Kampilobakterijų, išskirtų iš Lietuvoje gaminamos paukštienos, paplitimas, rūšinė įvairovė bei antibiotikų atsparumo veiksnių identifikavimas

(1)

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Vaida Devėnaitė

Kampilobakterijų, išskirtų iš Lietuvoje gaminamos

paukštienos, paplitimas, rūšinė įvairovė bei antibiotikų

atsparumo veiksnių identifikavimas

Prevalence and variety of the Campylobacter detected in

the Lithuanian poultry and identification of antibiotic

resistance factors

Veterinarinės maisto saugos nuolatinių studijų

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS

Darbo vadovas: lekt. dr. Sigita Ramonaitė Maisto saugos ir kokybės katedra

(2)

2 DARBAS ATLIKTAS MAISTO SAUGOS IR KOKYBĖS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ

Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Kampilobakterijų, išskirtų iš Lietuvoje gaminamos paukštienos, paplitimas, rūšinė įvairovė bei antibiotikų atsparumo veiksnių identifikavimas“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

Elektroniniu laišku patvirtinu, o darbas bus pasirašytas pasibaigus karantino ir ekstremaliosios situacijos dėl COVID-19 pandemijos Lietuvos Respublikoje laikotarpiui.

2020-04-20 Vaida Devėnaitė

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

2020-04-16 Loreta Andriuškevičienė

(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

2020-04-21 lekt. dr. Sigita Ramonaitė

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE

prof. dr. Mindaugas Malakauskas

(aprobacijos data ) (katedros (klinikos, instituto) vedėjo (-os) (vadovo (-ės)) (parašas) vardas, pavardė)

(3)

3 Baigiamojo darbo recenzentas

(vardas, pavardė) (parašas)

Baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

(data) (gynimo komisijos sekretoriaus (-ės) vardas, pavardė) (parašas)

(4)

4

TURINYS

SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 9

1.1 Kampilobakterijų rūšinė įvairovė ... 9

1.2 Paukštienos produktų užkrėstumas kampilobakterijomis Lietuvoje ... 10

1.3 Sergamumas kampilobakterioze Lietuvoje ... 12

1.4 Marinuotų paukštienos pusgaminių užkrėstumas kampilobakterijomis ir marinavimo įtaka bakterijų išgyvenimui ... 13

1.5 Kampilobakterijų atsparumas antibiotikams ... 14

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 16

2.1 Mėginių rinkimas ... 16

2.2 Kampilobakterijų aptikimas bei išskyrimas ... 16

2.3 DNR išskyrimas ... 17

2.4 Kampilobakterijų identifikavimas naudojant dauginį PGR metodą ... 17

2.5 Atsparumo antibiotikams genų identifikavimas ... 18

2.6 Statistinis duomenų įvertinimas ... 21

3. TYRIMO REZULTATAI... 22

3.1 Broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis ... 22

3.2 Kampilobakterijų rūšinė įvairovė broilerių produktuose ... 24

3.3 Kampilobakterijų genų, susijusių su atsparumu antibiotikams, identifikavimas ... 25

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 27

IŠVADOS ... 31

(5)

5

SANTRAUKA

Kampilobakterijų, išskirtų iš Lietuvoje gaminamos paukštienos, paplitimas, rūšinė įvairovė bei antibiotikų atsparumo veiksnių identifikavimas

Vaida Devėnaitė Magistro baigiamasis darbas

Tyrimo tikslas: įvertinti 2018 – 2019 m. mažmeninėje prekyboje parduodamų atvėsintų ir marinuotų broilerių pusgaminių užkrėstumą kampilobakterijomis bei molekulinio atsparumo antibiotikams veiksnius.

Tyrimo metodika: pasirinktas vienas didžiausių lietuviškos paukštienos produktų gamintojų ir mėginiai buvo perkami iš prekybos centro nuo 2018 m. spalio mėn. iki 2019 m. spalio mėn. du kartus per mėnesį. Broilerių produktai buvo tiriami kampilobakterijų atžvilgiu nuo produktų paviršiaus, o kampilobakterijų aptikimas ir išskyrimas buvo atliekamas naudojant tiesioginį (sėjant ant mCCDA agaro) ir pagausinimo (Bolton sultinyje) metodus. Kampilobakterijos buvo identifikuojamos iki rūšies naudojant modifikuotą Wang ir kt. (2002) metodą. Kampilobakterijų antimikrobiniam atsparumui įvertinti buvo pasirinkti Obeng ir kt., 2012 bei Mackiw ir kt., 2012 metodikoje pateikti su antibiotikų atsparumu susiję genai ir metodikos.

Rezultatai: iš 95 tirtų mėginių, įsigytų mažmeninėje prekyboje, parduodamų lietuviškos paukštienos gamintojo, nustatėme, kad kampilobakterijomis buvo užkrėsti 19 mėginių, t.y. 20 proc. visų broilerių produktų. Kampilobakterijomis buvo užsikrėtusios 30,4 proc. atvėsintų blauzdelių, 20,8 proc. atvėsintų sparnelių, 16,7 proc. marinuotų sparnelių, 12,5 proc. marinuotų blauzdelių. Nustatėme, kad broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis priklauso nuo mėginių rinkimo laiko (p<0,01). Užkrėstuose broilerių produktuose aptiktos šios kampilobakterijų rūšys: C. jejuni – 12,6 proc., C. coli – 1,1 proc., Campylobacter spp. – 6,3 proc. Iš 13 tirtų mėginių nustatytas C. jejuni

ir C. coli bakterijų rūšių atsparumas tetraciklinui – 69,2 proc. ir ciprofloksacinui – 46,2 proc.

Raktažodžiai: Campylobacter spp., atvėsinti, marinuoti broilerių produktai, antibiotikų atsparumas

(6)

6

SUMMARY

Prevalence and variety of the Campylobacter detected in the Lithuanian poultry and identification of antibiotic resistance factors

Vaida Devėnaitė Master‘s Thesis

The aim of the study was to investigate the occurrence of Campylobacter spp. in chilled and marinated ready-to-cook broiler products sold at retail stores during 2018 – 2019 and determine the factors of molecular antibiotic resistance.

Research methods. One of the largest producers of Lithuanian poultry was chosen for the research and the research samples were bought from a supermarket twice per month from October 2018 to October 2019. The broiler products were tested with respect to the Campylobacter found on the surface. The detection and isolation of the Campylobacter were carried out using the direct (disseminating in the mCCDA agar medium) and enrichment (Bolton’s broth) methods. The modified Wang et al. (2002) method was used to identify the species of the Campylobacter. The antibiotic resistance-related genes and methods described by Obeng et al. (2012) and Mackiw et al. (2012) were chosen for the evaluation of the antibiotic resistance of the Campylobacter.

Results. The study revealed that 19 samples out of 95 tested samples (i.e. 20 % of all the tested products) produced by the Lithuanian poultry producer and purchased at the retail stores were infected with the Campylobacter. The contamination of Campylobacter was detected in 30.4 % of chilled drumsticks, 20.8 % of chilled wings, 16.7 % of marinated wings, and 12.5 % of marinated drumsticks. It was determined that the contamination of Campylobacter in broiler products depended on the sampling time (p<0.01). The infected broiler products had the following species of the

Campylobacter: 12.6 % of C. jejuni, 1.1 % of C. coli, 6.3 % of Campylobacter spp. A total of 13

tested samples with C. jejuni and C. coli species had antibiotic resistance to tetracycline (69.2 %) and ciprofloxacin (46.2 %).

(7)

7

SANTRUMPOS

µl – mikrolitrai μm – mikrometras bp – bazių pora

df – laisvų narių skaičius DNR – deoksiribonukleorūgštis

EFSA – Europos maisto saugos tarnyba ksv – kolonijas sudarantys vienetai ml – mililitrai

p – tikimybė

PGR – polimerazės grandininė reakcija pH – vandenilio potencialas

rRNR – ribosominė ribonukleino rūgštis TAE – tris–acetato–EDTA buferis V – voltas

(8)

8

ĮVADAS

Kampilobakteriozė išlieka dažniausiai per maistą plintanti zoonozė Europos Sąjungoje ir Lietuvoje. Europos maisto saugos tarnyba (EFSA) 2010 m. paskelbė mokslinę nuomonę, kad 20 – 30 proc. žmonių susirgimų kampilobakterioze susiję su broilerių mėsos tvarkymu, ruošimu ir vartojimu, o 50 – 80 proc. viščiukų yra užkrato rezervuaras (1). Kadangi kampilobakterijos labai paplitusios broilerių pulkuose, galima daryti prielaidą, kad parduodama paukštiena gali būti užkrėsta kampilobakterijomis. Todėl labai svarbu įvertinti su kampilobakterijomis susijusios rizikos poveikį mažmeninėje prekyboje parduodamų paukštienos produktų, kurie patenka į vartotojų namus ir termiškai apdorojami, nes netinkamas paukštienos produktų terminis apdorojimas ir kryžminis užteršimas gali būti pagrindiniai žmogaus kampilobakteriozės rizikos veiksniai (2).

Viena iš pagrindinių kampilobakterijų rūšių, plintančių per maistą, daugelyje šalių yra

Campylobacter jejuni, kuri sukelia žmonių kampilobakteriozę. Mažmeninėje prekyboje įsigyti

užkrėsti paukštienos produktai gali sukelti kampilobakteriozės susirgimus, kuriems gali būti reikalingas antimikrobinis gydymas, ypač pacientams, kurių imunitetas yra susilpnėjęs (3). Tyrimai rodo, kad beveik pusė mažmeninėje prekyboje parduodamų paukštienos produktų kampilobakterijų izoliatų vidurio Europoje yra atsparūs antibiotikams, kurie naudojami medicinoje ir veterinarijoje, o trečdalis padermių yra atsparios keliems antibiotikams (4). Išaugęs antibiotikų naudojimas medicinoje ir paukštininkystėje kelia didelę visuomenės sveikatos problemą, nes kampilobakterijos tampa atsparios tokiems antibiotikams kaip makrolidai, chinolonai ir fluorochinolonai (5).

