Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis ir jų rūšinė įvairovė

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Renata Rakštelytė

Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas

kampilobakterijomis ir jų rūšinė įvairovė

Contamination of marinated poultry meat with

Campylobacter spp. and their species diversity

Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų

Darbo vadovas: prof. dr. Mindaugas Malakauskas

2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis ir jų rūšinė įvairovė“.

1. Yra atliktas mano paties/pačios;

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje;

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą panaudotos literatūros sąrašą.

2014-04-30 Renata Rakštelytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

2014-04-30 Renata Rakštelytė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADOS DĖL DARBO GYNIMO

2014-04-30 Mindaugas Malakauskas

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE/KLINIKOJE

2014-04-30 Mindaugas Malakauskas

(aprobacijos data) (katedros/instituto vedėjo/jos vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Magistro baigiamasis darbas yra įdėtas į ETD IS

3 TURINYS SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 5 SUTRUMPINIMAI ... 6 ĮVADAS ... 7 1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 9

1.1. Kampilobakterijų klasifikacija ir savybės ... 9

1.2. Kampilobakteriozės epidemiologija ... 10

1.2.1. Ţmonių kampilobakteriozė ... 12

1.2.2. Maistui auginamų gyvūnų kampilobakteriozė ... 14

1.3. Maisto ţaliavų ir produktų uţkrėstumas kampilobakterijomis ... 15

1.3.1. Mėsos uţkrėstumas kampilobakterijomis ... 15

1.3.1.1. Paukštienos uţkrėstumas ... 16

1.3.2. Kitų maisto ţaliavų ir produktų uţkrėstumas ... 18

1.4. Kampilobakterijų aptikimas ir identifikavimas ... 19

2. TYRIMO METODAI ... 22

2.1. Mėginių rinkimas ir kampilobakterijų aptikimas ... 22

2.2. Kampilobakterijų identifikavimas ... 23

2.3. Kampilobakterijų genotipavimas daugiaţidininių sekų nustatymo metodu (MLST) ... 23

2.4. Statistinė duomenų analizė ... 24

3. TYRIMO REZULTATAI IR APTARIMAS ... 25

3.1. Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis ... 25

3.2. Kampilobakterijų rūšinė įvairovė marinuotuose paukštienos pusgaminiuose ... 28

3.3. Kampilobakterijų genetinė įvairovė marinuotuose paukštienos pusgaminiuose ... 30

4. IŠVADOS ... 32

4 SANTRAUKA

Renata Rakštelytė

Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis ir jų rūšinė įvairovė Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas: prof. dr. Mindaugas Malakauskas Lietuvos sveikatos mokslų universitetas

Veterinarijos akademija Veterinarijos fakultetas

Maisto saugos ir kokybės katedra

Darbo apimtis 37 puslapiai, 4 lentelės, 9 paveikslai.

Darbo tikslas buvo įvertinti Lietuvoje parduodamų marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumą daţniausiai ţmonių susirgimus sukeliančiomis kampilobakterijų rūšimis. Tyrimų metu buvo ištirti 67 marinuotos paukštienos pusgaminiai. Trijų skirtingų paukštienos gamybos įmonių pusgaminiai tyrimui buvo perkami maţmeninės prekybos įmonėse be išankstinio įspėjimo. Kampilobakterijos buvo išskiriamos tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kampilobakterijos buvo identifikuojamos iki rūšies naudojant šiek tiek pakeistą Wang ir kt. (2002) aprašytą PGR metodą ir pradmenis.

Tyrimai parodė, kad 22 mėginiai (32,8 proc.) iš 67 tirtų marinuotų paukštienos pusgaminių, buvo uţkrėsti kampilobakterijomis. Daţniausiai marinuoti paukštienos pusgaminiai buvo uţkrėsti Campylobacter jejuni rūšies bakterijomis (16 mėginių), tuo tarpu Campylobacter coli bakterijos buvo aptiktos tik 2 mėginiuose, o vienas mėginys buvo uţkrėstas nenustatytos rūšies kampilobakterijomis. Dar dviejuose mėginiuose rastos tiek C. jejuni, tiek ir Campylobacter spp. bakterijos ir viename – C. coli ir nenustatytos rūšies kampilobakterijos.

Tyrimų laikotarpiu iš viso buvo genotipuota 11 C. jejuni padermių, išskirtų iš marinuotų paukštienos pusgaminių. Nustatyti sekų tipai buvo priskirti 5 skirtingiems kloniniams kompleksams (ST-353; ST-21; ST-464; ST-443 ir ST-607), du sekų tipai (3502 ir 6410) nebuvo priskirti jau ţinomiems kloniniams kompleksams. Taip pat 4 C. jejuni padermės buvo priskirtos 3 naujiems iki šiol neuţregistruotiems sekų tipams (6435, 6391 ir 6410). Šie nauji sekų tipai buvo uţregistruoti tarptautinėje Campylobacter Pubmlst duomenų bazėje (http://pubmlst.org/campylobacter/).

5 SUMMARY

Renata Rakštelytė

CONTAMINATION OF MARINATED POULTRY MEAT WITH CAMPYLOBACTER SPP. AND THEIR SPECIES DIVERSITY

Master thesis

Thesis supervisor: prof. dr. Mindaugas Malakauskas Lithuanian University of Health Sciences

Lithuanian Veterinary Academy Faculty of Veterinary

Departament of Food Safety and Quality Kaunas, 2014 m.

The coverage of the work: 37 pages, 4 tables, 9 pictures.

The aim of the study was to evaluate contamination of marinated poultry products with Campylobacter spp. sold at the retail level sale in Lithuania. It total 67 ready-to-cook marinated poultry products were examined. Detection of Campylobacter was carried out using direct plating on mCCDA agar and after enrichment in Bolton broth with further planting on mCCDA. Campylobacter species were identified by PCR method described by Wang et al. (2002 ) with minor changes. Only specific primers for identification of Campylobacter spp., C. jejuni and C. coli were used.

The study showed that out of the 67 tested marinated poultry products 22 (32,8 proc.) were contaminated with Campylobacter spp. Most often marinated poultry preparations were contaminated with C. jejuni (16 samples), while C. coli species were isolated only from 2 samples. Other Campylobacter species then C. jejuni or C. coli was found in one sample, C. jejuni and Campylobacter spp. bacteria were found in two samples and C. coli and unidentified Campylobacter species in one sample, respectively.

Eleven C. jejuni strains isolated from marinated poultry products were selected for Multilocus Sequence Typing (MLST). Genotyping of C. jejuni strains reveled five different clonic complexes (ST -353 , ST - 21 , ST - 464 , ST - 443 and ST -607 ), two types of sequences ( 3502 and 6410 ) were notassign to any identified clonic complexes. Four C. jejuni isolates were assigned to 3 new sequence types ( 6435, 6391 and 6410 ). These new types of sequences have been registered in the international Pubmlst database.

6 SUTRUMPINIMAI

EFSA – Europos maisto saugos tarnyba KSV – kolonijas sudarantys vienetai ES – Europos Sąjunga

ELISA – imunofermentinis metodas PGR – polimerazės grandininė reakcija DNR – deoksiribonukleorūgštis

MLST – daugiaţidininių sekų nustatymo metodas bp – bazių pora

μm – mikrometrai μl – mikrolitrai ml - mililitrai

7 ĮVADAS

Kampilobakteriozė – ţmonių ūmi ţarnyno infekcinė liga, kurią sukelia Campylobacter genčiai priklausančios bakterijos. Nors įvairūs gyvūnai, o ypač naminiai paukščiai, yra daţnai uţsikrėtę kampilobakterijomis, tačiau jie suserga labai retai, bet yra pagrindinis šių patogeninių bakterijų šaltinis. Produkcijos gyvūnų mėsa daţniausiai uţkrečiama kampilobakterijomis skerdimo metu, o maisto produktai – kryţminės taršos būdu. Daţniausiai ţmonių susirgimai kampilobakterioze yra siejami su paukštienos ir jos produktų vartojimu arba su higienos reikalavimų nesilaikymu maisto ruošos metu (Wilson et al., 2008).

Kampilobakteriozė – tai su maistu plintanti zoonozė. Daţniausiai kampilobakteriozę sukelia Campylobacter jejuni ir Campylobacter coli, tačiau yra ir kitų kampilobakterijų rūšių, galinčių sukelti ţmonių susirgimus. Bakterijų kiekis, su maistu patekęs į ţmogaus organizmą ir sukeliantis susirgimą, gali svyruoti nuo 500 iki 1000 ir daugiau bakterijų, ir priklauso nuo amţiaus, organizmo atsparumo, individualių savybių bei kt. Paprastai kampilobaketriozė pasireiškia viduriavimu, pilvo ir galvos skausmais, pykinimu ir vėmimu. Ligos simptomai gali trukti 3 – 5 dienas.

Registruotų ţmonių kampilobakteriozės susirgimų atvejų skaičius 2011 metais ES šalyse pasiekė 220209 atvejus (EFSA, 2013). Lietuvoje kampilobakteriozė yra antra pagal registruojamų susirgimų skaičių ţarnyno infekcinė liga. 2010 metais Lietuvoje šios zoonozės sergamumo rodiklis siekė 32,9 atvejus 100 tūkstančių gyventojų (EFSA, 2010). Tuo tarpu remiantis Europos maisto saugos tarnybos duomenimis paskelbtais 2013 metais, Lietuvoje 2011 metais sergamumo rodiklis padidėjo iki 34,6 atvejų 100 tūkstančių gyventojų (EFSA, 2013). Atsiţvelgiant į paskutinius Europos maisto saugos tarnybos duomenis, paskelbtus šiais metais, kampilobakteriozė yra toliau išlieka išskirtinai dominuojančia zoonoze Europos Sąjungos šalyse. Ţmonių sergamumas kampilobakterioze sudaro 214268 patvirtintus atvejus (EFSA, 2014).

