VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
VYTAUTAS PETKEVIČIUS
PAPRASTOSIOS KRAUJAŽOLĖS (Achillea millefolium L.) EKSTRAKTŲ
CHELATINIO IR ANTIMIKROBINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Raimondas Benetis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr. Vitalis Briedis, parašas
Data
PAPRASTOSIOS KRAUJAŽOLĖS (Achillea millefolium L.) EKSTRAKTŲ
CHELATINIO IR ANTIMIKROBINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbą atliko Darbo vadovas
Magistrantas doc. dr. Raimondas Benetis, parašas
Vytautas Petkevičius, parašas Data
Data
Recenzentas
Turinys
SANTRAUKA ... 5
SUMMARY ... 6
1. SANTRUMPOS ... 8
2. ĮVADAS ... 9
3. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI ... 10
4. LITERATŪROS APŽVALGA ... 11
4.1. Achillea millefolium apibūdinimas, paplitimas, panaudojimas medicinoje ir cheminė sudėtis .. 11
4.1.1. Paprastosios kraujažolės paplitimas ir morfologiniai požymiai ... 11
4.1.2. Paprastosios kraujažolės cheminė sudėtis ... 12
4.1.3. Panaudojimas medicinoje ir poveikis žmogaus organizmui ... 14
4.2. A. millefolium antimikrobinis aktyvumas ... 15
4.2.1. Antimikrobiniu poveikiu pasižymintys A. millefolium junginiai ... 15
4.2.2. Antimikrobinio aktyvumo nustatymo metodai ... 21
4.3. Polifenoliniai junginiai ... 23
4.3.1. Polifenolinių junginių biosintezė ir biologinis poveikis ... 23
4.3.2. Laisvieji radikalai, jų poveikis ir susidarymas ... 24
4.3.3. Antioksidantai ir jų nustatymo metodai ... 25
5. TYRIMŲ METODIKOS IR METODAI ... 29
5.1. Tyrimų objektas ... 29
5.2. Chelatinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 29
5.3. Bendrojo fenolkarboksirūgščių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 30
5.4. Mikrobiologinių tyrimų metodika ... 31
5.5. Duomenų analizė ... 33
6. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 34
6.1. Chelatinio aktyvumo varijavimas A. millefolium žolės ėminiuose ... 34
6.2. Chelatinio aktyvumo įvairavimas A. millefolium augalo morfologinėse dalyse ... 35
6.2.2. Antioksidantinio aktyvumo varijavimas A. millefolium lapuose ... 38
6.3.3. Antioksidantinio aktyvumo varijavimas i A. millefolium žieduose ... 39
6.4. Apibendrinimas ... 41
6.5. A. millefolium liofilizuoto žolės ekstrakto antimikrobinis aktyvumas ... 43
7. IŠVADOS ... 49
8. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 50
SANTRAUKA
Vytauto Petkevičiaus magistro baigiamasis darbas/mokslinis vadovas doc. dr. Raimondas Benetis; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Vaistų chemijos katedra. – Kaunas.
Paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) ekstraktų chelatinio ir antimikrobinio aktyvumo įvertinimas.
Tikslas: Ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) augalinių žaliavų chelatinį ir antimikrobinį aktyvumą.
Uždaviniai: 1) Nustatyti chelatinį aktyvumą natūraliose augavietėse surinktuose A. millefolium vaistinės augalinės žaliavos ėminiuose bei jos įvairavimą skirtingose cenopopuliacijose. 2) Įvertinti chelatinį aktyvumą bei jo rodmenų pokyčius A. millefolium stiebų, lapų ir žiedų augalinėse žaliavose. 3) Ištirti sausojo A. millefolium vaistinės augalinės žaliavos ekstrakto antimikrobinį poveikį.
Tyrimo metodika: Įvertintas pagaminto iš paprastosios kraujažolės žolės ėminių sausojo ekstrakto antimikrobinis poveikis. Sausasis ekstraktas pagamintas žolės ėminius ekstrahavus su 40 proc. etanoliu maceracijos metodu, iš gauto ekstrakto nugarinus etanolį ir liofilizavus vandeninį tirpalą. Antimikrobinis ekstrakto aktyvumas buvo nustatytas diskų difuzijos metodu. Chelatinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu metodu paruošus 70 proc. etanolinius A. millefolium ekstraktus ir panaudojus ferozino, bei geležies chlorido reagentus.
Rezultatai ir išvados:Pirmą kartą Lietuvoje įvertintas chelatinis 70 proc. etanolinių antžeminių
A. millefolium augalų dalių ekstraktų aktyvumas bei nustatytas antioksidantinio aktyvumo rodiklių
kintamumas, tiesiogiai priklausantis nuo augalo morfologinės dalies. Didžiausias chelatinis aktyvumas buvo nustatytas žiedų ekstraktuose, jis siekė 45,808 proc., šiek tiek mažesnis antioksidantinis aktyvumas buvo nustatytas lapuose. Vidutinis etanolinių lapų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas siekė 39,035 proc. Vidutinis stiebuose nustatytas antioksidantinis aktyvumas buvo 25,425 proc. FIC metodu nustatytas ženklus antioksidantinio aktyvumo įvairavimas tarp skirtingų A. millefolium cenopopuliacijų. Vaistinės žaliavos mėginių grupėje antioksidantinis aktyvumas skirtingose cenopopuliacijose kito nuo 29,353 iki 51,575 proc., žieduose nuo 34,052 iki 59,895 proc., lapuose nuo 23,549 iki 56,931 proc., stiebuose nuo 13,903 iki 44,827 proc. Eksperimentinių duomenų sklaidai apibūdinti apskaičiuoti bandinių grupių variacijos koeficientai (vaistinės žaliavos - 19,336 proc., žiedų - 18,569 proc., lapų - 24,827 proc., stiebų 34,113 proc.) parodė, kad antioksidantinio aktyvumo sklaida stiebuose yra labai didelė, lapuose didelė, o žiedų ir vaistinės augalinės žaliavos mėginiuose vidutinė. Nustatyta, kad liofilizuotam A. millefolium žolės ekstraktui yra būdingas platus antimikrobinio poveikio spektras. Jis slopino visų tirtų gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų kultūrų augimą.
Stipriausiai antimikrobiškai veikė G+ Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis ir G- Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa. Silpnesnis antibakterinis poveikis nustatytas G+ Bacillus mycoides, Bacillus cereus ir Staphylococcus aureus. Kraujažolių ekstraktas žymesniu priešgrybeliniu aktyvumu
nepasižymėjo.
SUMMARY
Vytautas Petkevičius final master’s thesis/research supervisor assoc. prof. PhD. Raimondas Benetis; Department of Drug Chemistry, Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. – Kaunas.
The investigation of chelating and antimicrobial activities of yarrow (Achillea millefolium L.) extracts.
Goal: To investigate chelating and antimicrobial activity of common yarrow (Achillea
millefolium L.) plant raw materials naturally growing in Lithuania.
Objectives: 1) To determine the chelating activity of collected in natural habitats A.
millefolium pharmacy plant raw material samples and its variation in different coenopopulations. 2) To
evaluate chelating activity and changes of its readings in plant raw materials of A. millefolium stems, leaves and flowers. 3) To investigate antimicrobial effect of dry A. millefolium medicinal plant raw material extract.
Methods of study: Antimicrobial effect of dry extract made from common yarrow herb samples was evaluated. Dry extract was produced by the extraction of herb samples with 40 percent ethanol by maceration method, from obtained extract performing the evaporation of ethanol and lyophilization of aqueous solution. The antimicrobial activity of extract was determined by disc diffusion method. Chelating activity was determined by spectrophotometric method after preparation of 70 percent ethanol extracts of A. millefolium and use of ferrozine and ferric chloride reagents.
Results and conclusions: For the first time in Lithuania chelating activity of 70 percent ethanol overground A. millefolium parts of plants extracts was evaluated and variability of antioxidant activity indicators was determined, directly depending on the morphology part of plant. The biggest chelating activity was determined in extracts of flowers, it was 45,808 percent, slightly lower antioxidant activity was determined in leaves. Average antioxidant activity of ethanol leaves extracts amounted to 39,035 percent. Average in stems determined antioxidant activity was 25,425 percent. By FIC method significant variability of antioxidant activity was determined between different A.
different coenopopulations vary from 29,353 percent to 51,575 percent, in flowers from 34,052 to 59,895 percent, in leaves from 23,549 to 56,931 percent, in stems from 13,903 to 44,827 percent. In order to characterize experimental data dispersion variation coefficients of groups of samples were calculated (pharmacy raw material – 19,336 percent, flowers – 18,569 percent, leaves – 24,827 percent, stems – 34,113 percent) and showed, that dispersion of antioxidant activity in stems is very big, in leaves big and in flowers and in pharmacy raw material samples is average. It was found, that lyophilised A. millefolium herb extract is characterized by wide spectrum of antimicrobial effect. He suppressed growth of all studied Gram-positive and Gram-negative bacterial cultures. The strongest antimicrobial activity was determined in G+ Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis and G-
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Weaker antibacterial effect was identified in G+ Bacillus mycoides, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus. Yarrow extract does not have greater antifungal
activity.
PADĖKA
Dėkoju magistrinio darbo vadovui doc. dr. Raimondui Benečiui už suteiktą didelę visokeriopą pagalbą rašant magistrinį darbą. Taip pat dėkoju doc. dr. J. Radušienei už pagalbą tiriant sausojo A.
1. SANTRUMPOS
eNOS – azoto oksido sintazėDCQA – dikafeilchino rūgštys ROS – reaktyvūs deguonies junginiai RNS – azoto laisvieji radikalai DNR – deoksiribonukleorūgštis proc. – procentai
FIC – geležies jonų surišimas
HSV-1 – herpes simpleks 1 tipo virusas PI-3 – parainfluenza 3 tipo virusas
2. ĮVADAS
Augalai buvo naudojami nuo priešistorinių laikų. Liaudies medicina beveik visame pasaulyje daugiausia remiasi augaliniais vaistiniais preparatais. Augalai naudojami terapijai. Tai saugus, ekonomiškas, veiksmingas ir lengvai prieinamas būdas [1]. Šiuo metu sparčiai didėja susidomėjimas augaliniais preparatais, labai didelis dėmesys skiriamas vaistinių augalinių žaliavų biologiniams tyrimams [111].
