FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
JOLANTA ŠLAJŪTĖ
LIETUVOJE AUGANČIŲ GERVUOGIŲ VAISIŲ FITOCHEMINĖS
SUDĖTIES ĮVAIROVĖS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Dr. Deividas Burdulis
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS FARMAKOGNOZIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas prof. dr Vitalis Briedis
_____________________
(parašas, data)
LIETUVOJE AUGANČIŲ GERVUOGIŲ VAISIŲ FITOCHEMINĖS
SUDĖTIES ĮVAIROVĖS TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Dr. Deividas Burdulis _________________ (data)
Recenzentas Darbą atliko
______________________________ Magistrantė
(vardas, pavardė, parašas) Jolanta Šlajūtė
_________________ _____________________________ (data)
(data)
Turinys
1.Santrumpos ... 7
2.Įvadas ... 8
3.Darbo tikslas ir uždaviniai ... 10
4. Literatūros apžvalga ... 11
4.1 Rubus genties charakteristika, botaninis aprašymas ... 11
4.1.1.Rubus caesius - Paprastoji gervuogė ... 12
4.1.2.Rubus plicatus – Raukšlėtoji gervuogė ... 12
4.1.3.Rubus nessensis - Stačioji gervuogė ... 13
4.1.4.Rubus corylifolius - Lazdynlapė gervuogė ... 13
4.2.Vaisių kokybinė ir kiekybinė sudėtis ... 13
4.4.Antocianinų bendra charakteristika ... 15
4.4.1.Antocianinų fizikocheminės savybės ... 18
4.4.2.Antocianinų farmakokinetinės savybės ... 18
4.4.4.Antocianinų pasiskirtymas augaluose ... 21
4.4.5. Kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymo metodikos ... 21
4.4.5.1. Plonasluoksnė chromatografija ... 22
4.4.5.2. Ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties (absorbcinė) spektrofotometrija ... 22
5.Tyrimo metodika ... 24
5.2. Reagentai ... 24
5.3.Aparatūra ... 24
5.4.Ekstrakcija ... 25
5.5.Nuodžiūvio nustatymas gervuogių vaistinėje augalinėje žaliavoje ... 25
5.7.1.2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalo sujungimo metodas ... 26
5.8.Statistinis duomenų įvertinimas ... 27
6.Tyrimo rezultatai ir jų aptarimas ... 28
6.1.Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas ... 28
6.2.Bendro antocianinų kiekio kitimo dinamika vaisių nokimo metu ... 31
6.3.Bendro antocianinų kiekio kitimo dinamika mėginiuose, surinktuose iš skirtingų Lietuvos vietovių ... 33
6.4.Gervuogių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo įvertinimas ... 34
6.4.2.2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalo katijono sujungimo metodas ... 37 7.Išvados ... 41 8.Literatūros sąrašas ... 42
SANTRAUKA
Lietuvoje augančių gervuogių vaisių fitocheminės sudėties įvairovės
tyrimas
J. Šlajūtės magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. D. Burdulis; Lietuvos Sveikatos mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Farmakognozijos katedra. – Kaunas.
Šio tyrimo tikslas yra įvertinti gervuogių (Rubus caesius L. ir Rubus nessensis Hall.) vaisių antocianinų sudėtį ir jos įvairavimą skirtingu nokimo metu bei vaisių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Vienas iš tyrimo objektų yra dviejų skirtingų Rubus genties atstovų (Rubus caesius L. ir
Rubus nessensis Hall.) vaisiai, kurie buvo renkami periodiškai kas savaitę nuo pat vaisių derėjimo
pradžios, Šilutės rajone. Nustačius optimalias ekstrahavimo sąlygas, vaisių etanoliniai ekstraktai buvo tiriami spektrofometrijos metodu bei nustatomas ekstraktų antiradikalinis aktyvumas, atliekant fotometrinius 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) bei 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalo katijono sujungimo metodus, o gauti rezultatai vertinami remiantis pagal tai, kurią nokimo savaitę buvo renkami vaisių mėginiai.
Antrasis tyrimo objektas – R.caesius L. vaisiai, surinkti iš įvairių Lietuvos vietovių, kurių etanolinių ekstraktų sudėtyje esantis antocianinų suminis kiekis taip pat buvo vertinamas spektrofotometrijos metodu, tačiau šioje tyrimo dalyje buvo siekiama nustatyti antocianinų sudėties įvairavimą priklausomai nuo gervuogių vaisių rinkimo vietovės.
Tyrimo rezultatai. Nustatyta, jog iš dviejų tirtų gervuogių rūšių, gausesne antocianinų
frakcijos sudėtimi pasižymi R. caesius L. vaisių ekstraktai, kuriuose antocianinų kiekis siekė nuo 4,16 proc. iki 4,89 proc. sausoje žaliavos masėje. Atitinkamai R. nessensis Hall. vaisių ekstraktuose nustatyta antocianinų koncentracija buvo ženkliai mažesnė – sudarė nuo 2,52 iki 2,92 proc. sausos žaliavos masės. Taip pat vertingesnė gervuogių vaisių sudėtis nustatyta tiriant Kauno rajone surinktą mėginį (3,18 proc.), o mažiausiai antocianinų turinti žaliava buvo surinkta Pagėgiuose – 2,41 proc.
Aktyviausiu antiradikaliniu poveikiu pasižymėjo R.caesius L. ekstraktas, gautas iš vaisių, surinktų 6-ąją pavyzdžių rinkimo savaitę (3,67 proc.), kuriuose atitinkamai nustatytas didžiausias kiekis antocianinų – 4,90 proc.( r = 0.68).
Išvados. Kaip vaistinė augalinė žaliava vertingiausia antocianinais yra R.caesius L. vaisiai,
surinkti šeštąją savaitę nuo vaisių derėjimo pradžios. Jie gali būti pritaikyti širdies ir kraujagyslių ligų profilaktikoje, gliukozės bei cholesterolio kiekio kraujyje kontrolėje, kaip antiradikaliniu poveikiu pasižymintis preparatas [1].
SUMMARY
The evaluation of phytochemical composition and its variation in
blackberry fruits, collected in different regions in Lithuania
The objective of this study is to evaluate the blackberry (Rubus caesius L and Rubus
nessensis Hall.) fruit’s anthocyanin composition and its variation during different ripening time and
also to measure the antiradical activity in fruit extracts.
One of the objects of the study is two different Rubus genus (Rubus caesius L. and Rubus
nessensis Hall.) fruits, which were collected weekly from the beginning of fruit bearing in Šilutė’s
area. Once the optimum extraction conditions were determined, the ethanol extracts of the fruits have been investigated using spectrophotometry and their antiradical activity was investigated using photometric 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2 '-azine-bis-(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid ) (ABTS) radical scavenging techniques, and the results were evaluated according to the time, when fruit samples were collected.
The second object of the research - R.caesius L. fruits collected from different locations in Lithuania. The total amount of anthocyanins in the extracts was also determined using spectrophotometry, but in this part of the study the main point was to determine how the variation of anthocyanins depends on the blackberry fruit collection area.
The results showed that from two studied species of blackberry, R. caesius L. fruit extracts contained a larger amount of anthocyanin’s fraction, compared to R. nessensis Hall. fruits. In R.
caesius L. fruit extracts anthocyanin’s concentration ranged from 4,16 percent to 4.89 percent,
calculated to dry material weight. Accordingly, the amount of anthocyanin in R. nessensis Hall. fruit’s extracts was significantly lower - ranged from 2,52 to 2,92 percent. Also, more valuable composition of blackberry fruits were determined in the samples, collected in Kaunas district (3,18 percent) and the least amount of anthocyanins was discovered in the blackberry fruits, collected in Pagėgiai – 2,41 percent. The strongest antiradical activity was noted in R.caesius L. extract, obtained from fruits harvested during the 6th week of ripening (3,67 percent) (r = 0,68).
Conclusions. The most valuable as a source of anthocyanins are R. caesius L. fruits,
collected during the sixth week of sample collection. They can be applied to the prevention of cardiovascular diseases, in the control of glucose and cholesterol levels in blood and as an antioxidant agent [1].
1. SANTRUMPOS
ABTS - 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
BMR spektroskopija – branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
DTL – didelio tankio lipoproteinai
ESC – efektyvoji skysčių chromatografija MCP-1 - monocitų chemotaksio baltymas 1 MTL- mažo tankio lipoproteinai
SD – standartinis nuokrypis
2. ĮVADAS
Natūralios augalinės žaliavos pritaikymas sveikatinimo tikslais vis labiau populiarėja, bei vis daugiau atliekama tyrimų farmakoterapiniam poveikiui nustatyti, tačiau mažiau dėmėsio skiriama augalams, kurie plačiau vartojami kaip maisto produktas, nei vaistinė žaliava, nors pagal savo fitocheminę sudėtį pastarieji taip pat galėtų būti vartojami esant vienai ar kitai indikacijai.
Empirinis vaistinių augalų naudojimas liaudies medicinoje padėjo pamatą dabartiniam augalinės žaliavos pritaikymui medicinos tikslams. Augalinė žaliava, kurioje gausu polifenolinių junginių yra tiriama ypač detaliai, siekiant nustatyti gydomąjį poveikį turinčius aktyviuosius komponentus [2].
Pastaruoju metu atliekamų tyrimų metu įrodoma, jog į maisto racioną įtraukus kuo daugiau vaisių ir daržovių, sumažėja rizika susirgti kai kuriomis širdies ir kraujagyslių ligomis, cukriniu diabetu, onkologinėmis ligomis [3]. Teigiamas poveikis žmogaus sveikatai siejamas su vaisių ir daržovių sudėtyje randamais vitaminais, fenoliniais junginiais, karotinoidais, kurie pasižymi antioksidaciniu poveikiu, ypač gausus kiekis natūralių antioksidantų randamas uogose [3]. Gervuogių vaisiuose aptinkamas didelis kiekis fenolinių junginių (katechinų, leukoantocianindinų, antocianinų), kurie turi stipriai išreikštą antioksidacinį poveikį, todėl galėtų būti puikus natūralių antioksidantų šaltinis [1].