Pasaulyje dauguma kampilobakteriozės atvejų yra siejami su kampilobakterijomis uţkrėstos paukštienos vartojimu. Siekiant sumaţinti ţmonių kampilobakterioze susirgimų riziką, didelis dėmesys yra skiriamas šių bakterijų kontrolei: nuo kampilobakterijų paplitimo broilerių pulkuose kontrolės iki galutinio produkto uţkrėstumo maţinimo (Hannson et al., 2007).

Darbo tikslas: Įvertinti maţmeninėje prekyboje parduodamų marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumą kampilobakterijomis.

8 Darbo uţdaviniai:

 Nustatyti paukštienos pusgaminų uţkrėstumą kampilobakterijomis

 Nustatyti išskirtų kampilobakterijų rūšinę įvairovę

9 1. LITERATŪROS APŢVALGA

1.1. Kampilobakterijų klasifikacija ir savybės

Kampilobakterijos – tai gramneigiamos, judrios, sporų nesudarančios, ţuvėdros ar S formos, termofilinės bakterijos. Kampilobakterijos yra apie 0,2 – 0,9 μm pločio ir apie 0,5 – 5 μm ilgio. Dauguma rūšių turi vieną polinį arba bipolinį ţiuţelį (Virtanen, 2008). Kampilobakterijų augimas ir išlikimas priklauso nuo įvairių veiksnių. Campylobacter spp. yra jautrios aplinkos veiksniams, pvz: aukštai temperatūrai, įprastam atmosferinio deguonies kiekiui, drėgmės trūkumui ir kt. Kampilobakterijos pakaitinus iki 60 °C temperatūros ţūva per 5 min, dţiovinant – per 3 val. Šių bakterijų augimui optimali temperatūra yra 38 – 42 °C (Masteikienė, 2002). Geriausiai jos auga mitybinėje terpėje praturtintoje 5 – 10 proc. krauju, esant maţam deguonies kiekiui. Kampilobakterijos yra mikroaerofilai, geriausiai augantys atmosferoje, kurioje yra apie 10 proc. CO2 ir maţdaug 5 proc. O2 (Gurtler, 2005).

Bakterijos gana ilgą laiką gali išsilaikyti ţemose temperatūros, tačiau yra visiškai neatsparios karščiui. Kampilobakterijos nors ir yra randamos maisto produktuose, tačiau priešingai nei kai kurios kitos bakterijų rūšys, jame nesidaugina. Dėl šios prieţasties masiniai kampilobakteriozės protrūkiai pasitaiko gana retai (Kapperud, 2003). Pagrindinės kai kurių kampilobakterijų rūšių savybės pateiktos 1 lentelėje.

1 lentelė. Kai kurių kampilobakterijų rūšių pagrindinės savybės ( Masteikienė, 2002)

Poţymis

Kampilobakterijų rūšys C.jejuni C.coli C.laridis

C.fetus ssp.fetus C.upsaliensis C.hyoint-estinalis Augimas 25°C temp. - - - + ± ± 23-37°C temp. + + + + + + 42°C temp. + + + ± + + 3,5%NaCl * - - - - - Nitratų redukcija * - + + + + Katalazė + + + + - + Oksidazė + + + + + + Gliukozės utilizavimas * - - - - - Hipurato hidrolizė + - - - - -

10 Pirmą kartą kampilobakterijos buvo išskirtos ir aprašytos 1913 metais.

Sisteminė klasifikacija: Karalystė: Bacteria Tipas: Proteobacteria

Klasė: Epsilonproteobacteria Būrys: Campylobacterales

Šeima: Campylobacteraceae (Vandamme et al., 2008).

Nustatyta, kad Campylobacteraceae šeimai priklauso 17 kampilobakterijų rūšių ir 6 porūšiai (Stephen, 2005). Daţniausiai ţmonėms kampilobakteriozę sukelia C. jejuni (anksčiau ţinoma kaip C. fetus subsp. jejuni) ir C. coli rečiau – Campylobacter upsaliensis, Campylobacter lari ir Campylobacter fetus. Pagrindiniais šių bakterijų šaltiniais yra naminiai ir laukiniai paukščiai, galvijai, avys, kiaulės. Šios kampilobakterijų rūšys ţmonėms gali sukelti gastroenteritą, meningitą, septicemiją. Kai kurie kamienai C. jejuni, C. fetus subsp. venerealis, ir C. fetus subsp. fetus (dar ţinomi kaip C. fetus subsp. intestinalis ir Vibrio fetus var intestinalis) sukelia avių ir galvijų nevaisingumą ir abortus. C. fetus subsp. fetus retkarčiais išsikiriama iš ţmonių, sergančių sepsiu.

1.2. Kampilobakteriozės epidemiologija

Pastaraisiais metais kampilobakteriozė tapo dominuojanti zoonozė Europos šalyse. Sergamumas kampilobakterioze yra uţregistruojamas beveik tris kartus didesnis nei sergamumas salmonelioze (1 pav).

11 2008 metais Europos Sąjungos šalyse uţregistruoti 190 566 kampilobakteriozės atvejai. Daugiausia kampilobakteriozės atvejų uţregistruota Čekijos Respublikoje – 193,3, Jungtinėje Karalystėje – 90,9, Liuksemburge – 90,7, Suomijoje – 84,0, Švedijoje – 83,8. Lietuvoje buvo nustatyti 762 ţmonių susirgimai kampilobaketrioze, kurie sudarė 22,6 atvejo 100000 gyventojų. Vaikai iki 5 metų amţiaus daţniau sirgo kampilobakterioze, lyginant su uţregistruotais kitų amţiaus grupių asmenų susirgimais. 2008 metais uţregistruoti 105 kampilobakteriozės atvejai 100000 gyventojų vaikų iki 5 metų amţiaus grupėje. Kitose amţiaus grupėse kito nuo 30 iki 47 atvejų 100000 gyventojų EFSA, 2010).

2009 metais kampilobakteriozės atvejų buvo uţregistruota 4 proc. daugiau nei 2008 metais. Europos Sąjungos šalyse iš viso buvo uţregistruoti 198 588 kampilobakteriozės atvejai. Didţiausiais sergamumas kampilobakterioze nustatytas Jungtinėse Valstijose ir Vengrijoje. Rumunijoje pastebimas susirgimų kampilobakterioze skaičiaus sumaţėjimas. Taip pat nustatyta, kad didţiausias ţmonių sergamumas buvo pastebimas vasaros mėnesiais, o rugsėjo – gruodţio mėnesiais nustatytas susirgimų atvejų maţėjimas.

2010 metais pastebima susirgimų kampilobakterioze skaičiaus augimo tendencija. Iš viso ES uţregistruoti 212 064 ţmonių kampilobakteriozės atvejai, t.y. 6,7 proc. atvejų daugiau nei 2009 metais. 2010 metais Lietuvoje šios zoonozės sergamumo rodiklis buvo 32,9 atvejai 100 tūkstančių gyventojų. Atlikti tyrimai parodė, kad kampilobakterijos buvo nustatytos švieţioje paukštienoje, kiaulienoje, jautienoje, piene ir pieno produktuose. Nustatyta, kad produktai daugumoje buvo uţteršti C. jejuni (EFSA, 2012).

Europos maisto saugos tarnybos duomenimis paskelbtais 2013 metais, Lietuvoje sergamumo rodiklis 2011 metais padidėjo iki 34,6. Registruotų ţmonių kampilobakteriozės susirgimų atvejų skaičius 2011 metais ES šalyse pasiekė 220209 atvejus. Lietuvoje kampilobakteriozė yra antra pagal registruojamų susirgimų skaičių ţarnyno infekcinė liga (EFSA, 2013).

Remiantis naujausiais Europos maisto saugos tarnybos duomenimis paskelbtais šiais metais, kampilobakteriozė ir toliau yra dominuojanti zoonozė Europos šalyse. Tačiau lyginant su 2013 metų duomenimis, 2012 sergamumas kampilobakterioze sumaţėjo 4,3 proc. ir sudaro 214268 patvirtintus atvejus (2 lentelė.).

