Skirtingos kilmės gintaro cheminės sudėties nustatymas ir gintaro rūgšties kiekybinis įvertinimas

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSILOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

LAURYNAS JARUKAS

Skirtingos kilmės gintaro cheminės sudėties nustatymas ir

gintaro rūgšties kiekybinis įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. Liudas Ivanauskas

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

ANALIZINĖS IR TOKSILOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA

TVIRTINU: VITALIS BRIEDIS

Farmacijos fakulteto dekanas

Skirtingos kilmės gintaro cheminės sudėties nustatymas ir

gintaro rūgšties kiekybinis įvertinimas

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas

Prof. Dr. Liudas Ivanauskas

Data

Recenzentas

Vardas, pavardė, parašas

Data (metai, mėnuo, diena)

Darbą atliko

Magistrantas Laurynas Jarukas

Data (metai, mėnuo, diena)

TURINYS

1.1 Gintaro kilmė ir rūšys ... 10

1.1.1 Gintaro susidarymas ir fosilizacija ... 10

1.1.2 Organiniai mineralai ir gintaras ... 11

1.2 Gintaro cheminė sudėtis ir tyrimai ... 13

1.2.1 Tyrimų raida ir istorija ... 13

1.2.2 Fosilinių sakų cheminė sudėtis ... 14

1.3 Fosilinių sakų analizės metodai ... 15

1.3.1 IR spektrofotometrija ... 15

1.3.2 Ramano Furjė spektroskopija ... 16

1.3.3 Fluorescencinė spektroskopija ... 16

1.3.4 Branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopija ... 17

1.3.5 Chromatografiniai metodai ... 18

1.4 Gintaro naudojimas medicinoje ... 18

1.4.1 Gintaro naudojimo istorija ... 18

1.4.2 Gintaro panaudojimas šiuolaikinėje medicinoje ... 20

1.4.3. Gintaro veikimo mechanizmas ... 20

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 22

2.1. Tyrimo objektas ... 22

2.2. Naudoti reagentai ir cheminės medžiagos ... 22

2.3. Naudota aparatūra ir priemonės ... 22

2.4.1. Cheminės sudėties nustatymas skirtingos kilmės fosilinių sakų mėginiuose DC-MS metodu ... 23

2.4.2. Gintaro rūgšties kokybinis nustatymas DC/MS metodu taikant derivatizaciją ... 24

2.4.3. Gintaro rūgšties kiekybinis nustatymas DC/MS metodu taikant derivatizaciją ... 26

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Skirtingos kilmės gintaro cheminės sudėties nustatymas DC-MS metodu ... 27

3.1.1. Sumatros gintaro ekstrakto cheminė sudėtis ... 27

3.1.3. Baltijos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis ... 29

3.1.4. Madagaskaro kopalo ekstrakto cheminė sudėtis ... 31

3.1.5. Etiopijos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis ... 32

3.1.6. Ukrainos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis ... 33

3.1.8. Kolumbijos kopalo ekstrakto cheminė sudėtis ... 34

3.2. Gintaro rūgšties identifikavimas DC-MS metodu taikant derivatizaciją... 36

3.3. Gintaro rūgšties kiekybinis palyginimas skirtingos kilmės gintaro ekstraktuose DC-MS metodu taikant derivatizaciją ... 38

IŠVADOS ... 42

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 43

SANTRAUKA

Lauryno Jaruko magistro baigiamasis darbas. Mokslinis darbo vadovas – prof. Liudas Ivanauskas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra, Kaunas, 2017.

Darbo tikslas: Atlikti skirtingos kilmės ir amžiaus gintaro ekstraktų cheminės sudėties

nustatymą ir kiekybinę gintaro rūgšties analizę

Darbo uždaviniai:

1. Remiantis moksliniais duomenimis, parinkti tinkamiausią dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodiką gintaro cheminės sudėties ir gintaro rūgšties kiekybiniam nustatymui.

2. Pasirinkta dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodika atlikti skirtingos kilmės bei amžiaus gintaro cheminės sudėties nustatymą bei kiekybinį gintaro rūgšties įvertinimą.

3. Palyginti skirtingos kilmės bei amžiaus gintaro cheminę sudėtį tarpusavyje bei aprašytuose moksliniuose šaltiniuose.

4. Palyginti gautus gintaro rūgšties kiekybinius rezultatus tarp skirtingos kilmės bei fosilinių sakų pavyzdžių.

Tyrimų objektas: Penki, skirtingos geografinės kilmės fosilinių sakų pavyzdžiai: Baltijos

gintaras, Ukrainos gintaras, Madagaskaro kopalas, Kolumbijos kopalas, Sumatros gintaras. Tyrimai atlikti su įmonės UAB „Alekso gintaras“ nemokamai perduotais gintaro pavyzdžiais, kurie buvo įsigyti 2012–2015 m. bei skirti juvelyrikos gaminiams. Atsižvelgiant į tyrimo tikslus, papildomai tirti smulkios frakcijos, skirtingos kilmės bei amžiaus, gintaro atliekų mėginiai.

Tyrimo metodika: Darbo metu pritaikytas dujų chromatografijos – masių spektrometrijos

metodas, gintaro rūgšties kiekybiniam nustatymui taikyta junginių derivatizacija.

Rezultatai ir išvados: Atlikus penkių skirtingos kilmės bei amžiaus fosilinių sakų ekstraktų

cheminę analizę, nustatyta, kad vyrauja mažos molekulinės masės aromatiniai angliavandeniliai: monoterpenai, seskviterpenai, diterpenoidai bei kiti lakūs junginiai. Nustatyta, kad skirtingos kilmės gintaras skiriasi savo chemine sudėtimi. Kokybinės analizės metu taikant derivatizaciją buvo nustatyta gintaro rūgštis. Atlikus gintaro rūgšties kiekybinę analizę, įvertinta, kad Ukrainos gintaro sudėtyje, palyginus su kitais fosiliniais sakais, gintaro rūgšties aptinkama daugiausia (10,65 µg/ml).

SUMMARY

Work title: Comparative study of chemical composition and succinic acid quantitave analysis in different origin of Amber. Laurynas Jarukas master‘s thesis/ supervised by Prof. Dr. Liudas Ivanauskas; Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy, Department of Analitic and Toxicological chemistry - Kaunas, 2017.

Aim: To analize chemical composition in different origin of Amber extracts and evaluate

quantity of succinic acid.

Objectives:

1. According to scientific data, choose the most suitable gass chromatgraphy – mass spectroscopy method to analyse chemical composition of Amber and succinic acid quantity.

2. Evaluate chemical composition in different origin of Amber extracts and investigate succinic acid quantity by selected gass chromatography – mass spectroscopy method. 3. Compare chemical composition between different origin of Amber samples and scientific

databases.

4. Compare the quantitave of succinic acid between different origin of Amber samples.

Object: Different geographical origin of fossil resins: Baltic amber, Ukrainian amber,

Madagascar copal, Colombia copal, Sumatra amber. Investigations were carried out with UAB "Alex amber" amber samples, which were acquired in the period 2012-2015 for jewelry products. According to the investigate objectives, research includes small fractions of different origin and age amber waste.

Methods: gas chromatography - mass spectrometry method. For the quantitative determination

of the succinic acid applied derivatization process.

Results and conclusions: After the five different origin and age of the fossil resin extracts

chemical analysis, chromatography show prevailing of low molecular weight aromatic hydrocarbons: monoterpenes, sesquiterpenes and other diterpenoid volatile compounds. Different origins of Amber contain various in chemical composition. Succinic acid was determined by qualitative analysis using the derivatization process. The quantitative analysis of succinic acid, estimated that in comparison with other fossil resins, the Ukrainian amber contains the most quantity of succinic acid (10,65 µg/ml).

SANTRUMPOS

DC – MS

Dujų chromatografija – masių spektrometrija;

MS

Masių spektrometrija;

BMR

Branduolinis magnetinis rezonansas;

m/z

Molekulinių jonų masių ir jų krūvių santykis;

Rpm

Apsisukimai per minutę;

PC

Plonasluoksnė chromatografija;

IR

Infraraudonieji spinduliai;

ĮVADAS

Gintaras – organinės kilmės mineralas pagal savo prigimtį yra laikomas fosiline derva, kuri susidaro per kelis tūkstančius metų iš spygliuočių sakų. Šiuolaikiniame pasaulyje gintaras labiausiai žinomas, kaip juvelyrinis gaminys arba dažnai vadinamas tiesiog „baltijos auksu“. Pagal savo kilmę bei amžių, fosilinės dervos pasižymi skirtingomis išorės savybėmis: tekstūra, spalva, inkliuzais. Todėl žmonės žaliavą pritaikė įvairiose srityse: papuošalų, liturginių reikmenų bei įvairiausių dekoracijų gamyboje. Natūralaus gintaro klodai randami ne tik Baltijos jūros regione, tačiau Dominikos Respublikoje, Sicilijoje, Ispanijoje, Kolumbijoje ir net Indijoje.[32] Šio, gamtinės kilmės mineralo savybės domina daugelio sričių mokslininkus – gamtininkus, fizikus, chemikus.

Taip pat, neatsiejamas bei integralus šios fosilinės dervos panaudojimas yra medicinoje ir farmacijoje. Gintaras nuo pat senovės buvo naudojamas įvairiais medicininiais tikslais: stiprinti žarnyno ir inkstų veiklą, gerinti nervų sistemos darbą, slopinti įvairius uždegimus. Jau nuo seniausių laikų randamos įvairios farmacinės formos: pastilės, tabletės, tinktūros, ekstraktai, pudra ir kitos, kurios komponuojamos tik su gintaru, arba kartu su augalinės, ar gyvulinės kilmės medžiagomis. Kartais gintaro preparatai naudoti ir gydant atsikosėjimą krauju, persileidimus, potencijos sutrikimus, venerines ligas, šlapimo pūslės akmenligę, gonorėją, tymus, epilepsiją, alkoholizmą ar net nestiprius nugaros skausmus.[11] Tačiau iki pat šių dienų nėra mokslinių tyrimų rezultatų, kurie patvirtintų istorines prielaidas, kad organinės kilmės „Baltijos auksas“ gali teigiamai veikti ar net gydyti ligas.