Tyrimų apie kampilobakterijų paplitimą atvėsintuose ir marinuotose broilerių produktuose, ypač parduodamų mažmeninės prekybos vietose, Lietuvoje yra nedaug, todėl šiuo tyrimu buvo siekiama ištirti kampilobakterijų paplitimą lietuviškoje paukštienoje, įvertinti aptiktų kampilobakterijų antimikrobinį atsparumą, vertinant pasirinktus su antibiotikų atsparumu susijusius genus.

Darbo tikslas: įvertinti 2018 – 2019 m. mažmeninėje prekyboje parduodamų atvėsintų ir marinuotų broilerių pusgaminių užkrėstumą kampilobakterijomis bei molekulinio atsparumo antibiotikams veiksnius.

Darbo uždaviniai:

1. Aptikti ir įvertinti kampilobakterijų paplitimą atvėsintuose ir marinuotose broilerių produktuose.

2. Nustatyti išskirtų kampilobakterijų rūšinę įvairovę.

(9)

9

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Kampilobakterijų rūšinė įvairovė

Remiantis Pasaulio sveikatos organizacijos duomenimis, Campylobacter genčiai priskiriama 17 rūšių ir 6 porūšiai kampilobakterijų (6). Įvairiuose moksliniuose straipsniuose pateikiami skirtingi duomenys apie kampilobakterijų rūšinę įvairovę, atrandamos vis naujos kampilobakterijų rūšys, todėl sudėtinga įvertinti kampilobakterijų rūšinės įvairovės paplitimą. Pagal internetinėje duomenų bazėje pateiktą prokariotinių pavadinimą, esančių nomenklatūroje sąrašą, kampilobakterijų genčiai priskiriamos 39 rūšys ir 16 porūšių kampilobakterijų (7).

Kampilobakterijos yra gramneigiamos spiralės formos, 0,2 – 0,9 μm pločio ir 0,2 – 5,0 μm ilgio bakterijos, priklausančios Campylobacteriaceae šeimai, turinčios vieną ar du žiuželius (po vieną žiuželį abiejuose ląstelės galuose) arba gali būti ir be žiuželių, priklausomai nuo kampilobakterijų rūšies (8-10). Šios bakterijos yra neigiamos indolo, gliukozės gaminimo atžvilgiu, o teigiamos oksidazės, hipurato, katalazės, nitrato testams, skirtiems patvirtinti ir identifikuoti kampilobakterijų rūšis (11). Nuo kitų, per maistą plintančių patogeninių bakterijų kampilobakterijos skiriasi tuo, kad jos yra mikroaerofilai, auga atmosferoje, kurioje yra 10 proc. anglies dioksido, 5 proc. deguonies ir 85 proc. azoto. Taip pat jos yra termofilinės bakterijos, nes auga temperatūros riboms esant nuo 30 iki 46 °C, o optimali augimo temperatūra yra 40 – 42 °C. Neauga, kuomet vandens aktyvumas (aw)

yra mažesnis nei 0,987, o optimali vertė yra 0,997. Kita savybė, leidžianti išgyventi nepalankiomis sąlygomis, yra kampilobakterijų sugebėjimas sudaryti bioplėvelę (8).

Kiekvienais metais patogeninės kampilobakterijų rūšys pasaulyje sukelia daugiau nei 400 – 500 milijonus infekcijų atvejų. Patogeninės kampilobakterijų rūšys, susijusios su žmonių infekcijomis, yra C. jejuni, C. concisus, C. rectus, C. hyointestinalis, C. insulaenigrae, C. sputorum, C. helveticus,

C. lari, C. vaisius, C. mucosalis, C. coli, C. upsaliensis ir C. ureolyticus (11). Tačiau svarbiausios,

grėsmę visuomenės sveikatai keliančios kampilobakterijų rūšys yra C. jejuni ir C. coli, kurios sukelia daugybę per maistą plintančių žarnyno infekcijų ligų atvejų (12,13).

Remiantis Europos maisto saugos tarnybos ataskaitos duomenimis, 2017 m. Europos Sąjungoje iš 54,1 proc. patvirtintų kampilobakteriozės atvejų buvo nustatytas šis rūšinis pasiskirstymas: 84,4 proc. C. jejuni, 9,2 proc. C. coli, 0,1 proc. C. lari, 0,1 proc. C. fetus, 0,1 proc. C. upsaliensis, o 6,2 proc. sudarė kitos kampilobakterijų rūšys (14). Atsižvelgiant į kampilobakterijų rūšinę įvairovę, Lietuvoje pastebima, kad 2017 m. labiausiai paplitusios rūšys yra C. jejuni – 94,4 proc. ir C. coli – 5,5 proc. (15).

C. jejuni bakterijos yra pagrindinės žmogaus kampilobakteriozės sukėlėjos, o paukštiena ir jos

(10)

10 yra laikomi pirminiu C. jejuni rezervuaru ir jie gali būti besimptomiai nešiotojai (13). Kampilobakterijos kolonizuojasi ūkiuose, nes paukščiai gali užsikrėsti kampilobakterijomis dar jiems augant ūkyje, kuomet kampilobakterijos gali patekti į ūkį iš aplinkos (vandens, žmonių, sergančių gyvūnų) ir šios bakterijos randamos naminių paukščių žarnyne, jų išmatose gali būti 109 _ksv/g.

Broilerių skerdena kampilobakterijomis užkrečiama skerdimo proceso metu (nuplikinimo, plunksnų pešimo, vidurių pašalinimo, plovimo ir atvėsinimo metu). Paukštienos paruošimo etape atsižvelgiama, kad vartotojas taip pat gali užkrėsti paukštieną kampilobakterijomis kryžminės taršos ir netinkamo apdorojimo metu, o užkrėstas dažniausiai būna vištienos paviršius. Tai yra pagrindiniai rizikos veiksniai, susiję su žmonių kampilobakterioze (16,17).

C. jejuni sudaro du porūšiai: C. jejuni subsp. jejuni ir C. jejuni subsp. doyley, kurių pagrindinis

fenotipinis požymis naudojamas atskirti šiuos du porūšius yra tai, kad C. jejuni subsp. doyley jautri cefalotinui ir nepasižymi nitrato redukcija. C. jejuni subsp. doyley padermė sukelia enteritą ir gastritą, o C. jejuni subsp. jejuni yra pagrindinė bakterinė enteroinvazinio viduriavimo priežastis (11).

C. jejuni yra viena iš labiausiai paplitusių bakterinio gastroenterito priežasčių visame pasaulyje.

Pagrindiniai infekcijos simptomai yra stiprūs pilvo skausmai, karščiavimas, ūmus vandeningas ar net su krauju viduriavimas, vėmimas, svorio kritimas, galvos skausmai. Simptomai pasireiškia praėjus 24 – 72 valandoms po suvalgyto kampilobakterijomis užkrėsto maisto. Taip pat gali sukelti komplikacijas, tokias kaip reaktyvusis artritas, bakteriemija, meningitas, Guillain – Barre sindromas (18).

C. coli yra S formos išlenkta ląstelė, kurios ilgis yra apie 0,2 – 0,5 μm, ji turi vieną žiuželį. Tai

antra pagal dažnumą kampilobakterijų rūšis, sukelianti žmonių infekcijas. C. coli labai panaši į C.

jejuni, nes abi bakterijos žmonėms sukelia žarnyno uždegimą ir viduriavimą. C. coli klinikiniai

simptomai yra vandeningas viduriavimas, pilvo skausmai, vėmimas, karščiavimas, pykinimas, uždegiminis enterokolitas. C. coli infekcijos būna pavienės, dažniausiai vasaros pabaigoje ar ankstyvą rudenį (11).

1.2 Paukštienos produktų užkrėstumas kampilobakterijomis Lietuvoje

Visame pasaulyje paukštienos vartojimas ir toliau auga tiek išsivysčiusiose, tiek besivystančiose šalyse (19). Lietuvoje taip pat pastebimas paukštienos suvartojimo augimo rodiklis. Remiantis Lietuvos statistikos departamento duomenimis, paukštienos gamyba Lietuvoje 2018 m. siekė 177,6 tūkst. tonų gyvo svorio arba 140,1 tūkst. tonų skerdenos, o vienas Lietuvos gyventojas per 2018 m. vidutiniškai suvartojo 38 kg paukštienos (20,21). Paukštienos produktų vartojimo populiarėjimą lemia tai, kad paukštienos mėsa yra aukštos kokybės baltymų šaltinis, paukštienos produktus galima įsigyti už žemesnę kainą, lyginant su kitomis mėsos rūšimis (19). Taigi didėjantis paukštienos vartojimas gali būti svarbus kampilobakteriozės rizikos veiksnys, nes kampilobakterijų

(11)

11 paplitimas broilerių pulkuose lemia tolimesnį jų plitimą paukštienos gamybos grandinėje ir paukštienos užkrėstumą mažmeninėje prekyboje (22,23).

Duomenų apie broilerių produktų užkrėstumą Campylobacter spp., ypač mažmeninėje prekyboje, Lietuvoje yra labai nedaug. Vieni iš pirmųjų tyrimų buvo atlikti 2008 – 2013 m., jie parodė, kad mažmeninėje prekyboje parduodamų atvėsintų broilerių sparnelių ir blauzdelių užkrėstumas kampilobakterijomis buvo 43 proc., dažniausiai buvo aptikta C. jejuni rūšis 51,4 proc. ir C. coli rūšis 37,7 proc. (24).

2009 m. buvo atliktas mažmeninėje rinkoje parduodamų broilerių produktų tyrimas, kurio metu nustatyta, kad Lietuvos gamintojų atvėsinti broilerių sparneliai ir blauzdelės kampilobakterijomis buvo užkrėsti 46,6 proc. Šie broilerių produktai buvo užkrėsti 69,12 proc. C. jejuni, 13,23 proc. C.

coli, 17,65 proc. užkrėsti abiem kampilobakterijų rūšimis (C. jejuni ir C. coli) (25).

2009 – 2010 m. tyrimų rezultatai parodė, kad broilerių sparneliai ir blauzdelės mažmeninėje prekyboje Lietuvos gamintojų užkrėsti kampilobakterijomis 46,8 proc., C. jejuni – 51,4 proc. C. coli – 37,7 proc. (26).