12 2 lentelė Kampilobakteriozės atvejų skaičius 2008 – 2012 metais ES šalyse (EFSA, 2014)

2011 metai 2010 metai 2009 metai 2008 metai

Austrija 4992 4710 55,79 5129 4404 4502 4280 Belgija 6607 6607 - 7716 6047 5697 5111 Bulgarija 97 97 1,32 73 6 26 19 Kipras 68 68 7,89 62 55 37 23 Čekijos Respublika 18412 18287 174,08 18743 21075 20259 20067 Danija 3720 3720 66,66 4060 4037 3353 3470 Estija 268 268 20,01 214 197 170 154 Suomija 4251 4251 78,7 4262 3944 4050 4453 Prancūzija 5079 5079 38,89 5538 4324 3956 3424 Vokietija 62880 62504 76,54 70812 65110 62787 64731 Graikija - - - -Vengrija 6384 6367 65,1 6121 7180 6579 5516 Airija 2392 2391 52,17 2433 1660 1810 1752 Italija 774 774 1,27 468 457 531 265 Latvija 8 8 0,39 7 1 0 0 Lietuva 917 917 30,49 1124 1095 812 762 Liuksemburgas 581 581 110,7 704 600 523 439 Malta 220 214 51,26 220 204 132 77 Olandija 4248 4248 48,83 4408 4322 3782 3341 Lenkija 431 431 112 354 367 359 270 Portugalija - - - -Rumunija 92 92 0,43 149 175 254 2 Slovakija 5844 5704 105,55 4565 4476 3813 3064 Slovėnija 983 983 47,83 998 1022 952 898 Ispanija 5488 5488 47,53 5469 6340 5106 5160 Švedija 7901 7901 83,32 8214 8001 7178 7692 Jungtinė Karalystė 72578 72578 117,43 72150 70298 65043 55609 VISO: 215215 214268 55,49 220209 215397 198725 190579

Patvirtintų atvejų skaičius Šalies pavadinimas 2012 metai Atvejų skaičius Patvirtintų atvejų skaičius Patvirtintų atvejų skaičius 100000 gyventojų 1.2.1. Ţmonių kampilobakteriozė

Kampilobakteriozė – tai ţarnyno infekcinis susirgimas, kurį sukelia Campylobacter rūšies bakterijos. Nors įvairūs gyvūnai, o ypač naminiai paukščiai, yra daţnai uţsikrėtę kampilobakterijomis, tačiau jie suserga labai retai, bet yra pagrindinis šių patogenų šaltinis. Maisto ţaliavos daţniausiai

13 uţkrečiamos kampilobakterijomis skerdimo metu, o maisto produktai kryţminės taršos būdu. Daţniausiai ţmonių susirgimai kampilobakterioze yra siejami su paukštienos ir jos produktų vartojimu arba su higienos reikalavimų nesilaikymu maisto ruošos metu (2 pav.) (Wilson et al., 2008).

2 pav. Kampilobakterijų plitimo būdai (Young et al., 2007)

Epidemiologiniai ligonių apklausos duomenys rodo, kad ţarnyno infekcine liga sirgę asmenys galėjo kampilobakterioze uţsikrėsti darbo vietoje, gydymo įstaigose, maitinimo, socialinės globos įstaigose, vaikų ugdymo įstaigose bei mokyklose, namuose ir kelionių metu kitose uţsienio šalyse. Tačiau daţniausiai (nuo 58,6 iki 75,1 proc. susirgusių asmenų) buvo uţsikrečiama namų aplinkoje – per buitinį sąlytį ar nuo namuose paruošto ir vartoto maisto (Belskij et al., 2013).

Pagrindinis kampilobakteriozės sukėlėjas yra C. jejuni ir C. coli rūšies bakterijos. Nustatyta, kad C. jejuni sukelia apie 90 proc. ţmonių kampilobakteriozės atvejų, rečiau susirgimus sukelia C. coli, C. lari, C. upsaliensis, C. fetus (Wiedman et al., 2012).

Dauguma susirgimų atvejų yra sporadiniai. Daţniausiai kampilobakterioze serga maţi vaikai ir asmenys nuo 18 iki 29 metų. Ţmogui susirgti pakanka net ir labai maţos dozės – 400 – 500 bakterijų. Ligos simptomai paprastai pasireiškia po 2 – 5) dienų po uţsikrėtimo. Sunkiais atvejais susirgimas gali uţsitęsti iki 3 savaičių. Nustatyta, kad maţdaug 25 proc. sergančių asmenų pasireiškia sunki ligos eiga. (Djenane et al., 2011). Liga pasireiškia viduriavimu (daţnai su krauju), pilvo, galvos skausmais, pykinimu ar vėmimu. Kampilobakteriozė gali komplikuotis sepsiu, kepenų, kasos uţdegimu, Guillan – Barre sindromu. Kai kurie C. jejuni serotipai yra glaudţiai susiję su Guillan – Barre sindromu (Van Belkum et al., 2008).

14 1.2.2. Maistui auginamų gyvūnų kampilobakteriozė

Daugelis gyvūnų rūšių, įskaitant galvijus, avis, vištas, kalakutus, kiaules yra pagrindiniai kampilobakterijų nešiotojai. Pagrindinių kampilobakterijų rūšių šaltiniai pateikiami 3 lentelėje.

3 lentelė. Pagrindiniai kampilobakterijų šaltiniai (Blaser et al., 2008; Lastovica et al., 2008) Nr. Kampilobakterijų rūšys Pagrindiniai kampilobakterijų šaltiniai

1. C. jejuni Naminiai ir laukiniai paukščiai, galvijai,

kiaulės, avys, pienas, vanduo

2. C .coli Kiaulės, galvijai, naminiai ir laukiniai paukščiai

3. C. fetus subsp. venerealis Galvijai

4. C. fetus subsp. fetus Avys, galvijai

5. C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis Kiaulės, galvijai, elniai

6. C. lari Laukiniai ir naminiai paukščiai, vanduo, katės,

šunys, beţdţionės, ruoniai

7. C. sputorum Galvijai, kiaulės, avys

8. C. hyointestinalis subsp. lawsonii Kiaulės

9. C. hyoilei Kiaulės

10. C. upsaliensis Laukiniai paukščiai, katės, šunys, beţdţionės

11. C. mucosalis Kiaulės

Gyvūnai kampilobaketrioze gali uţsikrėsti tiesioginio kontakto su sergančiu gyvūnu metu, tai pat per išmatomis uţterštus pašarus, vandenį. Daugeliui uţsikrėtusių gyvūnų infekcijos simptomai gali būti nepastebimi. Klinikiniai simptomai daţniau pasireiškia jauniems gyvūnams iki 6 mėnesių amţiaus. Pagrindinis infekcijos poţymis yra viduriavimas (daţnai su krauju). Taip pat gali pasireikšti anoreksija, vėmimas (Fulford, 2010). C. fetus subsp veneralis galvijams paţeidţia lytinius organus ir perduodama veisiant uţsikrėtusius, ir sveikus galvijus. Dėl C. fetus subsp veneralis sukeltos infekcijos

15 karvėms gali pasireikšti abortai. C. jejuni yra glaudţiai susijusi su avių, oţkų, galvijų ir kiaulių kampilobakterioze. C. jejuni taip pat kaip ir C. fetus gali sukelti abortus, o galvijams gali pasireikšti ir mastitas (Carlto et al., 2008).

1.3. Maisto ţaliavų ir produktų uţkrėstumas kampilobakterijomis 1.3.1. Mėsos uţkrėstumas kampilobakterijomis

Kiaulės ir galvijai yra laikomi kampilobakterijų nešiotojais, todėl tiek kiaulių, tiek ir galvijų mėsa gali būti uţkrėsta bakterijomis. Nustatyta, kad kiaulių ir galvijų skerdenoje kampilobakterijų paplitimas nėra toks didelis, lyginant su paukštiena.

Galvijų ūkiuose ir bandose kampilobakterijų paplitimas sudaro 12 proc. – 100 proc., o remiantis tyrimų, atliktų galvijų skerdyklose, duomenimis Campylobacter spp. populiacija kinta tarp 12,5 proc. – 89,4 proc. (Parisi et al., 2007). C. jejuni yra dominuojanti kampilobakterijų rūšis galvijų ūkiuose ir skerdyklose.

Skerdţiant galvijus skerdiena gali būti uţkrėčiama kampilobakterijomis, kai šalinant vidaus organus yra paţeidţiamas ţarnynas, taip pat lupant odą per įrankius ir įrangą ar per darbuotojus (Hakkinen et al., 2007). Remiantis įvairių tyrimų duomenimis galvijų skerdenos uţkrėstumas Campylobacter spp. sudaro apie 9,3 proc (Erick et al., 2013).

Nielsen (1999) nustatė, kad tiek ţmonės, tiek ir galvijai gali uţsikrėsti vienodomis kampilobakterijų padermėmis, o Kramer et al. (2000) nustatė ryšį tarp ţmonių ir avių uţsikrėtimo vienodomis Campylobacter spp. padermėmis.

Atlikti tyrimai siekiant nustatyti Campylobacter spp. paplitimą įvairiose gyvūnų rūšyse, parodė, kad paršavedės platina infekcinės ligos sukėlėjus (Hume et al., 2002). Paršeliai kampilobakterijų platintojais tampa praėjus vienai savaitei po gimimo. Farzan et al. (2010) nustatė, kad paršeliams pasiekus 14 savaičių amţių kampilobakterijų populiacija padidėja iki 15 proc. Todėl paršelių nujunkymas padeda sustabdyti kampilobakterijų plitimą.

Vokietijoje atliktas tyrimas parodė, kad pavieniais atvejais kiaulių ūkiuose kampilobakterijas gali platinti grauţikai. Kiaulių gardų valymas sumaţina bakterijų plitimą nuo 9,2 proc. iki 1,6 proc. (Alter et al., 2005). Transportuojant kiaules, kai jos yra nešeriamos 48 valandas, kampilobakterijų skaičius padidėja nuo 5 iki 7,2 log10 KSV.

16 C. coli yra dominuojanti kampilobakterijų rūšis tiek gyvose kiaulėse, tiek ir skerdenoje. Kampilobakterijų paplitimas kiaulienoje siekia apie 10,6 proc. (Aquino et al., 2002). Tačiau lyginant su kitais atliktais tyrimais, Steinhauserova et al. (2005) ir Malakauskas ir kt. (2006) atlikę tyrimus nustatė, kad kampilobakterijų kiekis kiaulienoje svyruoja nuo 34 proc. iki 63,6 proc.