Achillea genties augalų fitocheminiai tyrimai parodė, kad daugelis kaupiamų junginių šioje
gentyje yra biologiškai aktyvūs [112]. Paprastosios kraujažolės vaistinėje žaliavoje aptinkama junginių su antibakteriniu ir antioksidaciniu poveikiu [1].
Augalinės biomolekulės pasižymi struktūrine įvairove, jose kaupiami per milijonus metų susiformavę antioksidantai tapo funkcionalūs ir įvairiapusiški in vivo. Šie natūralių komponentų požymiai ypač skiriasi nuo sintetinių medžiagų. Tuo paaiškinamas geras daugelio natūralių junginių biologinis/farmakologinis aktyvumas [57]. Augaliniai antioksidantiniai junginiai, tokie kaip fenolkarboksirūgštys ir kiti polifenoliniai junginiai, aptinkami A. millefolium vaistinėje augalinėje žaliavoje, surišdami laisvuosius radikalus slopina vykstančius oksidacinius mechanizmus, sukeliančius [54; 60] baltymų, lipidų ir DNR pažeidimus [52].
Antioksidantai atlieka eilę kitų funkcijų, apimančių peroksidų suardymą, singletinio deguonies sumažinimą, NADH-oksidazės, sukcinoksidazės, ATPazės ir eNOS (azoto oksido sintazės) fermentų slopinimą [102], dalyvauja genų ekspresijoje [81].
Atsižvelgus į antioksidantų sukeliamą poveikį, antioksidantinį aktyvumą sąlygojantys kaupiami paprastosios kraujažolės vaistinėje žaliavoje junginiai svarbūs apsaugant organizmą nuo laisvųjų radikalų, sukeliančių vėžio vystymąsi, Alzheimerio, Parkinsono ligas, širdies ir kraujagyslių ligas, todėl svarbu ištirti chelatinį aktyvumą, nurodantį augalo antioksidacines savybes [52, 60].
Daugelį metų vyksta moksliniai tyrimai. Bandoma sukurti vis naujus plataus spektro antibiotikus, veikiančius prieš infekcines ligas, sukeltas bakterijų, virusų, grybelių ir parazitų. Ilgalaikis plataus spektro antibiotikų vartojimas didina atsparumą vaistams. Kyla didžiulis poreikis ieškoti naujų antimikrobiškai veikiančių medžiagų [92].
Paprastoji kraujažolė kaupia antimikrobiniu aktyvumu pasižyminčius junginius: eterinio aliejaus komponentus [15], flavonoidus [40], dikafeilchino rūgštis [104, 81, 105, 106], chlorogeno rūgštį [107, 81, 108, 109], todėl tikslinga ištirti paprastosios kraujažolės sausąjį ekstraktą, įvertinti jame esančių junginių antimikrobinį aktyvumą prieš bakterijas ir grybelius. Bakterijos ir grybeliai sukelia daugelį infekcinių ligų, todėl sausojo ekstrakto aktyvumo įvertinimas prieš tam tikrus mikrobus palengvintų infekcinių ligų eigą.
3. DARBO TIKSLAS IR DARBO UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea
millefolium L.) augalinių žaliavų chelatinį ir antimikrobinį aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1) Nustatyti chelatinį aktyvumą natūraliose augavietėse surinktuose A. millefolium vaistinės augalinės žaliavos ėminiuose bei jos įvairavimą skirtingose cenopopuliacijose.
2) Įvertinti chelatinį aktyvumą bei jo rodmenų pokyčius A. millefolium stiebų, lapų ir žiedų augalinėse žaliavose.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. Achillea millefolium apibūdinimas, paplitimas, panaudojimas
medicinoje ir cheminė sudėtis
Karalystė: Augalai (Plantae) Šeima: Astriniai (Asteraceae) Gentis: Kraujažolė (Achillea)
Rūšis: Paprastoji kraujažolė (Achillea millefolium) [1].
4.1.1. Paprastosios kraujažolės paplitimas ir morfologiniai požymiai
Kraujažolė - tai vaistinis augalas, priklausantis Asteraceae augalų šeimai, žinomas nuo antikos laikų. Lotyniškas pavadinimas Achillea kilęs iš karžygio vardo Achilas, kuris Trojos karo metu gydėsi žaizdas Achillea žole. Rūšies pavadinimas millefolium nurodo augalą, turintį didelį lapų skaičių. Pats augalas kilęs iš šiaurinio pusrutulio, ypatingai kalnuotų vietų, esančių Europoje, Rytų Azijoje ir Šiaurės Afrikoje. Daugiausia šios šeimos augalų yra išplitę vidutinio ir šalto klimato juostose. Labai paplitęs Lenkijoje, visoje Europoje, Centrinėje Azijoje ir Šiaurės Amerikoje. Kraujažolės auga kai kuriose šiaurinėse Irano dalyse, Elburso aukštumose, Urmijos ir Tabrizo miestuose, Kazachstano kalnuose, miškuose, stepėse. [2, 3, 5, 8].
Kraujažolė yra labai aromatingas daugiametis augalas, randamas pylimuose, sausose ganyklose ir pakelėse. Šios šeimos augalai yra daugiamečiai žoliniai, turi šakniastiebius. Augalas stipraus aromato, užauga iki 80 cm aukščio, turi kekės formos žiedyną. Būdinga plona šaknis su daugeliu plonų šakelių. Viršutinėje šaknies dalyje yra cilindrinis stiebas. Stiebas yra tiesus, šakelės kampuotos, išsidėsčiusios skirtingais atstumais viena nuo kitos ant stiebo, ant kurio auga daug lapelių, kai kurie neturi lapkočių. Maži plunksniški augalo lapeliai dengia šakas, augančias į viršų. Lapuose iš abiejų pusių yra maišeliai, užpildyti ekstraktu. Balti žiedai auga stiebo viršūnėje ir sudaro žiedyną. Kai kuriuose A. millefolium augaluose liežuviški žiedai būna purpurinės arba violetinės spalvos. Žiedyne gausu mažų, 4-8 mm ilgio ir 2-5 mm pločio žiedelių. Kiekvienas iš jų turi dviejų tipų žiedus: vamzdinius žiedelius, esančius viduryje galvutės ir baltus liežuviškus žiedelius galvutės pakraštyje. Vamzdiškų žiedelių augalas turi daugiau, tačiau jie yra mažesni už liežuviškos formos žiedelius. Įprastai kraujažolės žiedą sudaro 5 liežuvėlio formos žiedeliai, o žiedyną - 12-24 žiedų [2, 3, 8].
Kraujažolės vaisius yra lygus, kiaušinio formos, neturi plaukelių, yra nuo sidabriškai pilkos spalvos iki geltonos kvadratinės formos, 1,8-2 mm dydžio su mažais sparneliais. Kiekviena kraujažolė gali pagaminti apie 3000-4000 vaisių. Augalas turi automorfines, disko pavidalo nektarines, išsidėsčiusias žemiau vainikėlio vamzdelio virš žemesnės mezginės, iš dalies supančios piestelės pagrindą. Išorinės nektarinės sienelės turi penkiakampio formos pavidalą. Lyginant nektarinės dydį ir žiedo vainikėlį, matoma, jog nektaro liaukos ilgis sudaro apie 8 proc. vainikėlio ilgio. Nektarinė turi plokščią formą, o jos ilgis apie 181,5μm. [2, 3, 8].
4.1.2. Paprastosios kraujažolės cheminė sudėtis
Šiaurės srityje yra daugiau kaip 120 augalų rūšių, yra tipų, kurie skiriasi azuleno koncentracijos lygiu. Augalų rūšys gali būti diferencijuojamos į du tipus: pirmas tipas - turintys savo sudėtyje azuleno; antras tipas - neturintys savo sudėtyje azuleno. Sudėties skirtumas priklauso nuo to, kokiame regione augalas auga, tačiau iš esmės skirtumų augalų morfologijoje nėra. Pagrindiniai A.
millefolium komponentai yra monoterpenai ir seskviterpenai. Seskviterpenai eteriniame aliejuje
aptinkami aciklinės ir biciklinės struktūrų formų, dažnai jie būna seskviterpenų laktonai. Svarbiausi monoterpenų ingredientai: alfa-pinenas, beta – pinenas, tujonas, cineolas, borneolis. Sudėtyje esantys pinenai priskiriami dvicikliams monoterpenams [8]. A. millefolium savo sudėtyje kaupia terpenoidus: achiliciną, 8-alfa-artabsin 1,4-endoperoksidą, 8-alfa-artabsin 1,4-endoperoksidą ir longipinanus, flavonoidus: liuteoliną, cinarozidą, liuteolin malonil-gliukozidą, apigeniną, kosmosiną, apigenin 7-malonil-gliukozidą, rutiną, amino rūgšties darinius: choliną, betainą, proliną, stachidriną, betoniciną [4], cukrus taninus, gleives, dervas, alkaloidus, hidroksil – kumarinus, salicilo ir kavos rūgštis, fitosterolį, beta-sitosterolį [14]. Savo sudėtyje turi metoksilintų flavonų: kasticino, artemetino, 5-hidroksi-3,6,7,4‘-tetrametoksiflavono [10].