2014 m. marinuotos paukštienos pusgaminių, parduodamų mažmeninėje prekyboje, bendras užkrėstumas kampilobakterijomis Lietuvoje buvo 32,8 proc. Tyrime pasirinktuose mėginiuose kampilobakterijomis buvo užkrėsti 100 proc. marinuotas ketvirtis, 100 proc. marinuota šlaunelė su nugaros dalimi, 33,3 proc. marinuotų sparnelių, 33,3 proc. marinuotų broilerių filė., 25 proc. marinuotų blauzdelių, 25 proc. vištienos filė troškinio. Marinuoti paukštienos pusgaminiai buvo užkrėsti 72,7 proc. C. jejuni ir 9,1 proc. C. coli rūšimis (27).

2011 – 2013 m. vykdant projektą „Maisto žaliavų ir produktų saugos bei kokybės gerinimas žmonių kampilobakteriozės prevencijai“ buvo nustatyta, kad dažniausiai kampilobakterijomis užkrėsta paukštienos mėsa ir pusgaminiai: 58,6 proc. broilerių sparnelių, 50,0 proc. blauzdelių, 42,7 proc., kepenėlių, 34,3 proc. marinuotų broilerių gaminių, 21,2 proc. faršo. C. jejuni rūšis buvo dominuojanti ir aptikta 91,7 proc. marinuotose broilerių pusgaminiuose, 80 proc. broilerių mėsoje, o

C. coli rūšis 29,9 proc. marinuotose pusgaminiuose ir 21,7 proc. broilerių mėsoje. Taip pat šiuo tyrimu

buvo nustatyta, kad Lietuvoje žmonių sergamumui kampilobakterioze įtakos turi paukštienos gamyba, nes mažmeninėje prekyboje parduodamuose paukštienos gaminiuose ir kampilobakterioze sergančių žmonių klinikiniuose mėginiuose buvo aptikti tie patys kampilobakterijų kloniniai kompleksai (28).

Apibendrinant galima teigti, jog svarbiausias žmogaus kampilobakteriozės šaltinis Lietuvoje yra broilerių produktai, kurių užkrėstumas mažmeninėje prekyboje yra pakankamai didelis (26,29). Lietuvoje atliktų tyrimų duomenys yra panašūs su Europos Sąjungos duomenimis, nes 2017 m. Europos Sąjungoje kampilobakterijos labiausiai paplitusios šviežioje broilerių mėsoje – 37,4 proc., o kampilobakteriozės atvejus sukėlė 84,4 proc. C. jejuni ir 9,2 proc. C. coli rūšys (14).

(12)

12

1.3 Sergamumas kampilobakterioze Lietuvoje

Remiantis Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centro duomenimis, 2018 m. kampilobakteriozės susirgimų Lietuvoje užregistruota 925 atvejai (30), o tai yra 6 proc. mažiau negu 2017 m. (993 užregistruotų atvejų). Lietuvoje, kaip ir visoje Europoje, sergamumas kampilobakterioze didėjo iki 2016 m., o nuo 2016 m. sumažėjo nuo 42 atv./100 tūkst. gyventojų iki 33 atv./100 tūkst. gyventojų 2018 m. (31).

Kampilobakterijos yra viena iš dažniausių žarnyno infekcinių ligų priežasčių Europos Sąjungoje nuo 2005 m. Europos Sąjungoje sergamumas kampilobakterioze didėjo nuo 2008 m., o 2013 m. – 2017 m. sergamumo tendencija kampilobakterioze stabilizavosi (14). Europos Sąjungoje 2017 m. buvo užregistruoti 246,158 kampilobakteriozės atvejai ir sergamumo rodiklis siekė 64,8 atv./100 tūkst. gyventojų (14). Tuo tarpu Lietuvoje 2017 m. buvo 993 užregistruoti infekcijos atvejai, o sergamumo rodiklis siekė 34,9 atv./100 tūkst. gyventojų (1 pav.).

1 pav. Sergamumo dinamika kampilobakterioze Lietuvoje ir Europos Sąjungoje 2005 – 2017 m.

(32)

Teigiama, kad kampilobakteriozė yra dažniausiai per maistą plintanti zoonozė Lietuvoje, kuria dažniausiai serga vaikai iki 3 m. amžiaus, vyrų sergamumo rodiklis 1,5 karto didesnis negu moterų, taip pat pastebima, kad miesto gyventojų sergamumo rodiklis didesnis negu kaimo gyventojų. 2017 m. kampilobakterijos sudarė 46,1 proc. iš užregistruotų žarnyno infekcijų sukėlėjų, o vyraujanti rūšis buvo C. jejuni. Dažniausiai kampilobakterioze buvo užsikrečiama namuose, o pagrindinis rizikos veiksnys buvo vištiena ir jos produktai. Daugiausiai susirgimų registruojama gegužės – rugsėjo mėnesiais (15).

(13)

13

1.4 Marinuotų paukštienos pusgaminių užkrėstumas kampilobakterijomis

ir marinavimo įtaka bakterijų išgyvenimui

Marinuoti mėsos produktai kelia didelį vartotojų susidomėjimą, nes tai greitai paruošiamas ir patogus vartoti produktas (33). Mažmeninėje prekyboje taikomas marinavimas pagerina paukštienos pusgaminių kokybę ir mikrobiologinį saugumą (34,35). Marinuojant pagerėja paukštienos skonis, švelnumas, pailgėja jos galiojimo laikas, neleidžiama daugintis mikroorganizmams arba mažinamas jų kiekis. Dažniausiai paukštienos gaminiai užkrėsti C. jejuni bakterijomis (36).

Marinatai mėsos pramonėje naudojami mėsai pagardinti ir švelninti. Vieni iš dažniausiai naudojamų mėsos marinavimo būdų – komerciniai marinatai. Komercinių marinatų sudėtyje yra kvapnių ir funkcionalių ingredientų, tokių kaip fosfatai, druska, modifikuotas krakmolas, organinės rūgštys, dervos, stabilizatoriai, dažikliai, žolelių ir prieskonių milteliai, augaliniai aliejai, kurie yra pagrindinės marinatų sudedamosios dalys (33). Komercinių marinatų antimikrobinį aktyvumą skatina cheminiai priedai, tokie kaip natrio diacetatas ir kalcio laktatas. Tačiau komerciniai marinatai gali būti ne tokie veiksmingi mažinant kampilobakterijų skaičių produkte. Kampilobakterijų skaičius, naudojant komercinį marinatą, gali ir nesumažėti, jeigu vartotojai anksčiau įsigyja marinuotų paukštienos pusgaminių, per 24 valandas nuo marinavimo proceso pradžios, ar dėl blogos higienos ruošiant broilerių mėsą ar mėsos produktus, todėl yra didesnė tikimybė dėl kampilobakteriozės susirgimų (37).

Teigiama, jog natūralūs bioaktyvūs junginiai ir prieskoniai gali būti gera alternatyva komerciniams marinatams su cheminiais priedais, kurie skirti broilerių produktams marinuoti. Buvo atliktas tyrimas, siekiant įvertinti skirtingos sudėties marinatų poveikį kampilobakterijų išgyvenamumui, ant broilerių sparnelių. Naudoti marinatai buvo prieskonių pagrindo marinatai (čiobrelių, rozmarinų, bazilikų, mairūnų marinatas) su įvairiais bioaktyviais junginiais, komercinis marinatas, praturtintas bioaktyviais junginiais (linalolis, cinamaldehidas, pieno rūgštis), ir komercinis marinatas, kuriame buvo ne tik prieskonių (juodųjų, raudonųjų pipirų ir kt.), bet ir cheminių priedų (mononatrio glutamato, natrio diacetatao, kalcio laktato). Čiobrelių marinatas buvo efektyvesnis prieš

C. jejuni bakterijas, esančias ant broilerių sparnelių, negu komerciniai marinatai, nes bakterijų kiekis

mažėjo nuo 7,11 log10 ksv/g iki 5,84 log10 ksv/g. Čiobreliai praturtina marinatą bioaktyviais

junginiais, tokiais kaip karvakrolis, kuris yra monoterpenoidinis fenolis ir efektyviai sumažina daugelio patogeninių bakterijų skaičių, turi antibakterinį ir priešgrybelinį poveikį. Šie rezultatai rodo, kad natūralūs prieskoniai gali pakeisti komercinius marinatus, gaminant saugesnius paukštienos produktus (28).

Granatų sultys, citrinų sultys ir baltojo vyno actas taip pat gali sumažinti C. jejuni skaičių (37). Vyno actas veiksmingesnis mažinant C. jejuni skaičių vištienos krūtinėlėje negu citrinų sultys (34).

(14)

14 Didelė natrio chlorido koncentracija, žemas pH, įvairių prieskonių pridėjimas į marinatą apsaugo produktą nuo patogeninių mikroorganizmų augimo ir taip pailgina mėsos gaminių tinkamumo vartoti laiką. Vynai taip pat gali būti naudojami marinatuose siekiant sumažinti kampilobakterijų skaičių užkrėstuose paukštienos produktuose. Baltasis vynas turi stipresnį antibakterinį poveikį negu raudonasis vynas. Vyno antimikrobinėms savybėms įtakos turi žemas pH, polifenolio junginių buvimas, didelis alkoholio kiekis ir organinių rūgščių kiekis (38).

1.5 Kampilobakterijų atsparumas antibiotikams

Antimikrobinis atsparumas – tai bakterijų gebėjimas atsispirti antibakterinėms medžiagoms, kurioms jos anksčiau buvo jautrios. Genetinės mutacijos, netinkamas antimikrobinių medžiagų vartojimas veterinarijoje ir žmonių gydyme, blogos higienos sąlygos sveikatos priežiūros įstaigose ar maisto gamybos grandinėje yra bakterijų antimikrobinio atsparumo pasekmė (39).

Remiantis Europos veterinarinių antimikrobinių medžiagų naudojimo stebėjimo sistemos duomenimis, Lietuvoje 2017 m. buvo parduota 11,7 tonų antimikrobinių medžiagų, skirtų gyvūnams gydyti (40). Paukštininkystėje antimikrobinės medžiagos naudojamos skatinti paukščių augimą ir kontroliuoti ligas. Antibiotikams atsparūs patogenai perduodami žmonėms per maisto grandinę ir taip gali pakenkti klinikiniam gydymui, nes daugelis antimikrobinių medžiagų, naudojamų gyvulininkystėje, taip pat naudojamos medicinoje (41).