Plikinimas, svilinimas padeda sumaţinti kampilobakterijų skaičių. Į plikinimo vandenį 30 minučių pridėjus 0,05 proc. vandenilio peroksido ant skerdenos paviršiaus yra sumaţinamas mezofilinių ir psichrofilinių bakterijų skaičius (De Melo et al., 2009). Kampilobakterijos yra jautrios dţiovinimui ir ţemai temperatūrai, todėl atšaldymas yra veiksminga priemonė maţinant skerdenos uţkrėstumą. Pearce et al. (2003) teigia, kad skerdenos atšaldymas sumaţina kampilobakterijų paplitimą nuo 7 proc. iki 0 proc.

Nors maţmeninėje prekyboje parduodamos kiaulienos uţkrėstumas Campylobacter spp. nėra didelis, tačiau vartojant tokią produkciją, galimybė susirgti kampilobakterioze išlieka.

1.3.1.1. Paukštienos uţkrėstumas

Paukščiai yra laikomi kampilobakterijų rezervuaru. Daugelis atliktų tyrimų rodo, kad pagrindinis rizikos veiksnys yra kampilobakterijų patekimas į broilerių pulkus. Bakterijoms patekus į paukščių pulkus, jos greitai išplinta ir uţkrečiami visi pulke esantys paukščiai. Paukščių natūrali kūno temperatūra – 42 °C, kuri yra tinkama kampilobakterijų dauginimuisi. Paukščiai tampa bakterijų nešiotojais bei platintojais, uţteršia aplinką infekcinės ligos sukėlėjais.

Kai kurių šaltinių duomenys rodo, kad paukščiai uţsikrečia nuo fekalijomis uţteršto vandens. Todėl paukštynuose ypatingai svarbi pastatų higieninė būklė, vandens, pašarų ir paukščių gerovė. Paukščiai, kurie yra sergantys, prastos sveikatos būklės, prieš skerdimą patiriantys stresą, alkinimą yra labiau apsikrėtę kampilobakterijomis. Nemaţiau svarbu ir paukščių skerdimo higiena, kuri labai lemia skerdenų uţsikrėtimą kampilobakterijomis.

Nustatyta, kad kampilobakterijų paplitimas paukščių pulkuose sudaro 5 – 90 proc. Šiltuoju metų laiku pastebimas kampilobakterijų paplitimo broilerių pulkuose pikas. Manoma, kad tai yra susiję su didesniu paukštidţių ventiliavimu. Kudirkienė ir kt. (2009) ištyrė 42 broilerių pulkus uţaugintus 9 Lietuvos paukštynuose, nustatė, kad 31 broilerių pulkas buvo uţkrėstas C. jejuni bakterijomis ir 17 pulkų buvo nustatyta C. coli bakterijos. Broilerių pulkų uţkrėstumas C. jejuni ir C. coli bakterijomis atitinkamai sudarė 73,8 proc. ir 40,48 proc.

17 Arsenault et al. (2007) nustatė, kad Campylobacter spp. paplitimas kalakutų pulkuose yra apie 48 proc. Taip pat pastebėta, kad vandens chloravimas padeda sumaţinti kampilobakterijų paplitimą.

Skerdţiant paukščius kampilobakterijos patenka ant skerdenos. Kampilobakterijų kiekis broilerių skerdenoje priklauso nuo kampilobakterijų paplitimo skerdţiamame pulke. Kuo didesnis kampilobakterijų paplitimas broilerių pulkuose, tuo didesnė skerdenų tarša kampilobakterijomis (Rosenquist et al., 2006). Plikinant yra neišvengiama taršos rizikos, kadangi vanduo uţteršiamas kampilobakterijomis nuo paukščių plunksnų. Todėl po plikinimo proceso skerdenėlės uţkrėtimas kampilobakterijomis gali padidėti 2 – 7 kartus. Broilerių skerdimo metu, ypač jei paţeidţiamas skerdţiamų broilerių ţarnynas ţarnų šalinimo proceso metu, bakterijos patenka į aplinką bei uţkrečia skerdenėlę (Allen et al., 2007). Kryţminis uţsikrėtimas, kai C. jejuni iš broilerių išmatų ir skerdyklos aplinkos patenka ant skerdţiamų broilerių skerdenų, yra svarbiausias galutinių broilerių mėsos produktų uţsikrėtimo kelias skerdykloje.

2012 metais ES, Islandijoje ir Norvegijoje, tiriant švieţios paukštienos uţkrėstumą kampilobakterijomis, nustatyta 46,3 proc. teigiamų mėginių. C. jejuni sudarė 81,1 proc., C. coli – 6,2 proc., C. lari – 0,2 proc., C. upsaliensis – 0,06 proc., C. fetus – 0,01 proc.. Kampilobakterijų rūšis nebuvo nustatyta 12,4 proc. teigiamų mėginių (3 pav.).

.

3 pav. Kampilobakterijų rūšinė įvairovė (proc.) švieţioje broilerių mėsoje 2012 metais ES šalyse, Islandijoje ir Norvegijoje (EFSA, 2014)

18 Siekiant sumaţinti paukštienos uţkrėstumą kampilobakterijomis, pirmiausiai reikia kontroliuoti kampilobakterijų paplitimą pulkuose, taikant įvairias biosaugos priemones. Nustatyta, kad skerdenų tarša kampilobakterijomis yra tiesiogiai priklausoma nuo tinkamo skerdenos atšaldymo. Skerdenų atšaldymas yra efektyvesnė priemonė sumaţinti kampilobakterijų skaičių, negu jų apdorojimas chloruotu vandeniu (Berrang et al., 2007). Nors ir uţšaldymas ţenkliai sumaţina kampilobakterijų kiekį, tačiau nustatyta, kad kampilobakterijos šaldytoje paukštienoje gali išgyventi gana ilgą laiką, todėl vartojant nepakankamai apdorotą paukštieną, išlieka rizika susirgti kampilobakterioze.

1.3.2. Kitų maisto ţaliavų ir produktų uţkrėstumas

Campylobacter spp. yra aptinkama pieninių galvijų ţarnyne, todėl kampilobakterijos gali būti randamos ţaliame piene kaip fekalinio uţterštumo padarinys. Retais atvejais kampilobakterijos gali patekti į pieną dėl sukelto besimptomio mastito. Sveiki galvijai gali būti kampilobakterijų rezervuarais. Wesley et al. (2000) atlikę tyrimus nustatė, kad C. jejuni ir C. coli paplitimas piene kinta nuo 5 proc. iki 53 proc. ir priklauso nuo galvijų amţiaus, sezono ir tyrimo metodų. Campylobacter spp. paplitimas pieninių ir mėsinių galvijų ūkiuose yra susijęs ne tik su pieno ir skerdenos uţkrėtimu, bet ir patekimu į paviršinius vandenis, per ūkių nutekamuosius vandenis ir srutų patekimu į aplinką. Pagal Wesley et al. (2000) nustatytus C. jejuni genotipus gruntiniame vandenyje ir pieninių galvijų mėginiuose yra glaudus ryšys tarp vandens uţkrėtimo kampilobakterijomis ir galvijų.

Uţterštas geriamasis vanduo taip pat yra viena iš kampilobakteriozės protrūkių prieţasčių. Pastebima, kad ţmonės gyvenantys miestuose daţniau kampilobakterioze uţsikrečia per kampilobakterijomis uţkrėstą vandentiekio vandenį. Tačiau Šiaurės šalyse, maţesnėse gyvenvietėse, susergama vartojant gruntinį vandenį uţkrėstą C. jejuni rūšies bakterijomis (Miettinen et al., 2001; Hanninen et al., 2003). Perz – Boto et al. (2010) tyrė šulinių vandenį, netoli paukštininkystės ūkių ir šiuose ūkiuose laikomų paukščių išmatas. Iš mėginių buvo išskirtos C. jejuni ir C. coli bakterijos, ir atliekamas genotipavimas naudojant flaA geną. Gauti tyrimų rezultatai parodė, kad nustatytas C .coli genotipas vyravo tiek šulinių vandenyje, tiek ir paukščių išmatose.

Campylobacter spp. daţniausiai yra randamos paviršiniame vandenyje, taip pat rekreacijos vandenyse. Tačiau yra manoma, kad rekreaciniai vandenys retais atvejais yra susiję su kampilobakteriozių protrūkiais. Geriamasis upelio vanduo kalnuose galėtų būti Campylobacter spp. šaltinis, susijęs su rekreacine veikla. Taip pat rizikos faktoriumi yra laikoma maudynės eţeruose, upėse ar jūrose (Schönberg-Norio et al., 2004).

19 Retesniais atvejais kampilobakterijos gali būti randamos jūros vandenyje, todėl kai kurie dvigeldţiai moliuskai, pvz.: austrės, gali būti uţkrėsti kampilobakterijomis. Wagenaar et al. (2006) atlikti tyrimai parodė, kad daţniausiai C. lari, retesniais atvejais C. jejuni ir C. coli, į jūros vandenis patenka kartu su ţuvėdrų išmatomis.

Vieni mokslininkai teigia, kad susirgimas kampilobakterioze, kuris susijęs su ţuvies vartojimu, pasitaiko labai retais atvejais ir ţuvis, ir ţuvies produktai nėra laikomi kampilobakterijų šaltiniu. Taip pat atvejo – kontrolės studijos rodo, kad ryšys tarp ţuvies bei ţuvies produktų vartojimo ir rizikos susirgti kampilobakterioze yra neţymus. Tačiau Roels et al. (1998) aprašė atvejį, kurio metu ţmonės, vartoję tuno salotas, susirgo kampilobakterioze. Taip pat, buvo nustatyta, kad infekciją sukėlė C. coli bakterijos. Novotny et al. (2004) teigia, kad ţuvies uţkrėstumas kampilobakterijomis svyruoja tarp 0,8 proc. ir 2,8 proc.