Šio tyrimo objektas pasirinktas atsižvelgiant į visuomenės susidomėjimą natūralios kilmės medžiagų bei organinių mineralų panaudojimu įvairiose pramonės šakose, įskaitant ir farmacijos produktus – kosmetiką, maisto papildus ar vaistinius preparatus. Gintaro savybėmis ir naudojimu aktyviai domisi rytų šalys (Kinija, Indija), tai rodo nuo aktyviai registruojami patentai gaminti kosmetiką ar kitas sveikatinimo priemones.

Temos aktualumas ir tyrimo problema: Pastarąjį dešimtmetį pasaulyje sparčiai auga natūralios

kilmės vaistinių preparatų ir kosmetikos gamyba. Todėl tyrimas aktualus, siekiant pritaikyti gintaro, kaip teigiamą poveikį žmogaus organizmui turinčios medžiagos, galimybes kuriant naujas farmacines ar kosmetikos priemones. Atlikus palyginamąjį tyrimą, bus žinoma cheminė sudėtis ir vieno iš svarbiausių, cheminio junginio – gintaro rūgšties kiekis, skirtingos kilmės gintaro ekstraktuose. Duomenys leis daryti prielaidas tolimesniems vaisto formos ar kosmetinės priemonės kūrimo tyrimams. Taip pat, analitiniai rezultatai leis sužinoti, kokios kilmės gintaras labiausiai pasižymi antivirusinėmis savybėmis (būdingos gintaro rūgščiai), taip išskiriant geriausias pritaikymo galimybes.[34]

Darbo tikslas: įvertinti skirtingos kilmės gintaro cheminę sudėtį ir nustatyti gintaro rūgšties

kiekį.

Darbo uždaviniai:

1. Remiantis moksliniais duomenimis, parinkti tinkamiausią dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodiką gintaro cheminės sudėties ir gintaro rūgšties kiekybiniam nustatymui. 2. Pasirinkta dujų chromatografijos – masių spektrometrijos metodika atlikti skirtingos kilmės bei

amžiaus gintaro cheminės sudėties nustatymą bei kiekybinį gintaro rūgšties įvertinimą.

3. Palyginti skirtingos kilmės bei amžiaus gintaro cheminę sudėtį tarpusavyje bei aprašytuose moksliniuose šaltiniuose.

4. Palyginti gautus gintaro rūgšties kiekybinius rezultatus tarp skirtingos kilmės bei fosilinių sakų pavyzdžių.

5. Pateikti išvadas ir siūlymus tolimesniems tyrimams atlikti, siekiant išsiaiškinti gintaro pritaikymo galimybes farmacijos pramonėje.

Raktiniai žodžiai: gintaras, gintaro rūgštis, ekstrakcija, fosilinės dervos, kopalas, dujų

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Gintaro kilmė ir rūšys

1.1.1 Gintaro susidarymas ir fosilizacija

Gintaro kilmės klausimas, ilgus metus nebuvo išspręstas, tačiau dėl savo savybių, daugeliu atveju tyrinėtojai sutarė, kad tai - spygliuočių medžių produktas. Atlikti šiuolaikiniai tyrimai nustatant chemines gintaro sudėties ypatybes, patvirtina nuo seniausių laikų keltas hipotezes, kad gintarą galima apibūdinti, kaip senovinių spygliuočių medžių sakų fosilijomis, virtusiomis organiniais mineralais. Nustatyta, kad didžiausi fosilinių sakų šaltiniai susidarė eoceno opochos metu, prieš 40-50 milijonų metų, iš Araukarijinių pušainių šeimai (lot. Auracariaceae pinopsida) priklausančių pušų–gintarmedžių (lot. Pinus succinifera), išskiriančių didelį sakų kiekį. Palyginus su pirmtakais, šiuo metu augantys spigliuočiai gamina labai mažą kiekį sakų. Paprastai, toks kiekis patekęs į gruntą, tiesiog sunyksta.[37]

Nuo eoceno epochos, t.y prieš 40-50 milijonų metų, gintarmedžių sakams patekus į aplinką iki gintaro susidarymo, vyko įvairūs ir sudėtingi procesai. Šis fosilinių sakų susidarymo procesas pagal susidarymo kryptis skirstomas į tris etapus. Pirmasis etapas apibūdina laikotarpį, nuo sakų susidarymo iki patekimo į aplinką, t.y miško gruntą ar dirvožemį, ir sutampa su gintarmedžio amžiumi. Antrasis etapas apibrėžia pirminio gintaro susidarymą miško dirvožemyje ir išplovimą į upes ar vandens telkinius. Trečiasis etapas nusako molekulinius ir struktūrinius pokyčius, pirminiam gintarui patekus į antrines vietas ir telkinius, pvz. jūrą. [1]

I etapas – laikotarpis atitinkantis gintarmedžio augimo amžių, kurio metu formuojasi

spygliuočių dervos bei jų išsiskyrimas į aplinką. Gintarmedžių vegetacijos periodu susidarę sakai, medžiui suirus pateko į supančią aplinką: miško gruntą, upių deltas ar žiotis, kalnų šlaitus ir nulėmė išorės morfologinę įvairovę. (1 pav.) Dėl aplinkos sąlygų bei oksidacijos procesų, gintaras įgavo būdingą geltoną spalvą, išorę padengė tamsus sluoksnis bei įsiliejo įvairios aplinkos dalelės: smėlis, vabzdžiai, grybai ir kt.[19]

II etapas – laikotarpis trukęs keletą milijonų metų, apimantis išorės morfologinius pokyčius bei

pirminę gintaro struktūrą. Šiame etape pirminio gintaro šaltiniai upėmis bei vandens telkiniais buvo išplauti į jūras ir antrines vietoves. Bėgant laikui ir plaukiant vandenyje, fosilinės dervos dėl įvairių išorinių klūčių lūžinėjo, skilinėjo, apsiskaldė bei susiformavo patvaresni, apvalesni gabalai. Patekęs į įvairias upių sąnašas, vykstant polimerizacijos bei kitoms cheminėms reakcijoms, formavosi būdingos cheminės medžiagos: gintaro rūgštis, aromatinės medžiagos.

1 pav. Pirminės struktūros gintaro susidarymo schema.[19]

III etapas – apibūdina struktūrinius ir molekulinius pokyčius, gintarui patekus į antrines

susidarymo vietoves – telkinius. Didžiausi gintaro telkiniai randami Švedijoje, Jungtinėje Karalystėje, Ukrainoje, Baltarusijoje, Lenkijoje, Vokietijoje, Rusijoje, Lietuvoje ir Latvijoje. Šio etapo metu fosilinė derva sukietėja ir suformuoja sąlyginai patvarų junginių kompleksą.[1]

1.1.2 Organiniai mineralai ir gintaras

Pasaulyje organinės kilmės mineralų randama apie 150 rūšių, o Baltijos gintaras – tik vienas iš jų. Gintaro savokos apibrėžimas ir supratimas, priklausomai nuo autorių, ne visada sutampa, o šiuolaikiniame pasaulyje dėl komercinio panaudojimo priežasčių, vartojamas labai apibendrintai. Senkant gintaro ištekliams bei plečiantis panaudojimo sritims, gintaru vadinamos kitos, daug jaunesnės bei neidentifikuotos kilmės fosilinės dervos. Pasitaiko ir įvairių sintetinių, polimerinių klastočių, savo išvaizda panašių gaminių, kurie neretai vadinami gintaru. Vienas iš pagrindinių rodiklių nusakančių gintaro apibrėžimą yra geologinis amžius.

Vienas tiksliausių apibrėžimų buvo aprašytas Vokietijos mokslininkų 1978 m. D. Schlee ir W. Glockner: „Fosilinės dervos, kurių geologinis amžius yra senesnis nei milijonas metų, yra vadinamos gintaru, o visos jaunesnės dervos – kopalu“.[35]

Ne tik terminologinės ypatybės lydi gausų organinių mineralų pasaulį, bet ir skirtinga klasifikacija. Viena iš paprasčiausių fosilinių sakų klasifikacijų yra naudojama pagal botaninę kilmę:

 Gaubtasėklių kilmės gintaras  Spygliuočių kilmės gintaras

 Nežinomos botaninės kilmės gintaras

Tačiau, atpažinti skirtingus organinius mineralus pagal botaninę kilmę yra sudėtinga, nes reikalingi sudėtingi tyrimai. Praktikoje viena iš dažniausių klasifikacijų yra naudojama pagal makroskopinę analizę arba taikomus specialius tyrimus, pvz. terminę analizę, tirpumą eteryje ar etanolyje, geologinį amžių (1 lentelė).[27]

1 lentelė. Gintaro klasifikacija pagal paviršiaus tirpumą, botaninę kilmę ir amžių

Nr. Pavadinimas _(kilmė) Amžius

Paviršiaus tirpumas eteryje Paviršiaus tirpumas etanolyje

Spalva Botaninė kilmė

1. Kopalas (Madagaskaras) 10000 – 100 m. Mažai tirpus Tirpus Šv.

geltona H. verrucosa (Fabacea) 2 Kopalas (Kolumbija) 2,5 mln. – 200 m. Mažai tirpus Tirpus Šv.

geltona Hymenaea (Fabaceae) 3 Dominykos gintaras 45 -15 mln. m. Netirpus Netirpus Tamsiai geltona H. protera, H. verrucosa (Fabaceae) 4 Meksikos gintaras 26 – 22,5 mln. m. Netirpus Netirpus Aukso spalvos H. mexicana, H. courbaril, H. verrucosa (Fabaceae)

6. Sicilijos gintaras 28 – 5 mln. m Netirpus Netirpus Tamsiai raudona Agathis (Araucariaceae), (Fabaceae) 7. Baltijos gintaras 40 – 35 mln. m. Netiprus Netirpus Aukso spalvos Pinaceae, Araucariaceae, Burseraceae 8. Kedro ež. Gintaras (Kanada)

78 mln. m. Netirpus Netirpus Aukso

spalvos Araucariaceae

Viena iš dažniausiai sutinkamų klasifikacijų – pagal kilmės ar radimo vietą. Dėl skirtingų makroskopinių savybių bei cheminės sudėties, fosiliniai sakai, priklausomai nuo jų radimo vietos, dažniausiai buvo laikomi individualiomis rūšimis ir priskiriami individualūs pavadinimai: Rumenitas

(Rumunija), Almašitas (Almašo upės slėnyje randami sakai), Valchovitas (Čekoslovakija), Aikaitas (Vengrija), Kopalitas (Prancūzija), Gedanitas (Gdanskas).[1] Svarbu paminėti, jog skirtingą klasifikacija bei terminologiją lėmė ir nevienodas supratimas apie gintaro kilmę, todėl dažnai fosiliniai sakai buvo priskiriami mineralams bei suteikiami panašūs pavadinimai. Tik atlikus sisteminga analizę buvo pastebėti bendri bruožai (kietumas pagal Moso skalę, cheminė sudėtis, tankis bei makroskopinės savybės) ir fosilinės dervos pradėtos vadinti gintaru ar kopalu.