Visuomenės sveikatai kelia didelį susirūpinimą didėjantis kampilobakterijų atsparumas antibiotikams, ypač fluorochinolonams ir makrolidams, nes šie antibiotikai dažniausiai naudojami sunkiems ar užsitęsusiems kampilobakteriozės atvejams gydyti pacientus (42). Sunkiems kampilobakteriozės atvejams, kuomet pažeidžiama imuninė sistema, pasirenkamas antibiotikas eritromicinas (23). Dažniausi antimikrobiniai vaistai, naudojami gydant Campylobacter spp. sukeltas infekcijas, yra makrolidai (eritromicinas), fluorochinolonai (ciprofloksacinas), tetraciklinas, aminoglikozidai, betalaktamai, vankomicinas (11,43).

2017 m. Europos Sąjungos ataskaitos duomenys apie antimikrobinį atsparumą rodo, kad iš Lietuvos žmonių izoliatų išskirtos C. jejuni bakterijos turėjo atsparumą šioms antimikrobinėms medžiagoms: ciprofloksacinui – 91,5 proc. ir Lietuva buvo antra šalis iš visos Europos Sąjungos, kuri pasižymėjo dideliu atsparumu šiai antimikrobiniai medžiagai. Atsparumas eritromicinui ir tetraciklinui tarp kitų Europos Sąjungos šalių nebuvo didelis, iš Lietuvos žmonių izoliatų išskirtų C.

jejuni bakterijų atsparumas eritromicinui – 0,7 proc., o tetraciklinui – 62,6 proc. Iš žmonių izoliatų

išskirtų C. coli bakterijų atsparumas ciprofloksacinui buvo 97,1 proc., eritromicinui – 17,1 proc., tetraciklinui – 88,2 proc. (39).

Atliekami kampilobakterijų rūšių atsparumo antibiotikams genų molekuliniai nustatymai padeda išaiškinti atsparumo genus kampilobakterijų rūšims. Kampilobakterijų rūšių aptikti atsparumo

(15)

15 genai apima chinolonų grupės atsparumo genus (gyrA, gyrB ir parC), fluorochinolonams atsparų geną

parE, β-laktamazių geną blaOXA–61 ir blaOX–184, tetraciklinams atsparius genus (tetA, tetB, tetM, tetO

ir tetS), aminoglikozidams atsparius genus (aphA ir aadE) ir eritromicinui atsparų geną ermB. Kampilobakterijų atsparumo genai įgyjami perduodant geną per transdukciją, konjugaciją ir transformaciją arba genetinių, taškinių mutacijų metu dėl sumažėjusio mitochondrijų išorinės membranos pralaidumo ir rRNR metilazės (11).

Atliekami kampilobakterijų rūšių molekulinio atsparumo mechanizmų tyrimai. Dažniausiai chinolonams pastebima C257T mutacija gyrA gene, kuris sukelia Thr86Ile pasikeitimą girazėje, o tai suteikia aukštą atsparumą šiai antimikrobinių medžiagų grupei. Kampilobakterijų atsparumą tetraciklinams suteikia tet(O) genas, kuris plačiai paplitęs C. jejuni ir C. coli rūšyse. Tet(O) genas koduoja apsauginius ribosomos baltymus, kurie pašaliną tetracikliną iš ribosomų. Makrolidų atsparumas kampilobakterijose yra ribosomų modifikacijos mutacijos 23S rRNR rezultatas. Aminoglikozidų atsparumas kampilobakterijose susijęs su aminoglikozido 3'-O-fosfotransferaze, kuri yra labiausiai paplitusi C. jejuni ir C. coli rūšyse (44).

Taigi padidėjęs kampilobakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms skatina kurti vakcinas, kuriomis būtų galima skiepyti paukščius ir taip sumažinti žmonių infekcijų dažnį. Vakcinų kūrimas padėtų sumažinti gydymo išlaidas, susijusias su kampilobakterioze, padidintų maisto saugą ir sumažintų galimą pavojų žmonių sveikatai. Tačiau šiuo metu pasaulyje nėra sukurta vakcinų, skirtų užkirsti kelią infekcijai, nes trūksta tyrimų apie antigeninę įvairovę, epitopus, patogenezę. Naujo, veiksmingo antibiotiko kūrimas, skirto gydyti kampilobakteriozę, taip pat padėtų sumažinti antibiotikams atsparias kampilobakterijas, kurios negalėtų perduoti antibiotikams atsparius genus (11).

(16)

16

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

2.1 Mėginių rinkimas

Moksliniam tyrimui pasirinktas vienas didžiausių lietuviškos paukštienos produktų gamintojų ir mėginiai buvo perkami iš prekybos centro nuo 2018 m. spalio mėn. iki 2019 m. spalio mėn. du kartus per mėnesį. Pirkta atvėsinta blauzdelė, atvėsintas sparnelis ir marinuota blauzdelė, marinuotas sparnelis. Mėginiai buvo perkami dieną prieš tyrimą ir laikomi šaldytuve 4 °C temperatūroje. Tyrimas buvo atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universitete, Veterinarijos akademijoje, Maisto saugos ir kokybės katedroje, Gyvūninių maisto žaliavų saugos ir kokybės tyrimų laboratorijoje.

2.2 Kampilobakterijų aptikimas bei išskyrimas

Broilerių produktai buvo tiriami kampilobakterijų atžvilgiu nuo produktų paviršiaus, o kampilobakterijų aptikimas ir išskyrimas buvo atliekamas naudojant tiesioginį (sėjant ant modifikuoto cefoperazono deoksicholato agaro) ir pagausinimo (Bolton sultinyje) metodus. Kiekvienas broilerių produktas buvo įdedamas į sterilų vienkartinį homogenizavimo maišelį, užpilamas 100 ml buferinio peptono vandens ir 30 s rankiniu būdu masažuojamas. Toliau buvo atliekami dešimtkarčiai praskiedimai iki 10-2. Į sterilų mėgintuvėlį pipete atmatuojama 9 ml buferinio peptono vandens ir įpilama 1 ml paruošto mėginio, mėgintuvėlio turinys sumaišomas sūkurinio tipo maišykle (Bio Vortex, Biosan). Į sterilias vienkartines Petri lėkšteles, paruoštas su selektyvia mCCDA terpe, pasėjama po 100 µl mėginio iš atitinkamų praskiedimų. Mėginys ant lėkštelės paviršiaus tolygiai paskleidžiamas skleistuvo pagalba. Lėkštelės buvo inkubuojamos 37 °C temperatūroje 44 ± 4 val. mikroaerofilinėmis sąlygomis: 85 proc. azoto (N2), 10 proc. anglies

dioksido (CO2), 5 proc. deguonies (O2) termostate (Binder).

Atliekant pagausinimą į sterilius mėgintuvėlius su 9 ml selektyviu Bolton pagausinimo sultiniu buvo sėjama po 1 ml mėginio, mėgintuvėlių turinys sumaišomas sūkurinio tipo maišykle (Bio Vortex, Biosan). Mėgintuvėliai buvo inkubuojami mikroaerofilinėse sąlygose su Campygen priedu 42 °C temperatūroje 22 ± 2 val. Po inkubavimo mėgintuvėlių turinys sumaišomas sūkurinio tipo maišykle (Bio Vortex, Biosan) ir su 10 µl kilpele persėjama ant mCCDA lėkštelių ir inkubuojama 37 °C temperatūroje 44 ± 4 val. mikroaerofilinėse sąlygose.

Praėjus nurodytam inkubavimo laikotarpiui buvo ieškomos ir atrenkamos kampilobakterijoms būdingos kolonijos. Iš kiekvienos lėkštelės atrinktos dvi būdingos kolonijos po pagausinimo metodo ir po tiesioginio metodo, jos persėjamos su 1 µl kilpele į lėkšteles su kraujo agaru (Blood Agar Base No. 2) ir inkubuojamos 37 °C temperatūroje 44 ± 4 val. mikroaerofilinėse sąlygose. Po inkubavimo grynos bakterijų kultūros buvo surenkamos su 10 µl kilpele ir perkeliamos iš lėkštelės į šaldymo

(17)

17 mėgintuvėlį su 1 ml smegenų ir širdies ekstrakto sultinio, turinčio 30 proc. glicerolio ir grynos bakterijų kultūros laikomos – 80 °C temperatūroje šaldiklyje iki tolimesnių tyrimų.

2.3 DNR išskyrimas

Atliekant DNR išskyrimą, užšaldytos bakterijos buvo pasėjamos su 10 µl kilpele ant kraujo agaro bazės Nr. 2, lėkštelės inkubuojamos 37 °C temperatūroje 44 ± 4 val. mikroaerofilinėse sąlygose. Nuo lėkštelės kampilobakterijos surenkamos 1 µl kilpele ir perkeliamos į 1,5 ml mėgintuvėlį su 200 µl PrepMan tirpalu. Mėgintuvėlio turinys maišomas sūkurinio tipo maišykle (Bio Vortex, Biosan) 15 – 30 s. Mėgintuvėlis perkeliamas į termomikserį ir mėgintuvėliai su PrepMan tirpalu ir bakterijomis kaitinami 10 min. 100 °C temperatūroje. Po to mėgintuvėlis 3 min. centrifuguojamas 14 000 aps./min. greičiu. Viršutinė skysčio dalis perkeliama į naują 1,5 ml mėgintuvėlį ir vėl centrifuguojama 14 000 aps./min. greičiu, 3 min. Viršutinė skysčio dalis perkeliama į naują 200 µl mėgintuvėlį ir išskirta DNR buvo naudojama iš karto atliekant dauginę PGR arba užšaldoma – 20 °C temperatūroje iki kito tyrimo.