1.4. Kampilobakterijų aptikimas ir identifikavimas

Greiti ir tikslūs kampilobakterijų identifikavimo metodai yra reikalingi skiriant gydymą kampilobakteriozės atveju ir siekiant išvengti ligos protrūkio. Dabartiniai kampilobakterijų identifikavimo metodai remiasi bakterijų augimu ant selektyvių terpių jas pagausinant arba ne.

Nuo 1970 m. vidurio pradėjo plisti kampilobakterijų identifikavimas imunofermentiniu metodu (ELISA). Imunofermentinis ELISA metodas paremtas antigeno ir antikūno specifine sąveika, kai vienas iš reakcijos komponentų mobilizuotas ant tvirto paviršiaus. Reakcijos metu susidariusį imuninį kompleksą atpaţinti padeda indikatorinis fermentas, sujungtas arba su antigenu, arba su antikūnais. Imuninės reakcijos rezultatai vertinami specialiu spektrofotometru. Naudojant imunofermentinį ELISA metodą, galima greitai gauti informaciją apie antigenų ir antikūnų reakciją. Šiai reakcijai atlikti pakanka keleto valandų, be to, jos rezultatai yra labai tikslūs.

2001 metais grupė mokslininkų taikydami PGR – ELISA metodą įrodė, kad šiuo metodu galima ne tik aptikti kampilobakterijas, bet ir identifikuoti C. jejuni ir C. coli pagausintuose paukštienos gaminiuose (Grennan et al., 2001).

Serologiniai testai gali būti naudojami kampilobakterijų, kaip infekcijos sukėlėjų, nustatymui. Metodas remiasi ELISA metodo principu. Pirmąsias infekcijos savaites IgA grupės specifinių Campylobacter spp. antikūnių daugiausiai randama kraujo serume ir išmatose. Vėliau pastebimas IgG,

20 IgM, IgA imunoglobulinų kiekio kraujo serume didėjimas. Metodas gali būti naudingas tiriant kampilobakterijų etiologiją.

Kasdieninėje klinikinėje mikrobiologijoje kampilobakterijų rūšies identifikavimas vykdomas pagal fenotipinius metodus. Hipurato hidrolazės aktyvumo testas leidţia atskirti C. jejuni nuo kitų kampilobakterijų rūšių (Jensen et al., 2005). Tačiau kai kurie tyrimai rodo, kad ne visada C. jejuni pasireiškia hipurato aktyvumas. Wainø et al. (2003) atliko tyrimą, kurio metu identifikavo kampilobakterijų rūšis, išskirtas iš broilerių, taikydami fenotipinius metodus. Jų tyrimai parodė, kad 1,6 proc. – 13,4 proc. C. jejuni parodė neigiamą hipurato aktyvumą.

Biocheminiai testai, tokie kaip katalazės ar citochromoksidazės testai, leidţia nustatyti C. jejuni, C. coli, C. lari.

PGR metodo atradimas sukėlė tikrą revoliuciją molekulinės biologijos technologijų, taikomų biologijos bei medicinos mokslų tyrimuose, medicininėje diagnostikoje bei teismo medicinos praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika, leidţianti padauginti DNR fragmentus nuo pikograminių iki mikrograminių kiekių. Ţurnalas “Science” 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu metų mokslo įvykiu. PGR metodo esmė yra individo DNR fragmento padauginimas, dalyvaujant fermentui polimerazei. Reakcijos principas lygiai toks pat kaip ir ląstelės dalijimosi metu. Tik šiuo atveju viskas vyksta in vitro, mėgintuvėlyje. PGR vyksta automatiškai ciklais. Susintetintų fragmentų skaičius su kiekvienu ciklu dvigubėja, t.y. didėja geometrinė progresija ir per 25 ciklus, kurių kiekvieno trukmė 1-3 min., padidėja apie 1 mln. kartų. Taigi, turint vienos ląstelės genetinę medţiagą, naujaisiais PGR metodais per 30-35 ciklus galima gauti tokį produkto kiekį, kurio pakanka daugeliui tolimesnių tyrimo etapų (Ambrasienė, 2007).

Tai ypač tikslus, greitas ir jautrus metodas. Iki šiol nebuvo tokio metodo, kuriam reiktų tiek maţai tiriamosios medţiagos. PGR pakanka kelių ląstelių. Kitas metodo privalumas – didelis specifiškumas. Reakcijos sąlygos sumodeliuojamos taip, kad būtų dauginamas tik ieškomas DNR fragmentas. Didţiulis metodo jautrumas kelia ir problemų: reikia labai saugotis, kad į reakcijos mišinį nepatektų šalutinės DNR priemaišos (Matsune et al., 2007).

Plačiai taikomas modifikuotas PGR metodas – dauginė PGR. Metodo privalumas yra tai, kad gausinimo reakcijos metu padauginama ne viena, o keletas DNR sekų. Dauginės PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dėmesio reakcijos sąlygų optimizacijai. Tai pradmenų koncentracija, PGR buferio sudėtis, magnio chlorido ir nuleozidtrifosfatų (dNTP) koncentracijų balansas, DNR mėginio ir termostabilių polimerazių koncentracija bei gausinimo reţimas. Sėkminga dauginių PGR optimizacija

21 padidina reakcijos jautrumą, specifiškumą, pagerina netolygų analizuojamų sričių gausinimo efektyvumą.

22 2. TYRIMO METODAI

2.1. Mėginių rinkimas ir kampilobakterijų aptikimas

Tyrimams buvo pasirinkta trijų skirtingų paukštienos gamintojų marinuoti paukštienos pusgaminiai. Šie broilerių pusgaminiai buvo įsigyjami maţmeninės prekybos vietose Kauno mieste. Tyrimų laikotarpiu iš viso buvo surinkti ir ištirti 67 marinuotos paukštienos pusgaminių mėginiai, iš kurių: marinuoti sparneliai – 42 mėginiai, vištienos filė troškinys – 12 mėginių, marinuota broilerių filė – 6 mėginiai, marinuota blauzdelė – 4 mėginiai, marinuota šlaunelė su nugaros dalimi – 1 mėginys, broilerių ketvirčiai – 1 mėginys, marinuota broilerių krūtinėlė – 1 mėginys.

Surinkti mėginiai buvo tiriami kampilobakterijų atţvilgiu. Kampilobakterijos buvo išskiriamos tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Kiekvienas mėginys atskirai buvo uţpilamas buferiniu peptono vandeniu (BPV): jei buvo tiriamas marinuotas sparnelis ar blauzdelė – uţpilama 100 ml BPV, o jeigu 10 g marinuotos filė – 90 ml BPV ir homogenizuojama 1 min. Tolimesniam tyrimui į lėkšteles paruoštas su selektyvia mCCDA terpe buvo pasėta atitinkamai po 0,1 ml mėginio. Uţsėtos lėkštelės buvo inkubuojamos 37 ºC temperatūroje 48 valandas mikroaerofilinėmis sąlygomis. Po inkubacijos lėkštelėse su mCCDA buvo atrenkamos kampilobakterijoms būdingos kolonijos ir bakterijos patikrinamos vertinant jų morfologiją ir judrumą. Po to, iš kiekvienos lėkštelės buvo atrenkama iki 2 kolonijų ir kiekviena kolonija pasėjama į lėkšteles su kraujo agaru, praturtintu 5 proc. arklio krauju ir inkubuojama 37 ºC, 48 val. Po inkubavimo gryna kultūra buvo saugoma – 80 ºC temperatūroje smegenų ir širdies sultinyje su 30 proc. glicerolio priedu. Kiekvienas mėginys, siekiant aptikti ir nedidelius kiekius kampilobakterijų, atitinkamai buvo pagausinamas Bolton sultinyje. Į sterilius mėgintuvėlius su 9 ml selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu buvo įpilama 1 ml prieš tai paruošto mėginio su BPV. Mėgintuvėliai su pagausinimo sultiniu buvo inkubuojami mikroaerofilinėmis sąlygomis, 42 ºC, 24 val. Po inkubacijos 0,1 ml sultinio buvo sėjama į lėkšteles su mCCDA agaru. Preliminarių kampilobakterijų kolonijų nustatymas ir išgryninimas buvo atliekamas taip pat kaip aprašyta anksčiau.

23 2.2. Kampilobakterijų identifikavimas

DNR išskyrimas. Nuo 48 val. inkubuotos lėkštelės su kraujo agaro baze buvo surenkama pilna kilpelė (apie 1 μl) grynos kampilobakterijų kultūros ir perkeliama į mėgintuvėlį su 200 μl PrepMan reagentu. Mėgintuvėliai buvo maišomi naudojant Vortex tipo purtyklę 10-30 sekundţių, kad bakterijos pasiskleistų skiediklyje. Tuomet, taip paruoštas tirpalas buvo kaitinamas termomikseryje 100 ºC 10 min., po to 3 min. centrifuguojamas 16 000 aps./min. greičiu. Gautas supernatantas buvo perkeliamas į naują mėgintuvėlį ir uţšaldomas -20 ºC iki tolesnio tyrimo.

Kampilobakterijų identifikavimas naudojant dauginę PGR. Kampilobakterijos buvo identifikuojamas iki rūšies naudojant šiek tiek pakeistą Wang et al. (2002) aprašytą metodą ir pradmenis. Atliekant dauginę PGR buvo naudojama viena pradmenų pora (23SF ir 23SR) patvirtinti Campylobacter genčiai (650 bp) ir dvi pradmenų poros (CJF ir CJR; CCF ir CCR) nustatyti C. jejuni (323 bp) ir C. coli rūšis (126 bp).