1.2 Gintaro cheminė sudėtis ir tyrimai

1.2.1 Tyrimų raida ir istorija

Gintaro cheminė sudėtis ilgą laiką buvo sudėtingas klausimas, kuris ne tik neleido atskirti gintaro nuo kitų iškastinių fosilinių dervų, tačiau išlaikė paslaptį nustatant botaninę kilmę, jo panaudojimo galimybes. Nuo pat gilios senovės įvairiuose padavimuose ir legendose žmogus visuomet bandė atskleisti ir suvokti sudėtingos ir mįslingos medžiagos kilmę ir prigimtį. Tačiau, ilgą laiką egzistenciniai gintaro klausimai buvo aiškinami sakmėmis ir padavimais.

Garsus Romos mitas apie Fajetoną (525-456 m. p. m. e.), pasakoja, kad Fajetono motina Klimenė su savo seserimis Heliadėmis, radusi žuvusio jauno vaikino kūną šiaurės upėje, iš liūdesio virto topoliais, o graudžios ašaros nuneštos į jūrą – gintaru. Šis pasakojimas laikomas vienas pirmųjų užuominu apie augalinę gintaro kilmę.[8] Dar daugiau apie 497-406 m. p. m. e., graikų rašytojo Sofoklio kūrinyje, gintaras laikomas paukščių ašaromis, apverktomis senovės didvyrį Meleagrą, kurios vėliau sukietėjo jūros vandenyje.[24] Nors daugelis šaltinių p. m. e. yra mitologinio tipo, tačiau galima įžvelgti dėsningumą - gintarą sieti su jūra bei augaline jo kilme. Pirmieji mokslinio tipo duomenys pasirodė romėnų mokslininko Plinijaus Vyresniojo veikale „Historia natūralis“ (23-79 m. e.).Veikalas paremtas kitų senovės mokslininkų raštais bei mažiausiai 30 kitų veikalų, kurie aiškina autorių požiūrį į gintaro kilmę bei sudėtį. Vis dėlto, antikos mokslininkų išvados bei moksliniai tyrimai neturėjo rimtų įrodymų, dažniausiai buvo asocijacijų tipo. Pvz. Plinijaus veikale cituojamas Demostratas fosilinių sakų kilmę apibūdina iš lūšies šlapimo, kuris pateko į jūros vandenį; Nikėjas – pateikia savo versiją, jog tai saulės spindulių koncetratas. Nors pats autorius cituoja įvairius šaltinius, kurie ne visada sutampa, Plinijus pateikia argumentuotą išvadą, kad gintaras tai šiaurės šalysę augančių spygliuočių sakų produktas, kuris laikui begant vandens nunešamas į jūrą. Savo veikale išvadą argumentuoja, jog gintaras degdamas skleidžia pušies sakų aromatą, jame randamos vabzdžių ir augalų liekanos.[25] Vis dėlto, gintaro tyrimai išliko nagrinėjamu klausimu iki pat naujausių laikų, nors ir primityvūs, pirmykščiai tyrimai atskleidė nemažai tiesos.

Nuo Plinijaus Vyresniojo laikų dar daug kartų buvo keliamos įvairios hipotezės: banginių pakitusi ambra (Plinijus Jaunesnysis, 62-113 m.); akmens anglies pakitęs produktas – gagatas (Albertus Magnus, 1193-1280 m.); skystas bitumas, sukietėjęs ore (G. Agricola, 1494-1555 m.); gintaras – tai nafta (A. Kircheris, 1665); naftos, sieros rūgšties ir karbamido, susidarant pūvant jūros organizmams mišinys (H. Liūdolfas, 1752 m.). Tik nuo 1757 m. mokslininkas M. Lomonosovas remdamasis moksliniais duomenimis, pakartojo Plinijaus teiginius apie auglinę-botaninę gintaro kilmę. [1] Augant mokslinių duomenų skaičiui bei įvairių faktų, Plinijaus hipotezė buvo vis dažniau pagrindžiama bei išliko iki pat šių dienų. Pirmieji išsamūs tyrimai buvo atlikti 1828-1829 m. garsaus mokslininko, neorganinės chemijos pradidininko – Johann Jakob Freiherr von Berzelius, kuris atliko gintaro ekstakcijas su alkoholiu bei eteriu.[36] Nuo XX a. taikomi modernūs tyrimo metodai, kurie leido ne tik identifikuoti cheminę sudėtį, bet ir palyginti sandaros panašumus ir skirtumus, identifikuoti botaninę kilmę.

1.2.2 Fosilinių sakų cheminė sudėtis

Iki pat XIX a. vidurio pasaulyje buvo žinoma, kad Baltijos gintaro sudėtyje yra organinės rūgšties, vandens ir kitų junginių, o analizė buvo atliekama primityviu sakų destrukcijos metodu – sausaja distiliacija.[14]

Šiuolaikiniais tyrimų metodais nustatyta, kad gintarą vidutiniškai sudaro 30% tirpioji dalis ir apie 70% netirpi dalis, vadinama rezenais. Baltijos gintaro tirpioje frakcijoje išskiriami diterpenoidai t.y mažos molekulinės masės junginiai: p-cimeno (49 % masės dalies), fenecholio (10 % masės dalies), 1,8-cineolio (8 % masės dalies), borneolio (6 % masės dalies), kamparo (3 % masės dalies). Priklausomai nuo fosilinių sakų kilmės, nustatomi ir skirtingi mažos molekulinės masės junginiai kaip gintaro rūgštis, dehidroabietanas, retenas ir kiti lakūs junginiai.

Netipioje dalyje išskiriamos 4 skirtingos klasės rezenų, t.y didelės molekulinės masės medžiagų-polimerų:

 I-klasė: komuni rūgšties polimerai;

 II-klasė: kadineno ir polikadineno polimerai;

 III-klasė: stirenas, polistirenas, cinamono rūgštis ir dihidrocinamono rūgštis;

 IV-klasė: nepolimeriniai junginiai – įvairios mineralinės priemaišos atsiradusios susidarymo laikotarpiu.

Apibendrinant cheminę sudėtį būtina paminėti, jog tirpioje frakcijoje yra nustatoma ir daugiau junginių, tačiau jų kiekiai labai nedideli.[36]

1.3

Fosilinių sakų analizės metodai

1.3.1 IR spektrofotometrija

IR spektrofotometrinis analizės metodas – vienas iš dažniausiai taikomų, tiriant fosilines dervas, įskaitant tapatybės bei kiekybinius nustatymus. Gintaras gali būti ekstrahuojamas tirpikliais, atliekamas frakcionavimas ar maišant su Kalio Bromidu, analizuojamos nuosėdos. Taip pat, fosilinės dervos gali būti analizuojamos momentiniu Furje transformacijos infraraudonosios srities spektroskopijos metodu, naudojant difuzinį atspindį ar visišką vidaus atspindį.[15] [5]

Tiriant organinius mineralus IR spektroskopijos metodu, paprastai, užtenka nedidelio kiekio mėginių (1-2 mg), o metodas veiksmingas ir pigus. Gaunami IR spektrai yra analizuojami atsižvelgiant į būdingas absorbcijos juostas (4000-1450 cm-1_{), o skirtumai tarp skirtingos kilmės fosilinių dervų}

atsispindi būdingame regione (1450-600 cm-1_{).[33] Pavyzdžiui baltijos gintaras būdingame (1250 –}

1150) turi unikalų absorbcijos diapazoną, kuris atskiria nuo kitų organinių mineralų bei yra vaidinamas “baltijos pečiu” (2 pav.)

2 pav. Baltijos gintaro IR spektro pavyzdys. Spektro dalyje 1250-1150 cm-1 _{pažymėta būdinga Baltijos}

Šiuo metu, naudojant modernią kompiuterinę įrangą bei taikant chemometrinius metodus, randamos panašios spektrų dalys tarp šiuolaikinių augalų sakų ir gintaro. Taip pat, nustatant absorbcijos juostas išskiriamos tam tikros atomų grupės, o jų intensyvumas parodo atitinkamų junginių koncentraciją.

1.3.2 Ramano Furjė spektroskopija

Ramano spektroskopijos metodo metu monochrominė šviesa išskaidoma medžiagoje, todėl pasikeičia ir spinduliuotės dažnis. Analizės metodas dažniausiai taikomas minerologiniams tyrimams, kadangi tyrimo metu nėra sugadinami tiriamieji objektai (in situ), gaunamas lengvai analizuojamas spektras.[3] Šis metodas suteikia galimybę analizuoti organinius darinius, jų nepašalinant iš neorganinių mėginių ar mineralų.

