2013 metų liepos – rugpjūčio mėnesiais. Tyrimo metu naudoti augalinės žaliavos ėminiai buvo surinkti iš 23 natūralių augaviečių, esančių šiaurės rytų, pietryčių, pietvakarių, centriniame bei pietiniame Lietuvos regionuose (5 pav. ir 1 priedas).

5 pav. Achillea millefolium žolės ( ) ir žiedų, stiebų, lapų ( ) žaliavų rinkimo vietos gamtinėse cenopopuliacijose, 2013 m.

Fenolkarbosirūgščių sudėties tyrimui buvo ruošiami žolės (~ 10 cm ilgio ūglių viršūnės), lapų, stiebų ir žiedų žaliavų pavyzdžiai. A. millefolium žolės augalinė žaliava buvo surinkta iš 13 gamtinių cenopopuliacijų, esančių įvairiuose Lietuvos regionuose (Šiaudiniškiai, Vilkaviškio r.sav.; Raščiai,

Raseinų r.sav.; Medininkai, Vilkaviškio r.sav.; Margininkai, Prienų r.sav.; Rykantai, Trakų r.sav.; Romainiai, Kauno m.sav.; Grabuciškės, Kaišiadorių r.sav.; Girelės miškas, Kaišiadorių r.sav.; Miklusėnai, Alytaus r.sav.; Žebertonys, Elektrėnų r.sav.; Panevėžiukas, Kauno r.sav.; Pajevonys, Vilkaviškio r.sav.; Stirniai, Trakų r.sav.). Kitose 10 gamtinių cenopopuliacijų surinkti augalinės žaliavos pavyzdžiai buvo suskirstyti į lapus, žiedus (graižus) ir stiebus. Tokiu būdu gauti trijų augalo morfologinių dalių analitiniai pavyzdžiai (Lentvaris Trakų r.sav.; Kryžkalnis, Raseinių r.sav.; Dauparai, Klaipėdos r.sav.; Skaistgiriai, Kėdainių r.sav.; Virbalis, Vilkaviškio r.sav.; Puskelniai, Marijampolės r.sav.; Pašilė, Kelmės r.sav.; Karmėlava, Kauno r.sav.; Šančiai, Kauno m.sav.; Vėžaičiai, Klaipėdos r.sav.).

Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama kambario temperatūroje (20-25 ͦC), sausoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje, gerai vėdinamoje patalpoje.

5.2. Medžiagos ir reagentai

Tyrimų metu naudoti analitinio švarumo reagentai, įsigyti iš Sigma – Aldrich. 96 proc. (v/v) etanolis, įsigytas iš UAB „Stumbras“ (Kaunas, Lietuva). Taip pat tyrimams naudotas išgrynintas vanduo, analitinio švarumo natrio nitritas, natrio molibdatas (≥ 99 proc.), 37 proc. vandenilio chlorido rūgštis, natrio šarmas (99 proc.).

5

.3. Naudota aparatūra

Bandinių ekstrakcijai atlikti naudota ultragarso vonelė „BioSonic UC 100“ (Coltène/Whaledent, Mavajai, JAV). Fenolkarboksirūgščių suminis kiekis paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) žolėje, lapuose, stiebuose ir žieduose nustatytas naudojant spektrofotometrą „Genesys 2“ (Spectronic, USA).

5

.4. Tyrimų metodai

Paprastosios kraujažolės žolės, lapų, stiebų ir žiedų bandinių ekstraktų paruošimas.

Orasausė paprastosios kraujažolės augalinė žaliava buvo smulkinama elektriniu smulkintuvu iki dalelių praeinančių pro 355 µm sietą. Pasveriama apie 0,300 g smulkintos augalinės žaliavos, dedama į kolbutę, užpilama 95 ml 70 proc. (v/v) etanoliu, kolbutė dedama į ultragarso vonelę, kurioje

30 min vykdoma ekstrakcija. Gautas augalinės žaliavos ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą į matavimo kolbutę. Likutis ant filtro praplaunamas 5 ml 70 proc. (v/v) etanolio ir praskiedžiama iki 100 ml. Tokiu būdu pagaminta 13 žolės ekstraktų, 10 lapų ekstraktų, 10 žiedų ekstraktų ir 10 stiebų ekstraktų.