2.4 Kampilobakterijų identifikavimas naudojant dauginį PGR metodą

Kampilobakterijos buvo identifikuojamos iki rūšies naudojant modifikuotą Wang ir kt. (2002) metodą. Vienai reakcijai atlikti reikalingas PGR reakcijos mišinio kiekis buvo 25 µl, kurį sudarė 24 µl PGR mišinio su pradmenimis ir 1 µl DNR. 1,5 ml steriliame mėgintuvėlyje buvo ruošiamas PGR mišinys, 24 µl mišinio sudarė 12,5 µl DreamTaq Green PCR Master Mix, 10,5 µl sterilus bidistiliuotas vanduo ir 1 µl pradmenų mišinio, kuris sudarytas iš 23SRNRF ir 23SRNRR pradmenų, patvirtinančių Campylobacter gentį, CJF ir CJR pradmenų, nustatančių C. jejuni rūšį, bei CCF ir CCR pradmenų, nustatančių C. coli rūšį (1 lentelė).

1 lentelė. Pradmenų sekos, naudotos kampilobakterijų identifikavimui

Pradmuo Seka (5‘– 3‘) Pradmens dydis, bp

23SRNRF TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG 650 23SRNRR ATCAATTAACCTTCGAGCACCG CJF ACTTCTTTATTGCTTGCTGC 323 CJR GCCACAACAAGTAAAGAAGC CCF GTAAAACCAAAGCTTATCGTG 126 CCR TCCAGCAATGTGTGCAATG

(18)

18 Mėgintuvėlio turinys sumaišomas 15 – 30 s sūkurinio tipo maišykle (Bio Vortex, Biosan) ir centrifuguojamas 30 s 14 000 aps./min. greičiu. Į PGR mėgintuvėlius išpilstoma po 24 µl PGR mišinio ir į kiekvieną PGR mėgintuvėlį pridedama 1 µl atšildytos DNR. PGR mėgintuvėliai centrifuguojami 1 min. 4000 aps./min greičiu. Tuomet mėgintuvėliai patalpinami į termociklerį ir nustatoma programa, kurios sąlygos yra 95 °C 6 min. DNR polimerazei suaktyvinti, 95 °C 0,5 min. kartojant 30 kartų denatūracijai įvykti, 53 °C 0,5 min. kartojant 30 kartų pradmenų prilydymui, 72 °C 0,5 min. kartojant 30 kartų elongacijai įvykti, 72 °C 7 min. galutinei elongacijai įvykti, PGR produktas termocikleryje laikomas 4 °C.

Gauti PGR produktai analizuojami vykdant elektroforezę agarozės gelyje. Paruošiama TAE buferio vonelė, į kurią įpilama 6,5 µl Ethidium bromide tirpalo. Taip pat paruošiamas gelis iš 3 g agarozės ir 150 ml TAE buferio. Jam atvėsus pridedama 9 µl Ethidium bromide tirpalo ir išmaišoma. Gautas agarozės gelis supilamas į rėmelį su šukomis. Sustingus geliui nuimamos šukos, rėmelio kraštai ir gelis įdedamas į TAE buferio vonelę. Į gelyje esančius šulinėlius perkeliama 10 µl PGR produkto ir viename šulinėlyje patalpinamas 3 µl molekulinis žymuo GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder, skirtas DNR fragmentų dydžiui įvertinti. Elektroforezė buvo vykdoma 50 min. 105 V, o rezultatai buvo vertinami UV spindulių šviesoje padarius nuotraukas Uvitec, Uvipro Silver aparatu. Kampilobakterijų fragmentų ilgiai: Campylobacter spp. – 650 bp, C. jejuni – 323 bp, C. coli – 126 bp (2 pav.).

2 pav. Elektroforezės nuotrauka: M – DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1000 bp (MBI,

Fermentas); 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 11 – C. jejuni; 9 – C. coli; 4 – neigiamas mėginys

2.5 Atsparumo antibiotikams genų identifikavimas

Kampilobakterijų antimikrobinio atsparumo įvertinimui buvo pasirinkti su antibiotikų atsparumu susiję genai: tet (O), cmeB, BlaOXA-61, CjgyrA ir CcgyrA, 23SRNA – F (2 lentelė).

650 bp 323 bp 126 bp

(19)

19

2 lentelė. Tyrimui pasirinkti antibiotikų genai

Genas Pradmuo Seka (5‘– 3‘) Geno dydis, bp

tet(O) tet (O) – F GCGTTTTGTTTATGTGCG 559

tet (O) – R ATGGACAACCCGACAGAAG

cmeB cmeB – F TCCTAGCAGCACAATATG 241

cmeB – R AGCTTCGATAGCTGCATC

BlaOXA-61

BlaOXA-61 – F AGAGTATAATACAAGCG

372 BlaOXA-61 – R TAGTGAGTTGTCAAGCC

CjgyrA CjgyrA – F TTTTTAGCAAAGATTCTGAT 265

CjgyrA – R CAAAGCATCATAAACTGCAA

CcgyrA CcgyrA – F TATGAGCGTTATTATCGGTC 192

CcgyrA – R TAAGGCATCGTAAACAGCCA 23SRNA – F 23SRNA – F TTAGCTAATGTTGCCCGTACCG 485 ERY2074R AGTAAAGGTCCACGGGGTCTGG 23SRNA – F TTAGCTAATGTTGCCCGTACCG ERY2075R TAGTAAAGGTCCACGGGGTCGC

Tyrimas buvo atliekamas taikant molekulinį PGR metodą, taip kaip buvo aprašyta anksčiau, tik skyrėsi ruoštas PGR mišinys iš 7,25 µl DreamTaq Green PCR Master Mix, 1 µl pradmenų poros, 15,75 µl sterilaus bidistiliuoto vandens. Taip pat skyrėsi termociklerio PGR reakcijos sąlygos, kurios atsižvelgiant į pradmenį pateiktos 3, 4, 5 lentelėse.

3 lentelė. tet (O) – F ir tet (O) – R, cmeB – F ir cmeB – R, BlaOXA-61 – F ir BlaOXA-61 – R

PGR reakcijos sąlygos (45)

PGR etapas Temperatūra, °C Laikas Ciklų skaičius

DNR polimerazės suaktyvinimas 95 5 min. 1

Denatūracija 95 30 s 30

Pradmenų prilydymas 54 30 s 30

Elongacija 72 30 s 30

Galutinė elongacija 72 7 min. 1

(20)

20

4 lentelė. CjgyrA – F ir CjgyrA – R, CcgyrA – F ir CcgyrA – R PGR reakcijos sąlygos (46)

Denatūracija 94 1 min. 35

Pradmenų prilydymas 48 1 min. 35

Elongacija 72 1 min. 35

PGR produkto laikymas 4 ꝏ –

5 lentelė. 23SRNA – F ir ERY2074R, ERY2075R PGR reakcijos sąlygos (46)

Denatūracija 94 30 s 30

Pradmenų prilydymas 59 30 s 30

Elongacija 72 45 s 30

PGR produkto laikymas 4 ꝏ –

Tyrime naudotų genų pradmenų susidariusių fragmentų dydžiai buvo vertinami: tet (O) – 559 bp, cmeB – 241 bp, BlaOXA-61 – 372 bp, CjgyrA – 265 bp, CcgyrA – 192 bp, 23SRNA – F ir ERY2074R,

ERY2075R – 485 bp. 3 pav. pateiktas C. jejuni ir C. coli izoliatų atsparumas tet (O) genui, kurio fragmento ilgis 559 bp.

3 pav. Elektroforezės nuotrauka: M – DNR ilgio standartas nuo 100 bp iki 1000 bp (MBI,

Fermentas); 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 11, 13 – atsparumus tetraciklinui; 5, 10, 12, 14 – nėra atsparumo tetraciklinui

(21)

21

2.6 Statistinis duomenų įvertinimas

Tyrimo duomenys buvo suvedami ir susisteminami į Microsoft Office Excel. Statistinė duomenų analizė buvo atlikta naudojant standartizuotą SPSS 25.0 programos paketą. Kokybiniams kintamiesiems taikoma aprašomoji statistika. Naudojantis Crosstabs buvo skaičiuojamas chi – kvadrato (χ2_{) kriterijus, kuris parodo, ar broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis}

(22)

22

3. TYRIMO REZULTATAI

3.1 Broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis

Per vienerių metų laikotarpį, 2018 m. spalio mėn. – 2019 m. spalio mėn., ištirti 95 mėginiai, iš kurių kampilobakterijomis buvo užkrėsta 19 mėginių t.y. 20 proc. visų tirtų mėginių (6 lentelė), o 8,4 proc. kampilobakterijų buvo išskirta po pagausinimo Boltono sultinyje.

6 lentelė. Tirtų mėginių užkrėstumas kampilobakterijomis

Mėginių kiekis, vnt. Mėginių kiekis, proc.

Užkrėsti mėginiai 19 20

Neužkrėsti mėginiai 76 80

Tirti mėginiai 95 100

Iš 47 tirtų atvėsintų broilerių produktų mėginių 25,5 proc. buvo užkrėsti kampilobakterijomis, o marinuotų broilerių produktų užkrėstumas iš tirtų 48 mėginių buvo 14,6 proc. (7 lentelė). Lyginant atvėsintų ir marinuotų broilerių produktų užkrėstumą kampilobakterijomis, skirtumas nebuvo statistiškai reikšmingas (χ2_{= 1,779, df = 1, p = 0,182).}

7 lentelė. Atvėsintų ir marinuotų broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis

Tirtų mėginių kiekis, vnt. Užkrėsti mėginiai vnt. Užkrėsti mėginiai proc. Atvėsintas produktas 47 12 25,5 Marinuotas produktas 48 7 14,6

Buvo ištirtos 23 atvėsintos blauzdelės, iš kurių 7 mėginiai buvo užkrėsti kampilobakterijomis, ir 24 atvėsinti sparneliai, iš kurių kampilobakterijomis buvo užkrėsti 5 mėginiai. Ištirtų atvėsintų blauzdelių užkrėstumas kampilobakterijomis sudarė 30,4 proc., o atvėsintų sparnelių užkrėstumas buvo 20,8 proc.

Iš 24 tirtų marinuotų blauzdelių, kampilobakterijomis buvo užkrėsti 3 mėginiai, o iš tirtų 24 marinuotų sparnelių kampilobakterijomis buvo užkrėsti 4 mėginiai. Marinuotų sparnelių užkrėstumas kampilobakterijomis sudarė 16,7 proc., o marinuotų blauzdelių užkrėstumas buvo 12,5 proc.