Atliekant gintaro analizę Ramano Furjė spektroskopijos metodu pastebimos kelios išsiskiriančios spektro sritys (1640 cm-1 ir 1440 cm-1), charakterizuojančios organinio mineralo struktūrą. Šios spektro dalyse vyraujančios smailės, apibūdina alifatinės grupės, kurios parodo geologinį organinio mineralo amžių, ir gali būti panaudojamos kopalo ir gintaro geologinio amžiaus palyginimui.[10] Atliekant atitinkamų spektro sričių analizę, nustatoma siera, gintaro rūgštis bei atliekamos tiek kiekybinės, tiek tapatybės interpretacijos.[13]

1.3.3 Fluorescencinė spektroskopija

Fosilinių sakų tyrimai, dėl sudėtinės–polimerinės struktūros bei aplinkos poveikio formavimosi metu, beveik visada, yra sudėtingi ir kompleksiški. Dažniausiai įvairios metodikos yra paremtos gintaro tirpinimu cheminiuose tirpikliuose, o tik vėliau atliekant analitinius tyrimus. Kai kurie cheminiai junginiai, esantys fosiliniuose sakuose, sunkiai tirpsta tradiciniuose tirpikliuose (etanolis, eteris), ypač aromatinius fragmentus turintys junginiai – benzenas, antracenas. Šie junginiai Dominykos gintaro struktūroje nustatyti, būtent fluorescencinės spektroskopijos metodu, naudojant ekstrahentą n-heksaną.[6] Vis dėlto, dėl organinių junginių kompleksiškumo, sudėtingo spektrų analizės precesų bei standartų trūkumo, dažniausiai fluorescencijos spektrai naudojami gintaro ir kopalo palyginimui bei tapatybės įvertinimui dėl galimų klastočių.

Vienas iš svarbiausių tyrimų taikant fluorescencinę spektrofotometrinę analizę atliktas tiriant Dominykos Respublikos bei tolimųjų Rytų Rusijos gintarą, kuris neįprastai švyti saulės šviesoje.

Apšvietus šias fosilines dervas ultravioletine šviesa, gintaras įgauna mėlynai-žalią fluorescuojančią spalvą, o prie įprasto dirbtinio apšvietimo – geltona arba rudą spalvą. Šios gintaro savybės pasaulyje vertinamos dėl juvelyrinio panaudojimo bei papuošalų išskirtinumo. Fluorescencinės spektroskopijos metodu nustatyta, kad mėlynos spalvos švytėjimą sukelia medžiaga, kurios fluorescencinis spektras sutampa su policiklinę-aromatinę struktūrą turinčia medžiaga – perilenu. Nors atlikus detalią fluorescencinę analizę nustatyta, jog fluorescuojantį švytėjimą sukelia azuleno dariniai, tikslūs ir individualūs farmakoforai nustatyti nebuvo. Galima numanyti, jog ateityje pagal skirtingą farmakoforų grupę, bus galima identifikuoti gintarą, o galbūt ir naudoti nustatant biologinę kilmę, amžių ar klasifikuojant į skirtingas grupes.[10]

1.3.4 Branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopija

Nuo XX a. pasaulyje atliekant įvairius gintaro tyrimus, taikoma daugybė instrumentinės analizės metodų: plonasluoksnė chromatografija (PC) ir dujų chromatogracija (DC) – kompleksinių junginių atskyrimui; terminė analizė – klasifikacijos, tapatybės tyrimams; optinė emisijos spektrometrija ir neutronų aktivacijos analizė – mikroelementų nustatymui; rentgeno spindulių difrakcija – kristalinių komponentų tyrimams; IR spektroskopija, masių spektrometrija (MS), BMR spektroskopija – analizuoti molekulinius komponentus.

BMR spektroskopija – vienas iš sudėtingiausių instrumentinės analizės metodų, skirtas struktūrinei organinių junginių analizei. Priešingai nei IR, Ramano Furjė ar fluorescencinės spektroskopija, BMR metodu identifikuojamos atskiros atomų grupės. Analizės metodas daugiausia grindžiamas 13_{C nukleotidu tyrimais, kadangi fosilinės dervos sunkiai ekstrahuojamos tirpiklių ir}

tiriamos kietos fizikinės būsenos.[18] Atsižvelgiant į tai, jog kiekviena medžiaga prie atitinkamų sąlygų gali būti skystos ar dujų agregatinės būsėnos, taikomi ir 1_{H izotopo tyrimai. Atlikus sisteminius} 13_{C bei} 1_{H izotopų tyrimus, apibendrinus rezultatus, pagal spektrų panašumą fosilinės dervos buvo suskirstytos}

į 5 grupes. A grupės fosilinių sakų kilmė susijusi su Araukarijinių augalų šeima (lot. Araucariaceae;, B grupės – priklauso Sparneninių augalų šeimai (lot. Dipterocarpaceae); C grupės (Baltijos gintaras) – susiję su A grupės kilme, tačiau nustatyti didesni kiekiai gintaro rūgšties; D grupės (Lotynų Amerika, Karibai, Afrika) – kilę iš pupinių augalų genties priklausančio Kopalmedžio (lot. Hymenae); E grupės – fosilinės dervos turinčios labai reto fosilinio polistireno. [17] [18]

Svarbu paminėti, kad BMR analizės metodu atliekami tyrimai pakankamai retai dėl aukštos įrangos kainos bei išlaikymo kaštų, todėl dažniau atliekami instrumentiniai tyrimai su IR, Ramano spektroskopais. Taip pat, tiriant BMR metodu reikalingi sąlyginai nemaži (30 mg) mėginių kiekiai, kas sąlygoja archeloginių radinių ar gintaro dirbinių apgadinimą ar sunaikinimą.[10]

1.3.5 Chromatografiniai metodai

Atsižvelgiant į fosilinių sakų cheminės struktūros tyrimų raidą, pirmieji bandymai pradėti skyčių ekstrakcijos metodais, skirtingas junginių grupes išskiriant įvairiais tirpikliais. Vėliau išgryninti cheminiai junginiai ar jų grupės, buvo analizuojami cheminiais ar spektroskopiniais metodais. Chromatografijos metodas buvo pradėtas taikyti, dėl nedidelių mėginių kiekio, kurių dažniausiai neužtekdavo įprastai frakcinei analizei.[22]

Kadangi fosilinių sakų struktūrą sudaro organinių junginių mišiniai, medžiagų atskyrimui ir gryninimui pirmiausia pradėtas taikyti plonasluoksnės chromatografijos metodas (PC) (angl. Thin Layer

chromatography (TLC)). Nors PC laikomas vienas iš paprasčiausiai taikomų metodų, tačiau, dėl

chromatogramų sudėtingumo bei menkos atskyrimo gebos, išgryninti junginiai vėliau analizuojami infraraudonųjų spindulių ar masių spektrofotometrijos metodais.[26] Geresnius rezultatus galima gauti naudojant dujų chromatografijos su masių spektroskopijos detektoriumi (DC-MS) metodą, kadangi nuosekliau atskirimi junginiai, tačiau galimas nustatymas tik tirpiems, lakiems ar pusiau lakiems, mažos molekulinės masės junginiams. GC-MS metodas nėra taikomas kompleksiniams, polimerinių junginių tyrimams.[4] Siekiant išvengti mažos molekulinės masės junginių išplovimo bei geresnių chromatografijos rezultatų, papildomai gali būti taikoma junginių derivatizacija. Derivatizacijos metu, naudojami cheminiai reagentai modifikuoti esančias molekules taip, kad jos būtų tinkamos chromatografiniam tyrimui. Po taikomos derivatizacijos procedūros analitė tampa lakesnė bei pasižymi mažesniu poliškumu, o tai leidžia padidinti junginių aptikimo ribą bei analitinį našumą.[29] Atsižvelgiant į mokslinėje literatūroje taikomą fosilinių dervų klasifikaciją, dažniausiai ji paremta DC-MS metodu, taikant pirolizę. Pirolizės metu, dideli molekuliniai kompleksai bedeguonieje aplinkoje, temperatūriame rėžime yra skaidomi į mažesnės masės medžiagas, kurie vėliau nustatomi taikant DC-MS metodą. Metodas efektyvus nustatant chemines struktūras, tačiau dėl išskaidymo į mažos molekulinės masės, lakias, turinčias polines grupes medžiagas, analitinis tikslumas nėra didelis.[9] [30]

1.4 Gintaro naudojimas medicinoje

1.4.1 Gintaro naudojimo istorija

Gintaras liaudies medicinos praktikoje buvo naudojamas nuo romėnų filosofo Plinijaus laikų (23-79 m.) iki pat šių dienų: vaistų sudėtyje, gydomųjų žolelių mišiniuose ar panaudojant elektrostatines savybes dėvint ant kūno. Buvo manoma, kad karoliai apsaugo nuo gerklės ar ryklės ligų, pvz tonzilių uždegimo, skydliaukės padidėjimo ar reumato. Gydytojai naudojo įvairiausias ruošimo metodikas: pvz.

gintaro miltai sumaišyti su medumi buvo naudojami gerenti regėjimui, o geriant vandeninį tirpalą – gydyti skrandžio ligas.[12]

Atsižvelgiant į istorinius duomenis, bei panaudojimo sistemiškumą, matyti, kad gintaru gydomi simptomai ar ligos, savo veikimo mechanizmu tarpusavyje nesusiję. (2 lentelė). Naudojimo metodika dažniausiai siejama su šamanizmu ar liaudies medicinos išmintimi, o receptūros paremtos tuometiniu supratimu apie gydymą ir mediciną. Dar daugiau, gintarą kaip gydymojąją medžiagą naudojo ir veterinarijoje pvz. gydant arklius. Naudojamos gintaro druskos, aliejus, tinktūros, milteliai, esencijos, balzamai, kurių ruošimas paremtas praktikų išmintimi. Fosilinės dervos naudotos taip dažnai, kad egzistavo ne tik gydymo gairės, tačiau ir preparatų ruošimo technologijų aprašymai, primityvūs vaistų receptai. [28]

2 lentelė. Gintaro panaudojimo istorija (I a., XVa., IX a.)