PGR reakcijos mišinio kiekis vienai reakcijai atlikti buvo 25 μl. PGR mišinys buvo ruošiamas iš 2,5 μl 10X reakcijos buferio, 2,5 25 μl mM MgCl2, 2 μl 2 mM dNTP mišinio, 1,0 μl 100 μM pradmenų mišinio, 0.25 μl HotStart Taq DNR polimerazės, 15,75 μl sterilaus bidistiliuoto H2O. Gauti PGR produktai buvo analizuojami 1,3 proc. agarozės gelyje elektroforezės pagalba. Po 11 μl kiekvieno PGR produkto buvo pakraunama į 1,3 proc. agarozės gelį su 0,05 μl /ml etidţio bromido tirpalu. PGR rezultatai vertinami padarius nuotraukas UV šviesoje.

2.3. Kampilobakterijų genotipavimas daugiaţidininių sekų nustatymo metodu (MLST) Siekiant įvertinti kampilobakterijų genetinę įvairovę buvo atliktas kai kurių išskirtų C. jejuni padermių genotipavimas daugiaţidininių sekų nustatymo metodu (Dingle et al., 2001), kuris pagrįstas septynių struktūrinių genų (aspA, pgm, tkt, glnA, gltA, uncA, glyA) nukleotidų sekų palyginimu.

Vienai reakcijai atlikti buvo naudojama 25 μl Dream Taq Green PCR mišinio, 2,5 μl pradmenų poros mišinio, 8 μl sterilaus bidistiliuoto H2O. Pasigaminto mišinio po 23 μl išpilstomi į PGR paţymėtus mėgintuvėlius, maišant antgaliu pridedama 2,0 μl DNR. Kiekvienam genui amplifikuoti buvo naudojamas atitinkamų pradmenų L ir R sekų miksas: aspA-L (5’-CAACTKCAAGATGCWGTACC-3’), aspA-R 5’-ATCWGCTAAAGTATRCATTGC-3’), pgm-L (5’-GCTTATAAGGTAGCWCCKACTG-3’), pgm-R (5’-AATTTTCHGTTCCAGAATAGCG-3’), tkt-L (5’-AAAYCCMACTTGGCTAAACCG-3’), tkt-R (5’-TGACTKCCTTCAAGCTCTCC-3’),

24

glnA-L (5’-ACWGATATGATAGGAACTTGGC-3’), glnA-R

GYTTTGGCATAAAAGTKGCAG-3’), gltA-L TATCCTATAGARTGGCTTGC-3’), gltA-R (5’-AGCGCWCCAATACCTGCTG-3’), uncA-L (5’- CAAAAGCAAAGYACAGTGGC-3’), uncA-R (5’-CTACTTGCCTCATCYAAATCAC-3’), glyA-L (5’-AGGTTCTCAAGCTAATCAAGG-3’), glyA-R (5’-CATCTTTTCCRCTAAAYTCACG-3’). PGR mėgintuvėliai su paruoštu reakcijos mišiniu patalpinami į termociklerį ir nustatomos šios PGR reakcijos sąlygos: 1. 96 o

C – 9 min. 2. 94 oC – 0,5 min. 3. 52 oC – 0,5 min. 4. 72 oC – 1 min. 2 – 4 ţingsniai kartojami 30 ciklų. 5. 72 oC – 7 min. 6. 4 oC – ∞. Gauti PGR produktai buvo analizuojami 2proc. agarozės gelyje elektroforezės pagalba. Amplifikuotų genų dydis:

 aspA – 594 bp  pgm – 685 bp  tkt – 606 bp  glnA – 712 bp  gltA – 567 bp  uncA – 623 bp  glyA – 701 bp

Susidarių PGR produktų išgryninimas, paruošimas sekvenavimui bei sekvenavimas. PGR produktai buvo išgryninami naudojant GeneJET PCR išgryninimo rinkinį. Į PGR mėgintuvėlį pridedama 20 μl surišimo buferio ir visas mėgintuvėlio turinys perkeliamas į 1,5 μl mėgintuvėlius su valymo kolonėle, kurie 1 min. centrifuguojami 16 000 aps./min. greičiu. Į tą patį mėgintuvėlį pridedama 700 μl praplovimo buferio ir mėgintuvėlis 1 min. centrifuguojamas 16 000 aps./min. greičiu. Valymo kolonėlė perkeliama į naują 1,5 μl mėgintuvėlį, pridedama 25 μl sterilaus distiliuoto vandens ir 1 min. centrifuguojama 16 000 aps./min. greičiu. Valymo kolonėlė pašalinama iš mėgintuvėlio. Išgryninus produktą pamatuojama jo DNR koncentracija ir taip paruošti mėginiai siunčiami sekvenavimui į GATC Biotech AG (Vokietija).

2.4. Statistinė duomenų analizė

Statistiškai duomenys buvo apdorojami statistiniais, Microsoft Office Excel 2007, SPSS 16.0 programiniais paketais.

Siekiant išsiaiškinti veiksnių įtaką priklausomam kintamajam buvo taikoma daugiafaktorinė dispersinė analizė (ANOVA). Vertinant skirtumus tarp nepriklausomų, neparametrinius duomenis turinčių imčių buvo skaičiuojamas chi-kvadratas.

25

3.

3.1. Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis

Tyrimų laikotarpiu buvo ištirta 67 trijų skirtingų gamintojų marinuotos paukštienos mėginiai (4 pav.)

4 pav. A, B, C gamintojų marinuotos paukštienos pusgaminių skaičius

Atlikti tyrimai parodė, kad iš tirtų 67 marinuotos paukštienos pusgaminių mėginių, kampilobakterijomis buvo uţkrėsti 32,8 proc. marinuotų paukštienos pusgaminių (4 lentelė). Palyginus su kitų tyrimų duomenimis, Lietuvoje parduodamų marinuotos paukštienos pusgaminių uţkrėstumas yra gana daţnas, nes pavyzdţiui Suomijoje, nustatytas tik 9,5 proc. tokių gaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis (Katzav et al., 2008). Nustatyta, kad marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas tarp A, B ir C gamintojų buvo reikšmingai skirtingas (χ2

=16,39, df=2, p=0,01). Daugiausiai kampilobakterijomis uţkrėstų mėginių nustatyta įmonės C pagamintoje produkcijoje – 44,85 proc., iš kurių 10,34 proc. kampilobakterijos išskirtos tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro, o atlikus pagausinimą Bolton sultinyje rasta 34,82 proc. uţkrėstų paukštienos mėginių. Įmonėje B buvo uţkrėsta buvo 41,18 proc. pusgaminių. Sėjant tiesiogiai ant mCCDA agaro kampilobakterijų išskirta nebuvo ir tik atlikus pagausinimą Bolton sultinyje, buvo išskirtos kampilobakterijos. Maţiausiai kampilobakterijomis uţkrėstų marinuotų paukštienos pusgaminių buvo įmonėje A – 9,52 proc., iš kurių tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro išskirta 4,62 proc. ir atlikus pagausinimą Bolton sultinyje

26 išskirta taip pat 4,62 proc.. Tarp A, ir C gamintojų marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis buvo statistiškai patikimai skirtingas (p<0,01). Šie tyrimo rezultatai parodo, kad gaminio mikrobiologinė sauga priklauso nuo to, kaip gamintojas sugeba uţtikrinti higienos reikalavimų laikymąsi bei sugeba išvengti gaminio antrinio uţkrėtimo gamybos metu. Ankstesni tyrimai Lietuvoje taip pat atskleidė, kad maţmeninėje prekyboje parduodamos paukštienos (sparnelių ir blauzdelių) uţkrėstumas kampilobakterijomis labai priklauso nuo gamintojo (Kudirkienė ir kt., 2013). Šio tyrimo metu buvo nustatytas 46,8 proc., broilerių mėsos, parduodamos maţmeninėje prekyboje, uţkrėstumas kampilobakterijomis.

4 lentelė. A, B ir C gamintojų marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis Gamintojas Tirtų mėginių skaičius Teigiami mėginiai išskirti tiesiogiai % Teigiami mėginiai išskirti po pagausinimo % Iš viso teigiamų mėginių % A 21 1 4.76 1 4.76 2 9.52 B 17 - - 7 41.18 7 41.18 C 29 3 10.34 10 34.82 13 44.85 Viso: 67 4 5.97 18 26.86 22 32.8

Iš tirtų 42 marinuotų sparnelių kampilobakterijomis buvo uţkrėsta 33,3 proc. produkcijos. A gamintojo buvo ištirtas 21 marinuotas paukštienos sparnelis, iš kurių kampilobakterijos buvo aptiktos tik dviejuose pusgaminių mėginiuose. Kampilobakterijos iš pirmo mėginio buvo išskirtos tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro ir iš antro mėginio iškirtos atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Gamintojo B buvo ištirti trys marinuoti sparneliai, iš kurių du buvo uţkrėsti kampilobakterijomis. Iš abiejų mėginių kampilobakterijos buvo išskirtos tik atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Didţiausias marinuotų sparnelių uţkrėstumas kampilobakterijomis nustatytas C gamintojo pusgaminiuose. Iš 17 tirtų marinuotų sparnelių kampilobakterijos buvo išskirtos iš 10 mėginių, iš kurių dviejuose mėginiuose išskirta tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro ir iš aštuonių mėginių išskirta tik atlikus pagausinimą Bolton sultinyje.