Remiantis įrašais „Lietuvos floroje“, Lietuvoje labiausiai paplitusios yra šios gervuogių rūšys: paprastoji gervuogė (Rubus caesius L.), stačioji gervuogė (R. nessensis Hall), raukšlėtoji (R.
plicatus Weihe et Ness), retesnė lazdynlapė gervuogė (R.coryfolius Sm.). Plačiausiai vartojama
paprastoji gervuogė, kuri jau nuo seno turi pritaikymą liaudies medicinoje Vaistams naudojami paprastųjų gervuogių stiebai, lapai ir vaisiai, rečiau - šaknys. Džiovintų lapų ir vaisių užpilas geriamas sergant skrandžio ir žarnyno ligomis, dizenterija, skleroze, peršalus [4]
Rubus genties augalų panaudojimas medicinos praktikoje remiasi jų sudėtyje esančių flavonoidų biologiniu poveikiu - gervuogių vaisiuose esantys fenoliniai junginiai (pvz.: antocianinai, flavonoliai, fenolinės rūgštys (hidroksicinaminės rūgštys ir hidroksibenzoinės rūgštys) gali apsaugoti nuo oksidacijos procesų [1]. Ši hipotezė buvo patvirtinta 2005 metais Helsinkio universitete atlikto tyrimo metu, kur gauti rezultatai patvirtino, jog gervuogių sudėtyje esantys fenoliniai komponentai inhibuoja metillinoleato, liposomų oksidaciją [5].
Gervuogių vaisiuose esančių antocianinų sudėtis ir jos kitimas priklauso ne tik nuo gervuogės rūšies, bet ir nuo aplinkos sąlygų bei vaisių sunokimo [6]. Todėl siekiant įvertinti vaisių
antocianinų sudėties dinamiką, reikalingi išsamūs tyrimai, kurių kintamieji būtų ne tik skirtinga rūšis, bet ir augimo sąlygos bei rinkimo laikas.
Gervuogių vaisių fitocheminė sudėtis bei antiradikalinis ekstraktų aktyvumas buvo tirtas daugelyje vietovių ir su skirtingomis gervuogių kultūromis [7, 8], tačiau antocianinų sudėties įvairavimas gervuogių vaisiuose Lietuvoje tirtas mažai. Todėl tokio pobūdžio tyrimas yra inovatyvus ir svarbus moksliniu bei praktiniu požiūriu Lietuvoje bei būtų galima papildyti sukauptus duomenis, gautus tiriant kitose šalyse kultyvuotas gervuoges, rezultatais, gautais analizuojant Lietuvoje labiausiai paplitusias R. caesius L. ir R. nessensis Hall rūšis.
Cheminės sudėties kitimo dinamikos įvertinimas vaisių nokimo metu, esant skirtingam vaisių brendimo metui, yra labai svarbus siekiant nustatyti laikotarpį, kada sukaupiamas maksimalus veikliųjų junginių kiekis, vykdyti kokybiškos vaistinės augalinės žaliavos paruošas esant optimaliam veikliųjų junginių kiekiui žaliavose. Todėl šiam tiriamajam darbui buvo ikeltas tikslas ištirti gervuogių (R.caesius L ir R. nessensis Hall) vaisių antocianinų sudėtį ir jos įvairavimą bei vaisių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
3. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Tikslas: Ištirti gervuogių (R.caesius L ir R. nessensis Hall) vaisių antocianinų sudėtį ir jos įvairavimą bei vaisių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą.
Uždaviniai:
1. Optimizuoti gervuogių vaisių sudėtyje esančių antocianinų ekstrahavimo sąlygas.
2. Ištirti natūraliose augimvietėse surinktų R. caesius L vaisių antocianinų sudėties kiekybinių rodiklių įvairavimą skirtingose cenopopuliacijose.
3. Nustatyti R. caesius L vaisių antocianinų sudėties kiekybinių rodiklių kitimo dinamiką vaisių nokimo metu.
4. Palyginti R.caesius L ir R. nessensis Hall vaisių vaistinių augalinių žaliavų antocianinų sudėties kiekybinius rodiklius.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1 Rubus genties charakteristika, botaninis aprašymas
Rubus gentis priklauso erškėtinių (Rosaceae) šeimai, kurioje yra apie 450 įvairių augalų
rūšių, paplitusių Šiaurės pusrutulio vidutinių platumų juostoje. Šiai genčiai priklauso avietės, katuogės, tekšės ir gervuogės [9].
Daugelį šios genties rūšių augalų žmonės nuo seniai pažįsta ir naudoja savo reikmėms tenkinti. Prancūzų antropologas C.Lévi-Straussas, tyrinėjęs įvairių tautų liaudišką augalų ir gyvūnų nomenklatūrą, nurodo, kad kuo daugiau vardų organizmas ar jų grupė turi, tuo seniau jie žinomi ir naudojami. Paprastosios gervuogės įvairiose Lietuvos vietose irgi buvo vadinamos savitais liaudiškais pavadinimais: draskės, drėskės, gervenos, gervinės, krūmauogės, krantuogės, gervauogės.
Paprastosios gervuogės paplitusios visoje Lietuvoje, randamos upių ir ežerų pakrantėse, krūmynuose, pamiškėse, pakelėse, šlaituose, neretai sudaro didelius sąžalynus. Dažniausiai įsikuria derlingame, šarmingame arba neutralios reakcijos, vandeniui laidžiame dirvožemyje. Be paprastųjų gervuogių, Lietuvoje dar gana paplitusios stačiosios gervuogės, augančios mišriuose miškuose, pušynuose, pamiškėse. Tik Vakarų Lietuvoje aptinkamos raukšlėtosios gervuogės, kurių vaisiai tamsiai juodi, stambūs [10] .
Pagal taksonominę klasifikaciją, gervuoges būtų galima suskirstyti sekančiai [9]:
Šeima: Erškėtiniai – Rosaceae Juss.
Pošeimis: Erškėtrožiniai – Rosoideae Focke. Gentis: Avietė. Gervuogė – Rubus L.
Pogentė: Rubus. – Eubatus Focke I Sekcija: Suberecti P.J. Müller
1. Rubus plicatus – Raukšlėtoji gervuogė 2. Rubus sulcatus – Vagotoji gervuogė 3. Rubus nessensis – Stačioji gervuogė 4. Rubus fissus – Septynlapė gervuogė
II Sekcija: Rubus.-Corylifolii Focke.
1. Rubus ceasius – Paprastoji gervuogė 2. Rubus corylifolius – Lazdynlapė gervuogė 3. Rubus nemorosus – Krūminė gervuogė
Lietuvoje labiausiai paplitusios rūšys yra paprastoji gervuogė (Rubus caesius L.), stačioji gervuogė (R. nessensis Hall), raukšlėtoji (R. plicatus Weihe et Ness), retesnė lazdynlapė gervuogė (R.coryfolius Sm.) [9].
4.1.1. Rubus caesius - Paprastoji gervuogė
Tai 0,5-1 m aukščio krūmas, su stačiais ir šliaužiančiais stiebais, kurie siekia tris ir daugiau metrų ilgio, dažnai viršūnėje įsišaknijantys, o kartais lipa į gretimus augalus. Jauni ūgliai apvalūs, pliki arba nežymiai plaukuoti, su melsvai pilku apnašu ir gausiais, silpnais, tiesiais dygliais. Lapai trilapiai, retai kai kurie penkialapiai, plunksniški, raukšlėti, nelygiai įkirptai dantyti, abipus žali, apaugę retais plaukeliais. Viršūninis lapelis kiaušiniškai rombiškas, dažnai triskiautis, kotuotas, o šoniniai lapeliai beveik bekočiai, dažnai dviskiaučiai. Žiedai balti, susitelkę po kelis skėtiškose kekėse. Taurėlapiai, žiedams peržydėjus, prisiglaudžia prie vaisiaus. Vaisiai tamsiai mėlyni, beveik juodi, su melsvu apnašu, rūgštaus skonio [9].
Paprastoji gervuogė žydi gegužės-rugpjūčio mėnesiais, o pirmieji vaisiai prinoksta liepos mėnesį. Auga drėgnuose bei šlapiuose lapuočių ir mišriuose miškuose, paupiuose, Lietuvoje ši rūšis gausiai paplitusi [9].
4.1.2. Rubus plicatus – Raukšlėtoji gervuogė
Šios rūšies krūmo stiebai siekia iki 2 m. aukščio, pliki, iš saulėtos pusės rausvi, o viršuje ryškiai briaunoti, tankiai apaugę kietais, kiek lenktais dygliais. Senesni ūgliai lanku išsilenkę, neryškiai vagoti. Lapai su penkiais lapeliais, jauni lapeliai abipus švelniai plaukuoti, o seni lapai iš viršaus tamsiai žali, saulės atokaitoje dažnai raukšlėti, nežymiai plaukuoti arba pliki. Vidurinis lapelis plačiai kiaušiniškas, pagrinde širdiškas arba apskritas, viršūnėje laipsniškai nusmailėjęs, apie 7-10 cm ilgio, kotuotas. Šoniniai lapeliai siauresni, trumpakočiai arba dygliuoti. Žiedai gana stambūs, balti arba rausvi, susitelkę kekėse. Vaisiai juodi, blizgantys [9].
Raukšlėtoji gervuogė žydi birželio – rugpjūčio mėnesiais. Auga pamiškėse, miškų aikštėse, pakelėse. Lietuvoje labiau paplitusi vakarinėje dalyje (Klaipėda, Kretinga, Valkininkai, Kuršių Nerija), o kitur retas [9].
4.1.3. Rubus nessensis - Stačioji gervuogė
Stačiosios gervuogės krūmas pasiekia net trijų – keturių metrų aukštį. Jauni ūgliai statūs, o senesni išsilenkę lanku, briaunoti, apaugę smulkiais, tamsiai raudonais, tiesiais dygliais. Lapai su 5 lapeliais (viršutiniai kartais trilapiai), blizgantys, jų viršutinė pusė apaugusi retais plaukeliai arba plika, apatinė – tik visai jaunučių kiek gausiau plaukuota. Šoniniai lapeliai su koteliais, viršūninis lapelis laipsniškai nusmailėjęs, pamate širdiškas, apie 10-12 cm ilgio ir 5 cm pločio. Žiedai balti, retai rausvi, iki 2,5 cm skersmens, susitelkę negausiažiedėse trumpose kekėse. Neprinokę vaisiai tamsiai rusvai raudoni, prinokę beveik juodi, saldūs, kiek karstelėję [9].