Reagentų paruošimas.

70 proc. (v/v) etanolio tirpalas. Remiantis alkoholimetrine lentele, 665 ml 96 proc. (v/v)

etanolio praskiedžiama su 335 ml išgryninto vandens.

0,5 M vandenilio chlorido rūgšties tirpalas. Tirpalas pagamintas pamatavus 42 ml 37 proc.

vandenilio chlorido rūgšties ir ją sumaišius su išgrynintu vandeniu iki 1 litro.

Praskiestas natrio šarmo tirpalas. Pasveriama tikslus 8,500 g natrio šarmo kiekis ir

ištirpinama išgrynintame vandenyje praskiedžiant iki 100 ml.

Arnow reagentas. Pasveriama tikslus 10,000 g natrio molibdato kiekis, ištirpinama 70-80 ml

išgryninto vandens, tada pasveriama tikslus 10,000 g natrio nitrito kiekis, kuris taip pat ištirpinamas gautame tirpale ir praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 100 ml.

Bendrojo fenolkarboksirūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu [35].

Tyrimų metu, kiekvieno ekstrakto vienam analizės bandymui buvo pagaminama po du tirpalus: tiriamasis ir lyginamasis.

Tiriamasis tirpalas pagamintas sumaišius kolbutėje 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, dedama 2 ml Arnow reagento, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišoma. Iš karto matuojama gauto tirpalo absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui.

Lyginamuoju tirpalu buvo naudojamas tirpalas paruoštas kolbutėje sumaišant 1 ml tiriamo ekstrakto su 2 ml 0,5 M vandenilio chlorido rūgšties, 2 ml praskiesto natrio šarmo, praskiedžiama išgrynintu vandeniu iki 10 ml ir sumaišoma. Kiekvienas ekstraktas tirtas po tris kartus.

Bendras procentinis hidroksicinamono rūgčių kiekis ekstrakte perskaičiuotas chlorogeno rūgštimi remiantis formule:

X (%) =

m A*5,3

;

A – tiriamo tirpalo absorbcija esant 525 nm bangos ilgiui; m – tiriamos augalinės žaliavos masė gramais;

Kiekvienoje bandinių grupėje, vieno ėminio ekstraktui užrašytas to ėminio lyginamojo ir tiriamojo tirpalų absorbcijos spektras, vaizdžiai rodantis, tiriamojo tirpalo absorbcijos maksimumą prie matuoto 525 nm bangos ilgio (6 pav).

- - - lyginamasis tirpalas tiriamasis tirpalas

6 pav. Tirtų Achillea millefolium augalinių žaliavų, etanolinių ekstraktų absorbcijos spektrai

Duomenų analizė. Statistinė duomenų analizė ir duomenų grafinis atvaizdavimas atlikti „MS

Excel“ (Microsoft, JAV) kompiuterine programa ir SPSS 20 („IBM“, JAV) statistiniu paketu. Duomenų statistiniam įvertinimui apskaičiuotos tyrimo metu gautų duomenų padėties (vidurkis, mediana, kvantiliai) ir sklaidos (variacijos koeficientas, standartinis nuokrypis) charakteristikos. Išsamesniam imčių duomenų palyginimui nubrėžta sklaidos diagrama.

Norint patikrinti ar duomenų pasiskirstymas atitinka normalųjį skirstinį nubrėžta duomenų histograma su normaliojo skirstinio kreive. Taip pat pritaikyti Kolmogorovo Smirnovo ir Shapiro Wilk‘o testai. Duomenų vidurkiai palyginti naudojant Stjudento t testą nepriklausomoms imtims. Pasirinktas reikšmingumo lygmuo α=0,05.