Panaudojimas Farmacinė forma Autorius

Gerklės ligos, struma, apsinuodijimas, užkeikimas,

dizurija, peršalimas. Dėvėjimas ant kaklo

Plinijus Vyresnysis (23-79 m.) Trumparegystė ir kitos akių ligos Gintaro mišinys su medumi ir

rožių aliejumi Skrandžio skausmai Vandeninis tirpalas Vėmimas

Vandeninis tirpalas

Georgijus Agrikola (1546 m.) Dvylikapirštės žarnos opa

Angina ir gerklės ligos Vidaus organų ligos Esencinis tremoras Epilepsija

Gimdymo palengvinimas Dūmų inhaliacija Viduriavimas

Pastilės ir tabletės

Pometas (1737) Psichikos sutrikimai

Paralyžius Naudojamas ant šilko ar

medvilnės audinių Epilepsija

Tinktūra spirite ar vyne Sužeidimai, sumušimai

1.4.2 Gintaro panaudojimas šiuolaikinėje medicinoje

Gintaras kaip vaistas, kosmetinė priemonė ar maisto papildas, vartojamas ir šiuolaikiniame pasaulyje. Tradicinėje indų medicinoje (arjuvedinė sistema - Siddha) registruotas komercinis vaistas „Ambrex“ (tiekėjas „Cure and Care Herbs Ltd. Anna Salai, Chennai, India.“). „Ambrex“ preprato sudėtį sudaro įvairios žolelės, augalų lapai, sėklos, indiško ženšenio šaknys (lot. Withania somnifera), banguotojo ciko spurgos (lot. Cycas circinalis), stambiosios šorėjos derva (lot. Shorea robusta), vyriškosios gegužraibės šaknys (lot. Orchis mascula). Kapsulių (250 mg) sudėtyje yra 15% gintaro, vartojamas kaip antioksidantas nuo virškinimo trakto opų.[21] Didžiausias gintaro preparatų pasirinkimas yra Baltijos jūros regiono šalyse: gintaro tepalas (raumenų skausmui, artritui), gintaro tinktūra (migrenai, inkstų, širdies problemoms), galima įsigyti net pagalvę su gintaro miltelių užpildu.[12]

Nors fosilinių sakų preparatų pasirinkimas pakankamai platus, tačiau daugelis iš jų neturi veikimo mechanizmą įrodančių mokslinių ar klinikinių tyrimų. Net ir Indijos medicinos instituto, Fiziologijos katedros 2004 m. atlikta studija preparatui „Ambrex“, dėl taikytos metodikos (vartojimo trukmė – 15 dienų, 40 mg/kg) negali būti laikoma moksliniu įrodymu. Dar daugiau, 2012 m. Prancūzijoje atlikto tyrimo metu nustatyta, kad gintaro karolių dėvėjimas (indikacija: raminamoji, apsauganti priemonė) padidina kūdikių mirčių rizika dėl pasismaugimo.[31]

Nepaisant mokslinių įrodymų trūkumo, aktyviai registruojami patentai gaminti kosmetines priemones, į kurių sudėtyje yra gintaro:

 2011 m. (Nr. US 7887858 B2) „Kosmetika su gintaro ekstraktu (koncentracija nuo 0,01 iki 5%)“. Įrodytas gintaro ekstrakto poveikis gerinantis odoje esančio kolageno sintezę.[7]

 2014 m. (Nr. WO2015107398 A1) “Gintaru padengta fizioterapinė tekstilė skirta naudoti ant odos“. Antialerginis ir bakteriostatinis veikimo mechanizmas pagrįstas Japonijos patentu (Nr. JPH0929361).[2]

 2016 m. (Nr. US 2016/0008418 A1) „Vandenyje tirpių medicininių gintaro kristalų gamybos metodas“. Naudojamas tradicinės medicinos pagrindu.[16]

1.4.3. Gintaro veikimo mechanizmas

Gintaro biologinis poveikis žmogaus organizmui iki šiol nėra įrodytas ir pagrįstas rimtais moksliniais ar klinikiniais tyrimais. Dažniausiai fosiliniai sakai naudojami tradicinės ar Rytų medicinos pagrindu, o kartais tiesiog pagal empyrinį suvokimą. Tikėtina, kad daugeliu atveju vartojimo per OS

skirtingas poveikis lemiamas placebo efekto, kuomet pacientas dėl psichologinės būsenos pagerina savijautą ar klinikinę būklę.

Kadangi gintaras sudarytas iš daugybės skirtingų junginių ir kompleksinių medžiagų, jo poveikis žmogaus organizmui gali būti pagrindžiamas netiesioginiu, atskirų aktyvių junginių poveikiu. Nustatyta, kad dėl jame esančių junginių (abieto rūgštis, α-amirinas, metil-palmitatas), gintaras pasižymi priešuždegiminiu poveikiu ir gali būti palyginamas su indometacino poveikiu. Reikšmingą antioksidacinį poveikį, pavyzdžiui, naikinant laisvuosius radikalus, turi fosilinių sakų sudedamosios dalys: limonenas (antioksidacinis indeksas – 27,4; 29,4; 24,0 %), p-cimenas (42,6; 25,5; 14,9 %), terpinen-4-olis (31,0; 21,6; 8,1 %), pulegonas (31,1; 17,5; 5,0 %). Antibakteriniu poveikiu pasižymi sudedamosios dalys: α-pinenas, β-pinenas, kamparas, kamfenas, borneolis, o priešgrybeliniu – limonenas, fenchonas, terpinen-4-olis, eukaliptolis ir α-pinenas. Gintaras taip pat, gali būti naudojamas kaip repelentas, kadangi jame esantis p-cimenas pasižymi potencialiu poveikiu. Antivirusiniu poveikiu pasižymi tik gintaro rūgštis, kuri gali būti efektyviai naudojama apsisaugant nuo Rino viruso sukeliamos ligos – rinito ir Herpes viruso infekcijos. [34]

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo objektas

Tiriami penki, skirtingos geografinės kilmės, gintaro ir fosilinių sakų pavyzdžiai: Baltijos gintaras (Baltijos jūros regionas), Ukrainos gintaras (Vakarų Ukraina), Madagaskaro kopalas (Madagaskaras), Kolumbijos kopalas (Kolumbija), Sumatros gintaras (Sumatros sala). Tyrimai atlikti su įmonės UAB „Alekso gintaras“ nemokamai perduotais gintaro pavyzdžiais, kurie buvo 2012-2015 m. bei skirti juvelyrikos gaminiams.

Atsižvelgiant į tyrimo tikslus, papildomai tirti smulkios frakcijos, skirtingos kilmės bei amžiaus, gintaro atliekų mėginiai. Gintaro atliekos susidaro iš juvelyrikoje nepanaudojamos, per daug smulkios frakcijos. Pavyzdžiai atrinkti atsitiktine tvarka, neatsižvelgiant į laikotarpį, kilmę ar išvaizdą.

2.2. Naudoti reagentai ir cheminės medžiagos

Fosilinių sakų cheminės sudėties tyrimams bei gintaro rūgšties kiekybiniam nustatymui buvo naudojami šie analitinio švarumo reagentai:

 Tetrahidrofuranas (≥99,9 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija);

 Tyrimams atlikti naudojami standartai: gintaro rūgštis (≥99,0 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija);

 –bis-(trimetilsilil)-trifluoracetamidas (≥99,9 proc. Supelco, JAV );

 Acetonitrilas (≥99,9 proc. (HPLC, gradient grade) Sigma-Aldrich, Vokietija);  Helis (≥99,999 proc. Lietuva);

2.3. Naudota aparatūra ir priemonės

 Analitinės svarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija);  Elektrinis malūnas (Retsch 200, Haan, Vokietija);

 Automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);

 Q-Max membraninis filtras (25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija);

 Dujų chromatografas Shimadzu GCMS-QP2010nc Ultra system (Shimadzu Corporation, JAV) su masių spektrometrijos detektoriumi.

2.4.1. Cheminės sudėties nustatymas skirtingos kilmės fosilinių sakų mėginiuose

DC-MS metodu

Cheminės sudėties nustatymas tiriant skirtingos kilmės fosilinių sakų mėginius atliktas DC-MS metodu. Pirmiausia penki gintaro, kopalo bei fosilinių sakų atliekų pavyzdžiai elektriniu malūnu (Retsch 200, Haan, Vokietija) buvo sumalti iki miltų smulkumo. Siekiant išlaikyti dalelių vienodumą ir tolygią ekstakciją, gauti skirtingi mėginiai buvo sijojami naudojant metalinį sietą, kurio akučių dydis – 0,2 mm. Miltų smulkumo tiriamojo mėginio atsveriama po 0,50 g (tikslus svoris) ir perkeliama į 10 ml matavimo kolbutę bei užpilama 5 ml tirpikliu tetrahidrofuranu (≥99,9 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija). Gautus mėginius užkemšame kamšteliu ir perkeliama į termostatinę ultragarso vonelę (Heidolph, Schwabach, Vokietija). Pavyzdžiai ekstahuojami 15 min. kambario temperatūroje, sandariai uždarytame 10 ml centrifūginiame mėgintuvėlyje. Gautas ekstraktas centrifūguojamas 5 min. 400 rpm apsisukimų greičiu. Gautas supernantantas nupilamas nuo nuosėdų į 10 ml matavimo kolbutę. Nuosėdos užpilamos 2,5 ml tetrahidrofuranu (≥99,9 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija) ir kartojamas aukščiau aprašytas ekstrakcijos procesas 2 kartus. Gautas ekstraktas tiksliai praskiedžiamas iki 10 ml.

Gauti ekstaktai filruojami per Q-Max membraninį filtrą (25 mm diametro, 0,45 μm dydžio poros, Frisenette, Knebel, Vokietija). Mėginiai injekuojami į dųjų chomatografą, injekcijos tūris 1 µl ekstrakto. Junginių skirstymui naudojama kapiliarinė kolonėlė (30 m ilgio, 0,25 mm išorinio diametro ir 0,25 µm skystos–nejudančios fazės storis) su skysta nejudančia faze (5 proc. difenilo ir 95 proc. polisiloksano). Dujos nešiklės – helis, tekėjimo greitis – 1,22 ml/min. Injekavus 1 µl ekstrakto į dujų chromatografą, susidariusios dujos 1,0 min. nepertraukiamai (angl. splitless) perduodamos į kolonėlę, toliau dujų nešėjų srautą dalinant santykiu 1:5. Injektoriaus temperatūra – 260,0°C, DC-MS jungties temperatūra - 280,0°C, jonų šaltinio įtampa 70 eV, o temperatūra 200,0°C. Registruojamas bendras jonų signalas ir masių spektrai skenuojami tarp 35–450 m/z. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas pateiktas 3 lentelėje.