Augalas žydi birželio – liepos mėnesiais, o vaisiai prinoksta rugpjūčio mėn. Auga mišriuose miškuose, pamiškėse, miškų aikštelėse, kirtimuose, dažnai kartu su paprastąja aviete. Lietuvoje augalas gana dažnas visoje teritorijoje [9].
4.1.4. Rubus corylifolius - Lazdynlapė gervuogė
Krūmas su šliaužiančiais stiebais, kurie siekia iki 4 m ilgio. Viršutinės šakelių dalys ryškiai briaunotos, dažnai su apnašu ir dygliuotos. Lapai penkialapiai, apatinė jų pusė pilkšva ar balta, pūkuota; viršūninis lapelis kiaušiniškas ar beveik apskritas, su koteliu, o šoniniai mažesni, bekočiai. Žiedai balti, gelsvi arba rožiniai, gana stambūs, susibūrę į tankias skėtiškas kekes. Vaisiai juodi, be apnašo [9].
Augalas žydi birželio-liepos mėnesiais, auga miškuose, krūmynuose, Lietuvoje labai retai sutinkamas [9].
4.2. Vaisių kokybinė ir kiekybinė sudėtis
Gervuogių vaisiuose gausu angliavandenių, (gliukozės, fruktozės, ksilozės, sacharozės), organinių rūgščių (oksalo, citrinų, obuolių), vitaminų C, B grupės, E, K, karotino, fenolkarboksirūgščių, katechinų, flavonoidų, leukoantocianindinų, antocianinų, riebalinio aliejaus, taip pat kalio ir geležies [11].
Gervuogėse daugiausia aptinkami šie antocianinai: O-gliukozidas, cianidino-3-O-arabinozidas, bei kiti acilinti junginiai su malono ar oksalo rūgštimis [12]. 2008 metais, Kentukio unversitete atliktoje skirtingų Rubus genties kultūrų vaisių kokybinės sudėties analizėje ESC metodu, išskirti antocianinai, kurie yra bendri skirtingoms kultūroms, t.y. glukozidas,
cianidin-3-arabinozidas, cianidin-3-ksilozidas, cianidin-3-malonilglukozidas ir cianidin-3-dioksialilglukozidas [8].
2005 metais atliktame tyrime, kurio tiriamasis objektas - R. fruticosus vaisiai, buvo nustatyta, kad antocianinų frakcijos dalis sudaro 17,1 ± 0,9 mg/g sausos žaliavos masės, iš antocianinų net 87,5 proc. sudaro cianidin-3-glukozidas (Elisia I. ir kt. 2005). Greta šio antocianino, taip pat aptikti ksilozidas, (6-malonil)glukozidas ir cianidin-3-dioksaloilglukozidas, cianidin-3-rutinozidas, malvidin-3-glukozidas, cianidin -3-glukozidas acilintas malono rūgštimi [13].
R. fruticosus vaisių sudėtyje taip pat randama gliukozės (2,88-3,64%), fruktozės
(3,12-3.24%), sacharozės (0,35-0,58%), askorbo rūgšties (15-18 mg/%), karotino (220 mg/ 100g vaisių), vitamino E, organinių rūgščių (iki 2,2 %), rauginių ir aromatinių junginių [14].
Vokietijoje atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, jog R. fruticosus vaisių sudėtyje taip pat yra ir malono rūgšties, cianidinmonoglukozido su kumaro rūgštimi, gintaro, oksalo, pieno rūgščių, pektinų, dekstrozės, vitaminų A, C ir B [15].
4.3.
Rubus genties augalų panaudojimas medicinos praktikoje
.Gervuogių augalai jau nuo seno turi pritaikymą liaudies medicinoje. Vaistams naudojami paprastųjų gervuogių stiebai, lapai ir vaisiai, rečiau - šaknys. Lapų antpilas naudojamas kaip organizmą valantis ir stiprinantis vaistas. Juo gydomas viduriavimas, dizenterija, stabdomas kraujavimas. Kraujavimui stabdyti dažniau vartojamos šaknys, nes jose daugiau sutraukiamosiomis savybėmis pasižyminčių medžiagų. Išoriškai lapų ir šaknų nuoviru skalaujama skaudanti gerklė, gydomos burnos gleivinės opos, dantenų uždegimas, pienligė. Paprastųjų gervuogių lapuose gausu mikroelementų, vandenyje ir riebaluose tirpių vitaminų, todėl jų antpilas labai tinka organizmui stiprinti [11].
Gervuogių šaknų nuoviras – šlapimą varanti ir uždegimą šalinanti priemonė. Gervuogių preparatai mažina cukraus kiekį kraujyje sergant cukriniu diabetu. Ilgai geriant gervuogių arbatą, labai pagerėja cukriniu diabetu sergančiųjų medžiagų apykaita, apetitas. Gervuogių lapų yra vaistažolių mišiniuose, kuriais gydomas prostatos išvešėjimas, lėtinis prostatitas [11].
Rubus genties augalų panaudojimas medicinos praktikoje remiasi jų sudėtyje esančių antocianinų biologiniu poveikiu. Antocianinų veikimo mechanizmai organizme yra įvairūs, tačiau svarbiausias aspektas yra sugebėjimas veikti kaip antioksidantams ar prooksidantams, patekus į tam tikrą biologinę aplinką [16]. 2012 metais atlikto tyrimo metu nustatyta, jog gervuogės turi didesnį kiekį antocianinų bei kitų antioksidacinėmis savybėmis pasižyminčių junginių, nei mėlynių ar braškių vaisiai [17].
Pietų Korėjoje atliktame tyrime buvo nustatyta, jog apie 9 – 12 proc. šviežių Rubus genties vaisių masės sudaro sėklos, kuriose atitinkamai randama 10-23 proc. aliejų (apskaičiuota sausai žaliavai) (Oh H.H. ir kt. 2007). Šio tyrimo metu taip pat buvo įrodyta, jog būtent aliejiniai komponentai apsaugo lipidus nuo oksidacijos ir Rubus vaisių sėklos savo sudėtyje turi didesnį kiekį tokoferolių ir tokotrienolių, lyginant su vynuogių sėklomis ir saulėgrąžų aliejumi. Taip pat įvertinta, jog Rubus genties vaisiai pasižymi daug stipresniu priešuždegiminiu poveikiu, nei vynuogių sėklos, kviečių gemalai ir avokado aliejus [18].
Tyrimais, atliktais in vitro, nustatytas antocianinų biologinis aktyvumas esant endotelio funkcijos ar kraujotakos sutrikimams, taip pat jog antocianinų ekstraktas sumažina lipopolisacharidų sukelto endotoksinio šoko pažeidimus žiurkių organizmuose ir pasižymi citotoksiniu poveikiu į burnos, prostatos, plaučių vėžines ląsteles [16].
4.4. Antocianinų bendra charakteristika
Antocianinai – tai pati didžiausia ir pati svarbiausia vandenyje tirpių natūralių pigmentų grupė. Iki 2010 metų, gamtoje atrasti daugiau nei 635 antocianinai, suteikiantys augalams mėlyną, violetinę ir purpurinę spalvas [19]. Žodis antocianinas yra kilęs iš graikiškų žodžių derinio anthos, reiškiančio žiedą, ir kyanos – mėlyną [20].
Antocianinai priklauso didelei polifenolinių junginių grupei – flavonoidams, kurie yra antriniai metabolitai, sintetinami aukštesniųjų augalų. Jų aglikonų (antocianidinų) struktūrą sudaro anglies atomų skeletas, sudarytas iš 3 žiedų: C6 (A žiedas)-C3 (C žiedas)-C6 (B žiedas) (1 pav.) [19].
Antocianinų aglikonų struktūroje esančio chromoforo, sudaryto iš 8 konjuguotų dvigubųjų jungčių, dėka, esant rūgštinei pH reikšmei, aglikonai įgyja teigiamą krūvį ir intensyvią spalvą. Maksimali absorbcija regimajame spektre yra tarp 465 nm ir 550 nm, kai tuo tarpu UV spektre absorbcijos maksimumai stebimi esant 270 nm - 280 nm bangos ilgiui [20]. Dėl skirtingų hidroksigrupių ir metilo grupių išsidėstymo molekulės struktūroje yra išskirti net 25 skirtingi aglikonai, tačiau tik 6 iš jų yra dažniau sutinkami gamtoje, tai – pelargonidinas (Pg), peonidinas (Pn), cianidinas (Cy), malvidinas (Mv), petunidinas (Pt) ir delfinidinas (Dp) (1 lentelė) [19]. Būtent šie šeši anglikonai sudaro beveik 95 proc. visų antocianinų. Dažniausiai sutinkamas aglikonas yra cianidinas, randamas apie 80 proc. visų pigmentuotų lapų, 69 proc. vaisių ir 50 proc žiedų. Pagal dažnumą po cianidino atitinkamai seka delfinidinas ir pelargonidinas [19].
Skirtumai tarp individualių antocianinų siejami su hidroksigrupių skaičiumi, cukraus, prisijungusio prie molekulės kiekiu ir kilme, su cukraus pakaito padėtimi bei kilme ir skaičiumi alifatinių ar aromatinių rūgščių, prisijungusių prie cukraus molekulėje [21].
Antocianino suteikiama spalva varijuoja priklausomai nuo aglikono struktūros. Jei aglikono B žiede yra daugiau hidroksigrupių, stipriau sugeriama mėlyna spektro spalva, o jei daugiau metoksigrupių, tuomet anglikonai sugeria raudoną spektro spalvą [19].
1 pav. Antocianidinų struktūra
1 lentelė. Plačiausiai gamtoje paplitę antocianidinai
Antocianidinas R R‘ Pelargonidinas H H Cianidinas OH H Peonidinas OCH3 H Delfinidinas OH OH Petunidinas OH OCH3
Malvidinas OCH3 OCH3
Aglikonų struktūroje esančios hidroksigrupės gali būti pakeistos cukraus molekule, taip iš antocianidino susidarant antocianinui. Struktūroje esanti cukraus molekulė glikozidiniais ryšiais gali būti sujungta su kita cukraus molekule, sudarant diglikozidus, triglikozidus ir t.t. Aglikonų hidroksigrupės taip pat gali būti acilintos su aromatinių ar alifatinių rūgščių molekulėmis (pvz.: malono rūgšties, acto rūgšties) susidarant esteriniams ryšiams [20].