Iš 19 užkrėstų mėginių dažniausiai kampilobakterijomis buvo užkrėstos atvėsintos blauzdelės – 30,4 proc. (4 pav.). Statistiškai reikšmingas skirtumas nebuvo nustatytas tarp broilerio produkto rūšies ir užkrėstumo kampilobakterijomis (χ2_{= 2,586, df = 3, p = 0,460).}

(23)

23

4 pav. Tirtų mėginių užkrėstumas kampilobakterijomis

Kadangi mėginiai buvo rinkti metus laiko, kiekvieną mėnesį buvo ištirti 8 mėginiai, tik gruodžio mėnesį ištirta vienu mėginiu mažiau, didžiausias užkrėstumas kampilobakterijomis nustatytas birželio mėnesį – 62,5 proc., o mažiausias balandžio mėnesį – 12,5 proc. Kampilobakterijomis užkrėstų mėginių nenustatyta sausio, gegužės, rugpjūčio, rugsėjo, lapkričio mėnesiais (5 pav.). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, kad broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis priklauso nuo mėginių rinkimo laiko (χ2 = 27,143, df = 11, p = 0,004).

5 pav. Tirtų mėginių užkrėstumas kampilobakterijomis sausio – gruodžio mėnesiais

30,4 20,8 12,5 16,7 69,6 79,2 87,5 83,3 0 20 40 60 80 100 Atvėsintos blauzdelės Atvėsinti sparneliai Marinuotos blauzdelės Marinuoti sparneliai proc.

Užkrėsti mėginiai, proc. Neužkrėsti mėginiai, proc.

0 50 37,5 12,5 0 62,5 25 0 0 37,5 0 14,3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 proc .

(24)

24

3.2 Kampilobakterijų rūšinė įvairovė broilerių produktuose

Iš 19 užkrėstų mėginių nustatyta, kad 12,6 proc. mėginių buvo užkrėsti C. jejuni, 1,1 proc. C.

coli, 6,3 proc. Campylobacter spp. (8 lentelė).

8 lentelė. Kampilobakterijų rūšinė įvairovė broilerių produktuose

Mėginių kiekis, vnt. Mėginių kiekis, proc.

C. jejuni 12 12,6

C. coli 1 1,1

Campylobacter spp. 6 6,3

Užkrėsti mėginiai 19 20

C. jejuni bakterijos rastos 21,7 proc. atvėsintų blauzdelių, 12,5 proc. atvėsintų ir 12,5 proc.

marinuotų sparnelių, 4,2 proc. marinuotoje blauzdelėje. Tik viena marinuota blauzdelė buvo užkrėsta

C. coli bakterija (4,2 proc). Campylobacter spp. bakterijos rastos 8,7 proc. atvėsintų blauzdelių ir 8,3

proc. atvėsintų sparnelių bei 4,2 proc. marinuotų blauzdelių ir 4,2 proc. marinuotų sparnelių. Daugiausia atvėsintų blauzdelių buvo užkrėstos C. jejuni (6 pav.).

6 pav. Kampilobakterijų rūšinė įvairovė tirtuose mėginiuose

5 3 1 3 1 2 2 1 1 16 19 21 20 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Atvėsintos blauzdelės

Atvėsinti sparneliai Marinuotos blauzdelės

Marinuoti sparneliai

(25)

25

3.3 Kampilobakterijų genų, susijusių su atsparumu antibiotikams,

identifikavimas

Tyrimo metu atliktas C. jejuni ir C. coli izoliatų molekulinis atsparumo antibiotikams nustatymas. Iš 19 užkrėstų mėginių atsirinkome tik C. jejuni ir C. coli padermes. Iš tyrimui pasirinktų atsparumą lemiančių genų C. jejuni ir C. coli izoliatai pasižymėjo atsparumu tik tetraciklinui ir ciprofloksacinui, o dauginiu atsparumu, atsparumu ampicilinui ir eritromicinui nepasižymėjo.

Iš 13 tirtų mėginių didžiausias atsparumas nustatytas tetraciklinui – 69,2 proc. Viena C. coli rūšis turėjo atsparumo geną CcgyrA, o geną CjgyrA turėjo penkios C. jejuni padermės, tai parodė atsparumą ciprofloksacinui – 46,2 proc. (9 lentelė).

9 lentelė. Kampilobakterijų, išskirtų iš broilerių produktų, atsparumas antibiotikams

Antimikrobinė medžiaga

Tirti mėginiai, vnt.

Atsparių mėginių kiekis, vnt.

Atsparių mėginių kiekis, proc. Tetraciklinas 13 9 69,2 Dauginis atsparumas 13 0 0 Ampicilinas 13 0 0 Ciprofloksacinas 13 6 46,2 Eritromicinas 13 0 0

Analizuojant, iš kokių broilerių produktų išskirtos kampilobakterijų rūšys buvo atsparios antibiotikams, nustatėme, kad daugiausiai tetraciklinui atsparių mėginių buvo išskirta iš atvėsintų blauzdelių – 44,4 proc., o mažiausiai iš marinuotų sparnelių – 11,1 proc. Taip pat atsparumas tetraciklinui nustatytas iš 22,2 proc. atvėsintų sparnelių ir 22,2 proc. marinuotų blauzdelių. Iš 6 atsparių mėginių ciprofloksacinui nustatėme, kad viena C. coli rūšis buvo atspari ciprofloksacinui, kuri išskirta iš marinuotos blauzdelės (16,7 proc.). Penkios C. jejuni rūšys buvo atsparios ciprofloksacinui iš 33,3 proc. atvėsintų blauzdelių, 33,3 proc., atvėsintų sparnelių ir 16,7 proc. marinuotos blauzdelės (7 pav.).

(26)

26

7 pav. C. jejuni ir C. coli, išskirtų iš broilerių produktų, molekulinis atsparumas tetraciklinui ir

ciprofloksacinui 4 2 2 2 2 ₁ 1 ₁ 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Tetraciklinas Ciprofloksacinas

Atvėsintos blauzdelės Atvėsinti sparneliai Marinuotos blauzdelės Marinuoti sparneliai

(27)

27

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Tyrimo rezultatai parodė, kad mažmeninėje prekyboje parduodami Lietuvos paukštienos gamintojo atvėsinti ir marinuoti broilerių produktai kampilobakterijomis buvo užkrėsti 20 proc. Identiškų tyrimų, kuriuose būtų nustatytas ir palygintas atvėsintų ir marinuotų broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis, mūsų žiniomis, nebuvo atlikta. Rastose mokslinėse publikacijose skyrėsi tirtų mėginių kiekis, taikytos tyrimo metodikos, tyrimų laikotarpis, kas lėmė skirtingus tyrimų rezultatus. Anksčiau atlikti panašūs tyrimai parodė, kad 2009 m. mažmeninėje prekyboje parduodamų Lietuvos gamintojų atvėsintos broilerių blauzdelės ir sparneliai kampilobakterijomis buvo užkrėsti 46,6 proc. (25), o 2009 – 2010 m. mažmeninėje prekyboje parduodamų Lietuvos gamintojų atvėsintos broilerių blauzdelės ir sparneliai kampilobakterijomis buvo užkrėsti 43 proc. (26). Mūsų tyrimo metu nustatyta, kad atvėsintų broilerių blauzdelės ir sparneliai kampilobakterijomis buvo užkrėsti 25,5 proc. Sumažėjęs broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis gali būti siejamas su tuo, kad nuo 2018 m. sausio 1 d. buvo pradėtas taikyti 2017 m. rugpjūčio 23 d. Komisijos reglamentas (ES) 2017/1495, kuriuo dėl kampilobakterijų (Campylobacter) broilerių skerdenėlėse iš dalies keičiamas Reglamentas (EB) Nr. 2073/2005. Reglamente nurodoma, kad po atšaldymo kampilobakterijų skaičius broilerių skerdenėlėse turi neviršytų 1000 ksv/g ribos. Tokia kontrolė paukštynuose ir skerdyklose padeda sumažinti žmonių susirgimo riziką kampilobakterioze ir užtikrina apsaugą visoje paukštienos gamybos grandinėje. Mūsų atliktas tyrimas rodo, kad mažmeninėje prekyboje parduodamų broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis nėra aukštas, lyginant su kitomis šalimis. 2018 m. rugsėjo mėn – 2019 m. kovo mėn. Estijos mažmeninėje prekyboje buvo renkami Estijos, Lietuvos ir Latvijos gamintojų broilerių produktai (šlaunelės, blauzdelės, broilerių ketvirčiai, krūtinėlė, sparneliai), siekiant išsiaiškinti broilerių produktų užkrėstumą kampilobakterijomis. Tyrimo rezultatai parodė, kad Estijos mažmeninėje prekyboje parduodami Estijos gamintojų broilerių produktai nebuvo užkrėsti kampilobakterijomis, Latvijos gamintojų broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis buvo 33,7 proc., o Lietuvos gamintojų – 59 proc. Daugiausiai kampilobakterijomis buvo užkrėsti broilerių ketvirčiai – 36,8 proc., blauzdelės – 33,3 proc., šlaunelės – 19,2 proc. (47). Šis tyrimas parodė, kad Estijos mažmeninėje prekyboje parduodami importuoti lietuviškos kilmės broilerių produktai pasižymi dideliu kampilobakterijų paplitimu. Galima daryti prielaidą, kad pasirinkta skirtinga gamintojų produkcija lėmė skirtumus, lyginant su mūsų tyrimų rezultatais. Analizuojant šio tyrimo ir mūsų tyrimo rezultatus pastebima, kad dažniausiai blauzdelės užkrėstos kampilobakterijomis. 2009 m. kovo – rugsėjo mėnesiais, atliktas Bunevičienės ir kt. tyrimas taip pat parodė, kad broilerių blauzdelės buvo labiau užkrėstos kampilobakterijomis negu broilerių sparneliai (48). Atliekami tyrimai patvirtina, kad broilerių produktai dažnai būna užkrėsti kampilobakterijomis. Teigiama, jog kampilobakterijų paplitimas mažmeninėje prekyboje priklauso