3 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas

Kolonėlės temperatūros kėlimo

greitis (°C)

Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)

- 50,0 5,00

2,00 200,00 0,00

Atlikus chromatografinius tyrimus, iš gautų chromatogramų identifikuojami išskirti junginiai pagal masių spektroskopijos bibliotekos duomenų bazę, naudojant Lab Solution GCMS solution 2.71 versijos Shimadzu programą.

2.4.2. Gintaro rūgšties kokybinis nustatymas DC/MS metodu taikant derivatizaciją

Kai kuriems mažos molekulinės masės, poliniams, lakiems junginiams, norint tinkamai atlikti chromatografinę analizę naudojama speciali mėginių ruošimo metodika – derivatizacija. Derivatizacija – tai procesas, kurio metu chemiškai modifikuojamas pradinis mėginys, o gautas junginys ar jų grupė – pasižymi naujomis savybėmis, kurios tinkamos chromatografinei analizei.

Šiame tyrime naudojamas populiariausias silinimo bandynių apdorojimo derivatizacijos metodas.

Siekiant išvengti gintaro rūgšties absorbcijos ant injektoriaus, bei normalizuoti chromatogramų pikų aukščius ir plotus, gintaro analizei buvo naudojamas –bis-(trimetilsilil)-trifluoracetamidas (BSTFA (≥99,9 proc. Supelco, JAV ) derivatizato tirpalas. Derivatizacijos metu yra keičiamos funkcinės grupės, modifikuojant į lakų junginį, labiau tinkamą DC-MS analizei. Bendroji derivatizacijos procedūra gali būti užrašoma (3 paveikslas).

3 pav. Bendroji derivatizacijos procedūra

Etaloninio tirpalo ruošimas. Gaminant etaloninius tirpalus į 2 ml chromatgrafinių mėginių buteliuką, automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV) pagalba įmama 350 µl

+

Gintaro rūgštis BSTFA

derivatizato tirpalo (BSTFA) ir pridedame 850 µl gintaro rūgšties standarto tirpalo (2,390 mkg/ml) (≥99,0 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija) ir sandariai uždaroma.

Tiriamųjų tirpalų derivatizacija. Tiriamasis objektas – Baltijos gintaro ekstraktas. Remiantis literatūros šaltiniais, Baltijos jūros kilmės gintaro sudėtyje yra daugiausia gintaro rūgšties.[36] Iš paruošto gintaro ekstrakto, automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV) pagalba paimama 850 µl tirpalo, perkeliama į 2 ml chromatografinį mėginių buteliuką, į kurį pripilame 350 µl derivatizato tirpalo (BSTFA). Gautus tirpalus užkemšame sandariu kamšteliu. Gauti tiriamųjų tirpalų derivatizato mėginiai palaikomi 5 min. kambario temperatūroje ir po 1 µl injekuojami į kolonėlę. Pradinė injektoriaus temperatūra - 280,0°C.

Pasirinkus tinkamus dujų chromatografijos – masių spektroskopijos metodo parametrus, injekuojami pagaminti gintaro ekstraktų derivatizatai ir gintaro rūgšties standarto derivatizato tirpalai. Šiuo metodu sudaryta gintaro ekstraktų DC – MS chromatogramos, kuriose esančių smailių sulaikymo trukmės ir masės – krūvio santykiai vėliau lyginami su standartiniu gintaro rūgšties chromatogramos trukmėmis ir santykiais. Taikytas gradientinis temperatūros kitimas pateiktas (4 lentelė.).

4 lentelė. Gradientinis temperatūros kitimas

Temperatūros kėlimo greitis (°C)

Temperatūra (°C) Užlaikymo laikas (min)

- 45,0 2,00

16,00 250,00 1,00

50,00 315,00 5,00

Kokybiniam gintaro rūgšties chromatografiniam tyrimui pasirinktas 2,390 mkg/ml standarto (≥99,0 proc.) tirpalas. Gautų mėginių ištirtų dujų chromatografu chromatogramos buvo analizuojamos Lab Solution GCMS solution 2.71 versija Shimadzu programa.

2.4.3. Gintaro rūgšties kiekybinis nustatymas DC/MS metodu taikant derivatizaciją

Atsižvelgiant į tyrimo tikslus bei praktinių rekomendacijų ruošimą, kiekybinei gintaro rūgšties analizei naudojami skirtingos kilmės ir amžiaus fosilinių sakų ekstaktų mėginiai. Penki skirtingos kilmės gintaro pavyzdžiai, presuotas ir atliekų mišinys sumalami elektriniu malūnu (Retsch 200, Haan, Vokietija) iki miltų smulkumo. Gintaro pavyzdžiai buvo sijojami naudojant metalinį sietą, kurio akučių dydis – 0,2 mm.

Iki miltų smulkumo apdoroti tiriamieji pavyzdžiai perkeliami į 10 ml. matavimo kolbutę bei užpilama 8 ml. tirpikliu tetrahidrofuranu (≥99,9 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija). Pavyzdžiai ekstahuojami 15 min. kambario temperatūroje, sandariai uždarytame 10 ml centrifūginiame mėgintuvėlyje. Gautas ekstraktas centrifūguojamas 5 min. 400 rpm apsisukimų greičiu. Gautas supernantantas nupilamas nuo nuosėdų į 10 ml matavimo kolbutę. Nuosėdos užpilamos 2,5 ml tetrahidrofuranu (≥99,9 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija) ir kartojamas aukščiau aprašytas ekstrakcijos procesas 2 kartus. Gautas ekstraktas tiksliai praskiedžiamas iki 10 ml.

Gauti gintaro ekstaktraktai derivatizuojami derivatizato tirpalu (BSTFA) pagal anksčiau aprašytą metodiką.

Paruoštuose fosilinių sakų ekstraktuose kiekybinis gintaro rūgšties nustatymas atliktas pagal kalibracinę kreivę, kuri sudaryta iš žinomų koncentracijų gintaro rūgšties etaloninių tirpalų. Tyrime naudoti penkių skirtingų koncentracijų gintaro rūgšties standartiniai tirpalai (0,580; 1,170; 2,390; 4,680; 9,350 µg/ml). Tirpiklis – tetrahidrofuranas (≥99,9 proc. (HPLC) Sigma-Aldrich, Vokietija).

3. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Skirtingos kilmės gintaro cheminės sudėties nustatymas DC-MS metodu

3.1.1. Sumatros gintaro ekstrakto cheminė sudėtis

Masių spektroskopijos metodu nustatant junginius, jie identifikuojami lyginant su žinomų junginių masių spektrais arba analizuojant masių spektre būdingus jonus. Junginių identifikavimui kompiuterio pagalba naudojama biblioteka, kurioje yra standartinių junginių išmatuoti masių spektrai. Junginių spektrus lyginimui atrenka kompiuteris, atsižvelgiant bei vertinant pateiktų junginių buvimo tikimybę.

Atliekant chromatografinį tyrimą DC-MS metodu, pirmiausia įvertinta sumatros gintaro cheminė sudėtis.

Iš pateiktos chromatogramos nustatyta, kad metodika pritaikyta tinkamai, nes pagrindiniai junginiai (piko plotas>15%) vienas nuo kito aiškiai atsiskiria (trans-Kalameneno sulaikymo trukmė - 47.22min; 1(10),6,8-trienokadino sulaikymo trukmė - 50.92 min; Olean-12-en-3-ol-acetato - 90.88 min.) (4 pav.).

4 pav. Sumatros gintaro ekstrakto chromatograma

Chromatogram Sumatr C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Sumatros001.qgd

min 15,000,000 30.0 40.0 50.0 55.0 TIC 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Atlikus chromatografinę analizę naudojantis biblioteka ir palyginus su standartinių junginių masių spektrais, sumatros gintaro mėginiuose aptikta 11 junginių, kurie aiškiai atskirti chromatogramoje (4 pav.) ir nurodomi suvestinėje lentelėje (5 lentelė).

5 lentelė. Sumatros gintaro ekstrakto cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min Piko plotas, % 1. 1-metil-4-(1-metiletil)-benzenas 22,672 0,34 2. 1-(1,1-dimetiletil)-3-etil-benzenas 27,487 0,13 3. 1,2,3,4-tetrahidro-2,7-dimetilnaftalenas 35,756 2,47 4. Ciklosativenas 37,355 0,46 5. 2,3,4,4a,5,6-hexahydro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-naftalenas 45,157 2,47 6. α-murolenas 45,732 0,62 7. Trans-Kalamenenas 47,224 30,23 8. Kariofenil alkoholis 49,564 0,70 9. 1(10),6,8-trienokadinas 50,915 16,22 10. Kadalenas 55,555 3,49 11. Olean-12-en-3-ol-acetatas 90,877 42,42

Atsižvelgiant į gautą chromatogramą, nustatyta, kad Sumatros gintaro cheminę sudėti sudaro šie junginiai: Olean-12-en-3-ol-acetatas (42,42%), Trans-Kalamenenas (30,23%), 1(10),6,8-trienokadinas (16,22%). Taip pat, rasti nedideli kiekiai Kadaleno (3,49%), 1,2,3,4-tetrahidro-2,7-dimetilnaftaleno (2,47%), 2,3,4,4a,5,6-hexahydro-1,4a-dimetil-7-(1-metiletil)-naftaleno (2,47%). Aptikta muroleno, ciklosativeno, kriofenil alkoholio ir kitų junginių pėdsakų.

3.1.2. Dominykos Respublikos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis

Atlikus Dominykos Respublikos gintaro ekstrakto chromatografinę analizę, lyginant išmatuotus masių spektrus kompiuterinė programa duomenų bazės bibliotekoje atpažino tik 3 junginius: Olean-12-en-3-ol-acetatą (41,24%), β-amironą (34,30%), 1,1,4,5,6-Pentametil-2,3-dihidro-1H-indeną (24,46%) (6 lentelė).