Glikozido molekulė antocianino struktūroje visuomet jungiasi trečioje aglikono žiedo padėtyje, α ar β jungtimis. Jei struktūroje yra antra cukraus molekulė, ji dažniausiai jungiasi 5 ir 7, rečiau 3‘ ar 5‘ padėtyse. Antocianinuose dažniausiai iš heksozių aptinkamos gliukozės ar galaktozės molekulės, o iš pentozių – ramnozė, arabinozė ir ksilozė visuomet trečioje aglikono padėtyje [22] .
Glikozilinimas ir acilinimas turi poveikį antocianinų cheminėms savybėms, kadangi kinta molekulės dydis bei poliškumas. Glikozilinimas didina aglikonų tirpumą vandenyje, kai tuo tarpu
acilinimas – mažina. Aglikono forma nėra stabili, todėl gamtoje aptinkama retai. Glikozilinimas padidina antocianinų stabilumą, kadangi susiformuoja tarpmolekuliniai vandeniliniai ryšiai, todėl antocianinai yra stabilūs ir gali egzistuoti gamtoje [19].
Labiausiai paplitę aglikonai, kurių hidroksigrupė yra glikozilinta gliukozės ar ramnozės molekulėmis, tačiau tai pat dažnai sutinkamos ir kitos cukraus molekulės – galaktozė, arabinozė, ksilozė bei rutinozė [20].
Antocianinai yra unikalūs junginiai flavonoidų grupėje, kadangi jų struktūra grįžtamai kinta priklausomai nuo terpės pH reikšmės [20]. Antocianinų transformavimosi schema nurodyta 2 paveiksle. Vandeniniuose tirpaluose antocianinų molekulės egzistuoja pusiausvyroje keturiose skirtingose formose: flavilio katijono, kvinonoido bazės, karbinolio ar pseudobazės ir chalkono C. Esant skirtingai pH tirpalo reikšmei ir skirtingai antocianino struktūrai, pusiausvyra pasislenka į kurios nors formos pusę. Esant žemoms pH reikšmėms, dominuoja flavilio katijono forma, kuri tirpalą nudažo raudona spalva. Didėjant pH reikšmei, dauguma flavilio jonų kinta, pavirsdami kitomis formomis – mėlynos spalvos kvinonoidu arba bespalvėmis pseudobazėmis [16, 23].
Kai pH reikšmė tampa mažesnė nei 2, antocianinai egzistuoja raudonos spalvos flavilio katijono formoje. Padidėjus terpės pH reikšmei iki 3-6, katijono C-2 padėtyje vyksta greita hidratacija, kurios metu susidaro bespalvė karbinolio pseudobazė [23].
2 pav. Schema, vaiszduojanti antocianinų formų struktūros pokyčius, kintant vandeninės terpės pH (23).
4.4.1. Antocianinų fizikocheminės savybės
Antocianinai yra gerai tirpūs vandenyje ir alkoholiniuose tirpikliuose [19]. Nustatyta, jog antocianinai vandeniniuose tirpaluose yra stabilesni, jei pH reikšmė yra žema (pH<3), o antocianinų irimo laikas yra tiesiogiai proporcingas pH reikšmei – didėjant pH vertei, antocianinų irimas vyksta greičiau [24].
Antocianinai yra neatsparūs oksidacijai bei jautrūs tokiems faktoriams kaip temperatūra ir UV radiacija, kurie sąlygoja antocianinių stabilumo sumažėjimą. Antocianinai taip pat suyra sieros dioksido, askorbo rūgšties ar metalo jonų poveikyje, kurie gali būti aptinkami kaip maisto komponentai ar priedai [20]. Būdinga savybė sudaryti chelatinius junginius su geležies, vario, aliuminio ir seleno jonais, kurie gali būti aptinkami žaliavos įpakavime, ir dėka šios sąveikos gali pakisti pigmento spalva [19].
4.4.2. Antocianinų farmakokinetinės savybės
Organizme antocianinai yra greitai absorbuojami, maksimali koncentracija plazmoje siekia nuo 1,4 iki 200 nM, suvartojus atitinkamai nuo 10 iki 720 mg išgrynintos jų frakcijos. Ši koncentracija pasiekiama praėjus 45 min po antocianinų turinčio maisto suvartojimo [25], remiantis kitais šaltiniais, šis laikotarpis gali siekti ir iki 4 valandų (Mazza G. ir kt. 2002).
2002 metais atlikto tyrimo metu, buvo siekiama nustatyti, kaip antocianinų absorbcija kinta, vartojant išgrynintą frakciją arba antocianinus vartojant kartu su balastinėmis medžiagomis. Gauti rezultatai parodė, jog vartojant išgrynintą antocianinų frakciją, maksimali koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama po 1 val, jei tiriamasis subjektas iš vakaro būna nevalgęs. Jei antocianinai vartojami kartu su kitomis maisto medžiagomis, jų absorbcijos laikas pailgėja iki 1,5 val, ypač absorcija sulėtėja jei antocianinai vartojami su riebiu maistu - šiuo atveju maksimali koncentracija pasiekiama tik praėjus 4 val po antocianinų suvartojimo [26].
Taip pat absorbcijos procesams gali turėti įtakos glikozidinės grupės prigimtis ir padėtis antocianino molekulėje [27]. 2003 metais buvo nustatyta, jog antocianinai trečioje padėtyje turintys monoglikozidą yra lėčiau absorbuojami nei toje pačioje padėtyje esant rutinozido molekulei [28].
Jei antocianinai yra absorbuojami ir cirkuliuoja kraujyje, jie turi sisteminį poveikį, veikdami ląsteles taikinius žmogaus organizme. Jei nėra absorbuojami pro žarnyno gleivinę, antocianinai veikia lokaliai, virškinamajame trakte, ir galiausiai gali būti pritaikomi išoriniam naudojimui – siekiant apsaugoti odą nuo UV spinduliuotės [19].
4.4.3. Antocianinų poveikis žmogaus organizmui
Gervuogės yra puikus natūralių antocianinų šaltinis – tai viena iš pagrindinių priežasčių, skatinančių šių uogų populiarumą žmogaus dietoje. Antocianinai gali būti pritaikyti medicininėje praktikoje atsižvelgiant į jų antioksidacinį, priešuždegiminį poveikį, taip pat gebėjimą veikti vėžines ląsteles. 2005 metais, Gruzijos mokslininkų atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, jog antocianinai yra biologiškai aktyvūs prieš stemplės, tiesiosios žarnos vėžines ląsteles [29]. Taip pat antocianinų frakcija gali turėti praktinę naudą nutukimo gydyme, bei pasižymi gliukozės koncentraciją mažinančiu poveikiu, todėl gali būti pritaikomi cukrinio diabeto kontrolėje [16].
Pastebėta, kad raudonojo vyno ar mėlynių ekstrakto, kuriuose yra antocianinų, vartojimas sumažina riziką susirgti širdies kraujagyslių ligomis ir pagerina regėjimo funkciją (Manach C. ir kt.
2005m.). Taip pat yra nustatyta, jog antocianinai turi teigiamą poveikį gydant įvairias
mikrocirkuliacines ligas, kurias sukelia kapiliarų trapumas [1, 30]. Dar 1985 metais atliktų tyrimų metu buvo įrodyta, jog pigmentų ekstraktai yra daug efektyvesni už O-(b-hydroksietil)rutiną, mažinant kapiliarų pralaidumą ir trapumą [31]. Yra tikimasi, jog antocianinai gali pakeisti rutino preparatus, vartojamus esant audinių uždegiminiams procesams ar kapiliarų trapumui [32]. Taip pat nustatyta, jog antocianinų frakcija, išskirta iš Itališko raudonojo vyno, pasižymi stipriu antiradikaliniu poveikiu prieš reaktyvias deguonies formas bei inhibuoja trombocitų agregaciją [33].
Antocianinų pritaikymo sritis širdies ir kraujagyslių ligų prevencijos tikslais yra labiausiai ištirta ir turinti daugiausiai mokslinių įrodymų galimoms antocianinų indikacijoms. Pastarieji gali veikti skirtingas ląsteles, dalyvaujančias aterosklerotinių plokštelių formavimęsi, kurios yra viena iš pagrindinių kardiovaskulinės sistemos sutrikimų priežasčių [34]. Monocitų chemotaksio baltymas 1 (MCP-1) dalyvauja makrofagų lokalizavime į infekcijos ar uždegimo vietą, mokslininkai Garsia-Alonso M., Rimbach G. ir Rivas-Gonzalo J. 2004 metais atliktame tyrime įrodė, jog šis baltymas tiesiogiai dalyvauja aterosklerotinių plokštelių susidaryme, o antocianinai slopina MCP-1 baltymo sintezę endotelio ląstelėse, taip sumažindami galimą aterosklerozės riziką [34]. Taip pat antocianinai pasižymi vazodilatacinėmis savybėmis širdies vainikinėse kraujagyslėse - 2002 metais tyrėjų Wang J. ir Mazza G. atlikto tyrimo metu buvo pastebėta, jog antocianinai esantys gervuogių sudėtyje inhibuoja makrofaguose lipopolisacharidų sukeltą NO sintezę.[35].
Kiek vėliau 2005 metais atlikto tyrimo metu buvo nustatyta, jog išgrynintas cianidin-3-gliukozidas, gautas iš gervuogių ekstrakto, apsaugo žmogaus epiteliocitų atitikmenis in vitro (Caco – 2 ląsteles) nuo peroksido radikalo sukeltos apoptozės [29].
Ilinojaus universiteto mokslininkai atliko tyrimą, siekdami įsitikinti ar gervuogių vaisiai gali padėti apsaugoti nuo gaubtinės žarnos vėžio. Tam tikslui buvo atliktas bandymas su pelėmis - viena grupė pelių buvo maitinama maistu, kuriame buvo gausu riebalų ir trūko kalcio bei vitamino D. Kita
grupė maitinta tokiu pačiu maistu, bet 10 proc. jų raciono sudarė šaldytos gervuogės. Tyrimo pabaigoje įvertinus gautus rezultatus buvo nustatyta, jog pirmosios grupės pelių plonosiose, gaubtinėse ir tiesiosiose žarnose susidarė 60 proc daugiau metastazių, nei antrosios [20].