Remiantis skirtingų mokslininkų atliktais tyrimais nustatyta, kad pagrindiniai eterinio aliejaus komponentai yra: askaridolis – 47,2 proc., kariofileno oksidas – 20 proc., beta-kariofilenas 1,5 - 45,5 proc., chamazulenas – 13 proc., beta-tujonas – 8,3 - 21,7 proc., germakrenas-D – 36,3 proc., kamparas – 20,6 proc., artemiso ketonas – 10,4 proc., guaiazulenas – 9,5 proc., piperitonas – 7,5 proc., chrisantenonas – 7,1 proc. ir 1,8-cineolas – 6,6 proc. [5]. Sudėtyje esantys azulenai suteikia eteriniam aliejui būdingą spalvą. Daugiausia eterinio aliejaus randama žolės žieduose. Šviežiuose žieduose sukaupiama iki 0,25 proc. eterinio aliejaus, o išdžiovintuose randama iki 0,6 proc. eterinio aliejaus. Kitose augalo dalyse eterinio aliejaus kiekis svyruoja nuo 0,1 proc. iki 0,3 proc. Specialiai auginamose
siekia iki 5,88 proc., Vokietijoje iki 5,65 proc., Italijoje iki 2,25 proc. ir Lenkijoje iki 2 proc. eterinio aliejaus [8]. Kazachstane surinkta ir išdžiovinta A. millefolium žolė buvo tiriama „Clevenger“ tipo aparate, kur nustatytas eterinio aliejaus kiekis sudarė 0,33 proc. [5].
Atlikus liepsnos atominės absorbcijos spektrofotometrijos (F-AAS) testą nustatyta, kad A.
millefolium žolė kaupia varį – 5,9 ppm, cinką – 11,4 ppm, manganą – 43 ppm, geležį – 152 ppm,
chromą – 0,3 ppm, nikelį – 5,7 ppm ir šviną – 0,5 ppm [6].
Pagal Europos Farmakopėją, visos kraujažolės ar nukirptos A. millefolium žolės viršūnėse eterinio aliejaus kiekis turėtų būti ne mažesnis nei 2 ml/kg ir turėti ne mažiau kaip 0,02 proc. proazulenų, išreikštų chamazuleno pavidalu. Abi medžiagos skaičiuojamos esant išdžiovintai žolei. Ankstesnių tyrimų metu išanalizavus 40 komercinių A. millefolium mėginių nustatytas vidutinis eterinio aliejaus kiekis siekė 2,06 proc., o jo kiekis tiriamuosiuose mėginiuose kito nuo 0,5 proc. iki 5,88 proc. Sudėtyje esančių proazulenų koncentracija siekė nuo 0 proc. iki 0,23 proc., o vidutinis proazulenų kiekis buvo 0,03 proc. DCQA (dikafeilchino rūgščių) kiekis kraujažolėse svyravo nuo 0,10 proc. iki 1,60 proc., vidutinis kiekis buvo 0,87 proc. Flavonoidų rasta nuo 0,13 proc. iki 1,11 proc., vidutinis kiekis buvo 0,60 proc. [7]. Norvegijoje atlikto tyrimo metu pradinėje augimo stadijoje rastas didžiausias kiekis kamparo, 1,8-cineolo ir alfa-tujono. A. millefolium vegetacinio periodo metu sabineno, 4-terpineolio, borneolio ir jo acetato kiekis augalinėje žaliavoje laikui bėgant didėjo. Augalui užaugus, eteriniame aliejuje nustatyti didžiausi kiekiai alfa-pineno, beta-pineno, alfa-tujono ir 1,8-cineolo. Mažiausiai aptikta beta-tujono ir gama-terpineno. Augalo augimo metu mažai randama sabineno, kamparo, 4-terpineolio, borneolio ir jo acetato [8].
Lietuvoje iširtos keturios skirtingos Achillea millefolium vaistinės augalinės žaliavos rūšys, užaugintos Kauno botanikos sode. Tyrimui panaudotos A. millefolium su baltais, rožiniais, tamsiai rožiniais ir raudonais žiedais. Didžiausias flavonoidų kiekis nustatytas žolėje, turinčioje tamsiai rožinės spalvos žiedus, o mažiausias flavonoidų kiekis - turinčiose rožinius žiedynus. A. millefolium, turinčių baltus ir raudonus žiedynus, bendras flavonoidų kiekis žolėje buvo panašus. Nustatytas skirtumas tarp A. millefolium tipų, sukaupusių daugiausiai ir mažiausiai flavonoidų; skirtumas siekė 28,6 proc. A. millefolium, turinčiose baltus žiedynus, didžiausias flavonoidų kiekis aptiktas žolėje žydėjimo pradžioje ir žydėjimo pabaigoje. Didžiausias eterinio aliejaus kiekis nustatytas žolėje ir žieduose, turinčiuose baltojo tipo žiedyną. Kiek mažesnis kiekis nustatytas ryškiai rožinės spalvos A.
millefolium tipo žolėje ir žieduose, toliau sekė raudonos žiedų spalvos tipo A. millefolium. Jos
sukauptas eterinio aliejaus kiekis žolėje ir žieduose buvo dar mažesnis, negu ryškiai rožinės spalvos tipo. Mažiausias nustatytas eterinio aliejaus kiekis A. millefolium žolėje ir žieduose, turinčiuose rožinės spalvos žiedus. Eterinio aliejaus kiekis baltojo tipo kraujažolės žieduose nustatytas daugiau nei du kartus didesnis, palyginanti su rožinės spalvos A. millefolium žiedų tipu. Eterinio aliejaus kiekis
visuose keturiuose A. millefolium tipuose skyrėsi iki 40 proc. Kraujažolės žieduose eterinio aliejaus komponentų aptikta daugiau nei žolėje [9].
4.1.3. Panaudojimas medicinoje ir poveikis žmogaus organizmui
Kraujažolė yra vienas iš svarbiausių farmacijoje naudojamų augalų, kuris buvo dažnai vartojamas jau senovės medicinoje ligoms gydyti ir kaip vaistas nuo randų ir nudegimų. Augalui būdingos antihemorojinės savybės [2]. Kraujažolės gentis turi antihelmintinių, priešuždegiminių savybių, būdingas antimikrobinis aktyvumas, pasižymintis plataus ruožo antibakteriniu poveikiu žmonėms ir gyvūnams. Žolės užpilas naudingas turint virškinimo sistemos sutrikimų, tinka kaupiantis dujoms skrandyje, didina skrandžio sulčių rūgštingumą, tradicinėje medicinoje buvo vartojamas gydyti neuralgiją. A. millefolium veikia nervų sistemą, širdį, turi savo sudėtyje taninų, yra kartaus skonio ir aromatingo kvapo. Kraujažolė naudinga gydant paprastą diarėją, hemorojų, pasireiškiantį su kraujavimu - mažina kraujavimą iš hemorojaus, efektyviai veikia inkstų akmenis, pasižymi diuretinėmis ir karščiavimą mažinančiomis savybėmis. Pagamintas etanolinis arba vandeninis ekstraktas gali panaikinti odos randus. Yra įrodyta, kad augalui būdingas priešvėžinis citotoksinis poveikis. Priešvėžinis poveikis nuo MCF-7 (krūties vėžio ląstelių linijos) yra susijęs su apigenino, liuteolino, centaureidino, kasticino ir seskviterpenų poveikiu. Aktyviai veikia prieš THP (leukemijos ląstelių linijas) ir OVCAR-5 (kiaušidžių vėžio ląstelių linijas). Atlikti tyrimai parodė, kad antioksidaciniu ir priešuždegiminiu poveikiu pasižymi antžeminės kraujažolės augalo dalys. Priešuždegiminis poveikis būdingas flavonoidams. Jie labai reikšmingi arachidono rūgšties metabolizme. [2, 10, 64, 59]. A. millefolium naudojama kaip apetitą skatinantis vaistas, pagreitina žaizdų gijimą, turi choleretinių, spazmolitinių savybių. Pagrindinį farmakologinį aktyvumą lemia eterinis aliejus. Jis veikia antimikrobiškai, proazulenai ir kiti seskviterpenų laktonai veikia priešuždegimiškai, dikafeilchino (DCQAs) rūgštys pasižymi choleretiniu poveikiu, flavonoidai - antispazminiu poveikiu. Pagal „Volksmed-Datebank“ duomenų bazę, Austrijoje A. millefolium yra viena iš aštuonių dažniausiai tradicinėje medicinoje naudojamų augalų. A. millefolium įeina į vaistažolių arbatų sudėtį. Nusiskundimai tulžies išsiskyrimo ir virškinamojo trakto sutrikimais, tai dažniausios indikacijos vartoti šias arbatas [7]. Irane A. millefolium tradiciškai vartojama karščiuojant, sergant astma, bronchitu, kosuliu, odos uždegimais, sergant gelta ar kita kepenų liga. Ankstesnių tyrimų metu su gyvūnais nustatyta, kad A. millefolium eterinis aliejus turėjo įtakos imunosupresiniam veikimui. Nustatyta, kad kavos rūgšties glikozidas atsakingas už biologinį aktyvumą, mažinantį
ląstelinį ir humoralinį imunitetą. Gautame su metanoliu A. millefolium ekstrakte yra daug šio komponento, todėl jis gali būti naudojamas kaip imuninės sistemos slopintojas [10].
4.2. A. millefolium antimikrobinis aktyvumas
Nors kitos Achillea genties augalų rūšys yra plačiai tiriamos, tačiau įdomu pastebėti, kad
Achillea millefolium antimikrobinis aktyvumas nėra plačiai ištyrinėtas [103].
Siekiant įvertinti A. millefolium antimikrobinį aktyvumą, Turkijoje buvo paruoštas metanolinis žolės ekstraktas, iš kurio išskirti dviejų tipų junginiai: vandenyje tirpūs ir vandenyje netirpūs. Ištyrus vandenyje netirpius metanolinio ekstrakto junginius, nustatytas vidutinis antimikrobinis aktyvumas Clostridium perfringers bakterijoms ir mielėms. Antimikrobinis aktyvumas nepasireiškė atlikus tyrimą su vandenyje tirpiomis medžiagomis [11].