(28)

28 nuo kampilobakterijų paplitimo pulkuose. Jei ūkyje auginamuose broilerių pulkuose paplitusios kampilobakterijos, jos gali išgyventi visuose skerdimo etapuose ir tada užkrėsti broileriai patenka į mažmeninę prekybą bei sukelia riziką vartotojams užsikrėsti kampilobakterioze. Kampilobakterijos gali išgyventi broilerių produktuose, laikomuose 4 °C temperatūroje, o žemoje temperatūroje geba sudaryti bioplėveles, kurias naudoja kaip apsauginį mechanizmą, kuomet aplinkoje patiria stresą (49,50). Broilerių virškinimo traktas sudaro optimalias sąlygas daugintis kampilobakterijoms, nes broilerių kūno temperatūra yra 42 °C, yra daug maistinių medžiagų ir mažas deguonies kiekis. Kuomet maistas yra perdirbamas, kampilobakterijoms oksidacinis stresas yra neišvengiamas, tačiau atliekami tyrimai įrodo, kad kampilobakterijos gali būti tolerantiškos deguonies kiekiui. C. jejuni padermės buvo išskirtos iš mažmeninėje prekyboje parduodamos vištienos mėsos, labiausiai paplitę kloniniai kompleksas buvo CC – 21 ir CC – 45. Kloninio komplekso CC – 21 aerotolerancijos lygis buvo paplitęs 42 proc., kloninio komplekso CC – 45 – 21 proc. Tyrimas parodė, kad deguoniui tolerantiškos C. jejuni bakterijos labai paplitusios vištienos mėsoje, o padidėjęs atsparumas oksidaciniam stresui leidžia išgyventi perdirbant mėsą, todėl padidėja rizika žmonėms užsikrėsti kampilobakterijomis per maistą, nes kloninis kompleksas CC – 21 dažnai susijęs su žmonių gastroenteritu (51). Huat ir kt. tyrime buvo siekiama nustatyti kampilobakterijų paplitimą nuo ūkio iki mažmeninės prekybos. 95 proc. kampilobakterijų buvo aptikta atvirai ūkyje auginamų broilerių kloakose, skerdimo proceso metu skerdenose rasta nuo 84,0 proc. iki 94,0 proc. kampilobakterijų, o mažmeninėje prekyboje parduodamų broilerių mėsoje nuo 78,0 proc. iki 92,0 proc. Šis tyrimas parodė labai didelį broilerių užkrėstumą, o dažniausiai paplitusi rūšis buvo C. jejuni (ūkyje – 37,3 proc., skerdimo proceso metu – 65,5 proc., mažmeninėje prekyboje – 69,6 proc.) ir C. coli (ūkyje – 0,4 proc., skerdimo proceso metu – 0,5 proc., mažmeninėje prekyboje – 1,6 proc) (52). Mūsų tyrime, nustačius išskirtų kampilobakterijų rūšinę įvairovę, pastebėta, jog atvėsinti ir marinuoti broilerių produktai dažniausiai buvo užkrėsti C. jejuni bakterijomis.

Tyrimo metu pastebėjome sezoninius pokyčius, kurie turi įtakos kampilobakterijų paplitimui (p<0,01). Broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis buvo didžiausias birželio mėnesį. 2015 m. paskelbtame Estijos tyrime nustatytas didelis kampilobakterijų paplitimas broileriuose, parduodamuose mažmeninėje prekyboje nuo birželio mėn. iki rugsėjo mėn., o užkrėstumas kampilobakterijomis svyravo nuo 16,7 proc. iki 75 proc. Estijos tyrime buvo nurodytas kampilobakterijų paplitimas Lietuvoje: birželio – rugsėjo mėn. buvo nuo 5,9 proc. iki 61,5 proc. Vadinasi, kampilobakterijos paplitusios ypač vasaros mėnesiais, tačiau pagrindinius sezoniškumo veiksnius sunku identifikuoti, manoma, tam įtakos turi aplinkos temperatūra ir drėgmė (53). Taigi galime įžvelgti ryšį tarp kampilobakterijų paplitimo mažmeninėje prekyboje ir metų laiko.

Lygindami atvėsintų ir marinuotų broilerių produktų užkrėstumą kampilobakterijomis nustatėme, kad dažniausiai kampilobakterijomis buvo užkrėsti atvėsinti broilerių produktai.

(29)

29 Marinuotose broilerių produktuose kampilobakterijų buvo aptikta rečiau. Tačiau galima daryti prielaidą, kad marinavimas nesumažina kampilobakterijų kiekio produkte. Remiantis 2014 m. atliktu tyrimu, nustatyta, kad Lietuvos mažmeninėje prekyboje parduodami marinuoti sparneliai kampilobakterijomis buvo užkrėsti 33,3 proc., o marinuotos blauzdelės 25,0 proc. (27). Mūsų atliktas tyrimas taip pat parodė, kad marinuoti sparneliai buvo labiau užkrėsti kampilobakterijomis negu marinuotos blauzdelės. Broilerių produktų marinatai dažniausiai buvo medaus ir garstyčių, laukinio česnako bei rytietiškas marinatas. Marinatų pagrindinės sudedamosios dalys buvo augalinis rapsų aliejus, druska, prieskoniai (garstyčios, česnakai). Šie marinatai nepasižymėjo kampilobakterijų užkrėstumo sumažinimu broilerių produktuose, kadangi marinatuose nebuvo organinių rūgščių ar eterinių aliejų, kurie galėtų sumažinti kampilobakterijų skaičių produkte. Dominavo augalinis aliejus, druska ir prieskoniai, kurie neveikia antibakteriškai prieš kampilobakterijas. Atlikus tyrimą Atikoje, Graikijoje, nustatyta, kad mažmeninėje prekyboje parduodamų marinuotų paukštienos pusgaminių (blauzdelių, sparnelių, krūtinėlės, ketvirčių) kampilobakterijomis užsikrėtę 50 proc. Prekybininkai marinuoja mėsą, kurios tinkamumo laikas yra pasibaigęs, kad ji būtų greitai paruošta ir patrauklesnė vartotojams, taip pagerindami mėsos kokybę, tačiau jei marinatuose nėra antibakterinių medžiagų, veikiančių prieš kampilobakterijas, yra tikimybė, jog marinavimas nepagerins mėsos kokybės (33).

Taip pat tyrėme, ar iš broilerių produktų išskirtos kampilobakterijos pasižymėjo dauginiu atsparumu, ir įvertinome, koks kampilobakterijų atsparumas šiems antibiotikams: tetraciklinui, ampicilinui, ciprofloksacinui, eritromicinui. Atlikę kampilobakterijų atsparumą antimikrobinėms medžiagoms, nustatėmė, kad C. jejuni ir C. coli bakterijų rūšys atsparios tetraciklinui (69,2 proc.) ir ciprofloksacinui (46,2 proc.). Remiantis 2017 – 2018 m. Europos maisto saugos tarnybos ataskaita apie antimikrobinį atsparumą Europos Sąjungoje, teigiama, kad iš broilerių paimtų C. coli ir C. jejuni izoliatų atsparumas dažniausiai buvo nustatytas ciprofloksacinui, nalidikso rūgščiai ir tetraciklinui – nuo 54 iki 83 proc. Atsižvelgiant į skirtumus tarp Europos Sąjungos šalių iš boilerių išskirtų C. jejuni izoliatų, atsparumas buvo ne didesnis kaip 5 proc. Lietuvoje, Latvijoje, Portugalijoje, Kipre ir didesnis nei 70 proc. Islandijoje, Norvegijoje, Suomijoje, Švedijoje (54). Taigi galima įžvelgti panašuma, kad dažniausiai iš broilerių produktų išskirti kampilobakterijų izoliatai yra labiau atsparūs tetraciklinui ir ciprofloksacinui. Kitas 2009 m. vasario – birželio mėn. Lietuvoje atliktas Ružausko ir kt. tyrimas taip pat patvirtino, kad iš blauzdelių išskirti C. jejuni ir C. coli izoliatai pasižymi atsparumu ciprofloksacinui – 78,1 proc. ir tetraciklinui – 43,8 proc. Kadangi chinolonai ir fluorochinolonai bei tetraciklinas pasižymi plačiu veikimo spektru, dėl tos priežasties šios antimikrobinės medžiagos naudojamos medicinoje ir veterinarijoje, todėl aptinkamos ir broilerių mėsoje (55). Estijos mažmeninę rinką sudaro 30 proc. parduodamų lietuviškų broilerių produktų. Tyrimų metu buvo nustatyta, kad mažmeninėje prekyboje parduodamų lietuviškų broilerių produktuose aptiktas atsparumas ciprofloksacinui buvo 84,8 proc., o tetraciklinui 19,6 proc. (56). 2013 m. Mešhede, Irane,

(30)

30 mažmeninėje prekyboje parduodamos broilerių blauzdelės ir sparneliai kampilobakterijomis užkrėsti 63,1 proc., o dažniausiai pasitaikė atsparumas tetraciklinui (87,2 proc.) ir ciprofloksacinui (79,3 proc.) (57).

Atliktas tyrimas parodė, kad Lietuvos gamintojų mažmeninėje prekyboje parduodamų broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis yra sumažėjęs. Tam įtakos galimai turėjo didėjantis gamintojų sąmoningumas ir rizikos valdymas, susijęs su kampilobakterijų paplitimu. Vis dėlto yra reikalingos tinkamos kampilobakterijų kontrolės priemonės broilerių mėsos gamybos etapuose, ypač vasaros metu, siekiant apsaugoti visuomenės sveikatą. Marinuotuose broilerių produktuose taip pat aptinkamos kampilobakterijos, todėl prieš vartojimą būtinas tinkamas terminis apdorojimas. Kampilobakterijų atsparumas chinolonams (ciprofloksacinui) ir tetraciklinui parodo, kad yra reikalingas sistemingas kampilobakterijų antimikrobinio atsparumo stebėjimas ir antimikrobinių medžiagų naudojimo kontroliavimas paukštininkystėje.