Siekiant nustatyti fenolinių junginių įtaką cholesterolio koncentracijai žmogaus organizme, 2005 metais buvo atliktas dvigubai aklas, kontroliuojamas bandymas, kuriame dalyvavo 120 subjektų (40 – 65 metų amžiaus) besiskundžiantys aukštu lipidų kiekiu kraujyje. Jiems buvo paskirta vartoti po 160 mg antocianinų ekstrakto 2 kartus dienoje, o kontrolinei grupei buvo duodamas placebas. Praėjus 12 savaičių buvo vertinami rezultatai: grupėje, kuriai buvo paskirti antocianinai, nustatytas ženklus DTL cholesterolio padidėjimas kraujyje bei sumažėjusi MTL cholesterolio koncentracija [36].
2005 metais atliktas tyrimas parodė, jog antocianinai skatina insulino sekreciją iš kasos beta ląstelių. Šiuo poveikiu stipriausiai pasižymi cianidin-3- glukozidas ir delfinidin-3-glukozidas, o pelargonidinas - aktyviausias iš antocianidinų [37].
Tyrėjai Galvano F. ir Lazzarino G. įrodė, jog cianidinas apsaugo skrandžio gleivinę nuo aspirino sukeliamų pažeidimų. Antocianinų apsauginis poveikis skrandžio ląstelėms yra susijęs su jų priešuždegiminiu poveikiu. Uždegimas yra skrandžio gleivinės pažeidimo pasekmė, todėl apsaugant gleivinę galima būtų išvengti tolimesnių uždegiminių procesų [38].
Pasak Pasaulio Sveikatos organizacijos, remiantis toksikologiniais tyrimais, kurie apima mutageniškumą, toksinį poveikį reprodukcinei sistemai, teratogeniškumą, taip pat apsinuodijimo galimybės vertinimą, maisto produktai, savo sudėtyje turintys antocianinų yra toksiškai nepavojingi [39].
Susidomėjimas maisto sudėtyje esančiais polifenoliniais junginiais pradėjo ženkliai didėti pripažinus, jog jie turi potencialią naudą žmogaus sveikatai. Epidemiologiniai tyrimai parodė, jog tarp suvartojamo polifenolių kiekio ir susirgimų kai kuriomis chroniškomis ligomis, yra atvirkštinė priklausomybė [16], todėl pradėti plėtoti tolimesni tyrimai pasitelkiant in vitro ir in vivo modelius. Tačiau siekiant suprasti antocianinų veikimo mechanizmą ir efektyvumą in vivo, reikalingi tolimesni tyrimai. Taip pat reikalingos išsamesnės studijos siekiant geriau suprasti šių junginių biotransformacijos etapus, kurie vyksta in vivo sąlygomis, nuo patekimo į virškinamąjį traktą, iki ekskrecijos.
4.4.4. Antocianinų pasiskirtymas augaluose
Antocianinai aptinkami įvairiuose augalo organuose, kaip, pavyzdžiui, vaisiai, žiedai, stiebai, lapai ir šaknys. Šie pigmentai įprastai randami epidermio ląstelių vakuolėse, tačiau kai kuriose augalų rūšyse, antocianinai pasiskirstę tam tikruose vakuolės regionuose, vadinamuose antocianoplastuose. Pagrindinis antocianinų šaltinis yra raudoni vaisiai, ypatingai uogos ir raudonosios vynuogės, grūdinės kultūros, ypač raudonieji kukurūzai, daržovės, taip pat vynas [19].
Antocianinų sudėtis gali varijuoti netgi tarp to paties augalo vaisių, esant skirtingiems vidiniams ir išoriniams faktoriams, kaip genetiniai veiksniai, skirtingas šviesos intensyvumas, temperatūros svyravimai, galutinės žaliavos apdorojimas ir laikymas [20].
Pati svarbiausia antocianinų funkcija yra spalvos suteikimas augalams ar produktams, kurių sudėtyje yra augalų, turinčių antocianinų. Jie vaidina svarbų vaidmenį pritraukiant gyvūnus, kurie apdulkina žiedus ar išnešioja sėklas, todėl yra vertingi šios augalas – gyvūnas sąveikos bendroje evoliucijoje. Antocianinai ir 3-deoksiantocianidinai gali veikti kaip antioksidantai, pasižymi priešgrybeliniu ar antibakteriniu poveikiu, taip pat jie gali būti svarbūs faktoriai kartu su kitais flavonoidais apsaugant augalus nuo vabzdžių [19].
4.4.5. Kokybinės ir kiekybinės sudėties nustatymo metodikos
Siekiant garantuoti fitopreparatų efektyvumą ir saugumą, turi būti atliekama vaistinės augalinės žaliavos analizė bei veikliųjų medžiagų kokybinis ir kiekybinis įvertinimas. Kokybiniam ir kiekybiniam flavonoidų nustatymui dažniausiai naudojama ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties (absorbcinė) spektrofotometrija (UV ir IR spektroskopija), branduolių magnetinio rezonanso spektroskopija, masių spektroskopija, plonasluoksnė chromatografija, efektyvioji skysčių chromatografija [40].
Antocianinai yra tirpūs poliniuose tirpikliuose ir iš augalų paprastai ekstrahuojami naudojant metanolį, kuris turi nedidelį kiekį vandenilio chlorido rūgšties ar skruzdžių rūgšties. Rūgštis sumažina tirpalo pH reikšmę ir stabdo neacilintų antocianinų pigmentų degradaciją [22].
Nuolatinis metodų ir instrumentų (pvz. ESC, SC-MS, BMR spektroskopija), naudojamų antocianinų atskyrimui ir struktūros išaiškinimui, tobulinimas sudarė sąlygas, leidžiančias naudoti mažesnius žaliavos kiekius ir pasiekti tikslesnius rezultatus. Nauji antocianinai dažnai atrandami tuose augaluose, kurie jau anksčiau buvo kruopščiai ištirti. Dauguma antocianinų yra nestabilūs pagal įvairius cheminius ir fizikinius rodiklius, įskaitant deguonies, aukštos temperatūros, ir daugelio pH vertes, o taip pat įvairūs antocianinai turi panašią struktūrą ir gali būti mišinių pavidalu – šie
parametrai lemia, kad antocianinų išskyrimo procesas yra sudėtingas ir reikalaujantis kruopštumo [19].
4.4.5.1. Plonasluoksnė chromatografija
Kokybiniam antocianinų įvertinimui gali būti taikoma plonasluoksnė chromatografija. 5 g susmulkintų vaisių užpilama 20 ml metanolio tirpalo ir laikoma 15 min, po to ekstraktas nufiltruojamas ir gautas filtratas naudojamas tolimesnei analizei. Lyginamasis tirpalas ruošiamas ištirpinant 5 mg chrizantemino 10-yje ml metanolio tirpalo [42].
Ant paruoštos chromatografinės plokštelės, naudojant mikrokapiliarą, 1-2 cm atstumu nuo plokštelės krašto užlašinamas tiriamasis filtratas, o šalia – lyginamasis tirpalas. Judančiąją fazę sudaro bevandenė skruzdžių rūgštis, vanduo ir butanolis (16 : 19 : 65 V/V/V) [42].
Tirpiklių sistemai pasiekus 10 cm aukštį, chromatografinė plokštelė išimama iš kameros ir džiovinama esant 25±2°C temperatūrai bei apžiūrima dienos šviesoje. Chrizanteminas chromatogramoje sudaro raudonai violetinės spalvos liniją [42].
Rs =
4.4.5.2. Ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties (absorbcinė) spektrofotometrija
Spektroskopijos metodas pranašus tuo, kad tyrimo metu nesuardoma tiriamoji medžiaga, galima nustatyti ir nedidelius medžiagų kiekius, o pačios tyrimo metodikos gali būti modifikuojamos ir lengvai automatizuojamos [43].
Ultravioletinio ir regimojo spektrų sugerties (absorbcinė) spektrofotometrija – tai vienas iš spektroskopijos metodų, kuris remiasi tiriamosios medžiagos molekulių energijos pokyčio matavimu. Kiekybiniam vertinimui pritaikomas Bugero-Lanberto-Berto dėsnis, kuris nusako priklausomybę tarp tirpalo spalvos intensyvumo ir medžiagos kiekio ar koncentracijos tirpale. Spalvotų tirpalų kiekybinis nustatymas atliekamas regimojoje spektro dalyje, nespalvotų – UV spektro dalyje. Pagrindiniai analizės metodai gali būti atliekami sudarant gradavimo grafiką arba lyginant tiriamojo tirpalo sugertį su paruoštu etaloniniu tirpalu [43].
Vienas iš metodo variacijų – pH diferencinis metodas yra paprastas, tikslus ir dažniausiai pritaikomas siekiant apskaičiuoti suminį antocianinų kiekį mėginyje [44]. Antocianinų pigmentų struktūra grįžtamai transformuojama, pakitus aplinkos pH vertei, ir šie struktūros pakitimai lemia skirtingus absorbcijos spektro maksimumus. Kai pH vertė žema (pH=1), antocianino molekulės
struktūroje esantis C žiedas turi teigiamą krūvį ir susidaro spalvotas flavilio katijonas. Didėjant pH reikšmei, molekulės C žiedas hidratuojamas, krūvis prarandamas ir dominuojančia forma tampa beplavė karbinolio pseudobazė, kuri neabsorbuoja regimojo šviesos spektro [45].