Achillea millefolium kaupiamas eterinis aliejus turėjo žymų antimikrobinį poveikį Streptococcus pneumonae, Clostridium perfringers ir Candida albicans bakterijų kultūroms, nežymus
antimikrobinis aktyvumas nustatytas veikiant Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffii ir
Candida krusei mikroorganizmų kultūras [11].
Serbijoje ištirtas etanolinio ir etilo acetato A. millefolium ekstraktų antimikrobinis aktyvumas. Nustačius etilo acetato ekstrakto antimikrobinį aktyvumą, paaiškėjo žymus poveikis Erwinia
carotovora, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Sarcina lutea, Agrobacterium radiobacter
bakterijų kultūroms. Ypatingai stiprus etilo acetato ekstrakto antimikrobinis poveikis buvo prieš
Pseudomonas aeruginosa, tačiau nežymus Staphylococcus aureus ir antimikrobinio aktyvumo nebuvo
prieš Escherichia coli bakterijas [43].
Nustačius etanolinės ištraukos antimikrobinį aktyvumą, pastebėtas toks pat poveikis kaip ir etilo acetato ekstrakto su Escherichia coli bakterijomis, prieš kurias antibakterinio poveikio nebuvo. Etanolinė A. millefolium ištrauka silpniau už etilo acetato ekstraktą paveikė Pseudomonas aeruginosa,
Pseudomonas fluorescens, Sarcina lutea, Staphylococcus aureus bakterijų kultūras [43].
4.2.1. Antimikrobiniu poveikiu pasižymintys A. millefolium junginiai
Remiantis moksline literatūra sudėtinga įvertinti sąsają tarp konkrečių junginių ir antimikrobinio aktyvumo, todėl apžvelgiami tam tikri Achillea millefolium kaupiami antimikrobiniu aktyvumu pasižymintys junginiai.
Eterinis aliejus. Achillea millefolium eteriniame aliejuje randamas didelis kiekis terpenų darinių - monoterpenų: eukaliptolio, kamparo, alfa-terpineolio, beta-pineno ir borneolio. Šie pagrindiniai komponentai apima 59,7proc. viso eterinio aliejaus [11]. Literatūros duomenimis, A.
millefolium eterinis aliejus neleidžia daugintis Streptococcus pneumoniae, Clostridium perfringes ir Candida albicans kultūroms, švelniai slopina Mycobacterium smegmatis, Acinetobacter lwoffii ir Candida krussei mikroorganizmus [15].
Terpenoidai ir terpenai. Terpenoidai yra terpenų deguoniniai dariniai [85]. Tai didelė antimikrobinių junginių grupė, kuri pasižymi plačiu poveikio prieš mikroorganizmus spektru. A.
millefolium žolės eteriniame aliejuje aptinkami tokie terpenoidai kaip timolis, karvakrolis ir linalolas
[96]. Yra įrodyta, kad antimikrobinis terpenoidų aktyvumas daugiausia susijęs su jų funkcinėmis grupėmis. Antimikrobiniam aktyvumui teigiamą poveikį turi fenoliniuose terpenoiduose esančios hidroksi grupės, kurios dalyvauja šalinant elektronus [17].
Terpenoidai gali būti skirstomi į alkoholius, esterius, aldehidus, ketonus, eterius, fenolius ir epoksidus. Visi terpenai ir terpenoidai konstruojami nuo „galvos iki uodegos“ jungiant pasikartojančius C5 izopreno vienetus ir yra skirstomi į šeimas pagal izoprenoidų radikalų skaičių. Monoterpenai (C10) yra mažiausios molekulės. Toliau seka seskviterpenai (C15), diterpenai (C20), sesterterpenai (C25), triterpenai (C30), tetraterpenai (C40) ir politerpenai (daugiau kaip C40) [16, 63].
Karvakrolis ir timolis. Ankstesnių tyrimų metu nustatytas karvakrolio antimikrobinis aktyvumas ir jo priklausomybė nuo struktūros. Pastebėta, kad junginiui antimikrobio aktyvumo priduoda karvakrolio žiede esantys pakaitai, juos šalinant antimikrobinis aktyvumas mažėja. Silpniausias antimikrobinis aktyvumas lieka susidarius 3-izopropilfenoliui ir orto-krezoliui. Pašalinus vieną ar kitą alifatinę šoninę grandinę, sumažėja molekulės amfipatinės savybės, todėl tikėtina, jog silpnėja junginio pirminė sąveika su bakterijos membrana. Antimikrobinį aktyvumą junginyje daugiausia nulemia esanti izopropilo grupė, kiek mažiau įtakos turi metilo grupė [18].
Timolio struktūra labai panaši į karvakrolio, tačiau skirtingai nuo karvakrolio turi hidroksi grupę, esančią kitoje fenolinio žiedo padėtyje. Timolio, karvakrolio ir kitų panašių fenolinių darinių antimikrobinis poveikis susijęs su citoplazminės membranos struktūriniais ir funkciniais pažeidimais. Pirminis antibakterinio veikimo mechanizmas nėra pilnai žinomas, tačiau manoma, jog apima išorinės ir vidinės membranos suirimą ir sąveiką su membranos baltymais ir intraląsteliniais taikiniais [17].
1,8-cineolas. (1,3,3-trimetil-2-oksabiciklo[2,2,2]octanas) - natūralus organinis junginys, priklausantis monoterpenų oksidų klasei. 1,8-cineolo polinė grupė O-C – tai vandenyje netirpus, bespalvis skystis [20, 22]. 1,8-cineolas yra malonaus kvapo ir skonio. Tyrimo su neturinčiomis kailio pelėmis metu nustatyta, jog 1,8-cineolas pagerino kartu su juo vartojamų lipofilinių vaistų poodinę absorbciją [19]. 1,8-cineolas, dar vadinamas “eukaliptoliu”, mažina reumato simptomus, slopina
raumenų skausmą, lengvina atsikosėjimą sergant bronchitu [21], pasižymi antiuždegiminėmis savybėmis. 1,8-cineolas turi savybių, padedančių apsaugoti virškinimo traktą nuo opų, apsaugo nuo bronchų obstrukcijos, mažina dusulio simptomus, pagerina plaučių funkciją, jam būdingas hipotenzinis poveikis, retina širdies susitraukimų dažnį [22, 23]. 1,8-cineolas gali kontroliuoti kvėpavimo takų gleivių hipersekreciją, todėl linkęs mažinti astmos simptomus [24]. 1,8-cineolas – maža lipofilinė molekulė, lengvai praeinanti hematoencefalinį barjerą, neuronuose veikianti receptorių vietas ir enzimų aktyvumą. Tyrime su pelėmis nustatyta, kad 1,8-cineolas mažina nerimo lygį. Veikdamas acetilcholinesterazę (AchE) sumažina jos aktyvumą, todėl sumažėja neurotransmiterio acetilcholino, atsakingo už nervinių impulsų perdavimą, hidrolizė [23]. Pasižymi antioksidaciniu poveikiu, antimikrobiškai veikia bakterijas, virusus ir grybus [24]. Tyrimų metu su pelėmis nustatyta, kad mažos cineolio dozės antinociceptiniu poveikiu beveik prilygsta morfinui [25].
Šaltinių duomenimis, 1,8-cineolas pasižymi antimikrobiniu aktyvumu prieš Gram teigiamas ir Gram neigiamas bakterijas. Atlikus eksperimentinius tyrimus nustatytas aktyviausias veikimas prieš Gram teigiamas Clostridium difficile, Clostridium paraputrificum, Staphylococcus aureus bakterijas, šiek tiek silpnesnis veikimas Gram teigiamoms Clostridium perfringens, Bifidobacterium breve,
Bifidobacterium longum, Lactobacillus casei ir Gram neigiamoms Salmonella enterica serovar Bacteroides fragilis, Escherichia coli bakterijų kultūroms. Nežymus antimikrobinis 1,8-cineolo
veikimas buvo prieš Gram neigiamas Bifidobacterium infantis, Lactobacillus acidophilus, Clostridium
butyricum bakterijų kultūras [26]. Kitų šaltinių duomenimis, 1,8-cineolui in vitro būdingas Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis ir Escherichia coli bakterijų augimo slopinimas [27]. Korėjoje atlikus antimikrobinį tyrimą nustatytas
1,8-cineolo stipriausias aktyvumas prieš Staphylococcus epidermidis bakterijas, mažiau jautrios mikroorganizmų kultūros buvo Prevotella intermedia, Fusobacterium nucleatum, Streptococcus
gordonii. Dar mažesniu jautrumu pasižymėjo Streptococcus anginosus, Porphylomonas gingivalis,
turėjo nežymų veikimą prieš Streptococcus pyogenes, Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis,
Streptococcus sobrinus, Streptococcus ratti, Streptococcus criceti [35].
Kamparas. Tai vaškinis, baltas, skaidrus, kietos substancijos, turintis stiprų aromatinį kvapą junginys. Kamparas sublimuojasi kambario temperatūroje, jis yra dalinai netirpus vandenyje, bet tirpus alkoholyje, eteryje, chloroforme ir kituose organiniuose tirpikliuose. Tai terpenoidas, egzistuojantis dvejomis enantiomerinėmis formomis (1S) (-) ir (1R) (+). Šios dvi enantiomerų formos turi panašų kvapą, tačiau dar nenustatyta, kaip jos įtakoja biologinį aktyvumą. Gamtoje aptinkamas dešiniojo sukimo izomeras (D-kamparas). Kamparas pasižymi švelniu analgetiniu poveikiu, jis yra pagrindinė linimentų sudedamoji dalis, skirta palengvinti fibrozitą, neuralgiją ir panašius sutrikimus. Gali būti vartojamas kaip nestiprus kosulį lengvinantis vaistas [30]. Kamparas vartojamas esant nugaros
skausmams. 50 mg kamparo dozės vartojamos oraliniu būdu esant nedideliems širdies sutrikimams ir nuovargiui [31]. Vartojant per burną, kamparas sumažina vidurių pūtimą, tačiau turi dirginančiųjų savybių. Kamparo aliejus gali būti vartojamas injekcijomis į raumenis, per odą, gali būti naudojamas kaip kvėpavimo ir kraujo apytakos sistemos stimuliatorius, tačiau manoma, kad toks kamparo panaudojimas gali būti pavojingas. [30]. Tradiciškai kamparas buvo naudojamas kaip šaldomasis medikamentas esant krūtinės kongestijai, gydant uždegimą. Vartotas patempus sausgysles, sergant reumatu, bronchitu, astma ir raumenų skausmui sumažinti [32].