6 lentelė. Dominykos Respublikos gintaro ekstrakto cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min Piko plotas, % 1. 1,1,4,5,6-Pentametil-2,3-dihidro-1H-indenas 46.553 24.46 2. β-amironas 90.829 34.30 3. Olean-12-en-3-ol-acetatas 91.035 41.24

Iš pateiktos chromatogramos (5 pav.), matyti, kad identifikuotų smailių kiekis sudaro tik labai mažą dalį, esančių visų pikų. Kadangi chromatogramoje esančios smailės nėra persidengiančios, galima teigti, jog metodika pritaikyta tinkamai ir pašalinės medžiagos nesukelia persidengimo bei atmetama galimo išplovimo su tirpikliu versija. Tačiau atsižvelgiant į tyrimo objekto kompleksiškumą bei sudėtingumą, tikėtina, kad junginiai neidentifikuoti dėl neištirtų ir neįtrauktų į duomenų bazę, atskirų junginių.

5 pav. Dominykos gintaro ekstrakto chromatograma

3.1.3. Baltijos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis

Atlikus baltijos gintaro ekstrakto chromatografinę analizę, nusatyti šie junginiai: Izoborneolis (25,74%), o-Cimenas (18,19 %), p-Cimenas (14,11 %), Fencholis (12,71 %), Kamfenas (9,34 %), Kamparas (7,53 %), Abietolis (2,90 %), Cis-p-mentanas (2,14 %), Ciklopropanaftalenas (2,09 %),

Chromatogram Dominykos C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Dominykos001.qgd

min 5,650,116 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 95.0 TIC 1 2 3

Trans-Kalamenenas (1.76 %),1,1,4,5,6-pentametil-2,3-dihidro-indenas (1.67 %). (7 lentelė). Chromatogramoje junginių spektrai nepersidengia, daugelis pikų palyginus masių spektrus su duomenų bazėje esančiais, identifikuoti. Nustatyti eukaliptolio, fenchono junginių pėdsakai.

6 pav. Baltijos gintaro chromatograma

Remiantis literatūros šaltiniais, nuo 2 % iki 5 % Baltijos gintaro dalies sudaro mažos molekulinės masės aromatiniai angliavandeniliai (cimenai), monoterpenai (borneolis, kamparas, fenchonas, fencholis), seskviterpenai, diterpenoidai ir kt. lakūs junginiai.[34] Kadangi atlikto tyrimo metu buvo nustatytos identiškos medžiagos, galima teigti, jog tyrimo metodika parinkta tinkamai.

Chromatogram Baltijos C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Baltijos001.qgd

min 4,000,000 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 55.0 TIC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

7 lentelė. Baltijos gintaro cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min Piko plotas, % 1. Kamfenas 10.346 9.34 2. p-Cimenas 14.842 14.11 3. Eukaliptolis 15.235 0.96 4. o-Cimenas 15.712 18.19 5. Fenchonas 18.858 0.87 6. Fencholis 20.578 12.71 7. Kamparas 22.500 7.53 8. Izoborneolis 24.091 25.74 9. Cis-p-mentanas 26.375 2.14 10. Ciklopropanaftalenas 39.322 2.09 11. 1,1,4,5,6-pentametil-2,3-dihidro-indenas 46.545 1.67 12. Trans-Kalamenenas 46.959 1.76 13. Abietolis 83.722 2.90

3.1.4. Madagaskaro kopalo ekstrakto cheminė sudėtis

Atlikus Madagaskaro kopalo cheminės sudėties tyrimus, iš pateiktos chromatogramos (7 pav.), matyti, kad iš viso nustatyti 13 skirtingų junginių. Tyrimo metu identifikuoti: α-trans-bergamontenas (27,99 %), bisabololis (24,10 %), kurkumenas (13,98 %), Trans-seskvisabinenhidratas (8,36 %), α-cis-bergamontenas (4,80 %), α-Zingiberenas (4,60 %), Trans-seskvisabinenhidratas (3,42 %) ir kiti junginiai (8 lentelė).

7 pav. Madagaskaro gintaro chromatograma

Chromatogram Madag C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Madagaskaro001.qgd

min 16,000,000 41.0 42.0 43.0 44.0 45.0 46.0 47.0 48.0 49.0 50.0 51.0 52.0 53.0 54.0 55.0 TIC 1 2 3 4 5 6 7 8 ₉ 10 11 12 13

8 lentelė. Madagaskaro gintaro ekstrakto cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo _{trukmė, min} Piko plotas,

% 1. α-cis-bergamontenas 40,568 4,80 2. α-trans-bergamontenas 41,964 27,99 3. Seskvisabinenas 43,139 0,89 4. α-kurkumenas 44,794 13,98 5. α-Zingiberenas 45,534 4,60 6. β-bisabolenas 46,301 2,23 7. Seskvicineolas 46,531 1,88 8. β-seskvihelandernas 47,142 1,29 9. Cis-seskvisabinenhidratas 48,315 1,24 10. Trans-seskvisabinenhidratas 48,952 8,36 11. 1R,4R-1-metil-4-6-metilhept-5-en-2-yl-ciklohex-2-enolis 50,372 1,38 12. Trans-seskvisabinenhidratas 50,969 3,42 13. α-bisabololis 53,434 24,10

3.1.5. Etiopijos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis

Etiopijos gintaro tyrimo metu identifikuoti tik 5 junginiai, nors iš pateiktos chromatogramos (8 pav.), matyti, kad junginių pikų yra daugiau. Kiti junginiai nenustatyti, dėl jų sudėtingumo bei masių palyginimo duomenų bazės registro. Chromatografijos tyrimo metu identifikuoti: 1,1,4,5,6-pentametil-2,3-dihidro-1H-indenas (42,01 %), 1,1,5,6-tetrametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalenas (24,13 %), kariofenilalkoholis (19,15 %), 2,3,6-trimetilnaftalenas (11,45 %) ir kamparas (3,26 %) (9 lentelė).

8 pav. Etiopijos gintaro ekstrakto chromatograma

Chromatogram Etiop C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Etiopijos001.qgd

min 1,800,000 30.0 40.0 50.0 55.0 TIC 1 2 3 4

Nustatyti junginiai puikiai atskleidžia, jog savo chemine sudėtimi Etiopijos gintaras yra panašus į kitos kilmės organinius–fosilinius sakų darinius. Pagal junginių klasifikaciją naftalenas ir jo junginiai priskiriami - policikliniams aromatiniams angliavandeniliams, kamparas – monoterpenoidams, o pastarosios cheminės grupės būdingos visiems organinės kilmės fosilinių sakų pavyzdžiams.

9 lentelė. Etiopijos gintaro ekstrakto cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min Piko plotas, % 1. Kamparas 22,511 3,26 2. 1,1,5,6-tetrametil-1,2,3,4-tetrahidronaftalenas 46,543 24,13 3. Kariofenilalkoholis 49,511 19,15 4. 2,3,6-trimetilnaftalenas 50,154 11,45 5. 1,1,4,5,6-pentametil-2,3-dihidro-1H-indenas 60,290 42,01

3.1.6. Ukrainos gintaro ekstrakto cheminė sudėtis

Atlikus Ukrainos gintaro ekstrakto chromatografinę analizę iš viso nustatyti 13 skirtingų junginių. Nors chromatogramoje matyti, kad identifikuoti ne visi pikai, tačiau daugelis junginių nustatyti (9 pav.)

9 pav. Ukrainos gintaro ekstrakto chromatograma

Chromatogram Ukr C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Ukrainos001.qgd

min 7,572,957 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 77.0 TIC 1 2 3 4 5 6 7 8 910 11 12 13

Nustatyta, kad šios rūšies fosiliniuose sakuose yra izoborneolio (31,55 %), para-cimeno (14,92%), fencholio (12,44 %), trans-kalameneno (9,65 %), cis-kalameneno (7,97 %), 1,2,3,4-tetrahidro-2,7-dimetilnaftaleno (4,68 %) ir kitų junginių (10 lentelė). Taip pat, nustatyti 1,1,4,5,6-pentametil-2,3-dihidro-1H-indeno junginio pėdsakai.

10 lentelė. Ukrainos gintaro ekstrakto cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min Piko plotas, % 1. P-cimenas 14,844 14,92 2. Eukaliptolis 15,220 4,25 3. Fencholis 20,578 12,44 4. Izoborneolis 24,114 31,55 5. 1,2,3,4-tetrahidro-2,7-dimetilnaftalenas 35,712 4,68 6. Biciklononanenas 40,124 1,15 7. α-murolenas 45,679 2,71 8. 1,1,4,5,6-pentametil-2,3-dihidro-1H-indenas 46,548 0,84 9. Trans-kalamenenas 46,930 9,65 10. Cis-kalamenenas 46,993 7,97 11. Kariofenilalkoholis 49,525 4,41 12. Kadina-1(10),6,8-trienas 50,717 4,10 13. 7-izopropil-1,1,4a-trimetil-1,2,3,4,4a,9,10,10a-oktahidrofenantrenas 74,246 1,34

3.1.8. Kolumbijos kopalo ekstrakto cheminė sudėtis

Atsižvelgiant į gautus tyrimo rezultatus, Kolumbijos kopalo chromatogramoje identifikuotas labai didelis kiekis junginių (10 pav.) Kadangi, kopalas yra santykinai jaunesnis už gintarą, galima teigti, jog ekstakcija vyko efektyviau, nei ilgaamžiuose gintaro mėginiuose, kuriuose mažos molekulinės masės junginiai virto sudėtingais polimeriniais kompleksais.

Tyrimo metu identifikuoti α-kubabenas, α-kopaenas, Kubebolis, β-kubabenas, Epi-kubebolis, δ-kadedinas, Kariofilenas, 9-epi-(E)-kariofilenas ir aptikta mažos molekulinės masės aromatinių angliavandenilių pėdsakų (11 lentelė).