Spektrofotometru matuojama standarto ir tiriamojo pavyzdžio absorbcija 520 nm bangos ilgyje, esant skirtingoms pH reikšmėms. Pavyzdyje, kuriame pH=1, absorciją lemia ne tik antocianinai, bet visi junginiai, kurie sugeria regimosios šviesos spektro dalį 520 nm bangos ilgyje, tačiau kai pH=4,5, absorbcijos vertė priklauso tik nuo kitų junginių, t.y. ne antocianinų, o gautų sugerties reikšmių skirtumas parodo tik nuo antocianinų priklausančią absorbciją [46]. Siekiant išvengti polimerinių pigmentų bei kitų junginių įtakos rezultatams, papildomi matavimai atliekami 700 nm bangos ilgyje, o galutinis absorbcijos dydis apskaičiuojamas remiantis šia formule [47]:
Antocininų koncentracija išreiškiama cianidin-3-glukozido ekvivalentu [46]: c (mg/L) = (A x Mr x D x 1000)/(εxl)
Mr – cianidin-3-glukozido molekulinė masė (449.2 g/mol) D – praskiedimo faktorius
ε – cianidin-3-glukozido ekstincijos koeficientas l – kiuvetės storis, cm.
5. TYRIMO METODIKA
5.1.Tyrimo objektas
Tyrimams pasirinktos dvi skirtingos gervuogių rūšys – R. caesius bei R. nessensis, kiekvienos rūšies vaisių mėginiai buvo renkami kas savaitę, iki pat vaisių derėjimo periodo pabaigos, taip pat buvo surinkti vienkartiniai R. caesius vaisių mėginiai iš įvairių Lietuvos regionų (Vilniaus, Kauno, Klaipėdos, Druskininkų, Mažeikių, Prienų, Trakų, Karklės, Pagėgių, Rusnės) siekiant įvertinti antocianinų sudėties įvairavimą. Šviežiai surinkti ir užšaldyti gervuogių vaisiai, laikyti pastovioje -20ºC temperatūroje, kol buvo atliekami tyrimai.
Optimalių ekstrahavimo sąlygų nustatymui, buvo panaudoti gervuogių vaisiai, surinkti Kauno rajone.
5.2. Reagentai
Distiliuotas vanduo Skirtingos koncentracijos etanolio tirpalai: 20, 40, 60, 80 ir 100 (V/V), 0,1 proc, HCl tirpalas
ABTS DPPH
Kalio persulfatas
5.3. Aparatūra
Analitinės svarstyklės („Sartorius CP6M-0CE”, Vokietija) Mikropipetės („Eppendorf Research”, JAV)
Popieriniai filtrai („ODR – 9303”, Vokietija);
Spektrofotometras (Beckman DU – 70, 4273041, „Beckman Instruments”, JAV) Mechaninė purtyklė (Laboratory shaker 358S, Lenkija)
5.4. Ekstrakcija
Siekiant nustatyti tinkamiausio poliškumo ekstrahentą, buvo ruošiami gervuogių ekstraktai naudojant skirtingos koncentracijos etanolio tirpalą, parūgštintą 0,1 proc. HCl (20, 40, 60, 80, 100 proc. (V/V)). Kambario temperatūroje atšildyti gervuogių vaisiai sutrinami grūstuvėje ir pasvėrus 2 g trintų vaisių, jų masė užpilama 20 ml ekstrahento ir 15 min ekstrahuojama kambario temperatūroje, periodiškai maišant.
Gauti ekstraktai filtruojami ir atliekama spektrofotometrinė analizė. Tolimesniems tyrimams naudojamas tos koncentracijos ekstrahentas, kurio ekstrakcijos išeiga buvo didžiausia ir išekstrahuotas didžiausias antocianinų kiekis.
Nustačius tinkamiausio poliškumo ekstrahentą, buvo vertinama kokią įtaką ekstrakcijai turi ekstrahavimo trukmė. Buvo paruoštas ekstraktas iš 2 g trintų gervuogių vaisių ir 20 ml 40 proc.(V/V) etanolio, patūgštinto 0,1 proc. vandenilio chlorido rūgštimi. Ekstrahavimas atliekamas purtyklėje, nustačius 150 apsisukimų per minutę ir atitinkamai ekstraktai maceruojami 30 min, 1 val, 2 val ir 3 val, o vienas paruoštas ekstraktas paliekamas kambario temperatūroje, 24 val. Pasibaigus maceracijos laikotarpiui, ekstraktai buvo filtruojami ir mėginiai analizuojami spektrofotometriškai, 528 nm bangos ilgyje.
Ektrahavimo sąlygų optimizavimui ir siekiant sutrumpinti maceracijos trukmę, gali būti pritaikoma maceracija ultragarsinėje vonelėje, todėl siekiant palyginti maceracijos ir ekstrakcijos ultragarsinėje vonelėje efektyvumą, buvo atliktas bandymas: iš tų pačių gervuogių vaisių, kurie buvo naudojami optimaliam maceracijos laikui nustatyti, tomis pačiomis sąlygomis paruošti etanoliniai
ekstraktai patalpinami į ultragarsinę vonelę, nustačius 25⁰C temparatūros režimą (atitinka kambario
temperatūrą, kurioje buvo atlikta maceracija purtyklėje), ir ekstrahuojama atitinkamai 5, 10, 15, 20, 25, 30 ir 40 min. Suminis antocianinų kiekis nustatomas spektrofotometrijos metodu.
5.5. Nuodžiūvio nustatymas gervuogių vaistinėje augalinėje žaliavoje
Remiantis Europos farmakopėja, nuodžiūvis nustatomas dedant tiksliai pasvertą tiriamosios žaliavos kiekį į iš anksto iki pastovios masės išdžiovintą ir pasvertą biuksą. Į tokį biuksą buvo
atsverta 2 g. iki košelės konsistencijos sutrintų gervuogių uogų ir džiovinta 100-105 Cᵒ temperatūroje iki pastovios masės, iki kol svėrimai tesiskyrė ±0,001g.
Nuodžiūvis apskaičiuojamas remiantis formule [42]:
m – tiriamos žaliavos masė pries džiovinimą (g). m1 – tiriamos žaliavos masė po džiovinimo (g).
5.6.
Antocianinų kiekybės nustatymas spektrofotometriniu metodu
Atliekant spektrofotometrinę analizę, pirmiausiai vykdomas mėginio paruošimas. Remiantis Europos Farmakopėja, antocianinų spektrofotometrinė analizė atliekama tirpalų absorbciją matuojant 528 nm bangos ilgyje.
1 ml gauto ekstrakto perkeliamas į 25 ml kolbą ir praskiedžiamas 24 ml naudoto ekstrahento, parūgštinto 0,1% vandenilio chlorido rūgštimi, lyginamasis tirpalas – naudotas ekstrahentas. Antocianinų kiekis apskaičiuojamas remiantis šia formule (42):
C%=
A – tiriamojo ekstrakto absorbcija esant 528 nm bangos ilgiui m – analizei paimto tiriamojo mišinio masė (gramais)
718 – cianidin-3-gliukozido absorbcija esant 528 nm bangos ilgiui
5.7.
Gervuogių vaisių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo įvertinimas
fotometriniu metodu
5.7.1. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH•) radikalo sujungimo metodas
DPPH radikalo tirpalas, prisijungdamas protoną, keičia spalvą iš purpurinės į geltoną ir praranda savybę absorbuoti 515 nm bangos ilgio šviesą. Antiradikalinis aktyvumas įvertinamas matuojant, kiek procentų stabilaus DPPH radikalo neutralizuoja antiradikaliniu aktyvumu pasižymintys junginiai, esantys tiriamajame ekstrakte. 1 cm kiuvetėje 50 µl analizuojamo ekstrakto buvo sumaišyta su 2 ml šviežiai paruošto DPPH tirpalo metanolyje (6,5×10–5 mol l–1). Spektrofotometru matuojamas mėginio absorbcijos mažėjimas 515 nm bangos ilgyje, iki pasiekiama
absorbcijos pusiausvyra [48]. Ekstraktų aktyvumas išreiškiamas DPPH inaktyvinimo procentais [49, 50] :
Ab – tuščio bandinio absorbcija (t=0 min.)
Aa – bandinio su tiriamuoju tirpalu absorbcija (po pusiausvyros nusistovėjimo)
5.7.2. 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalo katijono
sujungimo metodas
ABTS·+ radikalas buvo gautas reaguojant ABTS su kalio persulfatu. Radikalas gaunamas laikant ABTS ir kalio persulfato mišinį santykiu 2:1 tamsoje 16 valandų. Katijoninė radikalo forma išlieka stabili dvi paras. Antiradikaliniam aktyvumui įvertinti ABTS·+ praskiedžiamas tiek, kad esant 734 nm bangos ilgiui, šviesos absorbcija būtų 0,7 [16]. Antiradikalinis aktyvumas išreiškiamas ABTS inaktyvinimo procentais ir apskaičiuojamas remiantis ta pačia formule, kaip ir DPPH radikalo sujungimo metodo atveju [51].
5.8. Statistinis duomenų įvertinimas
Kiekvieno tyrimo etapo matavimai kartojami tris kartus, o rezultatai pateikiami kaip gautų duomenų aritmetinis vidurkis, nurodant standartinį nuokrypį (SD). Suminis antocianinų kiekis išreikštas kaip procentinė dalis sausos žaliavos masėje. Gauti duomenys grafiškai apdorojami naudojant Microsoft Excel 2010 programa.
6. TYRIMO REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
6.1. Ekstrakcijos sąlygų optimizavimas
Literatūroje rasta duomenų, jog antocianinų ekstrakcijai dažniausiai taikomas metanolio tirpalas, parūgštintas vandenilio chlorido ar skruzdžių rūgštimi [32]. Tačiau dėl didelio metanolio toksiškumo, ir remiantis tuo, kad antocianinai yra gerai tirpūs poliniuose tirpikliuose, buvo nuspręsta optimalių ekstrahavimo sąlygų nustatymui kaip ekstrahentą pasirinkti vandens-etanolio mišinį, ir palyginti rezultatus, gautus ekstrakciją atliekant su skirtingos koncentracijos ekstrahentais.
Tinkamiausia koncentracija buvo parinkta bandymo būdu, ekstraktų paruošimui taikant vienodas sąlygas ir gamybai naudojant tuo pačiu metu surinktų gervuogių vaisius (bandymo eiliškumas aprašytas 5.4. skyriuje).
Antocianinų stabilumui ekstraktuose įtakos turi ekstrahento rūgštingumas – esant žemai pH reikšmei, antocianinų stabilumas didesnis, o kai pH<2 dominuojančia forma tampa flavilio katijonas, kuris suteikia tirpalui raudoną spalvą [20]. Todėl siekiant padidinti antocianinų stabilumą, ekstrahentai yra parūgštinami 0,1 proc. HCl rūgštimi.