Kai kurių tyrimų metu nustatyta, kad kamparui būdingas nežymus antimikrobinis aktyvumas. Tyrimai atskleidė, jog kamparo antimikrobinis aktyvumas labai padidėja pridedant 1,8-cineolo. Tarp 1,8-cineolo ir (-) kamparo pasireiškia sinergistinis efektas. Abi kamparo formos: (+) ir (-), turi nedidelį priešgrybelinį aktyvumą, veikia prieš C. albicans. 1,8-cineolo ir (-) kamparo mišinys sumažina C.
albicans bendrą kolonijas formuojančių vienetų skaičių. Nustatyta, kad kamparas sąveikauja
sinergistiškai su kitais eterinio aliejaus komponentais, todėl sustiprėja antimikrobinis aktyvumas [29]. Atlikus tyrimus su Salmonella bakterijomis nustatyta, kad skiriant aukščiausią netoksinę kamparo dozę mutageniškumo požymiai nepasireiškia [30]. Ištyrus antimikrobinį aktyvumą nustatyta, kad kamparas aktyviausiai veikė Prevotella intermedia, Porphylomonas gingivalis bakterijas, silpnesniu aktyvumu pasižymėjo prieš Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus anginosus,
Streptococcus gordonii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Fusobacterium nucleatum
mikroorganizmus, turėjo nežymų poveikį Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus ratti bakterijų kultūroms [35].
Borneolis. Tai biciklinis monoterpeno darinys, įeinantis į eterinių aliejų sudėtį, liaudies medicinoje vartojamas esant abdominaliniam skausmui. Borneolis plačiai naudojamas maisto pramonėje, kaip priedas kosmetikoje, turi antiuždegiminių, antibakterinių savybių [33, 36]. Vartojamas esant nudegimams, sužeidimams, reumatiniam skausmui, hemorojui, odos ligoms, burnos opoms. Jis skatina skrandžio sulčių išsiskyrimą, gerina kraujo cirkuliaciją. Gydo bronchitą, kosulį ir peršalimą, mažina stresą, skatina atsipalaidavimą ir mažina nuovargį.
Tyrime su žiurkėmis pasižymėjo antitrombinėmis savybėmis. Slopina keletą Gram neigiamų ir Gram teigiamus patogeninius mikroorganizmus, jam būdingas priešgrybelinis poveikis
.
[33]. (-) Borneoliui būdingas poveikis prieš HSV-1 (herpes simpleks 1 tipo virusas) ir PI-3 (parainfluenza – 3 tipo) virusus. Veikia antimikrobiškai E. Coli, P. Aeruginosa, P. Mirabilis, K. Pneumoniae, A.Baumannii, S. Aureus, E. Faecalis, B. Subtilis bakterijų kultūras ir C. Albicans, C. Parapsilosis
grybelius [34]. Ankstesniais metais atliktas antimikrobinis tyrimas su bakterijomis. Juo nustatyta, kad
Fusobacterium nucleatum bakterijos borneoliui jautriausios, Prevotella intermedia, Streptococcus sobrinus bakterijos ne tokios jautrios. Taip pat ne tokios jautrios buvo Porphylomonas gingivalis,
Streptococcus gordonii, Streptococcus anginosus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Streptococcus mutans, Actinobacillus actinomycetemcomitans bakterijų kultūros. Nejautriausi buvo Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus sanguinis, Streptococcus ratti, Streptococcus criceti mikroorganizmai [35]. Kito tyrimo duomenimis nustatyta, kad Candida albicans, Candida tropicalis grybeliai borneoliui buvo jautriausi, kiek mažesniu jautrumu pasižymėjo Enterococcus faecalis bakterijos, nejautrios buvo Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Morexella cattarhalis bakterijos, nustatyta, kad nejautriausios buvo ir Escherichia coli bakterijos [37].
Kitų A. millefolium eteriniame aliejuje esančių junginių antimikrobinis poveikis. Atlikti moksliniai tyrimai su terpinen-4-oliu, gama-terpinenu, alfa terpinenu, kaupiamais A. millefolium [113]. Jų metu įvertintas šių junginių antimikrobinis aktyvumas. Nustatyta, kad stipriausią priešgrybelinį poveikį turėjo terpinen-4-olis. Jis stipriai slopino E. floccosum, M. canis, T. rubrum, T. interdigitale, A.
niger, A. flavus, A. fumigatus grybelius, mažiau slopino R. rubra, S. cerevisiae, C. parapsilopsis, C. albicans grybelių kolonijas. Gama-terpinenas kiek aktyviau veikė E. floccosum, T. rubrum grybelius.
Alfa-terpinenas stipriai veikė E. floccosum grybelius, mažesnis poveikis buvo būdingas M. canis, T.
interdigitale, T. rubrum grybelių kolonijoms. Alfa-terpinenui ir gama-terpinenui buvo būdingas
nežymus poveikis S. cerevisiae ir R. rubra mikroorganizmams [38].
Ištyrus A. millefolium esančio alfa-pineno, beta-pineno, kamfeno [113] ir izoborneolio [110] antimikrobinį poveikį, nustatytas alfa-pineno ir beta-pineno antivirusinis poveikis HSV-1 ir PI-3 virusams. Kamfenas ir izoborneolis pasižymėjo teigiamomis savybėmis prieš HSV-1 tipo virusus. Alfa-pinenui, beta-pinenui, kamfenui ir izoborneoliui buvo būdingas antimikrobinis poveikis P.
aeruginosa, A. baumannii, B. subtilis, C. albicans, C. parapsilosis mikroorganizmams [34].
Polifenoliniai junginiai. Flavonoidai yra fenoliniai dariniai, kuriuos sintezuoja augalai kaip atsaką į patogeninius mikroorganizmus. In vitro pasižymi dideliu antimikrobiniu aktyvumu prieš daugelį mikroorganizmų: bakterijas, grybelius, virusus. Jų aktyvumą lemia gebėjimas sudaryti kompleksus su ekstraląsteliniais baltymais, taip pat kompleksų su bakterijų ląstelių sienelėmis sudarymas. Turintys didesnį lipofiliškumą flavonoidai gali suardyti mikrobų ląstelių membranas [40, 28]. Visiems flavonoidams būdingas C6-C3-C6 fenilo-benzopirano pagrindas. Pagal fenilo žiedo padėties kitimą benzopirano dalyje mišiniai skirstomi į: flavonoidus (2-fenil-benzopiranai), izoflavonoidus (3-fenil-benzopiranai), neoflavonoidus (4-fenil-benzopiranai) [41]. Į kitas grupes skirstomi pagal centrinio žiedo (C) oksidaciją ir tuo, kad turi specifines hidroksilo grupes. Individualūs mišiniai klasifikuojami pagal skirtingą radikalų išsidėstymą A ir B žiedų šablone, kurie įtakoja fenoksilo radikalo stabilumą ir medžiagų antioksidantines savybes [58]. Labiausiai paplitę flavonoidai yra flavonai (turi C2-C3 dvigubą ryšį ir C4 okso grupę, flavonoliai (flavonai su 3-OH grupe) ir flavanonai (flavonų analogai, tačiau C2-C3 padėtyje turi viengubą ryšį) [41].
Nustatytas kraujažolėje kaupiamo apigenino [10] antimikrobinis aktyvumas. Šaltinių duomenimis apigeninas stipriai antimikrobiškai veikė P. mirabilis, P. aeruginosa, E. aerogenes, E.
cloaceae mikroorganizmus, darė nežymų poveikį S. typhi, E. coli, K. pneumoniae bakterijų kultūroms
[42].
Kitų mokslininkų atliktais tyrimais nustatytas Achillea atrata sausojo ekstrakto ir pavienių išskirtų iš A. atrata vaistinės augalinės žaliavos junginių aktimikrobinis veikimas. Sausasis ekstraktas
in vitro slopino Candida albicans ir Bacillus subtilis mikroorganizmus. Nustatytas visų išskirtų
flavonų antibakterinis aktyvumas prieš B. subtilis, išskyrus keturis flavonus: santiną, centaureidiną, apigeniną ir apigenino 7-O-gliukozidą iš Achillea atrata antžeminių dalių. Santinas, centaureidinas ir apigeninas buvo aktyvūs prieš C. albicans, santinas ir apigeninas veikė antibakteriškai E. coli [114]. Atlikus tyrimus su pelės plaučių audiniu nustatyta, kad Achillea millefolium sudėtyje esantis liuteolinas slopina Chlamydia pneumoniae bakterijas. Taip pat tyrimu nustatytas teigiamas antimikrobinis poveikis prieš keletą parazitų tipų, įskaitant Leishmania donovani ir Plasmodium falciparum [28].