10 pav. Kolumbijos kopalo ekstrakto chromatograma

11 lentelė. Kolumbijos kopalo ekstrakto cheminės sudėties rezultatai

Nr. Junginio pavadinimas Sulaikymo

trukmė, min Piko plotas, % 1. α-kubabenas 36,713 20,30 2. α-kopaenas 38,534 37,53 3. β-kubabenas 39,201 6,05 4. Kariofilenas 40,734 3,02 5. Cis-α-bergamotenas 41,857 0,87 6. α-humulenas 42,726 0,61 7. 9-epi-(E)-kariofilenas 43,228 2,37 8. 4a-metil-1-metilen-7-decahydronaftalenas 44,050 0,64 9. γ -murolenas 44,258 0,95 10. β-longipinenas 44,554 0,22 11. α-kurkumenas 44,727 0,41 12. γ-amorfenas 45,027 0,19 13. Epi-kubebolis 45,481 6,74 14. α-murolenas 45,732 0,52 15. Kubebolis 46,777 8,79 16. δ-kadedinas 47,211 3,64

Atsižvelgiant į gautus skirtingos kilmės ir amžiaus fosilinių sakų ekstraktų cheminės sudėties rezultatus, pastebėta, kad naudojant DC-MS metodą, pagal gautas mėginių chromatogramas, galima identifikuoti ne tik junginius, bet ir atskirti kokios kilmės gintaro mėginys, kadangi skiriasi cheminė sudėtis ir vyraujantys junginiai.

min 37,000,000 40.0 50.0 60.0 69.0 TIC 1 2 3 4 5 ₆ 7 89 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26

Tirtuose Baltijos gintaro (Baltijos jūros regionas), Ukrainos gintaro (Vakarų Ukraina), Madagaskaro kopalo (Madagaskaras), Kolumbijos kopalo (Kolumbija), Sumatros gintaro (Sumatros sala) ekstraktų mėginiuose vyrauja mažos molekulinės masės aromatiniai angliavandeniliai (cimenai), monoterpenai (borneolis, kamparas, fenchonas, fencholis), seskviterpenai, diterpenoidai bei kiti lakūs, mažos molekulinės masės junginiai. Gauti rezultatai puikiai iliustruoja panašią fosilinių sakų biologinę kilmę bei pagrindžia jo kilmės hipotezes, jog gintaras spygliuočių sakų fosilizuotas produktas.

Atlikus skirtingos kilmės bei amžiaus fosilinių sakų ekstraktų cheminės sudėties tyrimus pagal DC-MS mūsų naudotą metodiką, kuri buvo taikoma cheminių junginių identifikavimui, nei viename mėginyje neaptiktas tyrimui svarbiausias aktyvus junginys – gintaro rūgštis.

3.2. Gintaro rūgšties identifikavimas DC-MS metodu taikant derivatizaciją

Pritaikius DC – MS metodiką nustatant skirtingos kilmės fosilinių sakų cheminę sudėtį, nepavyko identifikuoti vieno iš aktyviausių junginių – gintaro rūgšties, kuri pasižymi antivirusinėmis savybėmis.[34] Atsižvelgiant į tyrimo tikslus, gintaro rūgštis yra vienas iš svarbiausių aktyvių junginių, esančių fosilinių sakų sudėtyje, todėl pirmiausia buvo ieškoma tinkamos metodikos, kuri leistų identifikuoti ir atskirti komplekse esančią organinę rūgštį.

Dėl santykinai mažos molekulinės masės, mėginių kompleksiškumo bei galimų priemaišų, buvo taikoma junginio derivatizacija, remiantis T. P. Lynch ir A. P. K. Grosser moksliniame straipsnyje pateikta metodika.[20] Derivatizacijos metu gintaro rūgštis, –bis-(trimetilsilil)-trifluoracetamido (BSTFA (≥99,9 proc. Supelco, JAV )) derivatizato tirpalu chemiškai modifikuojama aktyvų vandenilį pakeičiant trimetilsilil Si(CH3)3 funkcine grupe. Naujas junginys pasižymi didesniu lakumu ir tampa

tinkamu chromatografinei analizei.

Kokybiniam gintaro rūgšties chromatografiniam tyrimui pasirinkti 2,390 mkg/ml gintaro rūgšties standarto (≥99,0 proc.) ir baltijos gintaro ekstrakto tirpalai. Tirpiklis – tetrahidrofuranas. Į 2 ml. chromatgrafinių mėginių buteliuką, automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV) pagalba įmama 350 µl derivatizato tirpalo (BSTFA) ir pridedame 850 µl gintaro rūgšties standarto tirpalo 2,390 mkg/ml (≥99,0 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija) ir sandariai uždaroma.

Gauti tiriamųjų tirpalų derivatizato mėginiai palaikomi 5 min. kambario temperatūroje, ir po 1 µl, pasirinkus tinkamus DC-MS metodo parametrus, injekuojami į dujų chromatografą. Pradinė injektoriaus temperatūra - 260,0°C.

Atlikus standarto derivatizato chromatografinę analizę nustatyta, kad gintaro rūgšties derivato sulaikymo trukmė – 9,5 min. (11 pav.). Gauta chromatograma bei sulaikymo laikas, ir pagal gautų

fragmentų masių santykį (147 m/z) lyginamas su duomenų bazės biblioteka naudojamas identifikuoti gintaro rūgštį pasirinktame fosilinių sakų ekstrakte.

11 pav. Gintaro rūgšties standartinio tirpalo derivato chromatograma

Baltijos gintaro ekstrakto derivato chromatogramoje (12 pav.) matyti, kad metodika pritaikyta tinkamai, gintaro rūgštis identifikuota, o gautos junginių smailės nepersidengia. Palyginus pikų sulaikymo trukmes ir masių spektrus 9,5 min. intervale, duomenys sutampa su etaloniniu gintaro rūgšties derivato tirpalu.

12 pav. Baltijos gintaro ekstrakto derivato chromatograma

Chromatogram Succinic a. 3 konc C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Succinic a. 3KK konc.qgd

min 40,000,000

9.0 10.0 11.0

TIC

Chromatogram Ukrainos Gintaras derivat new C:\GCMSsolution\Data\Gintaras\Duomenys\Ukrainos Gintaras derivat new.qgd

min 23,897,946

6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 20.9 TIC

Gintaro rūgšties derivatas

Taip pat, tyrimo metu buvo įvertinti ir tiriamojo junginio masių spektrai, kurie padeda dar tiksliau identifikuoti gintaro rūgštį. Buvo nustatyti gintaro rūgšties molekulės jonų masių ir krūvių santykiai tiriamajame ir etaloniame tirpale (m/z): 147; 73; 247.

13 pav. Gintaro rūgšties standarto derivato ir baltijos gintare esančios gintaro rūgšties masių spektrai

Gintaro rūgšties jonų masių ir krūvių santykiai tiriamjame ir standartiniame tirpale sutampa (13 pav.), todėl galima teigti, kad metodika yra tinkama gintaro rūgšties kokybinei ir kiekybei analizei taikyti.

3.3. Gintaro rūgšties kiekybinis palyginimas skirtingos kilmės gintaro ekstraktuose

DC-MS metodu taikant derivatizaciją

Nustačius gintaro rūgštį fosilinių sakų ekstraktuose toliau buvo atliekama kiekybinė analizė. Kiekybinis fosiliniuose sakuose esančios gintaro rūgšties nustatymas buvo atlikas pagal kalibracinę kreivę. Tyrime naudoti penkių skirtingų koncentracijų gintaro rūgšties standartiniai tirpalai (0,580; 1,170; 2,390; 4,680; 9,350 µg/ml). Tirpiklis – tetrahidrofuranas.

Gaminant etaloninius tirpalus į 2 ml. chromatgrafinių mėginių buteliuką, automatinės pipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV) pagalba įmama 350 µl derivato tirpalo (BSTFA) ir pridedame 850 µl gintaro rūgšties standarto tirpalo (≥99,0 proc. Sigma-Aldrich, Vokietija) ir sandariai uždaroma.

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) ₁₄₇ 73 247 55 _{129 172} 218 262 89 203 279 303 327 351 375 409423 448 471 495 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00(x10,000) ₁₄₇ 73 247 55 _{129 172} 218 262 89 203 279 303 327 351 375 409423 448 471 495

Gintaro rūgšties derivatas (Standartas)

Gauti tiriamųjų tirpalų derivato mėginiai palaikomi 5 min. kambario temperatūroje ir po 1 µl injekuojami į kolonėlę. Pradinė injektoriaus temperatūra - 260,0°C.

Pagal gintaro rūgšties derivatizato smailės plotą ir pagal 5 skirtingos koncentracijos etaloninius tirpalus padaryta tiesinės regresijos kalibracinė kreivė (14 pav.) Kalibracinių grafikų abscisių ašyje yra medžiagos koncentracija, o ordinačių – instrumento atsako intensyvumas.

14 pav. Kalibracinė kreivė gintaro rūgšties nustatymui

Kadangi kreiviės determinacijos koeficiento (r2=0,998324) reikšmė yra arti vieneto, galima teigti, kad šios kalibracinės kreivės sudarytos tinkamai ir gintaro rūgšties koncentracijas galima nustatyti tiksliai.

Sudarytų kalibracinių kreivių parametrai pateikiami 12 lentelėje, nurodant koncentracijos ribas, koncentracijų skaičiavimo lygtis ir m/z duomenis.

12 lentelė. Kalibracinės kreivės parametrai

Junginys Koncentracijų

ribos Lygtis m/z

Gintaro rūgštis 0,580 - 9,350 µg/ml y=675913,472855*x+147257,005158 147

Sudarius kalibracines kreives etaloniniams tirpalams, toliau atliekami kiekybinio įvertinimo tyrimai su skirtingos kilmės bei amžiaus fosilinių sakų ekstraktų derivatais. Atsižvelgiant į tyrimo

Calibration ID#:1 Mass:147.00 Name:Succinic acid

f(x)=675913.472855*x+147257.005158 rr1=0.999162 rr2=0.998324

MeanRF:743150.71 RFSD:38022.19 RFRSD:5.12 CurveType:Least Square Method

ZeroThrough:Not Through WeightedRegression:None External Standard 1.0 [*10^1] 0.0 0.5 7.0 [*10^6] 0.0 3.0

# Conc. (mkg/ml) Mean Area 1 0.580 433013.00 2 1.170 912756.00 3 2.390 1843860.00 4 4.680 3433486.00 5 9.350 6394518.00 r2_=0,998324