(31)

31

IŠVADOS

1. Prekybos centre parduodami lietuviškos paukštienos gamintojo broilerių pusgaminiai kampilobakterijomis užkrėsti 20 proc.

1.1 Iš visų tirtų mėginių dažniausiai kampilobakterijomis užsikrėtę 30,4 proc. atvėsintų blauzdelių, 20,8 proc. atvėsintų sparnelių, 16,7 proc. marinuotų sparnelių, o mažiausias užkrėstumas aptiktas marinuotose blauzdelėse – 12,5 proc.

1.2 Broilerių produktų užkrėstumas kampilobakterijomis priklauso nuo mėginių rinkimo laiko (p<0,01). Didžiausias užkrėstumas kampilobakterijomis nustatytas birželio mėnesį – 62,5 proc., o mažiausias balandžio mėnesį – 12,5 proc.

2. Iš 20 proc. užkrėstų mėginių nustatyta, kad 12,6 proc. mėginių buvo užkrėsti C. jejuni, 1,1 proc. C. coli, 6,3 proc. Campylobacter spp. Daugiausia atvėsintų blauzdelių buvo užkrėstos

C. jejuni – 21,7 proc.

3. Iš 13 atrinktų kampilobakterijų padermių nustatytas kampilobakterijų atsparumas tetraciklinui – 69,2 proc. ir ciprofloksacinui – 46,2 proc.

(32)

32

LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. EFSA Panel on Biological Hazards (BIOHAZ). Scientific opinion on quantification of the risk posed by broiler meat to human campylobacteriosis in the EU. EFSA Journal. 2010;8(1):1437.

2. Stella S, Soncini G, Ziino G, Panebianco A, Pedonese F, Nuvoloni R, et al. Prevalence and quantification of thermophilic Campylobacter spp. in Italian retail poultry meat: Analysis of influencing factors. Food Microbiology 2017;62:232-238.

3. Aksomaitienė J, Ramonaitė S, Olsen JE, Malakauskas M. Prevalence of genetic determinants and phenotypic resistance to ciprofloxacin in Campylobacter jejuni from Lithuania. Frontiers in microbiology. 2018; 9: 203.

4. Wieczorek K. Resistance to quinolones and tetracycline and its molecular background among

Campylobacter strains isolated in Poland. Bull. Vet. Inst. Pulawy. 2011;55: 613-618.

5. Di Giannatale E, Di Serafino G, Zilli K, Alessiani A, Sacchini L, Garofolo G, et al. Characterization of antimicrobial resistance patterns and detection of virulence genes in Campylobacter isolates in Italy. Sensors. 2014;14.2: 3308-3322.

6. World Health Organization. Campylobacter, 23 January 2018 [žiūrėta 2019 m. gruodžio 7 d.]. Prieiga per internetą: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/campylobacter.

7. LPSN List of prokaryotic names with standing in nomenclature: Genus Campylobacter [žiūrėta 2019 m. gruodžio 7 d.]. Prieiga per internetą: http://www.bacterio.net/campylobacter.html.

8. Chlebicz A, Śliżewska K. Campylobacteriosis, Salmonellosis, Yersiniosis, and Listeriosis as Zoonotic Foodborne Diseases: A Review. International Journal of Environmental Research and Public Health 2018;15(5):863.

9. Mezher Z, Saccares S, Marcianò R, De Santis P, Rodas E, De Angelis V, et al. Occurrence of

Campylobacter spp. in Poultry Meat at Retail and Processing Plants' Levels in Central Italy. Italian

journal of food safety. 2016;5(1):5495.

10. Kaakoush NO, Castaño-Rodríguez N, Mitchell HM, Man SM. Global Epidemiology of

Campylobacter Infection. Clin Microbiol Rev 2015;28(3):687.

11. Igwaran A, Okoh AI. Human campylobacteriosis: A public health concern of global importance. Heliyon. 2019;5(11): e02814.

12. Skarp CPA, Hänninen M-, Rautelin HIK. Campylobacteriosis: the role of poultry meat. Clinical Microbiology and Infection 2016 Feb;22(2):103-109.

13. Würfel SFR, Da Silva WP, de Oliveira MG, Kleinubing NR, Lopes GV, Gandra EA, et al. Genetic diversity of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from poultry meat products sold on the retail market in Southern Brazil. Poult Sci 2019;98(2):932.

(33)

33 14. The European Union summary report on trends and sources of zoonoses, zoonotic agents and food‐

borne outbreaks in 2017. EFSA Journal 2018 Dec;16(12):n/a.

15. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras. Sergamumo užkrečiamosiomis ligomis Lietuvoje 2017 m. apžvalga; 2018.

16. European Commission Directorate-General for Health and Food Safety. Overview report Mitigation Measures in Place for Campylobacter spp. in Poultry. 2017:3.

17. Marotta F, Garofolo G, Aprea G, Platone I, Cianciavicchia S, Alessiani A. Population diversity of

Campylobacter jejuni in poultry and its dynamic of contamination in chicken meat. BioMed Research

International 2015;2015.

18. Whitehouse C.A, Zhao S, Tate H. Antimicrobial Resistance in Campylobacter Species: Mechanisms and Genomic Epidemiology.

19. Kralik G, Kralik Z, Grčević M and Hanžek D. Quality of Chicken Meat. Journal of Animal Science 2017 Dec 20;Chapter 4:63-64.

20. Lietuvos statistikos departamentas. Realizuota skersti gyvulių ir paukščių [žiūrėta 2019 m. gruodžio 14 d.]. Prieiga per internetą: https://osp.stat.gov.lt/statistiniu-rodikliu-analize#/.

21. Lietuvos statistikos departamentas. Maisto produktų suvartojimas, tenkantis vienam gyventojui [žiūrėta 2019 m. gruodžio 14 d.]. Prieiga per internetą: https://osp.stat.gov.lt/statistiniu-rodikliu-analize?indicator=S9R104#/.

22. Mughini Gras L, Smid JH, Wagenaar JA, de Boer AG, Havelaar AH, Friesema IH, et al. Risk factors for campylobacteriosis of chicken, ruminant, and environmental origin: a combined case-control and source attribution analysis. PloS one. 2012;7(8): e42599.

23. García-Sánchez L, Melero B, Diez AM, Jaime I, Rovira J. Characterization of Campylobacter species in Spanish retail from different fresh chicken products and their antimicrobial resistance. Food Microbiol 2018;76:457-465.

24. Bunevičienė J. Kampilobakterijų, susijusių su broilerių mėsa ir žmonių susirgimais, genetinė įvairovė bei atsparumas antimikrobinėms medžiagoms: daktaro disertacijos santrauka. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Prieiga per eLABa – nacionalinė Lietuvos akademinė elektroninė biblioteka; 2013.

25. Ramonaitė S. Broilerių sparnelių ir blauzdelių užkrėstumas kampilobakterijomis: magistro darbas. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Prieiga per eLABa – nacionalinė Lietuvos akademinė elektroninė biblioteka; 2010.

26. Kudirkienė E, Bunevičienė J, Šernienė L, Ramonaitė S, Olsen JE, Malakauskas M. Importance of the producer on retail broiler meat product contamination with Campylobacter spp. Journal of the Science of Food and Agriculture. 2013;93(9), 2293-2298.

(34)

34 27. Rakštelytė R. Marinuotų paukštienos pusgaminių užkrėstumas kampilobakterijomis ir jų rūšinė įvairovė: magistro darbas. Kaunas: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas. Prieiga per eLABa – nacionalinė Lietuvos akademinė elektroninė biblioteka; 2014.

28. Lietuvos mokslo taryba. Nacionalinės mokslo programos „Sveikas ir saugus maistas“. 2016:15-16. 29. Ramonaitė S, Tamulevičienė E, Alter T, Kasnauskytė N, Malakauskas M. MLST genotypes of

Campylobacter jejuni isolated from broiler products, dairy cattle and human campylobacteriosis cases

in Lithuania. BMC infectious diseases. 2017;17(1):430.

30. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras. Dažniausia per maistą plintančių ligų priežastis – gyvūninis maistas, 2019 [žiūrėta 2019 m. gruodžio 16 d.]. Prieiga per internetą:

http://www.ulac.lt/naujienos/pranesimai-spaudai/dazniausia-per-maista-plintanciu-ligu-priezastis-gyvuninis-maistas.

31. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras. Pernai sumažėjo per maistą plintančių zoonozių, 2019 [žiūrėta 2019 m. gruodžio 16 d.]. Prieiga per internetą:

http://www.ulac.lt/naujienos/pranesimai-spaudai/pernai-sumazejo-per-maista-plintanciu-zoonoziu.

32. Užkrečiamųjų ligų ir AIDS centras. Sergamumo užkrečiamosiomis ligomis Lietuvoje 2018 m. apžvalga; 2019.

33. Lytou AE, Renieri CT, Doulgeraki AI, Nychas GE, Panagou EZ. Assessment of the microbiological quality and safety of marinated chicken products from Greek retail outlets. International Journal of Food Microbiology 2020:108506.

34. Park NY, Hong SH, Yoon KS. Effects of commercial marinade seasoning and a natural blend of cultured sugar and vinegar on Campylobacter jejuni and Salmonella Typhimurium and the texture of chicken breasts. Poult Sci 2014;93(3):719-727.

35. Thanissery R, Smith DP. Marinade with thyme and orange oils reduces Salmonella Enteritidis and

Campylobacter coli on inoculated broiler breast fillets and whole wings. Poult Sci

2014;93(5):1258-1262.

36. González M, Hänninen M. Reduction of Campylobacter jejuni counts on chicken meat treated with different seasonings. Food Control 2011;22(11):1785-1789.

37. Zakarienė G, Rokaitytė A, Ramonaitė S, Novoslavskij A, Mulkytė K, Zaborskienė G, et al. The Antimicrobial Effect of Spice‐Based Marinades against Campylobacter jejuni on Contaminated Fresh Broiler Wings. J Food Sci 2015;80(3):M627-M634.

38. Isohanni P, Alter T, Saris P, Lyhs U. Wines as possible meat marinade ingredients possess antimicrobial potential against Campylobacter. Poult Sci 2010;89(12):2704-2710.

39. The European Medicines Agency. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2017.