Nustatytas A. millefolium aptinkamų 3,4-dikafeilchino, 3,5-dikafeilchino, 1,5-dikafeilchino, 4,5-dikafeilchino rūgščių [81] priešgrybelinis poveikis E. turcicum ir G. zeae grybelių kolonijoms. Stipriausiai G. zeae veikė 1,5-dikafeilchino rūgštis, o prieš E. turicum labiausiai aktyvi buvo 3,5-dikafeilchino rūgštis [104]. 3,4-3,5-dikafeilchino rūgščiai būdingas antivirusinis poveikis prieš Influenza A tipo virusą [105]. Atlikus tyrimus su 3,4-DCQA, 3,5-DCQA, 4,5-DCQA prieš Bacillus shigae bakterijų rūšį, nustatytas stipriausias antibakterinis poveikis su 3,5-DCQA, silpnesnis su 4,5-DCQA ir silpniausias su 3,4-DCQA. Visi trys junginiai turi izomerines molekulines struktūras, susidedančias iš vienos chino rūgšties grupės ir dviejų kafeilo grupių, nuo kurių priklauso antibakterinės savybės. Kai abi kafeilo grupės cikloheksano žiede išsidėsčiusios C3 ir C5 padėtyse, antibakterinis poveikis B.
shigae būna stipresnis nei išsidėsčius C4 ir C5 padėtyse. Kafeilo grupių išsidėstymas C3 ir C4
padėtyse lemia silpną B. shigae bakterijų antimikrobinį aktyvumą [106].
Tyrimais nustatyta, kad A. millefolium kaupiamai chlorogeno rūgščiai [81] būdingas antibakterinis poveikis prieš S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa, B. cereus [107]. Kinijoje nustatytas chlorogeno rūgšties antimikrobinis aktyvumas prieš Gram teigiamas Streptococcus
pneumoniae, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis bakterijų kultūras ir Gram neigiamas Escherichia coli, Shigella dysenteriae, Salmonella typhimurium. Stipriausiai iš šių šešių tirtų bakterijų
paveikė Streptococcus pneumoniae ir Shigella dysenteriae rūšis [109]. Kitų tyrimų metu nustatytas chlorogeno rūgšties priešgrybelinis poveikis. Iš trijų tirtų grybelių kolonijų chlorogeno rūgštis stipriausiai paveikė M. furfur ir T. beigelii, silpniau paveikė C. albicans grybelius [108].
Taninai. Tai grupė polimerinių fenolinių junginių, pasižyminčių odos rauginėmis savybėmis ir želatinos nusodinimu iš tirpalų. Taninai veikia sutraukiančiai, Achillea millefolium augaluose
aptinkami hidrolizuotos ir kondensuotos būsenos. Atliktų tyrimų metu išsiaiškinta, jog taninai gali būti toksiški bakterijoms, siūliniams grybams ir mielėms. Taip pat taninai pasižymi virusų reversinės transkriptazės slopinimu [44].
Hidrolizuotuose taninuose centrinė molekulė yra angliavandenis (dažnai D-gliukozė). Angliavandenio hidroksigrupės, visos ar iš dalies, būna esterifikuotos su fenolinėmis grupėmis, tokiomis kaip elago ar galo rūgšties. Hidrolizuoti taninai būna hidrolizuoti silpnų bazių arba silpnų rūgščių [45].
Kondensuoti taninai, dar žinomi kaip proantocianidinai, yra polimerai, turintys nuo 2 iki 50 ar daugiau flavonoidų vienetų, sujungtų C-C ryšiais, todėl nėra jautrūs hidrolizei. Hidrolizuoti taninai ir dauguma kondensuotų taninų yra tirpūs vandenyje, tačiau didelės kondensacijos taninai yra netirpūs [45, 62].
4.2.2. Antimikrobinio aktyvumo nustatymo metodai
MIC yra mažiausia antimikrobinė koncentracija, akivaizdžiai stabdanti mikroorganizmų dauginimosi periodą. MIC vertės gali būti nustatomos atliekant standartines antimikrobinio poveikio įvertinimo procedūras. Dažniausiai paplitę nustatymo būdai yra skirtingų skiedimų ir agaro praskiedimo metodai. MIC yra svarbi laboratorinei diagnostikai patvirtinant mikroorganizmų atsparumą antimikrobiniam junginiui, taip pat monitoruojant naujų antimikrobinių medžiagų aktyvumą [46].
E testas. E testas in vitro metodas, kurio pagalba nustatoma individualių antimikrobinių medžiagų MIC agaro terpėje. E testas padeda išvengti trūkumų, su kuriais susiduriama atliekant disko difuzijos ir „broth“ praskiedimo procedūras. Šiuo metodu nesunkiai nustatoma MIC. E testą sudaro plona juostelė, kurioje pagal gradientą didėja antimikrobinės medžiagos koncentracija. Kiekybinėje analizėje E testas atliekamas agaro difuzijos principu; MIC nustatoma atsižvelgus į agaro lėkštelės paviršių, kuris, kaip ir atliekant diskų difuziją, yra padengtas bakterijų suspensija. Viena arba keletas E testo juostelių su tam tikrais antimikrobiniais preparatais gali būti patalpintos ant agaro paviršiaus ir testuojamos tuo pačiu metu [47].
Disko difuzijos metodas. Diskų difuzijos nustatymo metodas yra paprastas ir praktiškas, o rezultatai yra gana tikslūs. Testas atliekamas padengiant apytiksliai 1-2 X 108
CFU/ml (CFU kolonijas formuojantis vienetas) 150 mm diametro Miulerio-Hintono agaro terpę. Paruošiama iki 12 atitinkamos koncentracijos antimikrobinių preparatų popierinių diskų ir patalpinama ant bakterijomis padengtos agaro terpės paviršiaus. Lėkštelės inkubuojamos 16 - 24 valandų 35 C laipsnių temperatūroje. Gautos
slopinimo zonos aplink kiekvieną diską išmatuojamos kuo tikslesniu milimetru. Slopinimo zonos diametras parodo antimikrobinės medžiagos izoliaciją nuo mikroorganizmų ir difuzijos greitį per agaro terpę. Antimikrobiniai preparatai identifikuojami pagal kiekvienos antimikrobinės medžiagos gautos zonos skersmenį, remiantis Klinikinių ir Laboratorinių Standartų Institutu (CLSI), anksčiau vadintu Nacionaliniu Komitetu Klinikos Laboratoriniams Standartams (NCCLS). Diskų difuzijos būdu atliekami kokybiniai nustatymai. Disko difuzijos metodo pranašumai: nesudėtingai atliekamas testas, kuris nereikalauja kitos specialios papildomos įrangos, tai vienas iš pigiausių antimikrobinio jautrumo nustatymo metodų. Disko difuzijos metodo trūkumai: ribotos automatizavimo galimybės, ne visos šiuo metodu greitai ar lėtai augančios bakterijos gali būti tiksliai ištiriamos, reikalingas standartizavimas tiriant streptokokus, Haemophilus influenzae ir N. meningitidis, naudojama speciali terpė, atitinkamos inkubavimo sąlygos, taikomas specifinis zonos identifikavimo dydis [48].
Agaro praskiedimo metodas. Miulerio-Hintono agaro terpė rekomenduojama tiriant greitai augančias aerobines ir fakultatyvinius anaerobinius bakterijų patogenus. Tirpikliai ir skiedikliai reikalingi ruošiant pradinius antimikrobinių medžiagų tirpalus atliekant antimikrobinio jautrumo testą. Jie parenkami pagal CLSI standartus. Agaro praskiedimo testas yra gerai standartizuojamas ir atkuriamas, todėl gali būti naudojamas kaip etalonas vertinant kitus praskiedimo metodus. Šis metodas yra efektyvus tiriant didelį mikroorganizmų rūšių skaičių. Tiriant atsparias subpopuliacijas ir maišytų kultūrų mikroorganizmus, lengviau ištiriama agaro praskiedimo nei „broth“ tyrimo metodu. Pagrindinis agaro testo trūkumas: daug laiko atimantis lėkštelių paruošimas, ypač kai tiriamas didelis kiekis junginių; kai tyrimams yra skirtas ribotas bakterijų skaičius; arba esant ribotam bakterijų kiekiui tiriamas didelis junginių skaičius [49].
„Broth“ praskiedimo metodas. „Broth“ praskiedimo testas apima makropraskiedimą, kuriame tiriamuosiuose vamzdeliuose praskiedimo tūris lygus arba didesnis už 1 ml, ir mikropraskiedimus, kuriuose antimikrobinių medžiagų koncentracijos dažniausiai būna mažesnio tūrio. Tyrimui naudojamos 96 mikrotitravimo lėkštelės. „Broth“ makropraskiedimas yra patikimas ir gerai standartizuotas, ypač naudingas atliekant mokslinius tyrimus ir bandymus tiriant vieną antimikrobinę medžiagą prieš vieną bakterijų rūšį. Mikropraskiedimai yra plačiai taikomi klinikinėse laboratorijose. Plastikinės vienkartinės lėkštelės, turinčios keletą antimikrobinių medžiagų, paruošiamos laboratorijoje arba perkamos užšaldytos [49].
4.3. Polifenoliniai junginiai
Polifenoliniai junginiai yra įvairiapusė didelė grupė paprastų arba kompleksinių fenolinių junginių. Gaunama antrinio metabolizmo metu iš aromatinių amino rūgščių [51]. Visi augalo fenoliniai junginiai kilę iš paplitusio tarpinio junginio, fenilalanino arba uždaro pirmtako – šikimo rūgšties. Pirma: jie pasitaiko konjuguotose formose su viena ar daugiau cukraus liekanų, prijungtų prie hidroksilo grupių, nors tiesioginė cukraus jungtis (polisacharidas arba monosacharidas) su aromatine anglimi taip pat egzistuoja. Polifenoliai gali būti klasifikuojami į skirtingas grupes pagal funkcinių fenolinių žiedų skaičių ir pagrindinius struktūrinius elementus, jungiančius šiuos žiedus tarpusavyje [50]. A. millefolium turtinga tokiais polifenoliniais junginiais kaip flavonoidai, proantocianidinai ir fenolkarboksirūgštys [60].