Iš 12 tirtų B gamintojo marinuotos vištienos filė troškinių mėginių, kampilobakterijos išskirtos trijuose pusgaminiuose, tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro. Marinuotos filė troškinių uţkrėstumas sudarė 25,0 proc..

27 A, B ir C gamintojų buvo ištirti šeši marinuotos vištienos filė mėginiai. Iš A ir B gamintojų – po vieną, iš C gamintojo – keturi. Kampilobakterijomis buvo uţkrėsti C gamintojo dveji pusgaminių mėginiai, iš kurių kampilobakterijos išskirtos tik atlikus pagausinimą Bolton sultinyje. Nustatytas marinuotos filė uţkrėstumas kampilobakterijomis sudarė 33,3 proc..

Ištirtų marinuotų blauzdelių uţkrėstumas kampilobakterijomis sudarė 25,0 proc.. Iš viso buvo ištirti keturi marinuotų blauzdelių mėginiai: iš A ir B gamintojų po vieną ir C gamintojo - du. Kampilobakterijomis buvo uţkrėstas vienas iš dviejų tirtų marinuotų C gamintojo pusgaminių, iš kurio kampilobakterijos buvo išskirtos tiesiogiai sėjant ant mCCDA agaro.

Taip pat buvo ištirtas vienas marinuotas ketvirtis (A gamintojo) ir viena marinuota šlaunelė su nugaros dalimi (B gamintojo). Uţkrėstumas kampilobakterijomis buvo nustatytas abiejuose tirtuose pusgaminiuose. Visų tirtų marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas pateiktas 5 paveiksle.

5 pav. Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis (proc.)

Tyrimų duomenimis maţiausiai kampilobakterijomis uţkrėstų produktų nustatyta vasario ir rugsėjo mėnesiais. Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas atitinkamai sudarė 20 proc. ir 25 proc. Didţiausias mėginių uţkrėstumas kampilobakterijomis nustatytas paukštienos produktus įsigijus rugsėjo (50,0 proc.) ir lapkričio (42,9 proc.) mėnesiais, o gruodţio mėnesį kampilobakterijomis uţkrėstų mėginių nenustatyta. Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis priklausomai nuo mėnesio pateiktas 6 pav.

28 6 pav. Marinuotų pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis sausio – gruodţio

mėnesiais

Panašias paukštienos uţkrėstumo tendencijas nustatė ir kiti mokslininkai, kaip pvz., Japonijoje didţiausias paukštienos uţkrėstumas kampilobakterijomis nustatytas birţelio – lapkričio mėn. (Ishihara et al., 2012).

3.2. Kampilobakterijų rūšinė įvairovė marinuotuose paukštienos pusgaminiuose

Kampilobakterijos buvo identifikuojamos iki rūšies naudojant dauginę PGR .Rezultatai vertinami atlikus elektroforezę ir padarius nuotrauką UV šviesoje (7 pav).

29 M – DNR ilgio standartas nuo 100bp iki 1000 bp (MBI fermentas); 1, 2, 9, 10, 11, 12, 13 –

Campylobacter spp. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 16, 17 ir 18 – C. jejuni ir 14, 15 – C. coli

Tyrimai parodė, kad iš tirtų 67 marinuotos paukštienos pusgaminių mėginių kampilobakterijos buvo išskirtos iš 22 mėginių. Nustatėme, kad daţniausiai marinuoti paukštienos pusgaminiai buvo uţkrėsti C. jejuni rūšies kampilobakterijomis - 16 mėginių, tuo tarpu C. coli bakterijos buvo aptiktos tik 2 mėginiuose, o vienas mėginys buvo uţkrėstas nenustatytos rūšies kampilobakterijomis. Dar dviejuose mėginiuose rastos tiek C. jejuni, tiek ir Campylobacter spp. bakterijos ir viename - C. coli ir nenustatytos rūšies kampilobakterijos (8 pav). Tai, kad C. jejuni rūšis yra daţniausiai aptinkama kampilobakterijų rūšis paukštienoje, patvirtina tyrimai ir kitose šalyse (Moran et al., 2009; Wainø et al., 2003).

8pav. Marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas skirtingomis kampilobakterijų rūšimis (proc.)

Daţniausiai C. jejuni bakterijos buvo identifikuotos gamintojo C mėginiuose – 68,75 proc., o gamintojo B mėginiuose – 25,00 proc. Maţiausia C. jejuni buvo identifikuota gamintojo A mėginiuose – 6,25 proc. Taip pat gamintojo B mėginiuose ir gamintojo C mėginiuose buvo identifikuotos C. coli bakterijos.

Gamintojo A mėginiuose buvo rastos kampilobakterijos priklausančios kitoms nei C. jejuni ir C. coli rūšims. Remiantis tyrimo duomenimis, gamintojo C mėginiuose buvo identifikuota C. jejuni ir

30 nenustatytos rūšies kampilobakterijos, o gamintojo B mėginiuose aptikta C. coli ir nenustatytos rūšies kampilobakterijos.

3.3. Kampilobakterijų genetinė įvairovė marinuotuose paukštienos pusgaminiuose Tyrimų laikotarpiu iš viso buvo genotipuota 11 C. jejuni padermių, išskirtų iš marinuotų paukštienos pusgaminių. Nustatyti sekų tipai pateikiami filogenetiniame medyje (9 pav.).

50 50 50 50 50 50 50 50 50 19 19 19 19 19 19 19 19 19 376 376 376 376 376 376 376 376 376 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6435 6435 6435 6435 6435 6435 6435 6435 6435 464 464 464464464464464464464 6410 6410 6410 6410 6410 6410 6410 6410 6410 607 607 607607607607607607607 6391 6391 6391 6391 6391 6391 6391 6391 6391 3502 3502 3502 3502 3502350235023502 3502

9 pav. Nustatyti C. jejuni padermių sekų tipai

Nustatyti du C. jejuni sekų tipai (5 ir 6435), kurie priklausė kloniniui kompleksui 353. Šis kloninis kompleksas yra vienas iš dominuojančių tarp ţmonėms susirgimus sukėlusių C. jejuni padermių Lietuvoje.

Nustatyti 3 sekų tipai (50,19 ir 376), kurie priklauso 21 kloniniam komplesui. Šis kloninis kompleksas yra plačiai paplitęs pasaulyje įvairiuose šaltiniuose, o taip pat tarp kampilobakterijų padermių, sukėlusių ţmonių susirgimus kampilobaterioze (Kittl et al., 2013). Kloniniam kompleksui 464 priklausė 464 sekų tipas. Šis sekų tipas anksčiau atliktų tyrimų duomenimis yra dominuojantis tarp atvėsintų broilerių produktų parduodamų prekyboje. Taip pat nustatytas 607 sekų tipas, priklausantis

31 607 kloniniam kompleksui. Trys C. jejuni padermės, priklausančios sekų tipams 6410 ir 3502 nebuvo priskirtos ţinomam kloniniui kompleksui.

Tyrimų metu iš viso buvo nustatyti 3 nauji sekų tipai: 6410, 6391 ir 6435. Šiems sekų tipams priskirtos keturios C. jejuni padermės, išskirtos iš marinuotų paukštienos pusgaminių. Šios sekos buvo uţregistruotos tarptautinėje Pubmlst duomenų bazėje.

32 4. IŠVADOS

1. Tyrimų rezultatai parodė, kad 32,8 proc. marinuotų paukštienos pusgaminių, parduodamų maţmeninėje prekyboje, yra uţkrėsti kampilobakterijomis.

2. Didţiausias marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas nustatytas rugpjūčio ir lapkričio mėnesiais, tai yra atitinkamai 50,0 proc. ir 42,9 proc.

3. A ir C gamintojų marinuotų paukštienos pusgaminių uţkrėstumas kampilobakterijomis buvo statistiškai reikšmingas (p<0,01).

4. Tyrimų rezultatai parodė, kad marinuoti paukštienos pusgaminiai daţniausia yra uţkrėsti C. jejuni rūšies bakterijomis (72,7 proc.), rečiau C. coli (9,1 proc.). Taip pat tirtuose mėginiuose buvo aptinkamos ir kitos nei C. jejuni ar C. coli rūšies kampilobakterijos (13,61 proc.).

5. MLST genotipavimas parodė, kad marinuotuose paukštienos produktuose aptiktos kampilobakterijos priskiriamos kloniniams kompleksams, kurie, remiantis kitų tyrimų duomenimis, randami kampilobakterioze sergančių ţmonių klinikiniuose mėginiuose.

33 5. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Alter T., Gaull F., Kasimir S., Gürtler M., Mielke H., Linnebur M., Fehlhaber K. Prevalence and transmission routes of Campylobacter spp. strains within multiple pig farms. 2005. Vet Microbiol 108: 251 – 61.

2. Ambrasienė Daiva. Naujausių mokslinių pasiekimų biotechnologijos srityje mokslinė studija. 2007

3. Aquino M.H., Pacheco A.P., Ferreira M.C. & Tibana A. Frequency of isolation and identification of thermophilic Campylobacter from animals in Brazil. 2002. Veterinary Journal. P 164, 159 – 161.

4. Belskij A., Čaplinkskienė I., Davidavičienė E., Liausėdienė R., Razmuvienė D., Tamkevičiūtė J. Sergamumo uţkrečiamosiomis ligomis Lietuvoje 2012 m. apţvalga. Uţkrečiamų ligų ir AIDS centras. 2012 m.

5. Blaser M. and Engberg J. Clinical aspects of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli infections. In: Nachamkin I.C, Szymanski CM, Blaser M. editors. 2008. Campylobacter 3nd edition. P 99 – 122

6. Carlton L.G., Prescott J.F., Songer G. Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals. 2008. P 354 – 355

7. Cools I., Uyttendaele M., Caro C., D'Haese E., Nelis H. J. and Debevere J. Survival of Campylobacter jejuni strains of different origin in drinking water. 2003. J. Appl. Microbiol 94. P 886 – 892.