Gauti rezultatai pateikiami 1-oje diagramoje – didžiausias antocianinų kiekis (1,91 proc. sausos žaliavos masės) išekstrahuojamas naudojant 40 proc. (V/V) etanolio tirpalą, parūgštintą 0,1 proc. HCl. Todėl tolimesniems tyrimo etapams pasirinktas būtent šis ekstrahentas. Mažiausia antocianinų ekstracijos išeiga gauta ekstrakciją atliekant vandeniu, parūgštintu 0,1 proc. HCl – nustatyta 0,79 proc. antocianinų sausoje žaliavoje.
1 pav. Ekstrahento poliškumo įtaka ekstakcijos išeigai
Šio tyrimo metu gauti rezultatai papildo 2008 metais JAV atlikto tyrimo metu gautus duomenis, jog didinant vandens procentinį kiekį ekstrahente, antocianinų ekstrakcijos efektyvumas mažėja – JAV atlikto tyrimo metu nustatyta, jog suminis antocianinų kiekis optimaliausiai išekstrahuojamas esant 50 proc (V/V) etanolio koncentracijai, R. caesius mėginiuose – 40 proc. (V.V), o toliau didinant etanolio koncentraciją, ekstrakcijos efektyvumas abiems atvejais sumažėja [52].
Ekstrakcijos efektyvumui įtakos turi ne tik tirpalo poliškumas, bet ir ekstrakcijos trukmė – prieš atliekant ekstrakcijos optimizavimą, buvo iškelta hipotezė, jog ilgėjant ekstrakcijos laikui, antocianinų išeiga didėja. Gauti rezultatai pavaizduoti 2-oje diagramoje.
2 pav. Ekstrahavimo trukmės įtaka ekstrahavimo efektyvumui maceracijos metodu
Pagal gautus rezultatus, galima pastebėti tendenciją – didinant ekstrakcijos trukmę nuo 30 min iki 3 valandų, antocianinų kiekis ženkliai didėja – ekstrahuojant 30 min, nustatytas antocianinų kiekis mėginyje 2,03 ± 0,85 proc., o po trijų valandų maceracijos – 3,17 ± 0,69 proc., t.y. antocianinų koncentracija padidėjo 56,15 proc.
Kadangi ekstraktai buvo parūgštinti 0,1 proc. HCl, galima daryti prielaidą, jog ilgesnį laikotarpį atliekant antocianinų maceraciją, rūgštinėje aplinkoje prasideda hidrolizės procesai. Šią prielaidą patvirtina rezultatai, gauti atliekant matavimus su mėginiu, kuris buvo maceruojamas 24 val. – jame antocianinų koncentracija ženkliai sumažėja, lyginant su mėginiais, kurie buvo maceruojami 1, 2 ar 3 valandas.
Siekiant pagerinti ekstrahavimo efektyvumą ir sutrumpinti laiką, reikalingą maksimaliai išekstrahuoti antocianinų frakciją, gali būti panaudojamas ultragarsinis maceravimas. Rezultatai,
gauti atliekant antocianinų ekstrakciją 25⁰C temperatūroje, naudojant ultragarsinę vonelę, pateikiami
3 pav. Antocianinų išeiga, maceruojant ultragarsinėje vonelėje
Palyginus rezultatus, pavaizduotus antroje ir trečioje diagramose, akivaizdu, jog ekstrakcija efektyvesnė naudojant ultragarsinę vonelę, kadangi ekstrakcijos trukmę galima sutrumpinti iki 30 min, gaunant labai artimą rezultatą antocianinų koncentracijai, kuri buvo gauta maceraciją atliekant 2 valandas. Ilgėjant ekstrahavimo laikui, atitinkamai didėja ir antocianinų frakcijos kiekis mėginyje, tačiau ekstrakciją atlikus 40 min, buvo gautas kiek mažesnis rezultatas, manoma, kad ilgiau veikiami ultragarso antocianinai skilo ir tai lėmė mažesnį suminį antocianinų kiekį mėginyje.
Taigi, pagal gautus atlikto ekstrahavimo sąlygų įvertinimo rezultatus, nuspręsta tolimesnius ekstraktus, reikalingus tyrimui, ruošti naudojant 40 proc (V/V). etanolio tirpalą, parūgštintą 0,1 proc. HCl, ekstrakciją atliekant ultragarsinėje vonelėje, nustačius 30 min ekstrakcijos trukmę.
6.2. Bendro antocianinų kiekio kitimo dinamika vaisių nokimo metu
Iš viso tyrimui atlikti buvo paruošti 26 gervuogių vaisių ekstraktai: 10 mėginių buvo surinkti iš skirtingų Lietuvos vietovių, 10 mėginių buvo surinkta iš tos pačios R.caesius augimvietės Šilutės rajone, periodiškai kas savaitę, visą vaisių derėjimo laikotarpį, o likusieji 6 mėginiai - R.
nessensis vaisiai, kurie analogiškai buvo renkami kas savaitę, visą vaisių nokimo laikotarpį taip pat
Šilutės apylinkėje.
Ekstraktai buvo ruošiami pagal metodikas, nustatytas ekstrakcijos optimizavimo bandymo metu, palaikant vienodas sąlygas. Kiekvienas mėginys buvo tiriamas spektrofotometrijos metodu, nustatant kiekybinę antocianinų sudėtį. Gauti rezultatai lyginami 4-oje diagramoje:
4 pav. R.caesius ir R.nessensis antocianinų frakcijos kiekio priklausomybė nuo rinkimo laiko ir nuo augalo rūšies
Abiejų gervuogių rūšių vaisiai buvo renkami tame pačiame Šilutės rajone, tose pačiose cenopopuliacijose ir tuo pačiu laiku, tačiau akivaizdu, jog R.caesius genties vaisiai antocianinų sudėtimi daug turtingesni nei R.nessensis. Vidutinis antocianinų kiekis R. caesius vaisiuose siekia 4.43 ± 0.94 proc. (sausos žaliavos masės), kai tuo tarpu R.nessensis – 2.68 ± 0,78 proc. Šiuos
kitimus galėjo lemti genetiniai faktoriai, dirvožemio derlingumo skirtumai, taip pat gaunamos saulės šviesos kiekis, kadangi tiriamoji R.caesius augo atviresnėje vietoje, o R.nessensis – daugiau miško tankmėje.
Nokstant gervuogių vaisiams, antocianinų kiekis jose didėja iki penktosios-šeštosios mėginių rinkimo savaitės, R. caesius vaisiuose antocianinų kiekis nuo 4,24 ± 0,61 proc. nokimo pradžioje padidėjo iki 4,90 ± 0,98 proc. šeštąją rinkimo savaitę. R. nessensis vaisiai nokimo pradžioje buvo sukaupę 2,63 ± 0,64 proc. antocianinų, sausos žaliavos masėje, ir šis kiekis kito nežymiai – maksimalus kiekis antocianinų (2,92 ± 0,23 proc.) nustatytas ketvirtąją stačiosios gervuogės vaisių mėginių rinkimo savaitę. Taigi, nokimo metu, R. caesius vaisiuose antocianinų kiekis padidėjo 15,56 proc., o R. nessensis – 11,03 proc.
Nokstant uogoms jose bespalvių fenolinių junginių kiekis mažėja didėjant spalvotų fenolinių proantocianidinų tipo taninų, didėja antocianinų kiekis ir įvairovė [19]. Remiantis gautais rezultatais, galima būtų teigti, jog didžiausia antocianinų koncentracija augalo vaisiuose susidaro vaisių derėjimo periodo viduryje, apie 6-ą savaitę R.caesius ir atitinkamai R.nessensis – 4-ą vaisių rinkimo savaitę.
Panašaus pobūdžio tyrimas buvo atliktas 2007 metais, inicijuojant Lietuvos sodininkystės ir daržininkystės institutui, tačiau kaip tyrimo objektas buvo naudojamos aviečių uogos. Buvo tirtas biologiškai aktyvių junginių kitimas nokstant raudonosios avietės 'Willamette' (Rubus idaeus) ir juodosios avietės 'Bristol' (Rubus occidentalis) uogoms [41]. Buvo nustatyta, jog bioaktyvių junginių kiekis labai skiriasi priklausomai nuo genotipo ir uogų sunokimo laipsnio, o didžiausia antocianinų koncentracija susidaro vaisių vartotojiškos brandos periodu.
Taigi, tyrimo, atlikto su gervuogių uogomis rezultatai papildo jau prieš tai atliktą tyrimą su tos pačios genties atstovais, o išvados gali būti sugretinamos – antocianinų kiekis didėja vaisių nokimo metu.
6.3. Bendro antocianinų kiekio kitimo dinamika mėginiuose, surinktuose iš
skirtingų Lietuvos vietovių
Atliekant tyrimą su R.caesius gervuogių vaisiais, surinktais iš kelių skirtingų Lietuvos vietovių, nustatyta, jog antocianinų kiekis įvairuoja nuo 2,41 ± 0.42 proc. iki 3,04 ± 1.50 proc. Mažiausia antocianinų koncentracija nustatyta tuose mėginiuose, kurie buvo renkami iš Vakarų Lietuvos regionų, o didžiausias kiekis nustatytas Kauno rajone rastuose gervuogių vaisiuose, po to seka atitinkamai Prienų, Trakų ir Vilniaus regionuose surinktų vaisių bandiniai. Visi mėginiai buvo renkami rugpjūčio mėnesį, siekiant, kad gauti rezultatai turėtų kuo mažesnę paklaidą. Gauti rezultatai apibendrinti 3-ioje lentelėje.