4.3.1. Polifenolinių junginių biosintezė ir biologinis poveikis
Dažniausiai augalų fenoliai gaunami iš trans cinamono rūgšties, kuri susidaro iš L-fenilalanino veikiant L-L-fenilalanino amoniako liazei. Vykstant įvairioms šikimo rūgšties kelio metabolinėms reakcijoms, sintezuojami aromatiniai junginiai, ypač aromatinės amino rūgštys. L-fenilalaninas, kaip C6C3 gaminamas pagrindas, yra daugelio susidarančių produktų pirmtakas. Dažnai
augaluose pirmasis sintezės kelias yra amoniako eliminacija iš fenilalanino šoninės grandinės gaminant cinamono rūgštį, kuri vėliau modifikuojama į hidroksicinamono rūgštį. Kiti susiję dariniai gaunami toliau tęsiantis hidroksilinimui ir metilinimui. Vykstant struktūros pokyčiams suformuojamos hidroksibenzoinės rūgštys, kai iš šoninės hidroksicinamono darinio grandinės pašalinami du anglies atomai. Flavonoidai biosintezuojami kombinuotu šikimo rūgšties ir acilpolimalonato keliais. Esminė biosintetinimo reakcija yra p-kumaroil-CoA kondensavimas su trimis molekulėmis malonil-CoA iki chalkono tarpinio junginio, susidedančio iš dviejų fenolinių grupių, sujungtų atviru trijų anglies atomų tilteliu. Iš šio junginio, veikiant specifinėms fermentinėms sistemoms, vyksta įvairių flavonoidų klasių biogenezė [53].
Biologinis poveikis. Polifenoliai yra vienas iš antioksidantų šaltinių. Jie taip pat turi daugelį kitų biologinio aktyvumo funkcijų, pasižymi antihistamininiu, antiuždegiminiu poveikiu, mažina trombocitų agregaciją, didina kraujagyslių išsiplėtimą, moduliuoja viduląstelinių signalų perdavimus, aktyvuoja P-glikoproteiną. Jiem būdingas antibakterinis ir antivirusinis poveikis. Polifenoliai turi savybių, padedančių apsisaugoti nuo neurodegeneracinių ligų ir vėžio, indukuodami vėžio ląstelių apoptozę [52, 61].
4.3.2. Laisvieji radikalai, jų poveikis ir susidarymas
Laisvieji radikalai, ypač reaktyvios deguonies junginiai, daro didelę įtaką žmonėms veikdami kūną iš vidaus ir iš išorės. Radikalai gali susidaryti įprasto metabolizmo metu arba imuninėms ląstelėms neutralizuojant svetimkūnius. Be to, tokie faktoriai kaip užterštumas, alkoholis, kava, vaistai, rentgeno spinduliai, UV spinduliai, cigarečių rūkymas ir herbicidai skatina laisvųjų radikalų susidarymą [55, 56]. Dėl jų sukeliamo poveikio pažeidžiami baltymai, lipidai ir DNR. Radikalų sukeliamas oksidacinis DNR pažeidimas įtakoja vėžio atsiradimą, senstant ir vykstant neurodegeneracijai - Alzheimerio ir Parkinsono ligas, širdies ir kraujagyslių ligas - aterosklerozę ir audinių pažeidimus po patirto širdies priepuolio [52].
Laisvieji radikalai yra molekulės ar molekulių fragmentai, turintys vieną ar daugiau neporinių elektronų išorinėje orbitoje. Šie neporiniai elektronai yra nestabilūs ir dažnai pasižymi stipriu aktyvumu laisvuosiuose radikaluose. ROS (reaktyvius deguonies junginius) apima superoksido (O2• −), hidroksilo (•OH), peroksilo (ROO•), lipidų peroksilo (LOO•), alkoksilo (RO•) radikalai. RNS (azoto laisvuosius radikalus) apima azoto oksidas (NO•) ir azoto dioksidas (NO2•). Deguonies ir azoto laisvieji radikalai gali būti greitai pakeičiami į kitas beradikalias reaktyvias rūšis, kurios taip pat pavojingos sveikatai. Vandenilio peroksidas (H2O2), ozonas (O3), singletinis deguonis (1O2),
hipochloritinė rūgštis (HOCl), peroksinitritas (ONOO−), diazoto trioksidas (N2O3), lipidų peroksidas
(LOOH) nėra laisvieji radikalai ir įprastai vadinami oksidantais, kurie gali lengvai valdyti laisvųjų radikalų reakcijas gyvuosiuose organizmuose [56, 52].
O2●– susidarymas organizme ir jo sąveika. Organizme esančios NADPH oksidazės baltymai, katalizuodami nuo kofermento NADPH priklausomą deguonies redukciją, sudaro O2•– produktą, kuris savaime arba sąveikaujant superoksido dismutazei virsta H2O2 radikalu arba kitais
antriniais ROS [97].
NADPH + 2O2 → NADP+ + H+ + 2O2–
2O2– + 2H+ → O2 + H2O2 [97]
Oksidacinė DNR pažaida. Deguonies turintys radikalai gali tiesiogiai atakuoti DNR (deoksiribonukleorūgščių), bet kurias cukraus, fosfato arba purino ir pirimidino bazes. Kitu atveju oksidacinė DNR pažaida gali būti netiesioginė, atsirandanti dėl didėjančio kalcio jonų kiekio. Laisvųjų radikalų tarpinės reakcijos gali sukelti struktūrinius pokyčius DNR molekulėje, tokius kaip bazinių porų mutacijos, pertvarkymus, sekos sumažėjimus arba padidėjimus. Sumažėjus bazių skaičiui gausiai gaminami junginiai, įskaitant 8-hidroksiguaniną, hidroksimetilšlapalą, šlapalą, timino glikolį. Susidaro produktų, prisotintų timino ir adenino atvirais žiedais [99].
4.3.3. Antioksidantai ir jų nustatymo metodai
Komerciniai antioksidantai, išgaunami cheminių sintezių metu, dažnai turi labai stiprų ir nespecifinį antioksidantinį poveikį, blokuojantį reaktyvių deguonies rūšių naudojamus signalinius kelius. Dėl to ieškoma natūralių antioksidantų, pasitaikančių augaluose ir turinčių veiksmingas sistemas, apsaugančias nuo aplinkinio oksidacinio streso. Augaluose esančios biomolekulės pasižymi struktūrine įvairove, jose kaupiami per milijonus metų susiformavę antioksidantai įgijo puikų funkcionalumą ir įvairiapusiškumą in vivo. Šie natūralių komponentų požymiai ypač skiriasi nuo sintetinių medžiagų požymių. Tuo paaiškinamas geras daugelio natūralių junginių biologinis/farmakologinis aktyvumas [57]. Augaliniai antioksidantiniai junginiai, tokie kaip fenolinės rūgštys, kiti polifenoliniai junginiai, surišdami laisvuosius radikalus slopina vykstančius oksidacinius mechanizmus sukeliančius degeneracines ligas [54]. Labiausiai polifenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuo absorbcijos laipsnio ir metabolizmo, taip pat nuo sujungimo efektyvumo cirkuliuojančioje plazmoje [61].
Antioksidantiniai junginiai gali būti suklasifikuoti į dvi grupes: pirminiai ir antriniai antioksidantai. Pirminiai antioksidantai pertraukia grandines, suriša laisvuosius radikalus ir atiduoda vandenilio atomus. Antriniai antioksidantai, vadinami apsauginiais antioksidantais, paprastai jie yra metalų chelatoriai ir reduktoriai, apsaugantys kitus antioksidantus in vivo [102].
Antioksidantams būdingos dar ir kitos funkcijos, kurios apima peroksidų suardymą, singletinio deguonies sumažinimą, NADH-oksidazės, sukcinoksidazės, ATPazės ir eNOS (azoto oksido sintazės) fermentų slopinimą [102]. Flavonoidai netiesioginiu būdu gali mažinti oksidacines pažaidas: slopindami fermentų, atsakingų už ROS ir RNS susidarymą, aktyvumą; atlikdami signalo perdavimo kelių moduliaciją ląstelėse; vykdydami sąveiką su kitais antioksidacinės sistemos junginiais, tokiais kaip askorbo rūgštis, α-tokoferolis; dalyvaudami antioksidacinių ir II fazės fermentų genų ekspresijos aktyvavimo veikloje [81].
Atliktais tyrimais nustatyta, kad flavonoidams būdingas platus išsidėstymas ląstelės membranose, o poslinkis nuo lipidų hidrofobinės dalies link hidrofilinės priklauso nuo flavonoidų molekulėse esamų hidroksi grupių skaičiaus. Didėjant hidroksi grupių skaičiui, didėja poslinkis link hidrofilinės dalies. Flavonoidai ar jų metabolitai, lokalizuojantys arti hidrofilinio sluoksnio, daro didesnę įtaką lipidų peroksidacijai [81].
Lipidų peroksidacija yra dažnas oksidacinio streso rezultatas. Flavonoidai, veikdami įvairiausiais mechanizmais, apsaugo lipidus nuo oksidacinės pažaidos. Laisvi metalo jonai didina ROS susidarymą mažindami vandenilio peroksido ir didindami reaktyvaus hidroksilo radikalo kiekį. Atitinkamai, sumažėjus redokso potencialui, flavonoidai, atiduodami vandenilio atomą, geba sumažinti
didelio oksidacinio laipsnio laisvuosius radikalus, tokius kaip superoksidas, peroksilas, alkoksilas ir hidroksilas. Flavonoidai linkę chelatuoti metalo jonus (geležies, vario ir t.t.), būtent tokiu būdu jie slopina laisvųjų radikalų gamybą. Tyrimų metu in vitro lipidų peroksidacijos metu pastebėtas stiprus flavonoido rutino poveikis radikalų surišimui ir slopinimui. Šį poveikį nulemia flavonoidų B žiede esantis pakankamai stabilus katecholio grupės radikalas, sudarantis tvirtus ryšius ortosemikvinonas [101].
Ištirta, kad flavonoidai ir fenilpropanoidai gali būti svarbūs branduolio arba neuroninio perdavimo faktoriaus (NF-κB) veiklos moduliavime, veikdami kritinius oksidacinio streso medijuojamus NF-κB reguliacijos žingsnius arba moduliuodami ląstelinę redokso būklę [81].