8. De Mello A.S, Roca R.O. Effect of hydrogen peroxide in the scald tank on the microbial count of pork skin. 2009. Revue d'Elevage et de Medicine Veterinaire des Pays Tropicaux 62(1):27 31.

9. Dingle K.E, Colles F.M, Wareinq D.R, Ure R, Fox A.J, Bolton F.E, Bootsman H.J, Willems R.J, Urwin R., Maiden M.C. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. 2001. J Clin Microbiol. Jan;39(1):14 – 23

10. EFSA (European Food Safety Authority). The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in the European union in 2008. 2010. The EFSA Journal 8 (1): 1496.

34 11. EFSA (European Food Safety Authority).The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2009. 2011. The EFSA Journal 9 (3) 2090

12. EFSA (European Food Safety Authority).The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2010. 2012. The EFSA Journal 10 (3), 2597.

13. EFSA (European Food Safety Authority).The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2011. 2013. The EFSA Journal 11 (4), 3129

14. EFSA (European Food Safety Authority).The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in 2012. 2014. The EFSA Jornal 12(2), 3547

15. Farzan A, Friendship RM, Cook A, Pollari F. Occurrence of Salmonella, Campylobacter, Yersinia enterocolitica, Escherichia coli O157 and Listeria monocytogenes in swine. 2010. Zoonoses Public Health 57(6). P 388 – 96

16. Grennan B., O'Sullivan N.A., Fallon R., Carroll C., Smith T., Glennon M. PCR–ELISAs for the detection of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in poultry samples. 2001. Biotechniques. Mar 30 (3)

17. Gurtler M, Alter T, Kasimir S, Fehlhaber K. The importance of Campylobacter coli in human campylobacteriosis: Prevalence and genetic characterization. Epidemiology and Infection. 2005. P 133; 1081 – 1087

18. Hanninen, M. L., Haajanen, H., Pummi, T., Wermundsen, K., Katila, M. L., Sarkkinen, H., Miettinen, I. and Rautelin, H. Detection and typing of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli and analysis of indicator organisms in three waterborne outbreaks in Finland. 2003. Appl. Environ. Microbiol., 69: 1391

19. Hansson I., Vagsholm I., Svensson L., Olsson Engvall E. Correlations between Campylobacter spp. prevalence in the environment and broiler flocks. 2007. Journal of Applied Microbiology. Volume 103, Issue 3. P 640 – 649

20. Hume M.E. Campylobacter coli pulsed field gel electrophoresis genotypic diversity among sows and piglets in a farrowing barn. 2002. Current Microbiology 45. P 128 – 132

35 21. Ishihara K, Takahashi R, Andoh M, Ueno H, Muramatsu Y, Tamura Y. Seasonal variation in Campylobacter-contaminated retail chicken products: a year-round investigation in Japan. 2012.J Vet Med Sci. Jan;74(1):117-20

22. Jakobs BC, van Belkum A, Endtz HP. Guillan-Barré Syndrome and Campylobacter infection. 2008. Campylobacter, 3rd edition. Washington D.C.American Society for Microbiology. P 245 – 262.

23. Jensen AN, Andersen MT, Dahlgaard A, Baggesen DL, Nielsen EM. Development of real-time PCR and hybridization methods for detection and identification of thermophilic Campylobacter spp. in pig faecal samples. 2005. J Appl Microbiol 99(2). P 292 – 300.

24. Kapperud G., Espaland G., Wahl E., Walde A., Herikstad H., Gustavsen S., Tveit I., Natas O., Bevanger L. & Digranes A. Factors associated with increased and decreased risk of Campylobacter infection: A prospective case-control study in Norway. 2003. American Journal of Epidemiology 158. P 234 – 242

25. Katzav M, Isohanni P, Lund M, Hakkinen M, Lyhs U. PCR assay for the detection of Campylobacter in marinated and non-marinated poultry products. 2008. Food Microbiol. Oct 25(7). P 908 – 14

26. Kittl S., Korczak BM., Niederer L., Baumgartner A., Buettner S., Overesch G., Kuhnert P. Comparison of genotypes and antibiotic resistances of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli on chicken retail meat and at slaughter. 2013. Appl Environ Microbiol. Jun 79(12):3875-8.

27. Kombra E., Mdegela R., Mosoffe P. and Ingmer H. Human and animal Campylobacteriosis in Tanzania: A review. 2013. Tanzania Journal of Health Research Doi:Volume 15, Number 1, January

28. Kudirkienė E., Bunevičienė J., Šernienė L., Ramonaitė S., Olsen JE., Malakauskas M. Importance of the producer on retail broiler meat product contamination with Campylobacter spp. 2013. J Sci Food Agric. Jul 93(9):2293-8

29. Lastovica AJ and Allos MB. Clinical signifigance of Campylobacter and related species other than Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. 2008. In: Campylobacter 3rd edition. American Society for Microbiology. P 123 –150

36 30. Malakauskas M., Jorgensen K., Nielsen E.M., Ojeniyi B. and Olsen J.E. Isolation of Campylobacter species from a pig slaughterhouse and analysis of cross-contamination. 2006. International Journal of Food Microbiology 108. P 295 – 300

31. Masteikienė Redina Rita. Maisto produktų mikrobiologija. 2002. Vadovėlis 1 knyga. P 488 32. Matsune W. Y., Taguchi M., Kazuko S., Ryuji K., Kentaro K., Yuko K., Miyoshi

K., Masafumi N., Naoaki M., Teizo T. Development of a multiplex PCR assay for identification of Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari and Campylobacter upsaliensis. 2007. Journal of medical microbiology. November vol. 56. P 1467 – 1473

33. Miettinen I.T., Zacheus O., von Bonsdorff C.H. and Vartiainen T. Waterborne epidemics in Finland in 1998-1999. 2001. Water Science and Technology 43. P 67 –71

34. Moran L., Scates P., Madden RH. Prevalence of Campylobacter spp. in raw retail poultry on sale in Northern Ireland. 2009. J Food Prot. Sep;72(9):1830-5

35. Novotny L., Dvorska L., Lorencova A., Beran V, Pavlik I. Fish: a potential source of bacterial pathogens for human beings. 2004.Vet. Med. – Czech, 49 (9): 343–358

36. Parisi A., Lanzilotta S.G., Addante N., Normanno G., Di Modugno G., Dambrosio A. and Montagna C.O. Prevalence, molecular characterization and antimicrobial resistance of thermophilic Campylobacter isolates from cattle, hens, broilers and broiler meat in south-eastern Italy. 2007. Vet Res Commun 31. P 113-123

37. Pearce RA, Wallace FM, Call JE, Dudley RL, Oser A, Yoder L, Sheridan JJ, Luchansky JB. Prevalence of Campylobacter within a swine slaughter and processing facility. 2003. J Food Prot 66(9):1550 – 6

38. Roels T.H., Wickus B., Bostrom H.H., Kazmierczak J.J., Nicholson M.A., Kurzynski T.A., Davis J.P. A foodborne outbreak of Campylobacter jejuni (O:33) infection associated with tuna salad: a rare strain in an unusual vehicle. 1998.

39. Schönberg-Norio D., Takkinen J., Hänninen M. L., Katila M. L., Kaukoranta S. S., Mattila L. and Rautelin H. Swimming and Campylobacter infections. 2004. Emerg. Infect. Dis. 10: 1474 -1477.

40. Steinhauserova, I., Nebola, M. & Mikulicova, M. Prevalence of thermophilic Campylobacter species in slaughtered pigs in the Czech Republic, 2001–2003. 2005. Veterinary Medicine– Czech 50. P 171 – 174

37 41. Stephen L.W.On. Taxonomy, phylogeny, and methods for the identification of Campylobacter

species. 2005. Campylobacer molecular and cellular biology. P 13-35

42. Vandamme Peter, Debruyne Lies, Gevers Dirk. Taxonomy of the family Campylobacteracea. 2008. Campylobacter (3rd ed.) P 3 – 25

43. Virtanen Terfi and Huovinen Elisa. Campylobacter in Nordic countries. Risk Assessment Unit. Finnish Food Safety Authority Evira. 2007

44. Wainø M, Bang DD, Lund M, Nordentoft S, Andersen JS, Pedersen K, Madsen M. Identification of campylobacteria isolated from Danish broilers by phenotypic tests and species-specific PCR assays. 2003. J Appl Microbiol 95(4):6495 – 5.

45. Wagenaar J.A., Mevius D.J., Havelaar A.H. Campylobacter in primary animal production and control strategies to reduce the burden of human campylobacteriosis. 2006. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.25 (2). P 581 – 594

46. Wang H. Rapid methods for detection and enumeration of Campylobacter spp. in foods. 2002. Journal of AOAC International. P 996 – 999

47. Weese Scott J. and Fulford Martha. Companion animal zoonoses. 2010. P 129 – 131

48. Wiedmann M., and Zhang W. Genomic and transcriptomic analysis of foodborne bacterial pathogens. 2011. Genomics of Foodborne Bacterial Pathogens. Chapter 10. P 311 – 342

49. Wilson D.J., Gabriel E., Leatherbarrow A.J., Cheesbrough J., Gee S., Bolton E., Fox A., Fearnhead P., Hart C.A., Diggle P.J. Tracing the source of campylobacteriosis. 2008. PLoS Genet. Vol.4(9):e1000203