3 lentelė. R.caesius vaisiuose nustatytas antocianinų kiekis, priklausomai nuo augimo vietos
Rinkimo vietovė Antocianinų kiekis sausoje
žaliavoje (proc.) Druskininkai 2,58 ± 0,61 Mažeikiai 2,96 ± 0,95 Prienai 3,01 ± 1,25 Vilnius 2,95 ± 1,47 Trakai 3,04 ± 1,50 Karklė 2,51 ± 0,71 Pagėgiai 2,41 ± 0,42 Klaipėda 2,53 ± 0,72 Kaunas 3,18 ± 0,63 Rusnė 2,97 ± 1,81 Vidurkis 2,82 ± 1,01
2012 m. orų archyvo duomenimis, liepos-rugpjūčio mėnesiais Vilniaus ir Kauno rajonuose vidutinė paros temperatūra buvo aukštenė, nei Klaipėdos rajone, taip pat iki rugpjūčio 31 d. oras buvo be kritulių, kai tuo tarpu Vakarų Lietuvoje vasara buvo gana lietinga. Remiantis antocianinų tirpumu vandenyje, galima prielaida, jog dėl didesnio kritulių kiekio Klaipėdos rajone bei Pietvakarių Lietuvoje, gervuogių vaisių mėginiai, rinkti Pagėgiuose, Karklėje ir Klapėdos mieste turi mažesnį kiekį antocianinų, nei vaisiai, rinkti Kauno ir Vilniaus rajonuose.
Literatūros šaltiniuose nepavyko rasti duomenų apie panašaus profilio tyrimus, siekiant nustatyti antocianinų sudėties pasiskirstymą skirtinguose regionuose - daugiau atkreipiamas dėmesys į vaisių kiekybinės sudėties tyrimus bei tarprūšinius antocianinų sudėties skirtumus. Tačiau analizuojant skirtinguose regionuose išaugusių gervuogių vaisių ekstraktus, galima daryti prielaidą, jog antocianinų sudėties pokyčiams įtakos turi ne tik genetiniai faktoriai, bet ir geografiniai rodikliai.
6.4. Gervuogių ekstraktų antiradikalinio aktyvumo įvertinimas
6.4.1. 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo (DPPH) radikalo sujungimo metodas
R.caesius ir R.nessensis vaisių ekstraktuose esančių antocianinų antiradikalinis poveikis
buvo vertinamas naudojant DPPH radikalo sujungimo metodą. Tarp skirtingų gervuogių rūšių nustatytas ženklus antiradikalinio aktyvumo skirtumas: R.caesius vaisiuose esantys fenoliniai junginiai inaktyvina vidutiniškai apie 26.91±1.34proc. DPPH radikalų, kai tuo tarpu R.nessensis žaliavoje nustatytas antiradikalinis aktyvumas siekia apie 7.84±1.62 proc. Šie rezultatai gali būti
siejami su 6.2. skyriuje atlikto bandymo gautais rezultatais – palyginamoji diagrama pateikiama 5 paveiksle.
5 pav. R caesius antiradikalinio aktyvumo priklausomybė nuo antocianinų kiekio tiriamuose vaisių mėginiuose
Iš diagramos matyti, jog esant maksimaliam antocianinų kiekiui (4,90 proc.) 6-ąją rinkimo savaitę, fiksuojamas didžiausias antiradikalinis aktyvumas (36,71±0.97 proc.), apskaičiuota koreliacijos koeficiento reikšmė r = 0.68. Remiantis literatūros šaltiniais, jei koreliacijos koeficientas yra dydis tarp 0,40-0,69, tuomet ryšys yra vidutinis, o reikšmei didėjant 0,70 iki 0,89 – rodo stiprų ryšį tarp kintamųjų [53].
6 pav. Iš skirtingų regionų surinktų gervuogių vaisių antiradikalinio aktyvumo nustatymas DPPH metodu.
Antiradikalinis aktyvumas tarp gervuogių vaisių, surinktų iš skirtingų regionų varijuoja nuo 12,47 proc, iki 18,29 proc. Daugiausiai DPPH radikalų inaktyvina Kauno rajone surinkti gervuogių vaisiai, taip pat ekstraktai gauti iš Prienų ir Trakų rajonuose rinktų mėginių. Įvertinus koreliacijos koeficientą, nustatyta, jog tarp antocianinų koncentracijos ir antiradikalinio aktyvumo yra stiprus kintamųjų ryšys (r = 0.87).
Šie gauti rezultatai papildo 2012 metais atlikto tyrimo Kinijoje gautus rezultatus, tiriant gervuogių vaisių antiradikalinį aktyvumą, ir patvirtina hipotezę, jog tarp antocianinų kiekio vaisiuose ir antiradikalinio poveikio yra stipri priklausomybė [17].
DPPH radikalas yra stabilus, išsilaikantis pakankamai ilgą laiko tarpą bei jo panaudojimui nereikalinga aktyvizacija - tai paprastas ir greitai atliekamas metodas [54].
Tačiau DPPH metodu gautų rezultatų, tiriant antocianinų antiradikalinį aktyvumą, vertinimas yra gana sudėtingas, kadangi sutampa antocianinų ir DPPH radikalų absorbcijos spektrai [55]. Dėl šios priežasties nuspręsta antocianinų antiradikalinį aktyvumą įvertinti ir ABTS radikalų sujungimo metodu.
6.4.2. 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) (ABTS) radikalo katijono sujungimo metodas
Norint pagerinti gautų rezultatų tikslumą, antiradikalinio poveikio įvertinimui be DPPH metodo, taip pat buvo pritaikytas ABTS radikalo sujungimo metodas. Atlikus tyrimą pastebėta, jog naudojant ABTS metodą gauti rezultatai yra didesni nei atlikus DPPH radikalų sujungimo metodą.
4 lentelė. Skirtingų rūšių gervuogių vaisių antiradikalinio aktyvumo, nustatyto ABTS metodu, palyginimas. Žaliavos rinkimo data R. caesius R.nessensis ABTS(%) Antocianinų kiekis mėginyje (proc.) ABTS(%) Antocianinų kiekis mėginyje (proc.) 2012-07-30 11.42 ± 0.68 4.24 ± 0.61 17.87 ± 1.83 2.63 ± 0.64 2012-08-06 12.58 ± 0.82 4.27± 0.59 19.29 ± 1.06 2.64 ± 1.15 2012-08-13 22.01 ± 1.63 4.43 ± 0.75 31.73 ± 1.74 2.74 ± 0.71 2012-08-20 41.73 ± 1.85 4.68 ± 1.23 17.66 ± 1.25 2.92 ± 0.23 2012-08-27 50.24 ± 0.75 4.35 ± 1.16 18.49 ± 1.55 2.65 ± 0.54 2012-09-03 53.44 ± 1.27 4.90 ± 0.98 17.27 ± 2.18 2.52 ± 1.42 2012-09-10 31.82 ± 0.89 4.17 ± 0.82 -- --2012-09-17 33.80 ± 1.51 4.33 ± 1.11 -- --2012-09-23 28.74 ± 2.53 4.46 ± 1.04 -- --2012-09-30 29.88 ± 1.95 4.42 ± 1.08 -- --Vidurkis 31.57 ± 1.39 4.43 ± 0.94 20.38 ± 1.62 2.68 ± 0,78
Atlikus matavimus ABTS metodu ir įvertinus rezultatus gauta, jog R. caesius vaisiuose eantys fenoliniai junginiai inaktyvina vidutiniškai 31,57±1,39 proc. ABTS radikalų, o DPPH metodu nustatytas vidutinis antiradikalinis aktyvumas – 26,91±1,34 proc.
Priklausomai nuo antocianinų koncentracijos R.caesius mėginyje, antiradikalinis aktyvumas varijuoja – didėjant antocianinų koncentracijai, stipriau inhibuojamas ABTS radikalas ir maksimalus antiradikalinis aktyvumas – 53,44 proc. - fiksuojamas esant didžiausiam suminiam antocianinų
kiekiui mėginyje (r=0.73). R. nessensis vaisių ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai inhibuoja nuo 17.27 iki 31.73 proc. ABTS katijono radikalų ir pasižymi mažesniu antiradikaliniu aktyvumu nei gretimai tirti R. caesius vaisių ekstraktai, tačiau analogiškai R.nessensis vaisių ekstraktuose apskaičiuotas mažesnis suminis antocianinų kiekis. ABTS ir DPPH metodais gautų rezultatų, tiriant
Rubus vaisių ekstraktų antiradikalinį aktyvumą, palyginimas pateiktas 7, 8 ir 9 –ame paveiksluose.
7 pav. DPPH ir ABTS metodais gautų rezultatų, tiriant R. caesius vaisius, palyginimas. Pagal gautus duomenis, galima pastebėti, jog maksimalus gervuogių vaisių ekstraktų antiradikalinis aktyvumas fiksuojamas šeštąją bandinių rinkimo savaitę, nepriklausomai nuo antiradikalinio aktyvumo nustatymo metodo. Taip pat išlaikoma tendencija, jog iki šeštosios rinkimo savaitės antiradikalinis aktyvumas stiprėja, o po to, atitinkamai mažėjant antocianinų kiekiui, aktyvių radikalų inhibavimas vykdomas silpniau.
8 pav. DPPH ir ABTS metodais gautų rezultatų, tiriant R. nessensis vaisius, palyginimas. Tiriant stačiosios gervuogės vaisių ekstraktų antradikalinį aktyvumą, ABTS metodu gauti rezultatai buvo ženkliai didesni, nei tuos pačius ekstraktus tiriant DPPH radikalo sujungimo metodu, tačiau taip pat išlaikoma tendencija, jog maksimalus antiradikalinis efektyvumas fiksuojamas tą pačią vaisių rinkimo savaitę (antocianinų suminis kiekis mėginyje - 2,74 proc. sausos žaliavos masėje), o po to antiradikalinis efektyvumas mažėja iki vaisių derėjimo periodo pabaigos.
9 pav. DPPH ir ABTS metodais gautų rezultatų, tiriant R. caesius vaisius, surinktus iš skirtingų cenopopuliacijų, palyginimas.
Atlikus R. caesius vaisių, surinktų iš skirtingų cenopopuliacijų, ekstraktų antiradikalinį aktyvumą taip pat buvo nustatyta, jog ABTS katijono surišimo metodu gauti rezultatai yra ženkliai didesni, nei duomenys, gauti matavimus atliekant DPPH metodu.
Galima rezultatų neatitikimo priežastis – matuojant tirpalų absorbciją spektrofotometru, DPPH radikalų ir antocianinų spektrai sutampa [55], todėl ABTS metodas antocianinų antiradikalinio poveikio nustatymui šiuo atveju būtų tikslesnis.