Atlikti tyrimai rodo, kad flavonoidai, atrankiai veikdami ląstelės signalo perdavimo kelių komponentus: fosfoinozitido 3-kinazę (PI 3K), Akt/protein kinazę B (Akt/PKB), tirozino kinazes, protein kinazę C ir mitogenų aktyvuotą protein kinazę (MAPK), gali moduliuoti ląstelės fiziologiją. Nustatyta, kad chlorogeno rūgščiai būdingas NF-κB aktyvinimo slopinimas, susijęs su MAPK signalo perdavimo keliais [81].
Pagal fiziologines savybes turintys daugiau hidroksi grupių flavonoidai yra antioksidantiškai efektyvesni už turinčius vieną hidroksi grupę [58]. Antioksidantiniu aktyvumu pasižymi A. millefolium esantis kvercetinas, apigenino-7-O-gliukozidas, liuteolin-7-O-gliukozidas, salvigeninas ir dihidrokvercetinas [59].
Literatūros duomenimis, atitinkantiems šiuos kriterijus flavonoidams būdingas stiprus antioksidacinis poveikis:
1) orto 3,4-dihidroksi struktūra B žiede suteikia stabilumą flavonoido fenoksilo radikalams dėl vandenilinių ryšių arba didelių elektrono donorinių savybių;
2) C2-C3 dvigubo ryšio konjūgacijai su 4-keto grupe būdinga dalelių ir radikalų stabilizacija dėl vykstančio elektrono perkėlimo C žiede;
3) 3-OH ar/ir 5-OH grupės C ir A žiede, kai yra 4-keto grupė, rodo gebą maksimaliai sujungti ir stipriai absorbuoti radikalus; [100] Pav. 1.
Pav. 1 [102]
1. orto 3,4 – dihidroksi dalis B žiede
2. 2,3 – dvigubo ryšio derinys su 4-keto grupe
3. 3 ir 5 hidroksi grupės C ir A žiede konjūguotos su 4-keto grupe C žiede [102]
Genų ekspresija. Flavonoidai ir fenilpropanoidai turi savybę indukuoti genus, atsakingus už antioksidantinį aktyvumą, ir antros fazės detoksikaciją atliekančių fermentų ekspresiją [81] (pvz. NAD(P)H-kvinono oksidoreduktazę, glutationo S-transferazę ir UDP-gliukuronosil transferazę) [115]. Šios flavonoidų ir fenilpropanoidų savybės padeda apsaugoti ląstelę nuo oksidacinės pažaidos. Atliktais tyrimais įrodyta, kad esant dideliam kvercetino kiekiui, didėja SOD (superoksido dismutazės) ir KAT (katalazės) genų ekspresija ir tuo pat metu vyksta KAT aktyvumo slopinimas. Esant mažesniam kvercetino kiekiui, vyksta SOD mažėjimas ir glutationo peroksidazės genų ekspresijos didinimas [81].
Antioksidantinio veikimo nustatymo metodai.
FIC (geležies jonų surišimo) metodas. Laisviems pereinamiesiems metalams būdinga biologinių molekulių autooksidacijos katalizacija. Ligų atsiradimo priežastis stipriai įtakoja geležies (Fe2+) ir vario (Cu+) jonai. Silpnesnę įtaką turi O2●– ir H2O2, nes jie nepasižymi dideliu aktyvumu,
tačiau šiems junginiams kartu sąveikaujant su Fe2+
arba Cu+ jonais, gali susidaryti labai aktyvus HO● radikalas vykstant Fentono ir Haberio-Veiso reakcijoms [98].
Fe2+ (Cu2+) + H2O2 → Fe3+ + ●OH + ●OH (Fentono reakcija)
HO● radikalų sukeliamas poveikis visada būna žalingas. Siekiant išvengti žalingo poveikio, laisvi Fe2+ir Cu+ jonai surišami su baltymais. Organizme esantis baltymas, surišantis vario jonus ir Fe2+ keičiantis į Fe3+, yra ceruloplazminas. Toks baltymo veikimas, kai Fe2+ greitai oksiduojamas į mažiau reaktyvią Fe3+
jono būseną, laikomas antioksidantiniu veikimu [98].
Panašiai kaip ir baltymui ceruloplazminui, ferozinui būdingas kiekybinis kompleksų sudarymas su Fe2+ jonais. Susidarę kompleksai įgauna ryškiai raudoną spalvą. Kompleksų susidarymui gali trukdyti kiti pašaliniai tiriamajame tirpale esantys kompleksiniai junginiai. Dėl to sumažėja tirpalo raudonos spalvos intensyvumas, kurio sumažėjimas leidžia įvertinti turimų chelatuojančių medžiagų aktyvumą matuojant jį spektrofotometru prie 562 nm bangos ilgio. Atlikti tyrimai rodo, kad chelatuojančios medžiagos, kurios linkusios sudaryti sigma-ryšius su metalu, yra efektyvūs antioksidantai, kadangi jie, sumažindami redokso potencialą, stabilizuoja oksiduotą metalo jonų formą, todėl medžiagos, galinčios sumažinti raudonos spalvos intensyvumą, laikomos turinčiomis antioksidacinių savybių [76].
FRAP metodas. Šis metodas įvertina antioksidantų gebėjimą redukuoti trivalentės geležies jonus į dvivalentės geležies jonus. Tai paremta trivalentės geležies komplekso 2,3,5-trifenil-1,3,4-triaza-2-azoniacyclopenta-1,4-dieno chlorido [Fe(TPTZ)3+] kiekio mažėjimu pereinant į dvivalentės geležies komplekso būseną [Fe(TPTZ)2+] esant mažai pH terpei. Šis sumažėjimas pastebimas ir
įvertinamas absorbcijos pasikeitimu prie 593 nm bangos ilgio naudojant spektrofotometrą [77, 78].
Metodo pranašumai: paprastas, greitas, nebrangus, nereikalauja sudėtingos aparatūros. Gali
būti atliktas automatiškai, pusiau automatiškai arba rankiniu būdu [79].
Metodo trūkumai: metodas negali aptikti antioksidantų, į kurių cheminę sudėtį įeina SH
grupė; tai gali būti tokie antioksidantai kaip tioliai, glutationas arba baltymai [79].
DPPH. 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) molekulė yra apibūdinama kaip stabilus laisvas radikalas, veiksmingai gebantis prisijungti laisvą elektroną, todėl molekulė nesidimerizuoja, kaip tai atsitinka su dauguma kitų laisvųjų radikalų. Elektrono perkėlimas suteikia etanoliniam tirpalui ryškiai violetinę spalvą su būdinga absorbcija prie 517 nm bangos ilgio. Kai DPPH tirpalas sumaišomas su substratu, kuris gali atiduoti vandenilio atomą, tuomet tirpalo violetinė spalva pradeda blukti. Šis absorbcijos mažėjimas atitinkamai tiesiogiai priklauso nuo antioksidanto koncentracijos tiriamajame tirpale. Šiame tyrime kaip standartas antioksidantams yra naudojamas junginys troloksas. [77,80].
5. TYRIMŲ METODIKOS IR METODAI
5.1. Tyrimų objektas
Fenolkarbosirūgščių sudėties bei antioksidantinio aktyvumo tyrimams buvo naudotos natūraliai augančių paprastosios kraujažolės (Achillea millefolium L.) augalinės žaliavos, surinktos masinio žydėjimo metu iš įvairių augaviečių esančių Lietuvos teritorijoje. Vykdant tęstinius tyrimus kraujažolės rinktos 2014 metų liepos – rugpjūčios mėnesiais bei papildomai buvo panaudoti ekstraktai, paruošti iš 2013 metų liepos – rugpjūčio mėnesiais rinktų žaliavų.
Antioksidantinio aktyvumo tyrimui buvo naudojami žolės (~ 10 cm ilgio ūglių viršūnės), lapų, stiebų ir žiedų žaliavų pavyzdžiai. 2014 m. 3 gamtinėse augavietėse (Telšių m.; Raseinų m.; Šatrijoje, Luokės seniūnijoje) surinkti augalinės žaliavos pavyzdžiai buvo suskirstyti į lapus, žiedus (graižus) ir stiebus. Papildomai tirti A. millefolium žaliavų (13 žolės ir po 10 žiedų, lapų, stiebų) ekstraktai surinkti 2013 metais iš gamtinių augaviečių esančių įvairiuose Lietuvos regionuose [65].
Surinkta augalinė žaliava buvo džiovinama kambario temperatūroje (20 – 25 °C), sausoje, nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje, gerai vėdinamoje patalpoje.
5.2. Chelatinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu metodu
Medžiagos ir reagentai.
Tyrimų metu naudotas išgrynintas vanduo, reagentai skirti analitiniams tikslams, įsigyti iš Sigma – Aldrich: 97 proc. švarumo ferozinas, geležies (II) chloridas (≥ 99 proc.); iš UAB ,,Stumbras“ (Kaunas, Lietuva) įsigytas 96 proc. (v/v) etanolis.
Naudota aparatūra.
Mėginių ekstrakcijai atlikti panaudota ultragarso vonelė ,,Elmasonic S 40H“ (GmbH Vokietija). Achillea millefolium žolių, lapų, žiedų, stiebų ekstraktų antioksidantinis aktyvumas nustatytas naudojant spektrofotometrą ,,Genesys 2“ (Spectronic, USA).
Tyrimų metodika: paprastosios kraujažolės žaliavų bandinių ekstraktų paruošimas. Paprastiosios kraujažolės augalinė žaliava smulkinama elektriniu smulkintuvu iki tokio dalelių dydžio, kurios pereina 355 μm sietą. Pasvėrus apie 0,300 g susmulkintos augalinės žaliavos, dedama į kolbutę, ant viršaus užpilama 95 ml 70 proc. (v/v) etanolio ir patalpinama į ultragarso vonelę, kurioje 30 min vykdoma ekstrakcija. Gautas ekstraktas filtruojamas pro popierinį filtrą į matavimo
